CN114107347B - 一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明所述融合基因的结构，包括：IRES、IL‑10和miR‑122配对序列，本发明基于所述融合基因构建了重组载体和重组细胞，并利用重组细胞生产工程化外泌体，所述工程化外泌体具有理想的组织特异性和良好的治疗效果，且所述外泌体制备方法简单，可实现按需抗炎治疗具有组织特异性强、脱靶率低等优点，可作为基因治疗的载体，意义重大。

Description

一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化 外泌体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用。
背景技术
动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病(CVD)的主要原因，是一种慢性炎症疾病，其特征是大动脉和中动脉内膜斑块堆积。目前，动脉粥样硬化的临床治疗主要包括生活方式干预、调脂治疗和抗血栓治疗。越来越多研究表明，抗炎治疗为动脉粥样硬化的治疗打开了一扇新的窗口。例如，在临床试验中研究了白细胞介素-1β抑制剂Canakinumab、脂肪酶A2抑制剂和p38MAPK抑制剂Losmapimod的疗效和安全性。然而，这些治疗药物大多是全身用药的，而且通常需要频繁重复给药才能在动脉粥样硬化的慢性炎症条件下取得疗效。因此，迫切需要开发具有高给药特异性、低脱靶效应的新型抗炎药物。
已有的研究表明外泌体是具有多种优势的mRNA递送载体，来源于内体的细胞外囊泡，直径约40～160nm(平均100nm)，携带多种物质，如蛋白质和核酸，参与细胞间通讯。外泌体具有良好的循环稳定性和跨越多种生物屏障的能力，被认为是良好的的药物递送载体。然而，在靶组织/细胞之外，外泌体不可避免地被肝、脾、骨髓和其他富含单核/吞噬系统的器官吞噬。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用，通过基于外泌体的系统递送工程化IL-10mRNA来控制炎症，有望成为防治动脉粥样硬化的新策略。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种外泌体递送的融合基因，所述融合基因结构，包括：IRES(内部核糖体进入位点)、IL-10(白细胞介素10)和miR-122配对序列。
优选的，所述IRES的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
所述IL-10的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
所述miR-122配对序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明提供了一种包含上述融合基因的重组载体，所述重组载体的基础载体包括真核表达载体。
优选的，所述真核表达载体包括pWPI载体，将上述融合基因插入所述pWPI载体的Pme1和BstB1酶切位点之间。
本发明还提供了一种表达装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的重组细胞，包括利用上述重组载体转化真核细胞。
本发明还提供了一种制备装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的方法，包括以下步骤：将上述重组细胞接种于无血清的完全培养基中培养48h，上清液中包含所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
优选的，在所述培养后，还包括利用0.22μm滤器过滤，得到的上清液依次500g离心10min，10000g离心20min，100000g离心2h，所得沉淀为所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
本发明还提供了利用上述的方法制备得到的装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
本发明还提供了上述融合基因或上述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物以上述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体为有效成分。
有益效果：本发明以Il-10mRNA作为治疗药物装载入外泌体内，在所述Il-10mRNA的5’端携带有miR-155响应的IRES序列，IRES-Il-10mRNA被递送到动脉粥样斑块中后，当斑块中高表达的miR-155与IRES结合后，其构象发生改变，促进蛋白质翻译，可以实现外泌体递送核酸的炎症响应，发挥其按需抗炎治疗动脉粥样硬化作用；同时在Il-10mRNA的3’端增加3段与miR-122的5’端第1至第21nt能够完全互补配对的序列。当所述融合基因的mRNA被外泌体递送至肝脏时，可以被miRNA介导的mRNA降解作用降解，从而避免在非目的器官中的翻译，降低脱靶效应和副作用，从而降低药物使用剂量，因此本发明提供的装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体，具有理想的组织特异性和良好的治疗效果，且所述外泌体制备方法简单，可实现按需抗炎治疗具有组织特异性强、脱靶率低等优点，可作为基因治疗的载体，意义重大。
附图说明
图1为ExoIRES-Il-10的制备和表征；
图2为受体细胞成功内吞ExoIRES-Il-10后活力无明显降低；
图3为ExoIRES-Il-10将miR-155响应型IRES-Il-10mRNA递送至受体细胞；
图4为ExoIRES-Il-10减轻ApoE-/-小鼠斑块局部炎症；
图5为ExoIRES-Il-10可精确诱导ApoE-/-小鼠炎症组织中的IL-10的表达；
图6为ExoIRES-Il-10对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的治疗作用；
图7为超声评估ExoIRES-Il-10的安全性；
图8为ExoIRES-Il-10的安全性评估。
具体实施方式
本发明提供了一种外泌体递送的融合基因，所述融合基因结构，包括：IRES、IL-10和miR-122配对序列。
本发明所述融合基因的结构，自5’端至3’端优选包括IRES、IL-10和miR-122配对序列，且所述IRES来源于丙肝病毒(HCV)RNA，并对其进行改构，获得如SEQ ID NO.1所示(ATCAGCCCCCTGATGGGGGCGAGCATTAATCATATTAGCATTACCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGACAGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATG)的序列，使得该IRES序列具备与miR-155的结合能力，将其结合至IL-10mRNA的5’端，可实现外泌体中携带的核酸药物具有炎症响应性。本发明所述Il-10mRNA优选经密码子优化后，其不易发生m6A修饰。经密码子优化后的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示(CCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACGGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACGGCCTTCAGCCAGGTGAAGACGTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGATTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAATGAAAAGCTAA)。本发明所述融合基因能够识别miR-155并激活mRNA翻译。
本发明所述miR-122配对序列(miR-122recognition site)优选包括SEQ ID NO.3所示的序列(AAACACCATTGTCACACTCCA)，可使该mRNA在肝脏中通过miRNA介导的mRNA降解作用降解，增加了所述Il-10mRNA的组织特异性。
本发明所述融合基因的5’端和3’端优选分别包括一个酶切位点：Pme1和BstB1，并且包含3个所述miR-122配对序列，相邻两个miR-122配对序列之间还包含一个连接肽(linker)，从而形成的完整融合基因(Pme1-IRES-Il-10-miR-122recognition site-linker-miR-122recognition site-linker-miR-122recognition site-BstBI)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：GTTTAAACATCAGCCCCCTGATGGGGGCGAGCATTAATCATATTAGCATTACCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGACAGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACGGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACGGCCTTCAGCCAGGTGAAGACGTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGATTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAATGAAAAGCTAAAAACACCATTGTCACACTCCAGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGAAGCAAACACCATTGTCACACTCCAGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGAAGCAAACACCATTGTCACACTCCATTCGAA。
本发明还提供了所述融合基因的构建方法，优选包括：将miR-122识别的HCV-IRES序列替换为与miR-155互补的序列，将该IRES序列插入到Il-10mRNA 5’端，当动脉粥样硬化斑块中高表达的miR-155与IRES结合后，其构象发生改变，促进IL-10mRNA翻译成蛋白；对Il-10mRNA CDS序列进行密码子优化，使其不易发生m6A修饰；在Il-10mRNA CDS 3’端加3段miR-122recognition site，该序列与miR-122的5’端第1至第21nt能够完全互补配对，使得该mRNA在富含miR-122的环境中可以被降解。
本发明提供了一种包含上述融合基因的重组载体，所述重组载体的基础载体包括真核表达载体。
本发明对所述真核表达载体的种类并没有特殊限定，优选包括pWPI载体，如在本发明实施例中，则将SEQ ID NO.4所示的融合基因插入所述pWPI载体的Pme1和BstB1酶切位点之间，形成重组载体。本发明对所述插入的方法并没有特殊限定，优选包括双酶切。
本发明还提供了一种表达装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的重组细胞，包括利用上述重组载体转化真核细胞。
本发明对所述真核细胞的种类并没有特殊限定，优选包括本领域的常见成熟细胞系，如HEK 293T细胞或间充质干细胞等。在本发明实施例中以HEK 293T细胞作为转化的基础细胞，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转化方法即可，优选包括脂质体转染法。
本发明还提供了一种制备装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的方法，包括以下步骤：将上述重组细胞接种于无血清的完全培养基中培养48h，上清液中包含所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体(简称ExoIRES-Il-10)。
本发明进行所述培养前，优选还包括将利用上述转染方法转染后的细胞，放于37℃5％CO2的细胞孵箱中孵育4～6h，而后更换无血清的完全培养基进行所述培养。本发明所述培养的条件优选包括37℃5％CO2。
本发明在所述培养后，优选还包括利用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片，得到的上清液依次500g离心10min(去除细胞)，10000g离心20min(除残留细胞碎片)，100000g离心2h，所得沉淀为所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
本发明还提供了利用上述的方法制备得到的装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体(ExoIRES-IL-10)。外泌体是起源于内体的细胞外囊泡，直径约40～160nm(平均约100nm)，密度为1.13～1.18kg/L。其基本结构为磷脂双分子层，其内携带蛋白质、核酸等生物分子，几乎所有类型的细胞均可分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于所有的体液中，行使着多种功能。外泌体携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物，是参与病理和生理过程中细胞间通讯的媒介，影响着生命活动的各个方面，在疾病的发生发展过程中发挥重要作用。外泌体因其天然的物质运输能力、固有的长期循环能力和出色组织相容性，被认为是良好的药物递送载体，有望应用于体内递送各种蛋白质，核酸和基因治疗剂等药物。本发明使用外泌体蛋白标志物检测、电镜分析和粒径分析结果见图1中B、C和D。本发明还提供了上述融合基因或上述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明将所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体注射到动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE-/-小鼠)体内，ExoIRES-Il-10处理小鼠主动脉斑块内炎症水平显著下降，动脉粥样硬化明显缓解。此外，肝肾功能及各脏器H&E染色结果显示，ExoIRES-Il-10处理未见明显的毒性反应。实验证明所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体，具有治疗动脉粥样硬化功能，可用于制备相应的药物。
本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物以上述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体为有效成分。
本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，实施例中以所述工程化外泌体的PBS溶液为例进行小鼠尾静脉注射，使用BCA法测定蛋白浓度约为1g/L，用量为5g/kg(每kg小鼠体重5g外泌体)。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成SEQ ID NO.4所示的融合基因(Pme1-IRES-Il-10-miR-122recognition site-linker-miR-122recognition site-linker-miR-122recognition site-BstBI)；
2、通过Pme1和BstBI双酶切和连接，将SEQ ID NO.4所示的序列插入到pWPI载体上，得重组载体；
3、利用脂质体转染法，将重组载体转染化HEK293T细胞；
4、转染后的细胞，放于37℃含5％CO2的细胞孵箱，4-～6h后换为无血清的完全培养基，48h后收集细胞上清；
5、用0.22μm滤器过滤细胞上清，去除细胞碎片；
6、细胞上清500g离心10min去除细胞，10000g离心20min除去残留的细胞碎片，100000g超速离心2h，所得沉淀即为外泌体。
表1 qPCR所需要的引物序列
Figure BDA0003371688990000081
qPCR体系
利用表1所示的引物对所得外泌体进行qPCR和western blot检测。根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0003371688990000092
试剂(Invitgen，Waltham，USA)处理受损的主动脉和其他感兴趣的组织。分别用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit(TIANGEN,北京,中国)和FirstStrand cDNA合成试剂盒(Genenode，北京,中国)提取miRNA和mRNA，并按照制造商的操作规程反向转录成cDNA。qPCR反应由FastStart Essential DNA Green Master(Roche，巴塞尔，瑞士)进行。所有的PCR反应至少进行三次，并将目标RNA的表达归一化到U6或GAPDH水平。使用另外说明的2-ΔΔCT方法对对照样本进行归一化，计算相对表达量。
取1μl cDNA作为模板，配置20μl Real time PCR反应体，具体如下：
Figure BDA0003371688990000091
qPCR程序:90℃10s，60℃10s，72℃10s共40个循环。
扩增结束后，根据扩增曲线计算每个孔的CT值，确定各样品中目的RNA的相对值。
结果见图1中E和F，改构外泌体内装载炎症响应的IRES-Il-10mRNA。
实施例2
在细胞和体内水平探讨外泌体加载、递送、靶向及干预效率；将提取的外泌体注射到动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE-/-小鼠)体内，ExoIRES-Il-10处理小鼠主动脉斑块内炎症水平显著下降，动脉粥样硬化明显缓解。此外，肝肾功能及各脏器H&E染色结果显示，ExoIRES-Il-10处理未见明显的毒性反应。
1.细胞水平验证ExoIRES-Il-10将miR-155响应型IRES-Il-10mRNA递送至受体细胞
为了体外验证外泌体可以将IRES-IL-10递送至受体细胞，首先将用Dii标记的外泌体与巨噬细胞系共培养，激光共聚焦结果显示巨噬细胞能够内吞外泌体。细胞活力检测证明外泌体无明显细胞毒性(见图2)。尔后，将外泌体与转染miR155的293T细胞共培养，qPCR与WB结果表明miR155存在条件下IL-10蛋白表达量显著增高。动脉粥样硬化斑块中M1型巨噬细胞是最主要的炎症细胞，也是该治疗策略的目的细胞。因此，在诱导M0向M1极化，尔后与外泌共培养。qPCR与WB结果表明，在IRES-IL10外泌体与m1巨噬细胞共培养组中IL-10蛋白表达量显著增高。以上结果表明ExoIRES-Il-10能够将miR-155响应型IRES-Il-10mRNA递送至受体细胞(见图3)。
2.ExoIRES-Il-10减轻ApoE-/-小鼠斑块局部炎症
使用ApoE-/-小鼠作为动脉粥样硬化模型进行动物水平研究。雄性ApoE-/-小鼠(7周龄，20～22g)购自南京大学模型动物研究中心。小鼠保持在无特定病原体的条件下，光照周期为12h，暗周期为12h，温度保持在22℃～24℃之间。习服7d后，给予高脂饮食(D12492，ResearchDiet，脂肪45％，蛋白质20％，碳水化合物20％)喂养8周，诱导动脉粥样硬化。活体成像与激光共聚焦结果显示，外泌体可以在动脉粥样硬化斑块内富集并被CD68阳性的巨噬细胞吞噬。在尾静脉注射外泌体治疗4周后，APOE敲除小鼠斑块内炎症水平显著下降。以上结果证明ExoIRES-Il-10能够减轻ApoE-/-小鼠斑块局部炎症(见图4)。
3.ExoIRES-Il-10可精确诱导ApoE-/-小鼠炎症组织中的IL-10的表达
ELISA法检测治疗后小鼠主要脏器的IL-10蛋白结果显示，IL-10蛋白在斑块高表达，而在没有明显的炎症反应的其他组织和器官中很少被诱导翻译(见图5)。
4.ExoIRES-Il-10对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的治疗作用
将治疗时间延长到8周后，对小鼠进行主动脉大体油红检测、主动脉窦H&E和油红O染色，结果显示斑块面积显著降低。qPCR检测显示斑块炎症水平显著降低。证明ExoIRES-Il-10对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化具有治疗作用(见图6)。
5.ExoIRES-Il-10的安全性评估
外泌体治疗后小鼠的超声心动图、主要脏器H&E染色、肝肾功能。脂质代谢均无明显异常。以上结果提示外泌体具有良好的安全性(见图7和图8)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> 一种基于具有按需抗炎功能、装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体及其构建方法和应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcagccccc tgatgggggc gagcattaat catattagca ttacctgtga ggaactactg 60
tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgac agtcgtgcag cctccaggac 120
cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag 180
gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 240
gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 300
gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catg 344
<210> 2
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctggctcag cactgctatg ctgcctgctc ttactgacgg gcatgaggat cagcaggggc 60
cagtacagcc gggaagacaa taactgcacc cacttcccag tcggccagag ccacatgctc 120
ctagagctgc ggacggcctt cagccaggtg aagacgttct ttcaaacaaa ggaccagctg 180
gacaacatac tgctaaccga ctccttaatg caggatttta agggttactt gggttgccaa 240
gccttatcgg aaatgatcca gttttacctg gtagaagtga tgccccaggc agagaagcat 300
ggcccagaaa tcaaggagca tttgaattcc ctgggtgaga agctgaagac cctcaggatg 360
cggctgaggc gctgtcatcg atttctcccc tgtgaaaata agagcaaggc agtggagcag 420
gtgaagagtg attttaataa gctccaagac caaggtgtct acaaggccat gaatgaattt 480
gacatcttca tcaactgcat agaagcatac atgatgatca aaatgaaaag ctaa 534
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacaccatt gtcacactcc a 21
<210> 4
<211> 1045
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtttaaacat cagccccctg atgggggcga gcattaatca tattagcatt acctgtgagg 60
aactactgtc ttcacgcaga aagcgtctag ccatggcgtt agtatgacag tcgtgcagcc 120
tccaggaccc cccctcccgg gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gtacaccgga 180
attgccagga cgaccgggtc ctttcttgga tcaacccgct caatgcctgg agatttgggc 240
gtgcccccgc gagactgcta gccgagtagt gttgggtcgc gaaaggcctt gtggtactgc 300
ctgatagggt gcttgcgagt gccccgggag gtctcgtaga ccgtgcacca tgcctggctc 360
agcactgcta tgctgcctgc tcttactgac gggcatgagg atcagcaggg gccagtacag 420
ccgggaagac aataactgca cccacttccc agtcggccag agccacatgc tcctagagct 480
gcggacggcc ttcagccagg tgaagacgtt ctttcaaaca aaggaccagc tggacaacat 540
actgctaacc gactccttaa tgcaggattt taagggttac ttgggttgcc aagccttatc 600
ggaaatgatc cagttttacc tggtagaagt gatgccccag gcagagaagc atggcccaga 660
aatcaaggag catttgaatt ccctgggtga gaagctgaag accctcagga tgcggctgag 720
gcgctgtcat cgatttctcc cctgtgaaaa taagagcaag gcagtggagc aggtgaagag 780
tgattttaat aagctccaag accaaggtgt ctacaaggcc atgaatgaat ttgacatctt 840
catcaactgc atagaagcat acatgatgat caaaatgaaa agctaaaaac accattgtca 900
cactccagga ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagcgga ggcggtggaa gcaaacacca 960
ttgtcacact ccaggaggcg gtggaagcgg aggcggtgga agcggaggcg gtggaagcaa 1020
acaccattgt cacactccat tcgaa 1045
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcttactg actggcatga g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgcagctcta ggagcatgtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgaacttcg gggtgatcgg 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcttgtcac tcgaattttg aga 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctccaagcca aagtccttag ag 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggagctgtc attagggaca tc 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctctgttcag ctattggacg c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggaatttct gggattcagc ttc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaatccagc taactatccc tcc 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acccagtagc agtcatccca 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaactgttc ctgaactcaa ct 22
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atcttttggg gtccgtcaac t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttctcagcc caacaataca aga 23
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<212> DNA
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gtggacgggt cgatgtcac 19
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<212> DNA
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tagtccttcc taccccaatt tcc 23
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ttggtcctta gccactcctt c 21
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<212> DNA
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aggtcggtgt gaacggattt g 21
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ggggtcgttg atggcaaca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caatgacccc ttcattgacc 20
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<211> 20
<212> DNA
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gacaagcttc ccgttctcag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaatgctaa ttgtgatagg ggt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgcttcgg cagcaca 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.一种外泌体递送的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述融合基因的结构由IRES、IL-10和miR-122配对序列组成。
2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述IRES的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列；
所述IL-10的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列；
所述miR-122配对序列为SEQ ID NO.3所示的序列。
3.一种包含权利要求1或2所述融合基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体为真核表达载体。
4.根据权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述真核表达载体为pWPI载体，将权利要求1或2所述融合基因插入所述pWPI载体的Pme1和BstB1酶切位点之间。
5.一种表达装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的重组细胞，其特征在于，包括利用权利要求3或4所述重组载体转化真核细胞。
6.一种制备装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述重组细胞接种于无血清的完全培养基中培养48h，上清液中包含所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述培养后，还包括利用0.22μm滤器过滤，得到的上清液依次500g离心10min，10000g离心20min，100000g离心2h，所得沉淀为所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
8.利用权利要求6或7所述的方法制备得到的装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体。
9.权利要求1或2所述融合基因或权利要求8所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
10.一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物以权利要求8所述装载炎症响应型mRNA的工程化外泌体为有效成分。
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