JP2022136230A - ファブリー病の治療のためのα－ガラクトシダーゼＡをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

ファブリー病の治療のためのα－ガラクトシダーゼＡをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ療法に関する。【解決手段】本発明で使用するためのｍＲＮＡは、インビボで投与されたとき、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、そのアイソフォーム、その機能的断片、及びＧＬＡを含む融合タンパク質をコードする。本発明のｍＲＮＡは、好ましくは、対象に投与されるときに対象における細胞及び／または組織への効率的な送達を達成するために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル封入される。本発明のｍＲＮＡ療法は、対象におけるＧＬＡ発現及び／または活性の欠乏レベルを増加させる及び／または回復させる。本発明のｍＲＮＡ療法はさらに、対象における欠乏ＧＬＡ活性に関連する毒性代謝産物、つまりＧｂ３及びリゾ－Ｇｂ３のレベルを減少させる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１８日に出願された米国仮出願第６２／３３８，３５４号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
この電子的に提出された配列表の内容（名前：３５２９．１０７ＰＣ０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１７７，５２６バイト、作成日：２０１７年５月１７日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ファブリー病は、細胞のリソソーム区画内での脂肪の再利用に関与する酵素をコードするα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）遺伝子の変異によって引き起こされる、Ｘ染色体連鎖遺伝性障害である。ファブリー病は、α－ガラクトシダーゼＡ欠乏症、アンダーソン・ファブリー病、広汎性体部被角血管腫、広汎性角化血管腫、セラミドトリヘキソシダーゼ欠乏症、ファブリー病、ＧＬＡ欠乏症、及び遺伝性異所リピドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｄｙｓｔｏｐｉｃ ｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）とも称される。その発生率は男性４０，０００～４００，０００人に一人と推定される。Ｄｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｊ “Ｍｅｄ．”Ｇｅｎｅｔ．４３（４）：３４７－３５２。
ＧＬＡ（ＧＡＬＡとも称される）は、糖脂質及び糖タンパク質からの末端α－ガラクトシル部分を加水分解するホモ二量体糖タンパク質である。例えば、ＧＬＡ ｍＲＮＡ配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６９、ＧＬＡアミノ酸配列についてはＮＰ＿０００１６０を参照されたい。ＧＬＡ前駆体タンパク質は、４２９アミノ酸長であり、タンパク質プロセシング中に切断される３１アミノ酸のシグナルペプチドを含有する。ＧＬＡの変異は、血管樹の内皮を含むいくつかの組織のリソソームにおけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）、グロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ－Ｇｂ３）、ガラビオシルセラミド（Ｇａ２）、及び中性スフィンゴ糖脂質の蓄積をもたらす。Ｇｅｒｖａｓ－Ａｒｒｕｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ １６：１０９。正常な個体は非常に低いＧｂ３レベルを有するが、ファブリー病の患者では、血漿及び様々な組織の両方でＧｂ３が進行的に蓄積する。
ファブリー病の古典的な形態は、通常、小児期または青年期に顕在化し、四肢の激痛（先端触覚異常）、血管皮膚病変の出現（角化血管腫）、発汗異常（無汗症、乏汗症、及びまれには多汗症）、特徴的な角膜及び水晶体混濁、ならびにタンパク尿症という周期的危機を伴う。通常、２０代から４０代で末期腎疾患が生じ、腎疾患の治療が奏功した個体であっても、通常は心疾患または心血管疾患を患う。Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）。
現在、ファブリー病に対する治療は、典型的には、疼痛を低減するためのジフェニルヒダントイン、カルバマゼピン、またはガバペンチン、タンパク尿症を低減するためのＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシン受容体遮断剤、ならびに腎疾患を治療するための慢性血液透析及び／または腎移植からなる。酵素補充療法もまた推奨されることが多いが、その有効性は証明されていない。Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）。故に、ファブリー病を治療するための改善された治療薬及び療法が必要とされる。
本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。本発明のｍＲＮＡ治療薬は、この技術がＧＬＡをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的ＧＬＡタンパク質のデノボ合成を可能にするため、ファブリー病の治療に特によく適している。本発明は、（１）不要な免疫活性化（例えば、外来性核酸のインビボ導入に関連する自然免疫応答）を最小化する、及び（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するための、治療的ｍＲＮＡ内での修飾されたヌクレオチドの組み込みを特徴とする。本発明の例となる態様は、タンパク質発現を増大させるための、特にＧＬＡをコードする治療的ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での、自然免疫応答を低減する及び配列最適化のためのヌクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
さらなる実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療技術はまた、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した送達も特徴とする。本発明は、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡと組み合わされ、インビボで投与されたときに、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出等の改善された特性を有する、新規のイオン性脂質系ＬＮＰを特徴とする。本発明のＬＮＰ製剤はまた、ＬＮＰのインビボ投与に関連する免疫原性の低減を示す。
ある特定の態様では、本発明は、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）をコードするポリヌクレオチド、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物及び送達製剤、ならびにこれらを投与することによる、ファブリー病の治療を必要とする対象におけるファブリー病の治療方法に関する。
本開示は、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、脂質ナノ粒子にカプセル封入されたｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
本開示はさらに、（ａ）（ｉ）α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ＯＲＦ、（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、ｍＲＮＡと、（ｂ）送達剤とを含む、医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
本開示はさらに、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、もしくは少なくとも７２時間にわたって、血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させるのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間、参照の血漿中ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超を維持するのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性を増加させるのに十分であり、増加した血漿中ＧＬＡ活性レベルは、対象のベースラインＧＬＡ活性レベルまたは参照ＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
本開示はさらに、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、もしくは少なくとも７２時間にわたって、血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上のＧＬＡ活性レベルを１つ以上の対応する参照レベル以上に増加させるのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間にわたって、対象の血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上における少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超のＧＬＡ活性を維持するのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって、血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上のＧＬＡ活性を増加させるのに十分であり、増加した１つ以上の血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓ＧＬＡ活性レベルは、対象の対応するベースラインＧＬＡ活性レベルまたは対応する参照のＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
本開示はさらに、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、Ｇｂ３の血漿中レベルを、対象のベースラインＧｂ３血漿レベルまたは参照のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減する、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、リゾ－Ｇｂ３の血漿中レベルを、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルまたは参照のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減するのに十分である。いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、血漿中Ｇｂ３レベルまたは血漿中リゾ－Ｇｂ３を、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルまたは参照のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、８０％～１００％、または９０％～１００％低減する。
本開示はさらに、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルを、これらの組織のうちの１つ以上における対象のベースラインレベルまたはこれらの組織のうちの１つ以上における参照Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減する、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルを、これらの組織のうちの１つ以上における対象のベースラインレベルまたはこれらの組織のうちの１つ以上における参照リゾ－Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減するのに十分である。いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルまたはリゾ－Ｇｂ３のレベルを、その組織における対象のベースラインレベルまたは参照レベルと比較して４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、８０％～１００％、または９０％～１００％低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、送達剤をさらに含む。
ある特定の態様では、本発明は、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドに関し、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。
ある特定の実施形態では、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１１０％～約１５０％、約１１５％～約１５０％、約１２０％～約１５０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１４５％、約１２０％～約１４５％、約１１０％～約１４０％、約１１５％～約１４０％、または約１２０％～約１４０％である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、（ｉ）１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、または１２３％～（ｉｉ）１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、または１４５％である。ある特定の実施形態では、対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、または７０％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６２％～７０％である。
ある特定の実施形態では、ＯＲＦにおける総ヌクレオチド含量と比べたＯＲＦにおけるウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約２０％である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約１６％～約１８％である。
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対するＯＲＦのグアニン含量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％～約８５％、約７０％～約８０％、約７１％～約８０％、または約７２％～約８０％である。
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６５％～約８０％、約７０％～約８０％、または約７０％～約７６％である。
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含量（Ｇ／Ｃ）（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９５％である。ある特定の実施形態では、対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べたＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１２５％である。ある特定の実施形態では、ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量よりも、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％高い。
ある特定の実施形態では、ＯＲＦは、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列との少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡのポリペプチド配列（配列番号１）と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＧＬＡポリペプチドは、α－ガラクトシダーゼ活性を有する。
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、α－ガラクトシダーゼ活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列輸送ペプチドをコードするヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、グアニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、シトシンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、アデニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む。
ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、表３または表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞において発現され、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、造血系の免疫細胞において豊富なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位を含み、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、内皮細胞において豊富なマイクロＲＮＡのものである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じマイクロＲＮＡの第１及び第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、同じマイクロＲＮＡの３ｐ及び５ｐアームのものである。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２結合部位である。いくつかの実施形態では、１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つの１４２－５ｐ結合部位とを含む。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンに直接隣接する３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンから７０～８０塩基下流にある３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ 結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンの直前の５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより１５～２０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより７０～８０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、互いに直接隣接して、または５、５～１０、１０～１５、もしくは１５～２０ヌクレオチド未満のスペーサーを置いて位置付けられた、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲに位置する同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンに直接隣接して位置付けられ、第２及び第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の最も３’側の残基から３０～４０塩基下流に位置付けられている。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３０及び配列番号３２から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１４２は、配列番号２８を含む。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号８５及び配列番号８７から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１２６は、配列番号８３を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせに結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３３の核酸配列を含む５’ＵＴＲを含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含む。ある特定の実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２′－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ１を含む。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ポリＡ領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ポリＡ領域は、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されたＧＬＡポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、１つ以上の異種ポリペプチドは、ＧＬＡポリペプチドの薬物動態特性を増加させる。ある特定の実施形態では、対象に投与されると、ポリヌクレオチドは、配列番号２を含む対応するポリヌクレオチドと比べて、（ｉ）より長い血漿中半減期、（ｉｉ）ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、（ｉｉｉ）より高い構造安定性、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを有する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、（ｉ）５’－末端キャップ、（ｉｉ）５’－ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ、（ｉｖ）３’－ＵＴＲ、及び（ｖ）ポリＡ領域を含む。ある特定の実施形態では、３’－ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１９～１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択される、例えば、配列番号１１９または１２０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’－末端キャップ（例えば、Ｃａｐ１）及びポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）をさらに含む。
ある特定の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの生産方法に関し、本方法は、少なくとも１つのウラシルヌクレオ塩基をアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基で置換することによって、または少なくとも１つのアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基をウラシルヌクレオ塩基で置換することによって、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、これらの置換全ては、同義置換である。ある特定の実施形態では、方法は、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を５－メトキシウラシルと置き換えることをさらに含む。
ある特定の態様では、本発明は、（ａ）本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと、（ｂ）送達剤とを含む組成物に関する。ある特定の実施形態では、送達剤は、脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含む。
ある特定の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000001
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、
－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
ある特定の態様では、本発明は、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、送達剤とを含む組成物に関し、この送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000002
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、
－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及び
Ｃ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及び
Ｃ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及び
Ｃ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及び
Ｃ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）のもの、
Figure 2022136230000003
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）のもの、
Figure 2022136230000004
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｍ１は、Ｍ’である。
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、ｌは、１、３、または５である。
いくつかの実施形態では、化合物は、化合物１～化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
Figure 2022136230000005
またはその塩もしくは立体異性体である。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
Figure 2022136230000006
またはその塩もしくは立体異性体である。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）のもの、
Figure 2022136230000007
またはその塩もしくは立体異性体である。
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
Figure 2022136230000008
またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、ｎは、２、３、及び４から選択され、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載される通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、本明細書で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、各Ｒ６は、Ｈである。いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
Figure 2022136230000009
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
Figure 2022136230000010
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、
－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000011
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではないか、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかのものである。
Figure 2022136230000012
Figure 2022136230000013
式（ＩＩＩ）、または（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000014
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000015
または
Figure 2022136230000016
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000017
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000018
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000019
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000020
であり、この環は、Ｎ原子がＸ２と接続されている。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｘ３は、－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、結合または－（ＣＨ２）２－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くても１つが、－Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’であり得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ１２アルキルである。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
Figure 2022136230000021
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000022
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）のものである。
Figure 2022136230000023
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。ある特定のかかる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５－２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する。
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
他の実施形態では、送達剤は、を含む。式（Ｖ）を有する化合物
Figure 2022136230000024
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）のものである。
Figure 2022136230000025
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも一方は、ＮまたはＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、ＣＨであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであり得る。
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
Figure 2022136230000026
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９－１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ａ６は、Ｎであり、Ａ７は、Ｎである。いくつかの実施形態では、Ａ６は、ＣＨであり、Ａ７は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、－ＣＨ２－であり、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、－ＣＨ２－ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’ではない。
ある特定の実施形態では、組成物は、ナノ粒子組成物である。
ある特定の実施形態では、送達剤は、リン脂質をさらに含む。
ある特定の実施形態では、リン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、送達剤は、構造脂質をさらに含む。
ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。
ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、下記式、
Figure 2022136230000027
を有し、式中、ｒは、１～１００の整数である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
ある特定の実施形態では、送達剤は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン性脂質をさらに含む。
ある特定の実施形態では、送達剤は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
ある特定の実施形態では、組成物は、インビボ送達用に製剤化される。
ある特定の実施形態では、組成物は、筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される。
本開示はさらに、（ｉ）５’ＵＴＲと、（ｉｉ）ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＯＲＦと、（ｉｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲとを含むｍＲＮＡを含む、ポリヌクレオチドを提供し、このｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む。
本開示はさらに、（ｉ）５’－末端キャップと、（ｉｉ）配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む５’ＵＴＲと、（ｉｉｉ）ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列を含み、ｍＲＮＡが、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせ少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、ＯＲＦと、（ｉｖ）配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲと、（ｖ）ポリＡ領域とを含むｍＲＮＡを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１９～１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択される、例えば、配列番号１１９または１２０の核酸配列を含む。
本開示はさらに、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと、送達剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、化合物２３６、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
本明細書に開示される実施形態の一態様では、対象は、ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象である。
本明細書に開示される実施形態の一態様では、対象に投与されると、ｍＲＮＡは、配列番号２の核酸配列を有する及び／またはネイキッドｍＲＮＡとして投与される対応するｍＲＮＡと比べて、（ｉ）より長い血漿中半減期、（ｉｉ）ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、（ｉｉｉ）発現断片をもたらす停止した翻訳のより低い頻度、（ｉｖ）より高い構造安定性、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１つの単回単位用量または複数の単回単位用量としての投与に好適である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、対象においてファブリー病の１つ以上のバイオマーカーのレベルを低減するのに好適である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、対象においてファブリー病の徴候または症状を治療するか、予防するか、その発症を遅延させるのに使用するためのものである。いくつかの実施形態では、徴候または症状には、疼痛、胃腸障害、被角血管腫等の皮膚病変、腎機能障害、心筋症、卒中、またはそれらの組み合わせが含まれる。
ある特定の態様では、本発明は、該ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む宿主細胞に関する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。ある特定の態様では、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ある特定の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを酵素的にまたは化学的に合成することを含む、ポリヌクレオチドの作製方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、または開示されるポリヌクレオチドの作製方法によって生産されるポリヌクレオチドに関する。ある特定の態様では、本発明は、対象に有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象における活性ＧＬＡポリペプチドのインビボでの発現方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、対象に治療上有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の治療方法またはファブリー病の徴候及び／または症状の予防方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を緩和する。
ある特定の態様では、本発明は、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に予防上有効量のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の発症の予防または遅延方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を予防するかまたは遅延させる。ある特定の態様では、本発明は、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に治療上有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の寛解方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を寛解させる。
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、必要のあるヒト対象におけるα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドの発現方法を提供し、この医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１つの単回用量としてまたは複数の単回単位用量として対象に投与するのに好適である。
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、必要のあるヒト対象におけるファブリー病の徴候または症状の治療、予防、または、その発症の遅延方法を提供し、この投与は、対象におけるファブリー病の徴候または症状のうちの１つ以上を治療するか、予防するか、またはその発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、投与は、対象の血漿または組織中のＧｂ３またはリゾ－Ｇｂ３の進行的蓄積を減速する、停止する、または逆行させる。
本開示はさらに、ファブリー病を患うヒト対象に、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの単回静脈内投与を投与することを含む、ファブリー病の治療のための方法を提供する。
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、ヒト対象におけるＧｂ３血漿中レベルまたはリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルの低減方法を提供し、この投与は、対象においてＧｂ３またはリゾ－Ｇｂ３レベルを低減する。いくつかの実施形態では、（ｉ）Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルもしくは参照のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍低減され、及び／または（ｉｉ）リゾ－Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、対象のベースラインリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルもしくは参照のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍低減される。
いくつかの実施形態では、Ｇｂ３血漿中レベルは、対象において１０ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、９ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、８ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、７ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、６ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、５ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、４ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、３ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、または２ｎｍｏｌ／ｍＬ未満に低減される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与されてから２４時間、対象における前記ＧＬＡ活性は、対象のベースラインＧＬＡ活性または参照のＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増加する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡ活性は、対象の心臓、腎臓、肝臓、または脾臓において増加する。
いくつかの実施形態では、増加したＧＬＡ活性は、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間を超えて持続する。いくつかの実施形態では、増加したＧＬＡ活性は、１週間を超えて、２週間を超えて、３週間を超えて、４週間を超えて、５週間を超えて、または６週間を超えて持続する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与され、対象におけるＧｂ３のレベルは、対象のベースラインＧｂ３レベルまたは参照のＧｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。
いくつかの実施形態では、Ｇｂ３のレベルは、対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される。
いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、血漿、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルまたはリゾ－Ｇｂ３のレベルを、その組織における対象のベースラインレベルまたは参照レベルと比較して４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、８０％～１００％、または９０％～１００％に低減する。
いくつかの実施形態では、対象への投与後、対象におけるＧｂ３のレベルは、対象のベースラインＧｂ３レベルまたは参照のＧｂ３レベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与されてから２４時間、対象におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルは、対象のベースラインリゾ－Ｇｂ３レベルまたは参照のリゾ－Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。
いくつかの実施形態では、リゾ－Ｇｂ３のレベルは、対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される。
いくつかの実施形態では、対象への投与後、対象におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルは、対象のベースラインリゾ－Ｇｂ３レベルまたは参照のリゾ－Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１．５ｍｇ／ｋｇ未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．７５ｍｇ／ｋｇ未満、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量として投与される。
いくつかの実施形態では、対象への投与は、約週１回、約２週間に１回、または約１カ月に１回である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、静脈内投与される。
野生型ＧＬＡのタンパク質配列（パネルＡ）、ドメイン特徴を有する表（パネルＢ）、及びドメイン構造の図式表示（パネルＣ）を示す。 同上。 同上。 野生型ＧＬＡの核酸配列を示す。 野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するウラシル（Ｕ）評価基準を示す。「Ｕ含量（％）」と標示された欄は、％ＵＴＬパラメータに対応する。「Ｕ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＵＷＴに対応する。「Ｕ含量 ｖ．理論上最小（％）」と標示された欄は、％ＵＴＭに対応する。「ＵＵ対ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＵＵＷＴに対応する。 野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するグアニン（Ｇ）評価基準を示す。「Ｇ含量（％）」と標示された欄は、％ＧＴＬに対応する。「Ｇ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＧＷＴに対応する。「Ｇ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％ＧＴＭＸに対応する。 野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するシトシン（Ｃ）評価基準を示す。「Ｃ含量（％）」と標示された欄は、％ＣＴＬに対応する。「Ｃ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＣＷＴに対応する。「Ｃ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％ＣＴＭＸに対応する。 野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）評価基準を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。「Ｇ／Ｃ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＷＴに対応する。「Ｇ／Ｃ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＴＭＸに対応する。 野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成バイアスの間の比較を示す。 ヘマトキシリンで対比染色された、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡで処置された野生型ＣＤ１マウスの肝臓の抗ＧＬＡ免疫組織化学染色を示す。マウスは、ｍＲＮＡの注射の４８時間後に屠殺された。図８は、これらの肝臓切片におけるほんの低い抗ＧＬＡ染色レベルを示す。 ヘマトキシリンで対比染色された、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置された野生型ＣＤ１マウスの肝臓の抗ＧＬＡ免疫組織化学染色を示す。マウスは、ｍＲＮＡの注射の４８時間後に屠殺された。図９は、ＧＬＡ ｍＲＮＡ処置された動物の肝臓の肝細胞及び洞様血管の両方における、高い抗ＧＬＡ染色レベルを示す。 図１０～１０Ｇは、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡ及びＧＬＡ ｍＲＮＡ注射された野生型ＣＤ１マウスの血漿、肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓におけるＧＬＡタンパク質レベルを示す。ベースラインとして、図１０Ａは、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿における経時的なＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ｂは、ＧＬＡ ｍＲＮＡで処置された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿における増加されたＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、それぞれ、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び血漿における、ＧＬＡ ｍＲＮＡと比較してＧＦＰ ｍＲＮＡを投与された野生型マウスのＧＬＡ活性を示す。心臓（図１０Ｃ）、肝臓（図１０Ｄ）、及び腎臓（図１０Ｅ）のおおよその外因性マウスのＧＬＡ活性は、参照のために各図内で点線として示される。ＧＬＡ ｍＲＮＡでの処置後、ＧＬＡ活性レベルの増加が、試験された全ての組織において処置後の２４時間観察された。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１１Ａ及び１１Ｂは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって分析された場合の静脈内投与後７２時間での、ＧＬＡノックアウトマウスの肝臓におけるＧＬＡタンパク質レベルを示す。図１１Ａは、投与されたＧＬＡ ｍＲＮＡの各濃度で観察されたＧＦＰ制御に対する著しいＧＬＡ発現を伴う、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの投与後７２時間の肝臓におけるＧＬＡ発現の投与反応を示す。７２時間でのタンパク質発現の定量化は、図１１Ｂに図示される。 同上。 図１２Ａ～１２Ｄは、ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡでの処置後の血漿中のＧＬＡ活性の投与反応分析を示す。図１２Ａは、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中のＧＬＡ活性と比較した、ＧＬＡ ｍＲＮＡの各投与の経時的なＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ活性の対数グラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、それぞれ、処置後６時間、２４時間、及び７２時間での各投与の血漿中のＧＬＡ活性を示す。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスは、各時点で用量依存的様式で増加されたＧＬＡ活性を示した。 同上。 同上。 同上。 ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡを投与した後６時間の、血漿中のＧＬＡ発現を定量化するために行われたＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＧＬＡ タンパク質が制御ＧＦＰマウスの血漿中で検出されなかった一方で、著しいレベルのＧＬＡタンパク質が、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中で検出された。 図１４Ａ～１４Ｄは、ＧＬＡ ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。各組織において、ＧＬＡ活性は、用量依存的様式でＧＬＡ ｍＲＮＡ処置されたマウスについて高められた。 同上。 同上。 同上。 図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、ＧＬＡ ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ 投与での肝臓、血漿、及び心臓における超生理的（＞１００％）ＧＬＡ活性、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ 投与での腎臓におけるＧＬＡ活性の少なくとも５０％回復を示す。 同上。 同上。 図１６Ａ～１６Ｅは、ＧＬＡ ｍＲＮＡまたは制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスの血漿中及び組織試料におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルを示す。図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇの制御ＧＦＰ ｍＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡの投与後７２時間の、それぞれ、血漿、腎臓、及び心臓におけるリゾ－Ｇｂ３レベルを示す。これらのデータは、ＧＬＡ ｍＲＮＡの単回用量の投与後７２時間の、血漿中のリゾ－Ｇｂ３レベルの用量依存的減少を示す。図１６Ｄ及び１６Ｅは、未処置のノックアウトマウスの血漿、心臓、及び腎臓におけるリゾ－Ｇｂ３レベル対するパーセントとしての、リゾ－Ｇｂ３レベルの用量依存的低減を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 図１６Ｆ、１６Ｇ、及び１６Ｈは、ＧＬＡ機能に関する他の読出しに対する測定されたＧＬＡ活性の図を示す。図１６Ｆ及び１６Ｇは、それぞれ、血漿及び肝臓におけるＧＬＡ発現レベルの測定値に対するＧＬＡ活性の図を示す。両方の場合において、高い程度の相関関係がある（決定係数＞０．９）。これらの結果は、増加されたＧＬＡ発現が、ＧＬＡノックアウトマウスの血液及び組織の両方における増加されたＧＬＡ活性と相関することを示す。図１６Ｈは、ＧＬＡノックアウトマウスにおけるリゾ－Ｇｂ３のレベルに対するＧＬＡ活性の図を示す。この図は、ＧＬＡ ｍＲＮＡの単回用量を投与されたＧＬＡノックアウトマウスにおける、増加されたＧＬＡ活性が、インビボでのファブリー病のバイオマーカーの減少されたレベルと相関することを示す。 同上。 同上。 図１７Ａ、１７Ｂ、及び１７Ｃは、単回用量のＧＬＡ ｍＲＮＡで処置されたＧＬＡ －／－ノックアウトマウスにおけるＧＬＡのバイオマーカーのレベルを示す。図１７Ａは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ ＃１で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示すが、図１７Ｂは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ ＃２３で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示す。両方の場合において、リゾ－Ｇｂ３は、処置後３日間までに血漿中で８０～９０％低減された。リゾ－Ｇｂ３レベルは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ ＃１については、４週間の時間経過全体で初期測定値未満の７０％のレベル（図１７Ａを参照されたい）、及びＧＬＡ－ｍＲＮＡ ＃２３については、６週間の時間経過全体の初期測定値未満の７０％レベル（図１７Ｂを参照されたい）を維持した。図１７Ｃは、ｍＲＮＡの投与の効果を酵素補充療法（ＥＲＴ）の投与と比較する並列試験の結果を示す。ＥＲＴ及びｍＲＮＡ療法の両方は、おおよそ２０％のベースラインレベルにＧｂ３レベルを低減した。図１７Ｃは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ ＃２３で処置されたマウスにおけるＧｂ３血漿レベルが、処置後少なくとも６週間おおよそ２０％のベースラインを維持したと同時に、処置後２～３週間のＥＲＴ－処置マウスにおける血漿Ｇｂ３のレベルの回復を示す。 同上。 同上。 図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、投与後４週間及び６週間の、ＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスの心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓試料におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルを示す。図１８Ａは、処置後４週間の、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の３０～４０％のみを有したこと、ならびに処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の１０～２０％のみを有したことを示す。図１８Ｂは、処置後６週間の、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の４０～４５％のみを有したこと、ならびに処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３のおおよそ２０％を有したことを示す。 同上。 未処置のサルに対して、ＧＬＡ－ｍＲＮＡで処置されたサルの血漿中のＧＬＡ活性レベルの時間経過を示す。ＧＬＡ活性は、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの処置の後約６～１２時間でピークに達した。 複数回投与後、インビボでＧＬＡ活性を促進する、配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ－コードｍＲＮＡの能力を示す。ＧＬＡ活性は、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの各処置の後約６～１２時間でピークに達した。さらに、図２０は、ＧＬＡ活性レベルが、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの第２の処置の後で各時点でＧＬＡ－ｍＲＮＡでの第１の処置の後の同等の時点に対してより高かったことを示す。
本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。ファブリー病は、複数の細胞型のリソソーム内でのグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）及び関連するスフィンゴ糖脂質の進行的蓄積をもたらす、スフィンゴ糖脂質異化作用の遺伝性代謝障害である。ファブリー病は、酵素α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）をコードするＧＬＡ遺伝子の変異によって引き起こされる。ｍＲＮＡ治療薬は、この技術がＧＬＡをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的ＧＬＡタンパク質のデノボ合成を可能にするため、ファブリー病の治療に特によく適している。ｍＲＮＡの標的細胞への送達後、所望のＧＬＡタンパク質が細胞自体の翻訳機構によって発現され、よって、完全に機能的なＧＬＡタンパク質が、欠陥のあるまたは欠損したタンパク質を置き換える。さらに、ｍＲＮＡベースのファブリー病の療法は、ある割合の合成されたＧＬＡが細胞から分泌され、マンノース－６－リン酸受容体を通して受容体介在性エンドサイトーシスによって取り込まれるため、ｍＲＮＡが送達される細胞を超えて広がり得る。
核酸ベースの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）をインビボで送達することに関連する１つの課題は、身体の免疫系が外来性核酸に遭遇するときに生じ得る自然免疫応答に起因する。外来性ｍＲＮＡは、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）によって活性化される、トール様受容体（ＴＬＲ）、特にＴＬＲ７／８を通した認識を介して免疫系を活性化し得る。非免疫細胞においては、外来性ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）により生じ得る。外来性ｍＲＮＡの免疫認識は、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）産生、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）分布及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）応答を含む、不要なサイトカイン作用をもたらし得る。本発明は、免疫活性化を最小限に抑え、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するための、治療的ｍＲＮＡ内での異なる修飾されたヌクレオチドの組み込みを特徴とする。本発明の特定の態様は、タンパク質発現を増大させるための、特にＧＬＡをコードする治療的ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での、自然免疫応答を低減する及び配列最適化のためのヌクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
本発明のｍＲＮＡ治療技術のある特定の実施形態はまた、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した送達も特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡの標的細胞への安全で有効な送達の理想的な土台である。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送及びエンドソーム放出またはエンドソーム脱出を伴う機構によって核酸を送達する、固有の能力を有する。本発明は、インビボ投与されるときに改善された特性を有する、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡと組み合わせた新規のイオン性脂質系ＬＮＰを特徴とする。理論に拘束されることなく、この新規のイオン性脂質系ＬＮＰ製剤は、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出等の改善された特性を有すると考えられる。例えば第１の投与において、全身経路（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）で投与されるＬＮＰは、例えばさらなる投与においてその後注射されるＬＮＰのクリアランスを加速化し得る。この現象は、急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）として知られ、特に治療的関連で欠乏酵素（例えば、ＧＬＡ）を補充する際の主要な課題である。これは、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与がほとんどの事例において、対象（例えば、ファブリー病を患う対象）の標的組織内で必要な酵素レベルを維持するのに必須であるためである。反復投与の課題は、複数のレベルで対処することができる。ｍＲＮＡ操作及び／またはＬＮＰによる効率的な送達は、第１の用量投与後に発現されるタンパク質（例えば、ＧＬＡ）の増加したレベル及びまたはその持続時間の増大をもたらし得、これが今度は、第１の用量とその後の投薬との間の時間を延長し得る。ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的には、本来一過性であり、ＡＢＣの根底をなす免疫応答は、全身投与から十分な時間がたつと解消することが知られている。したがって、一態様において本発明のｍＲＮＡ治療薬の全身送達後にタンパク質発現及び／または活性の持続期間を増加させることで、ＡＢＣ減少に対抗する。その上、ＬＮＰを操作して、免疫検知及び／または認識を回避することができ、故に、後続の投与または反復投薬時のＡＢＣをさらに回避することができる。本発明の例となる態様は、低減されたＡＢＣを有するように操作された新規のＬＮＰを特徴とする。
１．α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）は、ホモ二量体グリコシド加水分解酵素である４８，７６７Ｄａのポリペプチドである。それは、糖脂質及び糖タンパク質からの末端アルファ－ガラクトシル部分を加水分解する。ＧＬＡは、ヒトにおけるＧＬＡ遺伝子によってコードされる。
ＧＬＡ遺伝子の変異は、α－ガラクトシダーゼＡの合成、プロセシング、及び安定性に影響を及ぼし得、まれなリソソーム蓄積障害であるファブリー病及びスフィンゴリピドーシスを引き起こし得る。ファブリー病は、アルファ－Ｄ－ガラクトシル糖脂質部分を異化することの不具合からもたらされ、糖脂質が多くの組織において蓄積するというスフィンゴ糖脂質異化の先天性異常を伴う。ファブリー病を有する患者では、血漿中のグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）及び関連するスフィンゴ糖脂質、ならびに細胞リソソームが全身にわたって全身的かつ進行的に蓄積する。例えば、ファブリー病の患者のある研究では、罹患した患者において平均Ｇｂ３血漿中濃度が１１．４±０．８ｎｍｏｌ／ｍＬであることが見出された。Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ ａｎｄ Ｏ’Ｂｒａｄｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３６ ｉｎ Ｆａｂｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ５ Ｙｅａｒｓ ｏｆ ＦＯＳ（Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ ＰｈａｒｍａＧｅｎｅｓｉｓ；２００６）。ファブリー病を有する男性は、体幹下部にわたって特徴的な皮膚病変（角化血管腫）を有する。眼内蓄積、熱性発作、四肢の灼熱痛が生じ得る。腎不全、ならびに高血圧による心臓もしくは脳の合併症または他の血管疾患は死につながり得る。角膜混濁等の特徴を伴う軽減されたファブリー病の形態が、ヘテロ接合型である女性において存在し得る。
野生型ＧＬＡ標準ｍＲＮＡ配列のコード配列（ＣＤＳ）は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）にて受託番号ＮＭ＿０００１６９．２（「Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）、ｍＲＮＡ」）の下に記載される。野生型ＧＬＡ標準タンパク質配列は、ＲｅｆＳｅｑデータベースにて受託番号ＮＰ＿０００１６０（「アルファ－ガラクトシダーゼＡ前駆体［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］」）の下に記載される。ＧＬＡタンパク質は、４２９アミノ酸長である。ＲｅｆＳｅｑ配列における参照タンパク質配列をコードする具体的な核酸配列は、それぞれのＲｅｆＳｅｑデータベースエントリにおいて示されるコード配列（ＣＤＳ）であることに留意する。
ある特定の態様では、本発明は、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡ配列と比べて置換、ならびに挿入及び／または付加、欠失及び／または共有結合修飾を含む、バリアント、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、配列タグまたはアミノ酸が、例えば、局在化のために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基が任意選択で欠失されて、断片をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ、２つ、３つまたは３つよりも多くの置換を含み得る、ＧＬＡ配列の置換バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
当業者に認識されるように、ＧＬＡタンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、及び同種タンパク質（オルソログ）もまた、本発明のＧＬＡポリペプチドの範囲内にあると見なされる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例が、ヒト野生型ＧＬＡのアミノ酸配列を示す、図１に示される。
２．ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、ファブリー病の治療（すなわち、予防的及び／または治療的治療）において使用するためのｍＲＮＡを特徴とする。本発明における使用のために特徴が示されるｍＲＮＡは、対象に投与され、インビボでヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）タンパク質（複数可）をコードする。したがって、本発明は、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、そのアイソフォーム、その機能的断片、及びＧＬＡを含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列最適化される。特定の実施形態では、本発明は、ヒトＧＬＡのポリペプチド配列、または配列最適化ポリヌクレオチドとの高い配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチドを含む、配列最適化ポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の態様では、本発明は、１つ以上のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコードされるＧＬＡポリペプチドは、下記から選択することができる。
（ｉ）完全長ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型ＧＬＡと同じまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）野生型ＧＬＡの機能的断片（例えば、野生型ＧＬＡよりも短いが、依然としてＧＬＡ酵素活性を保持する、切詰め（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つ以上のアミノ酸が置き換えられた完全長または切詰めタンパク質、例えば、野生型ＧＬＡのＧＬＡ活性の全てまたはほとんどを保持するバリアント）、または
（ｉｖ）（ｉ）完全長ＧＬＡタンパク質、機能的断片またはそのバリアント、及び（ｉｉ）異種タンパク質を含む融合タンパク質。
ある特定の実施形態では、コードされるＧＬＡポリペプチドは、哺乳類ＧＬＡポリペプチド、例えば、ヒトＧＬＡポリペプチド、その機能的断片またはバリアントである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞に導入されたとき、それらの細胞におけるＧＬＡタンパク質発現レベル及び／または検出可能なＧＬＡ酵素活性レベルを、本発明のポリヌクレオチドの投与前の細胞におけるＧＬＡタンパク質発現レベル及び／または検出可能なＧＬＡ酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加させる。ＧＬＡタンパク質発現レベル及び／またはＧＬＡ酵素活性は、当該技術分野で既知の方法に従って測定することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビボで細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＧＬＡ、例えば、野生型ヒトＧＬＡ（配列番号１、図１を参照されたい）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、このコドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＧＬＡ配列から得られる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＧＬＡの完全長配列（すなわち、イニシエーターメチオニンを含む）を有するＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟ヒトＧＬＡにおいて、イニシエーターメチオニンを除去して、翻訳産物の２～４２９のアミノ酸残基を含む 「成熟ＧＬＡ」を得ることができる。代替的に、シグナルペプチドを除去して、翻訳産物のアミノ酸残基３２～４２９を得ることができる。ヒトＧＬＡの完全配列（アミノ酸１～４２９）を対象とする本開示の教示はまた、イニシエーターメチオニンを欠いたヒトＧＬＡの成熟型（アミノ酸１～４２９）及びシグナルペプチドを欠いたヒトＧＬＡ（アミノ酸３２～４２９）にも適用可能である。故に、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＧＬＡの成熟配列（すなわち、イニシエーターメチオニンを欠いた）を有するＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、シグナルペプチドを欠いたＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＧＬＡの完全長もしくは成熟配列を有するＧＬＡをコードする、またはシグナルペプチドを欠いたＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡ配列の少なくとも１つの点突然変異を含み、かつＧＬＡ酵素活性を保持するＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡ（すなわち、同じ野生型ＧＬＡであるが、変異（複数可）を有しない）のＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である、ＧＬＡ活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡ酵素活性を改変しない変異を有するＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。かかる変異体ＧＬＡポリペプチドは、機能的に中立と称され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能的に中立な点の突然変異を含む変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡよりも高いＧＬＡ酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡ（すなわち、同じ野生型ＧＬＡであるが、変異（複数可）を有しない）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い、ＧＬＡ活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、１つ以上の断片が野生型ＧＬＡポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、ＧＬＡ酵素活性を保持する、機能的ＧＬＡ断片をコードする、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡ断片は、対応する完全長ＧＬＡのＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である、ＧＬＡ活性を有する。いくつかの実施形態では、機能的ＧＬＡ断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する完全長ＧＬＡよりも高いＧＬＡ酵素活性を有するＧＬＡ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。故に、いくつかの実施形態ＧＬＡ断片は、対応する完全長ＧＬＡのＧＬＡ活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い、ＧＬＡ活性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＧＬＡよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＧＬＡ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列との少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。表２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列との７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、８０％～８５％、８５％～９０％、８５％～９５％、または９０％～９５％の配列同一性を有する。表２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするＯＲＦを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１１９～１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択される配列との７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、７０％～９５％、８０％～９５％、７０％～８５％、７５％～９０％、８０％～９５％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、または９５％～１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。表５を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号２（例えば、図２を参照されたい）の配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号２（例えば、図２を参照されたい）の配列と７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８１％～１００％、８２％～１００％、８３％～１００％、８４％～１００％、８５％～１００％、８６％～１００％、８７％～１００％、８８％～１００％、８９％～１００％、９０％～１００％、９１％～１００％、９２％～１００％、９３％～１００％、９４％～１００％、９５％～１００％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、８０％～８５％、８５％～９０％、８５％～９５％、または９０％～９５％同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００～約１００，０００（例えば、９００～１，０００、９００～１，１００、９００～１，２００、９００～１，３００、９００～１，４００、９００～１，５００、１，０００～１，１００、１，０００～１，１００、１，０００～１，２００、１，０００～１，３００、１，０００～１，４００、１，０００～１，５００、１，１９４～１，４００、１，１９４～１，６００、１，１９４～１，８００、１，１９４～２，０００、１，１９４～３，０００、１，１９４～５，０００、１，１９４～７，０００、１，１９４～１０，０００、１，１９４～２５，０００、１，１９４～５０，０００、１，１９４～７０，０００、１，１９４～１００，０００、１，２８７～１，４００、１，２８７～１，６００、１，２８７～１，８００、１，２８７～２，０００、１，２８７～３，０００、１，２８７～５，０００、１，２８７～７，０００、１，２８７～１０，０００、１，２８７～２５，０００、１，２８７～５０，０００、１，２８７～７０，０００、または１，２８７～１００，０００）ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，１９４、１，２００、１，２５０、１，２８７、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、１，９５９、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、または最大１００，０００ヌクレオチド）である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、非コーディング、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位である少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’－ＵＴＲ（例えば、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７の配列から選択される）及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０の配列から選択される）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１１９～１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体）と、ポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）とを含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号８１、８２、１０３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１本鎖または２本鎖であるＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＧＬＡポリペプチドをコードし、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボで翻訳されて、コードされたＧＬＡポリペプチドをもたらすことができる、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
３．シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はまた、コードされるポリペプチドが治療的に関連性のある部位へ輸送されるのを容易にする追加の特徴をコードする、ヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を補助する１つのかかる特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含めて、多様な名称で知られている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、任意選択でコード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）にそれぞれ組み込まれる、約９～２００ヌクレオチド（３～７０アミノ酸）長である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列を追加することで、コードされたポリペプチドが、１つ以上の標的化経路を通して小胞体またはミトコンドリア等の所望の部位へと輸送されるようになる。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後、例えばシグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチドをコードする核酸配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
４．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする１つを超える核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１つを超えるＯＲＦ、例えば、ＧＬＡポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第１のＯＲＦと、第２の目的のポリペプチドを発現する第２のＯＲＦとを含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の目的のポリペプチドが遺伝子融合され得る、すなわち、２つ以上のポリペプチドが同じＯＲＦによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー（例えば、Ｇ４Ｓペプチドリンカーまたは当該技術分野で既知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くのＯＲＦを含み得、各々が目的のポリペプチドを発現する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）と、第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）とを含み得る。
５．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチド、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。配列最適化の一態様
配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするコドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、野生型ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）に対して少なくとも１つの同義ヌクレオ塩基置換を含む配列である。
配列最適化ヌクレオチド配列は、配列が参照配列とは部分的にまたは完全に異なり得る。例えば、ＴＣＴコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列を、そのヌクレオ塩基１００％を置換させることによって（各コドンにつき、１位のＴをＡで置き換え、２位のＣをＧで置き換え、３位のＴをＣで置き換える）配列最適化して、ＡＧＣコドンによって一様にコードされようポリセリンをコードする配列を得ることができる。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の対合的グローバルアラインメントから得られる配列同一性のパーセンテージは、０％であろう。しかしながら、両配列からのタンパク質産物は、１００％同一であろう。
いくつかの配列最適化（ときにコドン最適化とも称される）方法が、当該技術分野で知られており（及び下記でより詳細に考察され）、１つ以上の所望の結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果には、例えば、適切な折り畳みが確実となるような、ある特定の組織標的及び／または宿主生物におけるコドン頻度の一致；ｍＲＮＡ安定性を増加させるもしくは二次構造を低減するようなＧ／Ｃ含量の偏り；遺伝子構築もしくは発現を損ない得る縦列型反復コドンもしくは塩基の連なりの最小化；転写及び翻訳制御領域のカスタマイズ；タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去；コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／付加；タンパク質ドメインの付加、除去もしくはシャフリング；制限部位の挿入もしくは欠失；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位の修飾；タンパク質の種々のドメインが適切に折り畳まれるようにする翻訳率の調整；及び／またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造の低減もしくは排除が含まれ得る。配列最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。
各アミノ酸についてのコドン選択肢が表１に提供される。
Figure 2022136230000028
Figure 2022136230000029
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、この配列最適化ヌクレオチド配列によってコードされたＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントは、（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされたＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントと比較して）改善された特性、例えば、インビボ投与後の発現効率に関連する改善された特性を有する。かかる特性には、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織における翻訳有効性の増加、切り詰められた発現タンパク質の数の低減、発現タンパク質の折り畳みの改善またはその誤った折り畳みの防止、発現産物の毒性の低減、発現産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増加及び／または減少が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化され、当該技術分野における問題のうちの１つ以上を回避する構造的及び／または化学的特徴、例えば、構造的及び機能的統合性を保持しながらの核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達の最適化；発現の閾値の克服；発現率の改善；半減期及び／またはタンパク質濃度；タンパク質局在化の最適化；ならびに免疫応答及び／または分解経路等の有害な生体応答の回避に有用である特徴を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、下記を含む方法に従って配列最適化される、ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチド、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。
（ｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、ウリジン含量を増加または減少させるように代替のコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成すること、
（ｉｉ）同義コドン組において参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、より高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、Ｇ／Ｃ含量を増加させるように代替のコドンで置換すること、あるいは
（ｉｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの改善された特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化方法は、多パラメータにより、本明細書に開示される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多くの方法及び／または当該技術分野で既知の他の最適化方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態で有益と見され得る特徴は、該ポリヌクレオチドの領域によって、またはその領域内でコードされ得、かかる領域は、ＧＬＡポリペプチドをコードする領域の上流（５’）、その下流（３’）、または領域内にあり得る。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後にポリヌクレオチドに組み込むことができる。かかる特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、Ｋｏｚａｋ配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡ尾部、及び検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、Ｘｂａｌ認識を有し得る複数のクローンニング部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る、２つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る、２つ以上のｍｉＲＮＡを含む。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位の任意の部分（どの部分もなしを含めて）が配列最適化され得、独立して、配列最適化の前及び／または後に１つ以上の異なる構造または化学修飾を含むことができる。
いくつかの実施形態では、最適化後、ポリヌクレオチドは、再構成され、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体等であるがこれらに限定されないベクターに形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドは、再構成され、化学的に適格なＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、トウモロコシ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ等に形質転換され得、ここで高コピーのプラスミド様または染色体構造が本明細書に記載の方法によって生じる。
６．ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されたものである。
ヒトＧＬＡをコードする例となる配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号３～２７として記載される（それぞれＧＬＡ－ＣＯ０１、ＧＬＡ－ＣＯ０２、ＧＬＡ－ＣＯ０３、ＧＬＡ－ＣＯ０４、ＧＬＡ－ＣＯ０５、ＧＬＡ－ＣＯ０６、ＧＬＡ－ＣＯ０７、ＧＬＡ－ＣＯ０８、ＧＬＡ－ＣＯ０９、ＧＬＡ－ＣＯ１０、ＧＬＡ－ＣＯ１１、ＧＬＡ－ＣＯ１２、ＧＬＡ－ＣＯ１３、ＧＬＡ－ＣＯ１４、ＧＬＡ－ＣＯ１５、ＧＬＡ－ＣＯ１６、ＧＬＡ－ＣＯ１７、ＧＬＡ－ＣＯ１８、ＧＬＡ－ＣＯ１９、ＧＬＡ－ＣＯ２０、ＧＬＡ－ＣＯ２１、ＧＬＡ－ＣＯ２２、ＧＬＡ－ＣＯ２３、ＧＬＡ－ＣＯ２４、及びＧＬＡ－ＣＯ２５。ヒトＧＬＡをコードするさらなる例となる配列最適化ヌクレオチド配列が表２に示される。いくつかの実施形態では、配列番号３～２７として記載されるまたは表２に示される配列最適化ＧＬＡ配列、その断片、及びバリアントを使用して、本明細書に開示される方法を実施する。いくつかの実施形態では、表２における配列最適化ＧＬＡ配列、その断片及びバリアントは、図１～２に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替となる。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端へと、下記を含む。
（ｉ）本明細書に提供される５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、
（ｉｉ）本明細書に提供される配列、例えば、配列番号３３等の５’ＵＴＲ、
（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９として記載される、または表２に示されるＧＬＡをコードする配列最適化核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの停止コドン；
（ｖ）本明細書に提供される配列、例えば、配列番号８１、８２、または１０３等の３’ＵＴＲ、ならびに
（ｖｉ）上記で提供されるポリＡ尾部。
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本明細書に開示される配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは明確に異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、固有の組成特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする）におけるウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージは、参照の野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して変更される（例えば、低減される）。かかる配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、ある配列におけるウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることによって決定することができる。いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列は、参照の野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量は、参照の野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量を超え、かつ依然として有益な効果、例えば、参照の野生型配列と比較した場合に増加した発現及び／または低減されたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を維持する。
野生型ＧＬＡのウラシルまたはチミン含量は約２６％である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量は、２６％未満である。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量は、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、または１１％未満である。いくつかの実施形態では、ウラシルまたはチミン含量は、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、または１２％以上である。本明細書に開示される配列のウラシルまたはチミン含量、すなわち、その総ウラシルまたはチミン含量は、本明細書で％ＵＴＬまたは％ＴＴＬと略称される。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１２％～２６％、１３％～２６％、１３％～２５％、１４％～２５％、１４％～２４％、１５％～２４％、１５％～２３％、１６％～２３％、１６％～２２％、１６％～２１％、１６％～２０％、１６％～１９％、１６％～１８％、または１６％～１７％である。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１５％～１９％、１６％～１９％、または１６％～１８％である。
特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１６％～約１８％である。
本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）におけるウラシルもしくはチミン含量と比べたそのウラシルもしくはチミン含量に従って、または野生型タンパク質配列（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）をコードする核酸の理論上最小ウラシルもしくはチミン含量と比べたそのウラシルもしくはチミン含量に従って、説明することもできる。
「野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量と比べたウラシルまたはチミン含量」という語句は、配列最適化核酸におけるウラシルまたはチミンの数を対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略称される。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％～８０％、５１％～７９％、５２％～７８％、５３％～７７％、５４％～７６％、５５％～７５％、５６％～７４％、５７％～７３％、５８％～７２％、５９％～７１％、６０％～７０％、６１％～７０％、または６２％～７０％である。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６０％～７２％、６０．２％～７１．８％、６０．４％～７１．６％、６０．６％～７１．４％、６０．８％～７１．２％、６１％～７１％、６１．２％～７０．８％、６１．４％～７０．６％、６１．６％～７０．４％、６１．８％～７０．２％、または６２％～７０％である。
特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６２％～約７０％、例えば、６２．７３％～６９．７０％である。
ウラシルまたはチミン理論上最小量と比べたウラシル含量またはチミン含量とは、配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの数を、仮想的配列におけるコドン全てが可能な限り低いウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられた、仮想的ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略称される。
ＤＮＡの場合、チミンがウラシルの代わりに存在することが認識されるため、Ｕが現れる位置をＴで置換することになる。故に、例えば、ＲＮＡに関する％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連する全ての開示は、ＤＮＡに関する％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに同等に適用可能である。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、３００％を下回る、２９５％を下回る、２９０％を下回る、２８５％を下回る、２８０％を下回る、２７５％を下回る、２７０％を下回る、２６５％を下回る、２６０％を下回る、２５５％を下回る、２５０％を下回る、２４５％を下回る、２４０％を下回る、２３５％を下回る、２３０％を下回る、２２５％を下回る、２２０％を下回る、２１５％を下回る、２００％を下回る、１９５％を下回る、１９０％を下回る、１８５％を下回る、１８０％を下回る、１７５％を下回る、１７０％を下回る、１６５％を下回る、１６０％を下回る、１５５％を下回る、１５４％を下回る、１５３％を下回る、１５２％を下回る、１５１％を下回る、１５０％を下回る、１４９％を下回る、１４８％を下回る、１４７％を下回る、１４６％を下回る、１４５％を下回る、１４４％を下回る、１４３％を下回る、１４２％を下回る、１４１％を下回る、１４０％を下回る、１３９％を下回る、１３８％を下回る、１３７％を下回る、１３６％を下回る、１３５％を下回る、１３４％を下回る、１３３％を下回る、１３２％を下回る、１３１％を下回る、１３０％を下回る、１２９％を下回る、１２８％を下回る、１２７％を下回る、１２６％を下回る、１２５％を下回る、１２４％を下回る、１２３％を下回る、１２２％を下回る、１２１％を下回る、または１２０％を下回る。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列％ＵＴＭは、１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、１２５％を上回る、または１２６％を上回る、１２７％を上回る、１２８％を上回る、１２９％を上回る、または１３０％を上回る、１３５％を上回る、１３０％を上回る、１３１％を上回る、１３２％を上回る、１３３％を上回る、１３４％を上回る、１３５％を上回る、１３６％を上回る、１３７％を上回る、１３８％を上回る、１３９％を上回る、または１４０％を上回る、１４１％を上回る、１４２％を上回る、１４３％を上回る、１４４％を上回る、１４５％を上回る、１４６％を上回る、１４７％を上回る、１４８％を上回る、１４９％を上回る、または１５０％を上回る。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、１３１％～１３２％、１３０％～１３３％、１２９％～１３４％、１２８％～１３５％、１２７％～１３６％、１２６％～１３７％、１２５％～１３８％、１２４％～１３９％、１２３％～１４０％、１２２％～１４１％、１２１％～１４２％、１２０％～１４３％、１１９％～１４４％、１１８％～１４５％、または１１７％～１４６％である。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、約１２３％～約１３８％、例えば、１２３％～１３８％である。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、低減された数の連続ウラシルを有する。例えば、２つの連続ロイシンは、４つのウラシルクラスタを含む、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、例えばＣＵＧＣＵＣで置換することができ、これによりウラシルクラスタを除去する。
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。故に、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣにより置き換えられたとしても、同義コドンは依然としてウラシル対（ＵＵ）を含む。したがって、ある配列におけるフェニルアラニンの数は、コードされるポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させることなしには除去され得ないウラシル対（ＵＵ）の最小数を確立する。例えば、ポリペプチド、例えば、野生型ＧＬＡが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のフェニルアラニンを有する場合、ポリペプチド、例えば、野生型ＧＬＡをコードするウラシル修飾配列が含むことができるウラシル対（ＵＵ）の絶対最小数は、それぞれ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個である。
野生型ＧＬＡは、５個のウラシル対（ＵＵ）、及び１２個のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、低減された数のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を含むか、それを全く含まない。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）に対して、低減された数のウラシル対（ＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列における可能な限り最小数のウラシル対（ＵＵ）、例えば、野生型ＧＬＡの場合は１１個のウラシル対に対応する、ウラシル対（ＵＵ）を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）の数よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個少ないウラシル対（ＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１１～２７個のウラシル対（ＵＵ）を有する。
「野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）と比べたウラシル対（ＵＵ）」という語句は、配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシル対（ＵＵ）の数を対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシル対（ＵＵ）の総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＵｗｔと略称される。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満の％ＵＵｗｔを有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔ１６％～５８％を有する。特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔ２１％～５３％を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むウラシル修飾配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
いくつかの実施形態では、％ＧＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対する、ＧＬＡをコードする配列最適化ＯＲＦのグアニン含量」は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％～約８５％、約７０％～約８０％、約７１％～約８０％、または約７２％～約８０％である。
いくつかの実施形態では、％ＣＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量」は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６５％～約８０％、約７０％～約８０％、または約７０％～約７６％である。
いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含量（Ｇ／Ｃ）」は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９５％である。
いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＷＴと略称される、「対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べたＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量」は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１２５％である。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおける３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量よりも少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％高い。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されたものであり、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの各々は、単独でまたはそれらの組み合わせで、（ｉ）パラメータの最大値（ＭＡＸ）プラス標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０に対応する最大値と、（ｉｉ）パラメータの最小値（ＭＩＮ）マイナス標準偏差（ＳＴＤ ＤＥＶ）０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０に対応する最小値との間の範囲である。
７．配列最適化のための方法
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列最適化される。配列最適化ヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書で「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードする野生型配列）に対して、少なくとも１つのコドン修飾を含む。故に、配列最適化核酸において、少なくとも１つのコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）における対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化核酸は、少なくとも、参照配列におけるコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含む工程によって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列における各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することによって、または規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合、グリシンは、ある特定のコドンによってコードされるが、それが極性アミノ酸の隣にある場合、それは別のコドンによってコードされる）を適用することによって、達成される。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（不安定化モチーフの置換）等、厳密にはコドン最適化を対象としない追加の最適化工程を含む。これらの配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤が、機能的に活性なＧＬＡのインビボ発現を促進するために、必要のある対象に投与され得る。
細胞培養物中での大分子の組換え発現は、多数の制限（例えば、不十分なタンパク質発現レベル、切詰め発現産物をもたらす停滞した翻訳、タンパク質の誤った折り畳み等）を伴う困難なタスクであり得る。これらの制限は、機能的に活性なＧＬＡをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）またはそれを含む組成物もしくは製剤を、ファブリー病を患う患者に投与して、ファブリー病を治療するＧＬＡポリペプチドの合成及び送達が内因性で起こるようにすることによって、低減または回避することができる。
インビトロ発現系（例えば、細胞培養）からインビボ発現への変更は、治療剤をコードする核酸配列の再設計を必要とする。コードされるアミノ酸配列を必ずしも改変することなく異なるコドンを選択することによって、天然に生じる遺伝子配列を再設計することにより、しばしばタンパク質発現レベルの劇的な増加がもたらされ得る（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２， ３４６－５３）。コドン・アダプテーション指標（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ、ＣＡＩ）、ｍＲＮＡ二次構造、シス－調節配列、ＧＣ含量等の可変要素及びその他多くの同様の可変要素が、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６，”Ｊｏｕｒｎａｌ／ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７， ２８５）。しかしながら、遺伝子コードの縮重に起因して、全てが同じ治療剤をコードし得る、多数の異なる核酸配列が存在する。各アミノ酸は、最大６つの同義コドンによってコードされるため、これらのコドン間での選択は、遺伝子発現に影響を及ぼす。さらに、コドン使用頻度（すなわち、異なる生物がポリペプチド配列の発現のためにコドンを使用する頻度）は、生物間で異なる（例えば、ヒトまたはヒト化治療抗体の組換え生産は、ハムスター細胞培養物中で行われることが多い）。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、コドンマップを適用することによって配列最適化され得る。当業者であれば、下記で開示されるコドンマップのＴ塩基がＤＮＡにおいて存在する一方で、対応するＲＮＡにおいてはＴ塩基はＵ塩基で置き換えられることを理解する。例えば、ＤＮＡ形態での本明細書に開示される配列最適化核酸、例えば、ベクターまたはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）テンプレートは、対応する転写ｍＲＮＡにおいてはそのＴ塩基がＵ塩基として転写される。この点で、配列最適化ＤＮＡ配列（Ｔを含む）及びそれらの対応するＲＮＡ配列（Ｕを含む）の両方が、本発明の配列最適化核酸と見なされる。当業者であれば、１つ以上の塩基を非天然塩基で置き換えることによって同等のコドンマップが生成され得ることも理解する。故に、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これが今度は、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられたＲＮＡマップ）に対応し得る。
一実施形態では、ＧＬＡをコードする参照配列は、ある特定のアミノ酸をコードする全てのコドンを、コドンマップで提供される代替のコドンのうちの１つのみで置き換えることによって最適化され得る。例えば、最適化配列における全てのバリンは、ＧＴＧまたはＧＴＣまたはＧＴＴによってコードされる。
本発明の配列最適化ポリヌクレオチドは、１つ以上のコドン最適化方法、またはそれらの組み合わせを用いることによって生成され得る。核酸配列を配列最適化するのに用いられ得る配列最適化方法が、本明細書で詳述される。この方法の列挙は、包括的でも限定的でもない。
例えば、参照核酸配列の一部の領域に対する高Ｇ／Ｃ含量配列最適化または他の領域に対するウリジン含量配列最適化、ならびに配列全体にわたる二次構造を最小化するためまたは有害なモチーフを排除するための標的化されたヌクレオチド変異等の、下記で考察される配列最適化方法の一つひとつに関して記載される設計の原則及び規則は、多くの異なる方式で組み合わされ得ることが理解される。
配列最適化方法の潜在的な組み合わせの選定は、例えば、合成ポリヌクレオチドを生産するために使用される特定の化学反応に依存し得る。かかる選定はまた、配列最適化核酸によってコードされるタンパク質、例えば、全配列、機能的断片、またはＧＬＡを含む融合タンパク質等にも依存し得る。いくつかの実施形態では、かかる選定は、配列最適化核酸（例えば、治療的合成ｍＲＮＡ）によって標的とされる特定の組織または細胞に依存し得る。
配列最適化方法、または最適化方法の適用及び分析から導出された設計規則を組み合わせる機構は、単純な場合も、複雑な場合もある。例えば、組み合わせは下記であり得る。
（ｉ）逐次的：各配列最適化方法または設計規則の各組が、全体的配列のうちの異なる部分配列に適用される、例えば、コドン１～３０位においてウリジンを低減し、次いでその配列の残りの部分について高頻度コドンを選択する、
（ｉｉ）階層的：いくつかの配列最適化方法または設計規則の組が、階層的、確定的様式で組み合わされる。例えば、最もＧＣリッチなコドンを使用して、それらのコドンのうち最も頻繁なものを選定することによって連結（共通である）を破断する。
（ｉｉｉ）多因子的／多パラメータ的：機械学習または他のモデリング手法を用いて、複数の重複する及びことによると矛盾する要件を最もよく満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、いくつかの数学的手法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用するコンピュータの使用を必要とする。
最終的には、これらのアプローチの一つひとつが特定の規則の組をもたらし得、これは多くの場合、単一のコドン表、すなわち、標的タンパク質（すなわち、ＧＬＡ）における各アミノ酸に対して選別され、特定の規則または規則の組が各アミノ酸位に対する特定のコドンの選択方法を示す、コドン一覧に要約され得る。
ａ．ウリジン含量最適化
核酸配列における局所的に高濃度のウリジンの存在は、とりわけ、修飾されたウリジン類似体が合成ｍＲＮＡの生産において使用される場合、例えば、緩徐なまたは未成熟で終結した翻訳等、翻訳に有害な影響を有し得る。さらに、高ウリジン含量はまた、ＴＬＲ活性化に起因して合成ｍＲＮＡのインビボ半減期を低減し得る。
したがって、核酸配列は、少なくとも１つのウリジン含量最適化工程を含む方法を用いて配列最適化され得る。かかる工程は、例えば、参照核酸における少なくとも１つのコドンを代替のコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含み、このウリジン修飾配列は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する。
（ｉ）全体的なウリジン含量の増加または減少
（ｉｉ）局所的なウリジン含量の増加または減少（すなわち、ウリジン含量の変化は、特定の部分配列に限定される）、
（ｉｉｉ）全体的なウリジン含量を変化させることのないウリジン分布の変化、
（ｉｖ）ウリジンクラスタリングの変化（例えば、クラスターの数、クラスターの箇所、またはクラスター間の距離）、あるいは
（ｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含量を最適化すること、すなわち、配列最適化核酸におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージを、参照核酸配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して最適化することを含む。例えば、参照配列においてヌクレオ塩基の３０％がウリジンであり得、配列最適化核酸においてヌクレオ塩基の１０％がウリジンであり得る。
他の実施形態では、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的ウリジン含量を低減する、すなわち、配列最適化核酸の部分配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージを、参照核酸配列の対応する部分配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して低減することを含む。例えば、参照核酸配列が、局所的ウリジン含量３０％である５’末端領域（例えば、３０コドン）を有し得、配列最適化核酸においては同じ領域におけるウリジン含量が１０％に低減され得る。
具体的な実施形態では、コドンが、参照核酸配列において、例えば、タンパク質翻訳に有害な影響を有し得るウリジンクラスターの数、サイズ、箇所、または分布を低減または変更するために置き換えられ得る。原則として、参照核酸配列のウリジン含量を低減することが望ましいが、ある特定の実施形態では、参照核酸配列のいくつかの部分配列のウリジン含量、特に局所的ウリジン含量は、増加され得る。
翻訳に対する悪影響を回避するためのウリジン含量の低減は、他の設計目的を達成するために本明細書に開示される他の最適化方法と組み合わせて行うことができる。例えば、ほとんどのアミノ酸に対して最もまれなコドンの使用は、少数の例外を除いて、Ｕ含量を低減するため、ウリジン含量最適化を傾斜設計と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較したときにより低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘発するように設計される。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識してそれに応答する。ウイルスの頻繁な構成要素である、２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡが、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ， ４１３：７３２－７３８及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．， １０：１３６６－１３７３を参照されたい。１本鎖（ｓｓ）ＲＮＡはＴＬＲ７を活性化する。Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３ ：１５２９－１５３１を参照されたい。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。Ｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１５２６－１５２９を参照されたい。細菌及びウイルスＤＮＡに特徴的な、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ， ４０８：７４０－７４５を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「ＴＬＲ応答」という用語は、ＴＬＲ７受容体による１本鎖ＲＮＡの認識として定義され、いくつかの実施形態では、この受容体による１本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされるＲＮＡの分解及び／または生理的応答を包含する。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合の決定及び定量方法は、当該技術分野で知られている。同様に、ＲＮＡがＴＬＲ７媒介性生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）を誘発したかどうかの決定方法は、当該技術分野で周知のことである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりにＴＬＲ３、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９によって媒介され得る。
ＴＬＲ７媒介性応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成することができる。ＲＮＡは、自然界で１００を超える様々なヌクレオシド修飾を経る（ｍｏｄｓ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕにて利用可能なＲＮＡ修飾データベースを参照されたい）。例えば、ヒトｒＲＮＡは、細菌ｒＲＮＡよりも１０倍多いシュードウリジン（Ψ）及び２５倍多い２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡはヌクレオシド修飾を含まない一方で、哺乳類ｍＲＮＡは、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン及び多くの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド等の修飾されたヌクレオシドを有する。
ＲＮＡを定義する２つの特徴である、ウラシル及びリボースは両方ともＴＬＲ７刺激に必要かつ十分であり、短い１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、近接したいくつかのウリジンを含有する限り、配列依存的様態でＴＬＲ７アゴニストとして作用する。Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：３２５６－３２６７を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される最適化方法のうちの１つ以上は、ＴＬＲ７媒介性応答を低減または抑制するために、ウリジン含量（局所的に及び／または局所的に）を低減すること、及び／またはウリジンクラスタリングを低減もしくは調節することを含む。
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列によって引き起こされるＴＬＲ応答（例えば、ＴＬＲ７によって媒介される応答）は、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答は、ウリジン修飾配列によって引き起こされるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高い。
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（全体的ウリジン含量平均）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対または相対）よりも高い。したがって、いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％多くのウリジンを含む。
他の実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（平均全体的なウリジン含量）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対または相対）よりも低い。したがって、いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低いウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（平均全体的なウリジン含量）（絶対または相対）は、ウリジン修飾配列における総ヌクレオ塩基の５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量は、約１０％～約２０％である。いくつかの特定の実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量は、約１２％～約１６％である。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列のウリジン含量は、スライディング・ウィンドウを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、４０ヌクレオ塩基長を上回る。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、２０ヌクレオ塩基長である。スライディング・ウィンドウで測定されるウリジン含量に基づいて、参照核酸配列及び配列最適化核酸の全長にわたるウリジン含量を表すヒストグラムを生成することが可能である。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、ヒストグラムにおけるある特定のパーセンテージ値を上回るまたは下回るピークを低減または排除するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、スライディング・ウィンドウ表示における６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％ウリジンを上回るピークを排除するように修飾され得る。別の実施形態では、参照核酸配列は、２０ヌクレオ塩基スライディング・ウィンドウを使用して測定した場合に、配列最適化核酸において３０％ウリジンを上回るピークが何もないように、修飾され得る。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、２０ヌクレオ塩基スライディング・ウィンドウを使用して測定した場合に、ある特定の閾値を上回るまたは下回るピークが、配列最適化核酸配列において既定の数よりも多いまたはそれよりも少ないことのないように、修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、配列最適化核酸において１０％、１５％、２０％、２５％または３０％ウリジンを上回るピークが何もないように、またはピークが１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を超えないように、修飾され得る。別の実施形態では、配列最適化核酸は、ウリジン含量３０％以上のピーク０個の～ピーク２個を含む。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、連続ウリジンの出現例を低減するように配列最適化され得る。例えば、２つの連続ロイシンが、４つのウリジンクラスターを含む、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これはウリジンクラスターを効果的に除去する。したがって、参照核酸配列は、ウリジン対（ＵＵ）、ウリジン三つ組（ＵＵＵ）またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）を低減または排除することによって配列最適化され得る。Ｕの高次の組み合わせは、低次の組み合わせの組み合わせとは見なされない。故に、例えば、ＵＵＵＵは、２つの連続Ｕ対ではなく四つ組と厳密に見なされ、またはＵＵＵＵＵＵは、３つの連続Ｕ対、または２つの連続Ｕ三つ組ではなく六つ組と見なされる。
いくつかの実施形態では、全てのウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）が、参照核酸配列から除去され得る。他の実施形態では、ウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）は、配列最適化核酸において、ある特定の閾値未満、例えば、出現例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下に低減され得る。特定の実施形態では、配列最適化核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満のウリジン対を含む。別の特定の実施形態では、配列最適化核酸は、ウリジン対及び／または三つ組を含まない。
フェニルアラニンコドン、すなわち、ＵＵＣまたはＵＵＵは、ウリジン対または三つ組を含み、したがって、ウリジン含量を低減する配列最適化は、多くてもフェニルアラニンＵ三つ組をフェニルアラニンＵ対に低減するのみである。いくつかの実施形態では、ウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）出現例は、非フェニルアラニンＵ対または三つ組のみを指す。したがって、いくつかの実施形態では、非フェニルアラニンウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）は、配列最適化核酸において、ある特定の閾値未満、例えば、出現例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下に低減され得る。特定の実施形態では、配列最適化核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の非フェニルアラニンウリジン対及び／または三つ組を含む。別の特定の実施形態では、配列最適化核酸は、非フェニルアラニンウリジン対及び／または三つ組を含まない。
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸におけるウリジンの組み合わせ（例えば、対、三つ組、四つ組）の低減は、参照核酸配列に存在するウリジンの組み合わせに対するパーセンテージ低減として表され得る。
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン対の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン三つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン四つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジン対の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジン三つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。
いくつかの実施形態では、配列最適化配列におけるウリジン含量は、その配列における理論上最小ウリジン含量に対して表され得る。「理論上最小ウリジン含量」という用語は、核酸配列における全てのコドンが、最も低いウリジン含量を有する同義コドンで置き換えられた後の、その配列の長さのパーセンテージとしてのその配列のウリジン含量として定義される。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量と同一である。いくつかの態様では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量の約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％または約２００％である。
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量と同一である。
参照核酸配列（例えば、野生型配列）は、ウリジンクラスターを含み得、これは、それらの数、サイズ、箇所、分布またはそれらの組み合わせに起因して、翻訳に悪影響を有する。本明細書で使用されるとき、「ウリジンクラスター」という用語は、ある特定の閾値を上回るウリジン含量（通常はパーセンテージとして説明される）を含有する、参照核酸配列または配列最適化核酸配列における部分配列を指す。故に、ある特定の実施形態では、ｉｆ部分配列は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％を超えるウリジン含量を含み、かかる部分配列はウリジンクラスターと見なされる。
ウリジンクラスターの悪影響は、例えば、ＴＬＲ７応答の誘発であり得る。故に、本明細書に開示される核酸配列最適化方法のいくつかの実施態様では、クラスターの数、クラスターのサイズ、クラスターの箇所（例えば、核酸配列の５’及び／または３’末端に近い）、クラスター間の核酸配列、またはウリジンクラスターの分布（例えば、核酸配列にわたるクラスターのある特定のパターン、発現産物における二次構造要素に対するクラスターの分布、またはｍＲＮＡの二次構造要素に対するクラスターの分布）を低減することが望ましい。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、該ウリジンクラスターは、該部分配列における総ウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージが既定の閾値を上回る、参照核酸配列の部分配列である。いくつかの実施形態では、部分配列の長さは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、部分配列は、１００ヌクレオ塩基よりも長い。いくつかの実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。いくつかの実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＲを含むアミノ酸配列は、核酸配列ＧＣＵ、ＧＡＵ、ＧＧＵ、ＡＧＵ、ＣＧＵによってコードされ得る。かかる配列は、いずれのウリジン対、三つ組、または四つ組も含まないが、ヌクレオ塩基の３分の１がウリジンである。かかるウリジンクラスターは、代替のコドンを使用することによって、例えば、ウリジンを含まない、ＧＣＣ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＧＣ、及びＣＧＣを使用することによって、除去され得る。
他の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、該ウリジンクラスターは、スライディング・ウィンドウを使用して測定したときに該部分配列のウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージが既定の閾値を上回る、参照核酸配列の部分配列である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、４０ヌクレオ塩基長を上回る。いくつかの実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。いくつかの実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも２つのウリジンクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少ないウリジンリッチクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも多くのウリジンリッチクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長さが短いウリジンリッチクラスターを含有する。他の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長さが長いウリジンリッチクラスターを含有する。Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１５４－１５７、またはＳａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｜ ＡＯＰ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４ｍ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４２７８を参照されたく、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ｂ．グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）を変化させることを含む方法を用いて配列最適化され得る。かかる最適化は、参照核酸配列の全体的なＧ／Ｃ含量（絶対または相対）を変化させる（例えば、増加させるまたは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃ含量の局所的な変更を導入すること（例えば、参照核酸配列における選択される領域または部分配列のＧ／Ｃを増加または減少させる）、参照核酸配列におけるＧ／Ｃクラスターの頻度、サイズ、及び分布を変化させること、またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べたＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な増加を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な増加は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量と比べたＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な減少を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な減少は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列における対応する部分配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）と比べた、部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾部分配列）におけるグＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的増加である。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的増加は、参照核酸配列における対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の幅である。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列における対応する部分配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）と比べた、部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾部分配列）におけるＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的減少である。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的減少は、参照核酸配列における対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の幅である。
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、または１００００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
本明細書に記載のＧ及びＣ含量（絶対または相対）の増加または減少は、低Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンを、より高いＧ／Ｃ含量を有する同義コドンと置き換えること、またはその逆によって、実施され得る。例えば、Ｌは、６つの同義コドンを有し、これらのうちの２つが２つのＧ／Ｃ（ＣＵＣ、ＣＵＧ）を有し、３つが単一のＧ／Ｃ（ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ）を有し、１つがＧ／Ｃ（ＵＵＡ）を有しない。したがって、参照核酸がある特定の位置にＣＵＣコドンを有したとして、その位置のＧ／Ｃ含量は、ＣＵＣを、単一のＧ／Ｃを有するコドンのうちのいずれかまたはＧ／Ｃを有しないコドンで置き換えることによって低減され得る。
米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０ Ａ１号、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８３：３７－４６を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．コドン頻度－コドン使用頻度バイアス
当該技術分野で既知の多数のコドン最適化方法は、参照核酸配列におけるコドンの、より高い頻度を有するコドンでの置換に基づく。故に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＧＬＡをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列における使用頻度に対する、配列最適化核酸における他の同義コドンと比べた１つ以上のコドンの使用頻度の変更を含む方法を用いて、配列最適化され得る。
本明細書で使用されるとき、「コドン頻度」という用語は、コドン使用頻度バイアス、すなわち、コードＤＮＡ／ＲＮＡにおける同義コドンの出現頻度の差異を指す。一般に、コドン選好は、翻訳最適化のための変異バイアスと自然選択との間の均衡を反映することが認識される。最適なコドンは、より早い翻訳速度及び高確度を達成する一助となる。これらの要因の結果として、より高度に発現される遺伝子において翻訳選択がより強力となることが予想される。バイオインフォマティクス及び計算生物学の分野において、コドン使用頻度バイアスを解析するための多くの統計手法が提案され、使用されている。例えば、Ｃｏｍｅｒｏｎ ＆ Ａｇｕａｄｅ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４７：２６８－７４を参照されたい。「最適なコドンの頻度」（Ｆｏｐ）（Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１（３）：３８９－４０９）、相対コドン適合（ＲＣＡ）（Ｆｏｘ ＆ Ｅｒｉｌ（２０１０）ＤＮＡ Ｒｅｓ．１７（３）：１８５－９６）または「コドン適合インデックス」（ＣＡＩ）（Ｓｈａｒｐ ＆ Ｌｉ（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（３）：１２８１－９５）等の方法が、遺伝子発現レベルを予測するために用いられる一方で、「コドン有効数」（Ｎｃ）及び情報理論におけるシャノンエントロピー等の方法が、コドン使用頻度均一性を測定するために用いられる。対応分析及び主成分分析等の多変量統計手法が、遺伝子間のコドン使用頻度のばらつきを分析するために広く用いられる（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００８） ＤＮＡ Ｒｅｓ．１５（６）：３５７－６５、Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌ．２００８；８（２）：１８７－９２）。
本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡであり得る、例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列等）は、参照核酸配列における少なくとも１つのコドンを、同義コドン組においてより高いまたはより低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換することを含む方法を用いて、コドン最適化され得、結果として得られる配列最適化核酸は、参照核酸配列に対して、少なくとも１つの最適化された特性を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換され、参照核酸配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、コドン組において最も高いコドン頻度同義を有する。他の実施形態では、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、コドン組において最も低いコドン頻度同義を有する。いくつかの実施形態では、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
いくつかの具体的な実施形態では、少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。いくつかの具体的な実施形態では、少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
コドン頻度に基づく最適化は、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列に、上述のように全体的に、または局所的に適用され得る。いくつかの実施形態では、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて、ある特定の部分配列における全てのまたはある特定のパーセンテージのコドンを、それらのそれぞれの同義コドン組においてより高いまたはより低い頻度を有するコドンで置換することで、修飾され得る。故に、いくつかの実施形態では、参照核酸配列の部分配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換され、参照核酸配列の部分配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換され、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換され、より低いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も低いコドン頻度を有する。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換され、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において最も低いコドン頻度を有する。いくつかの実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換され、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
具体的な実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、特定の箇所で、例えば、配列最適化核酸の５’末端もしくは３’末端で、またはこれらの領域から既定の距離（例えば、配列最適化核酸の５’末端または３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００コドン）以内で、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的コドン頻度よりも高いまたは低い全体的コドン頻度を有する、部分配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的コドン頻度よりも高いまたは低い全体的コドン頻度を有する、１つを超える部分配列を含み得る。当業者であれば、全体的により高いまたはより低い全体的コドン頻度を有する部分配列が、全体的コドン頻度がより高いかそれともより低いか、部分配列の長さ、部分配列間の長さ、部分配列の箇所等に応じて、無数のパターンで組織化され得ることを理解する。米国特許第ＵＳ５０８２７６７号、同第ＵＳ８１２６６５３号、同第ＵＳ７５６１９７３号、同第ＵＳ８４０１７９８号、米国公開第ＵＳ２００８００４６１９２号、同第ＵＳ２００８００７６１６１号、国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４（９）：ｅ７００２、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ８３：３７－４６、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１３４を参照されたく、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ｄ．不安定化モチーフ置換
配列最適化に影響し得る様々なモチーフが存在し、それは、例えば以下の非排他的部類に分類される。
（ｉ）モチーフに基づく一次配列：ヌクレオチドの単純な配置によって定義されるモチーフ。
（ｉｉ）構造モチーフ：ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配置によってコードされるモチーフ。
（ｉｉｉ）局所モチーフ：１つの隣接する部分配列中にコードされるモチーフ。
（ｉｖ）分布モチーフ：２つ以上の分解された部分配列中にコードされるモチーフ。
（ｖ）有利なモチーフ：ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
（ｖｉ）不利なモチーフ：ヌクレオチドの構造または機能への有害な影響を有するモチーフ。
不利なモチーフの部類に適合する多くのモチーフが存在する。いくつかの例として、例えば、相対的に短くなる傾向がある制限酵素モチーフ、Ｘｂａ１の制限部位モチーフ等の完全系列（ＴＣＴＡＧＡ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＩＩ（ＣＣＷＧＧ、式中、ＩＵＰＡＣアンビギュイディーコードにつき、Ｗは、ＡまたはＴを意味する、）、またはＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）；Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｎｎｎｎＷｎＣＲｎＣＴＣｎＣｎｎＷｎＤ、式中、ｎは、任意のヌクレオチドを意味し、Ｒは、ＡまたはＧ意味し、Ｗは、ＡまたはＴを意味し、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴを意味するがＣではない）中等、より長くなる傾向があり、正確な配列ではなくコンセンサスに基づく酵素部位；ＧＧＧＧ反復（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１（６３２４）：３３１－２）等の構造モチーフ；またはＣＵＧ－トリプレット反復（Ｑｕｅｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２４：１７０３－１７１４）等の他のモチーフが挙げられる。
したがって、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列において、少なくとも１つの不安定化モチーフを置換することと、かかる不利なモチーフを除去することまたはそれを有利なモチーフと置き換えることとを含む方法を使用して配列最適化され得る。
いくつかの実施形態では、最適化プロセスは、参照核配列において、有利及び／または不利なモチーフを同定することを含み、かかるモチーフは、例えば、最適化プロセスの前またはその間に参照核酸配列において、安定性の損失を引き起こし得る特定の部分配列である。例えば、最適化の間の特定の塩基の置換は、制限酵素によって認識される部分配列（モチーフ）を生成し得る。したがって、最適化プロセスの間、不利なモチーフの出現は、配列最適化配列を不利であることが既知のモチーフのライブラリと比較することによって監視され得る。次いで、不利なモチーフの同定は、事後フィルターとして、すなわち、参照核酸配列中に潜在的に導入され得るある特定の修飾が実際に実施されるべきかどうかを判定するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、不利なモチーフの同定は、本明細書に開示される配列最適化方法の用途の前に使用され得、すなわち、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列中のモチーフの同定及び代替の核酸配列でのそれらの置き換えは、事前プロセスステップとして、例えば、ウリジン低減の前に使用され得る。
他の実施形態では、不利なモチーフの同定及びそれらの除去は、本明細書に開示される配列最適化方法のうちの２つ以上を含む多パラメータ核酸最適化方法において統合された追加の配列最適化技術として使用される。この仕方で使用される場合、最適化プロセスの間に同定される不利なモチーフは、例えば、元々の設計原理（複数可）（例えば、低いＵ、高い頻度等）と可能な限り綿密に維持するために、最も低い可能な数のヌクレオ塩基を置換することによって除去され得る。例えば、米国公開第ＵＳ２０１４／０２２８５５８号、第ＵＳ２００５／００３２７３０号、または第ＵＳ２０１４／０２２８５５８号を参照されたく、それらは、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
ｅ．限られたコドンセット最適化
いくつかの特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列における配列最適化は、限られたコドンセット、例えば、自然数より少ないコドンが２０個の天然アミノ酸、２０個の天然アミノ酸のサブセット、または例えば非天然アミノ酸を含むアミノ酸の拡大されたセットをコードするために使用されるコドンセットを使用して行われ得る。
遺伝コードは、全ての生物の中で非常に類似し、開始及び停止コドンに加えて、タンパク質翻訳に含まれる２０個の標準アミノ酸をコードする６４個の進入を有する単純な表に発現され得る。遺伝コードは、退化、すなわち、一般に、１つ以上のコドンが各アミノ酸を特定する。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧコドンによって特定されるが、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、またはＡＧＣコドンによって特定される（第１、第２、または第３の位置における差異）。自然遺伝コードは、天然発生型アミノ酸をコードする６２個のコドンを含む。したがって、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、２０個のアミノ酸をコードするために６２個未満のコドンを含む最適化コドンセット（遺伝コード）は、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０個のコドンを含み得る。
いくつかの実施形態では、限られたコドンセットは、２０個未満のコドンを含む。例えば、タンパク質が２０種類未満のアミノ酸を含む場合、かかるタンパク質は、２０個未満のコドンを有するコドンセットによってコードされ得る。したがって、いくつかの実施形態では、最適化コドンセットは、参照核酸配列によってコードされるタンパク質中に存在するアミノ酸の異なる種類と同程度の多くのコドンを含む。いくつかの実施形態では、最適化コドンセットは、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、またはさらに１個のコドンを含む。
いくつかの実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ、すなわち１つ以上のコドンによって天然にコードされるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸は、同義のコドンの天然発生数未満のコドンでコードされる。例えば、いくつかの実施形態では、Ａｌａは、３、２、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｃｙｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｓｐは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｕは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｐｈｅは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｙは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｈｉｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｉｌｅは、２個のコドンまたは１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｌｙｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｌｅｕは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｓｎは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｐｒｏは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｎは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｒｇは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ；Ｓｅｒは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｔｈｒは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｖａｌは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ；Ｔｙｒは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得る。
いくつかの実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ、すなわち、１つ以上のコドンによって天然にコードされるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸は、限られたコドンセット中の単一コドンによってコードされる。
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＤＮＡ及び２０個のコドンからなる限られたコドンセットであり、各コドンは２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＤＮＡであり、限られたコドンセットは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン；ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＴまたはＡＣＣから選択される少なくともコドン；ＧＡＴまたはＧＡＣから選択される少なくともコドン；ＴＧＴまたはＴＧＣから選択される少なくともコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、及びＧＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＣＡＴまたはＣＡＣから選択される少なくともコドン；ＡＴＴ、ＡＴＣ、及びＡＴＡからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、及びＣＴＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくともコドン；ＡＴＧコドン；ＴＴＴまたはＴＴＣから選択される少なくともコドン；ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、及びＣＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、及びＡＧＣからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＧＧコドン；ＴＡＴまたはＴＡＣから選択される少なくともコドン；ならびに、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、及びＧＴＧからなる群から選択される少なくともコドンを含む。
他の実施形態では、配列最適化核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり、限られたコドンセットは、２０個のコドンからなり、各コドンは、２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＲＮＡであり、限られたコドンセットは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン；ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＵまたはＡＣＣから選択される少なくともコドン；ＧＡＵまたはＧＡＣから選択される少なくともコドン；ＵＧＵまたはＵＧＣから選択される少なくともコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択され少なくともコドン；ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、及びＧＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＣＡＵまたはＣＡＣから選択される少なくともコドン；ＡＵＵ、ＡＵＣ、及びＡＵＡからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、及びＣＵＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくともコドン；ＡＵＧコドン；ＵＵＵまたはＵＵＣから選択される少なくともコドン；ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、及びＣＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、及びＡＧＣからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＧＧコドン；ＵＡＵまたはＵＡＣから選択される少なくともコドン；ならびに、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、及びＧＵＧからなる群から選択される少なくともコドンを含む。
いくつかの特定の実施形態では、限られたコドンセットは、ある特定の組織または細胞への投与後に、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ）のインビボ発現へ最適化されている。
いくつかの実施形態では、最適化コドンセット（例えば、２０個のアミノ酸をコードする２０個のコドンセット）は、以下の特性のうちの少なくとも１つに従う。
（ｉ）最適化コドンセットは、元々のもしくは天然コドンセットより高い平均Ｇ／Ｃ含量を有する；または、
（ｉｉ）最適化コドンセットは、元々のもしくは天然コドンセットより低い平均Ｕ含量を有する；または、
（ｉｉｉ）最適化コドンセットは、最も高い頻度を有するコドンからなる；または、
（ｉｖ）最適化コドンセットは、最も低い頻度を有するコドンからなる；または、
（ｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの特定の実施形態では、最適化コドンセット中の少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中で２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。いくつかの特定の実施形態では、最適化コドン中の少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中で２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
本明細書で使用される場合、「天然コドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために源生物によって天然に使用されるコドンセットを指す。本明細書で使用される場合、「元々のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に参照核酸配列をコードするために使用されるコドンセット、または配列最適化が反復的もしくは再帰的に適用される場合に、新しい最適化反復の開始での参照核酸配列の最適化バリアントをコードするために使用されるコドンセットを指す。
いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も高い頻度を有するものである。他の実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も低い頻度を有するものである。
いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も高いウリジン含量を有するものである。いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も低いウリジン含量を有するものである。
いくつかの実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対またはｒｅｌａｔｉｖｅ）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％高い。いくつかの実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対またはｒｅｌａｔｉｖｅ）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低い。
いくつかの実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対または相対）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％高い。いくつかの実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対または相対）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低い。
米国出願公開第２０１１／００８２０５５号、及び国際公開第ＷＯ２０００／０１８７７８号もまた参照されたく、その両方は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
８．配列最適化核酸の特徴付け
本発明のいくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露される場合の安定性）または発現特性が、非配列最適化核酸に関して改善されているかどうかを判定するために試験され得る。
本明細書で使用される場合、「発現特性」は、インビボ（例えば、投与を必要とする対象への投与後の、合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）またはインビトロ（例えば、インビトロモデル系内で試験される合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかで核酸配列の特性を指す。発現特性は、これらに限定されないが、投与後にＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって生成されるプロテインの量、及び生成される可溶性またはそうでなければ機能的タンパク質の量を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列最適化核酸は、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存能力に従って評価され得る。
特定の実施形態では、非最適化参照核酸配列に関するコドン置換を含む本明細書に開示される複数の配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対象の特性、例えば、インビトロモデル系、またはインビボでの標的組織もしくは細胞における発現特性を測定するために機能的に特徴付けられ得る。
ａ．核酸配列固有特性の最適化
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビボまたはインビトロでの安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞中の発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるその分解を防ぐことによってその血漿半減期を増加させるために配列最適化される。
他の実施形態では、核酸配列は、その抵抗を増加させるために配列最適化され、溶液中で加水分解し、例えば、配列最適化核酸または配列最適化核酸を含む医薬組成物が、最小限の分解を伴う水性条件下で保管され得る時間を長くする。
他の実施形態では、配列最適化核酸は、その抵抗を増加させるために最適化され得、乾燥保管条件で加水分解し、例えば、配列最適化核酸が、最小限の分解を伴う水性条件下で保管され得る時間を長くする。
ｂ．タンパク質発現のための核酸配列最適化
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド所望の特性は、本明細書に開示される配列最適化配列によってコードされるＧＬＡポリペプチドの発現のレベルである。タンパク質発現レベルは、１つ以上の発現系を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中で測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートから調製されたインビトロ発現系、または精製された個々の構成成分の集合体によって調製されたインビトロ発現系を使用して測定され得る。他の実施形態では、タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サル等において測定される。
いくつかの実施形態では、溶液形態でのタンパク質発現が望ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態では、参照配列は、可溶性形態で発現されたタンパク質の最適化レベルを有する配列最適化核酸配列を産出するために、配列最適化され得る。タンパク質発現のレベル、ならびに可溶性、集合体のレベル、及び不完全生成物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または欠陥のある翻訳に起因する断片）等の他の特性は、当該技術分野で知られている方法、例えば、電気泳動法（例えば、ネイティブまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー等）に従って測定され得る。
ｃ．標的組織または標的細胞生存能力
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織及び細胞において有害な影響を有し得、タンパク質産出を低減するか、または発現された生成物の質を低減するか（例えば、タンパク質断片の存在または封入体中の発現されたタンパク質の沈殿に起因する）、または毒性を引き起こす。
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列は、配列最適化核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存能力を増加させるために使用され得る。
異種タンパク質発現はまた、自己または異種の核酸配列でトランスフェクションされた細胞に対して有害であり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化は、配列最適化核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存能力を増加させるために使用され得る。細胞または組織生存能力、毒性、及び他の生理的反応における変化は、当該技術分野で知られている方法に従って測定され得る。
ｄ．免疫及び／または炎症性反応の低減
いくつかの場合では、ＧＬＡポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を引き起こし得、それは、（ｉ）治療剤（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）かかる治療剤の発現生成物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＧＬＡポリペプチド）、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされ得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化減少免疫は、ＧＬＡポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはかかる核酸によってコードされるＧＬＡの発現生成物によって引き起こされる、免疫もしくは炎症性反応を減少させるために使用され得る。
いくつかの態様では、炎症性反応は、当該技術分野で知られている方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、１つ以上の炎症性サイトカインの増加されたレベルを検出することによって測定され得る。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症性反応が高められたサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＧＲＯαとしても知られているＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１；インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ－誘発性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。用語、炎症性サイトカインはまた、当該技術分野で知られている炎症性反応に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）等を含む。
９．ＧＬＡポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列を含み、ｍＲＮＡは、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。
本発明のある特定の態様では、５－メトキシウラシル塩基がリボ―ス糖に連結されている場合、それはポリヌクレオチド中にあるため、結果として得られる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、５－メトキシウリジンと称される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が５－メトキシウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、１００％が５－メトキシウラシルである。
ポリヌクレオチドのウラシルが、少なくとも９５％が５－メトキシウラシルである実施形態では、全体のウラシル含量は、ｍＲＮＡが、免疫応答にほとんど誘発しない間に好適なタンパク質発現レベルを提供するように調節され得る。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論上最小ウラシル含量（％ＵＴＭ）の約１１０％～約１５０％、約１１５％～約１５０％、約１２０％～約１５０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１４５％、約１２０％～約１４５％、約１１０％～約１４０％、約１１５％～約１４０％、または約１２０％～約１４０％である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、約１２０％～約１４３％または１２３％～１３８％の％ＵＴＭである。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量は、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、または約１４０％の％ＵＴＭである。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシル及び／または天然発生型ウラシルを指す。
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約５０％、約４０％、約３０％、または約２０％未満である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約１２％～約２６％である。他の実施形態では、ＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約１６％～約１８％である。一実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総ヌクレオ塩基含量の約２６％未満である。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５－メトキシウラシル及び／または天然発生型ウラシルを指す。
さらなる実施形態では、５－メトキシウラシル及び調節されたウラシル含量を有するＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、増加されたシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体の増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおけるＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論上最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量（％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）の約１００％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、または約７５％未満である。他の実施形態では、ＯＲＦにおけるＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、それぞれ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの約７２％～約８０％、約７０％～約７６％、または約９１％～約９５％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＧ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、低いＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義のコドンをより高いＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義のコドンと置き換えることによって行われ得る。他の実施形態では、Ｇ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、Ｕで終わるコドンをＧまたはＣで終わる同義のコドンと置き換えることによって行われる。
さらなる実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも低いウラシル対（ＵＵ）及び／またはウラシル三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウラシル四つ組（ＵＵＵＵ）を含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシル対及び／またはウラシル三つ組及び／またはウラシル四つ組を含まない。いくつかの実施形態では、ウラシル対及び／またはウラシル三つ組及び／またはウラシル四つ組は、ある特定の閾値未満、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または５１以下の発生を低減される。特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３９、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含む。別の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含まない。
さらなる実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５－メトキシウラシルを含み、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列より少ないウラシルリッチクラスターを含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチクラスターよりも短い長さのウラシルリッチクラスターを含む。
さらなる実施形態では、代替のより低い頻度のコドンが用いられる。５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるコドンの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、代替のコドンで置換され、各代替のコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。ＯＲＦはまた、上述される通り、調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
いくつかの実施形態では、調節されたウラシル含量、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ｍＲＮＡからのＧＬＡの発現レベルより高い哺乳類細胞に投与されるとき、ＧＬＡの発現レベルを示す。他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された際のＧＬＡの発現レベルは、少なくとも９５％の５－メトキシウラシルを含み、かつ理論上最小の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％のウラシル含量を有する対応するｍＲＮＡに対して増加される。なおも他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された際のＧＬＡの発現レベルは、対応するｍＲＮＡに対して増加され、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％は、１－メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡは、ｍＲＮＡが哺乳類細胞にインビボで投与される際に発現される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内に投与される。他の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、ｍＲＮＡが、哺乳類細胞にインビトロで投与される際に発現される。いくつかの実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加される。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加される。
いくつかの実施形態では、調製されたウラシル含量、５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、増加された安定性を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡの安定性に対して、細胞中で増加された安定性を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼへの抵抗を含む増加された安定性、熱安定性、及び／または二次構造の増加された安定化を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによって示される増加された安定性は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞、または組織試料中）を決定すること及び／または経時的なｍＲＮＡ（例えば、インビトロまたはインビボ）によるタンパク質発現の曲線（ＡＵＣ）下の領域を決定することによって測定される。ｍＲＮＡは、半減期及び／またはＡＵＳが、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣを超える場合、増加された安定性を有するとして同定される。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡが、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘発する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下で５－メトキシウラシルは含まないが、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、または同じ条件下で調節されたウラシル含量を含まないが、ＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘発する。自然免疫応答は、炎症誘発性サイトカイン、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５等）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の停止もしくは低減の増加された発現によって現れ得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の低減は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－ζ）の発現もしくは活性レベル、またはｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）等のインターフェロン調節遺伝子の発現、及び／または細胞への本発明のｍＲＮＡの１つ以上の投与後の減少された細胞子によって測定され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに対する反応における哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、５－メトキシウラシルを含まないがＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、または調節されたウラシル含量を有さないがＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超が低減される。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ－βである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡの哺乳類細胞への投与によって引き起こされる細胞死頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、５－メトキシウラシルを含まないがＧＬＡポリペプチドコードするｍＲＮＡ、または調節されたウラシル含量を有さないがＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５－メトキシウラシルを含むｍＲＮＡと共に観察される細胞死頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウスまたはラットのものである。他の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒトのものである。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが誘発される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的には誘発しない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％の５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％～約１４０％であり、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約２６％未満である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ＯＲＦと比較して、ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）を少なくとも約４０％増加させるためにさらに修飾される。なおも他の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、２０個未満の非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する代替のコドンでさらに置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルが少なくとも約９５％の５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％～約１４０％であるＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされるＧＬＡポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡからのＧＬＡポリペプチドの発現と比較して、少なくとも約１０倍増加される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンＯＲＦを含み、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％の５－メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％～約１４０％であり、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが誘発される哺乳類細胞の免疫応答を実質的には誘発しない。
１０．ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む修飾されたポリヌクレオチドを含む（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）。修飾されたポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾されている場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、修飾されたヌクレオシド、及びＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）のヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）、または有機塩基と組み合わされたそれらの誘導体（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはそれらの誘導体（本明細書で「ヌクレオ塩基」とも称される）を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、または組換え的等の任意の有用な方法によって合成され、１つ以上の修飾されたまたは非天然ヌクレオシドを含む。ポリヌクレオチドは、領域または結合されたヌクレオシドの領域を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステルであり得、その場合においてポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
本明細書に開示される修飾されたポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれ以上（任意に異なる）のヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入された、修飾されたポリヌクレオチドは、修飾されていないポリヌクレオチドと比較して、１つ以上の望ましい特性、例えば、改善されたタンパク質発現、低減された免疫原性、または細胞中の低減された分解を示し得る。
ａ．構造修飾
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾されている。本明細書で使用されるように、「構造」修飾は、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なしでポリヌクレオチド中で２つ以上の結合されたヌクレオシドが、挿入、欠失、重複、転化、またはランダム化されるものである。化学結合が必然的に破壊及び改質されて、構造修飾に影響を与えるため、構造修飾は化学的性質であり、それ故に化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、ヌクレオチドの異なる配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」に化学修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」は挿入され、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
ｂ．化学修飾
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、化学修飾されている。ポリヌクレオチドの参照において本明細書で使用されるように、「化学修飾」または、適切な場合、「化学修飾された」という用語は、１つ以上のそれらの位置、パターン、パーセント、または集団において、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボ－もしくはデオキシリボヌクレオシドに関する修飾を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然発生型５’－末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図しない。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシドの種類の全てもしくはいずれかの均一な化学修飾、または同じヌクレオシドの種類の全てもしくはいずれかの同じ開始修飾の単なる下方滴定によって生成された修飾の集団、または全てのウリジンが、ウリジン類似体、例えば、プソイドウリジンまたは５－メトキシウリジンによって置き換えられるような、同じヌクレオシドの種類であるがランダムな組み込みを伴う全ての任意の化学修飾の測定されたパーセント。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通して同じヌクレオシドの種類のうちの２、３、または４つの均一な化学修飾を有し得る（同じ方法で修飾される全てのウリジン及び全てのサイトカイン等）。
修飾されたヌクレオシド塩基対は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対を包含するだけでなく、非標準的もしくは修飾された塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾されたヌクレオチドの間で形成された塩基対も包含し、水素結合供与対及び水素受容体の配置が、非標準的な塩基及び標準的な塩基の間、または２つの補完的な非標準的な塩基構造の間で水素結合を可能にする。かかる非標準的な塩基対の一実施例は、修飾されたヌクレオチドのイノシン及びアデニン、シトシン、またはウラシルの間の塩基対である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
当業者は、特に明記がある場合を除いて、本出願に記載のポリヌクレオチド配列が大法的なＤＮＡ配列中に「Ｔ」を列挙するが、配列はＲＮＡを表し、「Ｔ」は「Ｕ」に置換され得ることを理解するであろう。
本開示の組成物、方法、合成プロセスにおいて有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）修飾としては、以下のヌクレオチドに限定されないが、ヌクレオシド、及びヌクレオ塩基：２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’－Ｏ－ｄｉメチルアデノシン；１－メチルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバニルカルバモイルアデノシン；２’－Ｏ－メチルアデノシン；２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６－ｄｉメチルアデノシン；Ｎ６－ヒドロキシノルバニルアデノシン；Ｎ６－ヒドロキシノルバニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；２－メチルアデノシン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；７－デアザ－アデノシン；Ｎ１－メチル－アデノシン；Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６－シス－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン；α－チオ－アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２－（アルキル）アデニン；２－（アミノアルキル）アデニン；２－（アミノプロピル）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（ハロ）アデニン；２－（プロピル）アデニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６－（アルキル）アデニン；６－（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８－（アルケニル）アデニン；８－（アルキル）アデニン；８－（アルキニル）アデニン；８－（アミノ）アデニン；８－（ハロ）アデニン；８－（ヒドロキシル）アデニン；８－（チオアルキル）アデニン；８－（チオｌ）アデニン；８－アジド－アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６－（イソペンチル）アデニン；７－デアザ－８－アザ－アデノシン；７－メチルアデニン；１－デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルアデノシンＴＰ；２－アミノアデニン；２－アミノアデノシンＴＰ；２－アミノ－ＡＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－アジドアデノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルアデノシンＴＰ；２－ブロモアデノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトアデノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシアデノシンＴＰ；２－フルオロアデノシンＴＰ；２－ヨードアデノシンＴＰ；２－メルカプトアデノシンＴＰ；２－メトキシ－アデニン；２－メチルチオ－アデニン；２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ；３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ；３－デアザアデノシンＴＰ；４’－アジドアデノシンＴＰ；４’－炭素環式アデノシンＴＰ；４’－エチニルアデノシンＴＰ；５’－ホモ－アデノシンＴＰ；８－アザ－ＡＴＰ；８－ブロモ－アデノシンＴＰ；８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９－デアザアデノシンＴＰ；２－アミノプリン；７－デアザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン；２，６－ジアミノプリン；７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン；２－チオシチジン；３－メチルシチジン；５－ホルミルシチジン；５－ヒドロキシメチルシチジン；５－メチルシチジン；Ｎ４－アセチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン；ライシジン；Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン；Ｎ４－メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４－Ｄｉメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ；４－メチルシチジン；５－アザ－シチジン；シュード－イソ－シチジン；ピロロ－シチジン；α－チオ－シチジン；２－（チオ）シトシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３－（アルキル）シトシン；３－（デアザ）５（アザ）シトシン；３－（メチル）シチジン；４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５－（アルキル）シトシン；５－（アルキニル）シトシン；５－（ハロ）シトシン；５－（プロピニル）シトシン；５－（トリフルオロメチル）シトシン；５－ブロモ－シチジン；５－ヨード－シチジン；５－プロピニルシトシン；６－（アゾ）シトシン；６－アザ－シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；１－メチル－シュードイソシチジン；２－メトキシ－５－メチル－シチジン；２－メトキシ－シチジン；２－チオ－５－メチル－シチジン；４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－メトキシ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン；４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン；４－チオ－シュードイソシチジン；５－アザ－ゼブラリン；５－メチル－ゼブラリン；ピロロ－シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰハイドロクロライド；２’フルオロ－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ；２’－ａ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルシチジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトシチジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシシチジンＴＰ；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ；３’－エチニルシチジンＴＰ；４’－アジドシチジンＴＰ；４’－炭素環式シチジンＴＰ；４’－エチニルシチジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ；５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ；５－アミノアリール－ＣＴＰ；５－シアノシチジンＴＰ；５－エチニルアラ－シチジンＴＰ；５－エチニルシチジンＴＰ；５’－ホモ－シチジンＴＰ；５－メトキシシチジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ；Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ；Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７－メチルグアノシン；Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；Ｎ２－メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン；１－メチルグアノシン；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）；２’－Ｏ－メチルグアノシン；２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）；７－アミノメチル－７－デアザグアノシン；７－シアノ－７－デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７－ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン；６－チオ－グアノシン；７－デアザ－グアノシン；８－オキソ－グアノシン；Ｎ１－メチル－グアノシン；α－チオ－グアノシン；２（プロピル）グアニン；２－（アルキル）グアニン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６－（アルキル）グアニン；６－（メチル）グアニン；６－メチル－グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７－（アルキル）グアニン；７－（デアザ）グアニン；７－（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８－（アルケニル）グアニン；８－（アルキル）グアニン；８－（アルキニル）グアニン；８－（アミノ）グアニン；８－（ハロ）グアニン；８－（ヒドロキシル）グアニン；８－（チオアルキル）グアニン；８－（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ－（メチル）グアニン；１－メチル－６－チオ－グアノシン；６－メトキシ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン；６－チオ－７－デアザ－グアノシン；６－チオ－７－メチル－グアノシン；７－デアザ－８－アザ－グアノシン；７－メチル－８－オキソ－グアノシン；Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン；Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン；１－Ｍｅ－ＧＴＰ；２’フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；２’－ａ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－エチニルグアノシンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオログアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－

メルカプトグアノシンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシグアノシンＴＰ；４’－アジドグアノシンＴＰ；４’－炭素環式グアノシンＴＰ；４’－エチニルグアノシンＴＰ；５’－ホモ－グアノシンＴＰ；８－ブロモ－グアノシンＴＰ；９－デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ；１－メチルイノシン；イノシン；１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；７－メチルイノシン；２’－Ｏ－メチルイノシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル－キューオシン；マンノシルキューオシン；キューオシン；アリアミノ－チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ－チミジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオウリジン；３－メチルウリジン；５－カルボキシメチルウリジン；５－ヒドロキシウリジン；５－メチルウリジン；５－タウリノメチル－２－チオウリジン；５－タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）シュードウリジン；１－メチルシュードウリジン；１－エチル－シュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’－Ｏ－メチルウリジン；２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；３－メチル－シュード－ウリジンＴＰ；４－チオウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン；５，６－ジヒドロ－ウリジン；５－アミノメチル－２－チオウリジン；５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン；５－メトキシカルボニルメチルウリジン；５－メチルウリジン，）、５－メトキシウリジン；５－メチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン；５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－メチルアミノメチルウリジン；５－メチルジヒドロウリジン；５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ；５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ；Ｎ１－メチル－シュード－ウラシル；Ｎ１－エチル－シュード－ウラシル；ウリジン５－オキシ酢酸；ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ；５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５－プロピニルウラシル；α－チオ－ウリジン；１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－２（チオ）－シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）－シュードウラシル；１置換２（チオ）－シュードウラシル；１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチルエニル）－２－（チオ）－シュードウラシル；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－シュード－ＵＴＰ；１－エチル－シュード－ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２－（チオ）ウラシル；２，４－（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－グアノシン；２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’－デオキシ－２’－ａ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－アジドウリジンＴＰ；２－メチルシュードウリジン；３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）シュードウラシル；４－（チオ）ウラシル；４－チオウラシル；５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル；５（２－アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５－（２－アミノプロピル）ウラシル；５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（アルキル）シュードウラシル；５－（アルキル）ウラシル；５－（アルキニル）ウラシル；５－（アリールアミノ）ウラシル；５－（シアノアルキル）ウラシル；５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５－（ハロ）ウラシル；５－（ｌ，３－ジアゾール－ｌ－アルキル）ウラシル；５－（メトキシ）ウラシル；５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル；５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル；５－（メチル）２（チオ）ウラシル；５－（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチル）４（チオ）ウラシル；５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル；５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル；５－（メチル）シュードウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル；５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル；５－（プロピニル）ウラシル；５－（トリフルオロメチル）ウラシル；５－アミノアリール－ウリジン；５－ブロモ－ウリジン；５－ヨード－ウリジン；５－ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６－（アゾ）ウラシル；６－アザ－ウリジン；アリアミノ－ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード－ＵＴＰ－１－２－エタン酸；シュードウラシル；４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－カルボキシメチル－シュードウリジン；１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；１－プロピニル－ウリジン；１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン；１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン；１－タウリノメチル－シュードウリジン；２－メトキシ－４－チオ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン；２－チオ－１－メチル－シュードウリジン；２－チオ－５－アザ－ウリジン；２－チオ－ジヒドロシュードウリジン；２－チオ－ジヒドロウリジン；２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン；４－メトキシ－シュードウリジン；４－チオ－１－メチル－シュードウリジン；４－チオ－シュードウリジン；５－アザ－ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ；（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ；１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，２－ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－アミノ－エチル）シュード－ＵＴＰ；１－（２－ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（２－メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３，４－ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ＵＴＰ；１－（３－シクロプロピル－プロップ－２－イニル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ；１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－（４－チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（４－トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ＵＴＰ；１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ＵＴＰ；１，６－ジメチル－シュード－ＵＴＰ；１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１－アセチルシュードウリジンＴＰ；１－アルキル－６－（１－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－（２－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－アリール－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－エチニル－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ホモアリール－シュード－ＵＴＰ；１－アルキル－６－ビニル－シュード－ＵＴＰ；１－アリールシュードウリジンＴＰ；１－アミノメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１－ベンジルオキシメチルシュード

ウリジンＴＰ；１－ベンジル－シュード－ＵＴＰ；１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュードウリジンＴＰ；１－ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シアノメチルシュードウリジンＴＰ；１－シクロブチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロブチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロへプチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロへプチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロオクチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピルメチル－シュード－ＵＴＰ；１－シクロプロピル－シュード－ＵＴＰ；１－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－ヘキシル－シュード－ＵＴＰ；１－ホモアリールシュードウリジンＴＰ；１－ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－２－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－４－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－Ｍｅ－α－チオ－シュード－ＵＴＰ；１－メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１－メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－（置換フェニル）シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－アジド－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－エチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－ペンチル－シュード－ＵＴＰ；１－フェニル－シュード－ＵＴＰ；１－ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１－プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１－プロピル－シュード－ＵＴＰ；１－プロピニル－シュードウリジン；１－ｐ－トリル－シュード－ＵＴＰ；１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；１－チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１－チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；１－ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ；２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ；２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ；２’－ＯＭｅ－シュード－ＵＴＰ；２’－ａ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ａ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－ｂ－エチニルウリジンＴＰ；２’－ｂ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトウリジンＴＰ；２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシウリジンＴＰ；２－メトキシ－４－チオ－ウリジン；２－メトキシウリジン；２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ；３－アルキル－シュード－ＵＴＰ；４’－アジドウリジンＴＰ；４’－炭素環式ウリジンＴＰ；４’－エチニルウリジンＴＰ；５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ；５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ；５－シアノウリジンＴＰ；５－ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’－ホモ－ウリジンＴＰ；５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ；５－フェニルエチニルウリジンＴＰ；５－トリデューテロメチル－６－デューテロウリジンＴＰ；５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ；５－ビニルアラウリジンＴＰ；６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ；６－（置換－フェニル）－シュード－ＵＴＰ；６－アミノ－シュード－ＵＴＰ；６－アジド－シュード－ＵＴＰ；６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ；６－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－クロロ－シュード－ＵＴＰ；６－シアノ－シュード－ＵＴＰ；６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ；６－エチル－シュード－ＵＴＰ；６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ；６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ；６－ヨード－シュード－ＵＴＰ；６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ；６－メチル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－フェニル－シュード－ＵＴＰ；６－プロピル－シュード－ＵＴＰ；６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ；６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ；α－チオ－シュード－ＵＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ；シュードウリジン１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ １－メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ １－メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸；シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；非修飾ヒドロキシワイブトシン；４－ジメチルワイオシン；２，６－（ジアミノ）プリン；１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１イル：１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－ｌ－イル；１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１イル；１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５－（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－ウリジン；２’－アミノ－２’－デオキシリボース；２－アミノ－６－クロロ－プリン；２－アザ－イノシニル；２’－アジド－２’－デオキシリボース；２’フルオロ－２’－デオキシリボース；２’－フルオロ－修飾塩基；２’－Ｏ－メチル－リボース；２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３イル；２－オキソ－ピリドピリミジン－３イル；２－ピリジノン；３ニトロピロール；３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリル；３－（メチル）イソカルボスチリル；４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンズイミダゾール；４－（メチル）ベンズイミダゾール；４－（メチル）インドリル；４，６－（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５－（メチル）イソカルボスチリル；５－ニトロインドール；６－（アザ）ピリミジン；６－（アゾ）チミン；６－（メチル）－７－（アザ）インドリル；６－クロロ－プリン；６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノチアジン－ｌイル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１イル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－ｌイル；７－（アミノアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－ｌイル；７－（アザ）インドリル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジンｌイル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノチアジン－ｌイル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１イル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１イル；７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノチアジン－ｌイル；７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－ｌ，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－ｌイル；７－（プロピニル）イソカルボスチリル；７－（プロピニル）イソカルボスチリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル；７－デアザ－イノシニル；７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１イル；７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１イル；９－（メチル）－イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラックエニル；ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリル；イソグアニシン；Ｎ２－置換プリン；Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン；Ｎ６－置換プリン；Ｎ－アルキル化誘導体；ナフタレニル；ニトロベンズイミダゾール；ニトロイミダゾイル；ニトロインダゾイル；ニトロピラゾイル；ヌブラリン；Ｏ６－置換プリン；Ｏ－アルキル化誘導体；オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；ペンタセニル；フェナントレニル；フェニル；プロ

ピニル－７－（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン－３イル；ピリドピリミジン－３イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３イル；ピロロ－ピリミジン－２－オン－３イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４－トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン－５’－ＴＰ；２－チオ－ゼブラリン；５－アザ－２－チオ－ゼブラリン；７－デアザ－２－アミノ－プリン；ピリジン－４－オンリボヌクレオシド；２－アミノ－リボシド－ＴＰ；ホルマイシンＡ ＴＰ；ホルマイシンＢ ＴＰ；ピロロジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ；２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ；５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾されたヌクレオ塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン、（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－キューオシン、メチル化非修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾されたヌクレオ塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
（ｉ）塩基修飾
ある特定の実施形態では、化学修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中のヌクレオ塩基における。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾されたヌクレオ塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオ－グアノシン、及びα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾されたヌクレオ塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつか実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）を含む。いくつか実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２－チオウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’－Ｏ－メチルウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に均一に修飾されている（例えば、完全に修飾された、配列全体を通して修飾された）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾され得、ｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記に記載のもののうちのいずれか等の修飾された残基での置き換えによって、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に均一に修飾され得る。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中で化学修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたシトシンである。修飾されたシトシンを有するヌクレオ塩基及びヌクレオシドの例として、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたウリジンである。修飾されたウリジンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、５－シアノウリジンまたは４’－チオウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデニン（ｍ６Ａ）、及び２，６－Ｄｉアミノプリンを含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたグアニンである。修飾されたグアニンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中のヌクレオ塩基修飾ヌクレオチドは、５－メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾されたヌクレオ塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の少なくとも９５％の種類のヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の少なくとも９５％のウラシルは、５－メトキシウラシルである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、５－メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に均一に修飾されている（例えば、完全に修飾された、配列全体を通して修飾された）。例えば、ポリヌクレオチドは、５－メトキシウリジンで均一に修飾され得、実質的には、ｍＲＮＡ配列中の全てウリジンの残基が５－メトキシウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記に記載のもののうちのいずれか等の修飾された残基での置き換えによって、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に均一に修飾され得る。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたシトシンである。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたウラシルである。修飾されたウラシルを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、５－メトキシウラシルを含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたアデニンである。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたグアニンである。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間で任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物において有用である、骨格修飾を含むかかるリンカーとしては、以下に限定されないが、３’－アルキレンホスホネート、３’－アミノホスホルアミデート、骨格を含むアルケン、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド管結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシド及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホルアミデートが挙げられる。
（ｉｉ）糖修飾
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、数多くの異なる置換で修飾または置き換えられ得る。２’－位置における例となる置換としては、これらに限定されないが、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されるＣ１－６アルキル；任意選択で置換されるＣ１－６アルコキシ；任意選択で置換されるＣ６－１０アリールオキシ；任意選択で置換されるＣ３－８シクロアルキル；任意選択で置換されるＣ３－８シクロアルコキシ；任意選択で置換されるＣ６－１０アリールオキシ；任意選択で置換されるＣ６－１０アリール－Ｃ１－６アルコキシ、任意選択で置換されるＣ１－１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれかのもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択で置換されるアルキル、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であり；２’－ヒドロキシルが、Ｃ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレンによって連結されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）は、４’－同じリボース糖の炭素に架橋し、例となるブリッジは、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノブリッジを含み；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられる。
一般に、ＲＮＡは、糖基リボースを含み、それは、酸素を有する５員環である。例となる、非限定的に修飾されたヌクレオチドは、リボース中で酸素の置き換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンまたはエチレン等のアルキレン）；二重結合の追加（例えば、シクロペンタニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置き換える）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホルアミデート骨格も有するモルホリノ等への追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環）；多環式形態（例えば、トリシクロ；及びグルコール核酸（ＧＮＡ）等の「ロック解除された」形態（例えば、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されるグリコール単位によって置き換えられる）、トレオース核酸（リボースがα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられる、ＴＮＡ）、及びペプチド核酸（２－アミノ－エチル－グリシン結合がリボース及びホスホジエステル骨格を置き換える、ＰＮＡ）を含む。糖基はまた、リボース中の対応する炭素の炭素よりも立体化学的配置を保有する１つ以上の炭素を含み得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。かかる糖修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５２５２３号及び第ＷＯ２０１４／０９３９２４号に教示され、その各々の内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
（ｉｉｉ）修飾の組み合わせ
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的断片またはそのバリアントを含むポリヌクレオチド）は、糖、ヌクレオ塩基、及び／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載される任意の１つ以上の修飾を含み得る。
修飾されたヌクレオチドの組み合わせは、本発明のポリヌクレオチドを形成するために使用され得る。特に記述がない限り、修飾されたヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドに完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例では、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドで部分的に置換または置き換えられ得る（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得、及びかかる修飾は、国際特許公報ＷＯ２０１３／０５２５２３及びＷＯ２０１４／０９３９２４、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３／０１１５２７２号及び第ＵＳ２０１５／０３０７５４２号に教示され、その各々の内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
１１．非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されていない開始コドン（５’ＵＴＲ）の前及び停止コドン（３’ＵＴＲ）の後のポリヌクレオチドの核酸部分である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコード領域に対して相同または異種であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、それらの各々が、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、それらの各々が、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化されている。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、調節的役割を提供する特徴、例えば、増加または減少された安定性、局在化、及び／または翻訳効率性を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または有機体に投与され得、１つ以上の調節的特徴は、日常の方法を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ機能的断片は、それぞれ、完全長５’または３’ＵＴＲの１つ以上の調節特徴を有する。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を生む。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始することによるプロセスに含まれることで一般に知られているＫｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを含む。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）のプリン（アデニンまたはグアニン）の３つの塩基上流であり、別の「Ｇ」が後に続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合中に含まれる二次的構造を形成することで知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現された遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することによって、１つはポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質生成を増大させ得る。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、α－フェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓－発現ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増大させ得る。同様に、組織中の発現を改善するための他の組織－特定のｍＲＮＡの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に可能である。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、タンパク質（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）のファミリーに属し得、それは、特定の細胞、組織、または発達中のある時点で発現される。任意の遺伝子またはｍＲＮＡのＵＴＲは、タンパク質の同じまたは異なるファミリーの任意の他のＵＴＲと交換され、新しいポリヌクレオチドを作製し得る。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種であり得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
共有される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドにおいて利用され得る例となるＵＴＲの一覧を提供する。
本出願の例となるＵＴＲとしては、これらに限定されないが、α－またはβ－グロビン（例えば、ツメガエル、マウス、ラビット、またはヒトグロビン）等のグロビン；強度のＫｏｚａｋ翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトチトクロムｂ－２４５ αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デングウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；ヒートショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠乏するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト））；リボソームタンパク質大３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、例えばｒｐｓ９等のヒトまたはマウスリボソームタンパク質）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰシンターゼのＡＴＰ５Ａ１またはβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオビンディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられる。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ ＵＴＲ；強度のＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ；チトクロムｂ－２４５ αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デングウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；ヒートショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ；それらの機能的断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、β－グロブリン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；βサブユニットミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰシンターゼ（β－ｍＲＮＡ）３’ ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ；それらの機能的断片、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲは、発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、野生型または天然ＵＴＲに対して変化され得、例えば、ＯＲＦに対してＵＴＲの方向付けまたは位置を変更することによって、またはヌクレオチドの追加、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオドの交換または輸送を含むことによってバリアントＵＴＲを生成する。いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアントは、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、またはバリアントが利用され得、１つ以上のヌクレオチドは、ＵＴＲの末端に追加されるか、またはそこから除去される。
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲは、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２、及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／で利用可能な配列を参照されたい。各々の内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択されたものからの転写においてと同じ方向付けで配置され得るか、または方向付けもしくは位置において変化され得る。それ故に、５’及び／または３’ＵＴＲは、転化、短縮、延長され得るか、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、連続してまたは実質的に連続してのいずれかで同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重β－グロブリン３’ＵＴＲが使用され得る（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、その内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＵＴＲのうちのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、
５’ＵＴＲ－００１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３３）；
５’ＵＴＲ－００２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３４）；
５’ＵＴＲ－００３（上流ＵＴＲ）（配列番号３５を参照されたい）；
５’ＵＴＲ－００４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３６）；
５’ＵＴＲ－００５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３７）；
５’ＵＴＲ－００６（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＡＡＵＡＡＡＡＧＵＣＵＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＵＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＵＣＡＡＧＣＡＵＵＣＵＡＣＵＵＣＵＡＵＵＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＵＵＵＵＣＵＧＡＡＡＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＡＡＣ）（配列番号３８）；
５’ＵＴＲ－００７（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３９）；
５’ＵＴＲ－００８（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４０）；
５’ＵＴＲ－００９（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４１）；
５’ＵＴＲ－０１０、上流（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４２）；
５’ＵＴＲ－０１１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４３）；
５’ＵＴＲ－０１２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４４）；
５’ＵＴＲ－０１３（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４５）；
５’ＵＴＲ－０１４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４６）；
５’ＵＴＲ－１５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４７）；
５’ＵＴＲ－０１６（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４８）；
５’ＵＴＲ－０１７（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４９）；または
５’ＵＴＲ－０１８（上流ＵＴＲ）
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５０）を含む。
いくつかの実施形態では、３’ ＵＴＲは、
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５１）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５２）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５３）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５４）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５５）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５６）；
１４２－３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２－３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５７）；
３’ＵＴＲ－００１（クレアチンキナーゼＵＴＲ）（配列番号５８を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００２（ミオグロビンＵＴＲ）（配列番号５９を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００３（α－アクチンＵＴＲ）（配列番号６０を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００４（アルブミンＵＴＲ）（配列番号６１を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００５（α－グロブリンＵＴＲ）（配列番号６２を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００６（Ｇ－ＣＳＦ ＵＴＲ）（配列番号６３を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００７（Ｃｏｌ１ａ２；コラーゲン、Ｉ型、α２ＵＴＲ）（配列番号６４を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００８（Ｃｏｌ６ａ２；コラーゲン、ＶＩ型、α２ＵＴＲ）（配列番号６５を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－００９（ＲＰＮ１；リボホリン Ｉ ＵＴＲ）（配列番号６６を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１０（ＬＲＰ１；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１ＵＴＲ）（配列番号６７を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１１（Ｎｎｔ１；カルジオトロフィン様サイトカイン因子１ＵＴＲ）（配列番号６８を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１２（Ｃｏｌ６ａ１；コラーゲン、ＶＩ型、α１ＵＴＲ）（配列番号６９を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１３（Ｃａｌｒ；カルレティキュリンＵＴＲ）（配列番号７０を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１４（Ｃｏｌ１ａ１；コラーゲン、Ｉ型、α１ＵＴＲ（配列番号７１を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１５（Ｐｌｏｄ１；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタレート５－オキシゲナーゼ１ＵＴＲ）（配列番号７２を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１６（Ｎｕｃｂ１；クレオビンディン１ＵＴＲ）（配列番号７３を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１７（α－グロビン）（配列番号７４を参照されたい）；
３’ＵＴＲ－０１８（配列番号７５を参照されたい）；
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２＋ｍｉＲ１２６バリアント１）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８１）；
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ １４２－３ｐ及びｍｉＲ １２６－３ｐ結合部位バリアント２）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８２）；または
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２結合部位）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１６１）を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７のうちのいずれか含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１－１７０のうちのいずれか、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦは、強度なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリ－Ａテールのテンプレート追加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含む（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたく、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内で領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本発明のポリヌクレオチドへ組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質生成ならびにポリヌクレオチド発現レベルを増加させ得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと組み合わせた５’ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）エンハンサー要素、または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）エンハンサー要素を含む（集合的には、ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す、「ＴＥＥ」）。非限定的な例として、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０に記載されているものを含み得、その全体において参照により本明細書に組み込まれ、他のものは当該技術分野で既知である。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーター及び開始コドンの間に位置され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、これらに限定されないが、キャップ依存またはキャップ独立翻訳等の核酸の翻訳活性を促進し得るＵＴＲ中の保存要素である。
一非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホームドメインタンパク質の５’－リーダーにおいてＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００４ １０１：９５９０－９５９４を参照されたく、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥうちの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて組織化され得る。配列セグメントは、本明細書に提供されるＴＥＥのうちの１つ以上を含み得、各ＴＥＥは、１つ以上のコピー中に存在する。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在する間、それらは、相同または異種であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、同一もしくは異なる種類の本明細書に提供されるＴＥＥ、同一もしくは異なる数のＴＥＥの各々のコピー、及び／または各配列セグメント内の同一もしくは異なる組織のＴＥＥを含み得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。ＴＥＥ配列の非限定的な例は、米国公開２０１４／０２００２６１に記載されており、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
１２．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、外因性核酸結合分子のシュード－受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、かかる調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むとしても称される。センサー配列の非限定的な例は、米国公開２０１４／０２００２６１に記載されており、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の封入または組み込みは、組織特異的及び／または天然に生じるｍｉＲＮＡの細胞型特異的発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチド、及び今度は、それからコードされるポリペプチドの調節を提供する。
本発明は、また、医薬組成物及び上述されるポリヌクレオチドのいずれかを含む製剤を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対する著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡは、安定性を低減することか、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって、ポリヌクレオチドに結合し、遺伝子発現を下方制御する、１９～２５ヌクレオチド長非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８の領域における配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２～８または２～７を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得て、対応するｍｉＲＮＡ結合部位においてシード補完部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対置されるアデノシン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得て、対応するｍｉＲＮＡ結合部位においてシード補完部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対置されるアデノシン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングは、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を決定するために行われ得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ補完配列、またはマイクロＲＮＡシード補完配列を含む。かかる配列は、その各々の内容が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５で教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応、例えば、相補性を有し得る。
マイクロＲＮＡは、それ自体の上で折り返して、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（前駆体－ｍｉＲＮＡ）としばしば称される低分子ヘアピン型構造を形成するＲＮＡ転写物の領域に酵素的に由来する。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、典型的に、その３’末端で２－ヌクレオチドオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する。この前駆体－ｍＲＮＡは、核でプロセシングされ、その後細胞質に輸送され、これはＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ 酵素）によってさらにプロセシングされて、おおよそ２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、次いで、リボ核粒子に組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、ＲＩＳＣを形成する。成熟ｍｉＲＮＡの当該技術分野で認識されている述語は、典型的には、成熟ｍｉＲＮＡが由来するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのアームを指し、「５ｐ」はマイクロＲＮＡがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの５プライムアームからであり、「３ｐ」はマイクロＲＮＡがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの３プライム末端からであることを意味する。本明細書において数字によって指されるｍｉＲは、同じｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）の逆のアームに起源を持つ２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれかを称し得る。本明細書において言及される全てのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの指名によって特に特定されない限り、３ｐアーム／配列及び５ｐアーム／配列の両方を含むことを意図する。
本明細書で使用されるとき、用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」は、ｍｉＲＮＡに相互作用、会合、または結合するためにｍｉＲＮＡの全てまたは一領域に十分な相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中を含む、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。例となる実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性調節、例えば、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性翻訳抑制または分解を容易にするのに十分な相補性の程度を指す。本発明の例となる態様では、ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導されたＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断を容易にするのに十分な相補性の程度を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列、１９～２３ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列に相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分にのみ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列の完全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の一部分に、または天然に生じるｍｉＲＮＡ配列より短い１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の一部分に相補性であり得る。完全（ｆｕｌｌ）または完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）な相補性（例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡの長さの全体または著しい部分にわたる完全（ｆｕｌｌ）な相補性または完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）な相補性）が、所望の調節がｍＲＮＡ分解である場合、好ましい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有するが、１、２、または３ヌクレオチド置換、末端付加、及び／またはトランスケーションとは有さない。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方における対応するｍｉＲＮＡより短い、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）である。依然として他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方における対応マイクロＲＮＡより短い２ヌクレオチドである。対応するｍｉＲＮＡより短いｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つ以上を組み込むｍＲＮＡを分解することまたはｍＲＮＡの翻訳を予防することが依然として可能である。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、Ｄｉｃｅｒを含有する活性ＲＩＳＣの部分である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位のＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されることを予防する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドにおいて不安定性を誘発するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡとの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のミスマッチ（複数可）を有する。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の、それぞれ、近接ヌクレオチドに相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の近接ヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に操作することによって、当該のｍｉＲＮＡが利用可能である場合、ポリヌクレオチドは分解または低減された翻訳に対して標的化され得る。これは、ポリヌクレオチドの送達の際にオフターゲット効果を低減し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドが組織または細胞に送達されることが意図されないがこの組織または細胞中に行きつく場合、組織または細胞中の豊富なｍｉＲＮＡは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの結合部位がポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に操作される場合、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。故に、いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みは、核酸分子の送達の際のオフターゲット効果の危険を低減し、及び／またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異型調節を可能にし得る。なおも他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みが、インビボでの核酸送達の際に免疫応答を調節し得る。さらなる実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みが、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）を調節し得る。
反対に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特異型組織におけるタンパク質発現を増加するために、天然に生じるポリヌクレオチド配列から除去され得る。例えば、特異型ｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を向上するためにポリヌクレオチドから除去され得る。
複数の組織における発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の明確に異なるｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を通して達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去または挿入するかどうかの決定は、発達及び／または疾患における組織及び／または細胞中のｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいて行われ得る。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定は、報告されてきた（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びその中の全ての参考文献、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１４／０２００２６１号、第２００５／０２６１２１８号、及び第２００５／００５９００５号で記載される非限定的な例を含む任意の既知の配列に対応し得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ、及びそれによりタンパク質発現を調節することが既知である組織の例には、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等中で異なって発現することが既知である。免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法及び組織／臓器移植後の不要な免疫応答に関与する。免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡは、また、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの態様を調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は、免疫細胞中に排他的に発現し、骨髄樹状細胞中で特に豊富である。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ－１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲに添加することによって遮断され得て、組織及び細胞においてより多くの安定した遺伝子導入を可能にすることが示されてきた。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞中で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞毒性除去を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１；Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
抗原媒介性免疫応答は、生物に侵入する時に抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞の表面上に提示される、外来性抗原によって引き起こされる免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示される抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞毒性除去を誘発し得る。
ｍｉＲ－１４２結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに導入することは、ｍｉＲ－１４２媒介性分解を介して抗原提示細胞中の遺伝子発現を選択的に抑制し得て、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）中の抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後に抗原媒介性免疫応答を予防する。ポリヌクレオチドは、次いで、細胞毒性除去を引き起こすことなしで標的組織または細胞中で安定的に発現する。
一実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞中のポリヌクレオチドの発現を抑制するために、本発明のポリヌクレオチド内に操作され得て、抗原媒介性免疫応答を抑止する。ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞中で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異型タンパク質に対する免疫原性応答を予防するために、任意のｍｉＲ－１２２結合部位は、除去され得て、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に操作され得る。
ＡＰＣ及びマクロファージ中に選択的な分解及び抑圧をさらに駆動するために、本発明のポリヌクレオチドは、単独でまたはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位との組み合わせのいずれかで、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中にさらなる陰性の調節エレメントを含み得る。非限定的な例としては、さらなる陰性の調節エレメントは、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ，ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、新規のｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析を介して免疫細胞中で識別され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７；Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、その各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
肝臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｍｉＲ－１２２８－３ｐ、ｍｉＲ－１２２８－５ｐ、ｍｉＲ－１２４９、ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｍｉＲ－１３０３、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５２、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－５５７、ｍｉＲ－５８１、ｍｉＲ－９３９－３ｐ、及びｍｉＲ－９３９－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、肝臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。肝臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
肺中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１３４、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３２－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｍｉＲ－３８１－３ｐ、及びｍｉＲ－３８１－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肺特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、肺でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。肺特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
心臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１８６－３ｐ、ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３２０、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７４４－３ｐ、ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の心臓特異型マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、心臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。心臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
神経系中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１２４－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７１－３ｐ、ｍｉＲ－１２７１－５ｐ、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－３ｐ、ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｍｉＲ－１５３、ｍｉＲ－１８１ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－１８３－３ｐ、ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｍｉＲ－１９０ａ、ｍｉＲ－１９０ｂ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ，ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｍｉＲ－３６６５、ｍｉＲ－３６６６、ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｍｉＲ－４５４－５ｐ、ｍｉＲ－４８３、ｍｉＲ－５１０、ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５７１、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９２２、ｍｉＲ－９－３ｐ、及びｍｉＲ－９－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。神経系中で濃縮されるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１２－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、ｍｉＲ－３２０ｂ、ｍｉＲ－３２０ｅ、ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｍｉＲ－３２５、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－３２８、ｍｉＲ－９２２が含まれるが、これらに限定されない、ニューロン中で特異的に発現するもの、ならびにｍｉＲ－１２５０、ｍｉＲ－２１９－１－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０６５－３ｐ、ｍｉＲ－３０６５－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３２－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－５ｐ、及びｍｉＲ－６５７が含まれるが、これらに限定されない、グリア細胞中で特異的に発現するものをさらに含む。任意のＣＮＳ特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、神経系でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。神経系特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
膵臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１０５－３ｐ、ｍｉＲ－１０５－５ｐ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９５－３ｐ、ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－７－１－３ｐ、ｍｉＲ－７－２－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、及びｍｉＲ－９４４が含まれるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、膵臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。膵臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
腎臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ－１２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－３ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－１９４－３ｐ、ｍｉＲ－１９４－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ、ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－２－３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－３ｐ、ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、及びｍｉＲ－５６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、腎臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。腎臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
筋肉中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１２８６、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４５－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ、ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、及びｍｉＲ－２５－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、筋肉でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。筋肉特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
ｍｉＲＮＡは、また、例えば、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞だが、これらに限定されない、異なる種類の細胞中で異なって発現する。
内皮細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１００－３ｐ、ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｍｉＲ－１０１－５ｐ、ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｍｉＲ－１２３６－３ｐ、ｍｉＲ－１２３６－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｍｉＲ－２２２－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－４２４－３ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－２－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９２ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。多くの新規のｍｉＲＮＡは、ディープシークエンシング分析から内皮細胞中で発見される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２－４８４）。任意の内皮細胞特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、内皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。
上皮細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－２００ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－４５１ｂ、ｍｉＲ－４９４、ｍｉＲ－８０２及びｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－３４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４４９ａ、ｍｉＲ－４４９ｂ－３ｐ、呼吸器線毛上皮細胞中に特異なｍｉＲ－４４９ｂ－５ｐ、ｌｅｔ－７ファミリー、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、肺上皮細胞中に特異なｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－３８２－３ｐ、腎臓上皮細胞中に特異なｍｉＲ－３８２－５ｐ、ならびに角膜上皮細胞中に特異なｍｉＲ－７６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、上皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。
加えて、ｍｉＲＮＡの大群は、胚性幹細胞中で濃縮され、幹細胞自己再生ならびに様々な細胞、例えば神経細胞、心臓、造血細胞、肌細胞、骨原性細胞、及び筋肉細胞の発達及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７－７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５－６），４２８－４３６；Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９－２０５７、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞において豊富なｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｌｅｔ－ａ－３ｐ、ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｌｅｔ７ｄ－３ｐ、ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２４６、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１３８－１－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－２－３ｐ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－３ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－２９０、ｍｉＲ－３０１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－３ｐ、ｍｉＲ－３０２ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０２ｅ、ｍｉＲ－３６７－３ｐ、ｍｉＲ－３６７－５ｐ、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７０、ｍｉＲ－３７１、ｍｉＲ－３７３、ｍｉＲ－３８０－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｅ、ｍｉＲ－５４８ｆ、ｍｉＲ－５４８ｇ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｇ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｋ、ｍｉＲ－５４８ｌ、ｍｉＲ－５４８ｍ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５４８ｏ－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ｏ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－６６４ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－７６６－３ｐ、ｍｉＲ－７６６－５ｐ、ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｍｉＲ－８８５－５ｐ，ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｍｉＲ－９４１、ｍｉＲ－９６－３ｐ、ｍｉＲ－９６－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。多くの予期される新規のｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞におけるディープシークエンシングによって発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０－６２１；Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６－２５０５、その各々の内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、胚性幹細胞特異型ｍｉＲＮＡの結合部位は、胚性幹細胞の発達及び／または分化を調節するために、変性状態（例えば変性疾患）で幹細胞の老化を阻害するために、または、疾患状態で幹細胞の老化及びアポトーシスを刺激するために、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれ得るか、または本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびにＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現することが既知である及び／またはサイトカイン、例えば内皮細胞及び血小板を分泌することができる細胞における発現及び存在量に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、故に、ｍｉＲＮＡ組は、本発明のポリヌクレオチド中の対応するｍｉＲ部位組み込み（例えば、ｍＲＮＡ）が、特異型細胞型中のｍＲＮＡの不安定化及び／またはこれらのｍＲＮＡからの翻訳の抑圧をもたらし得るように、部分的にこれらの細胞の免疫原性の原因となり得るｍｉＲを含む。非限定的な代表例としては、造血細胞のうち多くに特異な、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、及びｍｉＲ－２２３、Ｂ細胞に発現する、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、及びｍｉＲ－２２３、前駆体造血細胞に発現する、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板、及び内皮細胞に発現するｍｉＲ－１２６が挙げられる。ｍｉＲの組織発現のさらなる考察に関しては、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ－Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０２２５９；Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １２９：１４０１－１４１４；Ｂｉｓｓｅｌｓ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．（２００９）ＲＮＡ １５：２３７５－２３８４を参照されたい。３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲにおける任意の１つのｍｉＲ部位組み込みは、複数の目的の細胞型において、かかる効果を媒介し得る（例えば、ｍｉＲ－１４２は、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方において豊富である）。
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲを有する同じ細胞型を標的にし、両方が豊富である（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ１４２－５ｐの両方が、造血幹細胞において豊富である）場合、３ｐ及び５ｐアームの各々への結合部位を組み込むことは有益であり得る。故に、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）（多くの造血細胞中で発現する）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、及びｍｉＲ－２２３からなる群、または（ｉｉ）（Ｂ細胞中で発現する）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１６、及びｍｉＲ－２２３からなる群、もしくは（前駆体造血細胞中で発現する）ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１６からなる群からの、２つ以上の（例えば、２、３、４つ以上の）ｍｉＲ結合部位を含有する。
いくつかの実施形態では、複数の目的の細胞型が同時に標的にされるように、様々なｍｉＲを組み合わせることが、また、有益であり得る（例えば、造血系及び内皮細胞のうちの多くの細胞を標的にするｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６）。故に、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、造血系細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、またはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とするか、または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、またはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とするか、または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、前駆体造血細胞（例えば、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２６ａ、またはｍｉＲ－１６）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ－１２６）を標的とするか、または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、造血系細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、またはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１６、またはｍｉＲ－２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（ｍｉＲ－１２６）を標的とするか、またはｍｉＲ結合部位の前述の４つの分類（すなわち、造血系細胞を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、前駆体造血細胞を標的とするもの、及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）の任意の他の可能な組み合わせである２つ以上の（例えば、２、３、４つ以上の）ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一実施形態では、免疫応答を調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含み得る。ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みが、免疫細胞活性化（例えば、活性化されたＢ細胞の頻度によって計測されるＢ細胞活性化）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが今や発見された。さらに、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みが、ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害することが今や発見された。
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物中に送達されるポリヌクレオチドの加速血中クリアランスを調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中で発現する１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含み得る。１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みは、ｍＲＮＡの送達に使用するための脂質含有化合物または組成物の急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）を低減または阻害することが今や発見された。さらに、１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みは、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルを低減する（例えば、Ｂ細胞によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急性産生を低減もしくは阻害する）及び／またはｍＲＮＡを含む脂質含有化合物または組成物の投与の後に形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化を低減もしくは阻害することが今や発見された。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列は、免疫細胞で発現する任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得て、これは米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５で教示され、その内容が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれるものを含むが、それらに限定されない。免疫細胞で発現するｍｉＲの非限定的な例としては、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／またはマクロファージで発現するものが挙げられる。例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、及びｍｉＲ－２７は、骨髄細胞中で発現し、ｍｉＲ－１５５は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞中で発現し、ｍｉＲ－１４６は、ＴＬＲ刺激の際、マクロファージ中でアップレギュレートされ、ｍｉＲ－１２６は、形質細胞様樹状細胞中で発現する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞中で豊富にまたは優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１２６－５ｐ）、ｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐ及び／またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５－５ｐ）は、免疫細胞中で豊富に発現する。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野で知られており、故に、当業者は、ワトソン－クリック相補性に基づいて、これらのマイクロＲＮＡが結合する結合配列または標的配列を容易に設計し得る。
したがって、様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、及びｍｉＲ－２７からなる群から選択されるｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための１～４、１、２、３、または４のｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためであり得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現する同じｍｉＲ結合部位の２つ以上の（例えば、２、３、４つの）コピー、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーの使用は、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して有益な特性を示し得る。３つのｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲのための配列の非限定的な例は、配列番号１０６（３つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）及び配列番号１０８（３つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の２つ以上の（例えば、２、３、４つの）コピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号８１（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号８２（１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位）、配列番号１０３（１つのｍｉＲ１２６－３ｐ結合部位）、配列番号１０９（２つのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）、及び配列番号１１２（２つのｍｉＲ－１５５－５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうち１つは、ｍｉＲ－１４２－３ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－３ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうち１つは、ｍｉＲ－１２６－３ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３ｐまたはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１２６－３ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）のための結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１４２－５ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１５５（ｍｉＲ－１５５－３ｐまたはｍｉＲ－１５５－５ｐ）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ－１５５－５ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４２（ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１４６（ｍｉＲ－１４６－３またはｍｉＲ－１４６－５ｐ）、またはｍｉＲ－１５５－５ｐ及びｍｉＲ－１２６（ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ）のための結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡは、また、血管新生（例えば、ｍｉＲ－１３２）（Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）等の複合生物学的プロセスを調節し得る。本発明のポリヌクレオチドにおいて、かかるプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、生物学的に関連性のある細胞型または関連性のある生物学的プロセスにポリヌクレオチドの発現を適合させるために除去または導入され得る。この文脈において、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドとして定義される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上のコピーを含む表３または表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、それらの任意の組み合わせを含む表３または表４から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上の同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合するか、またはｍｉＲ－１４２に相補性がある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２は、配列番号２８を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位は、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３０または配列番号３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合するか、またはｍｉＲ－１２６に相補性がある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１２６は、配列番号８３を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位は、配列番号８５を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位は、配列番号８７を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号８５または配列番号８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、第１のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合し、第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６に結合する。具体的な実施形態では、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号８１または８２の配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
Figure 2022136230000066
Figure 2022136230000067
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で本発明のポリヌクレオチドに挿入される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチド中の挿入部位は、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で、ポリヌクレオチド中のｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が機能的ポリペプチドの翻訳に干渉しない限り、ポリヌクレオチド中のどこでもよく、ｍｉＲＮＡの存在下で、ポリヌクレオチド中のｍｉＲＮＡ結合部位の挿入及び対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ポリヌクレオチドを分解し得るか、またはポリヌクレオチドの翻訳を予防し得る。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある少なくとも約３０ヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド中に挿入される。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ内のコード領域の停止コドン直後に３’ＵＴＲ内に挿入される。いくつかの実施形態では、構築物中に停止コドンの複数のコピーが存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最終停止コドン直後に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、停止コドンのさらに下流で挿入され、その場合、停止コドンとｍｉＲ結合部位（複数可）との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ中のｍｉＲに対する可能な挿入部位の３つの非限定的な例は、配列番号５１、５２、及び１１３に示され、これは、それぞれ、３’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つ内に挿入されるｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を有する３’ＵＴＲ配列を示す。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ以上の可能な挿入部位で５’ＵＴＲ内に位置付けられ得る。例えば、５’ＵＴＲ中のｍｉＲに対する可能な挿入部位の３つの非限定的な例は、配列番号１１５、１１６、及び１１７に示され、これは、それぞれ、５’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つ内に挿入されるｍｉＲ－１４２－３ｐ部位を有する５’ＵＴＲ配列を示す。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの１～１００ヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの３０～５０ヌクレオチド内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン直後の３’ＵＴＲ内、または停止コドン後の３’ＵＴＲの１５～２０ヌクレオチド内、または停止コドン後の３’ＵＴＲの７０～８０ヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間に（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡ尾部ヌクレオチドとの間にスペーサー領域を含む。例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長のスペーサー領域は、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡ尾部の初めとの間に位置し得る。
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの１～１００のヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの１０～５０のヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの少なくとも２５のヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドン前の５’ＵＴＲの１５～２０のヌクレオチド内、または開始コドン前の５’ＵＴＲの７０～８０のヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２～４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間に（例えば、１０～１００、２０～７０、または３０～５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超える停止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、停止コドンの下流に位置付けられる。例えば、３’ＵＴＲは、１、２、または３つの停止コドンを含み得る。使用され得る三重停止コドンの非限定的な例としては、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧが挙げられる。３’ＵＴＲ内で、例えば、１、２、３、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位は、停止コドン（複数可）に直接隣接して、または最終停止コドンの下流にある任意の数のヌクレオチドで位置付けられ得る。３’ＵＴＲが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、これらの結合部位は、構築物中で互いに直接隣接して（すなわち、順に）位置づけられ得て、または、代替的に、スペーサーヌクレオチドは、各結合部位の間に位置付けられ得る。
一実施形態では、３’ＵＴＲは、第３の停止コドンの下流に位置する単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３つの停止コドンを含む。最終停止コドンの下流にある異なる位置に位置する３つの停止コドン及び単一のｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、以下の表４に示される。
表４は、本出願の発明における有用なｍｉＲ配列、ｍｉＲ結合部位、及びＵＴＲの非限定的な例を含む。
Figure 2022136230000068
Figure 2022136230000069
Figure 2022136230000070
Figure 2022136230000071
Figure 2022136230000072
Figure 2022136230000073
停止コドン＝太字
ｍｉＲ１４２－３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲ１２６－３ｐ結合部位＝太字下線
ｍｉＲ１５５－５ｐ結合部位＝陰影付き
ｍｉＲ１４２－５ｐ結合部位＝陰影付き及び太字下線
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞中に発現するｍｉＲのための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結したヌクレオシドの３’尾部領域を含む。様々な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞中に発現する、好ましくは免疫細胞中に豊富または優先的に発現する、ｍｉＲのための１～４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一実施形態では、免疫細胞中に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３０に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１４２－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号８８に示される配列を含む。
一実施形態では、免疫細胞中に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６結合部位は、ｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号８５に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ－１２６－３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１０３に示される配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲのための非限定的な例となる配列としては、以下、ｍｉＲ－１４２－３ｐ（配列番号２９）、ｍｉＲ－１４２－５ｐ（配列番号３１）、ｍｉＲ－１４６－３ｐ（配列番号８９）、ｍｉＲ－１４６－５ｐ（配列番号９０）、ｍｉＲ－１５５－３ｐ（配列番号９１）、ｍｉＲ－１５５－５ｐ（配列番号９２）、ｍｉＲ－１２６－３ｐ（配列番号８４）、ｍｉＲ－１２６－５ｐ（配列番号８６）、ｍｉＲ－１６－３ｐ（配列番号９３）、ｍｉＲ－１６－５ｐ（配列番号９４）、ｍｉＲ－２１－３ｐ（配列番号９５）、ｍｉＲ－２１－５ｐ（配列番号９６）、ｍｉＲ－２２３－３ｐ（配列番号９７）、ｍｉＲ－２２３－５ｐ（配列番号９８）、ｍｉＲ－２４－３ｐ（配列番号９９）、ｍｉＲ－２４－５ｐ（配列番号１００）、ｍｉＲ－２７－３ｐ（配列番号１０１）、及びｍｉＲ－２７－５ｐ（配列番号１０２）が挙げられる。免疫細胞中に発現する（例えば、免疫細胞中に豊富にまたは優先的に発現する）他の好適なｍｉＲ配列は、当該技術分野、例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅで既知であり、利用可能である。前述のｍｉＲのうちいずれかを結合する部位が、ｍｉＲに対するワトソン－クリック相補性、ｍｉＲに対する典型的には１００％の相補性に基づいて、設計され得て、本明細書に記載される本開示のｍＲＮＡ構築物内に挿入され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、それらの３’ＵＴＲ）は、例えば、ＰＥＧに対してＢ細胞によりＩｇＭｓの産生を例えば低減または阻害することによって、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を低減または阻害することによって、それにより加速血中クリアランスを低減または阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得て、コードされる目的のタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
ｍｉＲＮＡ結合部位の間の距離は相当に変化し得て、２つのｍｉＲＮＡ結合部位の異なる配置を有するいくつかの異なる構築物が試験されてきて、全て機能的である。ある特定の実施形態では、ヌクレオチドスペーサーは、それぞれへのＲＩＳＣの結合を可能にするのに十分な長さの２つのｍｉＲＮＡ結合部位の間に位置付けられる。一実施形態では、２つのｍｉＲＮＡ結合部位は、互いから約４０塩基離れて位置付けられ、３’ＵＴＲの全長は、約１００～１１０塩基である。
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、取り囲む配列の種類、配列の種類（例えば、異種、同種、外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）、外因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）、または人工）、取り囲む配列中の調節エレメント、及び／または取り囲む配列中の構造的エレメント等の、しかしそれに限定されない、ｍｉＲＮＡを取り囲む配列によって影響され得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによって影響され得る。非限定的な例としては、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列の種類のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の調節効果を増加し得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造的エレメントが、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響し得る。調節エレメント及び／または構造的エレメントの一実施例は、タンパク質翻訳を開始する翻訳伸長因子の結合に必要な５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）である。５’－ＵＴＲ中のこの二次構造化エレメントに結合するＥＩＦ４Ａ２は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５）。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子調節を増大させるために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。この文脈では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであり得るか、または異なるｍｉＲＮＡ部位であり得る。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせとしては、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかのうちの１つを超えるコピーが組み込まれる組み合わせが挙げられ得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的にし得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲ中の組織特異型、細胞型特異型、または疾患特異型ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、特異型細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞等）中の発現の程度が低減され得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中の３’ＵＴＲの５’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の近くで操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近くで、及び３’ＵＴＲの３’末端近くで操作され得る。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補性であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチド中に少なくとも１つのセンサー配列を組み込むこと及び投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって、制御され得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと及び本明細書に記載の脂質のうちのいずれかを含むイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子におけるポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞に対して標的化され得る。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件中のｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特異型の組織、細胞型、または生物学的条件における、より標的化された発現のために操作され得る。組織特異型ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞中の、または生物学的条件の文脈における最適なタンパク質発現のために設計され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列と１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列と１００％未満の同一性を有するかのいずれかのｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むために設計され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列と少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むために設計され得る。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少するために部分的に変異され、そのようにしてポリヌクレオチドの低減された発現低下をもたらし得る。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度が、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するためにレオスタットとして作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域中の変異は、また、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響し得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’または３’ステムに組み込まれ得る。
一実施形態では、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）は、ステムループのステムの５’末端上に組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端上に組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループ後のステムまたは配列の３’末端に組み込まれ得る。ｍｉＲＮＡシード及びｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ及び／または異なるｍｉＲＮＡ配列用であり得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増加及び／または減少し得るステムループ領域の形態を変化させる。（例えば、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７－３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ－２２１ ａｎｄ ｍｉＲ－２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照されたい。）
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’－ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、シードなしの１９または２２のヌクレオチド配列及び／またはｍｉＲＮＡ配列であり得るが、それらに限定されない。
一実施形態では、５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定するために使用され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、開始コドン等だが、それらに限定されない、翻訳開始の部位の到達性を減少するために使用され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたく、これは、開始コドン（－４～＋３７で、ＡＵＧコドンのＡが＋１）の周りでアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）を、第１の開始コドン（ＡＵＧ）への到達性を減少するために使用した。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドンの周囲の配列をＬＮＡまたはＥＪＣで変更することが、ポリヌクレオチドの効率、長さ、及び構造的安定性に影響したことを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位への到達性を減少するために、翻訳開始の部位の近くでｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、または内部であり得る。非限定的な例としては、翻訳開始の部位は、シード配列または結合部位等のｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原の提示を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例としては、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例としては、抗原の提示を弱めるために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２－３ｐである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞中でコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例としては、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－３ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４２－５ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位、ｍｉＲ－１４６結合部位、ｍｉＲ－１４６シード配列、及び／またはシード配列なしのｍｉＲ－１４６結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、治療的送達によって引き起こされる不要な免疫原性の反応を抑止するため、免疫細胞中でｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲ中に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例としては、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において、本発明のポリヌクレオチドをより不安定にし得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそれらのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）及び（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、またはｍｉＲ－２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、またはｍｉＲ－１５５に結合する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞中で発現し、ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるヌクレオ塩基の一種（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む、送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
１３．３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
３’－ＵＴＲは、翻訳終了コドンのすぐ後に続き、転写後に遺伝子発現に影響する調節領域をしばしば含む、ｍＲＮＡの部分である。３’－ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響し得る。一実施形態では、本発明に有用な３’－ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡのための結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号８１、８２、１０３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
１４．５’キャップを有する領域
本発明は、また、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増大し、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して、細胞中のｍＲＮＡ安定性及び翻訳適格性の原因になるｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、成熟サイクリックｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡのスプライシングの間に、さらに５’近位イントロンの除去を支援する。
外因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャッピングされ得て、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間で５’－ｐｐｐ－５’－トリホスフェート結合を生成する。この５’グアニル酸キャップは、その後メチル化されてＮ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意選択で、また、２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’キャップ除去は、分解のためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
例となる実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、または特に、ポリヌクレオチド（またはｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲは、キャップ構造を含むか、またはキャッピングされる。
例となる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの部分またはセグメント、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリＡ尾部は、作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を予防し、故にｍＲＮＡ半減期を増加する非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造加水分解が５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾されたヌクレオチドは、キャッピング反応の間に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からのワクシニアキャッピング酵素は、製造者の指示に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドと共に使用され、５’－ｐｐｐ－５’キャップ中でホスホロチオアート結合を作製し得る。α－メチル－ホスホネート及びセレノ－リン酸ヌクレオチド等の追加の修飾されたグアノシンヌクレオチドが、使用され得る。
追加の修飾には、５’末端のリボース糖の２’－Ｏ－メチル化及び／または糖環の２’ヒドロキシル基上の（前述の）ポリヌクレオチドの５’末端前ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。複数の明確に異なる５’キャップ構造は、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチド等の核酸分子の５’キャップを生成するために使用され得る。本明細書で、また、合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体と称されるキャップ類似体は、キャップ機能を保持する一方で、それらの化学構造において天然の（すなわち、外因性、野生型、または生理的）５’キャップと異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）または酵素的に合成され、及び／または本発明のポリヌクレオチドに連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－トリホスフェート基によって連結される２つのグアニンを含み得て、１つのグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリホスフェート－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；同じく３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも呼ばれ得る）を含む。他の、非修飾グアニンの３’Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結するようになる。Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例となるキャップは、ＡＲＣＡと同様だが、グアノシン上の２’－Ｏ－メチル基を有するｍＣＡＰである（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリホスフェート－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例としては、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるホスフェート位置で、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載の、ジヌクレオチドキャップ類似体等の、ボラノホスフェート基またはホホロセレノ酸基で修飾され得る。
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体は、当該技術分野で知られており及び／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載の様々なキャップ類似体及びキャップ類似体を合成する方法を参照されたい）。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体がインビトロ転写反応においてポリヌクレオチドまたはそれらの領域の同時キャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％は、キャッピングされないままを維持し得る。これ、ならびに外因性細胞転写機構によって生成される核酸の外因性５’キャップ構造からのキャップ類似体の構造的差異は、低減された翻訳適格性及び低減された細胞安定性をもたらし得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、また、製造（ＩＶＴまたは化学合成のいずれか）後、より真正な５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用してキャッピングされ得る。本明細書で使用されるとき、「より真正な」という語句は、外因性または野生型特徴を、構造的にまたは機能的にのいずれかで、綿密に写すかまたは模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、例えば、従来技術の合成の特徴もしくは類似体等と比較して、外因性、野生型、天然、もしくは生理的細胞機能及び／または構造をより良く表すか、または１つ以上の点において、対応する外因性、野生型、天然、もしくは生理的特徴よりも性能が優れている。本発明のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野で知られている合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低減された感受性、及び／または低減された５’キャップ除去を増大するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準５’－５’－トリホスフェート結合を作製し得て、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含む。かかる構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野で知られている他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性及び細胞安定性ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの低減された活性化をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
非限定的な例としては、製造後にキメラポリヌクレオチドをキャッピングすることは、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドはキャッピングされ得るため、より効率的であり得る。これは、インビトロ転写反応の経過においてキャップ類似体がキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％と対照的である。
本発明に従って、５’末端キャップは、外因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
１５．ポリＡ尾部
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡ尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡ尾部は、脱３’ヒドロキシル尾部を含む。
ＲＮＡプロセシングの間、アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）の長鎖が、安定性を増加するために、ｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに添加され得る。転写直後で、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルを取り除き得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに添加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、例えば、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む、約８０～約２５０残基長であり得るポリＡ尾部を添加する。
ポリＡ尾部は、また、構築物が核から輸送された後に添加され得る。
本発明に従って、ポリＡ尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、脱３’ヒドロキシル尾部を含み得る。これらは、また、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）によって教示される構造的部分または２’－Ｏメチル修飾を含み得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡ尾部構造を有する転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙに従って、「末端ユリジン化は、また、ヒト複製依存的ヒストンｍＲＮＡに関して検出されてきた。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製の完了または抑制後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積を予防するために重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部のそれらの欠乏によって区別され、その機能は、代わりに、安定的なステムループ構造及びその同族ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって仮定され、後者は、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ上のＰＡＢＰのものと同じ機能を実行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
固有のポリＡ尾部長は、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点を提供する。一般に、ポリＡ尾部の長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドまたはそれより大きい）より長い。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域は、約３０～約３，０００（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、全体のポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さと比べて設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づくか、または、ポリヌクレオチドから発現する最終産物の長さに基づき得る。
この文脈において、ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチドまたはそれらの特徴より長さにおいて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くあり得る。ポリＡ尾部は、また、それが属するポリヌクレオチドの部分として設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長、構築物領域、またはポリＡ尾部を引いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの操作された結合部位及び抱合は、発現を増大させ得る。
加えて、複数の明確に異なるポリヌクレオチドは、ポリＡ尾部の３’末端で、修飾されたヌクレオチドを使用して、３’末端によってＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して共に連結され得る。トランスフェクション試験は、関連性のある細胞株中で行われ得て、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び７日後で、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧ－リッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇ－カルテットは、ポリＡ尾部の末端で組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、様々な時点で、安定性、タンパク質産生、及び半減期を含む他のパラメータを評価される。ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡ尾部のみを使用して見出されるものの少なくとも７５％と同等のｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見されてきた。
１６．開始コドン領域
本発明は、また、開始コドン領域と本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似の領域または開始コドン領域のような機能を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドン上で開始し得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ等であるが、それに限定されない、代替の開始コドン上で開始し得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、その内容の各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
非限定的な例としては、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧ上で開始する。別の非限定的な例としては、ポリヌクレオチド翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始する。さらに別の非限定的な例としては、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始する。
開始コドンまたは代替の開始コドン等であるが、それらに限定されない、翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響することが知られている。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることは、ポリヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を改変するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、マスキング剤が、コドンをマスキングまたは隠して、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンでの翻訳開始の可能性を低減するために、開始コドンまたは代替の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｍａｓｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ＬＮＡ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、マスキング剤は、翻訳が代替の開始コドン上で開始する可能性を増加するために、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、マスキング剤が、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替の開始コドン上での翻訳が開始する可能性を増加するために、第１の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスキングするために使用され得る。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体内に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体は、マスキング剤と同様のポリヌクレオチドの翻訳、長さ、及び／または構造の制御の一助となり得る。非限定的な例としては、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体の中間に位置し得る。開始コドンまたは代替の開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチド後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンは、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンではないコドン上で開始させるために、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの後のコドン上、または下流開始コドンもしくは代替の開始コドン上で開始し得る。非限定的な例では、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧは、下流開始コドンまたは代替の開始コドン上で翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列の第１の３ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するために、または制御しようとして、下流開始コドン及び／または代替の開始コドンのための少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
１７．停止コドン領域
本発明は、また、停止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）前に少なくとも２つの停止コドンを含み得る。停止コドンは、ＤＮＡの場合、ＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合、ＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合、停止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合、停止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の停止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の停止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続停止コドン、４つの停止コドン、またはそれ以上を含む。
１８．挿入及び置換
本発明は、また、挿入及び／または置換をさらに含む本開示のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／または紐の挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域及び／または紐には、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されず、ヌクレオチドは天然及び／または非天然であり得る。非限定的な例としては、ヌクレオチドの群は、５－８アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれかの紐、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれか、及び／またはそれらの組み合わせ等であるが、それらに限定されない、２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／または紐の挿入によって置き換えられ得る。例えば、５’ＵＴＲは、５－８アデニン塩基の挿入の後に５－８シトシン塩基の挿入によって置き換えられ得る。別の例では、５’ＵＴＲは、５－８シトシン塩基の挿入の後に５－８アデニン塩基の挿入によって置き換えられ得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流にある少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。非限定的な例としては、少なくとも１つの置換及び／または挿入が、（例えば、＋１～＋６であるが、これに限定されない）転写開始部位のすぐ下流にある領域で少なくとも１つの核酸を置換することにより、転写開始部位の下流で発生し得る。転写開始部位のすぐ下流にあるヌクレオチドの領域に対する改変は、開始速度に影響し、明らかなヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応一定値を増加し、転写複合体硬化開始転写からの短い転写物の解離を増加し得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｉｅｂａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４－５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換、及び／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列で変異を引き起こし得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流にある少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３グアニン塩基の置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流にある領域で少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６グアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例としては、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４アデニン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４シトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４チミン、及び／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流にある少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。明瞭さの目的のため、当業者は、開始コドンがタンパク質コード領域の第１のコドンである一方で、転写開始位置が転写が開始する位置であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドには、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８置換及び／または挿入が含まれ得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流にある１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの位置で挿入及び置換され得る。挿入された及び／または置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、Ａ及びＣ、Ａ及びＴ、またはＣ及びＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、及びＴ、またはＡ、Ｃ、及びＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
非限定的な例としては、ポリヌクレオチド中のコード領域の上流にあるグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチド中のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流及び開始コドンの前にある領域中に１つのグアニン塩基を残すために設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９－５０３を参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例としては、少なくとも５ヌクレオチドは、転写開始部位の下流であるが開始コドンの上流にある１つの位置で挿入され得て、少なくとも５ヌクレオチドは、同じ塩基の種類であり得る。
１９．ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端へと、下記を含む。
（ｉ）上記で提供される５’キャップ；
（ｉｉ）上記で提供される配列等の５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるＧＬＡをコードする配列最適化核酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つの停止コドン；
（ｖ）上記で提供される配列等の３’ＵＴＲ；
（ｖｉ）上記で提供されるポリＡ尾部。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ＧＬＡのタンパク質配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記に提供される５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１と、（２）配列番号１１９、１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、（３）上記に提供されるポリＡ尾部、例えば、およそ１００残基のポリＡ尾部を含み、
配列番号１１９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号７９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号８０のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２２は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４１のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２３は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４２のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２４は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４３のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２５は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４４のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２６は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４５のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２７は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４６のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２８は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４７のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１２９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４８のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３１は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５０のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３２は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５１のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３３は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５２のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３４は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５３のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３５は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５４のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３６は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５５のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３７は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５６のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３８は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５７のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１３９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５８のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１４０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
配列番号１６０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号７９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１０３の３’ＵＴＲを含む。
Figure 2022136230000074
Figure 2022136230000075
Figure 2022136230000076
Figure 2022136230000077
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Figure 2022136230000082
２０．ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、また、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはそれらの補体を作製する方法を提供する。
いくつかの態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を使用して構築され得る。他の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用する化学合成によって構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で知られている任意の他の方法の１つ以上の組み合わせによって作製される。
天然に生じるヌクレオシド、非天然に生じるヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列中に存在する天然に生じるヌクレオシドを完全にまたは部分的に置き換え得て、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれ得る。結果として得られるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、その後、タンパク質を産生及び／または治療的転帰を産生する能力を試験され得る。
ａ．インビトロ転写／酵素合成
本明細書に開示される本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。システムは、典型的には、転写緩衝、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然の及び非天然の（修飾された）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを組み込み得るポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。米国公開第ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本発明のポリヌクレオチドの合成において使用され得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失することによって修飾され得る。非限定的な例としては、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して２’修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む増加された能力を示すように修飾され得る（それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ２００８０７８１８０及び米国特許８，１０１，３８５を参照されたい）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化すること、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸及び／または核酸配列を最適化することによって、及び／または当該技術分野で知られている他の方法を使用することによって得られ得る。非限定的な例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔら（それらの全体において参照により本明細書に組み込まれるＮａｔｕｒｅ ４７２：４９９－５０３（２０１１））によって提示される連続した定向進化系を使用して進化され得て、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、トレオニンで置換された９３位のリジン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆ等であるが、それらに限定されない、少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００１２００２４号及び第２００７０１１７１１２号で記載されるように、少なくとも変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントには、また、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントが含まれ得るが、これらに限定されない。
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。それによって、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列改変の部位または領域を含有するように修飾され得る。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素方法によって行われ得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖中のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の作製を触媒する。現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の比較及び結晶構造の分析に基づいて、異なるファミリーに分割され得る。Ｅ．ｃｏｌｉのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７ ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）またはＡポリメラーゼファミリーは、これらのファミリーのうち最もよく研究されたもの１つである。別の大きなファミリーは、全て真核複製ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４及びＲＢ６９からのポリメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ α）またはＢポリメラーゼファミリーである。これらは同様の触媒機構を用いるが、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質の特異性、基質類似体組み込み効率、プライマー伸長の度合い及び速度、ＤＮＡ合成のモード、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感受性が異なる。
ＤＮＡポリメラーゼは、また、反応温度、ｐＨ、ならびにテンプレート及びプライマー濃度等の必要とする最適反応条件に基づいて選択される。ときに、１つを超えるＤＮＡポリメラーゼの組み合わせは、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、クローン化挿入及びヒトゲノムＤＮＡからの長い標的を効果的に増幅するために、ｐＨを増加し、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少し、伸長時間を増加し、及び３’～５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する二次耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ９１：５６９５－５６９９（１９９４）、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６からのＲＮＡポリメラーゼが、生化学及び生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するために広く使用されてきた。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属中の国際公開第ＷＯ２０１４０２８４２９号で開示され、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
一態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用され得るＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼである。（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｚｈｕらによって、海洋性シアノファージＳｙｎ５から、近年特徴付けられ、彼らは、また、プロモーター配列を識別した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して温度及び塩分のより広い範囲にわたってＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターにおける開始ヌクレオチドの要件として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼに対してよりストリンジェントでないことが見出されており、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ合成に有望となっている。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例としては、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成に使用され得る。
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターは、ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例としては、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）によって説明される５’－ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ－３’（配列番号７６）であり得る。
一態様では、Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載の及び／または当該技術分野で既知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用され得る（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３に記載のシュード－ＵＴＰ及び５Ｍｅ－ＣＴＰの組み込みを参照されたい）。
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）によって記載される変更及び改善された精製手順を使用して精製されてきたＳｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成され得る。
遺伝子操作における様々なツールは、テンプレートとして作用する標的遺伝子の酵素増幅に基づく。目的の個体の遺伝子または具体的な領域の配列の研究及び他の研究の必要のために、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さな試料からの標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。かかる方法が、本発明のポリヌクレオチドの製造において適用され得る。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の製造で利用され得る。
リガーゼによりポリヌクレオチドまたは核酸を構成することが、また、広く使用される。
ｂ．化学合成
標準的な方法は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）等の目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するように適用され得る。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む単一ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーは、合成され得る。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドは、合成され得、次いでライゲーションされ得る。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的な集合体のために５’または３’突出を含む。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野で既知の化学合成方法及び潜在的なヌクレオ塩基置換を使用して化学合成され得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、第ＷＯ２０１３０５２５２３号；第ＷＯ２０１３０３９８５７号、第ＷＯ２０１２１３５８０５号、第ＷＯ２０１３１５１６７１号；米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号；または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは第ＵＳ８７１０２００号を参照されたく、それらの全ては、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
ｃ．ＧＬＡをコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製には、ポリヌクレオチドの浄化、品質保証、及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。浄化は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）等の当該技術分野で知られている方法、または、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疏水的相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣに基づく精製方法によって行われ得るが、これらに限定されない。
「精製されたポリヌクレオチド」等のポリヌクレオチドに関して使用されるときの「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用されるとき、「汚染物質」は、別のものを不適当、不純、または劣等にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、天然に見出されるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれが治療もしくは精製方法を受ける前に存在したものとは異なる形態もしくは環境で存在する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、不要な免疫応答を低減または除去し得る不純物を除去し、例えば、サイトカイン活性を低減する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与の前に精製される。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製される本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法によって精製される本開示の同じポリヌクレオチドと共に得られる発現レベルと比較して、コードされたＧＬＡタンパク質の増加された発現を呈する。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））精製されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている点突然変異のうちの１つ以上を含むＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中のＧＬＡタンパク質の発現レベルに対して、細胞中でＧＬＡタンパク質発現レベルを、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中のＧＬＡタンパク質の機能的発現レベルに対して、細胞中で機能的ＧＬＡタンパク質発現レベルを、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ－ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中の機能的ＧＬＡの活性レベルに対して、細胞中で検出可能なＧＬＡ活性を、例えば、１０～１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、精製されたポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理のチェックは、ゲル電気泳動法、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣ等の方法を使用して行われ得るが、これらに限定されない。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法によって配列され得る。
ｄ．ＧＬＡをコードする発現されたポリヌクレオチドの定量化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現生成物、ならびに分解生成物及び代謝産物は、当該技術分野で知られている方法に従って定量化され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エクソソーム中または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。本明細書で使用されるとき、「体液」は、末梢血液、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、関節液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、排泄物、毛髪、涙、嚢胞液、肋膜及び腹膜液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞液、ならびに臍帯血を含む。代替的に、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
エクソソーム定量化方法では、２ｍＬ以下の試料は、対象、及びサイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、分画遠心分離法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離されるエクソソームから得られる。分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、不完全、または変更であり得る。そのレベルが１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関があることが有利である。
アッセイは、構築物の特定のプローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動法、質量分析、またはそれらの組み合わせを使用して行われ得るが、一方でエクソソームは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）方法等の免疫組織化学的方法を使用して単離され得る。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、分画遠心分離法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離され得る。
これらの方法は、研究者らに、即時に、残っているまたは送達されるポリヌクレオチドのレベルを監視する能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが、構造または化学修飾に起因する外因性形態とは異なるため、可能である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、これに限定されないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等の方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、適切なサイズであり得るかどうかを決定し、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。ポリヌクレオチドの分解は、これらに限定されないが、アガロースゲル電気泳動法、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疏水的相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣに基づく精製方法、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、ならびキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）等の方法によって確認され得る。
２１．医薬組成物及び製剤
本発明は、上記に記載されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸配列に対する著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、及びｍｉＲ－２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、任意選択で、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的及び／または予防的活性物質を含み得る。本発明の医薬組成物または製剤は、無菌及び／または発熱物質を含まないものであり得る。医薬品の製剤及び／または製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体において参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般に、本明細書に記載される通りに送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載される製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助的な成分と会合させ、次いで、必要な場合及び／または望ましい場合、生成物を所望の単回用量単位または複数回用量単位へ、分割、成形、及び／または包装する工程を含む。
本開示に従う医薬組成物または製剤は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、包装、及び／または大量に販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、活性成分の所定の量を含む医薬組成物の離散的な量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の用量及び／または例えば、かかる用量の２分の１または３分の１等のかかる用量の好都合な割合に等しい。
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬として許容され得る賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、同一性、サイズ、及び／または治療されている対象の状態に応じて変化し得、組成物が投与される経路にさらに応じて変化し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び製剤は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、本発明の１、２、３、４、または５つのポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または製剤は、１つを超える種類のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、直鎖及び環状形態でポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びインビトロ転写（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、及び環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書に提供される医薬組成物及び製剤の説明は、ヒトへの投与に好適な医薬組成物及び製剤を主に対象とするが、かかる組成物は、一般に任意の他の動物へ、例えば、非ヒト動物へ、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化され、（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションを増加させる；（３）持続または遅延放出（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）を可能にする；（４）生体分布（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に対して標的化する）を変化させる；（５）インビボでコードされるタンパク質の翻訳を増加させる；及び／または（６）インビボでコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
本明細書で使用されるとき、医薬として許容され得る賦形剤には、所望の特定の剤形に適するような、任意及び全ての溶媒、分散媒、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、潤滑剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、抗酸化剤、抗微生物薬もしくは抗真菌薬、オスモル濃度調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結防止剤、及び／または充填剤が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤及び組成物を調製するため技術は、当該技術分野で知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏを参照されたい（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
例となる希釈剤には、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となる造粒剤及び／または分散剤には、スターチ、予備糊化スターチ、もしくは微結晶スターチ、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル－ピロリドン）、（ポビドン）、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となる界面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、蝋、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となる結合剤には、スターチ、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に液体ｍＲＮＡ製剤の潜在的な分解経路である。酸化を防ぐために、抗酸化剤が製剤に添加され得る。例となる抗酸化剤には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ベンジルアルコール、ブチルヒドロキシアニソール、ｍ－クレゾール、メチオニン、ジブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸ナトリウムもしくはピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となるキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となる抗微生物薬または抗真菌薬には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたは安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となる防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β－カロチン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、ｐＨ５～ｐＨ８で維持され、安定性を改善する。ｐＨを制御するための例となる緩衝剤は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジン－ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
例となる潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、滑石、麦芽、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸マグネシウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結防止剤を含み、凍結の間にポリヌクレオチドを安定化し得る。例となる凍結防止剤には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結乾燥されたポリヌクレオチド製剤中に充填剤を含み、「医薬的に優れた」を固形物を産出し、長期間（例えば、３６カ月）の保管の間、凍結乾燥されたポリヌクレオチドを安定化させ得る。本発明の例となる充填剤には、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤は、限定することなく、リポソーム、脂質ナノ粒子、脂質様物質、ポリマー、リポプレックス、マイクロベシクル、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組み合わせを含み得る。
２２．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療剤及び／または予防剤、例えば、ｍＲＮＡの、哺乳類細胞または器官への送達のために、脂質ナノ粒子組成物として有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性をほとんどまたは全く有しない。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較してより低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質及び治療剤または予防剤、例えば、ｍＲＮＡを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、増加した治療インデックスを有する。
ある特定の実施形態では、本出願は、
（ａ）ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｂ）送達剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する脂質化合物であって、
Figure 2022136230000083
式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
脂質化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、アルキル及びアルケニル基は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合の５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、化合物が含まれる。
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員～１４員のヘテロアリールまたは８員～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員～１４員のヘテロアリールまたは８員～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
依然として別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
依然として別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
依然として他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
依然として他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、
Figure 2022136230000084
またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、
式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２でり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物、
Figure 2022136230000085
またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
Figure 2022136230000086
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
Figure 2022136230000087
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）のもの、
Figure 2022136230000088
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）のもの、
Figure 2022136230000089
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されるＲ４を含み、式中、Ｑ、Ｒ及びｎは、上記で定義される通りである。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択され、式中、Ｒは、上記で定義される通りである。いくつかの態様では、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
Figure 2022136230000090
またはその塩であり、式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、上記で定義される通りである。
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ３は、Ｃ５－Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ６は、Ｈである。
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物と、（２）任意選択でヘルパー脂質（例えばリン脂質）と、（３）任意選択で構造脂質（例えばステロール）と、（４）任意選択で脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ－脂質）とを含む、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例となる実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中にカプセル封入されたポリヌクレオチドをさらに含む。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの炭素原子）を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
「Ｃ１－１４アルキル」という表記は、１～１４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
「Ｃ２－１４アルケニル」という表記は、２～１４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４つ、またはそれよりも多くの二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であり得る。
「Ｃ３－６炭素環」という表記は、３～６個の炭素原子を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、アリール基）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２－ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「複素環」または「複素環式基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１個のヘテロ原子を含む、１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であり得る。複素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、ヘテロアリール基）。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「生分解性基」は、対象における脂質のより迅速な代謝を促進し得る基である。生分解性基は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「アリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基は両方とも、任意選択で置換され得る。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式において、Ｍ及びＭ’は独立して、上記の生分解性基の一覧から選択され得る。
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、別途明記されない限り、任意選択で置換され得る。任意選択的な置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、－ＯＨ）、エステル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にＣ＝Ｏで表される）、アシルハロゲン化物（例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である））、炭酸塩（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、－ＯＲ）、アセタール（例えば、－Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“（式中、各ＯＲは、同じまたは異なり得るアルコキシ基であり、Ｒ”“は、アルキルまたはアルケニル基））、リン酸塩（例えば、Ｐ（Ｏ）４ ３－）、チオール（例えば、－ＳＨ）、スルホキシド（例えば、－Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（ｔｈｉａｌ）（例えば、－Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸イオン（例えば、Ｓ（Ｏ）４ ２－）、スルホニル（例えば、－Ｓ（Ｏ）２－）、アミド（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、－Ｎ３）、ニトロ（例えば、－ＮＯ２）、シアノ（例えば、－ＣＮ）、イソシアノ（例えば、－ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、－ＮＲ２、－ＮＲＨ、または－ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、－Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、－Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなるが、これらに限定されない群から選択され得る。
前述のうちのいずれにおいても、Ｒは、本明細書で定義されるアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換され得る。例えば、Ｃ１－６アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換され得る。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、及び（ＩＩｅ）のうちのいずれか１つの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員の芳香族または非芳香族複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員～１４員のヘテロアリールまたは８員～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１－４アルキル、例えば、非置換メチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ”は、Ｃ４－８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分岐鎖（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イル、またはヘプタデカ－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
Figure 2022136230000091
である。
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ５－２０アルキルまたはＣ５－２０アルケニル（例えば、Ｃ３－６炭素環で置換された、例えば、１－シクロプロピルノニル）である。
他の実施形態では、Ｒ１は、－Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、－Ｒ＊ＹＲ”及び－ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ３－８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ６－１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ４－９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択される。
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分岐鎖（例えば、デカン－２－イル、ウンデカン－３－イル、ドデカン－４－イル、トリデカン－５－イル、テトラデカン－６－イル、２－メチルウンデカン－３－イル、２－メチルデカン－２－イル、３－メチルウンデカン－３－イル、４－メチルドデカン－４－イルまたはヘプタデカ－９－イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
Figure 2022136230000092
である。
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１－１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１－１８アルキル（例えば、Ｃ３－６炭素環で置換されるＣ１－１５アルキル、例えば、１－シクロプロピルノニル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は、－ＯＣ（Ｏ）－である。
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、いくつかの実施形態では、Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－である。いくつかの実施形態では、Ｍは、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－である。
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。ある特定のかかる実施形態では、各Ｒ６もまた、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ－プロピル）である。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキルまたはＣ５－１４アルケニルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ７アルキルである。
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１－７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３は、Ｈである。
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、及び複素環からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Ｑは、－ＯＨである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換５員～１０員のヘテロアリール、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２－アミノ－１，９－ジヒドロ－６Ｈ－プリン－６－オン－９－イル（またはグアニン－９－イル）、アデニン－９－イル、シトシン－１－イル、またはウラシル－１－イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、置換された５員～１４員のヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４－メチルピペラジニル、４－（４－メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン－２－イル－１，３－ジオンである。
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換Ｃ６－１０アリール（フェニル等）またはＣ３－６シクロアルキルである。
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の他の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、－（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４－メトキシベンジルであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３－６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１－６アルキル等で任意選択で置換される、シクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２－ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１－３アルキルまたは非置換Ｃ２－３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒは、置換Ｃ１－３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員～１４員の芳香族または非芳香族複素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族であれ非芳香族であれ、任意選択で置換されるＣ３－２０炭素環（例えば、Ｃ３－１８炭素環、Ｃ３－１５炭素環、Ｃ３－１２炭素環、またはＣ３－１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３－６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはフェニル基等のＣ６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３－６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子においてまたは隣接したもしくは隣接していない環原子において）置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を持つシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３によって形成される複素環またはＣ３－６炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されるシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基等のＣ７－１５炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基等のＣ３－６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３－６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子においてまたは隣接したもしくは隣接していない環原子において）置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を持つフェニル基を形成し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、式（Ｉ）の化合物は、下記からなる群から選択される。
Figure 2022136230000093
Figure 2022136230000094
Figure 2022136230000095
Figure 2022136230000096
Figure 2022136230000097
Figure 2022136230000098
Figure 2022136230000099
Figure 2022136230000100
Figure 2022136230000101
Figure 2022136230000102
Figure 2022136230000103
Figure 2022136230000104
Figure 2022136230000105
Figure 2022136230000106
Figure 2022136230000107
Figure 2022136230000108
Figure 2022136230000109
Figure 2022136230000110
Figure 2022136230000111
Figure 2022136230000112
Figure 2022136230000113
Figure 2022136230000114
Figure 2022136230000115
Figure 2022136230000116
Figure 2022136230000117
Figure 2022136230000118
Figure 2022136230000119
Figure 2022136230000120
Figure 2022136230000121
Figure 2022136230000122
Figure 2022136230000123
Figure 2022136230000124
及びそれらの塩もしくは立体異性体。
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１～化合物１４７からなる群、またはその塩もしくは立体異性体から選択される。
いくつかの実施形態では、中心ピペラジン部分を含むイオン性脂質が提供される。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する脂質化合物
Figure 2022136230000125
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
Figure 2022136230000126
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000127
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかのものである。
Figure 2022136230000128
Figure 2022136230000129
式（ＩＩＩ）、または（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000130
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000131
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000132
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000133
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000134
である。
いくつかの実施形態では、環Ａは、
Figure 2022136230000135
であり、この環は、Ｎ原子がＸ２と接続されている。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。他の実施形態では、Ｘ３は、－ＣＨ２－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、結合または－（ＣＨ２）２－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くても１つが、－Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが、－Ｒ”ＭＲ’であり得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ１２アルキルである。
ある特定の実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
Figure 2022136230000136
Figure 2022136230000137
Figure 2022136230000138
Figure 2022136230000139
Figure 2022136230000140
Figure 2022136230000141
Figure 2022136230000142
Figure 2022136230000143
Figure 2022136230000144
Figure 2022136230000145
Figure 2022136230000146
Figure 2022136230000147
いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物２３６を含む。別の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
Figure 2022136230000148
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000149
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、もしくはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される、または
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）のものである。
Figure 2022136230000150
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。ある特定のかかる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５－２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する。
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
いくつかの実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
Figure 2022136230000151
Figure 2022136230000152
Figure 2022136230000153
他の実施形態では、送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
Figure 2022136230000154
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）のものである。
Figure 2022136230000155
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも一方は、ＮまたはＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＣＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ａ３は、ＣＨであり、Ａ４は、ＮＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、－ＣＨ２－ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、－ＣＨ２－ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル及びＣ５－２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであり得る。
いくつかの実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
Figure 2022136230000156
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
Figure 2022136230000157
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９－１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ａ６は、Ｎであり、Ａ７は、Ｎである。いくつかの実施形態では、Ａ６は、ＣＨであり、Ａ７は、Ｎである。
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、－ＣＨ２－であり、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、－Ｃ（Ｏ）－である。
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、－ＣＨ２－ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、－Ｃ（Ｏ）－である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’ではない。
いくつかの実施形態では、化合物は、下記である。
Figure 2022136230000158
他の実施形態では、送達剤は、下記式を有する化合物を含む。
Figure 2022136230000159
本明細書に開示される脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下でプロトン化され得る。例えば、式（Ｉ）による脂質の中心アミン部分は、アミノ部分のｐＫａを下回るｐＨで典型的にプロトン化され（すなわち、正荷電性）、そのｐＫａを上回るｐＨでは実質的に非荷電性である。かかる脂質は、イオン性アミノ脂質と称され得る。
具体的な一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物１８である。別の実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物２３６である。
いくつかの実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約１ｍｏｌ％～９９ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９ｍｏｌ％である。
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、及び約４５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％の範囲である。
具体的な一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約５０ｍｏｌ％である。
本明細書に開示されるイオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ－脂質、及びそれらの任意の組み合わせ等の追加の構成成分を含み得る。
ｂ．脂質組成物中の追加の構成成分
（ｉ）リン脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリル酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負荷電性リン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療剤）が膜を通過して、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を許容するようにし得る。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含めた、非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化されるか、またはそれに架橋結合され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると銅触媒による環付加を経ることができる。かかる反応は、膜透過もしくは膜認識を促進するようにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化する際に、またはナノ粒子組成物を、標的化もしくは画像化部分（例えば、色素）等の有用な構成成分にコンジュゲートする際に有用であり得る。
リン脂質には、ホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、スフィンゴミエリン等のホスホスフィンゴ脂質も含む。
リン脂質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2022136230000160
Figure 2022136230000161
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物：
Figure 2022136230000162
（ＩＸ）、
またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、または任意選択で、２つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択で、３つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
Figure 2022136230000163
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であるが、
但し、該化合物は、下記式、
Figure 2022136230000164
 、
のものではないことを条件とし、Ｒ２の各出現例は独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
リン脂質頭部修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部（例えば、修飾されたコリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された第四級アミンを有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000165
またはその塩であり、式中、
各ｔは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは独立して、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000166
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
Figure 2022136230000167
Figure 2022136230000168
Figure 2022136230000169
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ａ）のもの、
Figure 2022136230000170
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾されたコアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたコアを有するリン脂質は、修飾されたコア構造を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ－ａ）のある特定の実施形態では、基Ａは、以下の式のものではない。
Figure 2022136230000171
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ａ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000172
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
Figure 2022136230000173
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ）のもの、
Figure 2022136230000174
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－１）のもの、
Figure 2022136230000175
またはその塩であり、式中、
ｗは、０、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－２）のもの、
Figure 2022136230000176
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－３）のもの、
Figure 2022136230000177
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、式（ＩＸ－ｂ－４）のもの、
Figure 2022136230000178
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｂ）の化合物は、以下のうちの１つ、
Figure 2022136230000179
またはその塩である。
リン脂質尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾された尾部を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。本明細書に記載されるとき、「修飾された尾部」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ａ）のもの、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの出現例は、Ｒ２の各出現例は、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキルであり、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられている。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ）のもの、
Figure 2022136230000180
またはその塩であり、式中、
各ｘは独立して、整数０～３０（端点を含む）であり、
各出現例は、Ｇは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を代表する。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－１）のもの、
Figure 2022136230000181
またはその塩であり、式中、
ｖの各出現例は独立して、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－２）のもの、
Figure 2022136230000182
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下の式のもの、
Figure 2022136230000183
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下、
Figure 2022136230000184
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、式（ＩＸ－ｃ－３）のもの、
Figure 2022136230000185
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下の式のもの、
Figure 2022136230000186
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ－ｃ）の化合物は、以下、
Figure 2022136230000187
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）、修飾されたホスホコリン部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物であり、式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000188
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
Figure 2022136230000189
Figure 2022136230000190
またはその塩である。
（ｉｉ）代替的な脂質
ある特定の実施形態では、代替的な脂質が、本発明のリン脂質の代わりに使用される。かかる代替的な脂質の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
Figure 2022136230000191
Figure 2022136230000192
（ｉｉｉ）構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロール、そしてまたステロール部分を含有する脂質を指す。
脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減する一助となり得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。構造脂質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2022136230000193
Figure 2022136230000194
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２４ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、または約３９ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｍｏｌ％である。
（ｉｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ－脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ－脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－ｌ，２－ジミリスチルオキソプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質の脂質部分には、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ－脂質は、当該技術分野で知られており、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ ２０１５／１３０５８４ Ａ２号に記載されるもの等があり、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質構成成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のうちのいくつかは、２０１６年１２月１０日に出願された、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されるように合成されてもよく、同文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等の、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含んでもよい。かかる種は代替的に、ＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する。
Figure 2022136230000195
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であり得、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のこれらの例となるＰＥＧ脂質のうちのいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるとき、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書で「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも称される）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を代表する。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるは、式（ＶＩＩ）の化合物、
Figure 2022136230000196
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００（端点を含む）の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られた部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
Figure 2022136230000197
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ＯＨ）のもの、
Figure 2022136230000198
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分（例えば、トリアゾール）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ａ－１）もしくは（ＶＩＩ－ａ－２）のもの、
Figure 2022136230000199
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000200
またはその塩であり、式中、
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000201
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000202
Figure 2022136230000203
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000204
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、Ｄは、生理的条件下で切断可能な部分である（例えば、エステル、アミド、炭酸塩、カルバメート、尿素）。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１）もしくは（ＶＩＩ－ｂ－２）のもの、
Figure 2022136230000205
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ－ｂ－１－ＯＨ）もしくは（ＶＩＩ－ｂ－２－ＯＨ）のもの、
Figure 2022136230000206
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000207
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000208
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000209
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000210
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＶＩＩＩ）の化合物、
Figure 2022136230000211
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１～１００（端点を含む）の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５１つ以上のメチレン基は、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ－ＯＨ）のもの、
Figure 2022136230000212
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
Figure 2022136230000213
Figure 2022136230000214
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
なおも他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、下記、
Figure 2022136230000215
またはその塩である。
一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、下記である。
Figure 2022136230000216
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５ｍｏｌ％である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ－脂質を含まない。
（ｖ）他のイオン性アミノ脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて、１つ以上のイオン性アミノ脂質を含み得る。
イオン性脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択され得る。これらに加えて、イオン性アミノ脂質はまた、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
イオン性脂質はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ ２０１７／０７５５３１ Ａ１号に開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン性アミノ脂質には、下記が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2022136230000217
Figure 2022136230000218
及びそれらの任意の組み合わせ。
イオン性脂質はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ ２０１５／１９９９５２ Ａ１号に開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン性アミノ脂質には、下記が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2022136230000219
Figure 2022136230000220
Figure 2022136230000221
及びそれらの任意の組み合わせ。
イオン性脂質には、下記がさらに含まれ得るが、これらに限定されない。
Figure 2022136230000222
及びそれらの任意の組み合わせ。
（ｖｉ）他の脂質組成物構成成分
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上述のものに加えて１つ以上の構成成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成成分を含み得る。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含み得る。
本明細書に開示される医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）をカプセル封入または部分的にカプセル封入するために、ポリマーを含める及び／または使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリエタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１～約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物対、治療剤をコードするポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、１つを超えるポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、脂質：ポリヌクレオチド重量比５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１で、またはこれらの比の範囲もしくはそのいずれか、例えば、限定されないが、５：１～約１０：１、約５：１～約１５：１、約５：１～約２０：１、約５：１～約２５：１、約５：１～約３０：１、約５：１～約３５：１、約５：１～約４０：１、約５：１～約４５：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約５５：１、約５：１～約６０：１、約５：１～約７０：１、約１０：１～約１５：１、約１０：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１０：１～約３０：１、約１０：１～約３５：１、約１０：１～約４０：１、約１０：１～約４５：１、約１０：１～約５０：１、約１０：１～約５５：１、約１０：１～約６０：１、約１０：１～約７０：１、約１５：１～約２０：１、約１５：１～約２５：１、約１５：１～約３０：１、約１５：１～約３５：１、約１５：１～約４０：１、約１５：１～約４５：１、約１５：１～約５０：１、約１５：１～約５５：１、約１５：１～約６０：１もしくは約１５：１～約７０：１で含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌ超の濃度で含み得る。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物等の送達剤を含む脂質組成物と、（ｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、ナノ粒子組成物も提供する。かかるナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをカプセル封入することができる。
ナノ粒子組成物は、典型的に、およそ数マイクロメートル以下のサイズにされ、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋結合され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１～１４７のうちの１つ以上、または化合物１～３４２のうちの１つ以上を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、多様な他の構成成分も含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて１つ以上の他の脂質、例えば、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ－脂質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを含んでもよい。構造脂質の包含は、例えば、式ＩＩＩによる脂質が本発明の脂質ナノ粒子組成物中で使用される場合等、任意選択的であり得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物、（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）。を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０～６０％のイオン性脂質：約５～２５％の構造脂質：約２５～５５％のステロール；及び約０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、構造脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０～１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、８０～１００ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で一般に定義されるとき、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性特性を有する小分子を指す。脂質は、天然型でも合成であってもよい。脂質の分類の例としては、脂肪、ろう、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）、及びポリケチド、及びプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、一部の脂質の両親媒性特性により、それらは水性溶媒中でリポソーム、小胞、または膜を形成する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「イオン性脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通例の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、正荷電性または負荷電性であり得る。イオン性脂質は、正荷電性であり得、その場合、それは「カチオン性脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含んでもよく、イオン性アミノ脂質と称され得る。本明細書で使用されるとき、「荷電部分」は、形式電荷、例えば、一価（＋１、または－１）、二価（＋２、または－２）、三価（＋３、または－３）等を持つ化学部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負荷電性）またはカチオン性（すなわち、正荷電性）であり得る。正荷電部分の例としては、アミン基（例えば、第１級、第２級、及び／または第３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電部分は、アミン基を含む。負荷電基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、硫酸基、ホスホネート基、リン酸基、ヒドロキシル基等が挙げられる。荷電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって異なり得、例えば、ｐＨの変化が、その部分の電荷を変化させ、及び／またはその部分を荷電させ得るかもしくは非荷電にさせ得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子上の「部分負電荷」または「部分正電荷」を指すわけではないことを理解されたい。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通例の意味を与えられる。「部分負電荷」は、電子密度が結合の１個の原子の方へ引き寄せられて、その原子上で部分負電荷を作り出すといったように、官能基が極性を持つようになる結合を含むときにもたらされ得る。当業者であれば、一般に、このようにして極性を持つようになり得る結合を認識するであろう。
いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、これは当該技術分野で「イオン性カチオン性脂質」と称されることもある。一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して接続された正荷電性親水性の頭部及び疎水性の尾部を有し得る。
これらに加えて、イオン性脂質はまた、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
一実施形態では、イオン性脂質は、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４及び同第ＷＯ２０１３１１６１２６号に記載されるイオン性脂質から選択され得るが、これらに限定されず、同文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
なおも別の実施形態では、イオン性脂質は、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得るが、これらに限定されず、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載されるもの等の、切断可能な脂質であり得る。一実施形態では、脂質は、当該技術分野で既知の及び／または国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号に記載される方法によって合成され得、同文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子組成物は、多様な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を検査することができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を用いて、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法をまた利用して、粒子サイズを決定することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）等の機器をまた使用して、粒子サイズ、多分散インデックス、及びゼータ電位等の、ナノ粒子組成物の複数の特性を測定することもできる。
ナノ粒子のサイズはまた、生物学的反応、例えば、限定されないが、炎症に対抗する一助となり得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増加させることができる。
本明細書で使用されるとき、ナノ粒子組成物の関連における「サイズ」または「平均サイズ」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約１０～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中で製剤化される。
一実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超の直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ未満）である。
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散インデックスを用いて、ナノ粒子組成物の均一度、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満）多分散インデックスは一般に、狭い粒子サイズ分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散インデックスを有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物の多分散インデックスは、約０．１０～約０．２０であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を用いて、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を説明することができる。正であれ負であれ、比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましく、これは、より高荷電の種が細胞、組織、及び身体の他の要素と不所望に相互作用し得るためである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ～約１００ｍＶ、約０ｍＶ～約９０ｍＶ、約０ｍＶ～約８０ｍＶ、約０ｍＶ～約７０ｍＶ、約０ｍＶ～約６０ｍＶ、約０ｍＶ～約５０ｍＶ、約０ｍＶ～約４０ｍＶ、約０ｍＶ～約３０ｍＶ、約０ｍＶ～約２０ｍＶ、約０ｍＶ～約１０ｍＶ、約１０ｍＶ～約１００ｍＶ、約１０ｍＶ～約９０ｍＶ、約１０ｍＶ～約８０ｍＶ、約１０ｍＶ～約７０ｍＶ、約１０ｍＶ～約６０ｍＶ、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１０ｍＶ～約４０ｍＶ、約１０ｍＶ～約３０ｍＶ、約１０ｍＶ～約２０ｍＶ、約２０ｍＶ～約１００ｍＶ、約２０ｍＶ～約９０ｍＶ、約２０ｍＶ～約８０ｍＶ、約２０ｍＶ～約７０ｍＶ、約２０ｍＶ～約６０ｍＶ、約２０ｍＶ～約５０ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、約２０ｍＶ～約３０ｍＶ、約３０ｍＶ～約１００ｍＶ、約３０ｍＶ～約９０ｍＶ、約３０ｍＶ～約８０ｍＶ、約３０ｍＶ～約７０ｍＶ、約３０ｍＶ～約６０ｍＶ、約３０ｍＶ～約５０ｍＶ、約３０ｍＶ～約４０ｍＶ、約４０ｍＶ～約１００ｍＶ、約４０ｍＶ～約９０ｍＶ、約４０ｍＶ～約８０ｍＶ、約４０ｍＶ～約７０ｍＶ、約４０ｍＶ～約６０ｍＶ、及び約４０ｍＶ～約５０ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ～約５０ｍＶ、約１５ｍＶ～約４５ｍＶ、約２０ｍＶ～約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ～約３５ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであり得る。
ポリヌクレオチドの「カプセル封入効率」という用語は、用意される最初の量と比べた、調製後のナノ粒子組成物によってカプセル封入される、またはそれと会合されるポリヌクレオチドの量を説明する。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉じ込め、包囲、または内包を指し得る。
カプセル封入効率は、望ましくは高い（例えば、１００％近く）。カプセル封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を、ナノ粒子組成物を１つ以上の有機溶媒または洗剤で分解する前及び後で比較することによって、測定され得る。
蛍光を用いて、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物の場合、ポリヌクレオチドのカプセル封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、カプセル封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、カプセル封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
本明細書に開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、ナノ粒子組成物の所望の標的及び／または用途、または他の特性、ならびにポリヌクレオチドの特性に左右され得る。
例えば、ナノ粒子組成物中で有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、及び他の性質に左右され得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量もまた異なり得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物及びポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考慮に応じて最適化され得る。ｍＲＮＡをポリヌクレオチドとして含む組成物の場合、Ｎ：Ｐ比は、有用な測定基準としての役目を果たし得る。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現及び忍容性の両方を制御するため、Ｎ：Ｐ比が低く、発現が強力なナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質対ＲＮＡの比に応じて異なる。
一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、約２：１～約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１～６：１である。具体的な一態様では、Ｎ：Ｐ比は、約は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物の提供に加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドをカプセル封入することを含む、脂質ナノ粒子の生産方法も提供する。かかる方法は、本明細書に開示される医薬組成物のうちのいずれかを使用することと、当該技術分野で既知の脂質ナノ粒子の生産方法に従って脂質ナノ粒子を生産することとを含む。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８－８０、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０－９５４、Ｎａｓｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５－１３、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１－３０２、及びそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。
２３．他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。これらの製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞へのトランスフェクションを増加させる、及び／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させることができるため、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、タンパク質産生に向けられるポリヌクレオチドの有効性を改善することができる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子をまた使用して、ポリヌクレオチドの安定性を増加させることもできる。
リポソームは、主に脂質二重層から構成され得る人工的に調製された小胞であり、医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用することができる。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＭＬＶ）は、直径数百ナノメートルであり得、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含有し得る。小さな単細胞小胞（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＳＵＶ）は、直径５０ｎｍ未満であり得、大きな単層膜小胞（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ、ＬＵＶ）は、直径５０～５００ｎｍであり得る。リポソーム設計には、リポソームの不良組織への結合を改善する、または事象、例えば、限定されないがエンドサイトーシスを活性化するための、オプソニンまたはリガンドが含まれるが、これらに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低ｐＨまたは高ｐＨ値を含み得る。
リポソームの製剤化は、捕捉される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質小胞が分散される溶媒の性質、捕捉される物質の有効濃度及びその潜在的毒性、小胞の適用及び／または送達中に伴う追加のプロセス、最適なサイズ、意図される適用に合わせた小胞の多分散度及び貯蔵寿命、ならびに安全で効率的なリポソーム製品のバッチ間での再現性及び規模拡大生産等に左右され得る。
非限定的な例として、合成膜小胞等のリポソームは、米国特許第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、同第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、同第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、及び同第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載される方法、装置及びデバイスによって調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポソームによってカプセル封入され得、及び／またはそれは、リポソームによってカプセル封入され得る水性コアに含有され得、これは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、同第ＷＯ２０１２０３１０４３号、同第ＷＯ２０１２０３０９０１号、同第ＷＯ２０１２００６３７８号、及び同第ＷＯ２０１３０８６５２６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、同第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、及び同第ＵＳ２０１３０２０２６８４号に記載される通りである。これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、カチオン性水中油エマルション中で製剤化され得、そのエマルション粒子は、ポリヌクレオチドと相互作用して分子をエマルション粒子に固定することができる油性コア及びカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、親水性相が中で分散した疎水性の連続相を含む、油中水エマルション中で製剤化され得る。例となるエマルションは、国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号及び同第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載される方法によって作製され得、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、脂質－ポリカチオン複合体中で製剤化され得る。脂質－ポリカチオン複合体は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０１７８７０２号に記載される方法によって実現され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載されるカチオン性ペプチドを含み得る。これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号、同第ＷＯ２０１２１７０９３０号、同第ＷＯ２０１１１２７２５５号及び同第ＷＯ２００８１０３２７６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載のＬＮＰ中で製剤化され得、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子製剤は典型的に、１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質は、イオン性脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）であり、これは当該技術分野で「イオン性カチオン性脂質」と称されることもある。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、及び凝集を低減可能な分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む他の構成成分をさらに含む。
例となるイオン性脂質には、本明細書に開示される化合物１～３４２のうちのいずれか１つ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。他の例となるイオン性脂質には、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ν，Ν－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－ｌ－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコサ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｅｐｔａｃｏｓ）－１５－エン－１０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）－８－アミン、ｌ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－［（ｌＲ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－ｌ－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－ｌ－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－ｌ－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル）オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－｛［８－（２－オクリルシクロプロピル（ｏｃｌｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ））オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
リン脂質には、ホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、スフィンゴミエリン等のホスホスフィンゴ脂質も含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の範囲である。
構造脂質は、ステロール及びステロール部分を含有する脂質を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの任意の混合物を含む。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の範囲である。
ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンを含む。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－ｌ，２－ジミリスチルオキソプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質組成物中のＰＥＧ－脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の範囲である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過促進分子を追加的に含み得る。非限定的な透過促進分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載される。
ＬＮＰ製剤は、リン酸コンジュゲート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をさらに含有し得る。リン酸コンジュゲートは、ナノ粒子のインビボ循環時間を増加させ、及び／またはその標的化された送達を向上させ得る。リン酸コンジュゲートは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載される方法によって作製され得る。ＬＮＰ製剤はまた、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、同第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、及び同第ＵＳ２０１３００７２７０９号に記載される、ポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含有し得る。これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ製剤は、対象において本発明のナノ粒子の送達を強化するためのコンジュゲートを含み得る。さらに、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の貪食クリアランスを阻害し得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチド（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５により記載される「自己」粒子）であり得る。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって示されるように、自己ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージ媒介性クリアランスを遅延させ、これによりナノ粒子の送達を強化した。
ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体には、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、オクテニルコハク酸フィトグリコーゲン、フィトグリコーゲンベータ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ－デキストリン（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号）が含まれ得るが、これらに限定されない。
ＬＮＰ製剤は、粒子の送達を改善するために界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、親水性コーティング剤、例えば、限定されないが、ＰＥＧコーティング剤及び／または中性表面電荷を有するコーティング剤（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載される）でコーティングされ得る。
ＬＮＰ製剤は、脂質ナノ粒子が粘膜障壁を透過し得るように粒子の表面特性を改変するように操作され得、これは米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載され、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
粘膜を透過するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー－ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチエンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｅｉｍｉｎｅｓ）、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリエタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが含まれ得るが、これらに限定されない。
粘膜を透過するように操作されたＬＮＰはまた、表面改質剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム等）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解薬（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシ、エルドステイン）及びｒｈＤＮａｓｅを含めた種々のＤＮａｓｅｓを含み得る。
いくつかの実施形態では、膜透過ＬＮＰは、粘膜透過促進コーティングを含む低張性製剤であり得る。製剤は、それが送達されている上皮に対して低張性であり得る。低張性製剤の非限定的な例は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に見出され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポプレックスとして製剤化され、例えば、限定することなく、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系、及びＳｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）による他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によるＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンベースの標的化及び非標的化核酸送達等である（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８－９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６－７８、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８－５０７、Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０－１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５－１２９４、Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１－１５、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９－７１７、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ ６；１０４：４０９５－４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２（同文献の全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、平均直径１０～１０００ｎｍの球体であり得る、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化される。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化し得、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化され得る、固体脂質コアマトリックスを有する。例となるＳＬＮは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載されるものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、制御放出及び／または標的化送達用に製剤化され得る。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、治療成果を達成するための特定の放出パターンに適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、制御放出及び／または標的化送達用に、本明細書に記載の及び／または当該技術分野で既知の送達剤にカプセル封入され得る。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入、包囲または内包を意味する。それが本発明の化合物の製剤化に関するとき、カプセル封入は、実質的、完全または部分的であり得る。「実質的にカプセル封入される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超または９９．９９９％超が送達剤内に封入、包囲または内包され得ることを意味する。「部分的にカプセル封入される」とは、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０ ５０以下が送達剤内に封入、包囲または内包され得ることを意味する。
有利なことに、カプセル封入は、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を使用して、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定され得る。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％超が、送達剤にカプセル封入される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド制御放出製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティング（例えば、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）及びセルロース誘導体、例えばエチルセルロース水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド制御放出製剤は、米国公開第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載のポリマー系、または米国特許第８，４０４，２２２号に記載のＰＥＧ及び／またはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含み得、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、治療的ナノ粒子にカプセル封入され得、これは本明細書で「治療的ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称される。治療的ナノ粒子は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、及び同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１２０１４０７９０号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号及び同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号、及び同第８，３１８，２１１号に記載される方法によって製剤化され得、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出用に製剤化され得る。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたってある放出速度に適合する医薬組成物または化合物を指す。この期間には、数時間、数日間、数週間、数か月間、及び数年間が含まれ得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号及び同第ＵＳ２０１３０１５０２９５号に開示されるように製剤化され得、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、治療的ナノ粒子ポリヌクレオチドは、標的特異的であるように製剤化され得、これには、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号及び同第ＷＯ２０１１０８４５１８号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び同第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のもの等があり、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して調製され得る。例となるマイクロ流体ミキサーには、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）により製造されるものを含むがこれらに限定されないスリット型インターデジタルマイクロミキサー及び／またはスタガ型ヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）が含まれ得るが、これらに限定されない（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔ ａｌ．，“Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８：３６３３－４０（２０１２）、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８－５１ （２０１２）を参照されたく、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例となるマイクロミキサーには、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙによる、Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ－Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ－ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを使用したＬＮＰの作製方法は、少なくとも２つの投入流を混合することをさらに含み、ここにおいて、マイクロ構造により誘導されるカオス的移流（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｏｔｉｃ ａｄｖｅｃｔｉｏｎ、ＭＩＣＡ）によって混合が生じる。この方法によれば、流体流が、ヘリンボンパターンで存在するチャネルを通って流動して、回転流を引き起こし、それぞれの流体を互いの周りに折り重ねる。この方法はまた、流体混合のための表面も含み、この表面が流体の循環中に向きを変える。ＳＨＭを使用したＬＮＰの生成方法には、米国公開第ＵＳ２００４０２６２２２３号及び同第ＵＳ２０１２０２７６２０９号に開示されるものが含まれ、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を用いて脂質ナノ粒子中で製剤化され得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４４２：３６８－３７３（２００６）、及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：６４７－６５１（２００２）を参照されたく、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロミキサーチップ、例えば、限定されないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）によるマイクロミキサーチップを用いて、脂質ナノ粒子中で製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構による２つ以上の流体流の迅速な混合に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば、限定されないが、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ 約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ及び／または約９０～約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中で製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超の直径を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さいＬＮＰを使用して送達され得る。かかる粒子は、０．１μｍ未満から１００ｎｍまで、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満の直径を含み得る。
本明細書に記載のナノ粒子及び微粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するように幾何学的に操作され得る。幾何学的に操作された粒子は、標的化送達、例えば、限定されないが肺送達用に、本明細書に記載のポリヌクレオチドを組み込むために、多様な形状、サイズ及び／または表面電荷を有し得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照されたい）。幾何学的に操作された粒子が含み得る他の物理的特徴には、開窓、角度付きアーム、非対称及び粗面、細胞及び組織との相互作用を変化させ得る電荷が含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子、例えば、限定されないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載されるものである。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、２つ以上のポリマー、例えば、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはそれらの組み合わせを含み得る、ポリマーマトリックスを含み得る。
ｂ．脂質様物質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、脂質様物質を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、脂質様物質と共に製剤化され得る。これらの脂質様物質を含有する複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製して、したがって、局所及び／または全身投与経路を介した脂質様物質製剤の注射後、コードされるタンパク質産生によって判定するとき、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドの脂質様物質複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むがこれらに限定されない、種々の手段によって投与され得る。
脂質様物質の合成は文献に記載される（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０ ２１：１４４８－１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ ２６７：９－２１、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ ２６：５６１－５６９、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１２９９６－３００１を参照されたく、同文献の全てが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
ペンタ［３－（１－ラウリルアミノプロピオニル）］－トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ－５ＬＡＰ、別名９８Ｎ１２－５、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）を参照されたい）、Ｃ１２－２００（誘導体及びバリアントを含む）、及びＭＤ１を含むがこれらに限定されない、異なる脂質様物質との製剤化がインビボ活性について試験され得る。脂質様物質「９８Ｎ１２－５」は、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ １７：８７２－８７９によって開示される。脂質様物質「Ｃ１２－２００」は、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９及びＬｉｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０ ６６９－６７０によって開示される。これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、アミノアルコール脂質様物質中で製剤化され得る。アミノアルコール脂質様物質は、米国特許第８，４５０，２９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって調製され得る。
脂質様物質製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３つまたは４つ以上の構成成分を含む粒子を含み得る。脂質様物質及び脂質様物質を含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第ＷＯ ２０１５０５１２１４号に記載される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
いくつかの実施形態では、注射（例えば、筋肉内または皮下注射）用の、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の構成物質である、ヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって組織透過性を増加させる（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７－４４０）。代替的に、ヒアルロニダーゼを使用して、筋肉内または皮下投与されたポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増加させることができる。
ｄ．ナノ粒子模倣体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入され、及び／またはそれに吸収させられる。ナノ粒子模倣体は、送達機能生物または粒子、例えば、限定されないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、プリオン及び細胞を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン粒子にカプセル封入され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１２４１号及び同第ＵＳ２０１３０１９５９６８号を参照されたく、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ｅ．ナノチューブ
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、限定されないが、ロゼットナノチューブ、リンカーによるツイン塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ及び／または単層カーボンナノチューブ等の少なくとも１つのナノチューブに付着されたまたは別様に結合させられた（例えば、立体的、イオン性、共有結合性及び／または他の力）、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドを含むナノチューブ及びナノチューブ製剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号に記載される。
ｆ．自己組織化ナノ粒子、または自己組織化高分子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達用の自己組織化ナノ粒子、または両親媒性高分子（ＡＭ）中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合性で連結されたアルキル化糖骨格を有する、生体適合性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中で、ＡＭは自己組織化してミセルを形成する。核酸自己組織化ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載され、ＡＭ及びＡＭの形成方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０２１７７５３号に記載され、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｇ．無機ナノ粒子、半導電及び金属ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、無機ナノ粒子、または半導電もしくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。無機ナノ粒子には、水膨潤性の粘土物質が含まれ得るが、これらに限定されない。水分散性ナノ粒子は、疎水性または親水性のナノ粒子であり得る。非限定的な例として、無機、半導電及び金属ナノ粒子は、例えば、米国特許第５，５８５，１０８号及び同第８，２５７，７４５号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２０２２８５６５号、同第ＵＳ ２０１２０２６５００１号及び同第ＵＳ ２０１２０２８３５０３号に記載され、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ｈ．外科用シーラント：ゲル及びヒドロゲル
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、外科用シーラント中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ゲル及びヒドロゲル等の外科用シーラントは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載される。
ｉ．懸濁製剤
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、懸濁液中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ポリヌクレオチド、水非混和性油デポー、界面活性剤及び／または補助界面活性剤及び／または補助溶媒を含む。懸濁液は、まず、ポリヌクレオチドの水溶液、及び１つ以上の界面活性剤を含む油系相を調製し、次いでこれらの２つの相（水性及び油系）を混合することによって、形成され得る。
懸濁製剤のための例となる油には、ゴマ油及びミグリオール（飽和ヤシ及びパーム核油由来のカプリル脂肪酸及びカプリン脂肪酸とグリセリンまたはプロピレングリコールとのエステルを含む）、トウモロコシ油、ダイズ油、ピーナッツ油、ミツロウ及び／またはパーム核油が含まれ得るが、これらに限定されない。例となる界面活性剤には、クレモフォール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール、トランスクトール、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、ラブラゾル（ｌａｂｒａｓｏｌ）、ミリスチン酸イソプロピル、及び／またはＳｐａｎ ８０が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、懸濁液は、エタノール、グリセロール及び／またはプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない、補助溶媒を含み得る。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、水非混和性デポーからの拡散、続いて周囲環境（例えば、水性環境）への再可溶化によって、周囲環境へのポリヌクレオチドの放出の調節を提供することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射されると、エマルションが自発的に形成し（例えば、水相に送達されるとき）、これにより、油相から水相へのポリヌクレオチドの放出のために高い表面積対体積比を提供し得るように、製剤化され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質または界面活性剤層によって包囲またはコーティングされた液体疎水性コアを含み得る、ナノエマルション中で製剤化される。例となるナノエマルション及びそれらの調製は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９６，９４５号に記載される。
ｊ．カチオン及びアニオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋及びそれらの組み合わせを含む。例となる製剤は、金属カチオンと錯化したポリマー及びポリヌクレオチドを含み得、これは例えば、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号に記載され、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組み合わせを含有し得る。カチオン性ナノ粒子を含むカチオン性ナノ粒子中または１つ以上のデポー中でのポリヌクレオチドの送達は、長期作用型デポーとして作用する及び／またはヌクレアーゼによる分解速度を低減することによって、ポリヌクレオチドの生物学的利用能を改善し得る。
ｋ．成型ナノ粒子及び微粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、種々のサイズ、形状及び化学的性質の成型ナノ粒子中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例えば、ナノ粒子及び／または微粒子は、ＬＩＱＵＩＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）によるＰＲＩＮＴ（登録商標）技術を用いて作製することができる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００７０２４３２３号）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、微粒子中で製剤化される。微粒子は、ポリヌクレオチドのコアと、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物を含むがこれらに限定されない、生体適合性及び／または生分解性ポリマーの外皮とを含有し得る。微粒子は、ポリヌクレオチドを吸着するための吸着性表面を有し得る。微粒子は、少なくとも１ミクロン～少なくとも１００ミクロン（例えば、少なくとも１ミクロン、少なくとも１０ミクロン、少なくとも２０ミクロン、少なくとも３０ミクロン、少なくとも５０ミクロン、少なくとも７５ミクロン、少なくとも９５ミクロン、及び少なくとも１００ミクロン）の直径を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微粒子及びポリヌクレオチドを含むマイクロエマルションである。例となる微粒子、マイクロエマルション及びそれらの調製物は、例えば、米国特許第８，４６０，７０９号、同第８，３０９，１３９号、及び同第８，２０６，７４９号、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９８３０号、同第ＵＳ２０１３１９５９２３号及び同第ＵＳ２０１３０１９５８９８号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３０７５０６８号に記載され、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｌ．ナノジャケット（ＮａｎｏＪａｃｋｅｔｓ）及びナノリポソーム（ＮａｎｏＬｉｐｏｓｏｍｅｓ）
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｎａｎｏ（Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）によるナノジャケット及びナノリポソーム中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含む、体内で天然に見出される材料で作製され、少量のケイ酸塩もまた含み得る。ナノジャケットは、５～５０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。
ナノリポソームは、限定されないが、体内で天然に存在する脂質等の脂質で作製される。ナノリポソームは、６０～８０ｎｍの範囲のサイズを有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、限定されないが、セラミドナノリポソーム等のナノリポソーム中で製剤化される。
ｍ．細胞またはミニセル（Ｍｉｎｉｃｅｌｌｓ）
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、エクスビボで細胞にトランスフェクションされ、その後対象に移植される、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの細胞ベースの製剤を使用して、細胞トランスフェクション（例えば、細胞担体中）を確実にし、ポリヌクレオチドの生体分布を変化させ（例えば、細胞担体を特定の組織または細胞型に対して標的化することによって）、及び／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させることができる。
例となる細胞には、赤血球、ビロゾーム、及びエレクトロポレーションした細胞が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｇｏｄｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ １２：１２７－１３３、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ １２：３８５－３８９、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１０９８０－１０９８５、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１０ ２７：４００－４２０、Ｈｕｃｋｒｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．２００７；１７：３９－４７、Ｃｕｓｉ，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．２００６ ２：１－７、ｄｅ Ｊｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６ １３：４００－４１１を参照されたく、同文献の全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ウイルス及び非ウイルス媒介技法を含む、多様な方法が当該技術分野で知られており、核酸の細胞への導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移入、マイクロインジェクション、微粒子銃媒介移入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１１０８５２３１号及び同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、ならびに米国公開第２０１１０１７１２４８号に記載される方法によって合成された合成ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中で送達され得、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ソノポレーション、または細胞ソニケーションの技法は、細胞形質膜の透過性を変化させるための音（例えば、超音波周波数）の使用である。ソノポレーション法は、核酸をインビボで送達することが知られている（Ｙｏｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１０ ７：３２１－３３０、Ｐｏｓｔｅｍａ ａｎｄ Ｇｉｌｊａ，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ ８：３５５－３６１、Ｎｅｗｍａｎ ａｎｄ Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７ １４：４６５－４７５、米国公開第ＵＳ２０１００１９６９８３号及び同第ＵＳ２０１００００９４２４号（全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって送達され得る。エレクトロポレーション技法は、インビボで及び臨床的に核酸を送達することで知られている（Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：２６７－２８０、Ｃｈｉａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：２８１－２８６、Ｈｏｊｍａｎ，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ １０：１２８－１３８；全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＴＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）（例えば、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｙｓｔｅｍ）及びＩｎｏｖｉｏ（Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）（例えば、Ｉｎｏｖｉｏ ＳＰ－５Ｐ筋肉内送達デバイスまたはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３０００皮内送達デバイス）を含むが、これらに限定されないエレクトロポレーションデバイスが、世界中で多くの企業によって販売されている。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、植物細胞、微生物細胞、藻細胞、及び真菌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヤギ細胞、ウマ細胞、ウサギ細胞、ハムスター細胞、またはウシ細胞等の哺乳類細胞であるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＫＥＫ ２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｃａｃｏ細胞、Ｃａｃｏ－２細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＤＧ４４細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、Ｈｕｖｅｃ細胞、ＣＶ－１細胞、Ｈｕｈ－７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＣＦ－７細胞、Ｕ－２０Ｓ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む確立された細胞株由来であり得るがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ細胞、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞、Ｃａｎｄｉｄａ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞等の真菌細胞であるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、またはＢＬ２１細胞等の細菌細胞であるが、これらに限定されない。本発明の方法によってトランスフェクションされる一次細胞及び二次細胞は、様々な組織から得ることができ、これらの細胞には、培養液中で維持することができる全ての細胞型が含まれるが、これらに限定されない。一次細胞及び二次細胞には、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、上皮細胞（例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経系細胞、血液の有形成分（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、及びこれらの体細胞型の前駆体が含まれるが、これらに限定されない。一次細胞は、同じ種のドナーから、または別の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）からも得ることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細菌ミニ細胞中の本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。非限定的な例として、細菌ミニ細胞は、国際公開第ＷＯ２０１３０８８２５０号または米国公開第ＵＳ２０１３０１７７４９９号に記載されているものであってもよく、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｎ．半固体組成物
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、半固体またはペースト様組成物を形成するための疎水性マトリックス中に、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。非限定的な例としては、半固体またはペースト様組成物は、国際公開第ＷＯ２０１３０７６０４号に記載される方法で作製することができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｏ．エクソソーム
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、エクソソーム中の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含み、これには、少なくとも１つのポリヌクレオチドが充填され、細胞、組織、及び／または生物に送達され得る。非限定的な例としては、ポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３０８４０００号に記載されるように、エクソソームに充填され得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｐ．絹ベースの送達
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、絹ベースの送達用に製剤化された本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。絹ベースの送達系は、絹フィブロイン溶液を本明細書に記載のポリヌクレオチドと接触させることによって形成することができる。非限定的な例としては、持続放出性の絹ベースの送達系及びかかる系の作製方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６１１号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｑ．アミノ酸脂質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質を含む製剤である本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び１つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の作製方法の非限定的な例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合し、このポリヌクレオチドを放出するアミノ酸脂質を含む、放出可能な形態のポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例としては、本明細書に記載のポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第７，０９８，０３２号、同第６，８９７，１９６号、同第６，４２６，０８６号、同第７，１３８，３８２号、同第５，５６３，２５０号、及び同第５，５０５，９３１号に記載される酸不安定性リンカーによってもたらされ得、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｒ．微小胞
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微小胞製剤中の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。例となる微小胞としては、米国公開第ＵＳ２０１３０２０９５４４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものが含まれる。いくつかの実施形態では、微小胞は、国際公開第ＷＯ２０１３１１９６０２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＡＲＲＤＣ１媒介性微小胞（ＡＲＭＭ）である。
ｓ．高分子間電解質複合体
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、高分子間電解質複合体中の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。高分子間電解質複合体は、動的電荷ポリマーが、１つ以上のアニオン性分子と複合したときに形成される。動的電荷ポリマー及び高分子間電解質複合体、ならびに高分子間電解質複合体の作製方法の非限定的な例は、米国特許第８，５２４，３６８号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｔ．結晶性高分子系
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶性高分子系中の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。結晶性高分子系は、結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を有するポリマーである。例となるポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｕ．ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコア－シェルナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに天然及び／または合成ポリマーを含む。ポリマーには、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ＰＬＬにグラフトしたＰＥＧ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐状ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾されたポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、マルチブロックコポリマー、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸）（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例となるポリマーには、ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製の製剤、限定するものではないがＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等のＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製のシクロデキストリン、デンドリマー、ならびにポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマーが含まれる。ＲＯＮＤＥＬＴＭ（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）及びＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等のｐＨ応答性コブロックポリマー。
ポリマー製剤は、（例えば、筋肉内または皮下注射後の）ポリヌクレオチドの持続放出または遅延放出を可能にする。ポリヌクレオチドの変えられた放出プロファイルは、例えば、長時間にわたるコードされるタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させるためにも使用することができる。持続放出製剤には、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、フィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）等の外科用シーラント、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧベースのシーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
非限定的な例としては、調節可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）を有するＰＬＧＡマイクロスフェアを調製し、カプセル封入プロセス中に修飾されたｍＲＮＡの一体性を維持しながら、ＰＬＧＡマイクロスフェアの中に修飾されたｍＲＮＡをカプセル封入することによって、ＰＬＧＡマイクロスフェア中の修飾されたｍＲＮＡを製剤化することができる。ＥＶＡｃは、前臨床の持続放出インプラント用途（例えば、緑内障のためのピロカルピン眼部インサートである長時間放出性製品Ｏｃｕｓｅｒｔ、または持続放出プロゲステロン子宮内デバイスであるｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ；経皮送達系Ｔｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ；カテーテル）で広く使用されている非生分解性の生体適合性ポリマーである。ポロキサマーＦ－４０７ ＮＦは、５℃未満の温度では低粘度を有し、１５℃超の温度では固体ゲルを形成するポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンの親水性非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーである。
非限定的な例としては、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載されるＰＬＬでグラフトしたＰＥＧのポリマーの化合物と共に製剤化することができる。別の非限定的な例としては、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号、ならびに米国特許第８，２３６，３３０号及び同第８，２４６，９６８号を参照されたい）、またはＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号を参照されたい）等のブロックコポリマーと共に製剤化することができる。これらの参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）、またはそれらの組み合わせ等の少なくとも１つのアミン含有ポリマーと共に製剤化することができる。例となるポリアミンポリマー及び送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第８，４６０，６９６号、同第８，２３６，２８０号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，６９６，０３８号、同第６，５１７，８６９号、同第６，２６７，９８７号、同第６，２１７，９１２号、同第６，６５２，８８６号、同第８，０５７，８２１号、及び同第８，４４４，９９２号、米国公開第ＵＳ２００３００７３６１９号、同第ＵＳ２００４０１４２４７４号、同第ＵＳ２０１００００４３１５号、同第ＵＳ２０１２００９１４５号、及び同第ＵＳ２０１３０１９５９２０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６０６３２４９号及び同第ＷＯ２０１３０８６３２２号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、直鎖生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせに入れて製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８４４５３号に記載される少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーに入れて、またはそれと共に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１０６０７２号、同第ＷＯ２０１３１０６０７３号、及び同第ＷＯ２０１３１０６０８６号に記載される少なくとも１つの架橋カチオン結合ポリマーに入れて、またはそれと共に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０２３１２８７号に記載される少なくともＰＥＧ化されたアルブミンポリマーに入れて、またはそれと共に製剤化することができる。これらの参照の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、限定されないが、リン酸カルシウム等のポリマー、脂質、及び／または他の生分解性作用剤の組み合わせを使用して、ナノ粒子として製剤化することができる。構成成分は、送達に関してナノ粒子を細かく調節することができるようにコア－シェル、ハイブリッド、及び／または層ごとの構造で組み合わせてもよい（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．２００６ ５：７９１－７９６、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８ ２９：１５２６－１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１１ ６３：７４８－７６１、Ｅｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１ ３２：７７２１－７７３１、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４－８７、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例としては、ナノ粒子は、水性－疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、及び／または親水性ポリマー等であるが、これらに限定されない複数のポリマーを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
コア－シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するための高スループットアプローチにさらに焦点が合わせられている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１２９９６－１３００１；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、及び内在化は、ナノ粒子のコアの構成成分とシェルの構成成分の両方の化学組成を変えることによって、正確に制御することができる。例えば、コア－シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、マウス肝細胞に効率的にｓｉＲＮＡを送達することができる。
いくつかの実施形態では、中間ＰＬＧＡ層及びＰＥＧを含有する外側中性脂質層を含む中空脂質コアは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを送達するために使用することができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコアと、このコア内のポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルと、を含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載のポリマーのいずれかであってもよく、当該技術分野で知られている。ポリマーシェルを使用して、コア中のポリヌクレオチドを保護することができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドと共に使用するためのコア－シェルナノ粒子は、米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開第ＷＯ２０１３１２４８６７号に記載されており、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ｖ．ペプチド及びタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させるように、及び／または（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的化することによって）ポリヌクレオチドの体内分布を改変するように、及び／またはコードされるタンパク質の翻訳を増加させる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号及び同第ＷＯ２０１３１２３２９８号）ように、ペプチド及び／またはタンパク質と共に製剤化される、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９７２６号、同第ＵＳ２０１３０１３７６４４号、及び同第ＵＳ２０１３０１６４２１９号に記載のものであり得る。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ｗ．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的基に共有結合しているか、またはコンジュゲートとして融合タンパク質を共に生産する２つのコード領域を含んでいる（例えば、標的基及び治療タンパク質もしくはペプチドを持つ）、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。コンジュゲートは、ナノ粒子を組織中もしくは生物内のニューロンへと選択的に指向するか、または血液脳関門の通過を補助するペプチドであり得る。
コンジュゲートは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質等の天然に生じる物質を含む。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）等の組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの担体として機能し得る。コンジュゲートは、ポリ（エチレングリコール）にグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミン等であるがこれらに限定されないカチオン性ポリマーを含み得る。例となるコンジュゲート及びそれらの調製物は、米国特許第６，５８６，５２４号及び米国公開第ＵＳ２０１３０２１１２４９号に記載され、これらの各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
コンジュゲートはまた、標的基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体（腎臓細胞等の特定の細胞型に結合するもの）も含み得る。標的基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣物、またはアプタマーであり得る。
標的基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、内皮細胞もしくは骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。標的基はまた、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フルコース（ｆｒｕｃｏｓｅ）、またはアプタマー等の非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であってもよい。
標的基は、特定の受容体を標的化することができる任意のリガンドであり得る。例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース－６Ｐ、アパタマー（ａｐａｔａｍｅｒ）、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが非限定的に挙げられる。特定の実施形態では、標的基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であっても、本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有してもよい。非限定的な例として、標的基は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３０２１６６１０１２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の血液中枢神経系関門をわたる標的化送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートであり得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、より大きな治療有効性を提供するための長時間作用性連続放出系を含む相乗的な生体分子－ポリマーコンジュゲートであり得る。相乗的な生体分子－ポリマーコンジュゲートは、米国公開第ＵＳ２０１３０１９５７９９号に記載のものであり得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、国際特許公開第ＷＯ２０１２０４０５２４号に記載のアプタマーコンジュゲートであり得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載のアミン含有ポリマーコンジュゲートであり得る。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、シグナル配列または標的配列も含み得る細胞透過性ポリペプチドに共有結合的にコンジュゲートされる。コンジュゲートは、増加した安定性及び／または増加した細胞トランスフェクション、及び／または改変された（例えば、特定の組織または細胞型に標的化された）体内分布を有するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、送達を増大させるために薬剤にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、国際公開第ＷＯ２０１１０６２９６５号に記載の標的化モノマーまたは標的遮断を有するポリマー等のモノマーまたはポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５，３９３号及び同第７，３７４，７７８号に記載のポリヌクレオチドに共有結合している輸送剤であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号及び同第８，００３，１２９号に記載のもの等の膜関門輸送増大剤であり得る。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ｘ．微小器官
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を微小器官内に含み、これは次いで持続性治療製剤中で目的のコードされるポリペプチドを発現し得る。例となる微小器官及び製剤は、国際公開第ＷＯ２０１４１５２２１１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
ｙ．シュードビリオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）をシュードビリオン（例えば、Ａｕｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡによって開発されたシュードビリオン）内に含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するために使用されるシュードビリオンは、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００１２４５０号、同第ＵＳ２０１３００１２５６６号、同第ＵＳ２１０３００１２４２６号、及び同第ＵＳ２０１２０２０７８４０号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３００９７１７号（これらの各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のヘルペス及びパピローマウイルス等であるがこれらに限定されないウイルスに由来し得る。
シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１２００１５８９９号及び同第ＵＳ２０１３０１７７５８７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１００４７８３９号、同第ＷＯ２０１３１１６６５６号、同第ＷＯ２０１３１０６５２５号、及び同第ＷＯ２０１３１２２２６２号に記載の方法によって調製されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり得る。一態様では、ＶＬＰは、バクテリオファージＭＳ、Ｑβ、Ｒ１７、ｆｒ、ＧＡ、Ｓｐ、ＭＩ、Ｉ、ＭＸＩ、ＮＬ９５、ＡＰ２０５、ｆ２、ＰＰ７、ならびに植物ウイルスであるカブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）、インゲンマメ南部モザイクウイルス（ＳＢＭＶ）、及びブロモウイルス属のメンバー（ソラマメモトルウイルス、ブロムモザイクウイルス、カシア黄色斑点ウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）、メランドリウム黄斑ウイルス、及びクレイトーニア潜在ウイルスを含む）であり得る。別の態様では、ＶＬＰは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７５８７号及び米国特許第８，５０６，９６７号に記載のインフルエンザウイルスに由来し得る。一態様では、ＶＬＰは、脂質膜または国際公開第ＷＯ２０１３１１６６５６号に記載のもの等の粒子の外面にアンカーされたＢ７－１及び／またはＢ７－２分子を含み得る。一態様では、ＶＬＰは、ノロウイルス、ロタウイルス組換えＶＰ６タンパク質、または二重層ＶＰ２／ＶＰ６（国際公開第ＷＯ２０１２０４９３６６号に記載のＶＬＰ等）に由来し得る。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、シュードビリオンは、国際公開第ＷＯ２０１０１２０２６６号及び米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２９０号に記載のヒトパピローマウイルス様粒子であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自己組織化粒子であり得る。一態様では、シュードビリオンは、米国公開第ＵＳ２０１３０１１６４０８号及び同第ＵＳ２０１３０１１５２４７号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３１１９８７７号に記載のビリオン由来ナノ粒子であり得る。これらの参考文献の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドの製剤及びその製剤化方法の非限定的な例も、国際公開第ＷＯ２０１３０９０６４８号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。
２４．血液クリアランスの加速化
本発明は、生物活性剤等の反復投与される活性剤に対するＡＢＣの効果を低減するための化合物、組成物、及びそれらの使用方法を提供する。容易に明らかになるように、投与される活性剤に対するＡＢＣの効果の完全な低減または排除は、その半減期及び故にその有効性を効果的に増加させる。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣの低減という用語は、陽性参照対照ＡＢＣ誘導ＬＮＰ（ＭＣ３ ＬＮＰ等）との比較での、ＡＢＣの任意の低減を指す。ＡＢＣ誘導ＬＮＰは、所与の時間枠内で、第２またはその後の投与時に活性剤の循環レベルの低減を引き起こす。故に、ＡＢＣの低減は、標準的なＬＮＰと比較して、薬剤の第２またはその後の用量時の循環剤のより少ないクリアランスを指す。低減は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、低減は、１０～１００％、１０～５０％、２０～１００％、２０～５０％、３０～１００％、３０～５０％、４０％～１００％、４０～８０％、５０～９０％、または５０～１００％である。代替的に、ＡＢＣの低減は、第２もしくはその後の投与後の少なくとも検出可能なレベルの循環剤、または標準的なＬＮＰの投与後の循環剤との比較での、循環剤の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍の増加を特徴とし得る。いくつかの実施形態では、低減は、２～１００倍、２～５０倍、３～１００倍、３～５０倍、３～２０倍、４～１００倍、４～５０倍、４～４０倍、４～３０倍、４～２５倍、４～２０倍、４～１５倍、４～１０倍、４～５倍、５～１００倍、５～５０倍、５～４０倍、５～３０倍、５～２５倍、５～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、６～１００倍、６～５０倍、６～４０倍、６～３０倍、６～２５倍、６～２０倍、６～１５倍、６～１０倍、８～１００倍、８～５０倍、８～４０倍、８～３０倍、８～２５倍、８～２０倍、８～１５倍、８～１０倍、１０～１００倍、１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、１０～２５倍、１０～２０倍、１０～１５倍、２０～１００倍、２０～５０倍、２０～４０倍、２０～３０倍、または２０～２５倍である。
本開示は、クリアランスを受けにくく、故により長いインビボ半減期を有する、脂質を含む化合物及び組成物を提供する。これは、組成物が反復（慢性を含む）投与のために意図される場合に、及びさらにより具体的には、かかる反復投与が数日または数週間以内に生じる場合に、特に当てはまる。
有意に、これらの組成物は、血液クリアランスの加速化（ＡＢＣ）の観察される現象を受けにくいか、または完全に回避する。ＡＢＣは、第２及びその後の投与時に、ある特定の外因的に投与された薬剤が血液から急速に排除される現象である。この現象は、部分的には、脂質化剤、リポソーム、または他の脂質系送達ビヒクル、及び脂質カプセル封入剤を含むが、これらに限定されない種々の脂質含有組成物について観察されている。これまで、ＡＢＣの基盤は良好には理解されておらず、場合によっては、体液性免疫応答が原因であるとされてきたため、インビボで（特に臨床設定で）その影響を限定的にするための戦略は、理解することができないままであった。
本開示は、仮にＡＢＣを受けやすい場合でも、ＡＢＣを受けにくい化合物及び組成物を提供する。いくつかの重要な態様では、かかる化合物及び組成物は、脂質を含む化合物及び組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物及び組成物は、第２及びその後のインビボ投与時にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性により、これらの化合物及び組成物は、短期間（数日間または１～２週間を含む）内の反復使用を含むインビボでの反復使用に特に好適となる。この増大した安定性及び／または半減期は、部分的には、これらの組成物がＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、及び／または従来のＢ細胞、ｐＤＣ、及び／または血小板を活性化することができないことによるものである。
したがって、本開示は、血液クリアランスの加速化（ＡＢＣ）の根底をなす機構の解明を提供する。本開示及び本明細書に提供される本発明に従って、ＡＢＣ現象が、少なくともそれが脂質及び脂質ナノ粒子に関する場合、少なくとも部分的には、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ、及び／または血小板に関与する自然免疫応答によって媒介されることが見出されている。Ｂ１ａ細胞は通常、循環ＩｇＭの形態の天然抗体の分泌を担う。このＩｇＭは、多反応性であり、これは、それが各々に対して比較的低い親和性をもってではあるが種々の抗原に結合することができることを意味する。
本発明に従って、インビボ投与される脂質ナノ粒子等のいくつかの脂質化剤または脂質を含む製剤がＡＢＣを誘発し、ＡＢＣを受けやすいことが見出されている。ここで、本発明に従って、第１の用量のＬＮＰの投与時に、自然免疫応答の生成に関与する１つ以上の細胞（本明細書においてセンサーと称される）がかかる薬剤に結合し、活性化され、次いでＡＢＣ及び毒性を促進する免疫性因子（本明細書においてエフェクターと称される）のカスケードを開始することが見出されている。例えば、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、活性化され（単独で、または他のセンサー（ｐＤＣ等）及び／またはエフェクター（ＩＬ６等）の存在下で）、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを分泌し得る。対象における既存の天然ＩｇＭもまた、ＬＮＰを認識し、それに結合することで、補体結合を誘発し得る。第１の用量の投与後、天然ＩｇＭの生産は、ＬＮＰの投与の１～２時間以内に開始する。典型的には、ＩｇＭの自然半減期のために、天然ＩｇＭは、約２～３週間までに系から排除される。天然ＩｇＧは、ＬＮＰの投与の約９６時間後に開始して生産される。ナイーブ設定で投与される場合、薬剤は、Ｂ１ａ細胞もしくはＢ１ｂ細胞の活性化後に生産される天然ＩｇＭ、または天然ＩｇＧによって比較的妨げられずに、その生物学的効果を発揮することができる。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは非特異的であり、故に抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧとは異なる。
本出願者は機構によって拘束されないものの、ＬＮＰが以下の機構を通してＡＢＣ及び／または毒性を誘発することが提案されている。ＬＮＰが対象に投与されるとき、ＬＮＰは、血液を通して脾臓に急速に輸送されると考えられる。ＬＮＰは、血液中及び／または脾臓内の免疫細胞に遭遇し得る。血液中及び／または脾臓内のＬＮＰの存在に応答して、急速な自然免疫応答が誘発される。本出願者は、本明細書において、ＬＮＰの投与の数時間以内に、いくつかの免疫センサーがＬＮＰの存在に反応したことを示している。これらのセンサーとしては、Ｂ細胞、ｐＤＣ、及び血小板等の免疫応答の生成に関与する免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。センサーは、脾臓の辺縁帯内等の脾臓内及び／または血液中に存在し得る。ＬＮＰは、他のセンサーと相互作用し得る１つ以上のセンサーと物理的に相互作用し得る。かかる場合では、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用している。センサーは、ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーは、脾臓内に位置し、容易に互いに相互作用し得る。代替的に、センサーのうちの１つ以上は、血液中のＬＮＰと相互作用し、活性化され得る。次いで、活性化されたセンサーは、他のセンサーと直接的に、または（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ６）等のメッセンジャーの刺激もしくは生産を通して）間接的に相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、以下のセンサー、ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板の各々と直接相互作用し、それらを活性化し得る。次いで、これらの細胞は、互いに直接的または間接的に相互作用して、エフェクターの生産を開始し得、これは最終的に、ＬＮＰの反復用量に関連するＡＢＣ及び／または毒性をもたらす。例えば、本出願者は、ＬＮＰ投与がｐＤＣ活性化、血小板凝集及び活性化、ならびにＢ細胞活性化をもたらすことを示している。ＬＮＰに応答して、血小板もまた凝集し、活性化され、Ｂ細胞と凝集する。ｐＤＣ細胞が活性化される。ＬＮＰは、血小板及びＢ細胞の表面と比較的素早く相互作用することが見出されている。ＬＮＰに応答して、これらのセンサーのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせの活性化を遮断することは、通常であれば生じる免疫応答の減衰に有用である。免疫応答のこの減衰は、ＡＢＣ及び／または毒性の回避をもたらす。
一旦活性化されたセンサーは、エフェクターを生産する。本明細書で使用されるとき、エフェクターは、Ｂ細胞等の免疫細胞によって生産される免疫分子である。エフェクターとしては、免疫グロブリン（天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧ等）ならびにサイトカイン（ＩＬ６等）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後２～６時間以内に天然ＩｇＭの生産を刺激する。天然ＩｇＧは、９６以内に検出され得る。ＩＬ６レベルは、数時間以内に増加する。天然ＩｇＭ及びＩｇＧは、数日間～数週間体内を循環する。この期間中、循環エフェクターは、新たに投与されるＬＮＰと相互作用し、身体によるそれらのＬＮＰのクリアランスを誘発し得る。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識し、それに結合し得る。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージによって認識され、それによる装飾ＬＮＰの取り込みを誘発し得る。次いで、マクロファージは、脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの生産は、ＡＢＣについて観察されるタイミングと相関する過渡応答である。
投与用量が第２またはその後の投与用量である場合、ならびにかかる第２またはその後の用量が前に誘導された天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧが系から排除される前（例えば、２～３ウィンドウ期間前）に投与される場合、かかる第２またはその後の用量は、代替の補体経路の活性化を誘発する循環天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧまたはＦｃによって標的化され、それ自体急速に排除される。エフェクターが身体から排除されるか、その数が減少した後にＬＮＰが投与される場合、ＡＢＣは観察されない。
故に、本発明の態様に従って、ＬＮＰと１つ以上のセンサーとの間の相互作用を阻害すること、ＬＮＰによる（直接的もしくは間接的な）１つ以上のセンサーの活性化を阻害すること、１つ以上のエフェクターの生産を阻害すること、及び／または１つ以上のエフェクターの活性を阻害することが有用である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰとセンサーとの相互作用を制限または遮断するように設計される。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防止するように改変されたＰＣ及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的にまたは加えて、ＬＮＰによって誘導される免疫応答を阻害する薬剤を使用して、これらの効果のうちのいずれか１つ以上を達成してもよい。
従来のＢ細胞もＡＢＣに関連付けられることもまた、決定されている。具体的には、薬剤の第１の投与時、本明細書においてＣＤ１９（＋）と称される従来のＢ細胞が薬剤に結合し、それに対して反応する。しかし、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞とは異なり、従来のＢ細胞は、最初にＩｇＭ応答を開始することができ（ＬＮＰの投与の約９６時間後に開始）、続いて、メモリー応答と同時にＩｇＧ応答を開始する（ＬＮＰの投与の約１４日後に開始）。故に、従来のＢ細胞は、投与された薬剤に対して反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にはＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭ及びＩｇＧは、典型的には、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧである。
いくつかの例では、ＡＢＣ応答の大部分がＢ１ａ細胞及びＢ１ａ媒介免疫応答を通して媒介されることが企図される。いくつかの例では、従来のＢ細胞及びＢ１ａ細胞の両方がかかる効果を媒介して、ＡＢＣ応答がＩｇＭ及びＩｇＧの両方によって媒介されることがさらに企図される。さらに依然としていくつかの例では、ＡＢＣ応答は、活性化されたＢ１ａ細胞によって生産され得る天然ＩｇＭ分子（これらのいくつかは天然ＩｇＭに結合することができる）によって媒介される。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つ以上の成分に結合し得る（例えば、ＬＮＰのリン脂質成分への結合（リン脂質のＰＣ部分への結合等）及び／またはＬＮＰのＰＥＧ－脂質成分への結合（ＰＥＧ－ＤＭＧへの結合、特にＰＥＧ－ＤＭＧのＰＥＧ部分への結合等）。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンがリガンドであるＣＤ３６を発現するため、ＣＤ３６受容体がＢ１ａ細胞の活性化及び故に天然ＩｇＭの生産を媒介し得ることが企図される。さらに依然として他の例では、ＡＢＣ応答は、主に従来のＢ細胞によって媒介される。
本発明に従って、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（薬剤、送達ビヒクル、及び製剤等）の使用を通して、ＡＢＣ現象を少なくとも部分的に低減または抑止することができることが見出されている。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書においてＢ１ａ不活性化合物及び組成物と称され得る。本発明に従って、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用を通して、ＡＢＣ現象を少なくとも部分的に低減または抑止することができることがさらに見出されている。いくつかの実施形態では、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書においてＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称され得る。故に、本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、それらは、従来のＢ細胞を活性化しない。いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ細胞及び従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書においてＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称され得る。
これらの根底をなす機構は、これまで理解されておらず、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞の役割、ならびにこの現象におけるＢ１ａ及びＢ１ｂ細胞と従来のＢ細胞との相互作用もまた、理解されていなかった。
したがって、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物及び組成物を提供する。これらは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板、及び／またはｐＤＣ、ならびに任意選択で従来のＢ細胞も活性化することができないことをさらに特徴とし得る。これらの化合物（例えば、予防剤、治療剤、及び診断剤等の生物活性剤を含む薬剤；リポソーム、脂質ナノ粒子、及び他の脂質系カプセル封入構造等の送達ビヒクル等）ならびに組成物（例えば、製剤等）は、反復投与、特に短期間内（例えば、１～２週間以内）に生じる反復投与を必要とする用途に特に望ましい。これは、例えば、薬剤が、定期的で近接した間隔で対象に提供される核酸系治療薬である場合に、特に当てはまる。本明細書に提供される発見は、同様に投与される、及び／またはＡＢＣを受けやすい、これら及び他の薬剤に適用され得る。
特に目的となるのは、脂質を含む化合物、脂質を含む粒子、及び脂質を含む組成物であるが、これは、これらがＡＢＣを受けやすいことが知られているためである。かかる脂質を含む化合物粒子及び組成物は、生物活性剤として、またはかかる薬剤の送達ビヒクルとして広く使用されている。故に、薬剤自体に対する、またはその送達ビヒクルに対するＡＢＣの効果の低減によるかに関わらず、かかる薬剤のそれらの有効性を改善する能力は、多様な活性剤にとって有益である。
１つ以上の生物活性剤の反復用量投与の投与に関連する急性相応答（ＡＲＰ）を刺激または後押ししない組成物もまた、本明細書に提供される。
いくつかの例では、本組成物は、天然ＩｇＭを含むが、これに限定されないＩｇＭに結合しなくてもよい。
いくつかの例では、本組成物は、Ｃ反応性タンパク質等であるがこれに限定されない急性相タンパク質に結合しなくてもよい。
いくつかの例では、本組成物は、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答を誘発しなくてもよい。本明細書で使用されるとき、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答は、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞によって媒介される免疫応答である。かかる応答としては、ＡＢＣ応答、急性相応答、ならびに天然ＩｇＭ及び／またはＩｇＧの誘導等を挙げることができる。
いくつかの例では、本組成物は、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答を誘発しなくてもよい。本明細書で使用されるとき、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答は、従来のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（－）Ｂ細胞によって媒介される免疫応答である。かかる応答としては、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、メモリーＢ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、及び抗タンパク質応答（タンパク質がＬＮＰ中にカプセル封入され得るもの）を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答等を挙げることができる。
Ｂ１ａ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と称される循環ＩｇＭの供給源である。天然ＩｇＭ抗体は、いくつかの抗原に対して弱い親和性を有することを特徴とし、したがって、それらは、「多特異性」または「多反応性」（それらが１つを超える抗原に結合する能力を示す）であると称される。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを生産することができない。加えて、それらは、メモリー細胞に発達せず、故に適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、それらは、活性化時にはＩｇＭを分泌することができる。分泌されたＩｇＭは、典型的には、約２～３週間以内に排除され、その時点で、免疫系は、前に投与された抗原に対して比較的ナイーブとなる。この期間後に（例えば、初期曝露の約３週間後の時点で）同じ抗原が提示される場合、抗原は、急速に排除されない。しかしながら、有意に、その期間内に（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内に）抗原が提示される場合、抗原は、急速に排除される。連続用量間のこの遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤の使用が不適となっている。
ヒトにおいて、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（－）、及びＣＤ５（＋）である。マウスにおいて、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５ Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。Ｂ１ａ細胞を他の従来のＢ細胞から区別するのは、典型的には、ＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は、高いレベルのＣＤ５を発現し得、これに基づいて、低いまたは検出不能なレベルのＣＤ５を発現するＢ－１Ｂ細胞等の他のＢ－１細胞から区別され得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞はまた、脂肪酸トランスロカーゼとしても知られるＣＤ３６も発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む多くのリガンドに結合し得る。
Ｂ１ｂ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を通してＴ細胞非依存性免疫を誘導することができる。ＣＤ２７は、典型的には、抗原活性化に応答して、Ｂ１ｂ細胞上で上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は、典型的には、脾臓及び腹膜腔等の特定の身体の位置に位置し、血液中では存在量が非常に低い。Ｂ１ｂ分泌天然ＩｇＭは、典型的には、約２～３週間以内に排除され、その時点で、免疫系は、前に投与された抗原に対して比較的ナイーブとなる。この期間後に（例えば、初期曝露の約３週間後の時点で）同じ抗原が提示される場合、抗原は、急速に排除されない。しかしながら、有意に、その期間内に（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内に）抗原が提示される場合、抗原は、急速に排除される。連続用量間のこの遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤の使用が不適となっている。
いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断する１つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの成分がＢ細胞活性化を促進するかを決定し、それらの成分を中和することを伴う。本明細書において、少なくともＰＥＧ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）が、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞の他の細胞との相互作用、及び／または活性化に寄与することが発見されている。ＰＥＧは、活性化をもたらし得る、Ｂ１細胞と血小板との間の凝集を促進する役割を果たし得る。ＰＣ（ＬＮＰ中のヘルパー脂質）はまた、可能性としてはＢ細胞表面上のＣＤ３６受容体との相互作用を通して、Ｂ１細胞を活性化することにも関与する。多数の粒子がＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧを含まない及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸もしくはその類似体）が設計され、試験されている。本出願者は、さもなければ反復投与時にＡＢＣを促進する、ＬＮＰ中のこれらの成分のうちの１つ以上の置換が、天然ＩｇＭの生産及び／またはＢ細胞活性化を低減することによるＡＢＣの防止に有用であることを確立した。故に、本発明は、Ｂ細胞誘発の包含を排除する設計の結果として低減したＡＢＣを有するＬＮＰを包含する。
Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞活性化を遮断するための別の戦略は、ＬＮＰによって誘導される免疫応答を阻害する薬剤の使用に関与する。これらの種類の薬剤は、以下により詳細に考察される。いくつかの実施形態では、これらの薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞とＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣとの間の相互作用を遮断する。例えば、薬剤は、相互作用を物理的に遮断する抗体または他の結合剤であってもよい。この一例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。薬剤はまた、活性化後または活性化前のＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞のシグナリングを防止または無効化する化合物であってもよい。例えば、ＬＮＰまたは他の免疫細胞とのＢ細胞相互作用から生じるＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナリングカスケード中の１つ以上の成分を遮断することが可能である。他の実施形態では、薬剤は、活性化後にＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞によって生産される１つ以上のエフェクターの役割を果たし得る。これらのエフェクターとしては、例えば、天然ＩｇＭ及びサイトカインが挙げられる。
本発明の態様に従って、ｐＤＣ細胞の活性化が遮断されるとき、ＬＮＰに応答したＢ細胞活性化が減少することが示されている。故に、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するために、ｐＤＣ活性化を防止することが望ましい。上記に考察した戦略と同様に、ｐＤＣ細胞活性化は、ｐＤＣとＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板との間の相互作用に干渉する薬剤によって、遮断され得る。代替的に、ｐＤＣに、活性化されるその能力を遮断するように、またはそのエフェクターに作用する薬剤をＬＮＰと共に使用して、ＡＢＣを回避することができる。
血小板もまた、ＡＢＣ及び毒性において重要な役割を果たし得る。ＬＮＰの第１の用量が対象に投与されたほんのすぐ後に、血小板はＬＮＰと会合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態では、血小板凝集及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板凝集及び／または活性化を遮断するための１つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの成分が血小板凝集及び／または活性化を促進するかを決定し、それらの成分を中和することを伴う。本明細書において、少なくともＰＥＧが、血小板凝集、活性化、及び／または他の細胞との相互作用に寄与することが発見されている。多数の粒子がＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧを含まないものが設計され、試験されている。本出願者は、さもなければ反復投与時にＡＢＣを促進する、ＬＮＰ中のこれらの成分のうちの１つ以上の置換が、天然ＩｇＭの生産及び／または血小板凝集を低減することによるＡＢＣの防止に有用であることを確立した。故に、本発明は、血小板誘発の包含を排除する設計の結果として低減したＡＢＣを有するＬＮＰを包含する。代替的に、血小板に、それが活性化された後にその活性を遮断するように、またはそのエフェクターに作用する薬剤をＬＮＰと共に使用して、ＡＢＣを回避することができる。
（ｉ）ＡＢＣ活性及び関連する活性の測定
ＬＮＰを含む、本明細書に提供される種々の化合物及び組成物は、インビボ投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、後述のもの等であるがこれらに限定されないいくつかのアッセイのうちのいずれか、及び実施例の節（実施例の方法小節を含む）に開示されるアッセイのうちのいずれかを通して特性評価及び／または特定され得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＢＣを促進する免疫応答を生産しないＬＮＰの投与に関与する。ＡＢＣを促進する免疫応答は、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板等の１つ以上のセンサー、及び天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧ、またはサイトカイン（ＩＬ６等）等の１つ以上のエフェクターの活性化に関与する。故に、ＡＢＣを促進する免疫応答を生産しないＬＮＰの投与は、最低でも、１つ以上のセンサーを有意に活性化せず、１つ以上のエフェクターを有意に生産しない、ＬＮＰの投与に関与する。この文脈において使用される有意なは、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの第２の用量について予想される血液クリアランスのレベルに関して、第２の用量の全部または一部の血液クリアランスの加速化の生理的結果をもたらす量を指す。例えば、免疫応答は、第２の用量後に観察されるＡＢＣが、ＡＢＣ誘発ＬＮＰについて予想されるよりも低いように減衰されるべきである。
（ｉｉ）Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示に提供されるある特定の組成物は、Ｂ１ａもしくはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）及び／または従来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５－）等のＢ細胞を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、いくつかの方法で決定することができ、これらの方法のいくつかを、以下に提供する。Ｂ細胞集団は、分画化Ｂ細胞集団または脾細胞もしくは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の未分画化集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、選択されるＬＮＰと共にある期間インキュベートされ、次いでさらなる分析のために採取され得る。代替的に、上清が採取され、分析されてもよい。
（ｉｉｉ）活性化マーカー細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６等の後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの増加した発現として示され得る。例となる非限定的なアッセイにおいて、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団としてまたはＰＢＭＣ集団として提供され、選択されるＬＮＰと共に特定の期間インキュベートされ、次いでＣＤ１９等の標準的なＢ細胞マーカーについて及びＣＤ８６等の活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを用いて分析される。好適な陰性対照は、同じ集団を培地と共にインキュベートし、次いで同じ染色及び可視化工程を行うことを伴う。陰性対照との比較での、試験集団におけるＣＤ８６発現の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｉｖ）炎症誘発性サイトカイン放出
Ｂ細胞活性化はまた、サイトカイン放出アッセイによっても評価することができる。例えば、活性化は、目的のＬＮＰへの曝露時のＩＬ－６及び／またはＴＮＦ－アルファ等のサイトカインの生産及び／または分泌を通して評価することができる。
かかるアッセイは、当該技術分野で周知の通例のサイトカイン分泌アッセイを用いて行うことができる。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｖ）Ｂ細胞へのＬＮＰ結合／会合及び／またはＢ細胞による取り込み
Ｂ細胞へのＬＮＰ会合または結合もまた、目的のＬＮＰを評価し、かかるＬＮＰをさらに特性評価するために使用することができる。会合／結合及び／または取り込み／内部移行は、検出可能に標識されたＬＮＰ（蛍光標識されたもの等）を用い、種々の期間のインキュベーション後にＢ細胞中またはＢ細胞上でのかかるＬＮＰの位置を追跡して、評価することができる。
本発明は、本明細書に提供される組成物が、循環ＩｇＭ等のＡＢＣの下流メディエーター及び／または急性相タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））等の急性相応答メディエーターによる認識または検出及び任意選択で結合を逃れることができる可能性があることをさらに企図する。
（ｖｉ）ＡＢＣを低減するための使用方法
ＡＢＣを促進することなく、治療剤等の薬剤をカプセル封入し得るＬＮＰを対象に送達する方法もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＡＢＣを促進しない、例えば、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの生産を誘導しない、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない、本明細書に記載のＬＮＰのうちのいずれかを投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰは、実質的なＡＢＣをもたらす免疫応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすのに十分ではない実質的に低いレベルの免疫応答を誘導するＬＮＰを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの生産を誘導しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすのに不十分な実質的に低いレベルの天然ＩｇＭ分子を誘導するかのいずれかであるＬＮＰを指す。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを生産するＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすのに不十分な実質的に低いレベルのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ応答を誘導するＬＮＰを指す。
いくつかの実施形態では、活性化しない及び生産を誘導しないという用語は、参照値または条件に対する相対的低減である。いくつかの実施形態では、参照値または条件は、ＭＣ３ ＬＮＰ等の標準的なＬＮＰによるＩｇＭ等の分子の活性化または生産の誘導の量である。いくつかの実施形態では、相対的低減は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低減である。他の実施形態では、Ｂ細胞等の細胞を活性化しない及びＩｇＭ等のタンパク質の生産を誘導しないという用語は、検出不能な量の活性細胞または特定のタンパク質を指し得る。
（ｖｉｉ）血小板効果及び毒性
本発明は、部分的には、ＬＮＰ投与に関連する用量制限毒性の根底をなす機構の解明をさらに前提としている。かかる毒性は、凝固障害、急性であるか慢性であるかに関わらず播種性血管内凝固（ＤＩＣ、消費性凝固障害とも称される）、及び／または血管血栓症を伴い得る。いくつかの例では、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性相応答（ＡＰＲ）または補体活性化関連シュードアレルギー（ＣＡＲＰＡ）である。
本明細書で使用されるとき、凝固障害は、インビボでの増加した凝固（血液凝固）を指す。本開示に報告される発見は、かかる増加した凝固と一貫しており、根底をなす機構の洞察を有意に提供する。凝固は、いくつかの異なる因子及び細胞型に関与するプロセスであり、この点について、ＬＮＰの相互作用と血小板との間の関係性は、これまで理解されていなかった。本開示は、かかる相互作用の証拠を提供し、低減した血小板会合、低減した血小板凝集、及び／または低減した血小板凝集を含む、低減した血小板効果を有するように修飾される化合物及び組成物もまた提供する。かかる血小板効果を調節する能力（好ましくは、下方制御する能力を含む）は、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低減し得る。転じて、これは、かかるＬＮＰに関連する毒性を低減することで、より高い用量のＬＮＰ及び重要なことにそれらのカーゴを、それを必要とする患者に投与することを可能にするだろう。
ＣＡＲＰＡは、ナノ医療及び生物学的製剤によって誘発され得る、過敏症反応（ＨＳＲ）において顕在化される急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは、典型的には、ＩｇＥには関与しないが、身体が病原体を排除する能力を増大させる自然免疫系の一部である、補体系の活性化の結果として生じる。以下の経路、古典的補体経路（ＣＰ）、代替経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）のうちの１つ以上が、ＣＡＲＰＡに関与し得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３－１７３（２０１４）。
古典的経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１複合体の活性化によって誘発される。Ｃ１複合体の活性化は、Ｃ１ｑが抗原と複合したＩｇＭもしくはＩｇＧに結合するとき、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合するときに生じる。かかる結合はＣ１ｑ分子の立体構造変化をもたらし、これがＣ１ｒの活性化をもたらし、これが転じてＣ１ｓを切断する。ここで、Ｃ１ｒ２ｓ２成分は、Ｃ４及び次いでＣ２を分割し、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを生産する。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂは結合して、Ｃ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断を促進する古典的経路Ｃ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成する。次いで、Ｃ３ｂはＣ３コンバターゼに結合して、Ｃ５コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。代替経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として連続的に活性化される。因子Ｐ（プロパージン）は、代替経路の正の制御因子である。プロパージンのオリゴマー化はＣ３コンバターゼを安定化し、次いでより多くのＣ３を切断し得る。Ｃ３分子は表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性を動員し、補体活性化の増幅をもたらし得る。
急性相応答（ＡＰＲ）は、感染症を防止し、潜在的な病原体を排除するための複合全身性自然免疫応答である。多数のタンパク質がＡＰＲに関与しており、Ｃ反応性タンパク質は特徴がはっきりしたものである。
本発明に従って、ある特定のＬＮＰが、インビボ投与のほぼ直後に血小板と物理的に会合することができる一方で、他のＬＮＰは、血小板とは全くまたはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが見出されている。有意に、血小板と会合するそれらのＬＮＰはまた、その後に形成される血小板凝集体を明らかに安定化する。血小板とある特定のＬＮＰとの物理的接触は、かかる血小板が凝集されたままであるか、または投与後長期間にわたって連続的に凝集体を形成する能力と相関する。かかる凝集体は、活性化された血小板、ならびにマクロファージ及びＢ細胞等の自然免疫細胞も含む。
２５．使用方法
本明細書に記載のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、ＧＬＡ関連疾患、障害、または病態を治療及び／または予防するための調製、製造、ならびに治療用途において使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物、及び製剤を使用して、ファブリー病を治療及び／または予防する。
例えば、本発明の一態様は、ＧＬＡをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を含む組成物または製剤を対象に投与することを含む、対象におけるファブリー病の徴候及び症状の緩和方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤を使用して、ファブリー病に関連する代謝産物のレベルを低減し、本方法は、有効量のＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、ファブリー病のバイオマーカー、例えば、Ｇｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３のレベルを低減する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与後、短期間内（例えば、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１６時間以内、約２０時間以内、または約２４時間以内）にファブリー病の１つ以上のバイオマーカーのレベルの低減をもたらす。
置換療法は、ファブリー病の潜在的な治療である。故に、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ファブリー病の遺伝子置換療法における使用に好適であるＧＬＡポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを対象に提供することによって、対象におけるＧＬＡもしくはＧＬＡ活性の欠如またはＧＬＡ活性の減少もしくは異常を治療する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、核酸は、例えば、そのＧ／Ｃ、ウリジン、もしくはチミジン含量を修飾することによって配列最適化される、及び／またはポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲＮＡ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞内でＧＬＡタンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象におけるＧＬＡ活性の増加をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用され、本方法は、対象の少なくともいくつかの細胞内でＧＬＡ活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与することは、正常な対象または参照対象（例えば、ファブリー病を患っていないヒト）において予想される活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％以上のレベルまで、対象の細胞内でＧＬＡ活性の増加をもたらす。
いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチドの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それらの細胞に導入されたとき、細胞内のＧＬＡ発現レベルを、ポリペプチドが細胞内に導入される前の細胞内のＧＬＡ発現レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または最大１００％だけ増加させる。
いくつかの実施形態では、本方法または使用は、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９（表２を参照されたい）の群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１１９、１２０、１２２～１４０、及び１６０（表５を参照されたい）の群から選択されるポリヌクレオチドに対する配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含み、ポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードする。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞を哺乳類対象に移植することに関する。細胞を哺乳類対象に投与することは、当業者にとって既知であり、局所埋め込み（例えば、局所もしくは皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈内注射もしくは吸入）、及び医薬として許容され得る担体内への細胞の製剤化を含むが、これらに限定されない。
本開示はまた、ＧＬＡ活性の増加を必要とする対象（例えば、ファブリー病を有する対象）におけるＧＬＡ活性の増加方法であって、治療有効量の本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチド（例えば、ヒトＧＬＡポリペプチド、その変異体、またはヒトＧＬＡを含む融合タンパク質）をコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤を対象に投与することを含む、方法も提供する。
いくつかの態様では、投与を必要とする対象（例えば、ファブリー病を有する対象）への投与後に測定されるＧＬＡ活性は、少なくとも健康なヒト対象において観察される正常なＧＬＡ活性レベルである。いくつかの態様では、投与後に測定されるＧＬＡ活性は、ファブリー病患者（例えば、未治療のファブリー病患者）において観察されるＧＬＡ活性レベルよりも高い。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物または製剤を対象に投与した後の、ＧＬＡ活性の増加を必要とする対象（例えば、ファブリー病を有する対象）におけるＧＬＡ活性の増加は、健康なヒト対象において観察される正常なＧＬＡ活性レベルの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または１００パーセント超である。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物または製剤を対象に投与した後（例えば、単回用量投与後）の、ファブリー病患者において観察されるＧＬＡ活性レベルを超えたＧＬＡ活性の増加は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１２日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間、または４２日間維持される。
血漿または組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、もしくは脾臓組織）内のＧｂ３及びリゾ－Ｇｂ３レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて測定され得る。本開示はまた、Ｇｂ３及びリゾ－Ｇｂ３レベルの減少を必要とする患者（例えば、未治療のファブリー病患者）におけるＧｂ３及びリゾ－Ｇｂ３レベルの減少方法であって、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、方法も提供する。
本開示はまた、ファブリー病患者におけるファブリー病の症状（例えば、疼痛、胃腸障害、被角血管腫等の皮膚病変、腎機能障害、心筋症、または卒中）の治療、予防、または寛解方法であって、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物または製剤を対象に投与することを含む、方法も提供する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物または製剤を、ファブリー病を患う対象に投与することは、ファブリー病の症状の低減をもたらす。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの用量は、少なくとも約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．１ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．６ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．８ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約１．９ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約２ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約３ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約４ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも約４．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、または少なくとも約５ｎｍｏｌ／ｋｇである。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの用量は、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１ｍｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、医薬組成物、及び製剤は、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列ならびに本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ－１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ－１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるある種類のヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば、約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
当業者であれば、本発明の薬物または治療の治療有効性が、対象から（例えば、前臨床の試験対象（げっ歯類、霊長類等）から、または臨床対象（ヒト）から）取得した試料（複数可）中のコードされるタンパク質（例えば、酵素）の発現のレベルを測定することによって特性評価または決定され得ることを理解するだろう。同様に、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から（例えば、前臨床の試験対象（げっ歯類、霊長類等）から、または臨床対象（ヒト）から）取得した試料（複数可）中のコードされるタンパク質（例えば、酵素）の活性のレベルを測定することによって特性評価または決定され得る。さらに、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から取得した試料（複数可）中の適切なバイオマーカーのレベルを測定することによって特性評価または決定され得る。タンパク質及び／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回用量の投与後に決定され得るか、または単回用量の投与後のいくつかの時点で決定及び／または監視され得るか、または治療（例えば、複数回用量治療）の経過を通して決定及び／または監視され得る。
（ｉ）ＧＬＡタンパク質の発現レベル
本発明のある特定の態様は、対象における、例えば、動物（例えば、げっ歯類及び霊長類等）における、またはヒト対象における、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）タンパク質の発現レベル（複数可）の測定、決定、及び／または監視を特徴とする。動物としては、正常で健康または野生型の動物、ならびにファブリー病及びその治療の理解に使用するための動物モデルを含む。例となる動物モデルとしては、げっ歯類モデル、例えば、ＧＬＡ－／－ノックアウトマウスとも称されるＧＬＡ欠乏マウスが挙げられる。
ＧＬＡタンパク質の発現レベルは、当該技術分野において認識されている、任意の生物学的試料（例えば、血液試料または針組織生検）中のタンパク質レベルの決定方法によって測定または決定され得る。本明細書で使用されるとき、「レベル」または「タンパク質のレベル」という用語は、好ましくは、試料中または対象におけるタンパク質の重量、質量、または濃度を意味する。ある特定の実施形態では、試料が、例えば、以下、精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離、及び／またはＨＰＬＣのうちのいずれかに供され、その後例えば、質量及び／または分光測定分析を用いたタンパク質のレベルの決定に供され得ることが当業者によって理解されるだろう。例となる実施形態では、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、タンパク質の発現レベルを決定することができる。他の例となる実施形態では、タンパク質精製、分離、及びＬＣ－ＭＳを、本発明に従ってタンパク質のレベルを決定するための手段として使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回静脈内用量）は、ｍＲＮＡ療法の単回用量の投与後、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間、少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、対象の肝臓組織中で増加したＧＬＡタンパク質の発現レベル（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の増加、及び／または参照レベルまたは正常なレベルの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％までの増加）をもたらす。
（ｉｉ）ＧＬＡタンパク質活性
ファブリー病患者において、ＧＬＡ酵素活性は低減され、ファブリー病患者は、典型的には、ＧＬＡ活性をほぼまたは全く有しない。本発明のさらなる態様は、対象における、例えば、動物（例えば、げっ歯類及び霊長類等）における、またはヒト対象における、ＧＬＡタンパク質の活性レベル（複数可）（すなわち、酵素活性レベル（複数可））の測定、決定、及び／または監視を特徴とする。活性レベルは、当該技術分野において認識されている、任意の生物学的試料中の酵素活性レベルの決定方法によって測定または決定され得る。本明細書で使用されるとき、「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、試料の体積、質量、もしくは重量当たりの、または試料中のタンパク質当たりの酵素の活性を意味する。例となる実施形態では、「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、１ミリリットルの流体（例えば、体液、例えば、血清、血漿、及び尿等）当たりの単位に関して記載されるか、または試料中の１重量の組織当たりもしくは１重量のタンパク質（例えば、全タンパク質）当たりの単位に関して記載される。酵素活性の単位（「Ｕ」）は、単位時間当たりに加水分解される基質の重量または質量に関して記載され得る。本発明の例となる実施形態は、Ｕ／ｍｌの血漿またはＵ／ｍｇのタンパク質（組織）に関して記載されるＧＬＡ活性を特徴とし、単位（「Ｕ」）は、１時間当たりに加水分解されるｎｍｏｌの基質（またはｎｍｏｌ／時）に関して記載される。例となるＧＬＡ酵素アッセイは、ＧＬＡ酵素活性が非蛍光４ＭＵ－α－Ｇａｌ基質から蛍光指標４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）を放出する能力を測定する。血漿及び組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓）中のＧＬＡ活性は、例えば、１時間当たり１ｍｇのタンパク質当たりで生産される４－ＭＵの量として定量化され得る。
例となる実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、投与後６～１２時間、または１２～２４時間、２４～４８時間、４８～７２時間、３日間超、４日間超、５日間超、６日間超、７日間超、１週間超、２週間超、３週間超、４週間超、５週間超、６週間超、血漿または組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、もしくは脾臓）中で少なくとも５Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも６０Ｕ／ｍｇ、少なくとも７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも８０Ｕ／ｍｇ、少なくとも９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも１５０Ｕ／ｍｇのＧＬＡ活性をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。
例となる実施形態では、本発明は、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、血漿ＧＬＡ活性レベルの、参照ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的レベル以上のレベルへの増加をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明は、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間、参照血漿ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的血漿ＧＬＡ活性レベルの少なくとも５０％を維持するのに十分なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明は、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって、血漿ＧＬＡ活性の増加をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とし、増加した血漿ＧＬＡ活性レベルは、対応する参照血漿ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的血漿ＧＬＡ活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
例となる実施形態では、本発明は、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓）ＧＬＡ活性レベルの、参照組織ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的レベル以上のレベルへの増加をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明は、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間、参照組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、もしくは脾臓）ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的組織ＧＬＡ活性の少なくとも５０％を維持するのに十分なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明は、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって、組織（例えば、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓）ＧＬＡ活性の増加をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とし、増加した組織ＧＬＡ活性レベルは、対応する参照組織ＧＬＡ活性レベルまたは正常な生理的組織ＧＬＡ活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
例となる実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、上述の活性レベルをもたらすｍＲＮＡの単回静脈内用量を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法は、上述の活性レベルを維持する、複数回のｍＲＮＡの単回単位静脈内用量で投与され得る医薬組成物を特徴とする。
（ｉｉｉ）ＧＬＡバイオマーカー
本発明のさらなる態様は、（例えば、同じ患者からの、別の患者からの、対照からの、及び／または同じもしくは異なる時点からの）別の試料中の同じもしくは別のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベル）、及び／または生理的レベル、及び／または高まったレベル、及び／または超生理的レベル、及び／または対照のレベルと比較して、試料中で決定される、バイオマーカー、例えば、Ｇｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３のレベル（複数可）を決定することを特徴とする。当業者であれば、バイオマーカーの生理的レベル、例えば、正常または野生型の動物及び正常または健康な対象等におけるレベル、特に、健康及び／または正常に機能している対象に特有のレベル（複数可）に精通しているだろう。本明細書で使用されるとき「高まったレベル」という語句は、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健康な対象（例えば、ヒト対象）において通常見出されるよりも多い量を意味する。本明細書で使用されるとき、「超生理的」という用語は、任意選択で有意に増大した生理的応答を生産している、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健康な対象（例えば、ヒト対象）において通常見出されるよりも多い量を意味する。本明細書で使用されるとき、「比較する」または「と比較して」という用語は、好ましくは、２つ以上の値の、例えば、バイオマーカー（複数可）のレベルの、数学的な比較を意味する。故に、当業者にとって、かかる値のうちの少なくとも２つが互いに比較される場合、値のうちの１つが、別の値または値の群よりも高いか、それよりも低いか、またはそれと同一であるかは容易に明らかになるだろう。比較することまたはとの比較は、例えば、投与前の該対象における（例えば、ファブリー病を患う人における）、または正常もしくは健康な対象における対照値と比較する文脈においてであり得る。比較することまたはとの比較はまた、例えば、投与前の該対象における（例えば、ファブリー病を患う人における）、または正常もしくは健康な対象における参照レベルとの比較での、例えば、対照値と比較する文脈においてでもあり得る。
本明細書で使用されるとき、「対照」は、好ましくは、対象からの試料であり、該対象のファブリー病状態は、既知である。一実施形態では、対照は、健康な患者の試料である。別の実施形態では、対照は、既知のファブリー病状態（例えば、重度、軽度、または健康なファブリー病状態）を有する少なくとも１人の対象（例えば、対照患者）の試料である。別の実施形態では、対照は、ファブリー病が治療されていない対象からの試料である。依然さらなる実施形態では、単一の対象からの試料もしくは異なる対象からの試料のプール、及び／または異なる時点で対象（複数可）から取得した試料である。
本明細書で使用されるとき、「レベル」または「バイオマーカーのレベル」という用語は、好ましくは、試料中または対象における本発明のバイオマーカーの質量、重量、または濃度を意味する。本発明のバイオマーカーとしては、例えば、Ｇｂ３及びリゾ－Ｇｂ３が挙げられる。ある特定の実施形態では、試料が、例えば、以下、物質精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離、及び／またはＨＰＬＣのうちの１つ以上に供され、その後例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたは質量分析を用いたバイオマーカーのレベルの決定に供され得ることが当業者によって理解されるだろう。例となる実施形態では、ＬＣ－ＭＳを、本発明に従ってバイオマーカーのレベルを決定するための手段として使用することができる。
ある特定の実施形態、本発明のｍＲＮＡを使用して、投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、または少なくとも１０週間、ファブリー病患者におけるＧｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３の血漿または組織レベルを、該対象における参照レベルの約７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０パーセント未満まで低減するのに十分なレベルでＧＬＡポリペプチドを発現させることができる。
本明細書で使用されるとき、バイオマーカーの「レベルの決定」という用語は、対象からの試料中、例えば、対象からの体液（例えば、血清、血漿、尿、血液、リンパ液、便等）中、または対象の組織（例えば、肝臓、心臓、脾臓腎臓等）中の少なくとも１つの物質の量を定量化することを含む方法を意味し得る。
本明細書で使用されるとき、「参照レベル」という用語は、本発明のｍＲＮＡ療法の投与前の対象における（例えば、ファブリー病を患う人における）、または正常もしくは健康な対象における（例えば、バイオマーカーの）レベルを指し得る。
本明細書で使用されるとき、「正常な対象」または「健康な対象」という用語は、ファブリー病に関連する症状を患っていない対象を指す。さらに、対象が、ファブリー病に関連する症状をもたらす、ＧＬＡ遺伝子の機能部分もしくはドメインの変異及び／または酵素ＧＬＡもしくはその活性の低減もしくはその欠乏症をもたらすＧＬＡ遺伝子の変異を有しない場合に、対象は、正常（または健康）であると見なされるだろう。該変異は、対象からの試料がかかるＧＬＡ変異の遺伝子試験に供される場合に検出されるだろう。本発明の例となる実施形態では、健康な対象からの試料を、対照試料として使用するか、または健康もしくは正常な対象の試料に由来するバイオマーカーのレベルの既知の値もしくは標準化された値を、対照として使用する。
いくつかの実施形態では、ファブリー病の治療を必要とする対象、ファブリー病の予防を必要とする対象、またはファブリー病が治療されている対象からの試料中のバイオマーカーのレベルを、バイオマーカーの対照レベルと比較することは、（ファブリー病の治療を必要とするか、またはそれが治療されている）対象からの試料中のバイオマーカーのレベルを、ベースラインまたは参照レベルと比較することを含み、（ファブリー病の治療を必要とするか、またはそれが治療されている）対象からの試料中のバイオマーカーのレベルが、ベースラインまたは参照レベルと比較して高まるか、増加するか、またはそれよりも高い場合、これは、対象がファブリー病を患っていること、及び／または治療を必要としていることを示し、及び／または（ファブリー病の治療を必要とするか、またはそれが治療されている）対象からの試料中のバイオマーカーのレベルが、ベースラインレベルと比較して減少するか、またはそれよりも低い場合、これは、対象がファブリー病を患っていないか、ファブリー病の治療が奏功しているか、またはファブリー病の治療を必要としていないことを示す。ある特定の期間内、例えば、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６０時間以内、もしくは７２時間以内、及び／またはある特定の期間、例えば、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月等にわたる、バイオマーカーのレベルの低減がより強力（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の低減、及び／または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の低減）であるほど、例えば、本発明のｍＲＮＡ療法（例えば、単回用量または複数回レジメン）等の療法は、より奏功している。いくつかの実施形態では、Ｇｂ３血漿レベルは、対象において、１０ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、９ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、８ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、７ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、６ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、５ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、４ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、３ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、または２ｎｍｏｌ／ｍＬ未満まで低減する。
投与後、１、２、３、４、５、６（またはそれ以上）日間以内の、特に、体液（例えば、血漿）中または対象における組織（複数可）（例えば、肝臓、心臓、脾臓、もしくは腎臓）中の、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも１００％以上のバイオマーカー、例えば、Ｇｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３のレベルの低減は、ファブリー病の治療の奏功のための好適な用量を示し、本明細書で使用されるとき、低減は、好ましくは、特定の期間後（例えば、投与後、例えば、単回静脈内用量の投与後）に決定されるバイオマーカーのレベルを、該期間の開始時（例えば、該用量の投与前）に決定される同じバイオマーカーのレベルと比較することを意味する。例となる期間としては、投与後１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間、特に投与後２４、４８、７２または９６時間が挙げられる。
基質レベル（例えば、Ｇｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３等のバイオマーカー）の持続した低減は、ファブリー病の治療が奏功しているｍＲＮＡ治療投薬及び／または投与レジメンを特に示す。かかる持続した低減は、本明細書において効果の「持続期間」と称され得る。例となる実施形態では、投与後１、２、３、４、５、６、７、８（またはそれ以上）日間以内の、特に、体液（例えば、血漿）中または対象における組織（複数可）（例えば、肝臓、心臓、脾臓、もしくは腎臓）中のバイオマーカーのレベルの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の低減は、治療アプローチの奏功を示す。例となる実施形態では、１つ以上の試料（例えば、流体及び／または組織）中の基質（例えば、バイオマーカー）レベルの持続した低減が、好ましい。例えば、任意選択で、少なくとも１つの組織、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ以上の組織中での該バイオマーカーの持続した低減と組み合わせて、（本明細書に定義される）Ｇｂ３及び／またはリゾ－Ｇｂ３の持続した低減をもたらすｍＲＮＡ療法は、治療の奏功を示す。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回用量は、約０．２～約０．８ｍｐｋ、約０．３～約０．７ｍｐｋ、約０．４～約０．８ｍｐｋ、または約０．５ｍｐｋである。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ療法の単回用量は、１．５ｍｐｋ未満、１．２５ｍｐｋ未満、１ｍｐｋ未満、０．７５ｍｐｋ未満、または０．５ｍｐｋ未満である。
２６．使用のための組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、上記に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤を対象とする。
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、
（ｉ）ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）であって、このポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウラシル（例えば、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５－メトキシウラシルである）を含み、このポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ－１４２（例えば、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐ結合部位）に結合するｍｉＲＮＡ結合部位、及び／またはｍｉＲ－１２６（例えば、ｍｉＲ－１２６－３ｐまたはｍｉＲ－１２６－５ｐ結合部位）に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む、ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１～２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３～３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９～４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と、を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％～約１５０％である。
いくつかの実施形態では、上記のポリヌクレオチド、組成物または製剤は、ＧＬＡ関連疾患、障害、または状態、例えば、ファブリー病を治療及び／または予防するために使用される。
２７．投与の形態
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物、及び製剤は、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、経腸（腸内へ）、胃腸内、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜へ）、経口（口を通って）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳へ）、脳室内（脳室へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通って）、静脈内（静脈へ）、静脈内ボーラス、静脈内持続点滴、動脈内（動脈へ）、筋肉内（筋肉へ）、心臓内（心臓へ）、骨内注入（骨髄内へ）、髄腔内（脊柱管内へ）、腹腔内（腹腔への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通って）、空洞内（病理学的空洞内へ）、体腔内（陰茎の付け根へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無処置の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送法（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜の上へ）、点耳液中、耳介（耳の中または耳を通って）、口腔（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯（歯（複数可）へ）、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸透、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨の中）、仙骨内（馬尾の中）、槽内（大槽の中）、角膜内（角膜の中）、歯冠内、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の拡張可能な空間内）、円板内（円板の中）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸の中）、硬膜内（硬膜の中または下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の中）、歯肉内（歯肉の中）、回腸内（小腸の遠位部分の中）、病変内（局所化した病変の中またはそこに直接導入する）、管腔内（管腔の中）、リンパ内（リンパの中）、骨髄内（骨の髄腔内）、脳脊髄膜内（髄膜内）、眼内（眼の中）、卵巣内（卵巣の中）、心膜内（心膜の中）、胸膜内（肋膜内）、前立腺内（前立腺の中）、肺内（肺またはその気管支の中）、鼻内（鼻または眼窩周囲洞内）、脊髄内（脊柱内）、関節滑液嚢内（関節の滑膜腔内）、腱内（腱の中）、精巣内（精巣の中）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸での脳脊髄液の中）、胸腔内（胸部の中）、管内（器官の管の中）、鼓室内（中耳内）、血管内（血管（複数可）の中）、脳室内（脳室の中）、イオン泳動（電流によって、可溶塩が身体の組織内に移動する）、潅注（開放創または体腔を浸すかまたは洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、鼻腔胃（鼻を通して胃の中へ）、密封包帯法（局所経路投与の後、領域を密封する包帯によって被覆する）、眼（外眼へ）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身効果のために経口吸入または経鼻吸入によって気道内へ）、延髄後（脳橋の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通すかまたはその全体に）、経気管（気管の壁を通して）、鼓膜内（鼓室全体またはそれを通して）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨麻酔、診断、神経ブロック、胆道灌流、心臓潅流、循環光療法、または脊髄が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮性関門を通過することを可能にする方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、投与の経路のための製剤は、１つ以上の不活性成分を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドまたは機能的断片またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ネイキッドで細胞に送達され得る。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」は、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。ネイキッドポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られており、かつ本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達され得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは機能的断片またはそのバリアント）は、本明細書に記載の方法を使用して製剤化され得る。製剤は、修飾及び／または未修飾であり得るポリヌクレオチドを含有し得る。製剤は、限定されないが、細胞膜透過剤、医薬として許容され得る担体、送達剤、生分解性または生体適合性ポリマー、溶媒、及び持続放出送達デポをさらに含み得る。製剤化されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られており、かつ本明細書に記載の投与経路を使用して細胞に送達され得る。
非経口投与用の医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。使用される不活性成分は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によっていずれも認可されているかいずれも認可されていない。非経口投与用の医薬組成物において使用するための不活性成分の非網羅的なリストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び水酸化ナトリウムが含まれる。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁化剤を使用して既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物は、無毒の非経口投与用に許容される希釈剤及び／または溶媒中の、滅菌注射溶液、懸濁液、及び／またはエマルション、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としてであり得る。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌の不揮発油が、溶媒または懸濁媒として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激の不揮発油を用いることができる。注射剤の調製においてオレイン酸等の脂肪酸を使用することができる。滅菌製剤はまた、局所麻酔、保存剤、及び緩衝剤等のアジュバントも含み得る。
注射用製剤は、細菌保持フィルタ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ－ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）を通す濾過によって、及び／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
注射用製剤は、組織、器官、及び／または対象の領域内への直接注射のためのものであり得る。非限定的な例として、組織、器官、及び／または対象に、虚血性領域内への心筋内注射によって製剤を直接注射することができる。（例えば、Ｚａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３を参照されたい；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
活性成分の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましいことが多い。これは、水溶性の乏しい結晶性または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは、結晶の大きさ及び結晶形態に依存し得る。代替的に、非経口投与された薬物形態の吸収の遅延は、油性ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることによって達成される。注射用デポ形態は、ポリラクチド－ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマー比、及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射用製剤は、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を封入することによって調製される。
２８．キット及びデバイス
ａ．キット
本発明は、特許請求される本発明のヌクレオチドを、好都合及び／または有効に使用するための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象（複数可）の複数の治療を実施し、及び／または複数の実験を実施することを可能にするために十分な量及び／または数の構成要素を含む。
一態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
当該キットは、翻訳可能領域を含む第１のポリヌクレオチドを含むタンパク質産生のためのものであり得る。キットは、包装及び説明書、及び／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含む。送達剤は、生理食塩水、緩衝溶液、脂質様物質、または本明細書に開示される任意の送達剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、緩衝溶液には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、及び／またはＥＤＴＡが含まれ得る。別の実施形態では、緩衝溶液には、生理食塩水、２ｍＭカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭカルシウムを含む５％マンニトール、リンガーの乳酸塩、塩化ナトリウム、２ｍＭカルシウムを含む塩化ナトリウム、及びマンノースが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国公開第２０１２０２５８０４６号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態では、緩衝溶液は、沈殿されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。各構成要素の量は、一貫した再現可能なより高い濃度の生理食塩水または単純な緩衝製剤を可能にするために変動し得る。構成要素はまた、一定時間にわたって、及び／または多様な条件下で、緩衝溶液中の修飾されたＲＮＡの安定性を増加させるために変動し得る。一態様では、本発明は、標的細胞に導入されると、翻訳領域によってコードされた所望の量のタンパク質を産生するために有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドと、細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される阻害性核酸を含む第２のポリヌクレオチドと、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドであって、細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、ポリヌクレオチドと、包装及び説明書とを含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本発明は、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドであって、細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、ポリヌクレオチドと、第１の核酸の翻訳可能領域の翻訳のために好適な哺乳動物細胞とを含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
ｂ．デバイス
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定な製剤中に、ヒト患者等の、必要のある対象に直ちに送達されるように利用可能な製剤中でポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
投与のためのデバイスを用いて、本明細書で教示される単回、複数回、または分割投与レジメンに従って本発明のポリヌクレオチドを送達することができる。かかるデバイスは、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号において教示され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
細胞、器官、及び組織への複数回投与のための当該技術分野で既知の方法及びデバイスは、本発明の実施形態として本明細書に開示される方法及び組成物と併せて使用することが企図される。これらには、例えば、複数の針を有する方法及びデバイス、例えばルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイス、ならびに熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスが含まれる。
本発明によると、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書において企図される単回、複数回、または分割用量を送達することができる。かかるデバイスは、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号において教示され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つの針を介して、３つの異なる、任意選択で隣接する部位に、同時または６０秒以内に（例えば、４、５、６、７、８、９、または１０の部位に同時または６０秒以内に）皮下または筋肉内に投与される。
ｃ．カテーテル及び／またはルーメンを利用する方法及びデバイス
カテーテル及びルーメンを使用する方法及びデバイスを用いて、本発明のポリヌクレオチドを、単回、複数回、または分割投与スケジュールで投与することができる。かかる方法及びデバイスは、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｄ．電流を利用する方法及びデバイス
電流を利用する方法及びデバイスを用いて、本明細書に教示される単回、複数回、または分割レジメンに従って本発明のポリヌクレオチドを送達することができる。かかる方法及びデバイスは、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
２９．定義
本開示をより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用されるとき、本明細書で別途明確に提供される場合以外、以下の用語は各々、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体を通して記載される。
本発明は、群の１つのみのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、その中で用いられるか、またはそれと別様に関連する、実施形態を含む。本発明は、群のメンバーの１つを超えるまたは全てが、所与の生成物またはプロセス中に存在するか、その中で用いられるか、またはそれと別様に関連する、実施形態を含む。
この明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途規定しない限り、複数の指示物を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つ以上の」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。ある特定の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「単一の」を意味する。他の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「２つ以上の」または「複数の」を含む。
さらに、本明細書で使用される「及び／または」は、２つの指定される特徴または構成要素の各々の、他方を伴うかまたは伴わない具体的な開示として取られるべきである。故に、「Ａ及び／またはＢ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが企図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが企図される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び化学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。
「を含む」という表現で態様が本明細書において記載される場合、「からなる」及び／または「から本質的になる」の用語で説明される、さもなければ類似の態様もまた提供される。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められる形式で表される。数値範囲は、範囲を規定する数字を含む。ある範囲の値が引用される場合、かかる値の間の各部分範囲と共に、その範囲の引用された上限及び下限の間の、介在する各整数値及びそれらの各分数もまた具体的に開示されることを理解されたい。任意の範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれてもその範囲から除外されてもよく、一方の限界を含むか、いずれの限界も含まないか、または両方の限界を含む各範囲も、本発明の範囲内に包含される。値が、明白に引用される場合、引用された値とおよそ同じ分量または量もまた、本発明の範囲内であることを理解されたい。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各部分的組み合わせも具体的に開示され、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、その組み合わせもまた開示される。本発明の任意の要素が、複数の選択肢を有するものとして開示される場合、各選択肢が単独で、または他の選択肢と任意の組み合わせで除外されたその発明の例も本明細書によって開示され、発明の１つを超える要素がかかる除外を有してもよく、かかる除外を有する要素の全ての組み合わせも本明細書によって開示される。
ヌクレオチドは、それらの一般に容認される１文字のコードで呼ばれる。別途示されない限り、核酸は、５’から３’の配向で左から右に書かれている。ヌクレオ塩基は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される、それらの一般に容認される１文字のコードで呼ばれる。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に容認される３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号のいずれかによって呼ばれる。別途示されない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの配向で左から右に書かれている。
約：明細書及び特許請求の範囲を通して数値に関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られ、かつ許容される精度間隔を意味し、かかる精度間隔は、±１０％である。
範囲が与えられる場合、端点は含まれる。さらに、別途示されない限り、または文脈もしくは当業者の理解から別途明白ではない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において指定される範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が別途明らかに示さない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで前提とすることができる。
組み合わせて投与される：本明細書で使用されるとき、「組み合わせて投与される」または「併用投与」という用語は、２つ以上の薬剤が、同時に、または患者への各薬剤の効果が重複し得る間隔で対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、薬剤は、互いに、約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、併用（例えば、相乗）効果が達成されるために十分に近い間隔を空けられる。
アミノ酸置換：「アミノ酸置換」という用語は、親または参照配列（例えば、野生型ＧＬＡ配列）中に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野で既知の組換え方法を通して、親または参照配列（例えば、野生型ＧＬＡポリペプチド配列）中で置換され得る。したがって、「Ｘ位での置換」への言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸の、別のアミノ酸残基による置換を指す。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹに従って記載されてもよく、Ａは、ｎ位に天然でまたは元来存在するアミノ酸に対応し、Ｙは、置換するアミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）に従って記載されてもよく、Ａは、Ｘ位に天然でまたは元来存在するアミノ酸を置換するアミノ酸に対応する１文字のコードであり、Ｙ及びＺは、代替の置換するアミノ酸残基である。
本開示の文脈において、置換（アミノ酸置換と呼ばれる場合であっても）は、核酸レベルで行われ、すなわち、代替のアミノ酸残基でのアミノ酸残基の置換は、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
動物：本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発育段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、またはクローンである。
おおよそ：本明細書で使用されるとき、目的の１つ以上の値に適用される「おおよそ」という用語は、指定される参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「おおよそ」という用語は、別途示されない限り、または文脈から別途明白でない限り（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、指定される参照値の、いずれかの方向に（それより大きいかまたは小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の値の範囲を指す。
に関連する：疾患に関して本明細書で使用されるとき、「に関連する」という用語は、当の症状、測定、特徴、またはステータスが、その疾患の診断、発症、存在、または進行と連結していることを意味する。関連性として、その疾患と原因的に連結している場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい。例えば、ファブリー病を有する患者の生活の質の低下を引き起こす、徴候及び症状、後遺症、または任意の影響は、ファブリー病に関連すると見なされ、本発明のいくつかの実施形態では、必要のある対象に本発明のポリヌクレオチドを投与することによって治療、寛解、または予防され得る。
２つ以上の部分に関して使用されるとき、「に会合した」、「コンジュゲートされた」、「連結した」、「結合した」、及び「繋がった」という用語は、直接的、または結合剤として働く１つ以上の追加の部分を介して、部分が互いに物理的に会合または接続しており、構造が使用される条件、例えば、生理学的条件下で、部分が物理的に会合したままであるために十分に安定な構造を形成することを意味する。「会合」は、必ずしも、厳密に直接共有化学結合を通したものでなくてもよい。それはまた、イオンもしくは水素結合、または「会合した」実体が物理的に会合したままであるために十分に安定なハイブリダイゼーションに基づく接続も示し得る。
二機能性：本明細書で使用されるとき、「二機能性」という用語は、少なくとも２つの機能を有することができるか、またはそれらを維持する任意の物質、分子、または部分を指す。機能は、同じ転帰または異なる転帰に影響し得る。機能を生み出す構造は、同じであっても異なってもよい。例えば、本発明の機能性修飾ＲＮＡは、ＧＬＡペプチド（第１の機能）をコードすることができる一方、コードＲＮＡを含むヌクレオシドはそれ自体で、ＲＮＡの半減期を延長させることができる（第２の機能）。この例では、タンパク質欠乏症を患う対象への二機能性修飾ＲＮＡの送達は、疾患または状態を寛解または治療することができるペプチドまたはタンパク質分子を産生するだけでなく、延長した期間の間、対象において存在する集団修飾ＲＮＡも維持することになる。他の態様では、二機能性修飾ｍＲＮＡは、例えば、ＧＬＡペプチドをコードするＲＮＡ（第１の機能）と、第１のタンパク質に融合したか、または第１のタンパク質と共発現した第２のタンパク質と、を含むキメラまたはキメリック（ｑｕｉｍｅｒｉｃ）分子であり得る。
生体適合性：本明細書で使用されるとき、「生体適合性」という用語は、生細胞、組織、器官、または系に適合し、損傷、毒性、または免疫系による拒絶の危険性をほとんどまたは全くもたらさないことを意味する。
生分解性：本明細書で使用されるとき、「生分解性」という用語は、生物の行為によって無毒の生成物へと分解され得ることを意味する。
生物学的に活性：本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性」という語句は、生物系及び／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に生物学的な効果をもたらす物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部のみだけでも生物学的に活性であるか、または生物学的に関連すると見なされる活性を模倣する場合に、生物学的に活性であると見なされ得る。
キメラ：本明細書で使用されるとき、「キメラ」は、２つ以上の不調和または不均質な部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、ＧＬＡポリペプチドを含む第１の部分と、第２の治療的タンパク質（例えば、固有の酵素活性、抗原結合部分、またはＧＬＡの半減期を延長させることができる部分、例えば、抗体のＦｃ領域を有するタンパク質）を含む第２の部分（第１の部分と遺伝子融合されている）と、を含み得る。
配列最適化：「配列最適化」という用語は、参照核酸配列中のヌクレオ塩基が代替のヌクレオ塩基で置き換えられ、改善された特性、例えば、改善されたタンパク質発現または減少した免疫原性を有する核酸配列をもたらす、プロセスまたは一連のプロセスを指す。
一般に、配列最適化の目的は、参照ヌクレオチド配列によってコードされるものと同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を産生することである。故に、参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対する、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド中にアミノ酸置換（コドン最適化の結果としての）は存在しない。
コドン置換：配列最適化の文脈における「コドン置換」または「コドン置き換え」という用語は、参照核酸配列中に存在するコドンを別のコドンで置き換えることを指す。コドンは、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当該技術分野で既知の組換え方法を通して、参照核酸配列中で置換され得る。したがって、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）中のある特定の位置での、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の領域もしくは部分配列内の「置換」または「置き換え」への言及は、代替のコドンでのかかる位置または領域のコドンの置換を指す。
本明細書で使用されるとき、「コード領域」及び「をコードする領域」という用語、ならびにそれらの文法的異形は、発現するとポリペプチドまたはタンパク質をもたらす、ポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
化合物：本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造の全ての立体異性体及び同位体を含むことが意図される。本明細書で使用されるとき、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、シス及びトランス異性体）、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、本明細書に記載の化合物のあらゆる全ての立体異性体を包含し、これには、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性体的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）、ならびに鏡像異性体及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体が含まれる。化合物の鏡像異性体及び立体異性体混合物、ならびにそれらをそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体に分解する手段は、周知である。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、原子核中の異なる数の中性子によってもたらされる異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウム及び重水素が含まれる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、通例の方法によって溶媒及び水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製され得る。
接触させる：本明細書で使用されるとき、「接触させる」という用語は、２つ以上の実体の間に物理的接続を確立させることを意味する。例えば、哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させることは、哺乳類細胞及びナノ粒子に物理的接続を共有させることを意味する。インビボ及びエクスビボの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と哺乳動物内に配置された哺乳類細胞を接触させることは、異なる投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）によって実施され得、異なる量のナノ粒子組成物を伴い得る。さらに、１つを超える哺乳類細胞がナノ粒子組成物によって接触され得る。
保存的アミノ酸置換：「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）が含まれる。故に、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられている場合、アミノ酸置換は、保存的であると見なされる。別の態様では、連続したアミノ酸が、順序が異なる構造的に同様な連続及び／または側鎖ファミリーメンバーの組成物で保存的に置き換えられ得る。
非保存的アミノ酸置換：非保存的アミノ酸置換には、（ｉ）陽電性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が、電気陰性の残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で、もしくはそれによって置換されるか、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で、もしくはそれによって置換されるか、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基で、もしくはそれによって置換されるか、または（ｉｖ）嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）が、より小さい側鎖を有するもの（例えば、ＡｌａまたはＳｅｒ）もしくは側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）で、もしくはそれによって置換されるものが含まれる。
他のアミノ酸置換は、当業者によって容易に特定され得る。例えば、アミノ酸アラニンの場合、置換は、Ｄ－アラニン、グリシン、ベータ－アラニン、Ｌ－システイン、及びＤ－システインのいずれか１つから取られ得る。リジンの場合、置き換えは、Ｄ－リジン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、ホモ－アルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチン、またはＤ－オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離されたポリペプチドの特性の変化を誘発することが予想され得る機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンまたはトレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンで（もしくはそれによって）置換されるか、（ｉｉ）システイン残基が、任意の他の残基で（もしくはそれによって）置換されるか、（ｉｉｉ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性の側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸で（もしくはそれによって）置換されるか、または（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、かかる側鎖を有しない残基、例えば、グリシンで（もしくはそれによって）置換されるものである。前述の非保存的置換のうちの１つがタンパク質の機能的特性を改変し得る可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置とも相関し、したがって、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性への影響がほとんどまたは全くない場合がある。
保存された：本明細書で使用されるとき、「保存された」という用語は、比較される２つ以上の配列の同じ位置で改変されずに生じる、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、最も関連する配列の中で、配列中の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも保存されているものである。
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに対して１００％同一である場合に、「完全に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに対して約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に、「高度に保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに対して少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に、「保存された」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに対して約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に、「保存された」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用することができ、またはそれらの部分、領域、もしくは特徴に適用することができる。
制御放出：本明細書で使用されるとき、「制御放出」という用語は、治療的帰結をもたらすための特定の放出パターンに準拠する医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状または環化：本明細書で使用されるとき、「環状」という用語は、連続したループの存在を指す。環状分子は、サブユニットの切れ目のない鎖を形成するために繋がっているのみで、円形である必要はない。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の環状分子は、単一の単位もしくは多量体であり得るか、または複合体もしくは高次構造の１つ以上の構成要素を含み得る。
細胞傷害性：本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、原生動物、寄生虫、プリオン、またはそれらの組み合わせを殺滅するか、またはそれらに対して有害、毒性、もしくは致死的な効果をもたらすことを指す。
送達する：本明細書で使用されるとき、「送達する」という用語は、実体を目的地に提供することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドを対象に送達することは、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に投与する（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路によって）ことを伴い得る。哺乳動物または哺乳類細胞へのナノ粒子組成物の投与は、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを伴い得る。
送達剤：本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的細胞へのポリヌクレオチドのインビボ、インビトロ、またはエクスビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化された：本明細書で使用されるとき、「不安定」、「不安定化させる」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の開始野生型または天然形態よりも安定していない領域または分子を意味する。
ジアステレオマー：本明細書で使用されるとき、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像ではなく、互いに重ねることができない立体異性体を意味する。
消化する：本明細書で使用されるとき、「消化する」という用語は、より小さい断片または構成要素に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及するとき、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位：本明細書で使用されるとき、「遠位」という用語は、中心から離れて、または目的の点もしくは領域から離れて置かれることを意味する。
ドメイン：本明細書で使用されるとき、ポリペプチドに言及するとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質－タンパク質相互作用の部位として働くこと）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投与レジメン：本明細書で使用されるとき、「投与レジメン」または「投与レジメン」は、投与スケジュール、または医師が決定した治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
有効量：本明細書で使用されるとき、薬剤の「有効量」という用語は、有益または所望の結果、例えば、臨床的結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。例えば、タンパク質欠乏症（例えば、ＧＬＡ欠乏症）を治療する薬剤の投与の文脈において、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしで認められる症状の重度と比較して、ＧＬＡ欠乏症に関連する徴候及び症状を寛解、低減、排除、または予防するのに十分なＧＬＡを発現するｍＲＮＡの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療上有効量」、または「治療上有効用量」と交換可能に使用され得る。
鏡像異性体：本明細書で使用されるとき、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、少なくとも９０％の１つの鏡像異性体及び最大で１０％の他の鏡像異性体）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％光学的純度または鏡像体過剰率（当該技術分野で標準的な方法によって決定される）を有する、本発明の化合物の各個々の光学的活性形態を意味する。
カプセル封入：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入、包囲、または収容することを意味する。
カプセル封入効率：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入効率」は、ナノ粒子組成物の調製に使用されるポリヌクレオチドの初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供された合計１００ｍｇのポリヌクレオチドのうち９７ｍｇのポリヌクレオチドがカプセル封入されている場合、カプセル封入効率は、９７％として得ることができる。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」は、完全な、実質的な、または部分的な、封入、限局、包囲、または収容を指し得る。
コードされたタンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作された：本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、開始点の野生型または天然分子とは異なる、構造的または化学的にかかわらない特徴または特性を有するように設計されている場合に「操作されている」。
増大した送達：本明細書で使用されるとき、「増大した送達」という用語は、目的の標的組織（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）への対照ナノ粒子によるポリヌクレオチドの送達レベルと比較して、より多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）、目的の標的組織（例えば、哺乳類肝臓）へのナノ粒子によるポリヌクレオチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織中の全タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織中の全ポリヌクレオチドの量と比較することによって測定することができる。標的組織へのナノ粒子の増大した送達は、治療される対象において決定する必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）等の代理において決定することができることを理解されたい。
エキソソーム：本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」は、ＲＮＡ分解に関与する哺乳類細胞または複合体によって分泌される小胞である。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのｍＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）；（２）ｍＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳；及び（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エクスビボ：本明細書で使用されるとき、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、またはその微生物、細胞、もしくは組織）の外側で生じる事象を指す。エクスビボ事象は、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に改変された環境下で生じ得る。
特徴：本明細書で使用されるとき、「特徴」は、特質、特性、または固有の要素を指す。ポリペプチドに言及するとき、「特徴」は、固有のアミノ酸配列に基づく分子の構成要素として定義される。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面顕在化、局所立体形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
製剤：本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドと、担体、賦形剤、及び送達剤のうちの１つ以上と、を含む。
断片：本明細書で使用される「断片」は、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養された細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、Ｎ末端、及び／またはＣ末端、及び／または内部の部分配列が欠失している、完全長タンパク質（例えば、ＧＬＡ）の部分配列である。本発明のいくつかの好ましい態様では、本発明のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的：本明細書で使用されるとき、「機能的」生体分子は、それが特徴とする特性及び／または活性の形態の生体分子である。故に、本発明のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的ＧＬＡ断片を発現することができるポリヌクレオチドである。本明細書で使用されるとき、ＧＬＡの機能的断片は、野生型ＧＬＡの断片（すなわち、その天然に生じるアイソフォームのいずれかの断片）、またはその変異体もしくはバリアントであり、この断片は、対応する完全長タンパク質の生物活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
ＧＬＡ関連疾患：本明細書で使用されるとき、「ＧＬＡ関連疾患」または「ＧＬＡ関連障害」という用語はそれぞれ、異常ＧＬＡ活性（例えば、減少した活性または増加した活性）からもたらされる疾患または障害を指す。非限定的な例として、ファブリー病は、ＧＬＡ関連疾患である。
「ＧＬＡ活性」及び「α－ガラクトシダーゼＡ活性」という用語は、本開示において交換可能に使用され、ＧＬＡのα－ガラクトシダーゼ活性を指す。したがって、ＧＬＡ活性を保持または有する断片またはバリアントは、測定可能なα－ガラクトシダーゼ活性を有する断片またはバリアントを指す。
ヘルパー脂質：本明細書で使用されるとき、「ヘルパー脂質」という用語は、脂質部分（脂質層、例えば、脂質二重層への挿入のため）及び極性部分（脂質層の表面での生理学的溶液との相互作用のため）を含む化合物または分子を指す。典型的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を「補完」し、二重層の膜融合性を増加させ、及び／または、例えば、細胞に送達された核酸のエンドソーム回避を促進することを助けることである。ヘルパー脂質はまた、ＬＮＰの表面への重要な構造的構成要素であると考えられている。
相同性：本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的関係を示す。故に、相同である２つの分子は、共通の進化原型を有することになる。本発明の文脈では、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、同一である（全く同じモノマーである）かまたは類似している（保存的置換）場合に、「相同である」と見なされる。「相同な」という用語は必ず、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）の間の比較を指す。
同一性：本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えばＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列を整列することによって実施することができる（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非同一配列は比較目的のために無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、等価物として見なされ得る。
様々な供給源から、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントについて、好適なソフトウェアプログラムが利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実施する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳ生物情報化学プログラム集の一部であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能である（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
配列アラインメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥ等の当該技術分野で既知の方法を使用して行われ得る。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それらのそれぞれの配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、１０分の１の位が四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は、常に整数であることにも留意されたい。
ある特定の態様では、第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一性パーセンテージ「％ＩＤ」は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによって整列された）において同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基（ヌクレオ塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列中の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高くなる。
当業者であれば、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が、一次配列データによって排他的に駆動されたバイナリ配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントが、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データ等の異種のソースからのデータと統合することによって生成され得ることも理解されるであろう。異種データを統合して複数の配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、かつ代替的に、例えば、ＥＢＩから利用可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アラインメントは、自動的にまたは手動で生成され得ることも理解されるであろう。
免疫応答：「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織への選択的損傷、その破壊、またはヒトの身体からのその排除をもたらす、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記の細胞または肝臓によって産生された可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の行為を指す。いくつかの場合では、脂質構成要素を含むナノ粒子及びカプセル封入治療剤の投与は、（ｉ）カプセル封入治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）かかるカプセル封入治療剤の発現産物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされたポリペプチド）、（ｉｉｉ）ナノ粒子の脂質構成要素、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされ得る免疫応答を誘発することができる。
炎症応答：「炎症応答」は、特異的及び非特異的防御系を伴う免疫応答を指す。特異的防御系応答は、抗原に対する特異的な免疫系応答である。特異的防御系応答の例としては、抗体応答が挙げられる。非特異的防御系応答は、一般に免疫記憶が不可能な白血球、例えば、マクロファージ、好酸球、及び好中球によって媒介される免疫応答である。いくつかの態様では、免疫応答には、炎症性サイトカインの分泌が含まれ、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす。
炎症性サイトカイン：「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答において上昇したサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１；別名ＧＲＯα、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語にはまた、当該技術分野で既知の炎症応答に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（Ｉｌ－１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）等も含まれる。
インビトロ：本明細書で使用されるとき、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、動物、または微生物）の中ではなく、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器中、採用培養中、ペトリ皿中等で生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用されるとき、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織）の中で生じる事象を指す。
挿入及び欠失バリアント：ポリペプチドに言及するときの「挿入バリアント」は、天然または開始配列中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接して」とは、アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基のいずれかに接続していることを意味する。ポリペプチドに言及するときの「欠失バリアント」は、天然または開始アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域において１つ以上のアミノ酸が欠失されている。
無傷：本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの文脈では、「無傷」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異または置換しないことを意味する。逆に、核酸の文脈では、「無傷」という用語は、野生型核酸に対応するヌクレオ塩基を保持すること、例えば、野生型ヌクレオ塩基を変異または置換しないことを意味する。
イオン性アミノ脂質：「イオン性アミノ脂質」という用語は、１、２、３つ以上の脂肪酸または脂肪アルキル鎖、及びｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質を含む。イオン性アミノ脂質は、典型的には、アミノ頭部基のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化され（すなわち、正荷電性）、そのｐＫａを上回るｐＨでは実質的に非荷電性である。かかるイオン性アミノ脂質には、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）及び（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）が含まれるが、これらに限定されない。
単離された：本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、物質または実体が会合していた（天然または実験設定のいずれかで）構成要素のうちの少なくともいくつかから分離された物質または実体を指す。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離された物質に関して、異なるレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが元来会合していた他の構成要素のうちの少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、それが他の構成要素を実質的に含まない場合、物質は、「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物は、それが形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物中で濃縮された組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約重量７０％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本開示の化合物またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。
「単離された」本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または任意の組成物は、天然に見出されない形態であるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物には、それらが天然に見出される形態ではなくなる程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体：本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を有し得、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）もしくは（－））またはシス／トランス異性体）等の立体異性体として存在し得ることを認識されたい。本発明によると、本明細書に描写される化学構造、及びしたがって、本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性体的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）、ならびに鏡像異性体及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ体を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体及び立体異性体混合物は、典型的には、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化等の周知の方法によってそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体に分解され得る。鏡像異性体及び立体異性体はまた、周知の不斉合成方法によって立体異性体または鏡像異性体的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。
リンカー：本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、原子団、例えば、１０～１，０００個の原子を指し、限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミン等の原子または基で構成され得る。リンカーは、第１の端部で、ヌクレオ塩基または糖部分上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドに、かつ第２の端部で、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に結合し得る。リンカーは、核酸配列内への組み込みに干渉しないために十分な長さであり得る。リンカーは、ポリヌクレオチド多量体（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子またはＩＶＴポリヌクレオチドの連結を通して）またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、ならびに本明細書に記載される通りにペイロードを投与するため等の、任意の有用な目的のために使用され得る。リンカー内に組み込まれ得る化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、その各々は、本明細書に記載される通りに任意選択で置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマー、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例には、還元剤または光分解を使用して切断され得る、例えば、ジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）等の、リンカー内の切断可能な部分が含まれるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、アミド結合が、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）もしくは他の還元剤、及び／または光分解の使用によって切断され得、ならびにエステル結合が、例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得ることが挙げられる。
投与方法：本明細書で使用されるとき、「投与方法」には、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法が含まれ得る。投与方法は、身体の特定の領域または系への送達（例えば、特異的に送達する）を標的化するために選択され得る。
修飾された：本明細書で使用されるとき、「修飾された」は、本発明の分子の状態または構造の変化を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的な方法を含む、多くの方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、それが、天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関連するため、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入によって修飾されている。キャップ構造等の等の非標準ヌクレオチドは、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるにもかかわらず、「修飾されている」とは見なされない。
粘液：本明細書で使用されるとき、「粘液」は、粘性であり、かつムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物：本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子組成物」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、典型的には、マイクロメーターまたはより小さい桁の大きさであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、５００ｎｍ以下の直径の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
天然に生じる：本明細書で使用されるとき、「天然に生じる」とは、人工的な補助なしに天然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用されるとき、「非ヒト脊椎動物」には、野生種及び家畜種を含む、ホモサピエンスを除く全ての脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例としては、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、及びヤク等の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸配列：「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、交換可能に使用され、連続した核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであり得る。
「核酸」という用語には、その最も広義において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質が含まれる。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称されることが多い。例となる本発明の核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ機能性を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ機能性を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのハイブリッドもしくは組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
「をコードするヌクレオチド配列」という語句は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）コード配列を指す。コード配列は、プロモーターを含む調節要素に作動可能に連結された開始及び終結シグナル、ならびに核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中の発現を指示することができるポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
オフターゲット：本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物への任意の意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム中に停止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的接続を指す。
任意選択で置換される：本明細書において、「任意選択で置換されたＸ」（例えば、任意選択で置換されたアルキル）の形態の語句は、「Ｘであって、Ｘは、任意選択で置換されている」（例えば、「アルキルであって、当該アルキルは、任意選択で置換されている」）と同等であることが意図される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であると意味することは意図されない。
部分：本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長未満である、ポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」は、特定の疾患または状態について、治療を求めるかもしくは必要とする対象、治療が必要な対象、治療を受けている対象、治療を受ける対象、または訓練された専門家による治療下にある対象を指す。いくつかの実施形態では、治療は、疾患のより重度な形態を発症するリスクを予防または減少させるために必要とされるか、必要であるか、または受けられ、すなわち、これは予防処置である。
医薬として許容され得る：「医薬として許容され得る」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織との接触における使用に好適な、化合物、材料、組成物、及び／または投与剤形を指すように本明細書において用いられる。
医薬として許容され得る賦形剤：本明細書で使用される「医薬として許容され得る賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外であり、患者において実質的に無毒かつ非炎症性である特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル）を指す。賦形剤には、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化薬、乳化剤、充填剤（希釈剤）、塗膜形成剤またはコーティング剤、香料、芳香剤、滑剤（流動改良剤）、潤滑剤、保存剤、印刷用インク、吸着材、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が含まれ得る。例となる賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（コーン）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
医薬として許容され得る塩：本開示はまた、本明細書に記載の化合物の医薬として許容され得る塩も含む。本明細書で使用されるとき、「医薬として許容され得る塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、親化合物は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基性基を好適な有機酸と反応させることによって）修飾されている。医薬として許容され得る塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱物または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリまたは有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むがこれらに限定されない非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。本開示の医薬として許容され得る塩には、例えば、非毒性無機または有機塩から形成された、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の医薬として許容され得る塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、かかる塩は、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、水中もしくは有機溶媒中で、または２つ混合物中で、化学量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製され得、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが使用される。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
医薬として許容され得る溶媒和物：本明細書で使用される「医薬として許容され得る溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれている、本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液から、結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例としては、エタノール、水（例えば、モノ、ジ、及びトリ水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジル等が挙げられる。水が溶媒であるとき、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生きた生物に投与された物質の成り行きの決定に関連するため、分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分配、代謝、及び排泄の程度及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは、一般的にＡＤＭＥと称され、（Ａ）吸収は、物質が血液循環に入るプロセスであり、（Ｄ）分配は、流体及び身体組織を通した物質の分散または散布であり、（Ｍ）代謝（または生体内変換）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、（Ｅ）排泄（または排出）は、身体からの物質の排出を指す。稀な場合には、いくつかの薬物は、身体組織中に不可逆的に蓄積する。
物理化学的：本明細書で使用されるとき、「物理化学的」は、物理的及び／または化学的特性を持つか、またはそれに関連することを意味する。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。故に、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、例えば、アルキル化によって、及び／またはキャッピングによって修飾された形態、ならびに修飾されていない形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）を含み、これには、スプライシングされているかスプライシングされていないかにかかわらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡ、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー（但し、ポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡにおいて見出されるような、塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成でヌクレオ塩基を含有することを条件とする）が含まれる。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然ヌクレオ塩基を含む。いくつかの態様では、ある特定のクラスの全てのヌクレオ塩基は、非天然ヌクレオ塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の全てのウリジンが、非天然ヌクレオ塩基、例えば、５－メトキシウリジンで置き換えられ得る）。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、天然ヌクレオ塩基のみ、すなわち、合成ＤＮＡの場合、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）のみ、または合成ＲＮＡの場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ（ウリジン）のみを含む。
当業者であれば、本明細書に開示されるコドンマップ中のＴ塩基は、ＤＮＡ中に存在し、一方で、Ｔ塩基は、対応するＲＮＡにおいてＵ塩基で置き換えられることを理解するであろう。例えば、ＤＮＡ形式で本明細書に開示されるコドン－ヌクレオチド配列、例えば、ベクターまたはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）テンプレートは、そのＴ塩基が、その対応する転写ｍＲＮＡにおいてＵ塩基として転写されることになる。この点で、コドン最適化ＤＮＡ配列（Ｔを含む）及びそれらの対応するｍＲＮＡ配列（Ｕを含む）はいずれも、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列と見なされる。当業者であれば、１つ以上の塩基を非天然塩基で置き換えることによって同等のコドンマップが生成され得ることも理解するであろう。故に、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これは転じて、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられているＲＮＡマップ）に対応する。
標準Ａ－Ｔ及びＧ－Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３－ＨとＣ４－オキシとの間、及びアデノシンのそれぞれＮ１とＣ６－ＮＨ２との間、及びシチジンのＣ２－オキシとＮ３とＣ４－ＮＨ２との間、及びグアノシンのそれぞれＣ２－ＮＨ２とＮ’－ＨとＣ６－オキシとの間の水素化結合の形成を可能にする条件下で形成される。故に、例えば、グアノシン（２－アミノ－６－オキシ－９－β－Ｄ－リボフランオシル－プリン）は、イソグアノシン（２－オキシ－６－アミノ－９－β－Ｄ－リボフランオシル－プリン）を形成するように修飾され得る。かかる修飾は、シトシンと標準塩基対を有効に形成しなくなったヌクレオシド塩基をもたらす。しかしながら、イソシトシン（１－β－Ｄ－リボフランオシル－２－アミノ－４－オキシ－ピリミジン－）を形成するためのシトシン（１－β－Ｄ－リボフランオシル－２－オキシ－４－アミノ－ピリミジン）の修飾は、グアノシンと有効に塩基対を形成しないが、イソグアノシンと塩基対を形成する、修飾されたヌクレオチドをもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６８１，７０２号）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９－１０４９６及びその中に引用される参考文献によって記載される方法によって調製することができ、２’－デオキシ－５－メチル－イソシチジンは、Ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１－４４６７及びその中に引用される参考文献の方法によって調製することができ、イソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上記）及びＭａｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３－５６０１によって記載される方法、またはＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，７８０，６１０号に記載される方法によって調製することができる。他の非天然塩基対は、２，６－ジアミノピリミジン及びその補体（１－メチルピラゾロ－［４，３］ピリミジン－５，７－（４Ｈ，６Ｈ）－ジオンの合成について、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３－３７に記載される方法によって合成することができる。Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５－３６８３及びＳｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（上記）等の、固有の塩基対を形成する他のかかる修飾されたヌクレオチド単位は既知である。
ポリペプチド：「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように交換可能に使用される。ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含み得る。この用語はまた、天然で、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素でのコンジュゲーション等の任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチン等の非天然アミノ酸）、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾も、この定義内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、この用語は、任意の大きさ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に生じるポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の等価物、バリアント、及び類似体を含む。ポリペプチドは、モノマーであってもよく、または二量体、三量体、または四量体等の多分子複合体であってもよい。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドにおいて見出される。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用し得る。いくつかの実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
ポリペプチドバリアント：本明細書で使用されるとき、「ポリペプチドバリアント」という用語は、それらのアミノ酸配列が、天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置で置換、欠失、及び／または挿入を保有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を保有する。いくつかの実施形態では、それらは、天然または参照配列に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％同一である。
単位薬物当たりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書で使用されるとき、ＰＵＤまたは単位薬物当たりの産物とは、体液または組織中で測定された産物（ポリペプチド等）の合計１日用量の細分化した部分（通常、１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇ等）として定義され、通常、体液中の計量によって割った、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬ等の濃度で定義される。
予防する：本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態の発症を部分的もしくは完全に遅らせること；特定の感染症、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の徴候及び症状、特徴、もしくは臨床症状の発症を部分的もしくは完全に遅らせること；特定の感染症、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の徴候及び症状、特徴、もしくは顕在化の発症を部分的もしくは完全に遅らせること；感染症、特定の疾患、障害、及び／または状態の進行を部分的もしくは完全に遅らせること；及び／または感染症、疾患、障害、及び／または状態に関連する病理を発症するリスクを減少させることを指す。
増殖する：本明細書で使用されるとき、「増殖する」という用語は、成長する、拡大する、増加する、または急速な成長、拡大、もしくは増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に抗するか、またはそれに適さない特性を有することを意味する。
予防的：本明細書で使用されるとき、「予防的」とは、疾患の蔓延を予防するために使用される治療または一連の措置を指す。
予防：本明細書で使用されるとき、「予防」とは、健康を維持し、疾患の蔓延を予防するために取られる手段を指す。「免疫予防」は、疾患の蔓延を予防するために能動または受動免疫を産生するための手段を指す。
タンパク質切断部位：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段によってアミノ酸の制御された切断が達成され得る部位を指す。
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断するためのポリペプチドにフラグまたは印をつける少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用されるとき、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書に提供されるもの、ならびにその断片、変異体、バリアント、及び変化を含む。
近位：本明細書で使用されるとき、「近位」という用語は、中心、または目的の点もしくは領域により近く置かれていることを意味する。
シュードウリジン：本明細書で使用されるとき、シュードウリジン（ψ）は、ヌクレオシドウリジンのＣ－グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾、バリアント、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体には、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、及び２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）が含まれるが、これらに限定されない。
精製された：本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製された」、「精製」は、不必要な構成要素、材料汚染、混合物、または不完全性から実質的に純粋にするかまたはそれらを取り除くことを意味する。
参照核酸配列：「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」という用語は、配列最適化され得る開始核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）を指す。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、断片、またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、以前に配列最適化された核酸配列である。
塩：いくつかの態様では、本明細書に開示される送達のための医薬組成物は、それらの脂質構成要素のいくつかの塩を含む。「塩」という用語は、任意のアニオン性及びカチオン性の複合体を含む。アニオンの非限定的な例としては、無機及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩（例えば、半シュウ酸塩）、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、重亜硫酸塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グルコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。
試料：本明細書で使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞、または構成要素部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、腟液、及び精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。試料は、生物全体、または例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、及び尿生殖路の外部切片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、もしくは器官を含むがこれらに限定されない、その組織、細胞、もしくは構成要素部分、またはその画分もしくは部分から調製された、ホモジネート、ライセート、または抽出物をさらに含み得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成要素を含有し得る栄養ブイヨンまたはゲル等の培地を指す。
シグナル配列：本明細書で使用されるとき、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」という語句は、交換可能に使用され、タンパク質のある特定の小器官、細胞区画への輸送もしくは局在化、または細胞外輸出を指示することができる配列を指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチド、及びシグナル配列をコードする核酸配列シグナル配列の両方を包含する。故に、核酸の文脈におけるシグナル配列への言及は、実際は、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路：「シグナル伝達経路」は細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝送の役割を果たす、多様なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す。本明細書で使用されるとき、「細胞表面受容体」という語句は、例えば、シグナルを受信し、かつ細胞の形質膜にわたってかかるシグナルを伝送することができる、分子及び分子の複合体を含む。
類似性：本明細書で使用されるとき、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対する類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が当該技術分野で理解されるような保存的置換を考慮することを除いて、同一性パーセントの計算と同じ様式で実施することができる。
単回単位用量：本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」は、１用量で／１回で／単一の経路／単一の接触点で、すなわち、単一の投与事象で投与される任意の治療剤の用量である。
分割用量：本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単回単位用量または全１日用量を２つ以上の用量に分けることである。
特異的送達：本明細書で使用されるとき、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、オフターゲット組織と比較した、ナノ粒子による目的の標的組織（例えば、哺乳類肝臓）へのより多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）ポリヌクレオチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織の重量と比較すること、組織中で産生されたタンパク質の量を当該組織中の全タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を当該組織中の全ポリヌクレオチドの量と比較することによって測定することができる。例えば、腎血管標的化について、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるポリヌクレオチドと比較して、組織１ｇ当たり、１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多いポリヌクレオチドが腎臓に送達される場合、ポリヌクレオチドは、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳類腎臓に特異的に提供されている。ナノ粒子が標的組織に特異的に送達する能力は、治療される対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）等の代理において決定することができることを理解されたい。
安定な：本明細書で使用されるとき、「安定な」とは、反応混合物からの有用な程度の純度への単離を生き残るのに十分に強固であり、かついくつかの場合では、有効な治療剤への製剤化が可能である化合物を指す。
安定化された：本明細書で使用されるとき、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」は、安定にするかまたは安定になることを意味する。
立体異性体：本明細書で使用されるとき、「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）が保有し得る全ての考えられる異なる異性体型及び立体型、特に、基本分子構造の全ての考えられる立体化学的及び立体的な異性体型、全てのジアステレオマー、鏡像異性体、及び／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性型で存在し得、後者の全ては、本発明の範囲内に含まれている。
対象：「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断、または療法が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家畜動物、家畜、動物園の動物、競技動物、愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ウシ（ｃｏｗ）；霊長類、例えば、類人猿、サル、オラウータン、及びチンパンジー；イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミ；ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ；ウマ類、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ；クマ、食用動物、例えば、ウシ、ブタ、及びヒツジ；有蹄類、例えば、シカ及びキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。他の実施形態では、対象は、ヒト患者である。特定の実施形態では、対象は、治療を必要とするヒト患者である。
実質的に：本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、完全なまたはほぼ完全な程度または範囲の、目的の特徴または特性を呈する定性的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的特徴は、完全になり、及び／または完全に進行する、もしくは絶対的な結果を達成もしくは回避することがあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的特徴に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるように本明細書において使用される。
実質的に等しい：投与間の時間差に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：複数の投与に関して本明細書で使用されるとき、この用語は、２秒以内を意味する。
を患う：疾患、障害、及び／または状態「を患う」個体は、その疾患、障害、及び／または状態と診断されているか、またはその１つ以上の徴候及び症状を提示している。
影響を受けやすい：疾患、障害、及び／または状態の「影響を受けやすい」個体は、疾患、障害、及び／または状態と診断されておらず、及び／またはその徴候及び症状を提示し得ないが、疾患またはその徴候及び症状を発症する傾向を持っている。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態（例えば、ファブリー病）の影響を受けやすい個体は、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられ得る：（１）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、及び／または状態に関連するタンパク質及び／または核酸の発現及び／または活性の増加及び／または減少；（４）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する習慣及び／または生活様式；（５）疾患、障害、及び／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害、及び／または状態の発症に関連する微生物への曝露及び／またはそれによる感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、及び／または状態を発症しない。
持続放出：本明細書で使用されるとき、「持続放出」という用語は、特定の時間にわたる放出速度に準拠する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成：「合成」という用語は、人間の手によって産生、調製、及び／または製造されたことを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的細胞：本明細書で使用されるとき、「標的細胞」は、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官において見出され得る。生物は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象、または患者であり得る。
標的組織：本明細書で使用されるとき、「標的組織」は、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらす、任意の１つ以上の目的の組織型を指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、及び系、またはその群が挙げられる。特定の用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管中（例えば、冠内または大腿内）の血管内皮であり得る。「オフターゲット組織」は、コードされたタンパク質の発現が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない、任意の１つ以上の組織型を指す。
オフターゲット組織中の治療剤の存在は、（ｉ）拡散を介するかもしくは血流を通した、投与部位から周辺組織もしくは遠位のオフターゲット組織へのポリヌクレオチドの漏出（例えば、ある特定の組織中でポリペプチドを発現するように意図されたポリヌクレオチドがオフターゲット組織に到達し、そのポリペプチドがオフターゲット組織中で発現される）、または（ｉｉ）かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後の、拡散を介するかもしくは血流を通した、周辺組織もしくは遠位のオフターゲット組織へのポリペプチドの漏出（例えば、ポリヌクレオチドが標的組織中でポリペプチドを発現し、ポリペプチドが周辺組織に拡散する）。
標的化配列：本明細書で使用されるとき、「標的化配列」という語句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
末端：本明細書で使用されるとき、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの先端を指す。かかる先端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域におけるさらなるアミノ酸を含み得る。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終端）の両方を有するものとして特徴付けられ得る。本発明のタンパク質は、いくつかの場合では、ジスルフィド結合によって、または非共有結合力（多量体、オリゴマー）によって一緒になった、複数のポリペプチド鎖で構成されている。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ及びＣ末端を有することになる。代替的に、ポリペプチドの末端は、場合によって、それらが有機コンジュゲート等の非ポリペプチドベースの部分で開始または終結するように修飾され得る。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されると、治療、診断、及び／または予防効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を呈する薬剤を指す。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、治療剤であり得る。
治療上有効量：本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態を患うか、またはその影響を受けやすい対象に投与されると、その感染症、疾患、障害、及び／または状態の治療、その徴候及び症状を改善、診断、予防、及び／またはその発症を遅らせるのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。
治療上有効な帰結：本明細書で使用されるとき、「治療上有効な帰結」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態を患うか、またはその影響を受けやすい対象において、その感染症、疾患、障害、及び／または状態を治療、その徴候及び症状を改善、診断、予防、及び／またはその発症を遅らせるのに十分な帰結を意味する。
合計１日用量：本明細書で使用されるとき、「合計１日用量」は、２４時間の間に与えられるかまたは処方される量である。合計１日用量は、単回単位用量または分割用量として投与され得る。
転写因子：本明細書で使用されるとき、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＲＮＡへのＤＮＡの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、単独で転写の制御をもたらす一方、他の転写因子は、他のタンパク質と共同して働く。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化及び抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、特異的標的配列、または標的遺伝子の制御領域中の特異的コンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を、単独で、または他の分子と複合して制御することができる。
転写：本明細書で使用されるとき、「転写」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡテンプレートまたは配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列またはテンプレート）を産生する方法を指す。
トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」は、細胞内へのポリヌクレオチドの導入を指し、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（例えば、外因性核酸）が発現されるか（例えば、ｍＲＮＡ）、またはポリペプチドが細胞機能を調節する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳、またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。トランスフェクションの方法には、化学的方法、物理的処理、及びカチオン性脂質または混合物が含まれるが、これらに限定されない。
治療する、治療、療法：本明細書で使用されるとき、「治療する」または「治療」または「療法」という用語は、疾患、例えばファブリー病の、部分的または完全な緩和、改善、除去、その発症の遅延、その進行の阻害、その重度の低減、及び／またはその１つ以上の徴候及び症状または特徴の発生率の低減を指す。例えば、ファブリー病を「治療する」ことは、疾患に関連する徴候及び症状の減少、患者の寿命の延長（生存率の増加）、疾患の重度の低減、疾患の発症の予防または遅延等を指し得る。治療は、疾患、障害、及び／または状態に関連する病理を発症するリスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／または状態の兆候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期徴候のみを示す対象に投与され得る。
未修飾：本明細書で使用されるとき、「未修飾」は、何らかの方法で改変される前の、任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、野生型または天然型の生体分子を指すことができるが、必ずしもそうではない。分子は、一連の修飾を経ることができ、それにより各修飾された分子は、その後の修飾のための「未修飾の」開始分子として働くことができる。
ウラシル：ウラシルは、ＲＮＡの核酸中の４つのヌクレオ塩基のうちの１つであり、文字Ｕによって表される。ウラシルは、β－Ｎ１－グルコシド結合を介して、リボース環、またはより具体的にはリボフラノースに結合して、ヌクレオシドウリジンをもたらし得る。ヌクレオシドウリジンはまた、一般に、そのヌクレオ塩基の１文字コードに従って、すなわちＵと略称される。故に、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがＵであるとき、かかるＵは、「ウラシル」または「ウリジン」と交換可能に指定されている。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、交換可能であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列中のウリジンまたはウラシルの総数）として、または相対的値（核酸配列中のヌクレオ塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表され得る。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含量及び／またはウリジンパターンに対して、異なる全体的もしくは局所的ウリジン含量（より多いもしくはより少ないウリジン含量）を有するか、または異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布もしくはクラスター化）を有する配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の内容において、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、等価かつ交換可能であると見なされる。
「高ウリジンコドン」は、２または３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「無ウリジンコドン」は、ウリジンを含まないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、低ウリジンコドンでの高ウリジンコドンの置換、無ウリジンコドンでの高ウリジンコドンの置換、高ウリジンコドンでの低ウリジンコドンの置換、無ウリジンコドンでの低ウリジンコドンの置換、低ウリジンコドンでの無ウリジンコドンの置換、高ウリジンコドンでの無ウリジンコドンの置換、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、無ウリジンコドンは、別の無ウリジンコドンで置き換えられ得る。ウリジン修飾配列は、ウリジン豊富化またはウリジン希薄化であり得る。
ウリジン豊富化：本明細書で使用されるとき、「ウリジン豊富化」という用語及び文法的異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量の増加（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）を指す。ウリジン豊富化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジンヌクレオ塩基を含有する同義コドンで置換することによって実装され得る。ウリジン豊富化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所（すなわち、候補核酸配列の配列または領域に対して）であり得る。
ウリジン希薄化：本明細書で使用されるとき、「ウリジン希薄化」という用語及び文法的異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対する、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）中のウリジン含量の減少（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列中のコドンを、より少ないウリジンヌクレオ塩基を含有する同義コドンで置換することによって実装され得る。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所（すなわち、候補核酸配列の配列または領域に対して）であり得る。
バリアント：本開示において使用されるバリアントという用語は、天然バリアント（例えば、多型、アイソフォーム等）、及び天然または開始配列（例えば、野生型配列）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なるアミノ酸が同じ位置に挿入されている人工バリアントの両方を指す。これらのバリアントは、「置換バリアント」と記載され得る。置換は単一であり、分子中の１つのみのアミノ酸が置換されていてもよく、またはそれらは複数であり、同じ分子中で２つ以上のアミノ酸が置換されていてもよい。アミノ酸が挿入または欠失している場合、結果として得られるバリアントは、それぞれ「挿入バリアント」または「欠失バリアント」となる。
３０．実施形態
この節全体を通して、実施形態という用語は、「Ｅ」とそれに続く序数として略称される。例えば、Ｅ１は、実施形態１に等しい。
Ｅ１．α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであって、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）が約１００％～約１５０％である、ポリヌクレオチド。
Ｅ２．％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１１０％～約１５０％、約１１５％～約１５０％、約１２０％～約１５０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１４５％、約１２０％～約１４５％、約１１０％～約１４０％、約１１５％～約１４０％、または約１２０％～約１４０％である、Ｅ１に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３．％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、（ｉ）１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、または１２３％～（ｉｉ）１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、または１４５％である、Ｅ２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４．対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である、Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５．％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、または７０％未満である、Ｅ４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ６．％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６２％～７０％である、Ｅ４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ７．ＯＲＦ中の総ヌクレオチド含量と比べたＯＲＦ中のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である、Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ８．％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約２０％未満である、Ｅ７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ９．％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約１６％～約１８％である、Ｅ１～Ｅ８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１０．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対するＯＲＦのグアニン含量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１１．％ＧＴＭＸは、約７０％～約８５％、約７０％～約８０％、約７１％～約８０％、または約７２％～約８０％である、Ｅ１０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１２．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量と比べたＯＲＦのシトシン含量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１３．％ＣＴＭＸは、約６０％～約８０％、約６５％～約８０％、約７０％～約８０％、または約７０％～約７６％である、Ｅ１２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１４．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量と比べたＯＲＦのＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１５．％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９７％、または約９１％～約９５％である、Ｅ１～Ｅ１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１６．対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べたＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１２５％である、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１７．ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量よりも、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％高い、Ｅ１～Ｅ１５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１８．ＯＲＦは、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む、Ｅ１～Ｅ１７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ１９．
（ｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ１、ＧＬＡ－ＣＯ５、またはＧＬＡ－ＣＯ１１と少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ２、ＧＬＡ－ＣＯ３、ＧＬＡ－ＣＯ６、ＧＬＡ－ＣＯ７、ＧＬＡ－ＣＯ９、ＧＬＡ－ＣＯ１０、ＧＬＡ－ＣＯ１２、ＧＬＡ－ＣＯ１３、ＧＬＡ－ＣＯ１４、ＧＬＡ－ＣＯ１５、ＧＬＡ－ＣＯ１８、ＧＬＡ－ＣＯ２０、ＧＬＡ－ＣＯ２１、ＧＬＡ－ＣＯ２２、ＧＬＡ－ＣＯ２３、またはＧＬＡ－ＣＯ２４と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ８、ＧＬＡ－ＣＯ１６、ＧＬＡ－ＣＯ１７、ＧＬＡ－ＣＯ１９、またはＧＬＡ－ＣＯ２５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、または
（ｉｖ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ４と少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、Ｅ１～Ｅ１８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２０．ＯＲＦを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ１、ＧＬＡ－ＣＯ５、またはＧＬＡ－ＣＯ１１と少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ２、ＧＬＡ－ＣＯ３、ＧＬＡ－ＣＯ６、ＧＬＡ－ＣＯ７、ＧＬＡ－ＣＯ９、ＧＬＡ－ＣＯ１０、ＧＬＡ－ＣＯ１２、ＧＬＡ－ＣＯ１３、ＧＬＡ－ＣＯ１４、ＧＬＡ－ＣＯ１５、ＧＬＡ－ＣＯ１８、ＧＬＡ－ＣＯ２０、ＧＬＡ－ＣＯ２１、ＧＬＡ－ＣＯ２２、ＧＬＡ－ＣＯ２３、またはＧＬＡ－ＣＯ２４と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、
（ｉｉｉ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ８、ＧＬＡ－ＣＯ１６、ＧＬＡ－ＣＯ１７、ＧＬＡ－ＣＯ１９、またはＧＬＡ－ＣＯ２５と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、または
（ｉｖ）ＯＲＦは、ＧＬＡ－ＣＯ４と少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一である、ポリヌクレオチド。
Ｅ２１．ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列と少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、Ｅ１～Ｅ２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２２．ＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡのポリペプチド配列（配列番号１）と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＧＬＡポリペプチドは、α－ガラクトシダーゼ活性を有する、Ｅ１～Ｅ２１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２３．ＧＬＡポリペプチドは、α－ガラクトシダーゼ活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である、Ｅ２２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２４．ポリヌクレオチド配列は、配列輸送ペプチドをコードするヌクレオチドをさらに含む、Ｅ１～Ｅ２３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２５．ポリヌクレオチドは、１本鎖である、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２６．ポリヌクレオチドは、２本鎖である、Ｅ１～Ｅ２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２７．ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２８．ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである、Ｅ１～Ｅ２６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ２９．ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである、Ｅ２８に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３０．ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、Ｅ１～Ｅ２９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３１．少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ３０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３２．少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、５－メトキシウラシルである、Ｅ３０に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３３．ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５－メトキシウラシルである、Ｅ３２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３４．ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む、Ｅ１～Ｅ３３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３５．ｍｉＲＮＡ結合部位は、表３から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、Ｅ３４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３６．ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２に結合する、Ｅ３４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３７．ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐまたはｍｉＲ－１４２－５ｐに結合する、Ｅ３５またはＥ３６に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３８．ｍｉＲ－１４２は、配列番号２８を含む、Ｅ３６またはＥ３７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ３９．ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ１～Ｅ３８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４０．５’ＵＴＲは、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む、Ｅ３９に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４１．ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲをさらに含む、Ｅ１～Ｅ４０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４２．３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む、Ｅ４１に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４３．ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲ内に位置する、Ｅ４１またはＥ４２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４４．ポリヌクレオチドは、５’末端キャップをさらに含む、Ｅ１～Ｅ４３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４５．５’末端キャップは、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、Ｅ４４に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４６．ポリヌクレオチドは、ポリＡ領域をさらに含む、Ｅ１～Ｅ４５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４７．ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である、Ｅ４６に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４８．ポリＡ領域は、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する、Ｅ４７に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ４９．ポリヌクレオチドは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されたＧＬＡポリペプチドをコードする、Ｅ１～Ｅ４８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５０．１つ以上の異種ポリペプチドは、ＧＬＡポリペプチドの薬物動態特性を増加させる、Ｅ４９に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５１．対象に投与されると、ポリヌクレオチドは、配列番号２を含む対応するポリヌクレオチドと比べて、
（ｉ）より長い血漿中半減期、
（ｉｉ）ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、
（ｉｉｉ）発現断片をもたらす停止した翻訳のより低い頻度、
（ｉｖ）より高い構造安定性、または
（ｖ）それらの任意の組み合わせ、
を有する、Ｅ１～Ｅ５０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５２．ポリヌクレオチドは、下記を含む、Ｅ１～Ｅ５１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
（ｉ）５’－末端キャップ、
（ｉｉ）５’－ＵＴＲ、
（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ、
（ｉｖ）３’－ＵＴＲ、及び
（ｖ）ポリＡ領域。
Ｅ５３．３’－ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、Ｅ５２に記載のポリヌクレオチド。
Ｅ５４．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの生産方法であって、少なくとも１つのウラシルヌクレオ塩基をアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基で置換することによって、または少なくとも１つのアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基をウラシルヌクレオ塩基で置換することによって、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、これらの置換全てが、同義置換である、方法。
Ｅ５５．方法は、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を５－メトキシウラシルと置き換えることをさらに含む、Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６．
（ａ）Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドと、
（ｂ）送達剤と、を含む、組成物。
Ｅ５７．送達剤は、脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、Ｅ５６に記載の組成物。
Ｅ５８．送達剤は、脂質ナノ粒子を含む、Ｅ５６に記載の組成物。
Ｅ５９．脂質ナノ粒子は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む、Ｅ５８に記載の組成物。
Ｅ６０．送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000223
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合の５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、Ｅ５６～Ｅ５９のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６１．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、送達剤とを含む組成物であって、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000224
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合の５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、組成物。
Ｅ６２．化合物は、式（ＩＡ）のもの、
Figure 2022136230000225
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、Ｅ６０または６１に記載の組成物。
Ｅ６３．ｍは、５、７、または９である、Ｅ６０～Ｅ６２のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６４．化合物は、式（ＩＩ）のもの、
Figure 2022136230000226
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、Ｅ６０～Ｅ６３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６５．Ｍ１は、Ｍ’である、Ｅ６２～Ｅ６４のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６６．Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である、Ｅ６５に記載の組成物。
Ｅ６７．ｌは、１、３、または５である、Ｅ６２～Ｅ６６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ６８．化合物は、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ６９．化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
Figure 2022136230000227
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７０．化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
Figure 2022136230000228
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７１．化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）のもの、
Figure 2022136230000229
Figure 2022136230000230
またはその塩もしくは立体異性体である、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７２．Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される、Ｅ６９～Ｅ７１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７３．化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
Figure 2022136230000231
またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、Ｅ６０またはＥ６１で定義される通りである、Ｅ６０またはＥ６１に記載の組成物。
Ｅ７４．Ｒ２は、Ｃ８アルキルである、Ｅ７３に記載の組成物。
Ｅ７５．Ｒ３は、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである、Ｅ７４に記載の組成物。
Ｅ７６．ｍは、５、７、または９である、Ｅ７３～Ｅ７５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７７．各Ｒ５は、Ｈである、Ｅ７３～Ｅ７６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ７８．各Ｒ６は、Ｈである、Ｅ７７に記載の組成物。
Ｅ７９．ナノ粒子組成物である、Ｅ６０～Ｅ７８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８０．送達剤は、リン脂質をさらに含む、Ｅ７９に記載の組成物。
Ｅ８１．リン脂質は、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、
Ｅ８２．１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６：０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８０に記載の組成物。
Ｅ８３．送達剤は、構造脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８１のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８４．構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８２に記載の組成物。
Ｅ８５．送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８３のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８６．ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、Ｅ８４に記載の組成物。
Ｅ８７．送達剤は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン性脂質をさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８５のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８８．送達剤は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、Ｅ６０～Ｅ８６のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ８９．組成物は、インビボ送達用に製剤化される、Ｅ６０～Ｅ８７のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ９０．筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される、Ｅ６０～Ｅ８８のいずれか１つに記載の組成物。
Ｅ９１．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
Ｅ９２．宿主細胞は、真核細胞である、Ｅ９０に記載の宿主細胞。
Ｅ９３．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ９４．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを酵素的にまたは化学的に合成することを含む、ポリヌクレオチドの作製方法。
Ｅ９５．Ｅ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０またはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のもしくはＥ９３に記載の方法によって生産されるベクター。
Ｅ９６．対象に有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０またはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを投与することを含む、必要のある対象における活性ＧＬＡポリペプチドのインビボでの発現方法。
Ｅ９７．必要のある対象におけるファブリー病の治療方法または予防方法であって、対象に治療上有効量のＥ１～Ｅ５４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０またはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを投与することを含み、投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を緩和する、方法。
Ｅ９８．必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の予防方法またはその発症の遅延方法であって、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に予防上有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０またはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを投与することを含み、投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を予防するかまたはその発症を遅延させる、方法。
Ｅ９９．必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の寛解方法であって、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に治療上有効量のＥ１～Ｅ５３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、Ｅ５６～Ｅ８９のいずれか１つに記載の組成物、Ｅ９０またはＥ９１に記載の宿主細胞、またはＥ９２に記載のベクターを投与することを含み、投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を寛解させる、方法。
３１．均等物及び範囲
当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそれを確認することができよう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
特許請求の範囲において、「ａ」「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、それとは反対の指示があるか、または文脈により別途明白でない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「ｏｒ」を含む、特許請求の範囲または説明は、それとは反対の指示があるか、または文脈により別途明白でない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、それにおいて用いられる、あるいはそれと関連性がある場合に、満たされると見なされる。本発明は、群のうちの厳密に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、それにおいて用いられる、あるいはそれと関連性がある、実施形態を含む。本発明は、群の成員のうちの１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、それにおいて用いられる、あるいはそれと関連性がある、実施形態を含む。
また、「を含む」という用語が範囲を制限せず、追加の要素または工程の包含を許容するが、それを必要とはしないことにも留意されたい。「を含む」という用語が本明細書で使用されるとき、「からなる」という用語もそれ故に包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指定されるか、または文脈もしくは当業者の理解により別途明白でない限り、範囲として表される値は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態において述べられる範囲内の任意の具体的な範囲または部分範囲を、その範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得ることを理解されたい。
さらに、先行技術の範囲内に該当する本発明の特定の実施形態が、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。かかる実施形態は、当業者に既知であるとされるため、それらは、除外について本明細書に明示的に記載されていないとしても除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質、任意の生産方法、任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、何らかの理由で、任意の１つ以上の請求項から除外され得る。
全ての引用される出典、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び本明細書に引用される技術は、引用において明示的に述べられていないとしても、参照により本明細書に組み込まれる。引用される出典と本明細書とで矛盾する記述があった場合、本明細書の記述が優先されよう。
節及び表見出しは、限定的であることを意図しない。
実施例１：キメラポリヌクレオチド合成
Ａ．トリホスフェート経路
キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分は、トリホスフェートの化学的性質を使用して結合され得るか、またはライゲーションされ得る。この方法に従って、第１の領域または１００個以下のヌクレオチドは、５’モノホスフェート及び末端３’ｄｅｓＯＨまたはブロックＯＨで化学合成され得る。領域が８０個のヌクレオチドよりも長い場合、それはライゲーションのために２つの鎖として合成され得る。
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、３’末端のその後のキャッピングとの５’モノホスフェートの変換がその後に続き得る。モノホスフェート保護基は、当該技術分野で既知のもののうちのいずれかから選択され得る。
キメラポリヌクレオチド第２の領域または部分は、化学合成またはＩＶＴ法のいずれかを使用して合成され得る。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップと共にプライマーを利用するＲＮＡポリメラーゼを含み得る。代替的には、最大８０個のヌクレオチドのキャップは、化学合成され得、ＩＶＴ領域または部分に連結され得る。
ライゲーション方法について、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼとのライゲーション、続いてＤＮＡ分解酵素での処理は、連鎖を容易に回避するはずであることに留意されたい。
全体的なキメラポリヌクレオチドは、リン酸－糖骨格で作製されていない必要がある。領域または部分のうちの１つがポリペプチドをコードする場合、かかる領域または部分は、ホスフェート－糖骨格を含み得る。
次いで、ライゲーションは、任意の既知のクリック化学、オルトクリック化学、ソルリンク、または当業者に既知の他の生体共役反応化学を使用して行われ得る。
Ｂ．合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連のセグメントの開始を使用して作製され得る。かかるセグメントは、以下を含む。
（ａ）正常な３’ＯＨを含むキャップ及び保護５’セグメント（セグメント１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得、正常な３’ＯＨを含む５’トリホスフェート酸セグメント（セグメント２）
（ｃ）コルジセピンを含むか、または３’ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３’末端の５’モノホスフェートセグメント（例えば、尾部）（セグメント３）
合成（化学またはＩＶＴ）後、セグメント３（セグメント３）は、コルジセピン、次いで、ピロホスファターゼで処理され、５’モノホスフェートを作製し得る。
次いで、セグメント２（セグメント２）はＲＮＡリガーゼを使用してセグメント３にライゲーションされ得る。次いで、ライゲーションされたポリヌクレオチドは、ピロホスファターゼで精製及び処理され、ジホスフェートを切断する。次いで、処理されたセグメント２～セグメント３の構築物は、精製され、セグメント１は、５’末端にライゲーションされる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製工程が行われ得る。
キメラポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする場合、ライゲーションまたは結合されたセグメントは、５’ＵＴＲ（セグメント１）、オープンリーディングフレーム、またはＯＲＦ（セグメント２）及び３’ＵＴＲ＋ＰｏｌｙＡ（セグメント３）として表され得る。
各工程の収率は、９０～９５％と同程度であり得る。
実施例２：ｃＤＮＡ産生のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの製剤のＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）の２倍のＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行われ得る。このシステムは、２倍のＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、テンプレートｃＤＮＡ－１００ｎｇ、及び２５．０μｌに希釈されたｄＨ２０を含む。ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分間、及び９８℃で２０秒間の２５サイクル、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃で終了までであり得る。
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡにおいてポリ－Ａ１２０のポリ－Ｔ１２０を組み込み得る。より長いまたはより短いポリ（Ｔ）トラクトを有する他のリバースプライマーは、ポリヌクレオチドｍＲＮＡ中のポリ（Ａ）テールの長さを調節するために使用され得る。
反応は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の指示（最大５μｇ）通りに使用して浄化され得る。より大きな反応は、より大きな容量を有する製品を使用する浄化を必要とするであろう。浄化の後に続いて、ｃＤＮＡは、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用して定量化され、アガロースゲル電気泳動法によって分析され、ｃＤＮＡが予期されたサイズであることを確認する。次いで、ｃＤＮＡは、インビトロ転写反応の進行の前に、配列分析のために提出され得る。
実施例３：インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応は、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成し得る。かかる均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。インプットヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）混合物は、天然及び非天然ＮＴＰを使用して作製され得る。
典型的なインビトロ転写反応は、以下を含む。
１ テンプレートｃＤＮＡ－１．０μｇ
２ １０倍転写緩衝剤（４００ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）－２．０μｌ
３ カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）－７．２μｌ
４ ＲＮａｓｅ阻害剤－２０Ｕ
５ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ－３０００Ｕ
６ ｄＨ２０－最大２０．０μｌ及び
７ ３７℃で３時間～５時間インキュベート
処理されていないＩＶＴ混合物は、翌日の浄化のために４℃で一晩保管され得る。次いで、１ＵのＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅは、元のテンプレートを消化するために使用され得る。３７℃でのインキュベートした１５分後、ｍＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造者の指示に従って使用して精製され得る。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。浄化の後に続いて、ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して定量化され得、アガロースゲル電気泳動法によって分析され、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。
実施例４：酵素キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングは、ＩＶＴ ＲＮＡ ６０μｇ～１８０μｇ及びｄＨ２０最大７２μｌを含む混合物で行われ得る。混合物は、６５℃で５分間インキュベートされ、ＲＮＡを変性させ得、次いで、氷に直ちに移される。
次いで、プロトコルは、１０倍のキャッピング緩衝剤（０．５Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭのＳ－アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２０（最大２８μｌ）の混合、及び６０μｇのＲＮＡを３７℃で３０分間または１８０μｇのＲＮＡを最大２時間インキュベートすることを含む。
次いで、ポリヌクレオチドは、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の指示に従って使用して精製され得る。浄化の後に続いて、ＲＮＡは、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して定量化され得、アガロースゲル電気泳動法によって分析され、ＲＮＡが適切なサイズであり、ＲＮＡの分解が生じていないことを確認する。ＲＮＡ産生物はまた、逆転写ＰＣＲを行うことによって配列され、配列のためのｃＤＮＡを生成し得る。
実施例５：ポリＡテール反応
ｃＤＮＡ中のポリ－Ｔなしで、ポリ－Ａテール反応は、最終生成物を浄化する前に行われなければならない。これは、キャッピングされたＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）、１０倍のテール緩衝剤（０．５Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリ－Ａポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２０最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行われ得る。ポリ－Ａテールが既に転写中である場合、次いで、テール反応は、省略され得、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（最大５００μｇ）での浄化に直接進行する。ポリ－Ａポリメラーゼは、いくつかの場合において、酵母で発現される組換え酵素である。
ポリＡテール反応の処理能力または完全性は、正確なサイズのポリＡテールを常にもたらすわけではないことを理解されたい。それ故に、おおよそ４０～２００個のヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０～１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、または１６５個のポリＡテールは、本発明の範囲内である。
実施例６：天然５’キャップ及び５’キャップ類似体
ポリヌクレオチドの５’－キャッピングは、以下の化学ＲＮＡキャップ類似体を使用してインビトロ－転写反応の間に同時に完了され、製造者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成し得る：３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾されたＲＮＡの５’－キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して転写後に完了され、「キャップ０」構造を生成し得る：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１の構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼの両方を使用して生成され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成し得る。キャップ２の構造は、キャップ１の構造から生成され得、その後に２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’－最後から３番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化が続く。キャップ３の構造は、キャップ２の構造から生成され得、その後に２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して５’－最後から４番目のヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル化が続く。酵素は、組換え源に由来し得る。
哺乳類細胞にトランスフェクションされる際、修飾されたｍＲＮＡは、１２～１８時間または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間超の安定性を有し得る。
実施例７：キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのうちのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞にトランスフェクションされ得る。トランスフェクション後の６、１２、２４、及び３６時間後、培地に分泌されたタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。より高いレベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳応答性のキャップ構造を有する合成ポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｂ．純度分析合成
本明細書で教示されるキャップのうちのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース－尿素ゲル電気泳動法またはＨＰＬＣ分析を使用して純度について比較され得る。単一の、電気泳動法によって固定されたバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたはストリーキングバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、より高い純度の生成物に対応する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ポリヌクレオチドはまた、より高い純度の生成物に対応するであろう。より高い効率性を有するキャッピング反応は、より純粋なポリヌクレオチド集団を提供するであろう。
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのうちのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクションされ得る。トランスフェクション後の６、１２、２４、及び３６時間後、培地に分泌されたＴＮＦ－α及びＩＦＮ－β等の炎症誘発性サイトカインの量は、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。より高いレベルの炎症誘発性サイトカインの培地への分泌をもたらすポリヌクレオチドは、免疫－活性化キャップ構造を含むポリヌクレオチドに対応するであろう。
Ｄ．キャッピング反応効率性
本明細書で教示されるキャップのうちのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理の後に、ＬＣ－ＭＳによってキャッピング反応効率性について分析され得る。キャッピングされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理は、遊離ヌクレオチドとＬＣ－ＭＳによって検出可能なキャッピングされた５’－５－トリホスフェートキャップ構造との混合物を産出するであろう。ＬＣ－ＭＳスペクトル上でキャッピングされた生成物の量は、反応から全ポリヌクレオチドのパーセントとして表され得、キャッピング反応効率性に対応する。より高いキャッピング反応効率性を有するキャップ構造は、ＬＣ－ＭＳによってキャッピングされた生成物のより高い量を有するであろう。
実施例８：修飾されたＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動法
個々のポリヌクレオチド（２０μｌ容積中に２００～４００ｎｇ）または逆転写ＰＣＲ生成物（２００～４００ｎｇ）は、非変性の１．２％アガロースＥ－ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でウエルに投入され、製造者のプロトコルに従って１２～１５分間実行され得る。
実施例９：Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡ定量化及びＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝剤（１μｌ）中の修飾されたポリヌクレオチドは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＵＶ吸光度読取りのために使用され、化学合成またはインビトロ転写反応から各ポリヌクレオチドの収率を定量化し得る。
実施例１０：脂質様物質を使用した修飾されたｍＲＮＡの製剤化
ポリヌクレオチドは、細胞への添加の前に、所定の比率でポリヌクレオチドを脂質様物質と混合することによってインビトロ試験のために調製化され得る。インビボでの製剤化は、身体全体を通しての循環を容易にするために、余分な成分の添加を必要とする。インビボでの作業に好適な粒子を形成するためのこれらの脂質様物質の能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ－脂質様物質製剤に使用される標準的な製剤プロセスは、開始点として使用され得る。粒子の形成後、ポリヌクレオチドは、添加され、複合体と融合することを可能にし得る。カプセル封入効率は、標準的な色素排除アッセイを使用して測定され得る。
実施例１１：タンパク質発現のスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体試料は、調製され、１、２、３、または４つの質量分析器を使用して、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）について製造者のプロトコルに従って分析され得る。生体試料はまた、タンデムＥＳＩ質量分析システムを使用して分析され得る。
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、特定のタンパク質の既知の対照と比較され得、同一性は比較によって決定され得る。
Ｂ．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化
対象に投与される１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体試料は、調製され、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）について製造者のプロトコルに従って分析され得る。
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、特定のタンパク質の既知の対照と比較され得、同一性は比較によって決定され得る。
Ｃ．液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析
１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る、生体試料は、トリプシン酵素で処理され、中に含まれるタンパク質を消化し得る。結果として得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー－質量分析－質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析され得る。ペプチドは、質量分析器中で断片化され、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列のデータベースに適合され得る診断パターンを産出する。消化された試料は、希釈され、特定のタンパク質のための１ｎｇ以下の開始物質を達成し得る。単純な緩衝剤バックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含む生体試料は、直接溶液内消化に適しており、より複雑なバックグラウンド（例えば、洗剤、非揮発性塩、グリセロール）は、追加の洗浄工程を必要とし、試料分析を容易にする。
タンパク質断片、またはタンパク質全体のパターンは、特定のタンパク質の既知の対照と比較され得、同一性は比較によって決定され得る。
実施例１２：ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの合成
ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ポリヌクレオチド、例えば、配列番号１は、実施例１～１１に記載されているように合成され、特徴付けられる。ヒトＧＬＡをコードするｍＲＮＡは、以下に記載される実施例のために調製され、実施例１～１１に記載されているように合成され、特徴付けられる。
ヒトＧＬＡをコードするｍＲＮＡは、例えば、配列番号２に提供されるＯＲＦ配列を使用することによって構築される。ｍＲＮＡ配列は、５’及び３’両方のＵＴＲ領域を含む（例えば、配列番号３３、５０、７５、及び８１を参照されたい）。構築物において、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、以下である。
５’ＵＴＲ
Figure 2022136230000232
５’ＵＴＲ
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３３）；及び
３’ＵＴＲ
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号７５）
または
３’ＵＴＲ
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８１）
ＧＬＡ ｍＲＮＡ配列は、修飾されたｍＲＮＡとして調製された。具体的には、インビトロでの翻訳中、修飾されたｍＲＮＡは、５－メトキシ－ＵＴＰを使用して生成され、ｍＲＮＡがウリジンの代わりに１００％の５－メトキシ－ウリジンを含むことを確実にし得る。さらに、ＧＬＡ ｍＲＮＡは、ポリＡ－テールを導入するプライマーで合成され得、キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチル－トランスフェラーゼを使用して、ｍＲＮＡの両方で生成され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成する。
ＧＬＡをコードする例となるｍＲＮＡは、以下の表６に列挙される。表６の修飾されたｍＲＮＡ構築物は、ヒトＧＬＡをコードする最適化ＯＲＦを含む。構築物１～２３の各々は、キャップ１の５’末端キャップ及び３’末端ポリＡ領域を含む。
Figure 2022136230000233
Figure 2022136230000234
実施例１３：インビトロでの内因性ＧＬＡ発現の検出
ＧＬＡ発現は、マウス及びヒトの源の両方に由来する様々な細胞株において特徴付けられる。細胞は、標準的な条件で培養され、細胞抽出物は、細胞を溶解緩衝剤中に置くことによって得られる。比較の目的のために、適切な対照もまた調製される。ＧＬＡ発現を分析するために、ライセート試料は、試験された細胞から調製され、リチウムドデシルサルフェート試料のローディングバッファーと混合され、標準的なウエスタンブロット分析にかけられる。ＧＬＡの検出のために、使用される抗体は、商業用の抗－ＧＬＡ抗体である。負荷制御の検出のために、使用される抗体は、抗－シトラーゼシンターゼ（ウサギポリクローナル；ＰＡ５－２２１２６；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））である。内因性ＧＬＡの局在化を試験するために、免疫蛍光分析は、細胞上で行われる。ＧＬＡ発現は、商業用の抗－ＧＬＡを使用して検出される。特定の細胞小器官の位置は、既存の商業用製品で検出され得る。例えば、ミトコンドリアは、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒを使用して検出され得、核はＤＡＰＩで染色され得る。画像分析は、Ｚｅｉｓｓ ＥＬＹＲＡ画像システム上で行われる。
内因性ＧＬＡ発現は、ベースラインとして使用され、ＧＬＡをコードする核酸を含むｍＲＮＡとのトランスフェクションからもたらされるＧＬＡ発現の変化を決定し得る。
実施例１４：ＨｅＬａ細胞中のＧＬＡのインビトロでの発現
ＨｅＬａ細胞中のＧＬＡのインビトロでの発現を測定するために、これらの細胞は、トランスフェクションの１日前に、１２ウエルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）上に播種される。ヒトＧＬＡまたはＧＦＰ制御を含むｍＲＮＡ製剤は、ウエル当たり６０μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ中で８００ｎｇのｍＲＮＡ及び２μＬのリポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクションされ、インキュベートされる。
２４時間後、各ウエル内の細胞は、溶解緩衝剤の一貫した量を使用して溶解される。適切な対照が使用される。各々のタンパク質濃度は、製造者の指示に従ってＢＣＡアッセイを使用して測定される。ＧＬＡ発現を分析するために、各ライセート（２４μｇ）の等しい負荷は、ローディングバッファー中で調製され、標準的なウエスタンブロット分析にかけられる。ＧＬＡの検出のために、商業用の抗－ＧＬＡ抗体は、製造者の指示に従って使用される。
実施例１５：ＨｅＬａ細胞におけるインビトロでのＧＬＡ活性
インビトロでのＧＬＡ活性アッセイは、ＧＬＡ配列を含むｍＲＮＡの導入後に外因的に発現されるＧＬＡが活性であるかどうかを決定するために行われる。
Ａ．発現アッセイ
ＨｅＬａ細胞は、ヒトＧＬＡまたはＧＦＰ制御を含むｍＲＮＡ製剤でトランスフェクションされる。細胞は、リポフェクタミン２０００でトランスフェクションされ、上記の実施例１４に記載されるように溶解される。適切な対照もまた調製される。
Ｂ．活性アッセイ
外因性ＧＬＡが機能し得るかどうかを評価するために、インビトロでの活性アッセイは、酵素活性の源として、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞ライセートを使用して行われる。ＧＬＡ活性は、細胞ライセート試料を、プレートに基づくアッセイにおいてｐＨ４．６で２ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵ－α－Ｇａｌ）、及びα－ガラクトシダーゼＢの５０ｍＭのＮ－アセチルガラクトサミン阻害剤と混合することによって測定された。アッセイ混合物は、３７℃で３０分間インキュベートされた。反応物は、０．５Ｍのエチレン－ジアミン（ｐＨ＝１０．４）の等しい容量の添加によって終了した。４－ＭＵ生成は、３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長を有する蛍光プレート読取り器を使用して測定された。
実施例１６：細胞にけるＧＬＡのインビトロでの発現測定
正常な対象及びファブリー病患者の細胞は、外因性ＧＬＡを発現するそれらの容量について試験される。細胞は、標準的なプロトコルを使用してエレクトロポレーションを介してヒトＧＬＡ、マウスＧＬＡ、またはＧＦＰ制御を含むｍＲＮＡ製剤でトランスフェクションされる。各構築物は、別々に試験される。インキュベートの後、細胞は溶解され、各ライセートのタンパク質濃度は、好適なアッセイを使用して、例えば、ＢＣＡアッセイによって測定される。ＧＬＡ発現を分析するために、各ライセートの等しい負荷は、ローディングバッファー中で調製され、標準的なウエスタンブロット分析にかけられる。ＧＬＡの検出のために、抗－ＧＬＡが使用される。負荷制御の検出のために、使用される抗体は、抗－シトラーゼシンターゼ（ウサギポリクローナル；ＭＡ５－１７６２５；Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標））である。
実施例１７：ライセートにおけるインビトロでのＧＬＡ活性測定
Ａ．発現
正常なヒト対象及びファブリー病患者の細胞が培養される。細胞は、標準的なプロトコルを使用してエレクトロポレーションを介してヒトＧＬＡ、マウスＧＬＡ、またはＧＦＰ制御を含むｍＲＮＡ製剤でトランスフェクションされる。
Ｂ．活性アッセイ
外因性ＧＬＡが機能するかどうかを評価するために、インビトロでの活性アッセイは、酵素活性の源として、トランスフェクションされた細胞ライセートを使用して行われる。ＧＬＡ活性は、単離されたタンパク質試料を、プレートに基づくアッセイにおいてｐＨ４．６で２ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵ－α－Ｇａｌ）、及びα－ガラクトシダーゼＢの５０ｍＭのＮ－アセチルガラクトサミン阻害剤と混合することによって測定された。アッセイ混合物は、３７℃で３０分間インキュベートされた。反応物は、０．５Ｍのエチレン－ジアミン（ｐＨ＝１０．４）の等しい容量の添加によって終了した。４－ＭＵ生成は、３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長を有する蛍光プレート読取り器を使用して測定された。
実施例１８：動物モデルにおけるインビボでのＧＬＡ発現
インビボでのＧＬＡ発現を容易にするＧＬＡ含有ｍＲＮＡの能力を評価するために、ヒトＧＬＡをコードするｍＲＮＡは、Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスに導入される。Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスは、対照のｍＲＮＡ（ＮＴ－ＦＩＸ）またはヒトＧＬＡ ｍＲＮＡのいずれかを静脈内注射される。ｍＲＮＡは、マウスへの送達のために脂質ナノ粒子中に製剤化される。マウスは、２４時間後に屠殺し、肝臓ライセートにおけるＧＬＡタンパク質レベルは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって測定される。クエン酸シンターゼ発現は、負荷制御としての使用のために試験される。対照ＮＴ－ＦＩＸ注射のために、４匹のマウスは、各時点で試験される。ヒトＧＬＡ ｍＲＮＡ注射のために、４匹のマウスは、各時点で試験される。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡでの処理は、ＧＬＡの発現を確実に誘発することが予期されている。
実施例１９：ヒトＧＬＡ変異体及びキメラ構築物
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＧＬＡをコードする連結されたヌクレオシド少なくとも第１の領域を含み得、それは、上記の実施例に従って構築され、発現され、特徴付けられ得る。同様に、ポリヌクレオチド配列は、増加または減少した活性を有するＧＬＡの発現をもたらす１つ以上の変異体を含み得る。さらに、ＧＬＡをコードするポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードする構築物の一部であり得る。
実施例２０：ナノ粒子組成物の生成
Ａ．ナノ粒子組成物の生成
ナノ粒子は、マイクロフルイディクス及び２つの流体の流れのＴ字路混合等の混合プロセスで作製され得、そのうちの一方は、ポリヌクレオチドを含み、他方は、脂質構成成分を有する。
脂質組成物は、エタノール中で約５０ｍＭの濃度で、化合物１８等の式（Ｉ）による脂質または化合物２３６等の式（ＩＩＩ）による脂質、リン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能なＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ等）、ＰＥＧ脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な、ＰＥＧ－ＤＭＧとしても既知の、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール、または化合物４２８等）、及び構造脂質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なコレステロールもしくはコルチコステロイド（プレドニゾロン、デキサメサゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン）、またはそれらの組み合わせ）を組み合わせることによって調製される。溶液は、保管のために、例えば、－２０℃で冷蔵されるべきである。脂質は、組み合わされて望ましいモル比を産出し、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終脂質濃度に水及びエタノールで希釈される。
ポリヌクレオチド及び脂質組成物を含むナノ粒子組成物は、脂質組成物対ポリヌクレオチドの重量：重量比率約５：１～約５０：１で、脂質溶液をポリヌクレオチドを含む溶液と組み合わせることによって調製される。脂質溶液は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体に基づくシステムを使用して、流量約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分でポリヌクレオチド溶液に注入され、水対エタノールの比率約１：１～約４：１の懸濁液を生成する。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物について、脱イオン水中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でのＲＮＡの溶液は、ｐＨ３～４の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤中で希釈され、原液を形成する。
ナノ粒子組成物は、透析によって処理され、エタノールを除去し、緩衝剤交換を達成し得る。製剤は、分画分子量１０ｋＤのＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ｐＨ７．４、一次生成物の２００倍の容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析される。最初の透析は、室温で３時間実施される。次いで、製剤は、４℃で一晩透析される。結果として得られるナノ粒子懸濁液は、０．２μｍの細菌濾過器（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してガラスのバイアルに濾過され、圧着閉鎖で密封される。０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が、一般に得られる。
上記に記載の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を含む。これらに限定されないが、Ｔ字路及び直接注射を含む代替のプロセスは、同じナノ沈殿を達成するために使用され得る。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特徴付け
ゼータサイザーナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）は、粒子サイズの決定においては１倍のＰＢＳ及びゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳで、ナノ粒子組成物の粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を測定するために使用され得る。
紫外可視分光法は、ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）の濃度を測定するために使用され得る。１倍のＰＢＳ中の１００μＬの希釈された製剤は、メタノール及びクロロホルムの９００μＬの４：１（ｖ／ｖ）混合物に添加される。混合後、溶液の吸光度スペクトルは、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）上で２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録される。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの濃度は、組成物中で使用されるポリヌクレオチドの吸光係数、及び例えば、２６０ｎｍの波長での吸光度と、例えば、３３０ｎｍの波長でのベースライン値との間の差に基づいて計算され得る。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物について、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、ナノ粒子組成物によるＲＮＡのカプセル封入を評価するために使用され得る。試料は、ＴＥ緩衝剤溶液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中でおおよそ５μｇ／ｍＬの濃度に希釈される。５０μＬの希釈された試料は、ポリスチレン９６ウエルプレートに移され、５０μＬのＴＥ緩衝剤または５０μＬの２％トリロンＸ－１００溶液のいずれかは、ウエルに添加される。プレートは、３７℃の温度で１５分間インキュベートされる。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬は、ＴＥ緩衝剤中で１：１００に希釈され、１００μＬのこの溶液は、各ウエルに添加される。蛍光強度は、蛍光プレート読取り器（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、例えば、約４８０ｎｍの励起波長及び例えば、約５２０ｎｍの発光波長で測定され得る。試薬ブランクの蛍光値は、試料の各々の値から引かれ、遊離ＲＮＡの百分率は、破壊された試料（トリトンＸ－１００の添加によって引き起こされる）の蛍光値により、無傷の試料（トリトンＸ－１００の添加なし）の蛍光強度を割ることによって測定される。
ナノ粒子組成物の例となる製剤は、以下の表７に表される。「化合物」という用語は、ＭＣ３、化合物１８、または化合物２３６等のイオン化可能な脂質を指す。「リン脂質」は、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥであり得る。「ＰＥＧ－脂質」は、ＰＥＧ－ＤＭＧまたは化合物４２８であり得る。
Figure 2022136230000235
Figure 2022136230000236
Figure 2022136230000237
実施例２１：ＧＬＡ ｍＲＮＡを注射された野生型マウスにおけるインビボでのＧＬＡ活性
Ａ．活性アッセイ
ＧＬＡ活性アッセイは、蛍光指示薬４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）を非蛍光４ＭＵ－α－Ｇａｌ基質から放出するＧＬＡ酵素活性の能力を測定する。アッセイは、野生型及びファブリーマウスの両方のバックグラウンドについて最適化された。マウスの血漿、腎臓、心臓、脾臓、及び肝臓について、４－ＭＵの標準曲線が、開発された。ＧＬＡ活性の１単位［Ｕ］は、１時間当たりに１ｎｍｏｌの基質を加水分解することができる量であると考えられた。このアッセイは、Ｄｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８１（２）：１５７－１７１（１９７３）、Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１６６７－１６８２（Ｊｕｌｙ １，１９９９）、及びＩｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１４－２５，２００１から適用された。
ＧＬＡ活性は、単離されたタンパク質試料を、プレートに基づくアッセイにおいてｐＨ４．６で２ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵ－α－Ｇａｌ）、及びα－ガラクトシダーゼＢの５０ｍＭのＮ－アセチルガラクトサミン阻害剤と混合することによって測定された。アッセイ混合物は、３７℃で３０分間インキュベートされた。反応は、０．５Ｍのエチレン－ジアミン（ｐＨ＝１０．４）の等しい容量の添加によって終了した。４－ＭＵ生成は、３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長を有する蛍光プレート読取り器を使用して測定された。
Ｂ．ＧＬＡをコードする配列最適化ｍＲＮＡの比較
ＧＬＡ活性をインビボで促進する配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ－コードｍＲＮＡの能力が試験された。野生型ＣＤ１マウス（群当たりＮ＝３）は、（ｉ）制御ｍＲＮＡ（ＮＴ－ＦＩＸ）、（ｉｉ）ヒトＧＬＡをコードする配列操作なしの野生型ｍＲＮＡ（ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号３）、（ｉｉｉ）ヒトＧＬＡをコードする配列最適化、化学修飾されたｍＲＮＡ（ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１～２及び４～２２）、または（ｉｖ）ＰＢＳ制御溶液を静脈内注射された。配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ ｍＲＮＡは、非翻訳領域においてｍｉｒ１４２／１２６結合部位を含んだ。ｍＲＮＡは、各マウスに送達への０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの送達のために、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）中で製剤化された。マウスは、２４時間後に屠殺され、マウスの肝臓は、採取された。
注射後２４時間の野生型マウスの肝臓におけるＧＬＡ活性は、以下の表８に示される。配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ ｍＲＮＡは、対照と比較して、マウスの肝臓における増加されたＧＬＡ活性を促進した。とりわけ、配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ ｍＲＮＡのうちの２つ（ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１及びＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２）は、内因性マウスのＧＬＡ活性よりもおおよそ１０倍高いＧＬＡ活性をもたらした。これらの２つのＧＬＡ ｍＲＮＡは、以下の実施例２２～２５に記載されるさらなる研究において使用された。
Figure 2022136230000238
Figure 2022136230000239
実施例２２：ＧＬＡ ｍＲＮＡの静脈内注射後の野生型マウスにおけるインビボでのＧＬＡタンパク質発現及び活性
野生型マウスの血漿及び組織におけるＧＬＡタンパク質発現及びＧＬＡ活性は、ヒトＧＬＡをコードする配列最適化、化学修飾されたｍＲＮＡ（ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２）、またはＧＦＰをコードする制御ｍＲＮＡが野生型ＣＤ１マウスに投与された後で、評価された。ＧＬＡ ｍＲＮＡは、ｍｉｒ１４２／１２６結合部位を含んだ。ｍＲＮＡは、送達のために脂質ナノ粒子（ＭＣ３）中で製剤化され、０．５ｍｇ／ｋｇ（群当たりＮ＝３）の単回用量として静脈内注射された。マウスは、投与の２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、または７日間後に屠殺された。屠殺後、マウスは、ＰＢＳで灌流され、組織は、収集された（肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓）。血漿もまた、マウスから収集された。試料は、以下に詳細にあるように分析された。
Ａ．ＧＬＡ免疫組織化学
ＧＬＡ ｍＲＮＡの注射後４８時間のマウスの肝臓におけるＧＬＡタンパク質発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析された。組織部分は、ライカ希釈剤中で１：４００に希釈された抗－ＧＬＡ抗体（アブカムウサギモノクローナルａｂ１６８３４１）で固定され、埋め込まれ、区分され、染色された。肝臓部分は、ヘマトキシリンで対比染色された。
図８及び９は、抗－ＧＬＡ抗体で染色された３匹の異なるマウスの代表的な組織試料を示す。図８は、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスの抗－ＧＬＡ染色された肝臓切片を示す。低い抗－ＧＬＡ染色レベルのみが、これらの組織切片で観察された。図９は、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスの抗－ＧＬＡ染色された肝臓切片を示す。高いＧＬＡ発現レベルが、ＧＬＡ ｍＲＮＡ処置された動物の肝臓の肝細胞及び洞様血管の両方において観察された。ＧＬＡ ｍＲＮＡ処置された動物において、均一な染色は、肝臓における広い分布、及びリソソームに輸送するＧＬＡを示した斑点発現を示した。
Ｂ．ＧＬＡ ｍＲＮＡの静脈内注射後の野生型マウスの血漿及び組織における経時的なＧＬＡタンパク質活性
対照ＧＦＰ ｍＲＮＡ及びＧＬＡ ｍＲＮＡを注射した野生型ＣＤ１マウスの血漿、肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓におけるＧＬＡタンパク質レベルは、上記の実施例２１に記載される４－ＭＵ蛍光発生ＧＬＡ活性アッセイを使用して分析された。
ベースラインとして、図１０Ａは、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿における経時的なＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ｂは、ＧＬＡ ｍＲＮＡで処置された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿におけるＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ａ及び１０Ｂの両方において、血漿ＧＬＡ活性の目盛りは右側のＹ軸に示され、組織ＧＬＡ活性の目盛りは左側のＹ軸に示される。図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、それぞれ、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び血漿における、ＧＬＡ ｍＲＮＡと比較してＧＦＰ ｍＲＮＡを投与された野生型マウスのＧＬＡ活性を示す。心臓（図１０Ｃ）、肝臓（図１０Ｄ）、及び腎臓（図１０Ｅ）、及び血漿（図１０Ｇ）のおおよその内因性マウスのＧＬＡ活性は、参照のために各図内で点線として示される。
これらの結果は、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡでの処置後、ＧＬＡ活性が、時間経過全体で各組織において低いベースラインの内因性レベルを維持したことを示す。ＧＬＡ ｍＲＮＡでの処置後、ＧＬＡ活性レベルの増加が、試験された全ての組織において処置の２４時間後に観察された。注射後２４時間で、肝臓、脾臓、及び血漿におけるＧＬＡ活性は、少なくとも８倍に増加し、心臓及び腎臓におけるＧＬＡ活性は、少なくとも２～３倍に増加した。血漿及び脾臓におけるＧＬＡ活性は、２４時間後に減少し始めた。ＧＬＡ活性は、処置後少なくとも１４４時間血漿中で高められた上記の内因性レベルを維持し、処置後少なくとも７２時間脾臓中で高められた上記の内因性レベルを維持した。心臓、腎臓、及び肝臓における増加されたＧＬＡ活性の上記の内因性レベルは、よりゆっくりと減少し、心臓及び肝臓における増加された活性は、ＧＬＡ ｍＲＮＡでの単回用量単回処置後少なくとも１週間持続された。
肝臓及び脾臓について公開されている酵素補充療法（ＥＲＴ）の結果と比較した場合、ＡＵＣは、より高くみられ、ｔ１／２は、ＧＬＡ ｍＲＮＡを投与された組織において、ＥＲＴ（Ｉｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１４－２５，２００１）と比較してより長くみえる。これらの結果はまた、酵素補充療法（ＥＲＴ）の報告と比較して、心臓及び腎臓においてより多くの取り込みを示す。
実施例２３：ＧＬＡ ｍＲＮＡの注射後のファブリーマウスにおけるＧＬＡ発現、活性、及びリゾ－Ｇｂ３レベル
ＧＬＡ－／－ノックアウトマウス（ＳＶ１２９／Ｃ５７Ｂ６系統、雄、生後２４～２６週間）は、ＧＬＡをコードする、配列最適化、化学修飾されたｍＲＮＡ（ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１）（群当たりＮ＝５）、またはＧＦＰをコードする制御ｍＲＮＡ（群当たりＮ＝３）を投与された。ＧＬＡ ｍＲＮＡは、送達のために脂質ナノ粒子（ＭＣ３）中で製剤化され、ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．０５ｍｇ／ｋｇで単回用量として静脈内注射された。３匹のマウスは、脂質ナノ粒子（ＭＣ３）中で製剤化されたＧＦＰをコードする制御ｍＲＮＡを投与され、ｍＲＮＡを０．５ｍｇ／ｋｇで単回用量として注射された。ＰＢＳ（ｍＲＮＡなし）中で脂質ナノ粒子（ＭＣ３）を投与された３匹の野生型マウス（ＣＤ１系統、雄、生後２４～２６週間）はまた、比較のために研究に含まれた。血液は、０．６時間、２４時間、及び７２時間で各マウスから収集された。７２時間後、マウスは屠殺され、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓は採取された。試料は、以下に詳細にあるように分析された。
Ａ．ＧＬＡノックアウトマウスの肝臓におけるｍＲＮＡ－媒介ＧＬＡ発現
静脈内投与後７２時間でのＧＬＡノックアウトマウスの肝臓におけるＧＬＡタンパク質レベルは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって分析された。図１１Ａは、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの投与の７２時間後の肝臓におけるＧＬＡ発現の投与－反応を示す。ＧＦＰ制御に対する有意なＧＬＡ発現は、投与されたＧＬＡ ｍＲＮＡの各濃度で観察され、ＧＬＡ発現の最も高いレベルは０．５ｍｇ／ｋｇ用量で観察された。ＧＬＡ発現は、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスの肝臓において観察されなかった。７２時間でのタンパク質発現の定量化は、図１１Ｂに図示される。０．５ｍｇ／ｋｇ用量での平均ＧＬＡ発現は、１５２．５ｎｇ／ｍｇであった。
Ｂ．ＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ ｍＲＮＡ投与－反応
血漿は、投与の０時間、６時間、２４時間、及び７２時間後に収集された血液試料から調製された。上記の実施例２１に記載される４－ＭＵ蛍光発生ＧＬＡ活性アッセイは、各血漿試料上で行われた。
図１２Ａは、制御ＧＦＰ ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中のＧＬＡ活性と比較した、ＧＬＡ ｍＲＮＡの各投与の経時的なＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ活性の対数グラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、それぞれ、処置後６時間、２４時間、及び７２時間での各投与の血漿中のＧＬＡ活性を示す。図１２Ｄにおいて、ＰＢＳ中の脂質ナノ粒子で処置された野生型マウスの７２時間のＧＬＡ活性データは、比較のために含まれる。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスは、各時点で用量依存的様式で増加されたＧＬＡ活性を示した。ＧＬＡ ｍＲＮＡの各投与の最も高いＧＬＡ活性レベルは、処置の６時間後に観察され、対照と比較して増加されたＧＬＡ活性は、処置の７２時間後にさらに観察された。
ＥＬＩＳＡアッセイは、投与の６時間後、血漿中でＧＬＡ発現を定量化するために行われた。図１３は、ＧＬＡタンパク質が制御ＧＦＰマウスの血漿中で検出されなかった一方で、有意なレベルのＧＬＡタンパク質が、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中で検出されたことを示す。
Ｃ．ＧＬＡノックアウトマウスの組織中のＧＬＡ ｍＲＮＡ投与－反応
ＧＬＡ活性は、ＧＬＡ ｍＲＮＡの投与の７２時間後のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織について測定された。図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、及び１４Ｄは、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓におけるＧＬＡ活性レベルを示す。各組織において、ＧＬＡ活性は、用量依存的様式でＧＬＡ ｍＲＮＡ処置されたマウスについて高められた。ＰＢＳ中の脂質ナノ粒子で処置された制御ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び野生型マウスのＧＬＡ活性データは、比較のために含まれる。ＧＬＡをコードする０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡでの処置後７２時間で、全組織中のＧＬＡ活性レベルは、対照と比較して増加された。図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、同じ組織特異型ＧＬＡ活性を示すが、ＰＢＳを注射された野生型マウスにおけるＧＬＡ活性に対する百分率として示す。図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ投与での肝臓、血漿、及び心臓における超生理的（＞１００％）ＧＬＡ活性、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ投与での腎臓におけるＧＬＡ活性の少なくとも５０％回復を示す。
Ｄ．ＧＬＡ ｍＲＮＡの静脈内注射後のファブリーマウスにおけるリゾ－Ｇｂ３レベル
ＧＬＡをコードするｍＲＮＡが、内因性ＧＬＡの欠乏を修正し、ファブリー病の症状と戦うことができるかどうかを判定するために、リゾ－Ｇｂ３は、ＧＬＡ ｍＲＮＡの投与後、ＧＬＡノックアウトマウスにおいて測定された。
リゾ－Ｇｂ３のレベルは、ＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスならびに対照の血漿及び組織試料において測定された。図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇの制御ＧＦＰ ｍＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡ、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ ｍＲＮＡの投与の７２時間後の、それぞれ、血漿、腎臓、及び心臓におけるリゾ－Ｇｂ３レベルを示す。図１６Ａは、同じマウスのｍＲＮＡ投与（パターンバー）の７２時間後のリゾ－Ｇｂ３レベルと比較した、出血前の血漿中リゾ－Ｇｂ３レベル（黒抜きバー）を示す。これらの結果は、ＧＬＡ ｍＲＮＡの単回用量の投与の７２時間後の、血漿中のリゾ－Ｇｂ３レベルの用量依存的減少を示す。図１６Ｂ及び１６Ｃは、異なるＧＬＡ ｍＲＮＡ用量で、それぞれ、腎臓及び心臓における投与後７２時間でのリゾ－Ｇｂ３レベルを示す。リゾ－Ｇｂ３レベルは、ＧＬＡ ｍＲＮＡの単回用量の投与の７２時間後、腎臓及び心臓において用量依存的様式で減少した。
図１６Ｄ及び１６Ｅは、未処置のノックアウトマウスの血漿、心臓、及び腎臓におけるリゾ－Ｇｂ３レベル対するパーセントとしての、リゾ－Ｇｂ３レベルの用量依存的低減を示す。百分率データを得るために、各投与された群のリゾ－Ｇｂ３レベルは、出血前のレベル（血漿の）またはＧＦＰ対照群のレベル（心臓及び腎臓の）に正規化された。図１６Ｄは、図形式でのパーセント低減リゾ－Ｇｂ３データを示すが、図１６Ｅは、表形式でのパーセント低減リゾ－Ｇｂ３データを示す。ＧＬＡ ｍＲＮＡ０．５ｍｇ／ｋｇ用量で、リゾ－Ｇｂ３は、血漿中７０％超低減され、心臓及び腎臓においては約５０％低減された。
図１６Ｆ及び１６Ｇは、それぞれ、血漿及び肝臓におけるＧＬＡ発現レベルの測定値に対するＧＬＡ活性の図を示す。両方の場合において、高い程度の相関関係がある（決定係数＞０．９）。これらの結果は、増加されたＧＬＡ発現が、ＧＬＡノックアウトマウスの血液及び組織の両方における増加されたＧＬＡ活性と相関することを示す。図１６Ｈは、ＧＬＡノックアウトマウスにおけるリゾ－Ｇｂ３のレベルに対するＧＬＡ活性の図を示す。この図は、ＧＬＡ ｍＲＮＡの単回用量を投与されたＧＬＡノックアウトマウスにおける、増加されたＧＬＡ活性が、インビボでのファブリー病のバイオマーカーの減少されたレベルと相関することを示す。
実施例２４：ＧＬＡ ｍＲＮＡの静脈内注射後のファブリーマウスにおけるインビボでのＧＬＡタンパク質活性
ＧＬＡ－／－ノックアウトマウス（ＳＶ１２９／Ｃ５７Ｂ６系統、雄、生後２２～２５週間）は、ＧＬＡ、具体的にはＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１またはＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３をコードする、配列最適化、化学修飾されたｍＲＮＡを投与された。ＧＬＡ ｍＲＮＡは、送達のために脂質ナノ粒子（化合物１８）中で製剤化され、０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ（試験されるｍＲＮＡ当たりＮ＝３）の単回用量として静脈内注射された。
血液は、投与の直前、ならびに投与の３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、及び４２日後に各マウスから収集された。ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１を注射されたマウスは、投与の２８日後に屠殺されたが、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３を注射されたマウスは、投与の４２日後に屠殺された。屠殺の際、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓が各マウスから採取された。
リゾ－Ｇｂ３のレベルは、ＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウス、ならびに対照の血漿試料で測定された。図１７Ａ及び１７Ｂは、未処置のノックアウトマウスの血漿中のリゾ－Ｇｂ３レベルに対するパーセントとしての経時的なリゾ－Ｇｂ３レベルの低減を示す。百分率データを得るために、各投与された群のリゾ－Ｇｂ３レベルは、出血前の血漿レベルに正規化された。図１７Ａは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示すが、図１７Ｂは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示す。両方の場合において、リゾ－Ｇｂ３は、処置後３日間までに血漿中で８０～９０％低減された。リゾ－Ｇｂ３レベルは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１については、４週間の時間経過全体で初期測定値より７０％低いレベル（図１７Ａを参照されたい）、及びＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３については、６週間の時間経過全体で初期測定値より７０％低いレベルを維持した（図１７Ｂを参照されたい）。
図１７Ｃは、ｍＲＮＡを投与することの効果を試験する実験の結果を、酵素補充療法（ＥＲＴ）を投与することの効果を試験する以前に報告された実験と比較する。Ｉａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１４－２５（２００１）に報告されているように、ＥＲＴ療法は、推奨臨床用量の３倍超である量の、単回３ｍｇ／ｋｇ用量として、ＧＬＡ－／－ノックアウトマウスに静脈内注射された（時点当たりＮ＝３）。ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３はまた、この以前に報告されたデータとの比較のために試験された（Ｎ＝３）。ＧＬＡ ｍＲＮＡは、送達のために脂質ナノ粒子（化合物１８）中で製剤化され、０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ（試験されるｍＲＮＡ当たりＮ＝３）の単回用量として静脈内注射された。血液は、投与の直前、ならびに投与の３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、及び４２日後に各ｍＲＮＡ注射されたマウスから収集された。血液は、注射の直前、ならびに投与の３日、７日、１１日、１４日、１８日、及び２１日後にＥＲＴを受ける各マウスから収集された。ＥＲＴを受けるマウスの群は、投与の１、２、３、及び４週間後に屠殺された。屠殺の際、心臓、肝臓、及び脾臓が各マウスから採取された。Ｇｂ３レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＥＲＴ処置されたマウスへの）またはＬＣＭＳＭＳ（ｍＲＮＡ処置されたマウスへの）を使用して、各血漿または組織試料中で測定された。図１７Ｃは、ＥＲＴ及びｍＲＮＡ療法の両方が、Ｇｂ３レベルをベースラインレベルのおおよそ２０％に低減したことを示す。図１７Ｃは、処置の２～３週間後のＥＲＴ処置されたマウスにおける血漿Ｇｂ３のレベルの反跳を示す。対照的に、図１７Ｃは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３で処置されたマウスにおけるＧｂ３血漿レベルが、処置後少なくとも６週間おおよそ２０％のベースラインレベルを維持したことを示す。
リゾ－Ｇｂ３のレベルはまた、ＧＬＡ ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウス、ならびに対照の心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓試料において測定された。図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、投与の４週間及び６週間後のリゾ－Ｇｂ３レベルの低減を示す。リゾ－Ｇｂ３レベルは、未処置のノックアウトマウスの組織中のリゾ－Ｇｂ３レベルに対するパーセントとして表される。百分率データを得るために、各投与された群のリゾ－Ｇｂ３レベルは、未処理の組織レベルに正規化された。図１８Ａは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号１の単回用量での処置の４週間後のマウスの組織中のパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示す。図１８Ａは、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の３０～４０％のみを有し、処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の１０～２０％のみを有したことを示す。図１８Ｂは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３の単回用量での処置の６週間後のマウスの組織中のパーセント低減リゾ－Ｇｂ３を示す。図１８Ｂは、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３の４０～４５％のみを有し、処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ－Ｇｂ３のおおよそ２０％を有したことを示す。
実施例２５：ＧＬＡ ｍＲＮＡを注射された非ヒト霊長類におけるインビボでのＧＬＡ活性
Ａ．活性アッセイ
ＧＬＡ活性アッセイは、蛍光指示薬４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）を非蛍光４ＭＵ－α－Ｇａｌ基質から放出するＧＬＡ酵素活性の能力を測定する。アッセイは、野生型及びファブリーマウスの両方のバックグラウンドについて最適化された。カニクイザルの血漿について４－ＭＵの標準曲線が、開発された。ＧＬＡ活性の１単位［Ｕ］は、１時間当たりに１ｎｍｏｌの基質を加水分解することができる量であると考えられた。このアッセイは、Ｄｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８１（２）：１５７－１７１（１９７３）、Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１６６７－１６８２（Ｊｕｌｙ １，１９９９）、及びＩｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１４－２５，２００１から適用された。
ＧＬＡ活性は、単離されたタンパク質試料を、プレートに基づくアッセイにおいてｐＨ４．６で２ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（４ＭＵ－α－Ｇａｌ）、及びα－ガラクトシダーゼＢの５０ｍＭのＮ－アセチルガラクトサミン阻害剤と混合することによって測定された。アッセイ混合物は、３７℃で３０分間インキュベートされた。反応は、０．５Ｍのエチレン－ジアミン（ｐＨ＝１０．４）の等しい容量の添加によって終了した。４－ＭＵ生成は、３６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長を有する蛍光プレート読取り器を使用して測定された。
Ａ．ＧＬＡ ｍＲＮＡの静脈内注射後のカニクイザルの血漿中の経時的なＧＬＡタンパク質活性
ＧＬＡ活性をインビボで促進する配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ－コードｍＲＮＡの能力が試験された。カニクイザル（群当たりＮ＝４）は、（ｉ）脂質ナノ粒子中で製剤化された０．２ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３（化合物１８）、（ｉｉ）脂質ナノ粒子中で製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３（化合物１８）、または（ｉｉｉ）脂質ナノ粒子中で製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３（化合物１８及び化合物４２８）を静脈内注射された。
血液は、注射の直前、ならびに投与の１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、及び１６８時間後に各サルから収集された。各血漿試料中のＧＬＡタンパク質活性レベルは、上記のＡ部に記載される４－ＭＵ蛍光発生ＧＬＡ活性アッセイを使用して分析された。図１９は、各処置群において未処置のサル及びＧＬＡ－ｍＲＮＡで処置されたサルの血漿中のＧＬＡ活性レベルを示す。図１９中の点線は、野生型カニクイザルにおける平均ＧＬＡ活性レベルを示す（９．１１Ｕ／ｍＬ；Ｎ＝１５）。図１９は、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの処置の約６～１２時間後にピークに達したＧＬＡ活性を示す。
Ｂ．ＧＬＡ ｍＲＮＡの複数回投与後のカニクイザルの血漿中のＧＬＡタンパク質活性
複数回投与後、インビボでＧＬＡ活性を促進する、配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ－コードｍＲＮＡの能力が試験された。カニクイザル（Ｎ＝４）は、脂質ナノ粒子中で製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ－ｍＲＮＡ番号２３（化合物１８）を、１日目及び１４日目に静脈内注射された。
血液は、注射の直前、ならびに各投与の１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、及び１６８時間後に各サルから収集された。各血漿試料中のＧＬＡタンパク質活性レベルは、上記のＡ部に記載される４－ＭＵ蛍光発生ＧＬＡ活性アッセイを使用して分析された。図２０は、未処置のサル及び各ＧＬＡ－ｍＲＮＡ処置後のサルの血漿中のＧＬＡ活性レベルを示す。図２０中の点線は、野生型カニクイザルにおける平均ＧＬＡ活性レベルを示す（９．１１Ｕ／ｍＬ；Ｎ＝１５）。図２０は、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの各処置の約６～１２時間後にピークに達したＧＬＡ活性を示す。さらに、ＧＬＡ活性レベルは、ＧＬＡ－ｍＲＮＡでの第２の処置後の各時点でＧＬＡ－ｍＲＮＡでの第１の処置後の同等の時点に対してより高かった。
発明を実施するための形態の部分、ならびに概要及び要約でない部分は、特許請求の範囲を説明するために使用されることが意図されることを理解されたい。概要及び要約の部分は、発明者（複数可）によって企図されるような本発明の１つ以上であるが全てではない例となる実施形態を記述し得、したがって、いかなる方法においても本発明及び添付の特許請求の範囲を制限することは意図されない。
本発明は、その特定の機能及び関係の実装を示す機能的ビルディングブロックを用いて上記に記載されている。これらの機能的ビルディングブロックの境界は、説明の便宜上のために本明細書に任意に定義されている。代替の境界は、特定の機能及びその関係が適切に行われる限り定義され得る。
特定の実施形態の前述の説明は、他の者が、当該技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、不要な実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、かかる特定の実施形態を様々な用途に容易に変更及び／または適合させることができるほど、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするであろう。したがって、かかる適合及び変更は、本明細書に表される教示及び指導に基づいて、開示される実施形態の同等物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書の語法または用語法は、本発明の明細書のかかる用語法または語法が、教示及び指導の観点から当業者によって解釈されるような、説明の目的のためであり、限定の目的のためではないことが理解されるであろう。
本発明の幅及び範囲は、上記に記載される例となる実施形態のうちのいずれによっても限定されるべきでなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの同等物のみに従って定義されるべきである。
本明細書に記述される全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。矛盾する場合においては、定義を含む本明細書が支配する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
医薬組成物であって、
（ａ）（ｉ）α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ＯＲＦ、及び（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、ｍＲＮＡと、
（ｂ）送達剤と、を含み、
ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である、医薬組成物。
（項目２）
ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、その
必要のあるヒト対象に単回静脈内用量として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させる、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の血漿中ＧＬＡ活性レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも高くに維持するのに十分である、医薬組成物。
（項目３）
前記組成物は、ファブリー病を患う前記ヒト対象に単回静脈内用量として投与されるとき、投与後７２時間、参照の血漿中ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％を維持するのに十分である、項目２に記載の医薬組成物。
（項目４）
ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、脂質ナノ粒子にカプセル封入されたｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、その必要のあるヒト対象に単回静脈内用量として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって肝臓、心臓及び／または腎臓ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させる、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の血漿中ＧＬＡ活性レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも高くに維持するのに十分である、医薬組成物。
（項目５）
前記組成物は、それを必要とする前記ヒト対象に単回静脈内用量として投与されるとき、投与後７２時間、参照の肝臓及び／または心臓ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％を維持するのに十分である、項目４に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記組成物は、それを必要とする前記ヒト対象に単回静脈内用量として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、もしくは少なくとも６週間にわたって、リゾ－Ｇｂ３血漿中レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減する、かつ／または（ｉｉ）投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、もしくは少なくとも６週間にわたって、Ｇｂ３血漿中レベルを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、項目１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目７）
ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、その必要のある対象に単回静脈内用量として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、Ｇｂ３の血漿中レベルを治療前のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減する、かつ／または
（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、リゾ－Ｇｂ３の血漿中レベルを治療前のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、医薬組成物。
（項目８）
ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、その
必要のある対象に単回静脈内用量として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織中のＧｂ３の組織中レベルをその組織中の治療前のＧｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減する、かつ／または
（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織中のリゾ－Ｇｂ３の組織中レベルをその組織中の治療前のリゾ－Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、医薬組成物。
（項目９）
ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、その必要のある対象に単回静脈内用量として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、血漿中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、心臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｉｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、肝臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｖ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、腎臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、及び／または
（ｖ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、脾臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させるのに十分である、及び／または
前記増加されたＧＬＡ活性レベルは、対応する参照のＧＬＡ活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である、医薬組成物。
（項目１０）
送達剤をさらに含む、項目２～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１１）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであって、前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べた前記ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）が約１００％～約１５０％である、ポリヌクレオチド。
（項目１２）
前記％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１１０％～約１５０％、約１１５％～約１５０％、約１２０％～約１５０％、約１１０％～約１４５％、約１１５％～約１４５％、約１２０％～約１４５％、約１１０％～約１４０％、約１１５％～約１４０％、または約１２０％～約１４０％である、項目１１に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３）
対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量と比べた前記ＯＲＦの前記ウラシル
またはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である、項目１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４）
前記％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、または７０％未満である、項目１３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５）
前記ＯＲＦ中の総ヌクレオチド含量と比べた前記ＯＲＦ中の前記ウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である、項目１１～１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６）
前記％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約２０％未満である、項目１５に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７）
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対する前記ＯＲＦのグアニン含量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、項目１１～１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８）
前記％ＧＴＭＸは、約６４％～約８５％、約６５％～約８５％、または約６５％～約８０％である、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９）
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量と比べた前記ＯＲＦのシトシン含量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、項目１１～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２０）
前記％ＣＴＭＸは、約６０％～約９５％、約６５％～約９５％、約７０％～約９５％、または約７５％～約９０％である、項目１９に記載のポリヌクレオチド。
（項目２１）
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量と比べた前記ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、項目１１～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２２）
前記％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％～約１００％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、または約９５％～約９９％である、項目２１に記載のポリヌクレオチド。
（項目２３）
対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べた前記ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、または少なくとも約１２５％である、項目１１～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２４）
前記ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９、８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６
％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目１１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２５）
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目１１～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６）
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、項目１１～２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７）
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列を含む、項目１１～２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８）
ｍＲＮＡである、項目１１～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目２８に記載のｍＲＮＡと送達剤とを含む、医薬組成物。
（項目３０）
前記送達剤は、脂質様物質、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、項目１、６、１０、及び２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３１）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニドコサ－１３－１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
前記脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを含む、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３３）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000240
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５であるとき、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２であるとき、Ｑは５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３４）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、前記化合物が式（ＩＡ）、
Figure 2022136230000241
またはその塩もしくは立体異性体のものであることを含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、項目３３に記載の医薬組成物。
（項目３５）
ｍは、５、７、または９である、項目３３～３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。（項目３６）
前記化合物は、式（ＩＩ）
Figure 2022136230000242
またはその塩もしくは立体異性体のものであり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝Ｎ
Ｒ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、項目３３～３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３７）
Ｍ１は、Ｍ’である、項目３４～３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目３８）
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である、項目３７に記載の医薬組成物。
（項目３９）
ｌは、１、３、または５である、項目３４～３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。（項目４０）
前記化合物は、化合物１～化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目３３に記載の医薬組成物。
（項目４１）
前記化合物は、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の医薬組成物。
（項目４２）
前記化合物は、化合物１８、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、項目４１に記載の医薬組成物。
（項目４３）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
Figure 2022136230000243
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
Figure 2022136230000244
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々
単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－ －ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000245
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない、かつ／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目４４）
前記化合物は、下記式を有する、項目４３に記載の医薬組成物
Figure 2022136230000246
（項目４５）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
Figure 2022136230000247
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000248
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの別の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目４６）
前記化合物は、式（ＩＶａ）のものである、項目４５に記載の医薬組成物。
Figure 2022136230000249
（項目４７）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
Figure 2022136230000250
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目４８）
前記化合物は、式（Ｖａ）のものである、項目４７に記載の医薬組成物。
Figure 2022136230000251
（項目４９）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
Figure 2022136230000252
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５０）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、化合物２３３～化合物３４２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５１）
前記化合物は、化合物２３６、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、項目５０に記載の医薬組成物。
（項目５２）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、式（Ｉ）を有する化合物
Figure 2022136230000253
またはその塩もしくは立体異性体を含む送達剤とを含む、医薬組成物であって、式中、
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５であるとき、Ｑは－Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）ｎが１または２であるとき、Ｑは５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、医薬組成物。
（項目５３）
前記送達剤は、前記化合物は、式（ＩＡ）のもの、
Figure 2022136230000254
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、項目５２に記載の医薬組成物。
（項目５４）
ｍは、５、７、または９である、項目５２～５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。（項目５５）
前記化合物は、式（ＩＩ）
Figure 2022136230000255
またはその塩もしくは立体異性体のものであり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、 Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、項目５２～５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５６）
Ｍ１は、Ｍ’である、項目５３～５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目５７）
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－である、項目５６に記載の医薬組成物。
（項目５８）
ｌは、１、３、または５である、項目５３～５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。（項目５９）
前記化合物は、化合物１～化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目５２に記載の医薬組成物。
（項目６０）
前記化合物は、化合物１～化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目５９に記載の医薬組成物。
（項目６１）
前記化合物は、化合物１８、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、項目６０に記載の医薬組成物。
（項目６２）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
Figure 2022136230000256
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
Figure 2022136230000257
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、－ＣＨ２－、－ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000258
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではない、かつ／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である、医薬組成物。
（項目６３）
前記化合物は、下記式を有する、項目６２に記載の医薬組成物。
Figure 2022136230000259
Figure 2022136230000260
（項目６４）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
Figure 2022136230000261
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６－２０アルキル及びＣ６－２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
Figure 2022136230000262
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの別の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６－２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６－２０アルケニルから選択される、医薬組成物。
（項目６５）
前記化合物は、式（ＩＶａ）のものである、項目６４に記載の医薬組成物。
Figure 2022136230000263
（項目６６）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
Figure 2022136230000264
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される、医薬組成物。
（項目６７）
前記化合物は、式（Ｖａ）のものである、項目６６に記載の医薬組成物。
Figure 2022136230000265
（項目６８）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物
Figure 2022136230000266
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ＣＨ２－、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＣＨ２－ＯＣ（Ｏ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、各Ｒ”は独立して、Ｃ３－１２アルキル及びＣ３－１２アルケニルからなる群から選択される、医薬組成物。
（項目６９）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、化合物２３３～化合物３４２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、医薬組成物。
（項目７０）
前記化合物は、化合物２３６、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、項目６９に記載の医薬組成物。
（項目７１）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む、項目２９～７０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目７２）
前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）、
Figure 2022136230000267
またはその塩を有し、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１～１００（端点を含む）の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られた部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
Figure 2022136230000268
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－
ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である、項目７１に記載の医薬組成物。
（項目７３）
前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）、
Figure 2022136230000269
またはその塩を有し、式中、
Ｒ３は、－ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１～１００（端点を含む）の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である、項目７１に記載の医薬組成物。
（項目７４）
前記ＰＥＧ脂質は、下記式、
Figure 2022136230000270
を有し、式中、ｒは、１～１００の整数である、項目７３に記載の医薬組成物。
（項目７５）
前記ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である、項目７４に記載の医薬組成物。
（項目７６）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、リン脂質をさらに含む、項目２９～７５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目７７）
前記リン脂質は、式（ＩＸ）、
Figure 2022136230000271
またはその塩を有し、式中、
各Ｒ１は独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、あるいは任意選択で、２つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される単環式カルボシクリルまたは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、あるいは任意選択で、３つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される二環式カルボシクリルまたは任意選択で置換二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
Figure 2022136230000272
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、－Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、または－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、
または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であるが、
但し、前記化合物は、下記式、
Figure 2022136230000273
のものではないことを条件とし、式中、Ｒ２の各出現例は独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである、項目７６に記載の医薬組成物。
（項目７８）
前記リン脂質は、下記式、
Figure 2022136230000274

またはその塩を有し、式中、
各ｔは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは独立して、１、２、または３である、項目７７に記載の医薬組成物。
（項目７９）
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む、項目１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目８０）
前記ｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、項目１～１０及び２９～７９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８に記載のポリヌクレオチド。
（項目８１）
前記ｍＲＮＡは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞において発現され、前記ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８２）
前記ｍＲＮＡは、造血系の免疫細胞において豊富なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位を含み、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、内皮細胞において豊富なマイクロＲＮＡのものである、項目８１に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８３）
前記ｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む、項目８０～８２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８４）
前記ｍＲＮＡは、同じマイクロＲＮＡの第１及び第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、項目８０～８３のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８５）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記同じマイクロＲＮＡの３ｐ及び５ｐアームのものである、項目８４に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８６）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７、ｍｉＲ－２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、項目８０～８５のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８７）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、項目８６に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８８）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位である、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目８９）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２結合部位である、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９０）
１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４６－３ｐ、ｍｉＲ－１４６－５ｐ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４及びｍｉＲ－２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９１）
少なくとも１つのｍｉＲ－１２６－３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位とを含む、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９２）
少なくとも１つのｍｉＲ－１４２－３ｐ結合部位と、少なくとも１つの１４２－５ｐ結合部位とを含む、項目８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９３）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する、項目８０～９２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９４）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９５）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９６）
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９７）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンに直接隣接する３’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９８）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンから７０～８０塩基下流にある３’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目９９）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンの直前の５’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。（項目１００）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより１５～２０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０１）
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより７０～８０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０２）
前記ｍＲＮＡは、互いに直接隣接して位置付けられた、または５未満、５～１０、１０～１５、もしくは１５～２０ヌクレオチドのスペーサーを伴う、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０３）
前記ｍＲＮＡは、前記３’ＵＴＲに位置する同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンに直接隣接して位置付けられ、第２及び第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の最も３’側の残基から３０～４０塩基下流に位置付けられている、項目９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０４）
前記ｍＲＮＡは、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む、項目１～１０及び２９～１０３のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１０３に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０５）
前記ｍＲＮＡは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む、項目１～１０及び２９～１０４のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１０４に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０６）
前記３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択
される核酸配列を含む、項目１０５に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０７）
前記ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、項目１～１０及び２９～１０６のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０８）
前記５’ＵＴＲは、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、項目１０７に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１０９）
前記５’ＵＴＲが、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む、項目１０８に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１０）
前記ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含む、項目１～１０及び２９～１０９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１０９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１１）
前記５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、項目１１０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１２）
前記５’末端キャップは、Ｃａｐ１を含む、項目１１１に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１３）
前記ｍＲＮＡは、ポリＡ領域をさらに含む、項目１～１０及び２９～１１２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１４）
前記ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である、項目１１３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１５）
前記ポリＡ領域は、約１０～約２００、約２０～約１８０、約５０～約１６０、約７０～約１４０、または約８０～約１２０ヌクレオチド長を有する、項目１１４に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１６）
前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～１０及び２９～１１５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１７）
前記少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メト
キシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１１６に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１８）
ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、項目１１６または１１７に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１１９）
グアニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、項目１１６～１１８のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２０）
シトシンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、項目１１６～１１９のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２１）
アデニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、項目１１６～１２０のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２２）
前記ｍＲＮＡは、精製されている、項目１～１０及び２９～１２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目２８及び８０～１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２３）
前記ＧＬＡポリペプチドは、ＧＬＡ活性を有する野生型、バリアント、または変異体である、先行項目のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２４）
前記ＧＬＡポリペプチドは、配列番号１からなる野生型ポリペプチド配列を含む、項目１２３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２５）
前記ＧＬＡポリペプチドは、ＧＬＡ融合タンパク質である、先行項目のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２６）
前記ＧＬＡ融合タンパク質は、異種タンパク質部分を含む、項目１２５に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１２７）
ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）５’ＵＴＲと、
（ｉｉ）ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＯＲＦと、
（ｉｉｉ）ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲと、を含み、
前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、前記ポリヌクレオチド。
（項目１２８）
ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）５’－末端キャップと、
（ｉｉ）配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む５’ＵＴＲと、
（ｉｉｉ）ヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される配列を含む、ＯＲＦと、
（ｉｖ）配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲと、
（ｖ）ポリＡ領域と、を含み、
前記ｍＲＮＡは、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、前記ポリヌクレオチド。
（項目１２９）
配列番号１１９～１２０、１２２～１４０、及び１６０からなる群から選択される核酸配列を含む、項目１２７または１２８に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３０）
項目１２７～１２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、送達剤とを含む、医薬組成物。
（項目１３１）
前記送達剤は、化合物１～３４２もしくは化合物４１９～４２８のうちのいずれか一方からなる群から選択される化合物、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である、項目１３０に記載の医薬組成物。
（項目１３２）
前記送達剤は、化合物１８もしくは化合物２３６、化合物４２８、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である、項目１３０に記載の医薬組成物。
（項目１３３）
前記送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む、項目１３０に記載の医薬組成物。
（項目１３４）
前記対象は、ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象である、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１３５）
前記対象に投与されると、前記ｍＲＮＡは、配列番号２の核酸配列を有する及び／またはネイキッドｍＲＮＡとして投与される対応するｍＲＮＡと比べて、
（ｉ）より長い血漿中半減期、
（ｉｉ）前記ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、
（ｉｉｉ）より高い構造安定性、または
（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ、
を有する、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（項目１３６）
１つの単回単位用量または複数の単回単位用量としての投与に好適である、先行項目の
いずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１３７）
前記対象においてファブリー病の１つ以上のバイオマーカーのレベルを低減するのに好適である、先行項目のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１３８）
前記対象においてファブリー病の徴候または症状の発症を治療、予防または遅延させるのに使用するための、先行項目のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１３９）
前記徴候または症状には、疼痛、胃腸障害、被角血管腫等の皮膚病変、腎機能障害、心筋症、卒中、またはそれらの組み合わせが含まれる、項目１３８に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
（項目１４０）
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドの発現をその必要のあるヒト対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目１１～２８、８０～１３０、及び１３６～１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１つの単回用量としてまたは複数の単回単位用量として前記対象に投与するのに好適である、方法。
（項目１４１）
ファブリー病の徴候または症状の治療、予防、または、その発症の遅延をその必要のあるヒト対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目１１～２８、８０～１３０、及び１３６～１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象におけるファブリー病の前記徴候または症状のうちの１つ以上を、治療するか、予防するか、またはその発症を遅延させる、方法。
（項目１４２）
前記投与は、前記対象の血漿または組織中のＧｂ３またはリゾ－Ｇｂ３の漸進的蓄積を減速する、停止する、または逆行させる、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
ファブリー病の治療方法であって、ファブリー病を患うヒト対象に、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目１１～２８、８０～１３０、及び１３６～１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの単回静脈内用量を投与することを含む、前記方法。
（項目１４４）
ヒト対象におけるＧｂ３血漿中レベル及び／またはリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルの低減方法であって、前記対象に、有効量の、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目１１～２８、８０～１３０、及び１３６～１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象における前記Ｇｂ３血漿中レベルまたはリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルを低減する、方法。
（項目１４５）
（ｉ）前記Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、治療前のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、かつ／または
（ｉｉ）前記リゾ－Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、治療前のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記Ｇｂ３血漿中レベルは、前記対象において１０ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、９ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、８ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、７ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、６ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、５ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、４ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、３ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、または２ｎｍｏｌ／ｍＬ未満に低減される、項目１４４に記載の方法。
（項目１４７）
ヒト対象におけるＧｂ３組織中レベル及び／またはリゾ－Ｇｂ３組織中レベルの低減方法であって、前記対象に、有効量の、項目１～１０、２９～１２６、及び１３０～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または項目１１～２８、８０～１３０、及び１３６～１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象における前記Ｇｂ３組織中レベル及び／またはリゾ－Ｇｂ３組織中レベルを低減する、前記方法。
（項目１４８）
前記組織は、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織である、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
（ｉ）前記Ｇｂ３組織中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、その組織中の治療前のＧｂ３レベルと比較して少なくとも５０％低減される、かつ／または
（ｉｉ）前記リゾ－Ｇｂ３組織中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、その組織中の治療前のリゾ－Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、項目１４５に記載の方法。
（項目１５０）
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与された２４時間後、前記対象におけるＧＬＡ活性は、参照個体におけるＧＬＡ活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％に増加している、項目１４０～１４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５１）
前記ＧＬＡ活性は、前記対象の心臓、腎臓、肝臓、または脾臓において増加する、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記増加したＧＬＡ活性は、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間を超えて持続する、項目１５０または１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与された２４時間後、前記対象におけるＧｂ３のレベルは、前記対象のベースラインＧｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減されている、項目１４０～１５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５４）
前記Ｇｂ３のレベルは、前記対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される、項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
前記対象への投与後、前記対象における前記Ｇｂ３のレベルは、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間前記対象における前記ベースラインレベルと比較して低減される、項目１５３または
１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与された２４時間後、前記対象におけるリゾ－Ｇｂ３のレベルは、前記対象のベースラインリゾ－Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減されている、項目１４０～１５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５７）
前記リゾ－Ｇｂ３のレベルは、前記対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記対象への投与後、前記対象における前記リゾ－Ｇｂ３のレベルは、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間前記対象における前記ベースラインレベルと比較して低減される、項目１５６または１５７に記載の方法。
（項目１５９）
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１．５ｍｇ／ｋｇ未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．７５ｍｇ／ｋｇ未満、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量として投与される、項目１４０～１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６０）
前記対象への前記投与は、約週１回、約２週間に１回、または約１カ月に１回である、項目１４０～１５９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６１）
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、静脈内投与される、項目１４０～１６０のいずれか１項に記載の方法。
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、静脈内投与される。
［付記１］
α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む医薬組成物であって、前記ＬＮＰが、式（ＩＡ）
Figure 2022136230000329
の化合物またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ １ は、結合またはＭ’であり、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １－３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、式中、ｎは、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ ８ 、－ＮＨＣ（＝ＮＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ ９ ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ 、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｒ ８ は、Ｃ ３－６ 炭素環および複素環からなる群から選択され、
Ｒ ９ は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ ２ 、Ｃ １－６ アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｒ、－Ｓ（Ｏ） ２ Ｎ（Ｒ） ２ 、Ｃ ２－６ アルケニル、Ｃ ３－６ 炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒは、Ｃ １－３ アルキル、Ｃ ２－３ アルケニル及びＨからなる群から選択され、
Ｒ’は、Ｃ １－１８ アルキル、Ｃ ２－１８ アルケニル、－Ｒ ＊ ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択され、
Ｒ”は、Ｃ ３－１４ アルキル及びＣ ３－１４ アルケニルからなる群から選択され、
Ｒ ＊ は、Ｃ １－２ アルキル及びＣ ２－１２ アルケニルからなる群から選択され、
Ｙは、Ｃ ３－６ 炭素環であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ ２ 及びＲ ３ は独立して、Ｈ、Ｃ １－１４ アルキル、及びＣ ２－１４ アルケニルからなる群から選択される、医薬組成物。
［付記２］
前記化合物は、式（ＩＩ）
Figure 2022136230000330
の化合物またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
Ｒ ４ は、非置換Ｃ １－３ アルキル、または－（ＣＨ ２ ） ｎ Ｑであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ） ２ 、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ） ２ である、付記１に記載の医薬組成物。
［付記３］
前記化合物は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）
Figure 2022136230000331
の化合物またはその塩もしくは立体異性体である、付記１に記載の医薬組成物。
［付記４］
Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＯＣ（Ｏ）－である、付記１に記載の医薬組成物。
［付記５］
（ｉ）Ｒ ２ 及びＲ ３ は同じであり、必要に応じて、Ｒ ２ 及びＲ ３ はＣ ８ アルキルである、または
（ｉｉ）Ｒ ２ とＲ ３ とが異なる、
付記１に記載の医薬組成物。
［付記６］
（ｉ）ｎが２である、
（ｉｉ）Ｒ’が、Ｃ ４ アルキル及びＣ ４ アルケニル、Ｃ ５ アルキル及びＣ ５ アルケニル、Ｃ ６ アルキル及びＣ ６ アルケニル、Ｃ ７ アルキル及びＣ ７ アルケニル、Ｃ ９ アルキル及びＣ ９ アルケニル、Ｃ １１ アルキル及びＣ １１ アルケニル、Ｃ １２ アルキル、Ｃ １２ アルケニル、Ｃ １３ アルキル、Ｃ １３ アルケニル、Ｃ １４ アルキル、Ｃ １４ アルケニル、Ｃ １５ アルキル、Ｃ １５ アルケニル、Ｃ １６ アルキル、Ｃ １６ アルケニル、Ｃ １７ アルキル、Ｃ １７ アルケニル、Ｃ １８ アルキル及びＣ １８ アルケニルから選択される、または
（ｉｉｉ）ｌが、３、４、及び５から選択される、
付記１に記載の医薬組成物。
［付記７］
前記化合物は、式
Figure 2022136230000332
の化合物またはその塩もしくは立体異性体である、付記１に記載の医薬組成物。
［付記８］
前記脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を含む、付記１～７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記９］
前記ＰＥＧ脂質は、式
Figure 2022136230000333
の化合物である、付記８に記載の医薬組成物。
［付記１０］
前記脂質ナノ粒子は、リン脂質を含む、付記１～９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１１］
前記脂質ナノ粒子が、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ脂質を含む、付記１～７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１２］
前記脂質ナノ粒子は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含み、ここで、前記化合物１８は、式
Figure 2022136230000334
の化合物であり、前記化合物４２８は、式
Figure 2022136230000335
の化合物である、付記１～１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１３］
前記ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含み、必要に応じて、前記３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む、付記１～１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１４］
前記ｍＲＮＡは５’ＵＴＲを含み、必要に応じて、前記５’ＵＴＲが、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む、付記１～１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１５］
前記ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含み、必要に応じて、前記５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、または５’メチルＧキャップを含む、付記１～１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１６］
前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含み、必要に応じて、（ａ）前記少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、かつ／または（ｂ）ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、付記１～１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１７］
前記ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、付記１～１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１８］
ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象を治療するための方法における使用のための、付記１～１７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［付記１９］
前記対象においてファブリー病の徴候または症状の発症を治療、予防または遅延させるための方法における使用のための、付記１～１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

Claims (19)

  1. α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む医薬組成物であって、前記ＬＮＰが、式（ＩＡ）
    Figure 2022136230000275
    の化合物またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
    ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
    ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
    Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
    Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環および複素環からなる群から選択され、
    Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
    Ｒは、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル及びＨからなる群から選択され、
    Ｒ’は、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”及びＨからなる群から選択され、
    Ｒ”は、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
    Ｒ＊は、Ｃ１－２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
    Ｙは、Ｃ３－６炭素環であり、
    Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
    Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される、医薬組成物。
  2. 前記化合物は、式（ＩＩ）
    Figure 2022136230000276
    の化合物またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
    Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記化合物は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）
    Figure 2022136230000277
    の化合物またはその塩もしくは立体異性体である、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＯＣ（Ｏ）－である、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. （ｉ）Ｒ２及びＲ３は同じであり、必要に応じて、Ｒ２及びＲ３はＣ８アルキルである、または
    （ｉｉ）Ｒ２とＲ３とが異なる、
    請求項１に記載の医薬組成物。
  6. （ｉ）ｎが２である、
    （ｉｉ）Ｒ’が、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニル、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニル、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニル、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニル、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニル、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル及びＣ１８アルケニルから選択される、または
    （ｉｉｉ）ｌが、３、４、及び５から選択される、
    請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記化合物は、式
    Figure 2022136230000278
    の化合物またはその塩もしくは立体異性体である、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 前記ＰＥＧ脂質は、式
    Figure 2022136230000279
    の化合物である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記脂質ナノ粒子は、リン脂質を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記脂質ナノ粒子が、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ脂質を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記脂質ナノ粒子は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含み、ここで、前記化合物１８は、式
    Figure 2022136230000280
    の化合物であり、前記化合物４２８は、式
    Figure 2022136230000281
    の化合物である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含み、必要に応じて、前記３’ＵＴＲは、配列番号５１～７５、８１～８２、８８、１０３、１０６～１１３、１１８、及び１６１～１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記ｍＲＮＡは５’ＵＴＲを含み、必要に応じて、前記５’ＵＴＲが、配列番号３３～５０、７７、及び１１５～１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含み、必要に応じて、前記５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、または５’メチルＧキャップを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含み、必要に応じて、（ａ）前記少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１－メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１－エチルシュードウラシル、２－チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’－チオウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、かつ／または（ｂ）ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記ＯＲＦは、配列番号３～２７、７９～８０、及び１４１～１５９からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象を治療するための方法における使用のための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 前記対象においてファブリー病の徴候または症状の発症を治療、予防または遅延させるための方法における使用のための、請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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