CN116916896A - 制备脂质纳米颗粒的方法 - Google Patents
制备脂质纳米颗粒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116916896A CN116916896A CN202180053181.2A CN202180053181A CN116916896A CN 116916896 A CN116916896 A CN 116916896A CN 202180053181 A CN202180053181 A CN 202180053181A CN 116916896 A CN116916896 A CN 116916896A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- lipid
- lnp
- less
- empty
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 1761
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 204
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 187
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 325
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims abstract description 285
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 1060
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 248
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 200
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 182
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 133
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 114
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 114
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 111
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 65
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 60
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 56
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 56
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 54
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 50
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 40
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 40
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 39
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 claims description 39
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 39
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 38
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 37
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 37
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 31
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 238000001249 flow field-flow fractionation Methods 0.000 claims description 24
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 23
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 20
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 17
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical group CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012929 tonicity agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000036316 preload Effects 0.000 claims description 4
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- JXASPPWQHFOWPL-UHFFFAOYSA-N Tamarixin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1=C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 JXASPPWQHFOWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical group NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 656
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 656
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 331
- -1 nucleic acid Lipid Chemical class 0.000 description 273
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 66
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 38
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 37
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 36
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 35
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 34
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 34
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 34
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 21
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 18
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 9
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 9
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 9
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 9
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical group OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IIPYXGDZVMZOAP-UHFFFAOYSA-N lithium nitrate Chemical compound [Li+].[O-][N+]([O-])=O IIPYXGDZVMZOAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N (2r,3r,4r,5r)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanal;hydrate Chemical compound O.O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HBDJFVFTHLOSDW-DNDLZOGFSA-N 0.000 description 1
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083957 1,2-butanediol Drugs 0.000 description 1
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 1
- ZCHGODLGROULLT-UHFFFAOYSA-N 2,2-bis(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;propane-1,2-diol Chemical compound CC(O)CO.OCC(CO)(CO)CO ZCHGODLGROULLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZDZIUCRHSNCAB-UHFFFAOYSA-N 3-(2h-pyridin-1-yl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CC=CC=C1 FZDZIUCRHSNCAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REEBJQTUIJTGAL-UHFFFAOYSA-N 3-pyridin-1-ium-1-ylpropane-1-sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CCC[N+]1=CC=CC=C1 REEBJQTUIJTGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N D-sucrose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-FBXJDJJESA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- BITMAWRCWSHCRW-PFQJHCPISA-N Raffinose Pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 BITMAWRCWSHCRW-PFQJHCPISA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical compound ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- BMRWNKZVCUKKSR-UHFFFAOYSA-N butane-1,2-diol Chemical compound CCC(O)CO BMRWNKZVCUKKSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diol Chemical compound OCCCCCCO XXMIOPMDWAUFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L lithium sulfate Inorganic materials [Li+].[Li+].[O-]S([O-])(=O)=O INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XKPJKVVZOOEMPK-UHFFFAOYSA-M lithium;formate Chemical compound [Li+].[O-]C=O XKPJKVVZOOEMPK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- PGFPZGKEDZGJQZ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylmethanamine oxide;dihydrate Chemical compound O.O.C[N+](C)(C)[O-] PGFPZGKEDZGJQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229940113115 polyethylene glycol 200 Drugs 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- PRWXGRGLHYDWPS-UHFFFAOYSA-L sodium malonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC([O-])=O PRWXGRGLHYDWPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012906 subvisible particle Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
- RBTVSNLYYIMMKS-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-aminoazetidine-1-carboxylate;hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)(C)OC(=O)N1CC(N)C1 RBTVSNLYYIMMKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229940074410 trehalose Drugs 0.000 description 1
- 229940074409 trehalose dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Abstract
本公开提供制造脂质纳米颗粒(LNP)配制物的方法以及所述方法所制造的LNP配制物。本公开也提供与所制造的LNP配制物相关的治疗和诊断用途。
Description
相关申请
本申请要求2020年8月6日提出申请的美国临时申请第63/062,369号、2021年1月29日提出申请的第63/143,703号及2021年7月28日提出申请的第63/226,395号的优先权和权益，各案的完整内容以引用的方式并入本文中。
发明领域
本公开提供产生核酸脂质纳米颗粒(LNP)配制物的新颖方法、该方法所产生的配制物以及相关治疗和/或诊断用途，例如涉及核酸脂质纳米颗粒将一种或多种治疗剂和/或预防剂，例如核酸递送至哺乳动物细胞或器官和/或在哺乳动物细胞或器官中产生多肽的方法。
背景技术
有效地靶向递送例如小分子药物、蛋白质和核酸的生物活性物质代表了一种持续的医学挑战。具体点说，由于此类物质的相对不稳定性和低细胞渗透性，使得核酸向细胞的递送变得困难。因此，需要开发促进例如核酸等治疗剂和预防剂递送至细胞的方法和组合物。
经证实，含脂质的纳米颗粒或脂质纳米颗粒、脂质体和脂质体复合物可有效作为例如小分子药物、蛋白质和核酸等生物活性物质转运至细胞和/或细胞内隔室中的媒剂。尽管多种此类含脂质的纳米颗粒已得到展示，但其安全性、功效和特异性仍有待改良。
发明内容
在一些方面，本公开提供一种制备空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成该空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些实施方案中，脂质溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述方法另外包括：
i-d)在步骤i-c)之后，过滤所述空LNP溶液；
任选地，步骤i-d)是在步骤iii)之前执行；并且
任选地，步骤i-d)是在步骤ii)之前执行。
在一些方面，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的空LNP配制物。
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的带负载的LNP溶液。
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约0.4或更小扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是通过毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的大部分是该群体的至少约70％。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中该群体是以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，该峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在小于该群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种包含本文所公开的空LNP群体的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种包含本文所公开的空LNP群体的空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种包含带负载的LNP的带负载的LNP溶液，该带负载的LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种包含带负载的LNP的带负载的LNP配制物，该带负载的LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所公开的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所公开的带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供本文所公开的带负载的LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供本文所公开的带负载的LNP配制物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供一种药物试剂盒，该试剂盒包含本文所述的空LNP、本文所述的空LNP溶液、本文所述的空LNP配制物、本文所述的带负载的LNP、本文所述的带负载的LNP溶液或本文所述的带负载的LNP配制物。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。尽管可将与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料用于本公开的实践或测试中，但下文描述适合方法和材料。本文所提到的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献均以全文引用的方式并入。当发生冲突时，将以本说明书(包括定义在内)为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性的，并且不意欲为限制性的。
本公开的其它特征和优势将从下文实施方式及权利要求书显而易知。
附图说明
本专利或申请档案含有至少一张彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的复本将在提出申请并支付必要费用后由专利局提供。
图1是展示带负载的LNP的直径随DSPC脂质添加的摩尔百分比变化的图。
图2是示出制备包含空LNP的空LNP溶液的一般方法的图。
图3是示出由包含空LNP的空LNP溶液制备LNP配制物的一般方法的图。
图4是示出制备LNP配制物的一般方法的图。
图5是示出包含纳米沉淀和处理步骤的制备空LNP配制物的一般方法的图。
图6是示出包含纳米沉淀和处理步骤的制备空LNP配制物的一般方法的图。
图7是示出包含负载和处理步骤的制备带负载的LNP配制物的一般方法的图。
图8是示出包含纳米沉淀、负载和处理步骤的制备带负载的LNP配制物的一般方法的图。
图9是示出包含纳米沉淀、负载和处理步骤的制备带负载的LNP配制物的一般方法的图。
图10是示出包含纳米沉淀、负载和处理步骤的制备带负载的LNP配制物的一般方法的图。
图11是示出包含纳米沉淀、负载和处理步骤的制备带负载的LNP配制物的一般方法的图。
具体实施方式
本发明的方法可包括制造空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物的一系列单元操作。两个单元操作是纳米沉淀以及超滤浓缩和渗滤。
纳米沉淀是这样一种单元操作，在该操作中，脂质纳米颗粒由其个别脂质组分，借助于动力学混合、随后成熟和连续稀释自组装得到。这一单元操作在技术上包含三个独立的步骤，所述步骤可分解为(i)水性输入物与有机输入物混合形成空脂质纳米颗粒溶液；(ii)将中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及(iii)在受控滞留时间之后进行稀释。由于这些步骤具有连续性，故它们将一起被视为一个单元操作。
在一些实施方案中，所述单元操作包括三个液体流的连续在线组合以及一个在线保持步骤：(i)水性缓冲液与脂质储备溶液混合；(ii)保持受控滞留时间；以及(iii)稀释纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述方法另外包括：iii-a)在处理带负载的LNP溶液之前(例如在将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至该带负载的LNP溶液中之前)，将该带负载的LNP溶液保持约5秒或更长时间。
在一些实施方案中，所述方法另外包括：iii-a)在处理该带负载的LNP溶液之前(例如在将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至带负载的LNP溶液中之前)，将带负载的LNP溶液保持约10秒或更长时间、约20秒或更长时间、约30秒或更长时间、约40秒或更长时间、约50秒或更长时间、约1分钟或更长时间、约5分钟或更长时间、约10分钟或更长时间、约15分钟或更长时间、约30分钟或更长时间或者约1小时或更长时间。
纳米沉淀本身是在适合规模的混合器中发生，该混合器被设计成允许水溶液与溶解于有机溶剂(例如乙醇)中的脂质储备溶液的连续、高能量组合。
在这整个操作中，所述水溶液和所述脂质储备溶液同时连续地流入混合硬件中。保持脂质溶解的有机溶剂含量(例如乙醇)急剧减小，并且脂质沉淀。因此，颗粒是在混合室中自组装的。
超滤浓缩和渗滤是脂质纳米颗粒溶液达到目标浓度并移除有机溶剂(例如乙醇)的单元操作。这是通过首先达到目标处理浓度，接着渗滤，然后(必要时)在有机溶剂(例如乙醇)完全移除后进行最终浓缩步骤来实现的。
本公开部分地基于以下发现：本文所公开的制造空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物的方法可影响和/或决定所述脂质纳米颗粒内某些组分的分布，并且这一分布可影响和/或决定所述脂质纳米颗粒的物理特性(例如稳定性)和/或生物特性(例如功效、细胞内递送、免疫原性)。
在一些实施方案中，本公开的方法减少由空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物制造的脂质纳米颗粒(LNP)或脂质纳米颗粒(LNP)配制物的非所需特性变化。在一些实施方案中，相较于通过可比较方法(例如不利用本文所公开的一个或多个步骤的方法)制造的LNP或LNP配制物，本公开的方法减少所制造的空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物脂质纳米颗粒(LNP)或脂质纳米颗粒(LNP)配制物的非所需特性变化。
在一些实施方案中，所述非所需特性变化是由施加于空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物脂质纳米颗粒配制物或脂质纳米颗粒上的应力引起的。在一些实施方案中，所述应力是在制造、纯化、包装、储存、运输和/或使用脂质纳米颗粒配制物或脂质纳米颗粒期间诱导的。在一些实施方案中，所述应力是热、剪切力、过度搅动、膜浓差极化(电荷状态变化)、脱水、冷冻应力、干燥应力、冷冻/解冻应力和/或雾化应力。在一些实施方案中，所述应力是在储存空LNP、带负载的LNP、空LNP溶液、带负载的LNP溶液和/或LNP配制物脂质纳米颗粒配制物或脂质纳米颗粒期间诱导的。
在一些实施方案中，所述非所需特性变化是LNP配制物的物理稳定性降低。在一些实施方案中，所述非所需特性变化是LNP配制物中杂质和/或亚可见颗粒的量增加，或LNP的平均大小增加。
在一些实施方案中，相较于通过如本文所公开的可比较方法制造的LNP配制物，本公开的方法减小所制造的LNP配制物的物理稳定性降低(例如LNP的平均大小增加)。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物的平均LNP直径是通过如本文所公开的可比较方法制造的LNP配制物的平均LNP直径的约99％或更低百分比、约98％或更低百分比、约97％或更低百分比、约96％或更低百分比、约95％或更低百分比、约90％或更低百分比、约85％或更低百分比、约80％或更低百分比、约75％或更低百分比、约70％或更低百分比、约65％或更低百分比、约60％或更低百分比、约55％或更低百分比、约50％或更低百分比、约40％或更低百分比、约30％或更低百分比、约20％或更低百分比或者约10％或更低百分比。
在一些实施方案中，LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径是约15nm至约150nm、约20nm至约125nm、约25nm至约100nm、约30nm至约80nm、约35nm至约70nm、约40nm至约60nm或约45nm至约50nm。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的空LNP的平均LNP直径是通过如本文所公开的可比较方法制造的空LNP的平均LNP直径的约99％或更低百分比、约98％或更低百分比、约97％或更低百分比、约96％或更低百分比、约95％或更低百分比、约90％或更低百分比、约85％或更低百分比、约80％或更低百分比、约75％或更低百分比、约70％或更低百分比、约65％或更低百分比、约60％或更低百分比、约55％或更低百分比、约50％或更低百分比、约40％或更低百分比、约30％或更低百分比、约20％或更低百分比或者约10％或更低百分比。
在一些实施方案中，空LNP的平均脂质纳米颗粒直径是约15nm至约150nm、约20nm至约125nm、约25nm至约100nm、约30nm至约80nm、约35nm至约70nm、约40nm至约60nm或约45nm至约50nm。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性高于通过如本文所公开的可比较方法所制造的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性比通过可比较方法制造的LNP配制物的功效、细胞内递送和/或免疫原性高约5％或更高百分比、约10％或更高百分比、约15％或更高百分比、约20％或更高百分比、约30％或更高百分比、约40％或更高百分比、约50％或更高百分比、约60％或更高百分比、约70％或更高百分比、约80％或更高百分比、约90％或更高百分比、约1倍或更高倍数、约2倍或更高倍数、约3倍或更高倍数、约4倍或更高倍数、约5倍或更高倍数、约10倍或更高倍数、约20倍或更高倍数、约30倍或更高倍数、约40倍或更高倍数、约50倍或更高倍数、约100倍或更高倍数、约200倍或更高倍数、约300倍或更高倍数、约400倍或更高倍数、约500倍或更高倍数、约1000倍或更高倍数、约2000倍或更高倍数、约3000倍或更高倍数、约4000倍或更高倍数、约5000倍或更高倍数或者约10000倍或更高倍数。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物展现的核酸表达量(例如mRNA表达量)高于通过可比较方法制造的LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物展现的核酸表达量(例如mRNA表达量)比通过可比较方法制造的LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)高约5％或更高百分比、约10％或更高百分比、约15％或更高百分比、约20％或更高百分比、约30％或更高百分比、约40％或更高百分比、约50％或更高百分比、约60％或更高百分比、约70％或更高百分比、约80％或更高百分比、约90％或更高百分比、约1倍或更高倍数、约2倍或更高倍数、约3倍或更高倍数、约4倍或更高倍数、约5倍或更高倍数、约10倍或更高倍数、约20倍或更高倍数、约30倍或更高倍数、约40倍或更高倍数、约50倍或更高倍数、约100倍或更高倍数、约200倍或更高倍数、约300倍或更高倍数、约400倍或更高倍数、约500倍或更高倍数、约1000倍或更高倍数、约2000倍或更高倍数、约3000倍或更高倍数、约4000倍或更高倍数、约5000倍或更高倍数或者约10000倍或更高倍数。
传统上，负载信使RNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)是通过高能混合mRNA水溶液和脂质的乙醇溶液制造的。水溶液是所述方法中使用的脂质的不良溶剂，脂质最常见的是阳离子脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质的混合物。因此，混合脂质会导致脂质自组装成纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒具有小于100nm的直径。
本发明的特征在于新颖的“床边(bedside)”和/或“定点照护(point-of-care)”配制物，由此mRNA可囊封于早期制备的预先形成的囊泡内。这一制造模式在临床供应的背景中具有优势，因为空LNP囊泡可分开制造和储存，随后在临床化合物环境中与mRNA重组。具体点说，床边配制物可促进增加的稳定性，因为mRNA和空的原材料可在独立优化的条件下储存。由于LNP制备是独立于货物(cargo)发生，故方法复杂性和产品成本可降低，由此能够为多种mRNA或活性剂构建体提供一种平台方法。空LNP加mRNA形式在本文中可称为“事后负载”(post hoc loading，PHL)、“事后添加”或“事后”。
本公开部分地基于以下努力：探究事后负载的基本原理，并在产生空LNP之后，在时间尺度上研究mRNA添加的影响和条件。在脂质沉淀之后mRNA添加的时间已向上变化七个数量级(例如1ms至10,000,000ms)，同时不会不利地影响配制物的物理化学特性(例如粒度、囊封、形态和/或结构完整性)。鉴于通常包括mRNA作为脂质沉淀反应的入口水性流内的关键组分，故物理化学特性的相似性出人意料且并不直观。此外，经常描述寡核苷酸参与早期颗粒组装步骤。由经验实验得到的结果表明，mRNA囊封在时间尺度上可显著长于脂质沉淀/颗粒形成，同时不会不利地影响LNP的物理化学特性。这些实验展示，脂质颗粒形成以及后续的mRNA囊封可分为两个反应步骤。本文所述的事后负载的概念可使得能够对每个步骤独立地进行控制和/或优化。此外，事后负载可使得能够在时间尺度(例如在空LNP制造之后数月或数年)上进行mRNA添加，由此使得能够制造定点照护配制物。
长期以来，尚未开发出以适合临床供应的规模产生预先形成的空脂质纳米颗粒(LNP)的工艺。本公开部分地基于确定有利于规模化制造的多个工艺参数，包括但不限于脂质浓度、PEG-脂质或聚合物脂质的量、温度、缓冲液组成(例如离子强度、pH、抗衡离子)以及乙醇含量，同时允许粒度控制。
本公开部分地基于以下发现：本文所公开的制造脂质纳米颗粒(LNP)或脂质纳米颗粒(LNP)配制物的方法可影响和/或决定所述脂质纳米颗粒内某些组分的分布，并且此分布可影响和/或决定所述脂质纳米颗粒的物理(例如稳定性)和/或生物(例如功效、细胞内递送、免疫原性)特性。
在一些实施方案中，本公开产生包含具有有利组分分布的脂质纳米颗粒的组合物。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物展现的核酸表达量(例如mRNA表达量)高于通过可比较方法制造的LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)。
在一些实施方案中，通过本公开的方法制造的LNP配制物展现的核酸表达量(例如mRNA表达量)比通过可比较方法制备的LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)高约5％或更高百分比、约10％或更高百分比、约15％或更高百分比、约20％或更高百分比、约30％或更高百分比、约40％或更高百分比、约50％或更高百分比、约60％或更高百分比、约70％或更高百分比、约80％或更高百分比、约90％或更高百分比、约1倍或更高倍数、约2倍或更高倍数、约3倍或更高倍数、约4倍或更高倍数、约5倍或更高倍数、约10倍或更高倍数、约20倍或更高倍数、约30倍或更高倍数、约40倍或更高倍数、约50倍或更高倍数、约100倍或更高倍数、约200倍或更高倍数、约300倍或更高倍数、约400倍或更高倍数、约500倍或更高倍数、约1000倍或更高倍数、约2000倍或更高倍数、约3000倍或更高倍数、约4000倍或更高倍数、约5000倍或更高倍数或约10000倍或更高倍数。
本公开的方法
在一些方面，本公开提供一种制备空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成该空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)将包含核酸的核酸溶液与该空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些实施方案中，所述脂质溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液不含PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中；以及
i-d)过滤该中间空LNP溶液，由此形成该包含空LNP的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中；
i-d)过滤该中间空LNP溶液，由此形成包含空LNP的空LNP溶液；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备空脂质纳米颗粒配制物的方法，该方法包括：
ii)处理包含空LNP的空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中；
i-d)过滤该中间空LNP溶液，由此形成包含空LNP的空LNP溶液；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)的方法，该方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将该中间空LNP溶液保持一定滞留时间；
i-c)将稀释溶液添加至该中间空LNP溶液中；
i-d)过滤该中间空LNP溶液，由此形成包含空LNP的空LNP溶液；
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与该空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种制备包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液的方法，该方法包括：
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)的方法，该方法包括：
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)；并且
iv)处理该带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
在一些实施方案中，所述方法另外包括：iii-a)在处理带负载的LNP溶液之前(例如在将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至带负载的LNP溶液中之前)，将带负载的LNP溶液保持约5秒或更长时间。
在一些实施方案中，所述方法另外包括：iii-a)在处理带负载的LNP溶液之前(例如在将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至带负载的LNP溶液中之前)，将带负载的LNP溶液保持约10秒或更长时间、约20秒或更长时间、约30秒或更长时间、约40秒或更长时间、约50秒或更长时间、约1分钟或更长时间、约5分钟或更长时间、约10分钟或更长时间、约15分钟或更长时间、约30分钟或更长时间、或约1小时或更长时间。
在一些实施方案中，步骤iii)包括将核酸溶液、空LNP溶液或空LNP配制物及负载缓冲溶液(例如具有低于可离子化脂质的pKa值的pH值)混合。
在一些实施方案中，所述方法另外包括在步骤iii)之前，将预负载缓冲溶液(例如具有低于可离子化脂质的pKa值的pH值)添加至空LNP溶液或空LNP配制物中。
在一些实施方案中，核酸溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，步骤i-a)至i-d)是在独立操作单元(例如独立反应装置)中执行。
在一些实施方案中，步骤i-a)至i-d)是在单一操作单元中执行。在一些实施方案中，步骤i-a)至i-d)是在连续流动装置中执行，使得步骤i-d)在步骤i-c)的下游，步骤i-c)在步骤i-b)的下游，步骤i-b)在步骤i-a)的下游。
在一些实施方案中，在步骤i-c)中，添加稀释溶液一次。
在一些实施方案中，在步骤i-c)中，稀释溶液是连续添加的。
在一些方面，本公开提供一种制造空脂质纳米颗粒(空LNP)的方法，该方法包括：i)混合步骤，包括将可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成空LNP，其中该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒配制物的方法，该方法包括：
i)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些实施方案中，所述脂质溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液不含PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，该方法包括：
i)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒配制物的方法，该方法包括：
i)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)；并且
ii)处理该空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些实施方案中，所述混合步骤包括将包含可离子化脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。
在一些方面，本公开提供一种制备带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的方法，该方法包括：ii)负载步骤，包括将核酸与空LNP混合，由此形成带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述负载步骤包括将包含核酸的核酸溶液与空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的LNP的带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)。
在一些实施方案中，空LNP或空LNP溶液在不进行保存或储存的情况下经历负载步骤。
在一些实施方案中，空LNP或空LNP溶液在保存一段时期之后经历负载步骤。
在一些实施方案中，空LNP或空LNP溶液在保存约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时或约24小时之后经历负载步骤。
在一些实施方案中，空LNP或空LNP溶液在储存约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约18小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约2年、约3年、约4年或约5年之后经历负载步骤。
在一些实施方案中，在形成之后，空LNP或空LNP溶液在不储存或保存一段时期的情况下经历负载步骤。
在一些方面，本公开提供一种方法，该方法另外包括：ii)处理空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
在一些方面，本公开提供一种方法，该方法另外包括：iv)处理带负载的LNP溶液，由此形成脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)。
与其它制造技术(例如薄膜再水合/挤出)相比，乙醇滴沉淀(ethanol-dropprecipitation)已成为用于产生核酸脂质纳米颗粒的工业标准方法。沉淀反应因其连续性、可扩展性和易用性而受到青睐。这些工艺通常使用高能混合器(例如T型接头、封闭式冲击射流、微流体混合器、涡旋混合器)以可控制方式将脂质(在乙醇中)引入适合反溶剂(即，水)中，由此驱动液体过饱和并自发沉淀成脂质颗粒。在一些实施方案中，所用涡旋混合器是描述于美国专利申请第62/799,636号和第62/886,592号中的涡旋混合器，所述美国专利申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，所用微流体混合器是描述于PCT申请第WO/2014/172045号中的微流体混合器，该PCT申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，所述混合步骤是用T形接头、封闭式冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行的。
在一些实施方案中，所述负载步骤是用T形接头、封闭式冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行的。
在一些实施方案中，所述混合步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
在一些实施方案中，所述负载步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，该第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，该第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至该空LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，该第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP中。
在一些实施方案中，所述处理带负载的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，该第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至该带负载的LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理带负载的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，该第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至带负载的LNP中。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括将包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，该第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，该第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，该第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至空LNP中。
在一些实施方案中，所述处理带负载的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，该第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至带负载的LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理带负载的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，该第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至带负载的LNP中。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括将包含PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG、约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG、约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至空LNP或带负载的LNP中。在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％、约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约0.1g/L至约10g/L、约0.5g/L至约9g/L、约0.75g/L至约8g/L、约1.0g/L至约7g/L、约2.0g/L至约6g/L、约3.0g/L至约5g/L或约4g/L至约4.5g/L的PEG脂质。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约0.1g/L、约0.5g/L、约1.0g/L、约1.5g/L、约2.0g/L、约2.5g/L、约3.0g/L、约3.5g/L、约4.0g/L、约4.5g/L、约5.0g/L、约5.5g/L、约6.0g/L、约6.5g/L、约7.0g/L、约7.5g/L、约8.0g/L、约8.5g/L、约9.0g/L、约9.5g/L或约10.0g/L的PEG脂质。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约1.75±0.5mol％、约1.75±0.4mol％、约1.75±0.3mol％、约1.75±0.2mol％或约1.75±0.1mol％(例如约1.75mol％)的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，在第一添加步骤之后，空LNP溶液(例如空LNP)包含约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％、约3.0mol％、约3.1mol％、约3.2mol％、约3.3mol％、约3.4mol％、约3.5mol％、约3.6mol％、约3.7mol％、约3.8mol％、约3.9mol％、约4.0mol％、约4.1mol％、约4.2mol％、约4.3mol％、约4.4mol％、约4.5mol％、约4.6mol％、约4.7mol％、约4.8mol％、约4.9mol％或约5.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，在第一添加步骤之后，带负载的LNP溶液(例如带负载的LNP)包含约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％、约3.0mol％、约3.1mol％、约3.2mol％、约3.3mol％、约3.4mol％、约3.5mol％、约3.6mol％、约3.7mol％、约3.8mol％、约3.9mol％、约4.0mol％、约4.1mol％、约4.2mol％、约4.3mol％、约4.4mol％、约4.5mol％、约4.6mol％、约4.7mol％、约4.8mol％、约4.9mol％或约5.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加缓冲剂，该缓冲剂选自柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、tris或其组合。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加浓度为20.0±2.0mM、20.0±2.0mM、20.0±1.5mM、20.0±1.0mM、20.0±0.9mM、20.0±0.8mM、20.0±0.7mM、20.0±0.6mM、20.0±0.5mM、20.0±0.4mM、20.0±0.3mM、20.0±0.2mM或20.0±0.1mM的缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加pH范围为约7.0至约9.5、约7.1至约9.2、约7.2至约9.0、约7.3至约8.8、约7.4至约8.6、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约7.5至约8.1、约7.5至约8.2、约7.5至约8.3、约7.5至约8.4或约7.5至约8.5的缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加pH值为或不低于约7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5的缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加乙酸盐缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约20mM的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加pH值为约7.5至约8.5的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤包括添加约20mM的pH值为约7.5至约8.5的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤另外包括添加PEG脂质。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加PEG。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG、约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG、约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％、约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约0.1g/L至约10g/L、约0.5g/L至约9g/L、约0.75g/L至约8g/L、约1.0g/L至约7g/L、约2.0g/L至约6g/L、约3.0g/L至约5g/L或约4g/L至约4.5g/L的PEG脂质。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约0.1g/L、约0.5g/L、约1.0g/L、约1.5g/L、约2.0g/L、约2.5g/L、约3.0g/L、约3.5g/L、约4.0g/L、约4.5g/L、约5.0g/L、约5.5g/L、约6.0g/L、约6.5g/L、约7.0g/L、约7.5g/L、约8.0g/L、约8.5g/L、约9.0g/L、约9.5g/L或约10.0g/L的PEG脂质。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约1.0±0.5mol％、约1.0±0.4mol％、约1.0±0.3mol％、约1.0±0.2mol％或约1.0±0.1mol％(例如约1.0mol％)的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括将约1.0mol％PEG脂质添加至空LNP或带负载的LNP中。
在一些实施方案中，在第二添加步骤之后，空LNP溶液(例如空LNP)包含约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％、约3.0mol％、约3.1mol％、约3.2mol％、约3.3mol％、约3.4mol％、约3.5mol％、约3.6mol％、约3.7mol％、约3.8mol％、约3.9mol％、约4.0mol％、约4.1mol％、约4.2mol％、约4.3mol％、约4.4mol％、约4.5mol％、约4.6mol％、约4.7mol％、约4.8mol％、约4.9mol％或约5.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，在第二添加步骤之后，带负载的LNP溶液(例如带负载的LNP)包含约1.0mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％、约3.0mol％、约3.1mol％、约3.2mol％、约3.3mol％、约3.4mol％、约3.5mol％、约3.6mol％、约3.7mol％、约3.8mol％、约3.9mol％、约4.0mol％、约4.1mol％、约4.2mol％、约4.3mol％、约4.4mol％、约4.5mol％、约4.6mol％、约4.7mol％、约4.8mol％、约4.9mol％或约5.0mol％的PEG脂质(例如PEG2k-DMG)。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加缓冲剂，该缓冲剂选自柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、tris或其组合。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加浓度为20.0±2.0mM、20.0±2.0mM、20.0±1.5mM、20.0±1.0mM、20.0±0.9mM、20.0±0.8mM、20.0±0.7mM、20.0±0.6mM、20.0±0.5mM、20.0±0.4mM、20.0±0.3mM、20.0±0.2mM或20.0±0.1mM的缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加pH范围为约7.0至约9.5、约7.1至约9.2、约7.2至约9.0、约7.3至约8.8、约7.4至约8.6、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约7.5至约8.1、约7.5至约8.2、约7.5至约8.3、约7.5至约8.4或约7.5至约8.5的缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加pH值为或不低于约7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5的缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加乙酸盐缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约20mM的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加pH值为约7.5至约8.5的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第二添加步骤包括添加约20mM的pH值为约7.5至约8.5的tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
在一些实施方案中，第二添加步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括至少一个选自以下的步骤：过滤、pH调节、缓冲液交换、稀释、透析、浓缩、冷冻、冻干、储存、澄清、添加冷冻保护剂、填充以及包装。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括pH调节。
在一些实施方案中，pH调节包括添加第二缓冲剂，该第二缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和tris缓冲剂。
在一些实施方案中，第一添加步骤是在pH调节之前执行的。
在一些实施方案中，第一添加步骤是在pH调节之后执行的。
在一些实施方案中，第二添加步骤是在pH调节之前执行的。
在一些实施方案中，第二添加步骤是在pH调节之后执行的。
在一些实施方案中，pH调节另外包括添加蔗糖。
在一些实施方案中，处理中间空LNP溶液、空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括过滤。
在一些实施方案中，过滤是切向流过滤(TFF)。
在一些实施方案中，过滤是灭菌或澄清过滤。
在一些实施方案中，过滤从中间空LNP溶液、空LNP溶液或带负载的LNP溶液中移除有机溶剂(例如醇或乙醇)。在一些实施方案中，过滤从中间空LNP溶液、空LNP溶液或带负载的LNP溶液中移除基本上全部有机溶剂(例如醇或乙醇)。在一些实施方案中，所得LNP溶液在储存或使用之前经历灭菌，例如通过过滤(例如通过0.1-0.5μm过滤器)灭菌。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括缓冲液交换。
在一些实施方案中，缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
在一些实施方案中，第一添加步骤是在缓冲液交换之前执行的。
在一些实施方案中，第一添加步骤是在缓冲液交换之后执行的。
在一些实施方案中，第二添加步骤是在缓冲液交换之前执行的。
在一些实施方案中，第二添加步骤是在缓冲液交换之后执行的。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括稀释。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括透析。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括浓缩。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括冷冻。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括冻干。
在一些实施方案中，冻干包括在约-100℃至约0℃、约-80℃至约-10℃、约-60℃至约-20℃、约-50℃至约-25℃或约-40℃至约-30℃的温度下冷冻带负载的LNP溶液。
在一些实施方案中，冻干另外包括干燥冷冻的带负载的LNP溶液以形成冻干的空LNP或冻干的带负载的LNP。
在一些实施方案中，干燥是在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行的。
在一些实施方案中，干燥是在约-35℃至约-15℃下执行的。
在一些实施方案中，干燥是在约室温至约25℃下执行的。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括储存。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括包装。
如本文所使用，“包装”可指将药物产品以其最终状态储存，或空LNP、带负载的LNP或LNP配制物在放入最终封装中之前的程序中储存。储存和/或包装模式包括但不限于无菌袋中冷藏、小瓶中的冷藏或冷冻配制物、小瓶和注射器中的冻干配制物等。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括：iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括：iib)过滤空LNP溶液或带负载的LNP溶液。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括：
iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中；并且
iic)过滤空LNP溶液或带负载的LNP溶液。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括以下步骤中的一个或多个：
iib)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中；
iic)将空LNP溶液或带负载的LNP溶液冻干，由此形成冻干的LNP组合物；
iid)储存该冻干的LNP组合物的空LNP溶液或带负载的LNP溶液；并且
iie)将缓冲溶液添加至空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物中，由此形成空LNP配制物或带负载的LNP配制物。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液中。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：iib)过滤空LNP溶液。
在一些实施方案中，处理空LNP溶液的步骤包括：
iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液中；并且
iic)过滤空LNP溶液。
所述方法的某些方面在PCT申请第WO/2020/160397号中有所描述，该案以引用的方式整体并入本文中。
混合步骤
本公开提供制造空脂质纳米颗粒(空LNP)的方法，该方法包括：i)混合步骤，包括将可离子化脂质与第一缓冲剂混合，由此形成空LNP，其中该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤包括将包含可离子化脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含空LNP的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。
在一些实施方案中，混合步骤另外包括缓冲液交换步骤。
在一些实施方案中，混合步骤不另外包括缓冲液交换步骤。
在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括将第一水性缓冲液交换为第二水性缓冲液。
在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括将第一水性缓冲液交换为第三水性缓冲液。
在一些实施方案中，缓冲液交换步骤包括将第二水性缓冲液交换为第三水性缓冲液。
在一些实施方案中，混合步骤另外包括过滤步骤。
在一些实施方案中，过滤步骤包括切向流过滤(TFF)。
在一些实施方案中，混合步骤不另外包括过滤步骤。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.01mol％至约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％至约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％至约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％至约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％至约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.5mol％至约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％至约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％至约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％至约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或约1.5mol％至约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0.05mol％至约0.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)的脂质溶液进行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0.1mol％至约0.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含小于约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或小于约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.01mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含超过约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或超过约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.01mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质并非PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是两亲性聚合物-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是PEG-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是表面活性剂。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是Brij或OH-PEG-硬脂酸酯。
在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含PEG脂质、磷脂和结构脂质的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含PEG脂质和磷脂的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含PEG脂质和结构脂质的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含磷脂和结构脂质的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含PEG脂质的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含磷脂的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含结构脂质的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-0.5mol％PEG脂质的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-10mol％PEG脂质的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约0-30mol％DSPC的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约15-50mol％SL-2和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约0-30mol％DSPC的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2和约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC和约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约15-50mol％SL-2和约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约30-60mol％IL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0-30mol％DSPC的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约15-50mol％SL-2的脂质溶液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约0.1-10mol％PEG2k-DMG的脂质溶液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约20至约70mg/mL可离子化脂质、约25至约65mg/mL可离子化脂质、约30至约60mg/mL可离子化脂质、约35至约55mg/mL可离子化脂质、约40至约50mg/mL可离子化脂质或约45至约50mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约5.0至约20mg/mL可离子化脂质、约7.5至约17.5mg/mL可离子化脂质、约10至约15mg/mL可离子化脂质或约12.5至约15mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约20mg/mL可离子化脂质、约25mg/mL可离子化脂质、约30mg/mL可离子化脂质、约35mg/mL可离子化脂质、约40mg/mL可离子化脂质、约45mg/mL可离子化脂质、约50mg/mL可离子化脂质、约55mg/mL可离子化脂质、约60mg/mL可离子化脂质、约65mg/mL可离子化脂质或约70mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约5.0mg/mL可离子化脂质、约7.5mg/mL可离子化脂质、约10mg/mL可离子化脂质、约12.5mg/mL可离子化脂质、约15mg/mL可离子化脂质、约17.5mg/mL可离子化脂质或约20mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约5至约35mg/mL结构脂质、约10至约30mg/mL结构脂质、约15至约25mg/mL结构脂质或约20至约25mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约1.0至约8.0mg/mL结构脂质、约2.0至约7.0mg/mL结构脂质、约3.0至约6.0mg/mL结构脂质或约4.0至约5.0mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约5mg/mL结构脂质、约10mg/mL结构脂质、约15mg/mL结构脂质、约20mg/mL结构脂质、约25mg/mL结构脂质、约30mg/mL结构脂质、约35mg/mL结构脂质或约40mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约1.0mg/mL结构脂质、约2.0mg/mL结构脂质、约3.0mg/mL结构脂质、约4.0mg/mL结构脂质、约5.0mg/mL结构脂质、约6.0mg/mL结构脂质、约7.0mg/mL结构脂质或约8.0mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约2.5至约20mg/mL磷脂、约5至约17.5mg/mL磷脂、约7.5至约15mg/mL磷脂或约10至约12.5mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约1.0至约5.0mg/mL磷脂、约1.5至约4.5mg/mL磷脂、约2.0至约4.0mg/mL磷脂、约2.5至约3.5mg/mL磷脂或约3.0至约3.5mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约2.5mg/mL磷脂、约5mg/mL磷脂、约7.5mg/mL磷脂、约10mg/mL磷脂、约12.5mg/mL磷脂、约15mg/mL磷脂、约17.5mg/mL磷脂或约20mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约1.0mg/mL磷脂、约1.5mg/mL磷脂、约2.0mg/mL磷脂、约2.5mg/mL磷脂、约3.0mg/mL磷脂、约3.5mg/mL磷脂、约4.5mg/mL磷脂或约5.0mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.05至约5.5mg/mL PEG脂质、约0.1至约5.0mg/mL PEG脂质、约0.25至约4.5mg/mL PEG脂质、约0.5至约4.0mg/mL PEG脂质、约1.0至约3.5mg/mL PEG脂质、约1.5至约3.0mg/mL PEG脂质或约2.0至约2.5mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约0.05mg/mLPEG脂质、约0.1mg/mL PEG脂质、约0.25mg/mL PEG脂质、约0.5mg/mL PEG脂质、约1.0mg/mLPEG脂质、约1.5mg/mL PEG脂质、约2.5mg/mL PEG脂质、约3.0mg/mL PEG脂质、约3.5mg/mLPEG脂质、约4.0mg/mL PEG脂质、约4.5mg/mL PEG脂质或约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约10至约20mg/mL可离子化脂质；约2.0至约8.0mg/mL结构脂质；约1.0至约5.0mg/mL磷脂；以及约0.1至约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是以约5mg/mL至约80mg/mL、约6mg/mL至约70mg/mL、约7mg/mL至约60mg/mL、约8mg/mL至约50mg/mL、约9mg/mL至约40mg/mL、约10mg/mL至约30mg/mL、约15mg/mL至约25mg/mL或约20mg/mL至约25mg/mL的总脂质浓度执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约70mg/mL或约80mg/mL的总脂质浓度执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约30mg/mL至约60mg/mL可离子化脂质；约10mg/mL至约30mg/mL结构脂质；约5mg/mL至约15mg/mL磷脂；以及约0.1mg/mL至约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约30mg/mL至约60mg/mL IL-1；约10mg/mL至约30mg/mL SL-2；约5mg/mL至约15mg/mL DSPC；以及约0.1mg/mL至约5.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约30mg/mL至约60mg/mL IL-2；约10mg/mL至约30mg/mL SL-2；约5mg/mL至约15mg/mL DSPC；以及约0.1mg/mL至约5.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL可离子化脂质；约4mg/mL至约8mg/mL结构脂质；约2mg/mL至约5mg/mL磷脂；以及约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL IL-1；约4mg/mL至约8mg/mL SL-2；约2mg/mL至约5mg/mL DSPC；以及约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，混合步骤是用脂质溶液执行的，该脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL IL-2；约4mg/mL至约8mg/mL SL-2；约2mg/mL至约5mg/mL DSPC；以及约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，混合步骤是用选自以下的第一缓冲剂执行的：硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠和HEPES。在一些实施方案中，第一缓冲剂是乙酸钠。
在一些实施方案中，混合步骤是用第一水性缓冲液执行的，该第一水性缓冲液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的水性缓冲液。
在一些实施方案中，混合步骤是用第一水性缓冲液执行的，该第一水性缓冲液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的水性缓冲液。
在一些实施方案中，混合步骤是用第一水性缓冲液执行的，该第一水性缓冲液包含浓度为5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM的水性缓冲液。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含浓度为约5mM的水性缓冲液的第一水性缓冲液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用另外包含蔗糖的第一水性缓冲液执行的。
在一些实施方案中，存在的蔗糖的浓度是约10g/L至约1000g/L、约25g/L至约950g/L、约50g/L至约900g/L、约75g/L至约850g/L、约100g/L至约800g/L、约150g/L至约750g/L、约200g/L至约700g/L、约250g/L至约650g/L、约300g/L至约600g/L、约350g/L至约550g/L、约400g/L至约500g/L及约450g/L至约500g/L。
在一些实施方案中，存在的蔗糖的浓度是约10g/L、约25g/L、约50g/L、约75g/L、约100g/L、约150g/L、约200g/L、约250g/L、约300g/L、约350g/L、约400g/L、约450g/L、约500g/L、约550g/L、约600g/L、约650g/L、约700g/L、约750g/L、约800g/L、约850g/L、约900g/L、约950g/L或约1000g/L。
在一些实施方案中，混合步骤是在约2.0至约9.0、约2.5至约8.5、约2.6至约8.4、约2.7至约8.3、约2.8至约8.2、约2.9至约8.1、约3.0至约8.0、约3.2至约7.8、约3.4至约7.6、约3.6至约7.4、约3.8至约7.2、约4.0至约7.0、约4.1至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.4、约4.4至约6.2、约4.5至约6.0、约4.6至约5.9、约4.7至约5.8、约4.8至约5.7、约4.9至约5.6、约5.0至约5.5、约5.1至约5.4或约5.2至约5.3的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在约2.0、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.2、约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.8、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4或约8.5的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在小于约2.0、小于约2.5、小于约2.6、小于约2.7、小于约2.8、小于约2.9、小于约3.0、小于约3.2、小于约3.4、小于约3.6、小于约3.8、小于约4.0、小于约4.1、小于约4.2、小于约4.3、小于约4.4、小于约4.5、小于约4.6、小于约4.7、小于约4.8、小于约4.9、小于约5.1、小于约5.2、小于约5.3、小于约5.4、小于约5.5、小于约5.6、小于约5.7、小于约5.8、小于约5.9、小于约6.0、小于约6.2、小于约6.4、小于约6.6、小于约6.8、小于约7.0、小于约7.2、小于约7.4、小于约7.6、小于约7.8、小于约8.0、小于约8.1、小于约8.2、小于约8.3、小于约8.4、小于约8.5或小于约9.0的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在约2.0或更小、约2.5或更小、约2.6或更小、约2.7或更小、约2.8或更小、约2.9或更小、约3.0或更小、约3.2或更小、约3.4或更小、约3.6或更小、约3.8或更小、约4.0或更小、约4.1或更小、约4.2或更小、约4.3或更小、约4.4或更小、约4.5或更小、约4.6或更小、约4.7或更小、约4.8或更小、约4.9或更小、约5.1或更小、约5.2或更小、约5.3或更小、约5.4或更小、约5.5或更小、约5.6或更小、约5.7或更小、约5.8或更小、约5.9或更小、约6.0或更小、约6.2或更小、约6.4或更小、约6.6或更小、约6.8或更小、约7.0或更小、约7.2或更小、约7.4或更小、约7.6或更小、约7.8或更小、约8.0或更小、约8.1或更小、约8.2或更小、约8.3或更小、约8.4或更小、约8.5或更小、或约9.0或更小的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在大于约2.0、大于约2.5、大于约2.6、大于约2.7、大于约2.8、大于约2.9、大于约3.0、大于约3.2、大于约3.4、大于约3.6、大于约3.8、大于约4.0、大于约4.1、大于约4.2、大于约4.3、大于约4.4、大于约4.5、大于约4.6、大于约4.7、大于约4.8、大于约4.9、大于约5.1、大于约5.2、大于约5.3、大于约5.4、大于约5.5、大于约5.6、大于约5.7、大于约5.8、大于约5.9、大于约6.0、大于约6.2、大于约6.4、大于约6.6、大于约6.8、大于约7.0、大于约7.2、大于约7.4、大于约7.6、大于约7.8、大于约8.0、大于约8.1、大于约8.2、大于约8.3、大于约8.4、大于约8.5或大于约9.0的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在约2.0或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大、约3.0或更大、约3.2或更大、约3.4或更大、约3.6或更大、约3.8或更大、约4.0或更大、约4.1或更大、约4.2或更大、约4.3或更大、约4.4或更大、约4.5或更大、约4.6或更大、约4.7或更大、约4.8或更大、约4.9或更大、约5.1或更大、约5.2或更大、约5.3或更大、约5.4或更大、约5.5或更大、约5.6或更大、约5.7或更大、约5.8或更大、约5.9或更大、约6.0或更大、约6.2或更大、约6.4或更大、约6.6或更大、约6.8或更大、约7.0或更大、约7.2或更大、约7.4或更大、约7.6或更大、约7.8或更大、约8.0或更大、约8.1或更大、约8.2或更大、约8.3或更大、约8.4或更大、约8.5或更大、或约9.0或更大的pH值(例如通过USP<791>测量)下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的pH值下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在8.0±2.0、8.0±1.5、8.0±1.0、8.0±0.9、8.0±0.8、8.0±0.7、8.0±0.6、8.0±0.5、8.0±0.4、8.0±0.3、8.0±0.2或8.0±0.1的pH值下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用pH值低于可离子化脂质的pKa值的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用具有约5.0的pH值的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含乙酸盐缓冲剂的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约5mM乙酸钠的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约pH 5.0的乙酸钠的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约pH 5.0的约5mM乙酸钠的第一水性缓冲液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用pH值高于可离子化脂质的pKa值的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用具有约8.0的pH值的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含磷酸盐缓冲剂的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含约pH 8.0的磷酸盐缓冲剂的第一水性缓冲液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用包含pH 5.0的7.155mM浓度的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含7.15mM乙酸钠的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含pH 5.0的7.15mM乙酸钠的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含pH 5.0的5mM乙酸钠和200g/L蔗糖的第一水性缓冲液执行的。在一些实施方案中，混合步骤是用包含pH 5.0的7.15mM乙酸钠和200g/L蔗糖的第一水性缓冲液执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用T形接头、封闭式冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是用带倒钩的三通管(barbed tee)执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约100至约500rpm、约150至约450rpm、约175至约400rpm、约200至约350rpm、约225至约300rpm或约250至约275rpm的混合速度执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约100rpm、约125rpm、约150rpm、约175rpm、约200rpm、约225rpm、约250rpm、约275rpm、约300rpm、约325rpm、约350rpm、约400rpm、约450rpm或约500rpm的混合速度执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min至约300mL/min、约5mL/min至约250mL/min、约10mL/min至约200mL/min、约25mL/min至约175mL/min、约50mL/min至约150mL/min、约75mL/min至约125mL/min或约100mL/min至约125mL/min的流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的脂质溶液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的脂质溶液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的核酸溶液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第一水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第一水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第二水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第二水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第三水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是以约1mL/min、约5mL/min、约10mL/min、约25mL/min、约50mL/min、约75mL/min、约100mL/min、约125mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约250mL/min或约300mL/min的第三水性缓冲液流动速率执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在小于约50℃、小于约45℃、小于约50℃、小于约35℃、小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤是在约50℃、约45℃、约50℃、约35℃、约30℃、约28℃、约26℃、约24℃、约22℃、约20℃或约环境温度下执行的。
在一些实施方案中，混合步骤执行约5分钟至约500分钟、约10分钟至约480分钟、约20分钟至约420分钟、约30分钟至约390分钟、约40分钟至约360分钟、约60分钟至约330分钟、约80分钟至约300分钟、约100分钟至约270分钟、约120分钟至约240分钟、约150分钟至约210分钟或约150分钟至约180分钟。
在一些实施方案中，混合步骤执行约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约60分钟、约75分钟、约80分钟、约90分钟、约105分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟、约210分钟、约240分钟、约270分钟、约300分钟、约330分钟、约360分钟、约390分钟、约420分钟、约450分钟、约480分钟或约500分钟。
在一些实施方案中，混合步骤执行不到约5分钟、不到约10分钟、不到约15分钟、不到约20分钟、不到约30分钟、不到约40分钟、不到约45分钟、不到约50分钟、不到约60分钟、不到约75分钟、不到约80分钟、不到约90分钟、不到约105分钟、不到约120分钟、不到约150分钟、不到约180分钟、不到约210分钟、不到约240分钟、不到约270分钟、不到约300分钟、不到约330分钟、不到约360分钟、不到约390分钟、不到约420分钟、不到约450分钟、不到约480分钟或不到约500分钟。
在一些实施方案中，混合步骤执行超过约5分钟、超过约10分钟、超过约15分钟、超过约20分钟、超过约30分钟、超过约40分钟、超过约45分钟、超过约50分钟、超过约60分钟、超过约75分钟、超过约80分钟、超过约90分钟、超过约105分钟、超过约120分钟、超过约150分钟、超过约180分钟、超过约210分钟、超过约240分钟、超过约270分钟、超过约300分钟、超过约330分钟、超过约360分钟、超过约390分钟、超过约420分钟、超过约450分钟、超过约480分钟或超过约500分钟。
保持步骤
在一些实施方案中，滞留时间小于约1秒。
在一些实施方案中，滞留时间是约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约6秒、约7秒、约8秒、约9秒、约10秒、约11秒、约12秒、约13秒、约14秒、约15秒、约16秒、约17秒、约18秒、约19秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒或约1分钟。
在一些实施方案中，滞留时间是约30±20秒、约30±15秒、约30±10秒、约30±9秒、约30±8秒、约30±7秒、约30±6秒、约30±5秒、约30±4秒、约30±3秒、约30±2秒、约30±1秒(例如约30秒)。
在一些实施方案中，滞留时间是约15±10秒、约15±9秒、约15±8秒、约15±7秒、约15±6秒、约15±5秒、约15±4秒、约15±3秒、约15±2秒、约15±1秒(例如约15秒)。
在一些实施方案中，滞留时间是约10±5秒、约10±4秒、约10±3秒、约10±2秒、约10±1秒(例如约10秒)。
在一些实施方案中，滞留时间是约5±3秒、约5±2秒、约5±1秒(例如约5秒)。
在一些实施方案中，滞留时间是约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时。
在一些实施方案中，滞留时间被配置成使得空LNP的平均直径比中间空LNP的平均直径要大约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，滞留时间被配置成使得空LNP的平均直径比中间空LNP的平均直径要大约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm或约1000nm。
在一些实施方案中，滞留时间被配置成使得空LNP的平均直径为约50nm至约70nm。
在一些实施方案中，滞留时间被配置成使得空LNP的平均直径为约60±30nm、约60±20nm、约60±15nm、约60±10nm、约60±9nm、约60±8nm、约60±7nm、约60±6nm、约60±5nm、约60±4nm、约60±3nm、约60±2nm或约60±1nm。
在一些实施方案中，滞留时间被配置成使得空LNP的平均直径为约50±30nm、约50±20nm、约50±15nm、约50±10nm、约50±9nm、约50±8nm、约50±7nm、约50±6nm、约50±5nm、约50±4nm、约50±3nm、约50±2nm或约50±1nm。
稀释步骤
在一些实施方案中，稀释溶液是水溶液。
在一些实施方案中，稀释溶液是包含第二缓冲剂的水性缓冲溶液。
在一些实施方案中，第二缓冲剂与第一缓冲剂相同。在一些实施方案中，第一缓冲剂和第二缓冲剂均为乙酸盐(例如乙酸钠)。
在一些实施方案中，第二缓冲剂不同于第一缓冲剂。在一些实施方案中，第一缓冲剂是磷酸盐(例如磷酸钠)，而第二缓冲剂是乙酸盐(例如乙酸钠)。
在一些实施方案中，包含第二缓冲剂的水性缓冲溶液是水性乙酸盐缓冲溶液。
在一些实施方案中，包含第二缓冲剂的水性缓冲溶液是水性乙酸钠缓冲溶液。
在一些实施方案中，第二缓冲剂是乙酸盐。
在一些实施方案中，第二缓冲剂是乙酸钠。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含约7±4mM、约7±3mM、约7±2mM、约7±1mM、约7±0.9mM、约7±0.8mM、约7±0.7mM、约7±0.6mM、约7±0.5mM、约7±0.4mM、约7±0.3mM、约7±0.2mM或约7±0.1mM的乙酸钠。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含约5±2mM、约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值与包含第一缓冲剂的水溶液的pH值基本上相同。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值低于包含第一缓冲剂的水溶液的pH值。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值低于空LNP中可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值比包含第一缓冲剂的水溶液的pH值低约3.0±2.0、3.0±1.5、3.0±1.0、3.0±0.9、3.0±0.8、3.0±0.7、3.0±0.6、3.0±0.5、3.0±0.4、3.0±0.3、3.0±0.2或3.0±0.1。
在一些实施方案中，包含第一缓冲剂的水溶液的pH值是约8.0±2.0、8.0±1.5、8.0±1.0、8.0±0.9、8.0±0.8、8.0±0.7、8.0±0.6、8.0±0.5、8.0±0.4、8.0±0.3、8.0±0.2或8.0±0.1。
在一些实施方案中，包含第一缓冲剂的水溶液的pH值是约5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值是约5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，稀释溶液包含乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，稀释溶液包含pH值低于空LNP中可离子化脂质的pKa值的乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，稀释溶液包含约pH 5.0的乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，稀释溶液包含约5mM乙酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，稀释溶液包含约pH 5.0的约5mM的乙酸盐缓冲剂。
在一些实施方案中，稀释溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，稀释溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液不含PEG脂质。
水性缓冲溶液、脂质溶液、稀释溶液、预负载或负载缓冲溶液之间的关系。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质溶液不含PEG脂质，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且步骤iii)包括将核酸溶液、空LNP溶液或空LNP配制物及负载缓冲溶液(例如具有低于可离子化脂质的pKa值的pH值)混合。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且所述方法另外包括在步骤iii)之前，将预负载缓冲溶液(例如具有低于可离子化脂质的pKa值的pH值)添加至空LNP溶液或空LNP配制物中。
在一些实施方案中，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且核酸溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，脂质溶液不含PEG脂质，水性缓冲溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，稀释溶液的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液另外包含PEG脂质。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，脂质溶液不含PEG脂质，水性缓冲溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
中间空LNP与空LNP之间的关系
在一些实施方案中，空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度低于中间空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度。
在一些实施方案中，空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度比中间空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度低约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。
在一些实施方案中，空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度是约15±10％、约15±9％、约15±8％、约15±7％、约15±6％、约15±5％、约15±4％、约15±3％、约15±2％或约15±1％。
在一些实施方案中，中间空LNP溶液中醇(例如乙醇)的浓度是约30±10％、约30±9％、约30±8％、约30±7％、约30±6％、约30±5％、约30±4％、约30±3％、约30±2％或约30±1％。
在一些实施方案中，空LNP溶液的pH值与中间空LNP溶液的pH值基本上相同。
在一些实施方案中，空LNP溶液的pH值与中间空LNP溶液的pH值的差异小于约1.0、小于约0.9、小于约0.8、小于约0.7、小于约0.6、小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1、小于约0.05、小于约0.04、小于约0.03、小于约0.02或小于约0.01。
在一些实施方案中，空LNP溶液的pH值低于中间空LNP溶液的pH值。
在一些实施方案中，空LNP溶液的pH值比中间空LNP溶液的pH值低约3.0±2.0、3.0±1.5、3.0±1.0、3.0±0.9、3.0±0.8、3.0±0.7、3.0±0.6、3.0±0.5、3.0±0.4、3.0±0.3、3.0±0.2或3.0±0.1。
在一些实施方案中，中间空LNP溶液的pH值是约8.0±2.0、8.0±1.5、8.0±1.0、8.0±0.9、8.0±0.8、8.0±0.7、8.0±0.6、8.0±0.5、8.0±0.4、8.0±0.3、8.0±0.2或8.0±0.1。
在一些实施方案中，中间空LNP溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，空LNP溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，空LNP是基本上稳定的(例如对加工步骤，或对冷冻和/或储存稳定)。
在一些实施方案中，空LNP的平均直径比中间空LNP的平均直径要大约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1000％。
在一些实施方案中，空LNP的平均直径比中间空LNP的平均直径要大约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm或约1000nm。
在一些实施方案中，空LNP的平均直径是约50nm至约70nm。
在一些实施方案中，空LNP的平均直径是约60±30nm、约60±20nm、约60±15nm、约60±10nm、约60±9nm、约60±8nm、约60±7nm、约60±6nm、约60±5nm、约60±4nm、约60±3nm、约60±2nm或约60±1nm。
脂质溶液
在一些实施方案中，本公开的方法提供脂质溶液。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液可另外包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或其任何组合。
在一些实施方案中，所述脂质溶液可另外包含囊封剂。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度范围为约0.01-1.0mg/mL、0.01-0.9mg/mL、0.01-0.8mg/mL、0.01-0.7mg/mL、0.01-0.6mg/mL、0.01-0.5mg/mL、0.01-0.4mg/mL、0.01-0.3mg/mL、0.01-0.2mg/mL、0.01-0.1mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-0.9mg/mL、0.05-0.8mg/mL、0.05-0.7mg/mL、0.05-0.6mg/mL、0.05-0.5mg/mL、0.05-0.4mg/mL、0.05-0.3mg/mL、0.05-0.2mg/mL、0.05-0.1mg/mL、0.1-1.0mg/mL、0.2-0.9mg/mL、0.3-0.8mg/mL、0.4-0.7mg/mL或0.5-0.6mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、4.0mg/mL、3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.09mg/mL、0.08mg/mL、0.07mg/mL、0.06mg/mL或0.05mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度大于约0.1mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL、8.0mg/mL、9.0mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL或30mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度范围为约0.1-20.0mg/mL、0.1-19mg/mL、0.1-18mg/mL、0.1-17mg/mL、0.1-16mg/mL、0.1-15mg/mL、0.1-14mg/mL、0.1-13mg/mL、0.1-12mg/mL、0.1-11mg/mL、0.5-10.0mg/mL、0.5-9mg/mL、0.5-8mg/mL、0.5-7mg/mL、0.5-6mg/mL、0.5-5.0mg/mL、0.5-4mg/mL、0.5-3mg/mL、0.5-2mg/mL、0.5-1mg/mL、1-20mg/mL、1-15mg/mL、1-12mg/mL、1-10mg/mL或1-8mg/mL的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为至多约30mg/mL、25mg/mL、20mg/mL、18mg/mL、16mg/mL、15mg/mL、14mg/mL、12mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、5.0mg/mL、4.0mg/mL、3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.09mg/mL、0.08mg/mL、0.07mg/mL、0.06mg/mL或0.05mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含在水性缓冲液和/或有机溶液中的可离子化脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒溶液可另外包含缓冲剂和/或盐。例示性适合缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的缓冲剂。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒溶液包含浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90nM或100nM的盐。
在一些实施方案中，所述脂质溶液的pH值范围可以是约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，所述脂质溶液的pH值范围可以是约7.0至约8.0、约7.1至约7.8、约7.2至约7.6或约7.3至约7.5。
在一些实施方案中，适合脂质溶液的pH值可以是或不大于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
在一些实施方案中，相对于脂质溶液的总体积，所述脂质溶液包含约1体积％至约50体积％的第一有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米颗粒配制物的总体积，所述脂质溶液包含约2体积％至约45体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米颗粒配制物的总体积，所述脂质溶液包含约3体积％至约40体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米颗粒配制物的总体积，所述脂质溶液包含约4体积％至约35体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于脂质纳米颗粒配制物的总体积，所述脂质溶液包含约5体积％至约33体积％的有机溶剂。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约30mol％至约70mol％的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含30mol％至约50mol％的结构脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约5mol％至约15mol％的磷脂。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约0.1mol％至约1.0mol％的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约30mol％至约70mol％的IL-1。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约30mol％至约70mol％的IL-2。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约30mol％至约50mol％的SL-2。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约5mol％至约15mol％的DSPC。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约0.1mol％至约1.0mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约30mol％至约70mol％的IL-1；
(b)30mol％至约50mol％的SL-2；
(c)约5mol％至约15mol％的DSPC；以及
(d)约0.1mol％至约1.0mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约30mol％至约70mol％的IL-2；
(b)30mol％至约50mol％的SL-2；
(c)约5mol％至约15mol％的DSPC；以及
(d)约0.1mol％至约1.0mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-1；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述脂质溶液包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂是醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂是乙醇。
缓冲剂
在一些实施方案中，本公开的方法提供缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的方法提供第一缓冲剂、第二缓冲剂、第三缓冲剂或其组合。
在一些实施方案中，第一缓冲剂包含第一水性缓冲液。在一些实施方案中，适合溶液可另外包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。例示性适合水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的水性缓冲液。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，第一缓冲剂包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。
在一些实施方案中，第一缓冲剂还可另外包含蔗糖。
在一些实施方案中，第一缓冲剂可包含约2％至约20％的蔗糖。在一些实施方案中，第一缓冲剂可包含约4％至约15％的蔗糖。在一些实施方案中，第一缓冲剂可包含约5％至约10％的蔗糖。
在一些实施方案中，第一缓冲剂的pH值可以是约4.0至约8.5、约4.1至约8.4、约4.3至约8.2、约4.5至约8.0、约4.6至约7.8、约4.8至约7.6、约5.0至约7.4、约5.5至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，第一缓冲剂的pH值可以是或不大于约4.0、4.1、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含大于约1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约2mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约15mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；大于约25mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；或大于约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约1mM至约30mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；约2mM至约20mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；约3mM至约10mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；约4mM至约8mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris；或约5mM至约6mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM乙酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM磷酸盐。
在一些实施方案中，第一缓冲剂的pH值可以是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，第一缓冲剂的pH值可以是8.0±2.0、8.0±1.5、8.0±1.0、8.0±0.9、8.0±0.8、8.0±0.7、8.0±0.6、8.0±0.5、8.0±0.4、8.0±0.3、8.0±0.2或8.0±0.1。
在一些实施方案中，第一缓冲剂是pH值为5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的乙酸盐。
在一些实施方案中，第一缓冲剂是pH值为8.0±2.0、8.0±1.5、8.0±1.0、8.0±0.9、8.0±0.8、8.0±0.7、8.0±0.6、8.0±0.5、8.0±0.4、8.0±0.3、8.0±0.2或8.0±0.1的磷酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含乙酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5mM乙酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含pH值为约5.0的乙酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含约5mM乙酸盐，其中该水性缓冲溶液的pH值为约5.0。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含磷酸盐。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液包含磷酸盐，其中该水性缓冲溶液的pH值为约8.0。
在一些实施方案中，第一水性缓冲液具有德拜屏蔽长度(Debye screen length)。在一些实施方案中，第一水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约0.1nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.3至约7nm、约0.4nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.75nm至约4nm或约1nm至约3nm。在一些实施方案中，第一水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约1nm至约3nm。
在一些实施方案中，第二缓冲剂包含第二水性缓冲液。在一些实施方案中，适合溶液可另外包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。例示性适合水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的水性缓冲液。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，第二缓冲剂包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。
在一些实施方案中，第二缓冲剂还可另外包含蔗糖。
在一些实施方案中，第二缓冲剂可包含约2％至约20％的蔗糖。在一些实施方案中，第二缓冲剂可包含约4％至约15％的蔗糖。在一些实施方案中，第二缓冲剂可包含约5％至约10％的蔗糖。
在一些实施方案中，第二缓冲剂的pH值范围可以是约4.0至约8.5、约4.1至约8.4、约4.3至约8.2、约4.5至约8.0、约4.6至约7.8、约4.8至约7.6、约5.0至约7.4、约5.5至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，第二缓冲剂的pH值可以是或不大于约4.0、4.1、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4及8.5。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液是tris缓冲液。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液是乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液是磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液是乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的组合。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液的pH值范围为约4.5至约9.0、约5.0至约8.8、约5.5至约8.6、约6.0至约8.4、约6.5至约8.2、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液的pH值是约7.5。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含tris，并且第二水性缓冲液的pH值是约7.5。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含乙酸盐，并且第二水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含磷酸盐，并且第二水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液包含乙酸盐和磷酸盐的组合，并且第二水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第二水性缓冲液具有德拜屏蔽长度。在一些实施方案中，第二水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约0.1nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.3至约7nm、约0.4nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.75nm至约4nm或约1nm至约3nm。在一些实施方案中，第二水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约1nm至约3nm。
在一些实施方案中，第三缓冲剂包含第三水性缓冲液。在一些实施方案中，适合溶液可另外包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。例示性适合水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的水性缓冲液。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，第三缓冲剂包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。
在一些实施方案中，第三缓冲剂还可另外包含蔗糖。
在一些实施方案中，第三缓冲剂可包含约2％至约20％的蔗糖。在一些实施方案中，第三缓冲剂可包含约4％至约15％的蔗糖。在一些实施方案中，第三缓冲剂可包含约5％至约10％的蔗糖。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液的pH值范围可以是约4.0至约8.5、约4.1至约8.4、约4.3至约8.2、约4.5至约8.0、约4.6至约7.8、约4.8至约7.6、约5.0至约7.4、约5.5至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，第三缓冲剂的pH值可以是或不大于约4.0、4.1、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4及8.5。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液是tris缓冲液。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液是乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液是磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液是乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的组合。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液的pH值范围为约4.5至约9.0、约5.0至约8.8、约5.5至约8.6、约6.0至约8.4、约6.5至约8.2、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液的pH值是约7.5。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含tris，并且第三水性缓冲液的pH值是约7.5。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含乙酸盐，并且第三水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含磷酸盐，并且第三水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液包含乙酸盐和磷酸盐的组合，并且第三水性缓冲液的pH值是约5.0。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液的pH值是约7.5。
在一些实施方案中，第三水性缓冲液具有德拜屏蔽长度。在一些实施方案中，第三水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约0.1nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.3至约7nm、约0.4nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.75nm至约4nm或约1nm至约3nm。在一些实施方案中，第三水性缓冲液的德拜屏蔽长度是约1nm至约3nm。
核酸和活性剂溶液
在一些实施方案中，本公开的方法提供包含治疗剂和/或预防剂的活性剂溶液。所述治疗剂和/或预防剂可呈溶液形式提供以混合或添加至脂质纳米颗粒或脂质纳米颗粒溶液中，由此使该治疗剂和/或预防剂可囊封于脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述治疗剂和/或预防剂是能够引起免疫反应的疫苗或化合物。
在一些实施方案中，所述治疗剂和/或预防剂是核酸。
在一些实施方案中，本公开的方法提供包含核酸的核酸溶液。所述核酸可呈溶液形式提供以混合或添加至脂质纳米颗粒或脂质纳米颗粒溶液中，由此使该核酸可囊封于脂质纳米颗粒中。
在一些实施方案中，所述核酸溶液包含打算以各种浓度囊封的核酸。在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度大于约0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL或2.0mg/mL的核酸。在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度范围为约0.01-1.0mg/mL、0.01-0.9mg/mL、0.01-0.8mg/mL、0.01-0.7mg/mL、0.01-0.6mg/mL、0.01-0.5mg/mL、0.01-0.4mg/mL、0.01-0.3mg/mL、0.01-0.2mg/mL、0.01-0.1mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-0.9mg/mL、0.05-0.8mg/mL、0.05-0.7mg/mL、0.05-0.6mg/mL、0.05-0.5mg/mL、0.05-0.4mg/mL、0.05-0.3mg/mL、0.05-0.2mg/mL、0.05-0.1mg/mL、0.1-1.0mg/mL、0.2-0.9mg/mL、0.3-0.8mg/mL、0.4-0.7mg/mL或0.5-0.6mg/mL的核酸。在一些实施方案中，核酸溶液可包含浓度为至多约5.0mg/mL、4.0mg/mL、3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.09mg/mL、0.08mg/mL、0.07mg/mL、0.06mg/mL或0.05mg/mL的核酸。在一些实施方案中，核酸溶液包含约0.001至约1.0mg/mL的核酸、约0.0025至约0.5mg/mL的核酸或约0.005至约0.2mg/mL的核酸。在一些实施方案中，核酸溶液包含约0.005至约0.2mg/mL的核酸。
在一些实施方案中，核酸溶液具有德拜屏蔽长度。在一些实施方案中，核酸溶液的德拜屏蔽长度是约0.1nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.3至约7nm、约0.4nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.75nm至约4nm或约1nm至约3nm。在一些实施方案中，核酸溶液的德拜屏蔽长度是约1nm至约3nm。
在一些实施方案中，核酸溶液包含在水性缓冲液中的核酸。在一些实施方案中，适合核酸溶液可另外包含缓冲剂和/或盐。例示性适合缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、HEPES等。
在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的缓冲剂。
在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的缓冲剂。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。
在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。在一些实施方案中，核酸溶液包含浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90nM或100nM的盐。
在一些实施方案中，核酸溶液的pH值范围可以是约4.5至约7.0、约4.6至约7.0、约4.8至约7.0、约5.0至约7.0、约5.5至约7.0、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，核酸溶液的pH值范围可以是约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5。在一些实施方案中，核酸溶液的pH值范围可以是约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5。在一些实施方案中，核酸溶液的pH值范围可以是约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5。在一些实施方案中，适合核酸溶液的pH值可以是或不大于4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
在一些实施方案中，核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约8.8mM乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约130mM乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM乙酸盐。
在一些实施方案中，核酸溶液的pH值可以是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，核酸溶液包含pH值为5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，核酸溶液包含乙酸盐。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约5mM乙酸盐。
在一些实施方案中，核酸溶液包含pH值为约5.0的乙酸盐。
在一些实施方案中，核酸溶液包含约5mM乙酸盐，其中水性缓冲溶液的pH值是约5.0。
空脂质纳米颗粒(空LNP)
在一些方面，本公开提供通过本文所公开的方法制备的空脂质纳米颗粒(空LNP)。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的大部分是该群体的至少约70％。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中该群体是以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在约0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体是在小于该群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约0.4或更小的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的大部分是该群体的至少约70％。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在约0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，该迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
在一些方面，本公开提供一种空LNP群体，该空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在小于该群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，该峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
在一些实施方案中，所述空LNP群体包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP群体不含PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该包含聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含小于约2.5mol％PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂以及小于约2.5mol％PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含IL-2、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含小于约2.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含IL-2、SL-2、DSPC以及小于约2.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.01mol％至约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％至约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％至约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％至约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％至约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.5mol％至约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％至约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％至约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％至约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或约1.5mol％至约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.05mol％至约0.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。在一些方面，本公开提供一种空LNP，该空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含小于约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、小于约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或小于约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.01mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％或更低百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含超过约0.01mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.05mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.30mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.40mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.50mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.60mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.70mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.80mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约0.90mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.6mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.7mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.8mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约1.9mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.1mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.2mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.25mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.3mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.4mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约2.75mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约3.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约3.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约4.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)、超过约4.5mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)或超过约5.0mol％聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.01mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.05mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.30mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.40mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.50mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.60mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.70mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.80mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约0.90mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.3mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.4mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.6mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.7mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.8mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约1.9mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.1mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.2mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.25mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.3mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.4mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约2.75mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约3.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)、约4.5mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)或约5.0mol％或更高百分比聚合物脂质(例如PEG脂质)。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质并非PEG脂质。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是两亲性聚合物-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是PEG-脂质缀合物。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是表面活性剂。
在一些实施方案中，所述聚合物脂质是Brij或OH-PEG-硬脂酸酯。
在一些实施方案中，所述空LNP另外包含PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含PEG脂质、磷脂和结构脂质。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含PEG脂质和磷脂。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含PEG脂质和结构脂质。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含磷脂和结构脂质。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含PEG脂质。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含磷脂。在一些实施方案中，所述空LNP另外包含结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP另外包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含IL-1、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2和约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1-0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-1。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1-10mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约15-50mol％SL-2；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2；约0-30mol％DSPC；以及约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2和约0.1-10mol％PEG2k-DMG。在一些实施方案中，所述空LNP包含约30-60mol％IL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0-30mol％DSPC。在一些实施方案中，所述空LNP包含约15-50mol％SL-2。在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1-10mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约20至约70mg/mL可离子化脂质、约25至约65mg/mL可离子化脂质、约30至约60mg/mL可离子化脂质、约35至约55mg/mL可离子化脂质、约40至约50mg/mL可离子化脂质或约45至约50mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约20mg/mL可离子化脂质、约25mg/mL可离子化脂质、约30mg/mL可离子化脂质、约35mg/mL可离子化脂质、约40mg/mL可离子化脂质、约45mg/mL可离子化脂质、约50mg/mL可离子化脂质、约55mg/mL可离子化脂质、约60mg/mL可离子化脂质、约65mg/mL可离子化脂质或约70mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，空LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，空LNP包含约30mg/mL至约60mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，空LNP包含约32mg/mL至约56mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约5至约35mg/mL结构脂质、约10至约30mg/mL结构脂质、约15至约25mg/mL结构脂质或约20至约25mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约5mg/mL结构脂质、约10mg/mL结构脂质、约15mg/mL结构脂质、约20mg/mL结构脂质、约25mg/mL结构脂质、约30mg/mL结构脂质、约35mg/mL结构脂质或约40mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约4mg/mL至约8mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10mg/mL至约30mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约12mg/mL至约24mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约2.5至约20mg/mL磷脂、约5至约17.5mg/mL磷脂、约7.5至约15mg/mL磷脂或约10至约12.5mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约2.5mg/mL磷脂、约5mg/mL磷脂、约7.5mg/mL磷脂、约10mg/mL磷脂、约12.5mg/mL磷脂、约15mg/mL磷脂、约17.5mg/mL磷脂或约20mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约2mg/mL至约5mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约5mg/mL至约15mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约7mg/mL至约13mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.05至约5.5mg/mL PEG脂质、约0.1至约5.0mg/mL PEG脂质、约0.25至约4.5mg/mL PEG脂质、约0.5至约4.0mg/mL PEG脂质、约1.0至约3.5mg/mL PEG脂质、约1.5至约3.0mg/mL PEG脂质或约2.0至约2.5mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.05mg/mL PEG脂质、约0.1mg/mL PEG脂质、约0.25mg/mL PEG脂质、约0.5mg/mL PEG脂质、约1.0mg/mL PEG脂质、约1.5mg/mL PEG脂质、约2.5mg/mL PEG脂质、约3.0mg/mL PEG脂质、约3.5mg/mL PEG脂质、约4.0mg/mL PEG脂质、约4.5mg/mL PEG脂质或约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1mg/mL至约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约1mg/mL至约2mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30至约60mg/mL可离子化脂质；约10至约30mg/mL结构脂质；约5至约15mg/mL磷脂；以及约0.1至约5.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的结构脂质；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的磷脂；以及
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30mg/mL至约60mg/mL IL-1。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约32mg/mL至约56mg/mL IL-1。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL IL-1。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30mg/mL至约60mg/mL IL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约32mg/mL至约56mg/mL IL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL IL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL IL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10mg/mL至约30mg/mL SL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约12mg/mL至约24mg/mL SL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约4mg/mL至约8mg/mL SL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL SL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约5mg/mL至约15mg/mL DSPC。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约7mg/mL至约13mg/mL DSPC。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL DSPC。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约2mg/mL至约5mg/mL DSPC。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1mg/mL至约5.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约1mg/mL至约2mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30至约60mg/mL IL-1；约10至约30mg/mLSL-2；约5至约15mg/mL DSPC；以及约0.1至约5.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含约30至约60mg/mL IL-2；约10至约30mg/mLSL-2；约5至约15mg/mL DSPC；以及约0.1至约5.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mLDSPC；以及
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mLPEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值是约3.0至约8.0、约3.2至约7.8、约3.4至约7.6、约3.6至约7.4、约3.8至约7.2、约4.0至约7.0、约4.1至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.4、约4.4至约6.2、约4.5至约6.0、约4.6至约5.9、约4.7至约5.8、约4.8至约5.7、约4.9至约5.6、约5.0至约5.5、约5.1至约5.4或约5.2至约5.3(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值是约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.2、约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.8或约8.0(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值小于约3.0、小于约3.2、小于约3.4、小于约3.6、小于约3.8、小于约4.0、小于约4.1、小于约4.2、小于约4.3、小于约4.4、小于约4.5、小于约4.6、小于约4.7、小于约4.8、小于约4.9、小于约5.1、小于约5.2、小于约5.3、小于约5.4、小于约5.5、小于约5.6、小于约5.7、小于约5.8、小于约5.9、小于约6.0、小于约6.2、小于约6.4、小于约6.6、小于约6.8、小于约7.0、小于约7.2、小于约7.4、小于约7.6、小于约7.8或小于约8.0(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值是约3.0或更小、约3.2或更小、约3.4或更小、约3.6或更小、约3.8或更小、约4.0或更小、约4.1或更小、约4.2或更小、约4.3或更小、约4.4或更小、约4.5或更小、约4.6或更小、约4.7或更小、约4.8或更小、约4.9或更小、约5.1或更小、约5.2或更小、约5.3或更小、约5.4或更小、约5.5或更小、约5.6或更小、约5.7或更小、约5.8或更小、约5.9或更小、约6.0或更小、约6.2或更小、约6.4或更小、约6.6或更小、约6.8或更小、约7.0或更小、约7.2或更小、约7.4或更小、约7.6或更小、约7.8或更小或者约8.0或更小(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值大于约3.0、大于约3.2、大于约3.4、大于约3.6、大于约3.8、大于约4.0、大于约4.1、大于约4.2、大于约4.3、大于约4.4、大于约4.5、大于约4.6、大于约4.7、大于约4.8、大于约4.9、大于约5.1、大于约5.2、大于约5.3、大于约5.4、大于约5.5、大于约5.6、大于约5.7、大于约5.8、大于约5.9、大于约6.0、大于约6.2、大于约6.4、大于约6.6、大于约6.8、大于约7.0、大于约7.2、大于约7.4、大于约7.6、大于约7.8或大于约8.0(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的pH值是约3.0或更大、约3.2或更大、约3.4或更大、约3.6或更大、约3.8或更大、约4.0或更大、约4.1或更大、约4.2或更大、约4.3或更大、约4.4或更大、约4.5或更大、约4.6或更大、约4.7或更大、约4.8或更大、约4.9或更大、约5.1或更大、约5.2或更大、约5.3或更大、约5.4或更大、约5.5或更大、约5.6或更大、约5.7或更大、约5.8或更大、约5.9或更大、约6.0或更大、约6.2或更大、约6.4或更大、约6.6或更大、约6.8或更大、约7.0或更大、约7.2或更大、约7.4或更大、约7.6或更大、约7.8或更大或者约8.0或更大(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的平均脂质纳米颗粒直径是约200nm、约175nm、约150nm、约125nm、约100nm、约90nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm或约20nm(例如根据动态光散射测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或者约20nm或更小(例如根据动态光散射测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm(例如根据动态光散射测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约25nm至约45nm(例如根据动态光散射测量)。
空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且该空LNP溶液不含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值高于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且该空LNP溶液包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液可包含空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度范围为约0.01-1.0mg/mL、0.01-0.9mg/mL、0.01-0.8mg/mL、0.01-0.7mg/mL、0.01-0.6mg/mL、0.01-0.5mg/mL、0.01-0.4mg/mL、0.01-0.3mg/mL、0.01-0.2mg/mL、0.01-0.1mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-0.9mg/mL、0.05-0.8mg/mL、0.05-0.7mg/mL、0.05-0.6mg/mL、0.05-0.5mg/mL、0.05-0.4mg/mL、0.05-0.3mg/mL、0.05-0.2mg/mL、0.05-0.1mg/mL、0.1-1.0mg/mL、0.2-0.9mg/mL、0.3-0.8mg/mL、0.4-0.7mg/mL或0.5-0.6mg/mL的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、4.0mg/mL、3.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.09mg/mL、0.08mg/mL、0.07mg/mL、0.06mg/mL或0.05mg/mL的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含在水性缓冲液中的空LNP。在一些实施方案中，所述空LNP溶液可另外包含缓冲剂和/或盐。例示性适合缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的缓冲剂。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的盐。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值范围可以是约4.0至约8.5、约4.1至约8.4、约4.3至约8.2、约4.5至约8.0、约4.6至约7.8、约4.8至约7.6、约5.0至约7.4、约5.5至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值可以是或不大于约4.0、4.1、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值是约2.0至约9.0、约2.5至约8.5、约2.6至约8.4、约2.7至约8.3、约2.8至约8.2、约2.9至约8.1、约3.0至约8.0、约3.2至约7.8、约3.4至约7.6、约3.6至约7.4、约3.8至约7.2、约4.0至约7.0、约4.1至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.4、约4.4至约6.2、约4.5至约6.0、约4.6至约6.0、约4.6至约5.9、约4.7至约5.8、约4.8至约5.7、约4.9至约5.6、约5.0至约5.5、约5.1至约5.4或约5.2至约5.3(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值是约2.0、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.2、约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.8、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4或约8.5(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值小于约2.0、小于约2.5、小于约2.6、小于约2.7、小于约2.8、小于约2.9、小于约3.0、小于约3.2、小于约3.4、小于约3.6、小于约3.8、小于约4.0、小于约4.1、小于约4.2、小于约4.3、小于约4.4、小于约4.5、小于约4.6、小于约4.7、小于约4.8、小于约4.9、小于约5.1、小于约5.2、小于约5.3、小于约5.4、小于约5.5、小于约5.6、小于约5.7、小于约5.8、小于约5.9、小于约6.0、小于约6.2、小于约6.4、小于约6.6、小于约6.8、小于约7.0、小于约7.2、小于约7.4、小于约7.6、小于约7.8、小于约8.0、小于约8.1、小于约8.2、小于约8.3、小于约8.4、小于约8.5或小于约9.0(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值是约2.0或更小、约2.5或更小、约2.6或更小、约2.7或更小、约2.8或更小、约2.9或更小、约3.0或更小、约3.2或更小、约3.4或更小、约3.6或更小、约3.8或更小、约4.0或更小、约4.1或更小、约4.2或更小、约4.3或更小、约4.4或更小、约4.5或更小、约4.6或更小、约4.7或更小、约4.8或更小、约4.9或更小、约5.1或更小、约5.2或更小、约5.3或更小、约5.4或更小、约5.5或更小、约5.6或更小、约5.7或更小、约5.8或更小、约5.9或更小、约6.0或更小、约6.2或更小、约6.4或更小、约6.6或更小、约6.8或更小、约7.0或更小、约7.2或更小、约7.4或更小、约7.6或更小、约7.8或更小、约8.0或更小、约8.1或更小、约8.2或更小、约8.3或更小、约8.4或更小、约8.5或更小或者约9.0或更小(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值大于约2.0、大于约2.5、大于约2.6、大于约2.7、大于约2.8、大于约2.9、大于约3.0、大于约3.2、大于约3.4、大于约3.6、大于约3.8、大于约4.0、大于约4.1、大于约4.2、大于约4.3、大于约4.4、大于约4.5、大于约4.6、大于约4.7、大于约4.8、大于约4.9、大于约5.1、大于约5.2、大于约5.3、大于约5.4、大于约5.5、大于约5.6、大于约5.7、大于约5.8、大于约5.9、大于约6.0、大于约6.2、大于约6.4、大于约6.6、大于约6.8、大于约7.0、大于约7.2、大于约7.4、大于约7.6、大于约7.8、大于约8.0、大于约8.1、大于约8.2、大于约8.3、大于约8.4、大于约8.5或大于约9.0(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值是约2.0或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大、约3.0或更大、约3.2或更大、约3.4或更大、约3.6或更大、约3.8或更大、约4.0或更大、约4.1或更大、约4.2或更大、约4.3或更大、约4.4或更大、约4.5或更大、约4.6或更大、约4.7或更大、约4.8或更大、约4.9或更大、约5.1或更大、约5.2或更大、约5.3或更大、约5.4或更大、约5.5或更大、约5.6或更大、约5.7或更大、约5.8或更大、约5.9或更大、约6.0或更大、约6.2或更大、约6.4或更大、约6.6或更大、约6.8或更大、约7.0或更大、约7.2或更大、约7.4或更大、约7.6或更大、约7.8或更大、约8.0或更大、约8.1或更大、约8.2或更大、约8.3或更大、约8.4或更大、约8.5或更大或者约9.0或更大(例如根据USP<791>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5.2±2.0mM、5.2±1.5mM、5.2±1.0mM、5.2±0.9mM、5.2±0.8mM、5.2±0.7mM、5.2±0.6mM、5.2±0.5mM、5.2±0.4mM、5.2±0.3mM、5.2±0.2mM或5.2±0.1mM乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液的pH值可以是5.2±2.0、5.2±1.5、5.2±1.0、5.2±0.9、5.2±0.8、5.2±0.7、5.2±0.6、5.2±0.5、5.2±0.4、5.2±0.3、5.2±0.2或5.2±0.1。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含pH值为5.2±2.0、5.2±1.5、5.2±1.0、5.2±0.9、5.2±0.8、5.2±0.7、5.2±0.6、5.2±0.5、5.2±0.4、5.2±0.3、5.2±0.2或5.2±0.1的乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5mM乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含pH值为约5.2的乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含约5mM乙酸盐，其中所述水性缓冲溶液的pH值为约5.2。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液另外包含第一有机溶剂。在一些实施方案中，所述第一有机溶剂是醇。
在一些实施方案中，所述醇是乙醇。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液另外包含张力剂。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL可离子化脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL IL-1的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL IL-2的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约4mg/mL至约8mg/mL结构脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约4mg/mL至约8mg/mL SL-2的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约2mg/mL至约5mg/mL磷脂的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约2mg/mL至约5mg/mL DSPC的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含IL-1、DSPC、SL-2及PEG2k-DMG的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含IL-2、DSPC、SL-2及PEG2k-DMG的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含小于约2.5mol％的PEG脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂以及小于约2.5mol％PEG脂质的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包括含约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG的空LNP。
在一些方面，本公开提供一种包含空LNP的空LNP溶液，该空LNP包含IL-1、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种包含空LNP的空LNP溶液，该空LNP包含IL-2、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含空LNP，该空LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)结构脂质；
(iii)磷脂；和
(iv)PEG脂质；以及
(b)乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.2。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.2。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或者约20nm或更小的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液包含平均脂质纳米颗粒直径为约15nm至约150nm、约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的空LNP。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占约0.01％至约5.0％、约0.05％至约4.5％、约0.1％至约4.0％、约0.15％至约3.5％、约0.20％至约3.0％、约0.25％至约2.5％、约0.3％至约2％、约0.5％至约1.5％或约0.75％至约1.0％的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占约0.01％、约0.05％、约0.10％、约0.15％、约0.20％、约0.25％、约0.30％、约0.5％、约0.75％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％或约5％的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.10％、小于约0.15％、小于约0.20％、小于约0.25％、小于约0.30％、小于约0.5％、小于约0.75％、小于约1.0％、小于约1.5％、小于约2.0％、小于约2.5％、小于约3.0％、小于约3.0％、小于约3.5％、小于约4.0％、小于约4.5％或小于约5％的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占约0.01％或更少、约0.05％或更少、约0.10％或更少、约0.15％或更少、约0.20％或更少、约0.25％或更少、约0.30％或更少、约0.5％或更少、约0.75％或更少、约1.0％或更少、约1.5％或更少、约2.0％或更少、约2.5％或更少、约3.0％或更少、约3.0％或更少、约3.5％或更少、约4.0％或更少、约4.5％或更少或者约5％或更少的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占大于约0.01％、大于约0.05％、大于约0.10％、大于约0.15％、大于约0.20％、大于约0.25％、大于约0.30％、大于约0.5％、大于约0.75％、大于约1.0％、大于约1.5％、大于约2.0％、大于约2.5％、大于约3.0％、大于约3.0％、大于约3.5％、大于约4.0％、大于约4.5％或大于约5％的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有占约0.01％或更多、约0.05％或更多、约0.10％或更多、约0.15％或更多、约0.20％或更多、约0.25％或更多、约0.30％或更多、约0.5％或更多、约0.75％或更多、约1.0％或更多、约1.5％或更多、约2.0％或更多、约2.5％或更多、约3.0％或更多、约3.0％或更多、约3.5％或更多、约4.0％或更多、约4.5％或更多或者约5％或更多的杂质(例如根据UPLC-CAD测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约500mOsm/kg至约1500mOsm/kg、约600mOsm/kg至约1400mOsm/kg、约700mOsm/kg至约1300mOsm/kg、约800mOsm/kg至约1200mOsm/kg、约850mOsm/kg至约1100mOsm/kg、约900mOsm/kg至约1000mOsm/kg或约900mOsm/kg至约950mOsm/kg的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约500mOsm/kg、约600mOsm/kg、约700mOsm/kg、约750mOsm/kg、约800mOsm/kg、约850mOsm/kg、约900mOsm/kg、约950mOsm/kg、约1000mOsm/kg、约1100mOsm/kg、约1200mOsm/kg、约1300mOsm/kg、约1400mOsm/kg或约1500mOsm/kg的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有小于约500mOsm/kg、小于约600mOsm/kg、小于约700mOsm/kg、小于约750mOsm/kg、小于约800mOsm/kg、小于约850mOsm/kg、小于约900mOsm/kg、小于约950mOsm/kg、小于约1000mOsm/kg、小于约1100mOsm/kg、小于约1200mOsm/kg、小于约1300mOsm/kg、小于约1400mOsm/kg或小于约1500mOsm/kg的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约500mOsm/kg或更小、约600mOsm/kg或更小、约700mOsm/kg或更小、约750mOsm/kg或更小、约800mOsm/kg或更小、约850mOsm/kg或更小、约900mOsm/kg或更小、约950mOsm/kg或更小、约1000mOsm/kg或更小、约1100mOsm/kg或更小、约1200mOsm/kg或更小、约1300mOsm/kg或更小、约1400mOsm/kg或更小或者约1500mOsm/kg或更小的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有大于约500mOsm/kg、大于约600mOsm/kg、大于约700mOsm/kg、大于约750mOsm/kg、大于约800mOsm/kg、大于约850mOsm/kg，大于约900mOsm/kg、大于约950mOsm/kg、大于约1000mOsm/kg、大于约1100mOsm/kg、大于约1200mOsm/kg、大于约1300mOsm/kg、大于约1400mOsm/kg或大于约1500mOsm/kg的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约500mOsm/kg或更大、约600mOsm/kg或更大、约700mOsm/kg或更大、约750mOsm/kg或更大、约800mOsm/kg或更大、约850mOsm/kg或更大、约900mOsm/kg或更大、约950mOsm/kg或更大、约1000mOsm/kg或更大、约1100mOsm/kg或更大、约1200mOsm/kg或更大、约1300mOsm/kg或更大、约1400mOsm/kg或更大或者约1500mOsm/kg或更大的渗透压(例如根据USP<785>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含约1EU/mL至约20EU/mL、约2EU/mL至约16EU/mL、约3EU/mL至约12EU/mL、约4EU/mL至约10EU/mL、约5EU/mL至约8EU/mL或约6EU/mL至约8EU/mL的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含约1EU/mL、约2EU/mL、约3EU/mL、约4EU/mL、约5EU/mL、约6EU/mL、约8EU/mL、约10EU/mL、约12EU/mL、约16EU/mL或约20EU/mL的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含小于约1EU/mL、小于约2EU/mL、小于约3EU/mL、小于约4EU/mL、小于约5EU/mL、小于约6EU/mL、小于约8EU/mL、小于约10EU/mL、小于约12EU/mL、小于约16EU/mL或小于约20EU/mL的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含约1EU/mL或更少、约2EU/mL或更少、约3EU/mL或更少、约4EU/mL或更少、约5EU/mL或更少、约6EU/mL或更少、约8EU/mL或更少、约10EU/mL或更少、约12EU/mL或更少、约16EU/mL或更少或者约20EU/mL或更少的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含大于约1EU/mL、大于约2EU/mL、大于约3EU/mL、大于约4EU/mL、大于约5EU/mL、大于约6EU/mL、大于约8EU/mL、大于约10EU/mL、大于约12EU/mL、大于约16EU/mL或大于约20EU/mL的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有包含约1EU/mL或更大、约2EU/mL或更大、约3EU/mL或更大、约4EU/mL或更大、约5EU/mL或更大、约6EU/mL或更大、约8EU/mL或更大、约10EU/mL或更大、约12EU/mL或更大、约16EU/mL或更大或者约20EU/mL或更大的细菌内毒素(例如根据USP<85>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TAMC至约10CFU/10mLTAMC、0.2CFL/10mL TAMC至约8.0CFU/10mL TAMC、0.5CFL/10mL TAMC至约6.0CFU/10mLTAMC、0.75CFL/10mL TAMC至约4.0CFU/10mL TAMC或者1.0CFL/10mL TAMC至约2.0CFU/10mLTAMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TAMC、约0.2CFL/10mLTAMC、约0.5CFL/10mL TAMC、约0.75CFL/10mL TAMC、约1.0CFL/10mL TAMC、约2.0CFL/10mLTAMC、约4.0CFL/10mL TAMC、约6.0CFL/10mL TAMC、约8.0CFL/10mL TAMC或约10CFL/10mLTAMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有小于约0.1CFL/10mL TAMC、小于约0.2CFL/10mL TAMC、小于约0.5CFL/10mL TAMC、小于约0.75CFL/10mL TAMC、小于约1.0CFL/10mL TAMC、小于约2.0CFL/10mL TAMC、小于约4.0CFL/10mL TAMC、小于约6.0CFL/10mLTAMC、小于约8.0CFL/10mL TAMC或小于约10CFL/10mL TAMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TAMC或更低、约0.2CFL/10mL TAMC或更低、约0.5CFL/10mL TAMC或更低、约0.75CFL/10mL TAMC或更低、约1.0CFL/10mL TAMC或更低、约2.0CFL/10mL TAMC或更低、约4.0CFL/10mL TAMC或更低、约6.0CFL/10mL TAMC或更低、约8.0CFL/10mL TAMC或更低或者约10CFL/10mL TAMC或更低的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有大于约0.1CFL/10mL TAMC、大于约0.2CFL/10mL TAMC、大于约0.5CFL/10mL TAMC、大于约0.75CFL/10mL TAMC、大于约1.0CFL/10mL TAMC、大于约2.0CFL/10mL TAMC、大于约4.0CFL/10mL TAMC、大于约6.0CFL/10mLTAMC、大于约8.0CFL/10mL TAMC或大于约10CFL/10mL TAMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TAMC或更大、约0.2CFL/10mL TAMC或更大、约0.5CFL/10mL TAMC或更大、约0.75CFL/10mL TAMC或更大、约1.0CFL/10mL TAMC或更大、约2.0CFL/10mL TAMC或更大、约4.0CFL/10mL TAMC或更大、约6.0CFL/10mL TAMC或更大、约8.0CFL/10mL TAMC或更大或者约10CFL/10mL TAMC或更大的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TYMC至约10CFL/10mLTYMC、0.2CFL/10mL TYMC至约8.0CFU/10mL TYMC、0.5CFL/10mL TYMC至约6.0CFU/10mLTYMC、0.75CFL/10mL TYMC至约4.0CFU/10mL TYMC或者1.0CFL/10mL TYMC至约2.0CFU/10mLTYMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TYMC、约0.2CFL/10mLTYMC、约0.5CFL/10mL TYMC、约0.75CFL/10mL TYMC、约1.0CFL/10mL TYMC、约2.0CFL/10mLTYMC、约4.0CFL/10mL TYMC、约6.0CFL/10mL TYMC、约8.0CFL/10mL TYMC或约10CFL/10mLTYMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有小于约0.1CFL/10mL TYMC、小于约0.2CFL/10mL TYMC、小于约0.5CFL/10mL TYMC、小于约0.75CFL/10mL TYMC、小于约1.0CFL/10mL TYMC、小于约2.0CFL/10mL TYMC、小于约4.0CFL/10mL TYMC、小于约6.0CFL/10mLTYMC、小于约8.0CFL/10mL TYMC或小于约10CFL/10mL TYMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TYMC或更低、约0.2CFL/10mL TYMC或更低、约0.5CFL/10mL TYMC或更低、约0.75CFL/10mL TYMC或更低、约1.0CFL/10mL TYMC或更低、约2.0CFL/10mL TYMC或更低、约4.0CFL/10mL TYMC或更低、约6.0CFL/10mL TYMC或更低、约8.0CFL/10mL TYMC或更低或者约10CFL/10mL TYMC或更低的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有大于约0.1CFL/10mL TYMC、大于约0.2CFL/10mL TYMC、大于约0.5CFL/10mL TYMC、大于约0.75CFL/10mL TYMC、大于约1.0CFL/10mL TYMC、大于约2.0CFL/10mL TYMC、大于约4.0CFL/10mL TYMC、大于约6.0CFL/10mLTYMC、大于约8.0CFL/10mL TYMC或大于约10CFL/10mL TYMC的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液具有约0.1CFL/10mL TYMC或更大、约0.2CFL/10mL TYMC或更大、约0.5CFL/10mL TYMC或更大、约0.75CFL/10mL TYMC或更大、约1.0CFL/10mL TYMC或更大、约2.0CFL/10mL TYMC或更大、约4.0CFL/10mL TYMC或更大、约6.0CFL/10mL TYMC或更大、约8.0CFL/10mL TYMC或更大或者约10CFL/10mL TYMC或更大的生物负荷(例如根据USP<61>测量)。
添加冷冻保护剂
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括：iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液中。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括：iib)过滤该空LNP溶液。
在一些实施方案中，所述处理空LNP溶液的步骤包括：
iia)将冷冻保护剂添加至空LNP溶液中；并且
iic)过滤该空LNP溶液。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是在冻干之前添加至空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含一种或多种冷冻保护剂，并且该一种或多种冷冻保护剂各自独立地为多元醇(例如二元醇或三元醇，例如丙二醇(即，1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非清洁剂磺基甜菜碱(例如NDSB-201(3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸酯)、渗透性调节物(例如L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如聚乙二醇200(PEG200)、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG2k-DMG、PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000、聚乙二醇单甲醚550(mPEG 550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000、mPEG 5000、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮K15)、季戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P400)、有机溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖单水合物、内赤藓糖醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-蜜三糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖单水合物)或盐(例如乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、乙酸钠、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠或其任何水合物)，或其任何组合。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂和/或赋形剂是蔗糖。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含乙酸钠。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂和/或赋形剂是乙酸钠。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含蔗糖和乙酸钠。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约10g/L至约1000g/L、约25g/L至约950g/L、约50g/L至约900g/L、约75g/L至约850g/L、约100g/L至约800g/L、约150g/L至约750g/L、约200g/L至约700g/L、约250g/L至约650g/L、约300g/L至约600g/L、约350g/L至约550g/L、约400g/L至约500g/L及约450g/L至约500g/L的浓度存在的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约10g/L至约500g/L、约50g/L至约450g/L、约100g/L至约400g/L、约150g/L至约350g/L、约200g/L至约300g/L及约200g/L至约250g/L的浓度存在的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约10g/L、约25g/L、约50g/L、约75g/L、约100g/L、约150g/L、约200g/L、约250g/L、约300g/L、约300g/L、约350g/L、约400g/L、约450g/L、约500g/L、约550g/L、约600g/L、约650g/L、约700g/L、约750g/L、约800g/L、约850g/L、约900g/L、约950g/L和约1000g/L的浓度存在的冷冻保护剂。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约25mM、约8mM至约20mM、约9mM至约15mM以及约10mM至约15mM的浓度存在的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约0.1mM至约10mM、约0.5mM至约9mM、约1mM至约8mM、约2mM至约7mM、约3mM至约6mM以及约4mM至约5mM的浓度存在的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包含以约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM和约100mM的浓度存在的冷冻保护剂。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含蔗糖的水溶液。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L蔗糖的水溶液。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含约200±100g/L、200±90g/L、200±80g/L、200±70g/L、200±60g/L、200±50g/L、200±40g/L、200±30g/L、200±20g/L、200±10g/L、200±9g/L、200±8g/L、200±7g/L、200±6g/L、200±5g/L、200±4g/L、200±3g/L、200±2g/L或200±1g/L蔗糖的水溶液。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含乙酸钠和蔗糖的水溶液。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)200±100g/L、200±90g/L、200±80g/L、200±70g/L、200±60g/L、200±50g/L、200±40g/L、200±30g/L、200±20g/L、200±10g/L、200±9g/L、200±8g/L、200±7g/L、200±6g/L、200±5g/L、200±4g/L、200±3g/L、200±2g/L或200±1g/L的蔗糖。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含乙酸钠及蔗糖的水溶液，其中该水溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖；并且
其中所述水溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)200±100g/L、200±90g/L、200±80g/L、200±70g/L、200±60g/L、200±50g/L、200±40g/L、200±30g/L、200±20g/L、200±10g/L、200±9g/L、200±8g/L、200±7g/L、200±6g/L、200±5g/L、200±4g/L、200±3g/L、200±2g/L或200±1g/L的蔗糖；并且
其中所述水溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，冻干是在适合的玻璃容器(例如10mL圆柱形玻璃小瓶)中进行。在一些实施方案中，所述玻璃容器在短时间内承受住在低于-40℃与高于室温之间的极端温度变化，和/或被切割成均一形状。在一些实施方案中，冻干步骤包括在高于约-40℃的温度下冷冻LNP溶液，由此形成冷冻的LNP溶液；以及干燥冷冻的LNP溶液以形成冻干的LNP组合物。在一些实施方案中，冻干步骤包括在高于约-40℃且低于约-30℃的温度下冷冻LNP溶液。冷冻步骤使温度经约6分钟线性降低至最终温度，优选地以每分钟约1℃从20℃降低至-40℃。在一些实施方案中，冷冻步骤以每分钟约1℃使温度经约6分钟线性降低至最终温度，即，从20℃降低至-40℃。在一些实施方案中，可使用12-15％的蔗糖，并且干燥步骤是在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行的。在一些实施方案中，可使用12-15％的蔗糖，并且干燥步骤是在约50毫托至约150毫托范围内的真空下，首先在约-35℃至约-15℃范围内的低温下执行，接着在室温至约25℃范围内的较高温度下执行。在一些实施方案中，可使用12-15％的蔗糖，并且干燥步骤是在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行，并且干燥步骤在三至七天内完成。在一些实施方案中，可使用12-15％的蔗糖，并且干燥步骤在约50毫托至约150毫托范围内的真空下，首先在约-35℃至约-15℃范围内的低温下执行，接着在室温至约25℃范围内的较高温度下执行，并且干燥步骤在三至七天内完成。在一些实施方案中，干燥步骤是在约50毫托至约100毫托范围内的真空下执行的。在一些实施方案中，干燥步骤是在约50毫托至约100毫托范围内的真空下，首先在约-15℃至约0℃范围内的低温下执行，接着在较高温度下执行。
在一些实施方案中，空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物是在约3.5至约8.0、约4.0至约7.5、约4.5至约7.0、约5.0至约6.5及约5.5至约6.0的pH值下储存。在一些实施方案中，空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物是在约3.5、约4.0、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约4.5、约5.5、约6.5、约7.0、约7.5及约8.0的pH值下储存。
在一些实施方案中，LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物是在包含蔗糖和乙酸钠的冷冻保护剂中储存。在一些实施方案中，LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物是在包含约150g/L至约350g/L蔗糖和约3mM至约6mM乙酸钠的冷冻保护剂中，在约pH 4.5至约pH 7.0下储存。在一些实施方案中，LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物是在包含约200g/L蔗糖和5mM乙酸钠的冷冻保护剂中，在约pH 5.0下储存。
在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，将空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约-80℃、约-78℃、约-76℃、约-74℃、约-72℃、约-70℃、约-65℃、约-60℃、约-55℃、约-50℃、约-45℃、约-40℃、约-35℃或约-30℃的温度下储存。
在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，将空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下储存。
在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，将空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下储存。
在一些实施方案中，在添加缓冲溶液之前，将空LNP溶液、带负载的LNP溶液或冻干的LNP组合物在约-20℃的温度下储存。
空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)
在一些实施方案中，本公开提供通过本文所公开的方法制备的空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物不含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值低于可离子化脂质的pKa值。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值低于可离子化脂质的pKa值，并且该空LNP配制物不含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值高于可离子化脂质的pKa值，并且该空LNP配制物包含PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约5.2±2.0mM、5.2±1.5mM、5.2±1.0mM、5.2±0.9mM、5.2±0.8mM、5.2±0.7mM、5.2±0.6mM、5.2±0.5mM、5.2±0.4mM、5.2±0.3mM、5.2±0.2mM或5.2±0.1mM乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的pH值可以是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含pH值为5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约5mM乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含pH值为约5.0的乙酸盐。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约5mM的乙酸盐，其中水性缓冲溶液的pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约4mg/mL至约8mg/mL结构脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约2mg/mL至约5mg/mL磷脂。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含IL-1、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含小于约2.5mol％的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂以及小于约2.5mol％的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含约0.1mol％至约0.5mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含IL-1、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含IL-2、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含
(a)可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)IL-1；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)结构脂质；
(iii)磷脂；和
(iv)PEG脂质；以及
(b)乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含：
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)IL-1；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物包含
(a)空LNP，该空LNP包含：
(i)IL-2；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小。
在一些实施方案中，所述空LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约15nm至约150nm、约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm。
带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含IL-1、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP另外包含约0.1-0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约3.0mol％PEG脂质或更少、约2.75mol％PEG脂质或更少、约2.5mol％PEG脂质或更少、约2.25mol％PEG脂质或更少、约2.0mol％PEG脂质或更少、约1.75mol％PEG脂质或更少、约1.5mol％PEG脂质或更少、约1.25mol％PEG脂质或更少、约1.0mol％PEG脂质或更少、约0.9mol％PEG脂质或更少、约0.8mol％PEG脂质或更少、约0.7mol％PEG脂质或更少、约0.6mol％PEG脂质或更少、约0.5mol％PEG脂质或更少、约0.4mol％PEG脂质或更少、约0.3mol％PEG脂质或更少、约0.2mol％PEG脂质或更少或者约0.1mol％PEG脂质或更少。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约0mol％至约3.0mol％PEG脂质、0.1mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.25mol％PEG脂质、约0.25mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.5mol％至约1.75mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约0.050mol％至约0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含空LNP，该空LNP包含IL-1、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含空LNP，该空LNP包含IL-2、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP的平均脂质纳米颗粒直径为约25nm至约45nm。
带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的带负载的LNP溶液。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度大于约0.01mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.15mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL或约1.0mg/mL的带负载的LNP。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度范围为约0.01-1.0mg/mL、0.01-0.9mg/mL、0.01-0.8mg/mL、0.01-0.7mg/mL、0.01-0.6mg/mL、0.01-0.5mg/mL、0.01-0.4mg/mL、0.01-0.3mg/mL、0.01-0.2mg/mL、0.01-0.1mg/mL、0.05-1.0mg/mL、0.05-0.9mg/mL、0.05-0.8mg/mL、0.05-0.7mg/mL、0.05-0.6mg/mL、0.05-0.5mg/mL、0.05-0.4mg/mL、0.05-0.3mg/mL、0.05-0.2mg/mL、0.05-0.1mg/mL、0.1-1.0mg/mL、0.2-0.9mg/mL、0.3-0.8mg/mL、0.4-0.7mg/mL或0.5-0.6mg/mL的带负载的LNP。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度为至多约5.0mg/mL、至多约4.0mg/mL、至多约3.0mg/mL、至多约2.0mg/mL、至多约1.0mg/mL、至多约0.09mg/mL、至多约0.08mg/mL、至多约0.07mg/mL、至多约0.06mg/mL或至多约0.05mg/mL的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含在水性缓冲液中的带负载的LNP。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液可另外包含缓冲剂和/或盐。例示性适合缓冲剂包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的缓冲剂。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的缓冲剂。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液的pH值范围可以是约4.0至约8.5、约4.1至约8.4、约4.3至约8.2、约4.5至约8.0、约4.6至约7.8、约4.8至约7.6、约5.0至约7.4、约5.5至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.9、约6.0至约6.8、约6.0至约6.7、约6.0至约6.6、约6.0至约6.5。在一些实施方案中，第二缓冲剂的pH值可以是或不大于约4.0、4.1、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液的pH值范围为约3.0至约8.5、约3.5至约8.0、约3.75至约7.5、约4.0至约7.0、约4.25至约6.5、约4.5至约6.25、约4.6至约6.0、约4.8至约5.8、约5.0至约5.75、约5.0至约5.5。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含约5.0±2.0mM、5.0±1.5mM、5.0±1.0mM、5.0±0.9mM、5.0±0.8mM、5.0±0.7mM、5.0±0.6mM、5.0±0.5mM、5.0±0.4mM、5.0±0.3mM、5.0±0.2mM或5.0±0.1mM乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液的pH值可以是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含pH值为5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1的乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含约5mM柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐或tris。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含约5mM的乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含pH值为约5.0的乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含约5mM乙酸盐，其中该水性缓冲溶液的pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含磷酸盐缓冲液，其中该磷酸盐缓冲液的pH值为约8.0。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含磷酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐与磷酸盐缓冲液的组合，其中该磷酸盐缓冲液的pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐与磷酸盐缓冲液的组合。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液另外包含第一有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂是醇。
在一些实施方案中，所述醇是乙醇。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液另外包含张力剂。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL可离子化脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL IL-1的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约10mg/mL至约20mg/mL IL-2的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约4mg/mL至约8mg/mL结构脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约4mg/mL至约8mg/mL SL-2的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约2mg/mL至约5mg/mL磷脂的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约2mg/mL至约5mg/mL DSPC的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约0.1mg/mL至约1.0mg/mL PEG脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约0.1mg/mL至约1.0mg/mLPEG2k-DMG的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含IL-1、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含小于约2.5mol％的PEG脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂以及小于约2.5mol％的PEG脂质的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包括含约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG的带负载的LNP。
在一些方面，本公开提供一种包含带负载的LNP的带负载的LNP溶液，该带负载的LNP包含IL-1、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些方面，本公开提供一种包含带负载的LNP的带负载的LNP溶液，该带负载的LNP包含IL-2、SL-2、DSPC以及约0.1mol％至约0.5mol％PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的可离子化脂质；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的结构脂质；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的磷脂；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-1；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(a)约15±10mg/mL、约15±9mg/mL、约15±8mg/mL、约15±7mg/mL、约15±6mg/mL、约15±5mg/mL、约15±4mg/mL、约15±3mg/mL或约15±2mg/mL的IL-2；
(b)约6±4mg/mL、约6±3mg/mL、约6±2mg/mL或约6±1mg/mL的SL-2；
(c)约3.0±1.0mg/mL、约3.0±0.9mg/mL、约3.0±0.8mg/mL、约3.0±0.7mg/mL、约3.0±0.6mg/mL、约3.0±0.5mg/mL、约3.0±0.4mg/mL、约3.0±0.3mg/mL、约3.0±0.2mg/mL或约3.0±0.1mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.5±0.4mg/mL、约0.5±0.3mg/mL、约0.5±0.2mg/mL或约0.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含
(a)带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)结构脂质；
(iii)磷脂；
(iv)PEG脂质；以及
(b)乙酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含
(a)带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(i)约10mg/mL至约20mg/mL的可离子化脂质；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的结构脂质；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的磷脂；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG脂质；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.2。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含
(a)带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(i)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(ii)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(iii)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；
(iv)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(b)约5mM乙酸盐缓冲液，其pH值为约5.2。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小的带负载的LNP。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP溶液包含平均脂质纳米颗粒直径为约15nm至约150nm、约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的带负载的LNP。
带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)
在一些实施方案中，本公开提供一种通过本文所公开的方法制备的带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)。
在一些实施方案中，带负载的LNP配制物包含一种或多种水性缓冲液和/或盐。例示性适合水性缓冲液包括但不限于硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、磷酸钠、HEPES等。在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含浓度范围为约0.1-100mM、约0.5-90mM、约1.0-80mM、约2-70mM、约3-60mM、约4-50mM、约5-40mM、约6-30mM、约7-20mM、约8-15mM、约9-12mM的水性缓冲液。在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含浓度为或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM的水性缓冲液。例示性适合盐包括但不限于氯化钾、氯化镁、氯化钠等。在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含浓度范围为约1-500mM、约5-400mM、约10-350mM、约15-300mM、约20-250mM、约30-200mM、约40-190mM、约50-180mM、约50-170mM、约50-160mM、约50-150mM或约50-100mM的盐。
在一些实施方案中，带负载的LNP配制物的pH值范围可以是约7.0至约9.5、约7.1至约9.2、约7.2至约9.0、约7.3至约8.8、约7.4至约8.6、约7.5至约8.5、约7.5至约8.0、约7.5至约8.1、约7.5至约8.2、约7.5至约8.3、约7.5至约8.4或约7.5至约8.5。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的pH值可以是或不小于约7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含tris。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐与tris的组合。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含pH值为约7.5至约8.5的乙酸盐。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含pH值为约7.5至约8.5的tris。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含pH值为约7.5至约8.5的乙酸盐与tris的组合。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的pH值是在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5的范围内。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的pH值为约5.0。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-0.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含约30-60mol％可离子化脂质；约0-30mol％磷脂；约15-50mol％结构脂质；以及约0.1-10mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含IL-1、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含IL-2、DSPC、SL-2和PEG2k-DMG。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含
(a)带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)结构脂质；
(iii)磷脂；
(iv)PEG脂质；以及
(b)乙酸盐及tris缓冲液。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物包含
(a)带负载的LNP，该带负载的LNP包含：
(i)可离子化脂质；
(ii)结构脂质；
(iii)磷脂；
(iv)PEG脂质；以及
(b)pH值为约7.5至约8.5的乙酸盐及tris缓冲液。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm。
在一些实施方案中，所述带负载的LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约40nm至约200nm、约50nm至约190nm、约60nm至约180nm、约70nm至约170nm、约80nm至约160nm、约90nm至约150nm、约100nm至约140nm或约110nm至约130nm。
在一些实施方案中，带负载的LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约25nm至约45nm。
在一些实施方案中，带负载的LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约80nm至约160nm。
施用LNP配制物
在一些实施方案中，所述施用包含：(i)提供包含治疗剂和/或预防剂的pH值在约4.5至约7.0范围内的活性剂溶液，以及包含空LNP的pH值在约4.5至约6.5范围内的空LNP溶液，该空LNP包含可离子化脂质；(ii)通过混合所述空LNP溶液和所述活性剂溶液来形成包含囊封所述治疗剂和/或预防剂的带负载的LNP的LNP配制物，使得该LNP配制物的pH值在约4.5至约小于7.0范围内；并且(iii)在混合之后不到约72小时，将所述LNP配制物施用给患者。
在一些实施方案中，第一pH值和第二pH值是在约7.0至约8.1，或约7.1至约7.8，或约7.2至约7.7，或约7.3至约7.6，或约7.4至约7.5范围内。
在一些实施方案中，第一pH值和第二pH值是在约4.5至约6.5，或约4.6至约6.0，或约4.8至约5.5范围内。
在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约72小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约60小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约48小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约36小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约24小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约20小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约16小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约12小时执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约8小时执行的。
在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约120分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约100分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约90分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约80分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约70分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约60分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约50分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约40分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约30分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约20分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约15分钟执行的。在一些实施方案中，所述施用是在混合之后不到约10分钟执行的。
在一些实施方案中，LNP配制物在混合与施用之间不进行处理。
在一些实施方案中，本公开的方法不包括在混合与施用之间进行pH调节。
在一些实施方案中，LNP配制物在混合与施用之间未经历过滤。
在一些实施方案中，所述方法另外包括在混合和施用装置的第一入口处接收有机溶液。
在一些实施方案中，所述方法另外包括在混合和施用装置的第二入口处接收水性缓冲溶液。
在一些实施方案中，所述混合是在混合和施用装置的混合位置处执行的。
在一些实施方案中，LNP配制物是通过混合和施用装置的出口施用。
在一些实施方案中，所述提供、所述形成、所述混合和所述施用均采用单个混合和施用装置执行。在一些实施方案中，所述提供、所述形成、所述混合和所述施用是采用流体连接的混合和施用装置执行的。
在一些实施方案中，所述混合和施用装置包括双筒注射器。
在一些实施方案中，所述混合和施用装置包括选自由K注射器和L注射器组成的组的至少一种。
在一些实施方案中，所述混合和施用装置包括在混合器位置处的静态混合器。
在一些实施方案中，所述静态混合器是螺旋静态混合器。
在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH值与脂质纳米颗粒配制物的pH值大致相同。
在一些实施方案中，相对于脂质纳米颗粒配制物的总体积，LNP配制物包含约1体积％至约50体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，LNP配制物包含约2体积％至约45体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，LNP配制物包含约3体积％至约40体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，LNP配制物包含约4体积％至约35体积％的有机溶剂。在一些实施方案中，相对于LNP配制物的总体积，LNP配制物包含约5体积％至约33体积％的有机溶剂。
在一些实施方案中，所述有机溶剂是醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂是乙醇。
在一些实施方案中，所述有机溶剂包含第一有机溶剂和第二有机溶剂。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂是醇并且所述第二有机溶剂是醇。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂是乙醇并且所述第二有机溶剂是苯甲醇。
在一些实施方案中，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的wt/wt比率在约100:1至约1:1，或约50:1至约1:1，或约20:1至约1:1，或约10:1至约1:1范围内。
在一些实施方案中，所述有机溶液另外包含润湿剂。如本文所使用，润湿剂可指增加、降低或改良液体维持与例如固体表面和/或液体表面之类表面接触的能力的剂。
在一些实施方案中，所述润湿剂是有机溶剂。
在一些实施方案中，所述润湿剂是二甲亚砜(DMSO)。
在一些实施方案中，所述润湿剂与所述有机溶剂的wt/wt比率在约1000:1至约1:1，或约500:1至约5:1，或约100:1至约10:1范围内。
在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液选自由以下组成的组中的至少一者：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液及其组合。在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液可以是适于维持生理pH值的任何缓冲液。在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液可以是适于维持适于施用患者的pH值的任何缓冲液。在一些实施方案中，所述患者是哺乳动物患者。在一些实施方案中，所述患者是人类患者。
在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液另外包含张力剂。如本文所使用，张力剂可指增加、降低或改良有效渗透压梯度(如由两种溶液的水势所定义)或溶质溶解于溶液中的相对浓度，从而影响扩散的方向和范围的剂。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含张力剂。
在一些实施方案中，所述张力剂是糖。
在一些实施方案中，所述糖是蔗糖。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL的张力剂。
在一些实施方案中，所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含约0.2g/mL至约0.25g/mL的张力剂。
空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液及LNP配制物的例示性实施方案
在一些实施方案中，本公开的空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物包含多种LNP，其中所述带负载的LNP或LNP配制物包含核酸和可离子化脂质。
本文进一步公开用于本公开的方法的适合核酸。在一些实施方案中，所述核酸是RNA(例如mRNA)。
本文进一步公开用于本公开的方法的适合可离子化脂质。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物另外包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或其任何组合。本文进一步公开用于本公开的方法的适合磷脂、PEG脂质和结构脂质。
在一些实施方案中，本公开的空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物包括至少一种脂质纳米颗粒组分。脂质纳米颗粒可包括脂质组分以及一种或多种额外组分，例如治疗剂和/或预防剂，例如核酸。LNP可被设计用于一种或多种特定应用或目标。LNP的成分可基于特定应用或目标，和/或基于一种或多种成分的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其它特征进行选择。同样，LNP的特定配制物可根据例如特定成分组合的功效和毒性，针对特定应用或目标进行选择。LNP配制物的功效和耐受性可受该配制物的稳定性影响。
所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的脂质组分可包括例如根据式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的脂质、磷脂(例如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)、PEG脂质和结构脂质。所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的脂质组分可包括例如根据式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的脂质、磷脂(例如不饱和脂质，例如DOPE或DSPC)和结构脂质。所述脂质组分的成分可以呈特定分率提供。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括根据式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的脂质、磷脂、PEG脂质和结构脂质。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括约30mol％至约60mol％的式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的化合物、约0mol％至约30mol％磷脂、约18.5mol％至约48.5mol％结构脂质以及约0mol％至约10mol％PEG脂质，其限制条件在于总mol％不超过100％。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的脂质组分包括约35mol％至约55mol％的式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的化合物、约5mol％至约25mol％磷脂、约30mol％至约40mol％结构脂质以及约0mol％至约10mol％PEG脂质。在一个特定实施方案中，所述脂质组分包括约50mol％的所述化合物、约10mol％磷脂、约38.5mol％结构脂质以及约1.5mol％PEG脂质。在另一特定实施方案中，所述脂质组分包括约40mol％的所述化合物、约20mol％磷脂、约38.5mol％结构脂质以及约1.5mol％PEG脂质。在一些实施方案中，所述磷脂可以是DOPE或DSPC。在一些实施方案中，所述PEG脂质可以是PEG-DMG和/或所述结构脂质可以是胆固醇。
脂质纳米颗粒可被设计用于一种或多种特定应用或目标。在一些实施方案中，LNP可被设计用于将例如RNA之类治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统，或其群组。脂质纳米颗粒的生理化学特性可发生改变以便增加针对特定身体目标的选择性。例如，粒度可基于不同器官的开窗大小加以调节。包括在LNP中的治疗剂和/或预防剂也可基于一个或多个所需递送目标进行选择。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对向特定细胞、组织、器官或系统或其群组的递送(例如局部或特异性递送)进行选择。在一些实施方案中，LNP可包括编码所关注多肽的mRNA，它能够在细胞内翻译产生所关注多肽。这一组合物可被设计用于特异性递送至特定器官。在一些实施方案中，组合物可被设计用于特异性递送至哺乳动物的肝脏。
LNP中治疗剂和/或预防剂的量可取决于所述脂质纳米颗粒的大小、组成、所需目标和/或应用或其它特性，并且也取决于所述治疗剂和/或预防剂的特性。在一些实施方案中，可用于LNP中的RNA的量可取决于该RNA的大小、序列和其它特征。LNP中治疗剂和/或预防剂以及其它成分(例如脂质)的相对量也可变化。在一些实施方案中，LNP中脂质组分与例如核酸之类治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可以是约5:1至约60:1，例如为5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。在一些实施方案中，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可以是约10:1至约40:1。在一些实施方案中，所述wt/wt比率是约20:1。LNP中治疗剂和/或预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)进行测量。
在一些实施方案中，LNP包括一种或多种RNA，并且该一种或多种RNA、脂质以及其量可被选择以提供特定N:P比率。组合物的N:P比率是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸酯基的数目的摩尔比率。一般而言，较低N:P比率是优选的。所述一种或多种RNA、脂质以及其量可被选择以提供约2:1至约30:1，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比率。在一些实施方案中，所述N:P比率可以是约2:1至约8:1。在一些实施方案中，所述N:P比率是约5:1至约8:1。在一些实施方案中，所述N:P比率可以是约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。在一些实施方案中，所述N:P比率可以是约5.67:1。
在一些实施方案中，包括LNP的配制物可另外包括盐，例如氯化物盐。
在一些实施方案中，包括LNP的配制物可另外包括糖，例如二糖。在一些实施方案中，所述配制物另外包括糖，但不包括盐，例如氯化物盐。
物理特性
本公开的LNP的物理特性可通过多种方法表征。在一些实施方案中，可使用显微术(例如透射电子显微术或扫描电子显微术)来检查LNP的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位分析法(例如电位滴定)来测量ζ电位。动态光散射也可用于测定粒度。也可使用例如Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)之类仪器来测量LNP的多种特征，例如粒度、多分散性指数和ζ电位。
所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可在数十纳米与数百纳米之间，这是例如根据动态光散射(DLS)测量的。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或者约20nm或更小的平均脂质纳米颗粒直径。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm的平均脂质纳米颗粒直径。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约15nm至约55nm、约20nm至约50nm、约25nm至约45nm或约30nm至约40nm的平均脂质纳米颗粒直径。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径具有约25nm至约45nm的平均脂质纳米颗粒直径。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可以是约70nm至约100nm。在一特定实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可以是约80nm。在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径可以是约100nm。
在一些实施方案中，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径在约1mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm或约38mm至约42mm范围内。
在一些实施方案中，当与通过可比较方法制造的空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物相比较时，所述空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物的平均LNP直径是约99％或更低、约98％或更低、约97％或更低、约96％或更低、约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低或者约10％或更低。
LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。较小(例如小于0.3)的多分散性指数一般指示狭窄的粒度分布。LNP的多分散性指数可以是约0至约0.25，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，LNP的多分散性指数可以是约0.10至约0.20。
治疗剂和/或预防剂，例如核酸的囊封效率描述相对于所提供的初始量，在制备之后被LNP囊封或以其它方式与LNP缔合的治疗剂和/或预防剂的量。高囊封效率是合乎需要的(例如接近100％)。囊封效率可例如根据比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破碎脂质纳米颗粒之前与之后含有脂质纳米颗粒的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。可使用阴离子交换树脂来测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。可使用荧光来测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。关于本文所描述的脂质纳米颗粒，治疗剂和/或预防剂的囊封效率可以是至少50％，例如为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，囊封效率可以是至少80％。在一些实施方案中，囊封效率可以是至少90％。在一些实施方案中，囊封效率可以是至少95％。
LNP可任选地包含一个或多个涂层。在一些实施方案中，LNP可被配制成具有涂层的胶囊、膜剂或片剂。包括本文所描述的组合物的胶囊、膜剂或片剂可具有任何有用的大小、拉伸强度、硬度或密度。
例示性实施方案
实施方案A1.一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含磷酸盐且pH值为8.0±2.0的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；并且
i-c)将包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成所述包含空LNP的空LNP溶液。
实施方案A2.一种制备包含空脂质纳米颗粒(空LNP)的空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；并且
i-c)将包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成所述包含空LNP的空LNP溶液。
实施方案A3.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
ii)处理所述空LNP溶液。
实施方案A4.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含磷酸盐且pH值为8.0±2.0的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；并且
i-c)将包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成包含空LNP的空LNP溶液；以及
ii)处理所述空LNP溶液；以及
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
实施方案A5.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)混合步骤，包括将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将包含乙酸盐且pH值为5.0±2.0的稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成包含空LNP的空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液；并且
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
实施方案A6.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)。
实施方案A7.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(LNP溶液)的方法，所述方法包括：
iii)负载步骤，包括将包含核酸的核酸溶液与包含空LNP的空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)。
实施方案A8.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成所述带负载的LNP配制物。
实施方案A9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤i-a)至i-c)是在独立操作单元(例如独立反应装置)中执行的。
实施方案A10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中步骤i-a)至i-c)是在单个操作单元中执行的。
实施方案A11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤i-c)中，将所述稀释溶液添加一次。
实施方案A12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤i-c)中，所述稀释溶液是连续添加的。
实施方案A13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述滞留时间是约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约6秒、约7秒、约8秒、约9秒、约10秒、约11秒、约12秒、约13秒、约14秒、约15秒、约16秒、约17秒、约18秒、约19秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒或约1分钟。
实施方案A14.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述滞留时间是约5±3秒、约5±2秒、约5±1秒(例如约5秒)。
实施方案A15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述滞留时间被配置成使得所述空LNP的平均直径为约50nm至约70nm。
实施方案A16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是IL-2。
实施方案A17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是SL-2。
实施方案A18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述磷脂是DSPC。
实施方案A19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是PEG2k-DMG。
实施方案A20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含醇。
实施方案A21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含乙醇。
实施方案A22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含：
(a)约30mol％至约70mol％的IL-2；
(b)30mol％至约50mol％的SL-2；
(c)约5mol％至约15mol％的DSPC；以及
(d)约0.1mol％至约1.0mol％的PEG2k-DMG。
实施方案A23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含：
(a)约10mg/mL至约20mg/mL的IL-2；
(b)约4mg/mL至约8mg/mL的SL-2；
(c)约2mg/mL至约5mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值与所述水性缓冲溶液的pH值基本上相同。
实施方案A25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值小于所述水性缓冲溶液的pH值。
实施方案A26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液是乙酸钠缓冲水溶液。
实施方案A27.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液中醇的浓度低于所述中间空LNP溶液中醇的浓度。
实施方案A28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液的pH值与所述中间空LNP溶液的pH值基本上相同。
实施方案A29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液的pH值小于所述中间空LNP溶液的pH值。
实施方案A30.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP基本上稳定。
实施方案A31.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP的平均直径为约50nm至约70nm。
实施方案A32.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液的步骤包括：
iia)将冷冻保护剂添加至所述空LNP溶液中；并且
iib)过滤所述空LNP溶液。
实施方案A33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖。
实施方案A34.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括含蔗糖的水溶液。
实施方案A35.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括含乙酸钠及蔗糖的水溶液。
实施方案A36.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖。
实施方案A37.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括含乙酸钠及蔗糖的水溶液，其中所述水溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
实施方案A38.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包括含以下各物的水溶液：
(a)约5±1mM、约5±0.9mM、约5±0.8mM、约5±0.5mM、约5±0.6mM、约5±0.5mM、约5±0.4mM、约5±0.3mM、约5±0.2mM或约5±0.1mM的乙酸钠；和
(b)约700±300g/L、700±200g/L、700±100g/L、700±90g/L、700±80g/L、700±70g/L、700±60g/L、700±50g/L、700±40g/L、700±30g/L、700±20g/L、700±10g/L、700±9g/L、700±8g/L、700±7g/L、700±6g/L、700±5g/L、700±4g/L、700±3g/L、700±2g/L或700±1g/L的蔗糖；并且
其中所述水溶液的pH值是5.0±2.0、5.0±1.5、5.0±1.0、5.0±0.9、5.0±0.8、5.0±0.7、5.0±0.6、5.0±0.5、5.0±0.4、5.0±0.3、5.0±0.2或5.0±0.1。
实施方案A39.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含约30mg/mL至约60mg/mL的可离子化脂质。
实施方案A40.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含约10mg/mL至约30mg/mL的结构脂质。
实施方案A41.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含约5mg/mL至约15mg/mL的磷脂。
实施方案A42.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG脂质。
实施方案A43.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A44.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约4.6至约6.0的乙酸盐缓冲液。
实施方案A45.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含乙醇的乙酸盐缓冲液，其pH值为约4.6至约6.0。
实施方案A46.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约7.5至约8.5的磷酸盐缓冲液。
实施方案A47.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含乙醇的磷酸盐缓冲液，其pH值为约7.5至约8.5。
实施方案A48.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；以及
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A49.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约4.6至约6.0的乙酸盐缓冲液。
实施方案A50.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含25％乙醇的乙酸盐缓冲液，其pH值为约4.6至约6.0。
实施方案A51.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约7.5至约8.5的磷酸盐缓冲液。
实施方案A52.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含25％乙醇的磷酸盐缓冲液，其pH值为约7.5至约8.5。
实施方案A53.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；以及
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A54.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约4.6至约6.0的乙酸盐缓冲液。
实施方案A55.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含25％乙醇的乙酸盐缓冲液，其pH值为约4.6至约6.0。
实施方案A56.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)pH值为约7.5至约8.5的磷酸盐缓冲液。
实施方案A57.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG；以及
(e)包含25％乙醇的磷酸盐缓冲液，其pH值为约7.5至约8.5。
实施方案A58.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理包括pH调节、第一添加步骤、缓冲液交换步骤、第二添加步骤以及过滤。
实施方案A59.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述负载步骤包括将所述包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含所述带负载的LNP的带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)。
实施方案A60.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在形成之后，使所述空LNP或所述空LNP溶液在不进行保持或储存的情况下经历所述负载步骤。
实施方案A61.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述空LNP溶液在保持一定时段之后经历所述负载步骤。
实施方案A62.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述空LNP溶液在储存一定时段之后经历所述负载步骤。
实施方案A63.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iii)处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液，由此形成脂质纳米颗粒配制物(LNP配制物)。
实施方案A64.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述带负载的LNP另外包含约0.1-0.5mol％PEG脂质、磷脂、结构脂质或其任何组合。
实施方案A65.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括第一添加步骤，所述第一添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A66.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
实施方案A67.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤包括第二添加步骤，所述第二添加步骤包括将聚乙二醇脂质(PEG脂质)添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A68.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤包括将包含所述PEG脂质的聚乙二醇溶液(PEG溶液)添加至所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
实施方案A69.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG或约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A70.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤包括将约1.75mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A71.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤包括将约0.1mol％至约3.0mol％PEG、约0.2mol％至约2.5mol％PEG、约0.5mol％至约2.0mol％PEG、约0.75mol％至约1.5mol％PEG、约1.0mol％至约1.25mol％PEG添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A72.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤包括将约1.0mol％PEG脂质添加至所述空LNP或所述带负载的LNP中。
实施方案A73.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述带负载的LNP包含约3.0mol％PEG脂质或更少、约2.75mol％PEG脂质或更少、约2.5mol％PEG脂质或更少、约2.25mol％PEG脂质或更少、约2.0mol％PEG脂质或更少、约1.75mol％PEG脂质或更少、约1.5mol％PEG脂质或更少、约1.25mol％PEG脂质或更少、约1.0mol％PEG脂质或更少、约0.9mol％PEG脂质或更少、约0.8mol％PEG脂质或更少、约0.7mol％PEG脂质或更少、约0.6mol％PEG脂质或更少、约0.5mol％PEG脂质或更少、约0.4mol％PEG脂质或更少、约0.3mol％PEG脂质或更少、约0.2mol％PEG脂质或更少或约0.1mol％PEG脂质或更少。
实施方案A74.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述带负载的LNP包含约0mol％至约3.0mol％PEG脂质、0.1mol％至约2.5mol％PEG脂质、约0.2mol％至约2.25mol％PEG脂质、约0.25mol％至约2.0mol％PEG脂质、约0.5mol％至约1.75mol％PEG脂质、约0.75mol％至约1.5mol％PEG脂质或约1.0mol％至约1.25mol％PEG脂质。
实施方案A75.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP或所述带负载的LNP包含约0mol％至约0.5mol％PEG脂质。
实施方案A76.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括至少一个选自以下的步骤：过滤、pH调节、缓冲液交换、稀释、透析、浓缩、冷冻、冻干、储存和包装。
实施方案A77.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括pH调节。
实施方案A78.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述pH调节包括添加第二缓冲剂。
实施方案A79.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二缓冲剂包含第二水性缓冲液。
实施方案A80.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液及其组合。
实施方案A81.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液是tris缓冲液。
实施方案A82.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液的pH值范围为约4.5至约9.0、约5.0至约8.8、约5.5至约8.6、约6.0至约8.4、约6.5至约8.2、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6。
实施方案A83.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液的pH值为约7.5。
实施方案A84.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二水性缓冲液的pH值为约5.0。
实施方案A85.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤是在所述pH调节之前执行的。
实施方案A86.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤是在所述pH调节之后执行的。
实施方案A87.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤是在所述pH调节之前执行的。
实施方案A88.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤是在所述pH调节之后执行的。
实施方案A89.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括过滤。
实施方案A90.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤是切向流过滤。
实施方案A91.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括缓冲液交换。
实施方案A92.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述缓冲液交换包括添加包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液。
实施方案A93.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三缓冲剂包含第三水性缓冲液。
实施方案A94.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲液选自由以下组成的组：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液及其组合。
实施方案A95.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲液的pH值范围为约4.5至约9.0、约5.0至约8.8、约5.5至约8.6、约6.0至约8.4、约6.5至约8.2、约7.0至约8.0、约7.2至约7.8或约7.4至约7.6。
实施方案A96.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲液的pH值为约7.5。
实施方案A97.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第三水性缓冲液的pH值为约5.0。
实施方案A98.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤是在所述缓冲液交换之前执行的。
实施方案A99.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤是在所述缓冲液交换之后执行的。
实施方案A100.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤是在所述缓冲液交换之前执行的。
实施方案A101.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤是在所述缓冲液交换之后执行的。
实施方案A102.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括稀释。
实施方案A103.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括透析。
实施方案A104.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括浓缩。
实施方案A105.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括冷冻。
实施方案A106.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括冻干。
实施方案A107.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中冷冻保护剂是在所述冻干之前添加至所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液中。
实施方案A108.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含一种或多种冷冻保护剂。
实施方案A109.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂选自多元醇(例如二元醇或三元醇，例如丙二醇(即，1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非清洁剂磺基甜菜碱(例如NDSB-201(3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸酯)、渗透性调节物(例如L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、聚合物(例如聚乙二醇200(PEG 200)、PEG 400、PEG 600、PEG1000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000、聚乙二醇单甲醚550(mPEG550)、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000、mPEG 5000、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮K15)、季戊四醇丙氧基化物或聚丙二醇P400)、有机溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖单水合物、内赤藻糖醇、木糖醇、肌醇、D-(+)-蜜三糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖单水合物)或盐(例如乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、乙酸钠、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠或其任何水合物)或其任何组合。
实施方案A110.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖。
实施方案A111.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含乙酸钠。
实施方案A112.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含蔗糖和乙酸钠。
实施方案A113.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约10g/L至约1000g/L、约25g/L至约950g/L、约50g/L至约900g/L、约75g/L至约850g/L、约100g/L至约800g/L、约150g/L至约750g/L、约200g/L至约700g/L、约250g/L至约650g/L、约300g/L至约600g/L、约350g/L至约550g/L、约400g/L至约500g/L及约450g/L至约500g/L的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A114.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约10g/L至约500g/L、约50g/L至约450g/L、约100g/L至约400g/L、约150g/L至约350g/L、约200g/L至约300g/L及约200g/L至约250g/L的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A115.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约10g/L、约25g/L、约50g/L、约75g/L、约100g/L、约150g/L、约200g/L、约250g/L、约300g/L、约300g/L、约350g/L、约400g/L、约450g/L、约500g/L、约550g/L、约600g/L、约650g/L、约700g/L、约750g/L、约800g/L、约850g/L、约900g/L、约950g/L及约1000g/L的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A116.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约0.1mM至约100mM、约0.5mM至约90mM、约1mM至约80mM、约2mM至约70mM、约3mM至约60mM、约4mM至约50mM、约5mM至约40mM、约6mM至约30mM、约7mM至约25mM、约8mM至约20mM、约9mM至约15mM及约10mM至约15mM的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A117.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约0.1mM至约10mM、约0.5mM至约9mM、约1mM至约8mM、约2mM至约7mM、约3mM至约6mM及约4mM至约5mM的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A118.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含以约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM及约100mM的浓度存在的冷冻保护剂。
实施方案A119.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液、带负载的LNP溶液或所述冻干的LNP组合物是在约3.5至约8.0、约4.0至约7.5、约4.5至约7.0、约5.0至约6.5及约5.5至约6.0的pH值下储存。
实施方案A120.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液、带负载的LNP溶液或所述冻干的LNP组合物是在约3.5、约4.0、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约4.5、约5.5、约6.5、约7.0、约7.5和约8.0的pH值下储存。
实施方案A121.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP溶液、带负载的LNP溶液或所述冻干的LNP组合物是在包含蔗糖和乙酸钠的冷冻保护剂中储存。
实施方案A122.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP溶液、带负载的LNP溶液或所述冻干的LNP组合物是在包含约150g/L至约350g/L蔗糖及约3mM至约6mM乙酸钠的冷冻保护剂中，在约pH 4.5至约pH 7.0下储存的。
实施方案A123.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP溶液、带负载的LNP溶液或所述冻干的LNP组合物是在包含约200g/L蔗糖及5mM乙酸钠的冷冻保护剂中，在约pH 5.0下储存的。
实施方案A124.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冻干包括在约-100℃至约0℃、约-80℃至约-10℃、约-60℃至约-20℃、约-50℃至约-25℃或约-40℃至约-30℃的温度下冷冻所述带负载的LNP溶液。
实施方案A125.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冻干另外包括干燥冷冻的带负载的LNP溶液以形成冻干的空LNP或冻干的带负载的LNP。
实施方案A126.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥是在约50毫托至约150毫托范围内的真空下执行的。
实施方案A127.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥是在约-35℃至约-15℃下执行的。
如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干燥是在约室温至约25℃下执行的。
实施方案A128.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括储存。
实施方案A129.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述储存包括在约-80℃、约-78℃、约-76℃、约-74℃、约-72℃、约-70℃、约-65℃、约-60℃、约-55℃、约-50℃、约-45℃、约-40℃、约-35℃或约-30℃的温度下储存所述空LNP或所述带负载的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案A130.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述储存包括在约-40℃、约-35℃、约-30℃、约-25℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约-5℃、约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃或约25℃的温度下储存所述空LNP或所述带负载的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案A131.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述储存包括在约-40℃至约0℃、约-35℃至约-5℃、约-30℃至约-10℃、约-25℃至约-15℃、约-22℃至约-18℃或约-21℃至约-19℃的温度下储存所述空LNP或所述带负载的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案A132.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述储存包括在约-20℃的温度下储存所述空LNP或所述带负载的LNP至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年。
实施方案A133.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液的步骤另外包括包装。
实施方案A134.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述混合步骤是用T形接头、封闭式冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行的。
实施方案A135.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述负载步骤是用T形接头、封闭式冲击射流、微流体混合器或涡旋混合器执行的。
实施方案A136.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述混合步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
实施方案A137.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述负载步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
实施方案A138.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一添加步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
实施方案A139.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二添加步骤是在小于约30℃、小于约28℃、小于约26℃、小于约24℃、小于约22℃、小于约20℃或小于约环境温度的温度下执行的。
实施方案A140.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述混合步骤与所述第一添加步骤之间的滞留时间在约1.0毫秒至约60分钟、约2.0毫秒至约30分钟、约3.0毫秒至约15分钟、约4.0毫秒至约10分钟、约5.0毫秒至约5分钟、约10.0毫秒至约2分钟、约100.0毫秒至约1.0分钟、约1000毫秒至约1.0分钟范围内。
实施方案A141.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液的pH值在约7.0至约8.0、约7.1至约7.8、约7.2至约7.6或约7.3至约7.5范围内。
实施方案A142.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液的pH值范围是约2.0至约9.0、约2.5至约8.5、约2.6至约8.4、约2.7至约8.3、约2.8至约8.2、约2.9至约8.1、约3.0至约8.0、约3.2至约7.8、约3.4至约7.6、约3.6至约7.4、约3.8至约7.2、约4.0至约7.0、约4.1至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.4、约4.4至约6.2、约4.5至约6.0、约4.6至约5.9、约4.7至约5.8、约4.8至约5.7、约4.9至约5.6、约5.0至约5.5、约5.1至约5.4或约5.2至约5.3。
实施方案A143.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的pH值范围是约4.5至约6.5、约4.8至约6.25、约4.8至约6.0、约5.0至约5.8或约5.2至约5.5。
实施方案A144.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液、所述空LNP溶液和所述LNP配制物的pH值在约5.0至约6.0、约5.1至约5.75或约5.2至约5.5范围内。
实施方案A145.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP溶液的pH值范围是约2.0至约9.0、约2.5至约8.5、约2.6至约8.4、约2.7至约8.3、约2.8至约8.2、约2.9至约8.1、约3.0至约8.0、约3.2至约7.8、约3.4至约7.6、约3.6至约7.4、约3.8至约7.2、约4.0至约7.0、约4.1至约6.8、约4.2至约6.6、约4.3至约6.4、约4.4至约6.2、约4.5至约6.0、约4.6至约5.9、约4.7至约5.8、约4.8至约5.7、约4.9至约5.6、约5.0至约5.5、约5.1至约5.4或约5.2至约5.3。
实施方案A146.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液另外包含第一有机溶剂。
实施方案A147.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含第一有机溶剂。
实施方案A148.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂是醇。
实施方案A149.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一有机溶剂是乙醇。
实施方案A150.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含大于约10mM磷酸盐、大于约15mM磷酸盐、大于约20mM磷酸盐、大于约25mM磷酸盐或大于约30mM磷酸盐。
实施方案A151.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含大于约1mM磷酸盐、大于约2mM磷酸盐、大于约5mM磷酸盐、大于约10mM磷酸盐、大于约15mM磷酸盐、大于约20mM磷酸盐、大于约25mM磷酸盐或大于约30mM磷酸盐。
实施方案A152.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含约1mM至约30mM磷酸盐、约2mM至约20mM磷酸盐、约3mM至约10mM磷酸盐、约4mM至约8mM磷酸盐或者约5mM至约6mM磷酸盐。
实施方案A153.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含约5mM磷酸盐。
实施方案A154.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含大于约10mM乙酸盐、大于约15mM乙酸盐、大于约20mM乙酸盐、大于约25mM乙酸盐或大于约30mM乙酸盐。
实施方案A155.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含大于约1mM乙酸盐、大于约2mM乙酸盐、大于约5mM乙酸盐、大于约10mM乙酸盐、大于约15mM乙酸盐、大于约20mM乙酸盐、大于约25mM乙酸盐或大于约30mM乙酸盐。
实施方案A156.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含约1mM至约30mM乙酸盐、约2mM至约20mM乙酸盐、约3mM至约10mM乙酸盐、约4mM至约8mM乙酸盐或约5mM至约6mM乙酸盐。
实施方案A157.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第一水性缓冲液包含约5mM乙酸盐。
实施方案A158.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含张力剂。
实施方案A159.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液是在所述负载步骤之前，在张力剂存在下储存的。
实施方案A160.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述张力剂是糖。
实施方案A161.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述糖是蔗糖。
实施方案A162.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含约0.01g/mL至约1.0g/mL、约0.05g/mL至约0.5g/mL、约0.1g/mL至约0.4g/mL、约0.15g/mL至约0.3g/mL或约0.2g/mL至约0.25g/mL的张力剂。
实施方案A163.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含约0.2g/mL至约0.25g/mL的张力剂。
实施方案A164.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液另外包含约0.2g/mL的蔗糖。
实施方案A165.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约0.01至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.05至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.1至约0.25mg/mL的所述核酸。
实施方案A166.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约0.001至约1.0mg/mL的所述核酸、约0.0025至约0.5mg/mL的所述核酸或约0.005至约0.2mg/mL的所述核酸。
实施方案A167.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约0.005至约0.2mg/mL的所述核酸。
实施方案A168.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的德拜屏蔽长度为约0.1nm至约10nm、约0.2nm至约8nm、约0.3至约7nm、约0.4nm至约6nm、约0.5nm至约5nm、约0.75nm至约4nm或约1nm至约3nm。
实施方案A169.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的德拜屏蔽长度为约1nm至约3nm。
实施方案A170.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含选自由以下组成的组的缓冲液：乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。
实施方案A171.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案A172.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约1mM至约200mM乙酸盐缓冲液、约2mM至约180mM乙酸盐缓冲液、约3mM至约160mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约150mM乙酸盐缓冲液、约4mM至约140mM乙酸盐缓冲液、约5mM至约130mM乙酸盐缓冲液、约6mM至约120mM乙酸盐缓冲液、约7mM至约110mM乙酸盐缓冲液、约8mM至约100mM乙酸盐缓冲液、约9mM至约90mM乙酸盐缓冲液、约10mM至约80mM乙酸盐缓冲液、约15mM至约70mM乙酸盐缓冲液、约20mM至约60mM乙酸盐缓冲液、约25mM至约50mM乙酸盐缓冲液或约30mM至约40mM乙酸盐缓冲液。
实施方案A173.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约8.8mM乙酸盐缓冲液。
实施方案A174.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液包含约130mM乙酸盐缓冲液。
实施方案A175.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液和所述空LNP溶液在所述负载步骤期间是以约5:1至约7:1、约4:1至约6:1、约3:1至约5:1或约2:1至约4:1的体积流量比混合。
实施方案A176.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液和所述空LNP溶液在所述负载步骤期间是以约3:1的体积流量比混合。
实施方案A177.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液包含乙酸盐缓冲液。
实施方案A178.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP溶液或带负载的LNP溶液包含约5mM乙酸盐缓冲液，其中所述乙酸盐缓冲液的pH值为约5.0。
实施方案A179.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP、所述空LNP溶液、所述带负载的LNP、所述带负载的LNP溶液和/或所述LNP配制物另外包含囊封剂。
实施方案A180.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述囊封剂是式(EA-I)的化合物：
或其盐或异构体，其中
R201和R202各自独立地选自由H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和(C＝NH)N(R101)2组成的组，其中各R101独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R203选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
R204选自由H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)和C(O)(NHC2-C20烯基)组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施方案A181.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述囊封剂是式(EA-II)的化合物：
或其盐或异构体，其中
X101是键、NH或O；
R101和R102各自独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R103和R104各自独立地选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
实施方案A182.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述囊封剂是月桂酰精氨酸乙酯或其盐或异构体。
实施方案A183.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述囊封剂是至少一种选自由以下组成的组的化合物：
/>
或其盐和异构体，例如游离碱、TFA盐和/或HCl盐。
实施方案A184.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物与所述核酸的wt/wt比率在约5:1至约60:1范围内。
实施方案A185.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物与所述核酸的wt/wt比率在约10:1至约50:1范围内。
实施方案A186.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液、所述空LNP溶液、所述带负载的LNP、所述带负载的LNP溶液和/或所述LNP配制物另外包含磷脂、PEG脂质、结构脂质或其任何组合。
实施方案A187.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物包含
约30-60mol％可离子化脂质；
约0-30mol％磷脂；
约15-50mol％结构脂质；以及
约0.1-0.5mol％PEG脂质。
实施方案A188.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物包含
约30-60mol％可离子化脂质；
约0-30mol％磷脂；
约15-50mol％结构脂质；以及
约0.01-10mol％PEG脂质。
实施方案A189.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油以及PEG修饰的二烷基甘油。
实施方案A190.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-I)的化合物：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选地被取代的烷基或氧保护基；
r是在1与100之间的整数，包括1和100；
L1是任选地被取代的C1-10亚烷基，其中所述任选地被取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2的各情况独立地为键或任选地被取代的C1-6亚烷基，其中所述任选地被取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2的各情况独立地为任选地被取代的C1-30烷基、任选地被取代的C1-30烯基或任选地被取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基；
环B是任选地被取代的碳环基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；并且
p是1或2。
实施方案A191.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-I-OH)的化合物：
/>
或其盐。
实施方案A192.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-II)的化合物：
或其盐，其中：
R3是-ORO；
RO是氢、任选地被取代的烷基或氧保护基；
r是在1与100之间的整数；
R5是任选地被取代的C10-40烷基、任选地被取代的C10-40烯基或任选地被取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基。
实施方案A193.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-II-OH)的化合物：
或其盐，其中：
r是在1与100之间的整数；
R5是任选地被取代的C10-40烷基、任选地被取代的C10-40烯基或任选地被取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基。
实施方案A194.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中r是在40与50之间的整数。
实施方案A195.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中r是45。
实施方案A196.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中R5是C17烷基。
实施方案A197.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-II)的化合物：
或其盐。
实施方案A198.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-II)的化合物：
实施方案A199.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是式(PL-III)的化合物：
或其盐或异构体，其中s是在1与100之间的整数。
实施方案A200.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述PEG脂质是下式的化合物：
实施方案A201.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质选自由以下组成的组：胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚及其衍生物。
实施方案A202.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述磷脂选自由以下组成的组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂及其衍生物。
实施方案A203.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案A204.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质包含可离子化氨基脂质。
实施方案A205.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-1)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2及未经取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、
-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、
-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R)2C(O)OR，并且各n独立地选自1、2、3、4和5；
各R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
各R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M及M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”是键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
各R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
各R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
各R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各Y独立地为C3-6碳环；
各X独立地选自由F、Cl、Br及I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n是1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n是1或2时，Q不为5员、6员或7元杂环烷基。
实施方案A206.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IA)化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8及9；M1是键或M’；R4是氢、未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m是5、7或9。在一些实施方案中，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
实施方案A207.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IB)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中所有变量均如本文所定义。
在一些实施方案中，m选自5、6、7、8及9；R4为氢、未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m是5、7或9。在一些实施方案中，Q是OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q是-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
实施方案A208.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-II)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1是键或M’；R4是氢、未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
实施方案A209.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIa)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
实施方案A210.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIb)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
实施方案A211.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIc)或(IL-IIe)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中R4如本文所描述。
实施方案A212.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIf)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中M是-C(O)O-或-OC(O)-，M”是C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
实施方案A213.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IId)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中n是2、3或4；并且m、R’、R”和R2-R6如本文所描述。在一些实施方案中，R2和R3各自可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
实施方案A214.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIg)的化合物：
或其N-氧化物，或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8及9；M1是键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”是C1-6烷基(例如C1-4烷基)或C2-6烯基(例如C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
实施方案A215.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案A216.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A217.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案A218.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案A219.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A220.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A221.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A222.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A223.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A224.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A225.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A226.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。/>
实施方案A227.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A228.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A229.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A230.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A231.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A232.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A233.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A234.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-III)的化合物：
或其盐或异构体，其中，
W是
环A是
t是1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z是CH2或不存在，其中当Z是CH2时，虚线(1)和(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”组成的组；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
各M独立地选自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基组成的组；
M*是C1-C6烷基，
W1和W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
各R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由以下组成的组：键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
各Y独立地为C3-6碳环；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
各R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
各R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n是整数1-6；
其中当环A是时，则
i)X1、X2和X3中的至少一者不为-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-R”MR’。
实施方案A235.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是式(IL-IIIa1)-式(IL-IIIa8)中任一者的化合物：
实施方案A236.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案A237.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质是
或其盐。
实施方案A238.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是
或其盐。
实施方案A239.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是
或其盐。
实施方案A240.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是以在约15mol％至约70mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约50mol％、约30mol％至约45mol％、约35mol％至约40mol％或者约36mol％至约38mol％范围内的浓度存在。
实施方案A241.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述结构脂质是以约36.6±25mol％、约36.6±20mol％、约36.6±15mol％、约36.6±10mol％、约36.6±9mol％、约36.6±8mol％、约36.6±7mol％、约36.6±6mol％、约36.6±5mol％、约36.6±4mol％、约36.6±3mol％、约36.6±2mol％、约36.6±1mol％、约36.6±0.8mol％、约36.6±0.6mol％、约36.6±0.5mol％、约36.6±0.4mol％、约36.6±0.3mol％、约36.6±0.2mol％或约36.6±0.1mol％(例如约36.6mol％)的浓度存在。
实施方案A242.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述可离子化脂质选自由以下组成的组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2R))及(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2S))。
实施方案A243.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸是核糖核酸。
实施方案A244.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核糖核酸是至少一种选自由以下组成的组的核糖核酸：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)。
实施方案A245.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸是信使RNA(mRNA)。
实施方案A246.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括至少一个选自由以下组成的组的基序：茎环、链终止核苷、聚腺苷酸序列、聚腺苷酸化信号和5’帽结构。
实施方案A247.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA是至少30个核苷酸长。
实施方案A248.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA是至少300个核苷酸长。
实施方案A249.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约1.1:1至约30.1。
实施方案A250.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约20:1。
实施方案A251.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的N:P比率为约2:1至约10:1或约2:1至约5:1。
实施方案A252.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP包含约0.01至约500mg/mL的所述核酸、约0.1至约100mg/mL、约0.25至约50mg/mL、约0.5至约10mg/mL或约1.0至约10mg/mL的所述核酸。
实施方案A253.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或LNP配制物的多分散性指数(PDI)为约0.01至约0.25。
实施方案A254.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的囊封效率为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
实施方案A255.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的囊封效率为至少约85％、至少约90％或至少约95％。
实施方案A256.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的囊封效率为至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％或至少约98％。
实施方案A257.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)为约20％或更高、约25％或更高、约30％或更高、约35％或更高、约40％或更高、约45％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高或约99％或更高。
实施方案A258.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约200nm或更小、约175nm或更小、约150nm或更小、约125nm或更小、约100nm或更小、约90nm或更小、约80nm或更小、约75nm或更小、约70nm或更小、约65nm或更小、约60nm或更小、约55nm或更小、约50nm或更小、约45nm或更小、约40nm或更小、约35nm或更小、约30nm或更小、约25nm或更小或约20nm或更小。
实施方案A259.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约20nm至约150nm、约25nm至约125nm、约30nm至约110nm、约35nm至约100nm、约40nm至约90nm、约45nm至约80nm或约50nm至约70nm。
实施方案A260.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约15nm至约55nm、约20nm至约50nm、约25nm至约45nm或约30nm至约40nm。
实施方案A261.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约25nm至约45nm。
实施方案A262.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物在约-5-25℃、约0-10℃或约2-8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年之后，所述空LNP、所述空LNP溶液、所述带负载的LNP、所述带负载的LNP溶液和/或所述LNP配制物的多分散性指数(PDI)增加小于约0.25、小于约0.20、小于约0.15、小于约0.10、小于约0.05、小于约0.04、小于约0.03、小于约0.02或小于约0.01。
实施方案A263.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物在约-100℃至约80℃、约-80℃至约60℃、约-40℃至约40℃、约-20℃至约30℃、约-5℃至约25℃、约0℃至约10℃或约2℃至约8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年之后，所述空LNP、所述空LNP溶液、所述带负载的LNP、所述带负载的LNP溶液和/或所述LNP配制物的多分散性指数(PDI)增加小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
实施方案A264.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物在约-100℃至约80℃、约-80℃至约60℃、约-40℃至约40℃、约-20℃至约30℃、约-5℃至约25℃、约0℃至约10℃或约2℃至约8℃下储存至少1天、至少2天、至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少8个月或至少1年之后，所述空LNP、所述空LNP溶液、所述带负载的LNP、所述带负载的LNP溶液和/或所述LNP配制物具有小于约25％的囊封效率减少、小于约20％减少、小于约15％减少、小于约10％减少、小于约5％减少、小于约4％减少、小于约3％减少、小于约2％减少或小于约1％的囊封效率减少。
实施方案A265.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中如与通过可比较方法制造的LNP配制物相比较，所述空LNP、所述带负载的LNP和/或所述LNP配制物的平均脂质纳米颗粒直径为约99％或更小、约98％或更小、约97％或更小、约96％或更小、约95％或更小、约90％或更小、约85％或更小、约80％或更小、约75％或更小、约70％或更小、约65％或更小、约60％或更小、约55％或更小、约50％或更小、约40％或更小、约30％或更小、约20％或更小或约10％或更小。
实施方案A266.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的囊封效率比通过可比较方法制造的LNP配制物的囊封效率高出约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高、约90％或更高、约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约100倍或更高、约200倍或更高、约300倍或更高、约400倍或更高、约500倍或更高、约1000倍或更高、约2000倍或更高、约3000倍或更高、约4000倍或更高、约5000倍或更高或约10000倍或更高。
实施方案A267.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)比通过可比较方法制造的LNP配制物的核酸表达量(例如mRNA表达量)高出约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高、约90％或更高、约1倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约10倍或更高、约20倍或更高、约30倍或更高、约40倍或更高、约50倍或更高、约100倍或更高、约200倍或更高、约300倍或更高、约400倍或更高、约500倍或更高、约1000倍或更高、约2000倍或更高、约3000倍或更高、约4000倍或更高、约5000倍或更高或约10000倍或更高。
实施方案A268.一种带负载的LNP，所述LNP是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案A269.一种带负载的LNP溶液，所述是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案A270.一种LNP配制物，所述LNP配制物是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案A271.一种空LNP，所述空LNP是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案A272.一种空LNP，所述空LNP包含小于约2.5mol％PEG脂质。
实施方案A273.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％的所述PEG脂质。
实施方案A274.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP另外包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂。
实施方案A275.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，其中所述PEG脂质是PEG-2k-DMG。
实施方案A276.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，其中所述可离子化脂质是IL-2，所述结构脂质是SL-2，并且所述磷脂是DSPC。
实施方案A277.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案A278.一种包含空LNP的空LNP溶液，其中所述空LNP包含约0.1mol％至约0.5mol％PEG脂质。
实施方案A279.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述空LNP另外包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂。
实施方案A280.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述可离子化脂质是IL-2。
实施方案A281.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述结构脂质是SL-2。
实施方案A282.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述磷脂是DSPC。
实施方案A283.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述PEG脂质是PEG2k-DMG。
实施方案A284.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其另外包含醇及第一缓冲剂。
实施方案A285.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述醇是乙醇。
实施方案A286.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述第一缓冲剂是磷酸盐。
实施方案A287.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，其中所述第一缓冲剂是乙酸盐。
实施方案A288.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约30mg/mL至约60mg/mL的可离子化脂质。
实施方案A289.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约10mg/mL至约30mg/mL的结构脂质。
实施方案A290.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约5mg/mL至约15mg/mL的磷脂。
实施方案A291.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含约1.0mg/mL至约5.0mg/mL的PEG脂质。
实施方案A292.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(a)约30mg/mL至约60mg/mL的IL-2；
(b)约10mg/mL至约30mg/mL的SL-2；
(c)约5mg/mL至约15mg/mL的DSPC；以及
(d)约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A293.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(a)约32mg/mL至约56mg/mL的IL-2；
(b)约12mg/mL至约24mg/mL的SL-2；
(c)约7mg/mL至约13mg/mL的DSPC；以及
(d)约1mg/mL至约2mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A294.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液包含：
(a)约45±20mg/mL、约45±15mg/mL、约45±14mg/mL、约45±13mg/mL、约45±12mg/mL、约45±11mg/mL、约45±10mg/mL、约45±9mg/mL、约45±8mg/mL、约45±7mg/mL、约45±6mg/mL、约45±5mg/mL、约45±4mg/mL、约45±3mg/mL或约45±2mg/mL的IL-2；
(b)约20±10mg/mL、约20±9mg/mL、约20±8mg/mL、约20±7mg/mL、约20±6mg/mL、约20±5mg/mL、约20±4mg/mL、约20±3mg/mL、约20±2mg/mL或约20±1mg/mL的SL-2；
(c)约10±5mg/mL、约10±4mg/mL、约10±3mg/mL、约10±2mg/mL或约10±1mg/mL的DSPC；以及
(d)约1.5±1.0mg/mL、约1.5±0.9mg/mL、约1.5±0.8mg/mL、约1.5±0.7mg/mL、约1.5±0.6mg/mL、约1.5±0.5mg/mL、约1.5±0.4mg/mL、约1.5±0.3mg/mL、约1.5±0.2mg/mL或约1.5±0.1mg/mL的PEG2k-DMG。
实施方案A295.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的空LNP。
实施方案A296.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液。
实施方案A297.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP。
实施方案A298.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液。
实施方案A299.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的LNP配制物。
实施方案A300.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肠胃外执行的。
实施方案A301.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行的。
实施方案A302.如前述实施方案中任一项所述的空LNP，所述空LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案A303.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液，所述空LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案A304.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP，所述带负载的LNP用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案A305.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案A306.如前述实施方案中任一项所述的LNP配制物，所述LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案A307.一种如前述实施方案中任一项所述的空LNP的用途，所述空LNP用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案A308.一种如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液的用途，所述空LNP溶液用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案A309.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP的用途，所述带负载的LNP用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案A310.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液的用途，所述带负载的LNP溶液用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案A311.一种药物试剂盒，所述试剂盒包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物。
实施方案A312.一种药物试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)包含空脂质纳米颗粒(LNP)的LNP溶液；和
(ii)包含治疗剂和/或预防剂的活性剂溶液。
实施方案A313.一种组合，所述组合包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP、空LNP溶液、带负载的LNP、带负载的LNP溶液或LNP配制物。
实施方案A314.一种组合，所述组合包含空脂质纳米颗粒(LNP)及治疗剂和/或预防剂。
实施方案A315.一种组合，所述组合包含：
(i)包含空脂质纳米颗粒(LNP)的LNP溶液；和
(ii)包含治疗剂和/或预防剂的活性剂溶液。
实施方案B1.一种制备空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成所述空LNP溶液。
实施方案B2.一种制备空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
实施方案B3.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
实施方案B4.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
实施方案B5.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
实施方案B6.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
实施方案B7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值。
实施方案B8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值是约8.0±2.0、约8.0±1.5、约8.0±1.0、约8.0±0.9、约8.0±0.8、约8.0±0.7、约8.0±0.6、约8.0±0.5、约8.0±0.4、约8.0±0.3、约8.0±0.2或约8.0±0.1(例如约8.0)。
实施方案B9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含磷酸盐。
实施方案B10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述脂质溶液包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
实施方案B11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含：
约5mg/mL至约20mg/mL的所述可离子化脂质；
约1mg/mL至约8mg/mL的所述结构脂质；
约1mg/mL至约5mg/mL的所述磷脂；以及
约0.05mg/mL至约5.5mg/mL的所述PEG脂质。
实施方案B12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述滞留时间小于约一秒、约一秒至约一分钟或者约一分钟至约一小时。
实施方案B13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
实施方案B14.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案B15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含乙酸盐。
实施方案B16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其另外包括：
i-d)在步骤i-c)之后，过滤所述空LNP溶液；
任选地，步骤i-d)是在步骤iii)之前执行的；以及
任选地，步骤i-d)是在步骤ii)之前执行的。
实施方案B17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤是利用切向流过滤(TFF)执行的。
实施方案B18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的有机溶剂；
任选地，所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的乙醇。
实施方案B19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤将第二缓冲剂添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；并且
任选地，所述过滤将乙酸盐添加至所述空LNP溶液中。
实施方案B20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述空LNP溶液包括添加冷冻保护剂；
任选地，处理所述空LNP溶液包括将所述冷冻保护剂的溶液添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；并且
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐；并且
任选地，所述冷冻保护剂是蔗糖。
实施方案B21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述空LNP配制物包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
实施方案B22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案B23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含乙酸盐；并且
任选地，所述空LNP配制物包含约3mM至约50mM的乙酸盐。
实施方案B24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述核酸溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述核酸溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述核酸溶液包含约5mM或更多的乙酸盐。
实施方案B25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA；
任选地，所述核酸是mRNA。
实施方案B26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液包含约10mM至约100mM的乙酸盐。
实施方案B27.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iii-a)在处理所述带负载的LNP溶液之前，将所述带负载的LNP溶液保持5秒或更长时间。
实施方案B28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液是乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。
实施方案B29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在添加所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液后，所述带负载的LNP溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案B30.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质的溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合。
实施方案B31.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在添加所述PEG脂质后，所述带负载的LNP溶液包含约1.5mol％至约3.5mol％的所述PEG脂质。
实施方案B32.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案B33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐及tris。
实施方案B34.一种空LNP溶液，所述是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案B35.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案B36.一种带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案B37.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案B38.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比巨额约0.4或更小的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案B39.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
实施方案B40.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有约0.35或更小、约0.3或更小、约0.25或更小、约0.2或更小、约0.15或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的扩展。
实施方案B41.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的大部分是所述群体的至少约70％。
实施方案B42.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案B43.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
实施方案B44.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案B45.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
实施方案B46.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
实施方案B47.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案B48.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰是在约0.45至约0.7、约0.5至约0.65、约0.52至约0.63处；并且
任选地，所述迁移率峰是在约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.60、约0.61、约0.63、约0.64或约0.65处。
实施方案B49.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.15至约0.33、约0.18至约0.32、约0.19至约0.3、约0.20至约0.28或约0.21至约0.26的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32或约0.33的扩展。
实施方案B50.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
实施方案B51.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰在约0.18至约0.28或者约0.2至约0.25处；并且
任选地，所述第一迁移率峰在约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24或约0.25处。
实施方案B52.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述第一迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案B53.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰在约0.38至约0.48或者约0.4至约0.45处；并且
任选地，所述第二迁移率峰在约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44或约0.45处。
实施方案B54.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.06至约0.09的扩展；并且
任选地，所述第二迁移率峰具有约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案B55.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
实施方案B56.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案B57.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分的回转半径范围为约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或者17nm至约25nm。
实施方案B58.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
实施方案B59.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案B60.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或17nm至约25nm处。
实施方案B61.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
实施方案B62.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案B63.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰在约0.32至约0.38、约0.33至约0.37、约0.36至约0.35处；并且
任选地，所述迁移率峰在约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37或约0.38处。
实施方案B64.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案B65.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
实施方案B66.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案B67.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分的回转半径范围为约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或者6nm至约8nm。
实施方案B68.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在小于所述群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案B69.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约5nm至15nm、约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或6nm至约8nm处。
实施方案B70.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其中所述CZE被配置成使得中性参考标准以在0处的迁移率峰为特征，并且带电参考标准以在1.0处的迁移率峰为特征。
实施方案B71.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其中所述中性参考标准是DMSO，并且所述带电参考标准是苯甲胺。
实施方案B72.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其包含约30mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约0mol％至约30mol％的磷脂、约15mol％至约50mol％的结构脂质及约0mol％至约1mol％的PEG脂质。
实施方案B73.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体。
实施方案B74.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体。
实施方案B75.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案B76.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，另外包含乙酸盐；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物包含约1mM至约100mM、2mM至约80mM或3mM至约50mM的乙酸盐。
实施方案B77.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，另外包含冷冻保护剂。
实施方案B78.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，其中所述张力剂是蔗糖。
实施方案B79.一种带负载的LNP溶液，所述包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
实施方案B80.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
实施方案B81.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐和tris。
实施方案B82.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，具有高于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案B83.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案B84.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质是或其盐。
实施方案B85.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述结构脂质是胆固醇。
实施方案B86.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案B87.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述PEG脂质是PEG2k-DMG。
实施方案B88.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液。
实施方案B89.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物。
实施方案B90.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肠胃外执行的。
实施方案B91.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行的。
实施方案B92.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案B93.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案B94.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液的用途，所述带负载的LNP溶液用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案B95.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物的用途，所述带负载的LNP配制物用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案C1.一种制备空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成所述空LNP溶液。
实施方案C2.一种制备空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
实施方案C3.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液。
实施方案C4.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的所述带负载的LNP溶液。
实施方案C5.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
实施方案C6.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
实施方案C7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值。
实施方案C8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值是约8.0±2.0、约8.0±1.5、约8.0±1.0、约8.0±0.9、约8.0±0.8、约8.0±0.7、约8.0±0.6、约8.0±0.5、约8.0±0.4、约8.0±0.3、约8.0±0.2或约8.0±0.1(例如约8.0)。
实施方案C9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含磷酸盐。
实施方案C10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述脂质溶液包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
实施方案C11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含：
约5mg/mL至约20mg/mL的所述可离子化脂质；
约1mg/mL至约8mg/mL的所述结构脂质；
约1mg/mL至约5mg/mL的所述磷脂；以及
约0.05mg/mL至约5.5mg/mL的所述PEG脂质。
实施方案C12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述滞留时间小于约一秒、约一秒至约一分钟或者约一分钟至约一小时。
实施方案C13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
实施方案C14.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案C15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含乙酸盐。
实施方案C16.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
i-d)在步骤i-c)之后，过滤所述空LNP溶液；
任选地，步骤i-d)是在步骤iii)之前执行；并且
任选地，步骤i-d)是在步骤ii)之前执行的。
实施方案C17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤是利用切向流过滤(TFF)执行的。
实施方案C18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的有机溶剂；
任选地，所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的乙醇。
实施方案C19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤将第二缓冲剂添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；并且
任选地，所述过滤将乙酸盐添加至所述空LNP溶液中。
实施方案C20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述空LNP溶液包括添加冷冻保护剂；
任选地，处理所述空LNP溶液包括将所述冷冻保护剂的溶液添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐；并且
任选地，所述冷冻保护剂是蔗糖。
实施方案C21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述空LNP配制物包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
实施方案C22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案C23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含乙酸盐；并且
任选地，所述空LNP配制物包含约3mM至约50mM的乙酸盐。
实施方案C24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述核酸溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述核酸溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述核酸溶液包含约5mM或更多的乙酸盐。
实施方案C25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA；
任选地，所述核酸是mRNA。
实施方案C26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液包含约10mM至约100mM的乙酸盐。
实施方案C27.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iii-a)在处理所述带负载的LNP溶液之前，将所述带负载的LNP溶液保持5秒或更长时间。
实施方案C28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液是乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。
实施方案C29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在添加所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液后，所述带负载的LNP溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案C30.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质的溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合。
实施方案C31.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在添加所述PEG脂质后，所述带负载的LNP溶液包含约1.5mol％至约3.5mol％的所述PEG脂质。
实施方案C32.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案C33.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐及tris。
实施方案C34.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案C35.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案C36.一种带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备。
实施方案C37.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物是通过如前述实施方案中任一项所述的方法制备的。
实施方案C38.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比及约0.4或更小的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案C39.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
实施方案C40.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有约0.35或更小、约0.3或更小、约0.25或更小、约0.2或更小、约0.15或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的扩展。
实施方案C41.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的大部分是所述群体的至少约70％。
实施方案C42.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案C43.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
实施方案C44.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案C45.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中大小异质性模式峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
实施方案C46.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中大小异质性模式峰具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
实施方案C47.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案C48.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰在约0.45至约0.7、约0.5至约0.65、约0.52至约0.63处；并且
任选地，所述迁移率峰在约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.60、约0.61、约0.62、约0.63、约0.64或约0.65处。
实施方案C49.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.15至约0.33、约0.18至约0.32、约0.19至约0.3、约0.20至约0.28或约0.21至约0.26的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32或约0.33的扩展。
实施方案C50.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
实施方案C51.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰在约0.18至约0.28或者约0.2至约0.25处；并且
任选地，所述第一迁移率峰在约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24或约0.25处。
实施方案C52.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述第一迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案C53.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰在约0.38至约0.48或者约0.4至约0.45处；并且
任选地，所述第二迁移率峰在约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44或约0.45处。
实施方案C54.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.06至约0.09的扩展；并且
任选地，所述第二迁移率峰具有约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案C55.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
实施方案C56.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案C57.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分的回转半径的范围为约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或者17nm至约25nm。
实施方案C58.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
实施方案C59.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案C60.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或17nm至约25nm处。
实施方案C61.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
实施方案C62.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
实施方案C63.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰在约0.32至约0.38、约0.33至约0.37、约0.36至约0.35处；并且
任选地，所述迁移率峰在约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37或约0.38处。
实施方案C64.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
实施方案C65.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
实施方案C66.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
实施方案C67.如前述实施方案中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的大部分的回转半径的范围为约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或者6nm至约8nm。
实施方案C68.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质；
其中所述群体是以在小于所述群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
实施方案C69.如实施方案24的空LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约5nm至约15nm、约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或6nm至约8nm处。
实施方案C70.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其中所述CZE被配置成使得中性参考标准以在0处的迁移率峰为特征，并且带电参考标准以在1.0处的迁移率峰为特征。
实施方案C71.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其中所述中性参考标准是DMSO，并且所述带电参考标准是苯甲胺。
实施方案C72.如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体，其包含约30mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约0mol％至约30mol％的磷脂、约15mol％至约50mol％的结构脂质及约0mol％至约1mol％的PEG脂质。
实施方案C73.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体。
实施方案C74.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物包含如前述实施方案中任一项所述的空LNP群体。
实施方案C75.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
实施方案C76.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，另外包含乙酸盐；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物包含约1mM至约100mM、2mM至约80mM或3mM至约50mM乙酸盐。
实施方案C77.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，另外包含冷冻保护剂。
实施方案C78.如前述实施方案中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，其中所述张力剂是蔗糖。
实施方案C79.一种带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
实施方案C80.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
实施方案C81.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐和tris。
实施方案C82.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，具有高于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
实施方案C83.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质为或其盐。
实施方案C84.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质为或其盐。
实施方案C85.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述结构脂质是胆固醇。
实施方案C86.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述磷脂是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
实施方案C87.如前述实施方案中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述PEG脂质是PEG2k-DMG。
实施方案C88.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液。
实施方案C89.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物。
实施方案C90.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肠胃外执行的。
实施方案C91.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述施用是肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行的。
实施方案C92.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案C93.如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
实施方案C94.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP溶液的用途，所述带负载的LNP溶液用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
实施方案C95.一种如前述实施方案中任一项所述的带负载的LNP配制物的用途，所述用于制造供治疗或预防疾病或病症用的药剂。
定义
如本文所用，术语“烷基(alkyl)”或“烷基(alkyl group)”意谓包括一个或多个碳原子(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十个以上碳原子)的直链或分支链饱和烃，该烃任选被取代。注记“C1-14烷基”意谓任选地被取代的包括1-14个碳原子的直链或分支链饱和烃。除非另外规定，否则本文所述的烷基是指未被取代和被取代的烷基。
如本文所用，术语“烯基(alkenyl)”或“烯基(alkenyl group)”意谓包括两个或更多个碳原子(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或二十个以上碳原子)和至少一个双键的直链或分支链烃，该烃任选被取代。注记“C2-14烯基”意谓任选地被取代的包括2-14个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或分支链烃。烯基可包括一个、两个、三个、四个或四个以上碳-碳双键。在一些实施方案中，C18烯基可包括一个或多个双键。包括两个双键的C18烯基可以是亚油烯基。除非另外规定，否则本文所述的烯基是指未被取代和被取代的烯基。
如本文所用，术语“碳环(carbocycle)”或“碳环基(carbocyclic group)”意谓任选地被取代的包括一个或多个碳原子环的单环或多环系统。环可以是三员、四员、五员、六员、七员、八员、九员、十员、十一员、十二员、十三员、十四员、十五员、十六员、十七员、十八员、十九员或二十员环。注记“C3-6碳环”意谓包括具有3-6个碳原子的单环的碳环。碳环可包括一个或多个碳-碳双键或三键且可以是非芳族的或芳族的(例如环烷基或芳基)。碳环的实例包括环丙基、环戊基、环己基、苯基、萘基和1,2-二氢萘基。如本文所用，术语“环烷基”意谓非芳族碳环且可包括或可不包括任何双键或三键。除非另外规定，否则本文所述的碳环是指未被取代和被取代的碳环基，即，任选地被取代的碳环。
如本文所用，术语“杂环(heterocycle)”或“杂环基(heterocyclic group)”意谓任选地被取代的包括一个或多个环的单环或多环系统，其中至少一个环包括至少一个杂原子。杂原子可以是例如氮、氧或硫原子。环可以是三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元、十一元、十二元、十三元或十四元环。杂环可包括一个或多个双键或三键并且可以是非芳族的或芳族的(例如杂环烷基或杂芳基)。杂环的实例包括咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。如本文所用，术语“杂环烷基”意谓非芳族杂环并且可包括或可不包括任何双键或三键。除非另外规定，否则本文所述的杂环是指未被取代和被取代的杂环基，即，任选地被取代的杂环。
如本文所用，“生物可降解基团”是可促进哺乳动物实体中脂质的更快速代谢的基团。生物可降解基团可选自由但不限于以下组成的组：-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、芳基和杂芳基。如本文所用，“芳基”是任选地被取代的包括一个或多个芳族环的碳环基。芳基的实例包括苯基和萘基。如本文所用，“杂芳基”是任选地被取代的包括一个或多个芳族环的杂环基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。芳基和杂芳基均可任选被取代。在一些实施方案中，M和M’可选自由任选地被取代的苯基、噁唑和噻唑组成的非限制性组。在本文中的各式中，M和M’可独立地选自上文生物可降解基团的清单。除非另外规定，否则本文所述的芳基或杂芳基是指未被取代和被取代的基团，即，任选地被取代的芳基或杂芳基。
除非另外规定，否则烷基、烯基和环基(例如碳环基和杂环基)可任选被取代。任选地取代基可选自由但不限于以下组成的组：卤素原子(例如氯基、溴基、氟基或碘基)、羧酸(例如-C(O)OH)、醇(例如羟基、-OH)、酯(例如-C(O)OR或-OC(O)R)、醛(例如-C(O)H)、羰基(例如-C(O)R，或者由C＝O表示)、酰基卤(例如-C(O)X，其中X是选自溴基、氟基、氯基和碘基的卤基)、碳酸酯(例如-OC(O)OR)、烷氧基(例如-OR)、缩醛(例如-C(OR)2R””，其中各OR是可相同或不同的烷氧基，并且R””是烷基或烯基)、磷酸酯(例如P(O)4 3-)、硫醇(例如-SH)、亚砜(例如-S(O)R)、亚磺酸(例如-S(O)OH)、磺酸(例如-S(O)2OH)、硫醛(例如-C(S)H)、硫酸酯(例如S(O)4 2-)、磺酰基(例如-S(O)2-)、酰胺(例如-C(O)NR2或-N(R)C(O)R)、叠氮基(例如-N3)、硝基(例如-NO2)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如-NC)、酰氧基(例如-OC(O)R)、氨基(例如-NR2、-NRH或-NH2)、氨甲酰基(例如-OC(O)NR2、-OC(O)NRH或-OC(O)NH2)、磺酰胺(例如-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H或-N(H)S(O)2H)、烷基、烯基和环基(例如碳环基或杂环基)。在前述任一者中，R是如本文所定义的烷基或烯基。在一些实施方案中，所述取代基自身可进一步被例如一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所定义的取代基取代。在一些实施方案中，C1-6烷基可进一步被一个、两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的取代基取代。
如本文所用，如应用于一个或多个所关注的值的术语“大约”和“约”是指类似于所陈述的参考值的值。在一些实施方案中，除非另外规定或另外自上下文显而易知(除了该数字将超过可能值的100％的情况外)，否则术语“大约”或“约”是指所陈述的参考值在任一方向上(大于或小于)变化25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低范围内的值的范围。在一些实施方案中，当在LNP的脂质组分中既定化合物的量的背景中使用时，“约”可意谓所陈述值的+/-10％。例如，包括具有约40％的既定化合物的脂质组分的LNP可包括30-50％的该化合物。
如本文所用，术语“化合物”意欲包括所描绘的结构的所有异构体和同位素。“同位素”是指具有相同原子序数但由于原子核中的中子数不同而具有不同质量数的原子。在一些实施方案中，氢的同位素包括氚和氘。此外，本公开的化合物、盐或复合物可通过常规方法与溶剂或水分子组合制备以形成溶剂化物和水合物。
如本文所用，术语“之后”旨在指代动作发生之后的时间点。例如，“施用后”是指施用动作之后的时间点。
如本文所用，术语“接触(contacting)”意谓在两个或更多个实体之间建立物理连接。在一些实施方案中，使哺乳动物细胞与LNP接触意谓使该哺乳动物细胞与纳米颗粒共享物理连接。使细胞与外部实体在体内和离体接触的方法是生物学领域中众所周知的。在一些实施方案中，使LNP与处于哺乳动物内的哺乳动物细胞接触可通过不同施用途径(例如静脉内、肌肉内、皮内和皮下)执行，并且可涉及不同量的脂质纳米颗粒。此外，超过一种哺乳动物细胞可被LNP接触。
如本文所用，术语“可比较方法”是指关于所比较方法(例如制造本公开的LNP配制物)，具有可比较参数或步骤的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是具有所比较方法的步骤i)、步骤ia)、步骤iaa)、步骤ib)、步骤ii)、步骤iia)、步骤iib)、步骤iic)、步骤iid)及步骤iie)中的一个或多个的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是不具有所比较方法的步骤i)、步骤ia)、步骤iaa)、步骤ib)、步骤ii)、步骤iia)、步骤iib)、步骤iic)、步骤iid)及步骤iie)中的一个或多个的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是不具有所比较方法的步骤ia)和步骤ib)中的一个或多个的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是使用核酸的水溶性盐的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是使用不包含有机溶剂可溶性核酸的有机溶液的方法。在一些实施方案中，“可比较方法”是包括在施用脂质纳米颗粒配制物之前处理脂质纳米颗粒的方法。
如本文所用，术语“递送(delivering)”意谓向目的地提供实体。在一些实施方案中，向受试者递送治疗剂和/或预防剂可涉及向该受试者施用(例如根据静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)包括该治疗剂和/或预防剂的LNP。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用LNP可涉及使一种或多种细胞与脂质纳米颗粒接触。
如本文所用，术语“增强的递送(enhanced delivery)”意谓与对照纳米颗粒向所关注的目标组织递送治疗剂和/或预防剂的水平(例如MC3、KC2或DLinDMA)相比，纳米颗粒向所关注的目标组织(例如哺乳动物肝脏)递送的治疗剂和/或预防剂较多(例如至少1.5倍多、至少2倍多、至少3倍多、至少4倍多、至少5倍多、至少6倍多、至少7倍多、至少8倍多、至少9倍多、至少10倍多)。纳米颗粒向特定组织递送的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与该组织的重量，比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与该组织的重量，比较组织中产生的蛋白质的量与该组织中总蛋白质的量，或比较组织中的治疗剂和/或预防剂的量与该组织中总治疗剂和/或预防剂的量来测量。应理解，纳米颗粒向目标组织的增强的递送无需在所治疗的受试者中测定，它可在例如动物模型(例如大鼠模型)的替代物中测定。
如本文所用，术语“特异性递送(specific delivery)”、“特异性地递送(specifically deliver)”或“特异性地递送(specifically delivering)”意谓与脱靶组织(例如哺乳动物脾)相比，纳米颗粒向所关注的目标组织(例如哺乳动物肝脏)递送的治疗剂和/或预防剂较多(例如至少1.5倍多、至少2倍多、至少3倍多、至少4倍多、至少5倍多、至少6倍多、至少7倍多、至少8倍多、至少9倍多、至少10倍多)。纳米颗粒向特定组织递送的水平可通过比较组织中产生的蛋白质的量与该组织的重量，比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与该组织的重量，比较组织中产生的蛋白质的量与该组织中总蛋白质的量，或比较组织中治疗剂和/或预防剂的量与该组织中总治疗剂和/或预防剂的量来测量。在一些实施方案中，关于肾血管靶向，如果在全身性施用治疗剂和/或预防剂之后，与递送至肝脏或脾的量相比，每1g组织1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍或20倍多的治疗剂和/或预防剂被递送至肾，则如与肝脏及脾相比，治疗剂和/或预防剂特异性地提供至哺乳动物肾。应理解，纳米颗粒特异性地递送至目标组织的能力无需在所治疗的受试者中测定，它可在例如动物模型(例如大鼠模型)的替代物中测定。
如本文所用，“囊封效率(encapsulation efficiency)”是指相对于用于制备LNP的治疗剂和/或预防剂的初始总量，变成LNP的一部分的治疗剂和/或预防剂的量。在一些实施方案中，如果在最初提供至组合物的总计100mg治疗剂和/或预防剂中有97mg治疗剂和/或预防剂被囊封于LNP中，则囊封效率可以是97％。
如本文所用，“囊封(encapsulation)”、“囊封(encapsulated)”、“带负载的(loaded)”和“缔合(associated)”可指完全、实质性或部分封闭、限制、围绕或包装。如本文所用，“囊封”或“缔合(association)”可指将个别核酸分子限制于纳米颗粒内和/或在个别核酸分子与纳米颗粒之间建立生理化学联系的程序。如本文所用，“空纳米颗粒”可指基本上不含治疗剂或预防剂的纳米颗粒。如本文所用，“空纳米颗粒”可指基本上不含核酸的纳米颗粒。如本文所用，“空纳米颗粒”可指基本上仅由脂质组分组成的纳米颗粒。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽或蛋白质和/或多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，术语“体外”是指事件发生于人工环境中，例如试管或反应容器中、细胞培养物中、皮氏培养皿等中，而非发生于生物体(例如动物、植物或微生物)内。
如本文所用，术语“体内”是指事件发生于生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)内。
如本文所用，术语“离体”是指事件发生于生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)外部。离体事件可发生于相较于天然(例如体内)环境有最低程度地改变的环境中。
如本文所用，术语“异构体”意谓化合物的任何几何异构体、互变异构体、两性离子、立体异构体、对映异构体或非对映异构体。化合物可包括一个或多个手性中心和/或双键，并因此可以立体异构体，例如双键异构体(即，几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如对映异构体(即，(+)或(-))或顺式/反式异构体)存在。本公开涵盖本文所述化合物的任何和所有异构体，包括立体异构纯形式(例如几何异构纯、对映异构纯或非对映异构纯)以及对映异构体和立体异构体混合物(例如外消旋物)。化合物的对映异构体和立体异构体混合物以及将其拆分成其组分对映异构体或立体异构体的方式是众所周知的。
如本文所用，“脂质组分”是脂质纳米颗粒中包括一种或多种脂质的组分。在一些实施方案中，所述脂质组分可包括一种或多种阳离子/可离子化、PEG化、结构或其它脂质，例如磷脂。
如本文所用，“连接体”是连接两个部分的部分，例如帽物质的两个核苷之间的连接。连接体可包括一个或多个基团，包括但不限于磷酸酯基(例如磷酸酯、硼烷磷酸酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯及膦酸酯)、烷基、酰胺化物或甘油。在一些实施方案中，帽类似物的两个核苷可在其5’位置处由三磷酸酯基或由包括两个磷酸酯部分和一个硼烷磷酸酯部分的链连接。
如本文所用，“施用方法”可包括静脉内、肌肉内、皮内、皮下或向受试者递送组合物的其它方法。可选择一种施用方法以靶向递送(例如特异性地递送)至身体的特定区域或系统。
如本文所用，“被修饰”意谓非天然的。在一些实施方案中，RNA可以是被修饰的RNA。即，RNA可包括一个或多个非天然存在的核碱基、核苷、核苷酸或连接体。“被修饰”的物质在本文中也可称作“改变的”物质。物质可以化学方式、在结构上或在功能上被修饰或改变。在一些实施方案中，被修饰的核碱基物质可包括一种或多种非天然存在的取代。
如本文所用，“N:P比率”是例如在包括脂质组分和RNA的LNP中，脂质中的可离子化(在生理pH范围内)氮原子:RNA中的磷酸酯基的摩尔比率。
如本文所用，“脂质纳米颗粒”是包含一种或多种脂质的组合物。脂质纳米颗粒典型地是微米级或更小的大小并且可包括脂质双层。除非另外规定，否则如本文所用的脂质纳米颗粒涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如脂质囊泡)和脂质体复合物。在一些实施方案中，LNP可以是含有具有500nm或更小直径的脂质双层的脂质体。
如本文所用，“天然存在”意谓无人工辅助而存在于自然界中。
如本文所用，“患者”是指可寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将接受治疗的受试者，或处于针对特定疾病或疾患受过训练的专业人员的护理下的受试者。
如本文所用，“PEG脂质”或“PEG化脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
如本文所用，“聚合物脂质”是指在化学结构中包含重复亚基的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质是包含聚合物组分的脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质为PEG脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质并非PEG脂质。在一些实施方案中，所述聚合物脂质为Brij或OH-PEG-硬脂酸酯。
短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断的范围内适合与人类和动物组织接触使用而无过量毒性、刺激、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理效益/风险比率相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物以外并且具有在患者中基本上无毒且非炎性特性的任何成分(例如能够悬浮、复合或溶解活性化合物的媒剂)。赋形剂可包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、涂层、压缩助剂、崩解剂、染料(颜色)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或涂层、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮或分散剂、甜味剂以及水合水。例示性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(一氢)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶凝淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、乙醇酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E(α-生育酚)、维生素C、木糖醇以及本文所公开的其它物质。
组合物也可包括一种或多种化合物的盐。盐可以是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基团与适合有机酸反应)而发生改变。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机酸或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱盐或有机盐等等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、褐藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等；以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，这些盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。在一些实施方案中，非水性介质是乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。适合盐的清单可见于Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1985,第1418页，Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl及C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008，及Berge等人,Journal ofPharmaceutical Science,66,1-19(1977)中，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用，“磷脂”是包括磷酸酯部分和一个或多个碳链(例如不饱和脂肪酸链)的脂质。磷脂可包括一个或多个多(例如双或三)键(例如一个或多个不饱和键)。磷脂或其类似物或衍生物可包括胆碱。磷脂或其类似物或衍生物可不包括胆碱。特定磷脂可促进与膜融合。在一些实施方案中，阳离子磷脂可与膜(例如细胞或细胞内膜)的一个或多个带负电的磷脂相互作用。磷脂与膜融合可允许含脂质的组合物的一种或多种成分传递通过膜，从而允许例如将该一种或多种成分递送至细胞。
如本文所用，“多分散性指数”是描述系统粒度分布的均质性的比率。较小值，例如小于0.3，指示狭窄的粒度分布。
如本文所用，两亲性“聚合物”是包含寡聚物或聚合物的两亲性化合物。在一些实施方案中，两亲性聚合物可包含寡聚物片段，例如两个或更多个PEG单体单元。在一些实施方案中，本文所述的两亲性聚合物可以是PS 20。
如本文所用，术语“多肽”或“所关注的多肽”是指典型地通过肽键接合的氨基酸残基的聚合物，它可天然地(例如经分离或经纯化)或以合成方式产生。
如本文所用，“RNA”是指可天然或非天然存在的核糖核酸。在一些实施方案中，RNA可包括经修饰和/或非天然存在的组分，例如一种或多种核碱基、核苷、核苷酸或连接体。RNA可包括帽结构、链终止核苷、茎环、聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。RNA可具有编码所关注的多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，RNA可以是信使RNA(mRNA)。编码特定多肽的mRNA的翻译，例如哺乳动物细胞内mRNA的体内翻译，可产生编码多肽。RNA可选自由以下组成的非限制性组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)及其混合物。
如本文所用，“单一单位剂量”是以一次剂量/一次性/单一途径/单一接触点(即，单一施用事件)施用的任何治疗剂的剂量。
如本文所用，“分次剂量”是将单一单位剂量或总每日剂量分成两次或更多次剂量。
如本文所用，“总每日剂量”是在24小时的时段给出或开具处方的量。它可作为单一单位剂量施用。
如本文所用，术语“受试者”是指可例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的施用根据本公开的组合物或配制物的任何生物体。典型受试者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)和/或植物。
如本文所用，“Tx”是指LNP、LNP溶液、冻干LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备该LNP、LNP溶液、冻干的LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约X所持续的时间量。例如，“T80％”是指LNP、LNP溶液、冻干的LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备该LNP、LNP溶液、冻干的LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约80％所持续的时间量。另举一例，“T1/2”是指LNP、LNP溶液、冻干的LNP组合物或LNP配制物的核酸完整性(例如mRNA完整性)降级至用于制备该LNP、LNP溶液、冻干的LNP组合物或LNP配制物的核酸(例如mRNA)的初始完整性的约1/2所持续的时间量。
如本文所用，“靶细胞”是指任何一种或多种所关注的细胞。所述细胞可在生物体的体外、体内、原位或者组织或器官中发现。所述生物体可以是动物。在一些实施方案中，所述生物体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述生物体是人。在一些实施方案中，所述生物体是患者。
如本文所用，“靶组织”是指治疗剂和/或预防剂的递送将引起所需的生物和/或药理作用的任何一种或多种所关注的组织类型。所关注的靶组织的实例包括特定组织、器官和系统，或其群组。在特定应用中，靶组织可以是肾、肺、脾、在血管中(例如冠状动脉内或股动脉内)的血管内皮或肿瘤组织(例如通过肿瘤内注射)。“脱靶组织”是指编码蛋白的表达不会引起所需生物和/或药理作用的任何一种或多种组织类型。在特定应用中，脱靶组织可包括肝和脾。
术语“治疗剂”或“预防剂”是指当施用给受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起所需的生物和/或药理作用的任何剂。治疗剂也称作“活性剂(active)”或“活性剂(active agent)”。此类剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
如本文所用，术语“治疗有效量”意谓当施用给罹患或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者时足以治疗该感染、疾病、病症和/或疾患，改良其症状，诊断、预防该感染、疾病、病症和/或疾患，和/或延迟其发作的欲递送的剂(例如核酸、药物、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。
如本文所用，“转染”是指将物质(例如RNA)引入至细胞中。转染可例如在体外、离体或体内发生。
如本文所用，术语“治疗”是指部分地或完全地缓解、改善、改良、减轻特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度，和/或降低其发生率。在一些实施方案中，“治疗”癌症可指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于减少发展与疾病、病症和/或疾患相关的病变的风险的目的，治疗可施用给未展现疾病、病症和/或疾患的病征的受试者，和/或施用给仅展现疾病、病症和/或疾患的早期病征的受试者。
如本文所用，“ζ电位”是例如颗粒组合物中脂质的动电位。
如本文所用，术语“多分散性”、“多分散性指数”或“PDI”是指对给定样品中分子质量分布的量度。多分散性是如下计算：Mw/Mn，其中Mw是指质量平均摩尔质量(或分子量)且Mn是数量平均摩尔质量(或分子量)。
如本文所用，术语“空脂质纳米颗粒”或“空LNP”是指基本上不含治疗剂或预防剂的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，空LNP基本上不含核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，空LNP包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，与带负载的LNP相比，空LNP包含基本上较少的核酸(例如RNA)。在一些实施方案中，空LNP包含小于约5％w/w、小于约4％w/w、小于3％w/w、小于2％w/w、小于1％w/w、小于0.5％w/w、小于0.4％w/w、小于0.3％w/w、小于0.2％w/w或小于0.1％w/w的核酸(例如RNA)。在一些实施方案中，空LNP不含核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，空LNP进一步基本上不含与LNP表面缔合或与LNP外部缀合的核酸(例如mRNA)。
如本文所用，术语“带负载的脂质纳米颗粒”或“带负载的LNP”是指包含大量治疗剂或预防剂的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，带负载的LNP包含大量的核酸(例如mRNA)。在一些实施方案中，空LNP包含可离子化脂质、磷脂、结构脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，空LNP包含大量核酸(例如mRNA)，所述核酸至少部分在LNP的内部。在一些实施方案中，空LNP包含大量与LNP表面缔合或与LNP外部缀合的核酸(例如mRNA)。
应当理解，本文所公开的LNP的一些特性可通过毛细管区带电泳(CZE)表征。毛细管区带电泳(CZE)是指这样一种分离技术，该技术根据带电物质的电泳迁移率，使用毛细管两端的高电压来分离所述物质。在一些实施方案中，CZE是用乙酸盐缓冲液(例如pH 5的50mM乙酸钠)进行的。在一些实施方案中，CZE是在20cm有效长度的75um毛细管上以约10kV的反向电压进行。在一些实施方案中，毛细管涂覆有聚乙烯亚胺。
如本文所用，术语“迁移率峰”是指代表通过CZE测量的物质(例如LNP群体)分布的峰。在一些实施方案中，迁移率峰的强度是由散射光检测的。应理解，峰的强度可以指示物质在该峰的位置处的部分的量。在一些实施方案中，峰的位置是相对于以在0处的迁移率峰为特征的中性参考标准(例如DMSO)以及以在1.0处的迁移率峰为特征的带电参考标准(例如苯甲胺)计算。在一些实施方案中，根据CZE所测量，LNP群体可展现出多于一个峰，并且除非另有指示，否则迁移率峰是指在该多于一个峰中具有最大峰面积的峰。
如本文所用，术语“扩展”是指峰(例如迁移率峰)的半高宽度。
应理解，除非另有说明，否则本文所用的术语“大部分”是指至少约50％的部分。在一些实施方案中，所述大部分是至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
应理解，本文所公开的LNP的一些特性可以通过不对称流场流分级分离(AF4)表征。AF4是指单相分离，它使用针对膜的垂直流动(交错流)结合平行于膜的通道流动，根据样品的扩散行为对样品进行分级分离。通道流给出拋物线轮廓，并且垂直流驱动大分子朝向膜的边界层。与布朗运动(Brownian motions)相关的扩散在纵向流动较快的通道中以较高的扩散速率移动较小的颗粒，从而更快地洗脱较小的颗粒。在一些实施方案中，所述技术与分离相结合以对LNP的多分散性进行卷积。
如本文所用，术语“大小异质性模式峰”或“Rg模式峰”是指代表根据AF4所测量的物质(例如LNP群体)的分布的峰。在一些实施方案中，迁移率峰的强度是通过散射光、UV或RI检测。应理解，峰的强度可以指示物质在该峰的位置处的部分的量。在一些实施方案中，根据AF4所测量，LNP群体可展现出多于一个峰，并且除非另有指示，否则大小异质性模式峰是指在该多于一个峰中具有最大峰面积的峰。
如本文所用，术语“分布百分比”是指参考峰的峰面积占光谱或图中所有峰的总峰面积的百分比。例如，迁移率峰的分布百分比是指通过CZE所测量的迁移率峰的峰面积占物质(例如LNP群体)的所有峰的总峰面积的百分比。又例如，大小异质性模式峰的分布百分比是指根据AF4所测量的大小异质性模式峰的峰面积占物质(例如LNP群体)的所有峰的总峰面积的百分比。
如本文所用，术语“回转半径”是指到具有与物体的实际质量分布相同的惯性矩的点的径向距离，如果物体的总质量集中在那里的话。在一些实施方案中，回转半径是由AF4测量。
如本文所用，术语“不含”是指不包含所提到的组分。例如，当群体、溶液或配制物被描述为“不含PEG脂质”时，该群体、溶液或配制物不包含PEG脂质(例如不包含本文所述的PEG脂质(例如不包含PEG-DMG))。
可离子化脂质
本公开提供可离子化脂质。在一些实施方案中，可离子化脂质包括中央胺部分和至少一个生物可降解基团。在一些实施方案中，可离子化脂质是氨基脂质。本文所述的脂质可有利地用于脂质纳米颗粒和脂质纳米颗粒配制物以将治疗剂和/或预防剂(例如核酸)递送至哺乳动物细胞或器官。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-1)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中：
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由以下组成的组：氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，各o独立地选自1、2、3和4，并且各n独立地选自1、2、3、4和5；
各R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
各R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、
-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
R10选自由以下组成的组：H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基；
各R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H，
并且各q独立地选自1、2和3；
各R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
各R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各Y独立地为C3-6碳环；
各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；并且其中当R4为-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5元、6元或7元杂环烷基。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-X)的化合物：
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
或其盐或异构体，其中
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
R4选自由以下组成的组：氢、C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、N(R)R8、-N(R)S(O)2R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，各o独立地选自1、2、3和4，并且各n独立地选自1、2、3、4和5；
Rx选自由以下组成的组：C1-6烷基、C2-6烯基、-(CH2)vOH和-(CH2)vN(R)2，
其中v选自1、2、3、4、5和6；
各R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
各R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由以下组成的组：H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环；
R10选自由以下组成的组：H、OH、C1-3烷基和C2-3烯基；
各R独立地选自由以下组成的组：C1-3烷基、C2-3烯基、(CH2)qOR*和H，
并且各q独立地选自1、2和3；
各R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
各R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各Y独立地为C3-6碳环；
各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的子集包括式(IL-IA)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8及9；M1为键或M’；R4为氢、未被取代的C1-3烷基、-(CH2)oC(R10)2(CH2)n-oQ或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。例如，m为5、7或9。例如，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。例如，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(I)的化合物的子集包括式(IL-IB)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中所有变量均如本文所定义。在一些实施方案中，m选自5、6、7、8和9；R4为氢、未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，m为5、7或9。在一些实施方案中，Q为OH、-NHC(S)N(R)2或-NHC(O)N(R)2。在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，式(IL-I)的化合物的子集包括式(IL-II)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1为键或M’；R4为氢、未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n为2、3或4，并且Q为-OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-VI)的化合物：
或其N-氧化物，
或其盐或异构体，其中
R1选自由以下组成的组：C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR”、-YR”和-R”M’R’；
R2和R3独立地选自由以下组成的组：H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环；
各R5独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
各R6独立地选自由以下组成的组：OH、C1-3烷基、C2-3烯基和H；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
各R独立地选自由H、C1-3烷基和C2-3烯基组成的组；
RN为H或C1-3烷基；
各R’独立地选自由以下组成的组：C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H；
各R”独立地选自由C3-15烷基和C3-15烯基组成的组；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各Y独立地为C3-6碳环；
各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；
Xa和Xb各自独立地为O或S；
R10选自由以下组成的组：H、卤基、-OH、R、-N(R)2、-CN、-N3、-C(O)OH、-C(O)OR、-OC(O)R、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)OR、-S(O)2OR、-NO2、-S(O)2N(R)2、-N(R)S(O)2R、-NH(CH2)t1N(R)2、-NH(CH2)p1O(CH2)q1N(R)2、-NH(CH2)s1OR、-N((CH2)s1OR)2、碳环、杂环、芳基和杂芳基；
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13；
n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
r为0或1；
t1选自1、2、3、4和5；
p1选自1、2、3、4和5；
q1选自1、2、3、4和5；并且
s1选自1、2、3、4和5。
在一些实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VI-a)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
R1a和R1b独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；并且
R2和R3独立地选自由以下组成的组：C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR”、-YR”和-R*OR”，或R2和R3连同其所连接的原子形成杂环或碳环。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VII)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1为键或M’；并且
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIII)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
M1为键或M’；并且
Ra’和Rb’独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；并且
R2和R3独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-VI)、式(IL-VI-a)、式(IL-VII)或式(IL-VIII)中任一个的化合物在适用时包括以下特征中的一个或多个。
在一些实施方案中，M1为M’。
在一些实施方案中，M和M’独立地为-C(O)O-或-OC(O)-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一个为-C(O)O-或-OC(O)-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一个为-OC(O)-。
在某些实施方案中，M为-OC(O)-且M’为-C(O)O-。在一些实施方案中，M为-C(O)O-并且M’为-OC(O)-。在某些实施方案中，M和M’各自为-OC(O)-。在一些实施方案中，M和M’各自为-C(O)O-。
在某些实施方案中，M和M’中的至少一者为-OC(O)-M”-C(O)O-。
在一些实施方案中，M和M’独立地为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的至少一者为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的一者为-C(O)O-或-OC(O)-并且另一者为-S-S-。例如，M为-C(O)O-或-OC(O)-并且M’为-S-S-，或M’为-C(O)O-或-OC(O)-并且M为-S-S-。
在一些实施方案中，M和M’中的一者为-OC(O)-M”-C(O)O-，其中M”为键、C1-13烷基或C2-13烯基。在其它实施方案中，M”为C1-6烷基或C2-6烯基。在某些实施方案中，M”为C1-4烷基或C2-4烯基。例如，在一些实施方案中，M”为C1烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C2烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C3烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C4烷基。例如，在一些实施方案中，M”为C2烯基。例如，在一些实施方案中，M”为C3烯基。例如，在一些实施方案中，M”为C4烯基。
在一些实施方案中，l为1、3或5。
在一些实施方案中，R4为氢。
在一些实施方案中，R4不为氢。
在一些实施方案中，R4为未被取代的甲基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R或-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q为OH。
在一些实施方案中，Q为-NHC(S)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-NHC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)R。
在一些实施方案中，Q为-N(R)S(O)2R。
在一些实施方案中，Q为-O(CH2)nN(R)2。
在一些实施方案中，Q为-O(CH2)nOR。
在一些实施方案中，Q为-N(R)R8。
在一些实施方案中，Q为-NHC(＝NR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-NHC(＝CHR9)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-OC(O)N(R)2。
在一些实施方案中，Q为-N(R)C(O)OR。
在一些实施方案中，n为2。
在一些实施方案中，n为3。
在一些实施方案中，n为4。
在一些实施方案中，M1不存在。
在一些实施方案中，至少一个R5为羟基。例如，一个R5为羟基。
在一些实施方案中，至少一个R6为羟基。例如，一个R6为羟基。
在一些实施方案中，R5和R6中的一者为羟基。例如，一个R5为羟基并且各R6为氢。例如，一个R6为羟基并且各R5为氢。
在一些实施方案中，Rx为C1-6烷基。在一些实施方案中，Rx为C1-3烷基。例如，Rx为甲基。例如，Rx为乙基。例如，Rx为丙基。
在一些实施方案中，Rx为-(CH2)vOH并且v为1、2或3。例如，Rx为甲酰基。例如，Rx为乙酰基。例如，Rx为丙酰基。
在一些实施方案中，Rx为-(CH2)vN(R)2，v为1、2或3并且各R为H或甲基。例如，Rx为甲氨基、甲基甲氨基或二甲基甲氨基。例如，Rx为氨基甲基、甲基氨基甲基或二甲基氨基甲基。例如，Rx为氨基乙基、甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。例如，Rx为氨基丙基、甲基氨基丙基或二甲基氨基丙基。
在一些实施方案中，R’为C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”或-YR”。
在一些实施方案中，R2和R3独立地为C3-14烷基或C3-14烯基。
在一些实施方案中，R1b为C1-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C2-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C3-14烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-8烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-5烷基。在一些实施方案中，R1b为C1-3烷基。在一些实施方案中，R1b选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C1烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C2烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C3烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C4烷基。例如，在一些实施方案中，R1b为C5烷基。
在一些实施方案中，R1不同于-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7。
在一些实施方案中，-CHR1aR1b-不同于-(CHR5R6)m-M-CR2R3R7。
在一些实施方案中，R7为H。在一些实施方案中，R7选自C1-3烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C1烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C2烷基。例如，在一些实施方案中，R7为C3烷基。在一些实施方案中，R7选自C4烷基、C4烯基、C5烷基、C5烯基、C6烷基、C6烯基、C7烷基、C7烯基、C9烷基、C9烯基、C11烷基、C11烯基、C17烷基、C17烯基、C18烷基和C18烯基。
在一些实施方案中，Rb’为C1-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C2-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C3-14烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-8烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-5烷基。在一些实施方案中，Rb’为C1-3烷基。在一些实施方案中，Rb’选自C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基和C5烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C1烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C2烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C3烷基。例如，在一些实施方案中，Rb’为C4烷基。
在一个实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIa)：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIb)：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIc)或式(IL-IIe)：
/>
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在另一实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIf)：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中M为-C(O)O-或-OC(O)-，M”为C1-6烷基或C2-6烯基，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组，并且n选自2、3和4。
在又一实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IId)：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R’、R”和R2-R6如本文所述。在一些实施方案中，R2和R3各自可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在又一实施方案中，式(IL-I)的化合物具有式(IL-IIg)：
或其N-氧化物或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1为键或M’；M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。在一些实施方案中，M”为C1-6烷基(例如C1-4烷基)或C2-6烯基(例如C2-4烯基)。在一些实施方案中，R2和R3独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIa)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIIa)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIIb)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIb-1)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIb-2)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIb-3)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIc)的化合物：
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIId)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIIc)的化合物：
在另一实施方案中，式(IL-VI)的化合物的子集包括式(IL-VIIId)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体。
式(IL-I)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-VI)、式(IL-VI-a)、式(IL-VII)、式(IL-VIII)、式(IL-VIIa)、式(IL-VIIIa)、式(IL-VIIIb)、式(IL-VIIb-1)、式(IL-VIIb-2)、式(IL-VIIb-3)、式(IL-VIIc)、式(IL-VIId)、式(IL-VIIIc)或式(IL-VIIId)在适用时包括以下特征中的一个或多个。
在一些实施方案中，可离子化脂质是PCT申请第PCT/US2020/051613号、第PCT/US2020/051613号和第PCT/US2020/051629号，以及PCT公开第WO 2017/049245号、第WO2018/170306号、第WO 2018/170336号、第WO 2020/061367号中所述的化合物中的一种或多种。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自美国申请第62/475,166号中所述的化合物1-280。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为(IL-1)。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-2。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-3。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-4。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-5。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-6。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-7。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-8。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-9。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-10。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-11。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-12。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-13。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
/>
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-14。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-15。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-16。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-17。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-18。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-19。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-VIVa)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，
其中R’a为R’分支链或R’环状；其中
R’分支链为且R’环状为：/>并且
R’b是：
其中表示附接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为-(CH2)2OH；
各R’独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-VIVb)的化合物：
或其N-氧化物或其盐或异构体，
其中R’a为R’分支链或R’环状；其中
R’分支链为且R’环状为：/>并且
R’b是：
其中表示附接点；
其中Raγ和Rbγ各自独立地为C2-12烷基或C2-12烯基；
R2和R3各自独立地选自由C1-14烷基和C2-14烯基组成的组；
R4为其中/>表示附接点；
R10为N(R)2；各R独立地选自由C1-6烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且n2选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组；
各R’独立地为C1-12烷基或C2-12烯基；
Ya为C3-6碳环；
R*”a选自由C1-15烷基和C2-15烯基组成的组；并且
s为2或3。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自：
在一些方面，本公开的可离子化脂质可以是一种或多种式(IL-III)的化合物：
或其盐或异构体，其中，
W是
环A为
t为1或2；
A1和A2各自独立地选自CH或N；
Z为CH2或不存在，其中当Z为CH2时，虚线(1)和虚线(2)各自表示单键；并且当Z不存在时，虚线(1)和虚线(2)均不存在；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：C5-20烷基、C5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”和-R*OR”；
RX1和RX2各自独立地为H或C1-3烷基；
各M独立地选自由以下组成的组：-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基和杂芳基；
M*为C1-C6烷基，
W1及W2各自独立地选自由-O-和-N(R6)-组成的组；
各R6独立地选自由H和C1-5烷基组成的组；
X1、X2和X3独立地选自由以下组成的组：键、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)O-、-OC(O)-(CH2)n-、-(CH2)n-OC(O)-、-C(O)O-(CH2)n-、-CH(OH)-、-C(S)-和-CH(SH)-；
各Y独立地为C3-6碳环；
各R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
各R独立地选自由C1-3烷基和C3-6碳环组成的组；
各R’独立地选自由C1-12烷基、C2-12烯基和H组成的组；
各R”独立地选自由C3-12烷基、C3-12烯基和-R*MR’组成的组；并且
n为整数1-6；
其中当环A是时，则
i)X1、X2和X3中的至少一个不为-CH2-；和/或
ii)R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-R”MR’。
在一些实施方案中，所述化合物具有式(IL-IIIa1)-式(IL-IIIa8)中的任一个：
在一些实施方案中，可离子化脂质是PCT公开第WO 2017/112865号、第WO 2018/232120号中所描述的一种或多种化合物。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自PCT公开第WO 2018/232120号中所描述的化合物1-156。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自PCT公开第WO 2017/112865号中所描述的化合物1-16、化合物42-66、化合物68-76及化合物78-156。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-20。
在一些实施方案中，可离子化脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，可离子化脂质为IL-21。
根据式(IL-1)、式(IL-IA)、式(IL-IB)、式(IL-II)、式(IL-IIa)、式(IL-IIb)、式(IL-IIc)、式(IL-IId)、式(IL-IIe)、式(IL-IIf)、式(IL-IIg)、式(IL-III)、式(IL-IIIa1)、式(IL-IIIa2)、式(IL-IIIa3)、式(IL-IIIa4)、式(IL-IIIa5)、式(IL-IIIa6)、式(IL-IIIa7)或式(IL-IIIa8)的脂质的中央胺部分可在生理pH下质子化。因此，脂质可在生理pH下具有正电荷或部分正电荷。此类脂质可称作阳离子或可离子化(氨基)脂质。脂质也可以是两性离子性的，即，同时具有正电荷和负电荷的中性分子。
在一些实施方案中，可离子化脂质选自由以下组成的组：3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2R))及(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA(2S))。
聚乙二醇(PEG)脂质
如本文所用，术语“PEG脂质”是指被聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。PEG脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺以及PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称作PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油烯基、PEG-二油烯基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基咪唑双酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物。
在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22的脂质部分。在一些实施方案中，PEG脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C16的脂质部分。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)的大小为约1000道尔顿、2000道尔顿、5000道尔顿、10,000道尔顿、15,000道尔顿或20,000道尔顿。在一个实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含PEG脂质，其为不可扩散PEG。不可扩散PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域中已知的，例如描述于美国专利第8158601号和国际公开第WO2015/130584 A2号中者，所述文献以引用的方式整体并入本文中。
一般而言，本文所述的各式的一些其它脂质组分(例如PEG脂质)可如2016年12月10日提出申请的标题为“Compositions and Methods for Delivery of TherapeuticAgents”的国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述般合成，该案以引用的方式整体并入。
脂质纳米颗粒或脂质纳米颗粒配制物的脂质组分可包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，例如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称作PEG化脂质。PEG脂质是被聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自以下包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油及其混合物的非限制性组。在一些实施方案中，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG DMG的修饰的形式。PEG-DMG具有以下结构：
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是国际公开第WO2012099755号中所描述的PEG化脂质，该案的内容以引用的方式整体并入本文中。本文所述的这些例示性PEG脂质中的任一者均可被修饰成在PEG链上包含羟基。在一些实施方案中，PEG脂质为PEG-OH脂质。如本文一般所定义，“PEG-OH脂质”(本文中也称作“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)的PEG化脂质。在一些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在一些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为式(PL-I)的化合物。本文提供式(PL-I)的化合物：
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选地被取代的烷基或氧保护基；
r为在1与100之间的整数，包括1和100；
L1为任选地被取代的C1-10亚烷基，其中所述任选地被取代的C1-10亚烷基的至少一个亚甲基独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
D是通过点击化学获得的部分或在生理条件下可裂解的部分；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2的各情况独立地为键或任选地被取代的C1-6亚烷基，其中所述任选地被取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选被O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O或NRNC(O)N(RN)置换；
R2的各情况独立地为任选地被取代的C1-30烷基、任选地被取代的C1-30烯基或任选地被取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基；
环B为任选地被取代的碳环基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；并且
p为1或2。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物为PEG-OH脂质(即，R3为-ORO，并且RO为氢)。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-OH)：
或其盐。
在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为PEG化脂肪酸。在一些实施方案中，可用于本发明的PEG脂质为式(PL-II)的化合物。本文提供式(PL-II)的化合物：
或其盐，其中：
R3为-ORO；
RO为氢、任选地被取代的烷基或氧保护基；
r为1与100之间的整数，包括1和100；
R5为任选地被取代的C10-40烷基、任选地被取代的C10-40烯基或任选地被取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基单元被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，式(PL-II)化合物具有式(PL-II-OH)：
或其盐，其中：
r为在1与100之间的整数；
R5为任选地被取代的C10-40烷基、任选地被取代的C10-40烯基或任选地被取代的C10-40炔基；并且任选地，R5的一个或多个亚甲基被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(＝NRN)、C(＝NRN)N(RN)、NRNC(＝NRN)、NRNC(＝NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)或N(RN)S(O)2O置换；并且
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基。
在一些实施方案中，r为10至80之间、20至70之间、30至60之间或40至50之间的整数。
在一些实施方案中，r为45。
在一些实施方案中，R5为C17烷基。
在其它实施方案中，式(PL-II)化合物为：
/>
或其盐。
在一个实施方案中，式(PL-II)化合物为
在一些方面，本文所述的药物组合物的脂质组合物不包含PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质可以是美国申请第62/520,530号中所描述的一种或多种PEG脂质。
在一些实施方案中，PEG脂质为式(PL-III)的化合物：
或其盐或异构体，其中s为在1与100之间的整数。
在一些实施方案中，PEG脂质为下式的化合物：
或其盐或异构体。
结构脂质
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇，并且也指含有固醇部分的脂质。
在脂质纳米颗粒中并入结构脂质可帮助减轻颗粒中的其它脂质的聚集。结构脂质可选自包括但不限于胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇、类固醇及其混合物的组。在一些实施方案中，结构脂质为两种或更多种组分的混合物，各组分独立地选自胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、藿烷、植物固醇及类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为固醇。在一些实施方案中，结构脂质为两种或更多种固醇的混合物。如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成之类固醇子组。在一些实施方案中，结构脂质为类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇之类似物。在一些实施方案中，结构脂质为α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质可以是美国申请第62/520,530号中所描述的一种或多种结构脂质。
如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成之类固醇子组。在一些实施方案中，结构脂质为类固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质为胆固醇之类似物。在一些实施方案中，结构脂质为α-生育酚。
在一些实施方案中，结构脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，结构脂质为SL-1。
在一些实施方案中，结构脂质为
或其盐。
在一些实施方案中，所述结构脂质(例如SL-2)是以在约15mol％至约70mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约50mol％、约30mol％至约45mol％、约35mol％至约40mol％或者约36mol％至约38mol％范围内的浓度存在。
在一些实施方案中，所述结构脂质(例如SL-2)是以约36.6±25mol％、约36.6±20mol％、约36.6±15mol％、约36.6±10mol％、约36.6±9mol％、约36.6±8mol％、约36.6±7mol％、约36.6±6mol％、约36.6±5mol％、约36.6±4mol％、约36.6±3mol％、约36.6±2mol％、约36.6±1mol％、约36.6±0.8mol％、约36.6±0.6mol％、约36.6±0.5mol％、约36.6±0.4mol％、约36.6±0.3mol％、约36.6±.2mol％或约36.6±0.1mol％(例如约36.6mol％)的浓度存在。
囊封剂
在本公开的一些实施方案中，囊封剂为式(EA-I)的化合物：
或其盐或异构体，其中
R201和R202各自独立地选自由以下组成的组：H、C1-C6烷基、C2-C6烯基和(C＝NH)N(R101)2，其中各R101独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R203选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；
R204选自由以下组成的组：H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)和C(O)(NHC2-C20烯基)；
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，R201和R202各自独立地选自由H和CH3组成的组。
在一些实施方案中，R201和R202各自独立地选自由(C＝NH)NH2和(C＝NH)N(CH3)2组成的组。
在一些实施方案中，R203选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，R204选自由以下组成的组：H、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C(O)(OC1-C20烷基)、C(O)(OC2-C20烯基)、C(O)(NHC1-C20烷基)及C(O)(NHC2-C20烯基)；C8-C18烷基、C8-C18烯基、C(O)(OC8-C18烷基)、C(O)(OC8-C18烯基)、C(O)(NHC8-C18烷基)和C(O)(NHC8-C18烯基)；以及C12-C16烷基、C12-C16烯基、C(O)(OC12-C16烷基)、C(O)(OC12-C16烯基)、C(O)(NHC12-C16烷基)和C(O)(NHC12-C16烯基)；
在一些实施方案中，n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；n1选自1、2、3、4、5和6；n1选自2、3和4。
在一些实施方案中，n1为3。
在本公开的一些实施方案中，囊封剂为式(EA-II)的化合物：
或其盐或异构体，其中
X101为键、NH或O；
R101和R102各自独立地选自由H、C1-C6烷基和C2-C6烯基组成的组；
R103和R104各自独立地选自由C1-C20烷基和C2-C20烯基组成的组；并且
n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，X101为键。
在一些实施方案中，X101为NH。
在一些实施方案中，X101为O。
在一些实施方案中，R101和R102各自独立地选自由H和CH3组成的组。
在一些实施方案中，R103选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，R104选自由C1-C20烷基、C8-C18烷基和C12-C16烷基组成的组。
在一些实施方案中，n1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；n1选自1、2、3、4、5和6；n1选自2、3和4。
在一些实施方案中，n1为3。
例示性囊封剂包括但不限于月桂酰精氨酸乙酯、肉豆蔻酰精氨酸乙酯、棕榈酰精氨酸乙酯、胆固醇-精氨酸乙酯、油酸精氨酸乙酯、癸酸精氨酸乙酯及辛酸精氨酸乙酯。
在某些实施方案中，囊封剂为月桂酰精氨酸乙酯
或其盐或异构体。
在某些实施方案中，囊封剂是至少一种选自由以下组成的组的化合物：
/>
或其盐和异构体，例如游离碱、TFA盐和/或HCl盐。
磷脂
磷脂可组装成一个或多个脂质双层。一般而言，磷脂包含一个磷脂部分以及一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂组成的非限制性组。
脂肪酸部分可选自例如由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚麻油酸、α-次亚麻油酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生油酸、二十碳五烯酸、二十二酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
特定磷脂可促进融合至膜。在一些实施方案中，阳离子磷脂可与膜(例如细胞或细胞内膜)的一种或多种带负电的磷脂相互作用。磷脂与膜融合可允许含脂质的组合物(例如LNP)的一种或多种成分(例如治疗剂)传递通过膜，从而允许例如将该一种或多种成分递送至靶组织。
还考虑非天然磷脂物质，包括具有包括分支、氧化、环化和炔在内的修饰和取代的天然物质。在一些实施方案中，磷脂可被一种或多种炔(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔交联。在适当反应条件下，炔基可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成。此类反应可用于使纳米颗粒组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或可用于使纳米颗粒组合物结合于有用组分，例如靶向或成像部分(例如染料)。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括磷酸鞘脂，例如鞘磷脂。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是DSPC之类似物或变体。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂是式(PL-I)的化合物：
或其盐，其中：
各R1独立地为任选地被取代的烷基；或任选地，两个R1与介入原子接合在一起以形成任选地被取代的单环碳环基或任选地被取代的单环杂环基；或任选地，三个R1与介入原子接合在一起以形成任选地被取代的双环碳环基或任选地被取代的双环杂环基；
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
A具有下式：
L2的各情况独立地为键或任选地被取代的C1-6亚烷基，其中所述任选地被取代的C1-6亚烷基的一个亚甲基单元任选被-O、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-或-NRNC(O)N(RN)-置换；
R2的各情况独立地为任选地被取代的C1-30烷基、任选地被取代的C1-30烯基或任选地被取代的C1-30炔基；任选地，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；
RN的各情况独立地为氢、任选地被取代的烷基或氮保护基；
环B为任选地被取代的碳环基、任选地被取代的杂环基、任选地被取代的芳基或任选地被取代的杂芳基；并且
p为1或2；
其限制条件在于所述化合物不具有下式：
其中R2的各情况独立地为未被取代的烷基、未被取代的烯基或未被取代的炔基。
在一些实施方案中，磷脂可以是描述于美国申请第62/520,530号中的一种或多种磷脂。
在一些实施方案中，磷脂可选自由以下组成的非限制性组：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)以及鞘磷脂。在一些实施方案中，LNP包括DSPC。在一些实施方案中，LNP包括DOPE。在一些实施方案中，LNP包括DSPC和DOPE两者。
i)磷脂头修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含被修饰的磷脂头(例如被修饰的胆碱基团)。在一些实施方案中，具有被修饰的头的磷脂是具有被修饰的季胺的DSPC或其类似物。在一些实施方案中，在式(PL-I)的实施方案中，至少一个R1不为甲基。在一些实施方案中，至少一个R1不为氢或甲基。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物是以下各式中的一者：
或其盐，其中：
各t独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
各u独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
各v独立地为1、2或3。
在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-a)：
或其盐。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含替代甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，可用于本发明的磷脂为DSPC或其类似物，具有替代甘油酯部分的环状部分。在一些实施方案中，式(PL-I)化合物具有式(PL-I-b)：
或其盐。
ii)磷脂尾修饰
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含被修饰的尾。在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为DSPC或其类似物，具有被修饰的尾。如本文所述，“被修饰的尾”可以是具有较短或较长脂族链、引入分支链的脂肪族链、引入取代基的脂肪族链、其中一个或多个亚甲基由环状或杂原子基团置换的脂肪族链或其任何组合的尾。在一些实施方案中，(PL-I)的化合物具有式(PL-I-a)，或其盐，其中R2的至少一种情况为R2的各情况为任选地被取代的C1-30烷基，其中R2的一个或多个亚甲基单元独立地被任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换。
在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有式(PL-I-c)：
或其盐，其中：
各x独立地为0-30之间的整数，包括0和30；并且
G的各情况独立地选自由以下组成的组：任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基、任选地被取代的亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-。每种可能性代表本发明的一单独实施方案。
在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂包含被修饰的磷酸胆碱部分，其中连接季胺至磷酰基的烷基链不为亚乙基(例如n不为2)。因此，在一些实施方案中，可用于或潜在可用于本发明的磷脂为式(PL-I)化合物，其中n为1、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，式(PL-I)的化合物具有以下各式中的一者：
或其盐。
替代脂质
在一些实施方案中，替代脂质替代本公开的磷脂来使用。此类替代脂质的非限制性实例包括以下：
佐剂
在一些实施方案中，包括本文所述的一种或多种脂质的LNP可另外包括一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡脱氧核苷酸(例如A类或B类)、聚(I:C)、氢氧化铝及Pam3CSK4。
治疗剂
脂质纳米颗粒(例如空LNP或带负载的LNP)可包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。本公开的特征在于向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂、在哺乳动物细胞中产生所关注的多肽及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒(例如空LNP或带负载的LNP)和/或使哺乳动物细胞与包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒(例如空LNP或带负载的LNP)接触。
治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质并且替代地称作“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞、器官或其它身体组织或系统中引起所需变化的物质。此类物质可用于治疗一种或多种疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或疾患的小分子药物。
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是疫苗、引起免疫反应的化合物(例如编码蛋白质或多肽或肽的多核苷酸或核酸分子或蛋白质或多肽或肽)和/或另一治疗剂和/或预防剂。疫苗包括能够提供针对与传染病相关的一种或多种疾患的免疫性，并且可包括编码传染病源性抗原和/或表位的mRNA的化合物和制剂。疫苗也包括引导针对癌细胞的免疫反应并且可包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA的化合物和制剂。在一些实施方案中，疫苗和/或能够引起免疫反应的化合物是通过本公开的组合物在肌肉内施用。
在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂为蛋白质，例如增加或置换所关注的天然存在的蛋白质所需的蛋白质。此类蛋白质或多肽可以是天然存在的，或可使用本领域中已知的方法被修饰，例如以增加半衰期。例示性蛋白质为细胞内、跨膜或分泌性的。
多核苷酸和核酸
在一些实施方案中，治疗剂是增强(即，增加、刺激、上调)蛋白质表达的剂。可用于增强蛋白质表达的治疗剂类型的非限制性实例包括RNA、mRNA、dsRNA、CRISPR/Cas9技术、ssDNA和DNA(例如表达载体)。上调蛋白质表达的剂可上调天然存在或非天然存在的蛋白质(例如被修饰用于改良半衰期的嵌合蛋白，或包含所需氨基酸变化的蛋白质)的表达。例示性蛋白质包括细胞内、跨膜或分泌性蛋白质、肽或多肽。
在一些实施方案中，治疗剂为DNA治疗剂。DNA分子可以是双链DNA、单链DNA(ssDNA)或作为部分双链DNA的分子(即，具有双链部分及单链部分)。在一些情况下，DNA分子为三链的或为部分三链的(即，具有三链部分及双链部分)。DNA分子可以是环状DNA分子或直链DNA分子。
DNA治疗剂可以是能够将基因转移至细胞中，例如编码转录物且可表达转录物的DNA分子。在其它实施方案中，DNA分子为合成分子，例如体外产生的合成DNA分子。在一些实施方案中，DNA分子为重组分子。非限制性例示性DNA治疗剂包括质粒表达载体和病毒表达载体。
本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括多种不同特征。本文所述的DNA治疗剂(例如DNA载体)可包括非编码DNA序列。例如，DNA序列可包括针对基因的至少一种调控元件，例如启动子、增强子、终止元件、聚腺苷酸化信号元件、剪接信号元件及其类似元件。在一些实施方案中，非编码DNA序列为内含子。在一些实施方案中，非编码DNA序列为转座子。在一些实施方案中，本文所述的DNA序列可具有可操作性连接至转录活性基因的非编码DNA序列。在其它实施方案中，本文所述的DNA序列可具有未连接至基因的非编码DNA序列，即该非编码DNA不调控该DNA序列上的基因。
在一些实施方案中，在本公开的带负载的LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂为核酸。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂选自由核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂为DNA时，该DNA选自由以下组成的组：双链DNA、单链DNA(ssDNA)、部分双链DNA、三链DNA及部分三链DNA。在一些实施方案中，所述DNA选自由环状DNA、直链DNA及其混合物组成的组。
在一些实施方案中，在本公开的带负载的LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂选自由质粒表达载体、病毒表达载体及其混合物组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂为RNA时，该RNA选自由单链RNA、双链RNA(dsRNA)、部分双链RNA及其混合物组成的组。在一些实施方案中，所述RNA选自由环状RNA、直链RNA及其混合物组成的组。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂为RNA时，该RNA选自由以下组成的组：短干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、RNA干扰(RNAi)分子、微小RNA(miRNA)、同型替代抗体(antagomir)、反义RNA、核糖核酸酵素、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、锁核酸(LNA)和CRISPR/Cas9技术，及其混合物。
例如，在一些实施方案中，当所述治疗剂和/或预防剂为RNA时，该RNA选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂为mRNA。在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂为被修饰mRNA(mmRNA)。
在一些实施方案中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂是并入微小RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA。此外，在一些实施方案中，mRNA包括茎环、链终止核苷、聚腺苷酸序列、聚腺苷酸化信号和/或5’帽结构中的一或多者。
mRNA可以是天然或非天然存在的mRNA。mRNA可如下文所述包括一个或多个被修饰核碱基、核苷或核苷酸，在此情况下其可称作“被修饰mRNA”或“mmRNA”。如本文所述，“核苷”是定义为含有与有机碱(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中也称作“核碱基”)组合的糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”是定义为包括磷酸酯基的核苷。
mRNA可包括5’不翻译区(5’-UTR)、3’不翻译区(3’-UTR)和/或编码区(例如开放阅读框)。mRNA可包括任何适合数目的碱基对，包括数十个(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个)、数百个(例如200、300、400、500、600、700、800或900个)或数千个(例如1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个)碱基对。任何数目(例如全部、一些或无)的核碱基、核苷或核苷酸均可以是经典物质之类似物，经取代、被修饰或以其它方式非天然存在。在某些实施方案中，特定核碱基类型的全部可被修饰。在一些实施方案中，所有尿嘧啶或尿苷均被修饰。当所有核碱基、核苷或核苷酸均被修饰，例如所有尿嘧啶或尿苷时，mRNA可称作“完全被修饰”，例如针对尿嘧啶或尿苷。
在一些实施方案中，如本文所述的mRNA可包括5’帽结构、链终止核苷酸、任选地Kozak序列(也称作Kozak共有序列)、茎环、聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。
5'帽结构或帽物质是包括通过连接体接合的两个核苷部分的化合物并且可选自天然存在的帽、非天然存在的帽或帽类似物或抗-反向帽类似物(ARCA)。帽物质可包括一个或多个被修饰的核苷和/或连接体部分。例如，天然mRNA帽可包括鸟嘌呤核苷酸和在7位置处甲基化的鸟嘌呤(G)核苷酸，由所述核苷酸的5’位置处的三磷酸酯键接合，例如m7G(5’)ppp(5’)G，通常书写为m7GpppG。帽物质也可以是抗-反向帽类似物。可能的帽物质的非限制性清单包括m7GpppG、m7Gpppm7G、m73’dGpppG、m27,O3’GpppG、m27,O3’GppppG、m27,O2’GppppG、m7Gpppm7G、m73’dGpppG、m27,O3’GpppG、m27,O3’GppppG和m27,O2’GppppG。
mRNA可替代地或另外包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在其糖基的2’和/或3’位置处脱氧的核苷。此类物质可包括3’脱氧腺苷(蛹虫草菌素)、3’脱氧尿苷、3’脱氧胞嘧啶、3’脱氧鸟苷、3’脱氧胸腺嘧啶及2',3’二脱氧核苷(例如2',3’二脱氧腺苷、2',3’二脱氧尿苷、2',3’二脱氧胞嘧啶、2',3’二脱氧鸟苷及2',3’二脱氧胸腺嘧啶)。在一些实施方案中，将链终止核苷酸并入至mRNA中例如3’-末端处可导致mRNA的稳定化。
mRNA可替代地或另外包括茎环，例如组蛋白茎环。茎环可包括2、3、4、5、6、7、8个或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可位于mRNA的任何区中。例如，茎环可位于不翻译区(5’不翻译区或3’不翻译区)、编码区或聚腺苷酸序列或尾中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可影响mRNA的一种或多种功能，例如翻译起始、翻译效率和/或转录终止。
mRNA可替代地或另外包括聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸序列可仅包含或主要包含腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物。聚腺苷酸序列也可包含稳定化核苷酸或类似物。例如，聚腺苷酸序列可包括脱氧胸苷作为稳定化核苷酸或类似物，例如反向(或反向键)脱氧胸苷(dT)。关于使用反向dT和其它稳定化聚腺苷酸序列修饰的详情可见于例如WO2017/049275A2中，该案的内容以引用的方式并入本文中。聚腺苷酸序列可以是与mRNA的3’不翻译区相邻定位的尾。在一些实施方案中，聚腺苷酸序列可影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。
mRNA可替代地或另外包括微小RNA结合位点。微小RNA结合位点(或miR结合位点)可用于调控多种组织或细胞类型中的mRNA表达。在例示性实施方案中，miR结合位点是被工程改造成mRNA的3’UTR序列以调控(例如增强)mRNA在表达同源miR的细胞或组织中的降解。此类调控可用于调控或控制mRNA的“脱靶”表达，即体内在非所需细胞或组织中的表达。关于使用mir结合位点的详情可见于例如WO 2017/062513 A2中，该案的内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，mRNA是包含第一编码区和第二编码区的双顺反子mRNA，所述编码区具有包含允许第一编码区与第二编码区之间的内部翻译起始的内部核糖体进入位点(IRES)序列的介入序列，或具有编码自裂解肽(例如2A肽)的介入序列。IRES序列和2A肽典型地用于增强来自同一载体的多种蛋白质的表达。多种IRES序列是本领域中已知的并且可获得的，并且可加以使用，包括例如脑心肌炎病毒IRES。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含一个或多个被修饰的核碱基、核苷或核苷酸(称作“被修饰mRNA”或“mmRNA”)。在一些实施方案中，被修饰的mRNA可具有可用特性，包括如与参考未被修饰的mRNA相比，增强的稳定性、细胞内保留、增强的翻译和/或缺乏其中引入该mRNA的细胞的先天免疫反应的实质诱导。因此，被修饰的mRNA的使用可增强蛋白质产生效率、核酸的细胞内保留，以及具有降低的免疫原性。
在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如1、2、3或4个)不同的被修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个)不同的被修饰的核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，相对于相应的未被修饰的mRNA，被修饰的mRNA可在其中引入该mRNA的细胞中具有降低的降解。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的尿嘧啶。具有被修饰的尿嘧啶的例示性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒并-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸腺嘧啶、2’-F-阿拉伯糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿苷。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的胞嘧啶。具有被修饰的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲酰基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(k2C)、α-硫代-胞苷、2’-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞苷、2’-F-阿拉伯糖-胞苷、2’-F-胞苷以及2’-OH-阿拉伯糖-胞苷。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的腺嘌呤。具有被修饰的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括a-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲基硫代-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘胺酰基氨甲酰基-腺苷(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(m6t6A)、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(hn6A)、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2’-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-阿拉伯糖-腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-阿拉伯糖-腺苷以及N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的鸟嘌呤。具有被修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括a-硫代-鸟苷、肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-去甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OhyW)、修饰不足的羟基怀丁苷(OhyW*)、7-去氮杂-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1G)、N2-甲基-鸟苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m22G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m2,2,7G)、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2’-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2’-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、2’-F-阿拉伯糖-鸟苷以及2’-F-鸟苷。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、2-硫代尿苷、4’-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷或2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。在一些实施方案中，被修饰的核碱基为N1-甲基假尿苷(m1ψ)并且本公开的mRNA完全地被N1-甲基假尿苷(m1ψ)修饰。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的75-100％尿嘧啶。在一些实施方案中，N1-甲基假尿苷(m1ψ)表示mRNA中的100％尿嘧啶。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的胞嘧啶。具有被修饰的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括N4-乙酰基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-卤基-胞苷(例如5-碘-胞苷)、5-羟基甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的腺嘌呤。具有被修饰的腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括7-去氮杂-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是被修饰的鸟嘌呤。具有被修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、7-去氮杂-鸟苷、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQ1)、7-甲基-鸟苷(m7G)、1-甲基-鸟苷(m1G)、8-侧氧基-鸟苷、7-甲基-8-侧氧基-鸟苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，被修饰的核碱基是1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷或α-硫代-腺苷。在一些实施方案中，本公开的mRNA包括一种或多种前述被修饰的核碱基的组合(例如2、3或4种前述被修饰的核碱基的组合)。
在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，mRNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷(s2U)。在一些实施方案中，mRNA包含2-硫代尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，mRNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，mRNA包含2’-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，mRNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
在某些实施方案中，本公开的mRNA是针对特定修饰均一地被修饰(即，完全地被修饰、通过整个序列被修饰)。例如，mRNA可均一地被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)修饰，意谓mRNA序列中的所有尿苷或所有胞嘧啶核苷均被N1-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)置换。同样，本公开的mRNA可通过用被修饰的残基(例如上文所陈述者)置换而针对存在于该序列中的任何类型的核苷残基均一地被修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA可在编码区(例如编码多肽的开放阅读框)中被修饰。在其它实施方案中，mRNA可在除编码区的外的区中被修饰。例如，在一些实施方案中，提供5’-UTR和/或3’-UTR，其中任一者或两者可独立地含有一种或多种不同的核苷修饰。在此类实施方案中，核苷修饰也可存在于编码区中。
本公开的mmRNA可包括针对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰的组合。这些组合可包括本文所述的任何一种或多种修饰。
在列出单一修饰的情况下，所列出的核苷或核苷酸表示100％的A、U、G或C核苷酸或核苷已被修饰。在列出百分率的情况下，这些表示所存在的A、U、G或C三磷酸酯的总量中该百分率的特定A、U、G或C核碱基三磷酸酯。例如，组合：25％5-氨基烯丙基-CTP+75％ CTP/25％5-甲氧基-UTP+75％ UTP是指这样一种多核苷酸，其中25％的胞嘧啶三磷酸酯为5-氨基烯丙基-CTP，而75％的胞嘧啶为CTP；而25％的尿嘧啶为5-甲氧基UTP，而75％的尿嘧啶为UTP。在未列出被修饰的UTP的情况下，则天然存在的ATP、UTP、GTP和/或CTP用于该多核苷酸中发现核苷酸的100％位点中。在此实例中，所有GTP和ATP核苷酸均保持未被修饰。
本公开的mRNA或其区可经历密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的并且可用于多种目的：匹配宿主生物体中的密码子频率以确保适当折叠，使GC含量产生偏好以增加mRNA稳定性或降低二级结构，使可削弱基因建构或表达的串联重复序列密码子或碱基串降至最低，定制转录和翻译控制区，插入或移除蛋白质转运序列，移除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)，添加、移除或改组蛋白结构域，插入或删除限制位点，修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点，调节翻译速率以允许蛋白质的多个结构域适当地折叠，或降低或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的；非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park,CA)的服务和/或专属方法。在一些实施方案中，mRNA序列使用优化算法被优化，例如以优化哺乳动物细胞中的表达或增强mRNA稳定性。
在某些实施方案中，本公开包括与任何本文所述的多核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。
本公开的mRNA可通过本领域中可获得的方式，包括但不限于体外转录(IVT)和合成方法产生。可使用酶(IVT)、固相、液相、组合的合成方法、小区合成以及接合方法。在一些实施方案中，mRNA使用IVT酶合成方法制得。因此，本公开也包括可用于体外转录本文所述的mRNA的多核苷酸，例如DNA、构建体和载体。
非天然被修饰的核碱基可在合成期间或合成后引入至多核苷酸，例如mRNA中。在某些实施方案中，修饰可在核苷间键、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。在特定实施方案中，修饰可引入多核苷酸链的末端处或该多核苷酸链中的别处；使用化学合成或使用聚合酶。
可使用酶或化学接合方法将多核苷酸或其区域与不同的功能部分，例如靶向或递送剂、荧光标记、液体、纳米颗粒等缀合。
用于降低蛋白质表达的治疗剂
在一些实施方案中，治疗剂是降低(即，减少、抑制、下调)蛋白质表达的治疗剂。可用于降低蛋白质表达的治疗剂之类型的非限制性实例包括并入微小RNA结合位点(miR结合位点)的mRNA、微小RNA(miRNA)、antagomir、小(短)干扰RNA(siRNA)(包括shortmer及dicer-底物RNA)、RNA干扰(RNAi)分子、反义RNA、核糖核酸酵素、小发夹RNA(shRNA)、锁核酸(LNA)以及CRISPR/Cas9技术。
感应序列和微小RNA(miRNA)结合位点
感应序列包括例如微小RNA(miRNA)结合位点、转录因子结合位点、结构化mRNA序列和/或基序、被工程改造成充当内源核酸结合分子的假受体的人工结合位点及其组合。感应序列的非限制性实例描述于美国公开2014/0200261中，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，本公开的包含编码多肽的开放阅读框(ORF)的聚核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))另外包含感应序列。在一些实施方案中，感应序列为miRNA结合位点。
miRNA是19-25个核苷酸长的非编码RNA，它结合于聚核糖核苷酸并且通过降低该聚核糖核苷酸的稳定性或通过抑制其翻译来下调基因表达。miRNA序列包含“种子”区，即成熟miRNA的位置2-8的区中的序列。miRNA种子可包含成熟miRNA的位置2-8或2-7。在一些实施方案中，miRNA种子可包含7个核苷酸(例如成熟miRNA的核苷酸2-8)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。在一些实施方案中，miRNA种子可包含6个核苷酸(例如成熟miRNA的核苷酸2-7)，其中相应miRNA结合位点中的种子互补位点侧接与miRNA位置1相对的腺苷(A)。参见例如Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP；Mol Cell.2007年7月6日；27(1):91-105。可进行靶细胞或组织的miRNA谱剖绘，以确定细胞或组织中存在或不存在miRNA。在一些实施方案中，本公开的聚核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))包含一个或多个微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。此类序列可对应于任何已知的微小RNA，例如美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005中教示者，各公开的内容均以引用的方式整体并入本文中。
如本文所用，术语“微小RNA(miRNA或miR)结合位点”是指聚核糖核苷酸内(例如DNA内或RNA转录物内，包括5’UTR和/或3’UTR中)的序列，该序列与整个miRNA或其区具有充足互补性以与miRNA相互作用、缔合或结合。在一些实施方案中，本公开的包含编码多肽的ORF的聚核糖核苷酸另外包含miRNA结合位点。在例示性实施方案中，聚核糖核苷酸(例如核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA))的5’UTR和/或3’UTR包含miRNA结合位点。
与miRNA具有充足互补性的miRNA结合位点是指互补程度足以促进miRNA介导的聚核糖核苷酸调控，例如miRNA介导的聚核糖核苷酸的翻译抑制或降解。在本公开的例示性方面，与miRNA具有充足互补性的miRNA结合位点是指互补程度足以促进miRNA介导的聚核糖核苷酸降解，例如miRNA指导的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的mRNA裂解。miRNA结合位点可与例如19-25个核苷酸的miRNA序列、19-23个核苷酸的miRNA序列或22个核苷酸的miRNA序列具有互补性。miRNA结合位点可仅与miRNA的一部分互补，例如与天然存在的miRNA序列的全长的小于1、2、3或4个核苷酸的部分互补。在一些实施方案中，所需调控为mRNA降解。在一些实施方案中，miRNA结合位点具有充分或完全互补性(例如在天然存在的miRNA的长度的全部或大部分上充分互补或完全互补)。在一些实施方案中，mRNA降解具有充分或完全互补性。
在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有互补性(例如部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA种子序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有互补性(例如部分或完全互补性)的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点包括与miRNA序列具有完全互补性的序列。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA序列具有完全互补性，但具有1、2或3个核苷酸取代、末端添加和/或截短。
在一些实施方案中，miRNA结合位点的长度与相应miRNA相同。在一些实施方案中，在5'末端、3'末端或两个末端处，miRNA结合位点比相应miRNA短一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个核苷酸。在其它实施方案中，在5'末端、3'末端或两个末端处，微小RNA结合位点比相应微小RNA短两个核苷酸。比相应miRNA短的miRNA结合位点仍能够使并入一个或多个miRNA结合位点的mRNA降解或防止mRNA翻译。
在一些实施方案中，miRNA结合位点结合于相应成熟miRNA，该成熟miRNA是含有Dicer的活性RISC的一部分。在另一实施方案中，miRNA结合位点与RISC中的相应miRNA的结合使含有miRNA结合位点的mRNA降解或防止mRNA翻译。在一些实施方案中，miRNA结合位点与miRNA具有充足互补性，使得包含miRNA的RISC复合物裂解包含miRNA结合位点的聚核糖核苷酸。在一些实施方案中，miRNA结合位点具有不完美互补性，使得包含miRNA的RISC复合物诱导包含miRNA结合位点的聚核糖核苷酸中的不稳定性。在另一实施方案中，miRNA结合位点具有不完美互补性，使得包含miRNA的RISC复合物抑制包含miRNA结合位点的聚核糖核苷酸的转录。
在一些实施方案中，miRNA结合位点与相应miRNA具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个错配。
在一些实施方案中，miRNA结合位点具有分别与相应miRNA的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个相邻核苷酸互补的至少约十个、至少约十一个、至少约十二个、至少约十三个、至少约十四个、至少约十五个、至少约十六个、至少约十七个、至少约十八个、至少约十九个、至少约二十个或至少约二十一个相邻核苷酸。
通过将一个或多个miRNA结合位点工程改造至本公开的聚核糖核苷酸中，所述聚核糖核苷酸可被靶向用于降解或减少的翻译，只要可获得所讨论的miRNA。这可减少递送聚核糖核苷酸时的脱靶效应。在一些实施方案中，如果本公开的聚核糖核苷酸不欲递送至组织或细胞，而是终止于组织或细胞，则如果miRNA的一个或多个结合位点被工程改造至该聚核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中，则该组织或细胞中的丰富miRNA可抑制所关注的基因的表达。
相反，miRNA结合位点可自其中天然存在所述结合位点的聚核糖核苷酸序列中移除，以便增加特定组织中的蛋白质表达。在一些实施方案中，针对特定miRNA的结合位点可自聚核糖核苷酸中移除以改良含有miRNA的组织或细胞中的蛋白质表达。
在一个实施方案中，本公开的聚核糖核苷酸可在5'UTR和/或3'UTR中包括至少一个miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，例如但不限于正常细胞和/或癌细胞。在另一实施方案中，本公开的聚核糖核苷酸可在5'-UTR和/或3'-UTR中包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十个以上miRNA结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mRNA治疗剂引导至特定细胞，例如但不限于正常细胞和/或癌细胞。
对多种组织中的表达的调控可通过引入或移除一个或多个miRNA结合位点来实现。可基于疾病的miRNA表达模式和/或其谱剖绘来决定移除或插入miRNA结合位点。已报导了miRNA的鉴别、miRNA结合位点及其表达模式以及在生物学中的作用(例如Bonauer等人,Curr Drug Targets 2010 11:943-949；Anand及Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176；Contreras和Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011年12月20日.doi:10.1038/leu.2011.356)；Bartel Cell 2009136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007 129:1401-1414；Gentner及Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403及其中所有参考文献；所述文献各自以引用的方式整体并入本文中)。
miRNA和miRNA结合位点可对应于任何已知序列，包括描述于美国公开第2014/0200261号、第2005/0261218号和第2005/0059005号中的非限制性实例，各公开以引用的方式整体并入本文中。
其中已知miRNA调控mRNA并由此调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾(miR-192、miR-194、miR-204)以及肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
具体点说，已知miRNA在免疫细胞(也称作造血细胞)中，例如在抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、粒细胞、自然杀手细胞等中差异性表达。免疫细胞特异性miRNA涉及免疫原性、自身免疫性、对感染的免疫反应、炎症以及在基因疗法和组织/器官移植之后的非所需免疫反应中。免疫细胞特异性miRNA也调控造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化及细胞凋亡的多个方面。在一些实施方案中，miR-142及miR-146仅在免疫细胞中表达，尤其在骨髓树突状细胞中很丰富。已证明，对聚核糖核苷酸的免疫反应可通过向该聚核糖核苷酸的3'-UTR中添加miR-142结合位点来关闭，使得能够在组织和细胞中进行更稳定基因转移。miR-142有效地降解抗原呈递细胞中的外源性聚核糖核苷酸并抑制被转导的细胞的细胞毒性消除(例如Annoni A等人,blood,2009,114,5152-5161；Brown BD等人,Nat med.2006,12(5),585-591；Brown BD等人,blood,2007,110(13):4144-4152，各文献以引用的方式整体并入本文中)。
抗原介导的免疫反应可指由外来抗原触发的免疫反应，所述外来抗原在进入生物体时由抗原呈递细胞处理且呈现于抗原呈递细胞的表面上。T细胞可识别呈递的抗原并诱导表达该抗原的细胞的细胞毒性消除。
将miR-142结合位点引入本公开的聚核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中可通过miR-142介导的降解选择性地抑制抗原呈递细胞中的基因表达，从而限制抗原呈递细胞(例如树突状细胞)中的抗原呈递并由此防止在递送该聚核糖核苷酸之后出现抗原介导的免疫反应。所述聚核糖核苷酸接着于靶组织或细胞中稳定表达，而不会触发细胞毒性消除。
在一个实施方案中，已知在免疫细胞、尤其抗原呈递细胞中表达的miRNA的结合位点可被工程改造至本公开的聚核糖核苷酸中，以通过miRNA介导的RNA降解抑制该聚核糖核苷酸在抗原呈递细胞中的表达，从而抑制抗原介导的免疫反应。该聚核糖核苷酸在其中未表达免疫细胞特异性miRNA的非免疫细胞中维持表达。在一些实施方案中，为了防止针对肝脏特异性蛋白的免疫原性反应，可移除任何miR-122结合位点且miR-142(和/或mirR-146)结合位点可被工程改造至本公开的聚核糖核苷酸的5'UTR和/或3'UTR中。
为了进一步驱动APC和巨噬细胞中的选择性降解和抑制，本公开的聚核糖核苷酸可在5'UTR和/或3'UTR中包括另一负调控元件，单独或与miR-142和/或miR-146结合位点组合。作为非限制性实例，另一负调控元件为组成性衰减元件(CDE)。
免疫细胞特异性miRNA包括但不限于hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p、miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p及miR-99b-5p。此外，可通过微阵列杂交和切片机分析在免疫细胞中鉴别新颖miRNA(例如Jima DD等人,Blood,2010,116:e118-e127；Vaz C等人,BMC Genomics,2010,11,288，其各自的内容以引用的方式整体并入本文中。)
已知在肝脏中表达的miRNA包括但不限于miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p以及miR-939-5p。任何肝脏特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在肝脏中的表达。肝脏特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经历工程改造。
已知在肺中表达的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p以及miR-381-5p。任何肺特异性miRNA的miRNA结合位点均可被引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在肺中的表达。肺特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经历工程改造。
已知在心脏中表达的miRNA包括但不限于miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p以及miR-92b-5p。任何心脏特异性微小RNA的miRNA结合位点均可经引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在心脏中的表达。心脏特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经历工程改造。
已知在神经系统中表达的miRNA包括但不限于miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p以及miR-9-5p。富集于神经系统中的miRNA另外包括特异性地表达于神经元中者，包括但不限于miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922，以及特异性地表达于神经胶质细胞中者，包括但不限于miR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p以及miR-657。任何CNS特异性miRNA的miRNA结合位点均可经引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在神经系统中的表达。神经系统特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知在胰脏中表达的miRNA包括但不限于miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p以及miR-944。任何胰脏特异性miRNA的miRNA结合位点均可经引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在胰脏中的表达。胰脏特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经历工程改造。
已知在肾中表达的miRNA包括但不限于miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p以及miR-562。任何肾特异性miRNA的MiRNA结合位点均可经引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在肾中的表达。肾特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
已知在肌肉中表达的miRNA包括但不限于let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p以及miR-25-5p。任何肌肉特异性miRNA的miRNA结合位点均可经引入至本公开的聚核糖核苷酸中或自本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在肌肉中的表达。肌肉特异性miRNA结合位点可单独或另外与本公开的聚核糖核苷酸中的免疫细胞(例如APC)miRNA结合位点组合经工程改造。
miRNA也差异性表达于不同类型的细胞，例如但不限于内皮细胞、上皮细胞及脂肪细胞中。
已知在内皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p以及miR-92b-5p。通过深度测序分析在内皮细胞中发现了许多新颖miRNA(例如Voellenkle C等人,RNA,2012,18,472-484，以引用的方式整体并入本文中)。任何内皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点均可引入至本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在内皮细胞中的表达。
已知在上皮细胞中表达的miRNA包括但不限于let-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802及miR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、miR-449b-5p(在呼吸道纤毛上皮细胞中具特异性)、let-7家族、miR-133a、miR-133b、miR-126(在肺上皮细胞中具特异性)、miR-382-3p、miR-382-5p(在肾上皮细胞中具特异性)以及miR-762(在角膜上皮细胞中具特异性)。任何上皮细胞特异性miRNA的miRNA结合位点均可被引入本公开的聚核糖核苷酸中或从本公开的聚核糖核苷酸移除以调控该聚核糖核苷酸在上皮细胞中的表达。
此外，一大组miRNA富集于胚胎干细胞中，从而控制干细胞自更新以及多种细胞谱系，例如神经细胞、心脏、造血细胞、皮肤细胞、骨原细胞及肌肉细胞的发育和/或分化(例如Kuppusamy KT等人,Curr.Mol Med,2013,13(5),757-764；Vidigal JA和Ventura A,SeminCancer Biol.2012,22(5-6),428-436；Goff LA等人,PLoS One,2009,4:e7192；Morin RD等人,Genome Res,2008,18,610-621；Yoo JK等人,Stem Cells Dev.2012,21(11),2049-2057，其各自均以引用的方式整体并入本文中)。胚胎干细胞中含量丰富的miRNA包括但不限于let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p、miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941、miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3p以及miR-99b-5p。通过深度测序在人类胚胎干细胞中发现许多预测的新颖miRNA(例如Morin RD等人,Genome Res,2008,18,610-621；Goff LA等人,PLoS One,2009,4:e7192；Bar M等人,Stem cells,2008,26,2496-2505，其各自的内容以引用的方式整体并入本文中)。
在一个实施方案中，胚胎干细胞特异性miRNA的结合位点可包括于本公开的聚核糖核苷酸的3'UTR中或自本公开的聚核糖核苷酸的3'UTR移除，以调节胚胎干细胞的发育和/或分化，以抑制退化性状态(例如退化性疾病)下的干细胞的衰老，或刺激疾病状态下的干细胞(例如癌症干细胞)的衰老和细胞凋亡。
进行了许多miRNA表达研究，以剖绘miRNA在多种癌细胞/组织和其它疾病中的差异性表达。一些miRNA在某些癌细胞中异常地过表达，而另一些则表达不足。在一些实施方案中，miRNA在癌细胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294)；癌症干细胞(US2012/0053224)；胰腺癌及疾病(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210)；哮喘和炎症(US8415096)；前列腺癌(US2013/0053264)；肝细胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538)；肺癌细胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357)；皮肤T细胞淋巴瘤(WO2013/011378)；结肠直肠癌细胞(WO2011/0281756、WO2011/076142)；癌症阳性淋巴结(WO2009/100430、US2009/0263803)；鼻咽癌(EP2112235)；慢性阻塞性肺病(US2012/0264626、US2013/0053263)；甲状腺癌(WO2013/066678)；卵巢癌细胞(US2012/0309645、WO2011/095623)；乳癌细胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病和淋巴瘤(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563，其各自的内容以引用的方式整体并入本文中)中差异性表达。
作为非限制性实例，在某些癌症和/或肿瘤细胞中过表达的miRNA的miRNA结合位点可从本公开的聚核糖核苷酸的3'UTR移除，从而恢复受到癌细胞中过表达的miRNA抑制的表达，因此改良相应生物学功能，例如转录刺激和/或抑制、细胞周期停滞、细胞凋亡及细胞死亡。其中miRNA表达未上调的正常细胞及组织将保持不受影响。
MiRNA也可调控复杂生物学过程，例如血管生成(例如miR-132)(Anand及ChereshCurr Opin Hematol 2011 18:171-176)。在本公开的聚核糖核苷酸中，可移除或引入牵涉于此类过程中的miRNA结合位点，以便针对生物学相关细胞类型或相关生物学过程调适该聚核糖核苷酸的表达。在本文中，本公开的聚核糖核苷酸是定义为营养缺陷型聚核糖核苷酸。
肽/多肽治疗剂
在一些实施方案中，治疗剂为肽治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂为多肽治疗剂。
在一些实施方案中，所述肽或多肽是天然来源的，例如从天然来源分离。在其它实施方案中，所述肽或多肽为合成分子，例如体外产生的合成肽或多肽。在一些实施方案中，所述肽或多肽为重组分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽为嵌合分子。在一些实施方案中，所述肽或多肽为融合分子。在一些实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂为天然存在的肽或多肽。在一些实施方案中，所述组合物的肽或多肽治疗剂为天然存在的肽或多肽的被修饰形式(例如与其野生型、天然存在的肽或多肽配对物相比，含有少于3个、少于5个、少于10个、少于15个、少于20个或少于25个氨基酸取代、缺失或添加)。
在一些实施方案中，在本公开的带负载的LNP中，所述一种或多种治疗剂和/或预防剂为多核苷酸或多肽。
基因组编辑技术
在一些实施方案中，所述核酸适用于基因组编辑技术。
在一些实施方案中，所述基因组编辑技术是规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)或转录活化子样效应子核酸酶(TALEN)。
在一些实施方案中，所述核酸选自由CRISPR RNA(crRNA)、反式活化crRNA(tracrRNA)、单向导RNA(sgRNA)及DNA修复模板组成的组的适用于基因组编辑技术的至少一种核酸。
疫苗
在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂为RNA(例如信使RNA(mRNA))的核糖核酸(RNA)癌症疫苗，其可安全地引导身体的细胞机制产生几乎任何所关注的癌症蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述RNA为被修饰的RNA。例如，本公开的RNA疫苗可用于诱导针对癌症的平衡免疫反应(包含细胞免疫及体液免疫两者)，而无插入性突变诱发的可能性风险。
所述RNA疫苗可用于多种环境中，视癌症的流行率或未满足的医学需要的程度或水平而定。所述RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种阶段或转移程度的癌症。所述RNA疫苗具有卓越特性，因为与包括癌症疫苗的替代抗癌疗法相比，该疫苗产生大得多的抗体效价并且更早产生反应。虽然不希望受理论束缚，但相信呈mRNA多核苷酸形式的RNA疫苗是更好地被设计以在翻译时产生适当蛋白质构形，因为所述RNA疫苗选用天然细胞机制。与离体制造并且可触发非所需细胞反应的传统疫苗不同，所述RNA疫苗以更天然方式呈递至细胞系统。
本公开的一些实施方案提供包括至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸的癌症疫苗，该开放阅读框编码至少一种癌症抗原多肽或其免疫原性片段(例如，能够诱导针对癌症的免疫反应的免疫原性片段)。其它实施方案包括至少一种具有开放阅读框的核糖核酸(RNA)多核苷酸，该开放阅读框编码能够诱导针对癌症的免疫反应的两种或更多种抗原或表位。
本发明在一些方面是具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA以及具有编码免疫检查点调节剂的开放阅读框的mRNA的疫苗。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂为抑制性检查点多肽。在一些实施方案中，抑制性检查点多肽是特异性地结合于选自由PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR及LAG3组成的组的分子的抗体或其片段。在一些实施方案中，抑制性检查点多肽为抗CTLA4或抗PDl抗体。任选地，疫苗包括脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，将具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA的疫苗施用给受试者。在其它实施方案中，检查点抑制剂在3-10周后施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂在4周后施用。
在其它方面，本发明是具有编码至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA及脂质纳米颗粒载剂的个人化癌症疫苗，其中该至少2种癌症抗原为患者特异性癌症抗原。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径为50-200nm。
在其它方面，本发明是具有编码至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA的个人化癌症疫苗，其中该至少2种癌症抗原代表患者的抗原。在一些实施方案中，患者的抗原为外泌体鉴别的患者的抗原。在一些实施方案中，单一mRNA编码所述癌症抗原。在其它实施方案中，多种mRNA编码所述癌症抗原。
在其它实施方案中，各mRNA可编码5-10种癌症抗原或单一癌症抗原。在一些实施方案中，mRNA编码2-100种癌症抗原。在其它实施方案中，mRNA编码10-100、20-100、50-100、100-200、300-400、500-600、600-700、700-800、900-1,000或1,000-10,000种癌症抗原。
在一些实施方案中，
a)编码各癌症抗原的mRNA中散布有裂解敏感性位点；
b)编码各癌症抗原的mRNA在无连接体的情况下直接彼此连接；
c)编码各癌症抗原的mRNA用单一核苷酸连接体彼此连接；
d)各癌症抗原包含25-35个氨基酸并且包括位于中央的SNP突变；
e)至少30％的癌症抗原对来自受试者的I类MHC分子具有最高亲和力；
f)至少30％的癌症抗原对来自受试者的II类MHC分子具有最高亲和力；
g)至少50％的癌症抗原对HLA-A、HLA-B和/或DRB 1具有IC>500nM的预测结合亲和力；
h)mRNA编码20种癌症抗原；
i)50％的癌症抗原对I类MHC具有结合亲和力并且50％的癌症抗原对II类MHC具有结合亲和力；和/或
j)编码癌症抗原的mRNA被安排成使得所述癌症抗原被排序以使假表位减至最少。
在一些实施方案中，各癌症抗原包含31个氨基酸并且包括位于中央的SNP突变，在该SNP突变的每一侧上具有15个侧接氨基酸。
在一些实施方案中，所述疫苗为个人化癌症疫苗，并且其中该癌症抗原为受试者特异性癌症抗原。在一些实施方案中，受试者特异性癌症抗原可代表受试者的肿瘤样品的外显子组，或受试者的肿瘤样品的转录物组。在一些实施方案中，受试者特异性癌症抗原可代表受试者的外泌体。
在一些实施方案中，开放阅读框进一步编码一种或多种传统癌症抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原为非突变型抗原。在一些实施方案中，传统癌症抗原为突变型抗原。
在一些实施方案中，所述mRNA疫苗另外包含具有编码一种或多种传统癌症抗原的开放阅读框的mRNA。
在一些实施方案中，单一mRNA编码所述癌症抗原。在其它实施方案中，多种mRNA编码所述癌症抗原。在一些实施方案中，各癌症抗原为10-50个氨基酸长。在其它实施方案中，各癌症抗原为15-20个氨基酸长。在其它实施方案中，癌症抗原为20-50、25-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-1,000或1,000-10,000个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述疫苗另外包含佐剂。
本公开的一些实施方案提供在脂质纳米颗粒内配制的包括至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸的癌症疫苗，该至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸具有编码至少一种癌症多肽的开放阅读框、至少一个5'末端帽和至少一种化学修饰。在一些实施方案中，5'末端帽为7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
在一些实施方案中，至少一种化学修饰选自假尿苷、Nl-甲基假尿苷、Nl-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷以及2'-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，经化学修饰的核苷酸的并入程度被优化以改良对疫苗配制物的免疫反应。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、固醇和非阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质为可离子化阳离子脂质，并且非阳离子脂质为中性脂质，并且固醇为胆固醇。在一些实施方案中，阳离子脂质选自2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、二亚油烯基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)以及9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-l-基)酯(L319)。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒配制物包括免疫增强剂(例如TLR激动剂)以增强疫苗(配制物)的免疫原性。
在一些实施方案中，开放阅读框中的100％尿嘧啶具有化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰在尿嘧啶的5-位处。在一些实施方案中，化学修饰为Nl-甲基假尿苷。
在其它实施方案中，编码APC再编程分子的mRNA包括在疫苗中或与疫苗共施用。APC再编程分子可以是CIITA、伴侣蛋白(例如CLIP、HLA-DO、HLA-DM)、共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86)、CIITA片段(例如CIITA的氨基酸26-137)或与CIITA具有80％序列同一性的蛋白质。
在其它方面，提供一种在受试者体内引发免疫反应的方法，该方法通过自受试者的样品鉴别至少2种癌症抗原，其中该至少2种癌症抗原包括选自由移码突变和重组组成的组的突变，并且向该受试者施用具有编码该至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA疫苗。
在一些实施方案中，由受试者的外泌体鉴别所述癌症抗原。在一些实施方案中，由外泌体鉴别2-100种抗原。在其它实施方案中，mRNA疫苗具有编码所述2-100种抗原的开放阅读框。单一mRNA或多种mRNA可编码所述抗原。
在一些实施方案中，所述抗原是癌症抗原。所述癌症抗原可具有选自点突变、移码突变和重组的突变。所述方法可另外涉及通过外显子组分析确认所述癌症抗原是受试者特异性的。
在一些实施方案中，所述方法可另外涉及通过转录物组分析确认所述癌症抗原是受试者特异性的。
在一些实施方案中，所述方法还涉及在施用mRNA疫苗之后至少一个月，自受试者的样品鉴别至少2种癌症抗原以产生癌症抗原的第二集合，并且向该受试者施用具有编码癌症抗原的第二集合的开放阅读框的mRNA疫苗。
在其它实施方案中，受试者的样品是肿瘤样品。
在其它方面，本发明包含一种在受试者体内引发免疫反应的方法，该方法通过自受试者的样品鉴别至少2种癌症抗原以产生癌症抗原的第一集合，向该受试者施用具有编码癌症抗原的第一集合的开放阅读框的mRNA疫苗，在施用该mRNA疫苗之后至少一个月，自受试者的样品鉴别至少2种癌症抗原以产生癌症抗原的第二集合，并且向该受试者施用具有编码癌症抗原的第二集合的开放阅读框的mRNA疫苗。
在一些实施方案中，具有编码抗原的第二集合的开放阅读框的mRNA疫苗在具有编码癌症抗原的第一集合的开放阅读框的mRNA疫苗之后6个月至1年施用给受试者。在其它实施方案中，具有编码抗原的第二集合的开放阅读框的mRNA疫苗在具有编码癌症抗原的第一集合的开放阅读框的mRNA疫苗之后1-2年施用给受试者。
在一些实施方案中，单一mRNA具有编码癌症抗原的开放阅读框。在其它实施方案中，多种mRNA编码所述抗原。在一些实施方案中，癌症抗原的第二集合包括2-100种抗原。在其它实施方案中，所述癌症抗原具有选自点突变、移码突变和重组的突变。
在其它方面，本发明包含一种在受试者体内引发免疫反应的方法，该方法通过自受试者的样品鉴别至少2种癌症抗原，向该受试者施用具有编码该至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA，并且向该受试者施用癌症治疗剂。在一些实施方案中，所述癌症治疗剂是靶向疗法。靶向疗法可以是BRAF抑制剂，例如维罗非尼(vemurafenib)(PLX4032)或达拉非尼(dabrafenib)。
在其它实施方案中，癌症治疗剂是T细胞治疗剂。T细胞治疗剂可以是检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是BMS-936558(纳武单抗(nivolumab))。在其它实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。在其它实施方案中，T细胞治疗剂是OX40L。在其它实施方案中，癌症治疗剂是包含基于群体的肿瘤特异性抗原的疫苗。
在其它实施方案中，癌症治疗剂是包含具有编码一种或多种传统癌症抗原的开放阅读框的mRNA的疫苗。
在一些实施方案中，将具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA与癌症治疗剂同时施用给受试者。在一些实施方案中，在施用癌症治疗剂之前，将具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA施用给受试者。在一些实施方案中，在施用癌症治疗剂之后，将具有编码所述至少2种癌症抗原的开放阅读框的mRNA施用给受试者。
在本发明的其它方面，提供一种方法，该方法包括使具有编码癌症抗原的开放阅读框的mRNA与脂质纳米颗粒配制物混合以产生mRNA癌症疫苗，并在混合的24小时内向受试者施用该mRNA癌症疫苗。在一些实施方案中，所述mRNA癌症疫苗是在混合的12小时内施用给受试者。在其它实施方案中，所述mRNA癌症疫苗是在混合的1小时内施用给受试者。在一些实施方案中，所述mRNA癌症疫苗编码2-100种癌症抗原或10-100种癌症抗原。
在一些实施方案中，所述疫苗是个人化癌症疫苗，并且其中所述癌症抗原是受试者特异性癌症抗原。
在一些实施方案中，单一mRNA编码癌症抗原。在其它实施方案中，多种mRNA编码癌症抗原。在其它实施方案中，每一mRNA编码5-10种癌症抗原或单一癌症抗原。在其它实施方案中，每一癌症抗原为10-50个氨基酸长或15-20个氨基酸长。
本文另外提供癌症疫苗在制造用于在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法中的药剂中的用途，所述方法包括以有效产生抗原特异性免疫反应的量向该受试者施用该癌症疫苗。
在其它方面，提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法通过在分离自该受试者的外泌体中鉴别至少2种癌症抗原；基于所鉴别的抗原，产生具有编码所述抗原的开放阅读框的mRNA疫苗；并且向该受试者施用该mRNA疫苗，其中该mRNA疫苗在该受试者中诱导肿瘤特异性免疫反应，由此治疗该受试者的癌症。在其它方面，本发明是可根据如下方法制备的RNA疫苗，该方法涉及在分离自受试者的外泌体中鉴别至少2种癌症抗原；根据所鉴别的抗原，产生具有编码所述抗原的开放阅读框的mRNA疫苗。
在本发明各方面，提供一种在受试者体内引发针对癌症抗原的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用RNA疫苗，由此在受试者中诱导对该抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，该RNA疫苗包含至少一种具有编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价有所增加。“抗-抗原多肽抗体”是特异性地结合于抗原多肽的血清抗体。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平下预防癌症进展的治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量是疫苗的包装插页中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本发明的mRNA疫苗以外的疫苗。例如，传统疫苗包括但不限于活微生物疫苗、灭活微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、DNA疫苗等。在例示性实施方案中，传统疫苗是已获得监管批准和/或由国家药物监管机构(例如美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA.))登记的疫苗。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加1log至10log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加1log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加2log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加3log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加5log。
在一些实施方案中，在疫苗接种之后，受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价相对于接种有预防有效剂量的针对癌症的传统疫苗的受试者体内的抗-抗原多肽抗体效价增加10log。
在本发明的其它方面，提供一种在受试者体内引发针对癌症抗原的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用RNA疫苗，由此在受试者中诱导对抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，所述RNA疫苗包含至少一种具有编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的针对癌症抗原的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗两倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗三倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗4倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗5倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗10倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗50倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗100倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗10倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应等于接种有相对于该RNA疫苗100倍至1000倍剂量水平的传统疫苗的受试者体内的免疫反应。
在其它实施方案中，通过确定受试者中的抗体效价来评估免疫反应。
在其它方面，本发明包含一种在受试者体内引发免疫反应的方法，该方法通过向受试者施用RNA疫苗，由此在受试者中诱导对该抗原多肽或其免疫原性片段具特异性的免疫反应，所述RNA疫苗包含至少一种具有编码至少一种癌症抗原多肽或其免疫原性片段的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的针对癌症抗原的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2天至10周诱导。在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应在接种有相对于该RNA疫苗2倍至100倍剂量水平的预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2天诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早3天诱导。在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早1周诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早2周诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早3周诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早5周诱导。
在一些实施方案中，受试者体内的免疫反应相对于接种有预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应早10周诱导。
一种在受试者体内引发针对癌症的免疫反应的方法，该方法通过向受试者施用具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的癌症RNA疫苗进行，其中RNA多核苷酸不包括稳定化元件，并且其中佐剂未与该疫苗共配制或共施用。
在其它方面，本发明包含一种产生编码多联体癌症抗原的mRNA的方法，所述多联体癌症抗原包含1000个与3000个之间核苷酸，所述方法通过以下步骤进行
(a)使包含编码该多联体癌症抗原的开放阅读框的第一多核苷酸以及包含5'-UTR的第二多核苷酸结合至与固体支撑物缀合的多核苷酸；
(b)在适合条件下，使第二多核苷酸的3’末端接合至第一多核苷酸的5’末端，由此产生第一接合产物，其中适合条件包含DNA连接酶；
(c)在适合条件下，使包含3'-UTR的第三多核苷酸的5'末端接合至第一接合产物的3'末端，由此产生第二接合产物，其中适合条件包含RNA连接酶；并且
(d)自所述固体支撑物释放第二接合产物，由此产生编码多联体癌症抗原的mRNA，所述多联体癌症抗原包含1000个与3000个之间核苷酸。在所提供的组合物或方法中的任一者的一些实施方案中，mRNA编码一种或多种复发性多态现象。在一些实施方案中，所述一种或多种复发性多态现象包含p53中的复发性体细胞癌突变。在一些此类实施方案中，p53中的一种或多种复发性体细胞癌突变选自由以下组成的组：
(1)在邻近密码子p.T125的典型5'剪接位点处的突变；
(2)在邻近密码子p.331的典型5'剪接位点处的突变；
(3)在邻近密码子p.126的典型3'剪接位点处的突变；
(4)在邻近密码子p.224的典型5'剪接位点处的突变，从而诱导一个隐含的替代内含子5'剪接位点。
在一个实施方案中，本发明提供一种癌症治疗疫苗，该癌症治疗疫苗包含编码开放阅读框(ORF)的mRNA，该开放阅读框(ORF)编码新抗原肽(1)-(4)中的一者或多者。在一个实施方案中，本发明提供基于含有任何上述突变的患者的肿瘤，选择性施用含有或编码肽(1)-(4)中的一者或多者的疫苗。在一个实施方案中，本发明提供基于含有任何上述突变的受试者的肿瘤以及含有预测结合至所得新抗原的相应HLA等位基因的受试者的正常HLA类型的双重标准选择性施用疫苗。
在本发明的其它方面，提供一种用个人化mRNA癌症疫苗治疗受试者的方法，该方法通过从受试者分离样品，通过分析来自样品的患者转录物组和/或患者外显子组来鉴别新表位的集合以产生患者特异性突变组，基于MHC结合强度、MHC结合多样性、预测的免疫原性程度、低自身反应性和/或T细胞反应性选择用于来自该突变组的疫苗的新表位的集合，制备编码新表位的集合的mRNA疫苗，并在从受试者分离样品的两个月内向受试者施用该mRNA疫苗。在一些实施方案中，在从受试者分离样品的一个月内向受试者施用所述mRNA疫苗。
在其它方面，本发明包含一种鉴别用于个人化mRNA癌症疫苗的新表位的集合的方法，该个人化mRNA癌症疫苗具有一种或多种编码新表位的集合的多核苷酸，该方法通过以下步骤进行：a.通过分析患者转录物组和患者外显子组来鉴别患者特异性突变组，b.基于以下至少三者，使用针对所述新表位的加权值自该突变组选出15-500种新表位的子集：在患者RNA-seq中评估基因或转录物水平的表达；变体调用置信度评分；RNA-seq等位基因特异性表达；保守对非保守氨基酸取代；点突变的位置(针对增加的TCR接合的定中心评分)；点突变的位置(针对差异性HLA结合的锚定评分)；自主性：使用患者WES数据，<100％核心表位同源性；针对8聚体-11聚体的HLA-A和-B IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DRB 1IC50；混杂评分(即，预测结合的患者HLA的数目)；针对8聚体-11聚体的HLA-C IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DRB3-5 IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DQB 1/A1 IC50；针对15聚体-20聚体的HLA-DPB 1/A1IC50；I类对II类比例；所涵盖的患者HLA-A、HLA-B及DRB 1同种异型的多样性；点突变对复杂表位(例如移码)的比例；和/或假表位HLA结合评分，并c.基于最高加权值，从所述子集选择用于个人化mRNA癌症疫苗的新表位的集合，其中新表位的集合包含15-40种新表位。
在一些实施方案中，本文所述的核酸疫苗经历化学修饰。在其它实施方案中，所述核酸疫苗未被修饰。
其它方面提供用于对受试者接种疫苗的组合物和方法，所述方法包括向受试者施用核酸疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸不包括稳定化元件，并且其中佐剂未与该疫苗共配制或共施用。
在其它方面，本发明是用于对受试者接种疫苗的组合物或方法，所述方法包括向受试者施用核酸疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中将10ug/kg与400ug/kg之间剂量的核酸疫苗施用给受试者。在一些实施方案中，RNA多核苷酸的剂量是每剂1-5ug、5-10ug、10-15ug、15-20ug、10-25ug、20-25ug、20-50ug、30-50ug、40-50ug、40-60ug、60-80ug、60-100ug、50-100ug、80-120ug、40-120ug、40-150ug、50-150ug、50-200ug、80-200ug、100-200ug、120-250ug、150-250ug、180-280ug、200-300ug、50-300ug、80-300ug、100-300ug、40-300ug、50-350ug、100-350ug、200-350ug、300-350ug、320-400ug、40-380ug、40-100ug、100-400ug、200-400ug或300-400ug。在一些实施方案中，所述核酸疫苗通过皮内或肌肉内注射施用给受试者。在一些实施方案中，所述核酸疫苗在第零天施用给受试者。在一些实施方案中，第二剂量的该核酸疫苗在第二十一天施用给受试者。
在一些实施方案中，25微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，100微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，50微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，75微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，150微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，400微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，200微克剂量的RNA多核苷酸被包括在施用给受试者的核酸疫苗中。在一些实施方案中，与远侧淋巴结相比，所述RNA多核苷酸以高100倍水平积聚于局部淋巴结中。在其它实施方案中，所述核酸疫苗经历化学修饰，并且在其它实施方案中，所述核酸疫苗未经历化学修饰。
本发明各方面提供一种核酸疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸不包括稳定化元件；以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中佐剂未包括在所述疫苗中。在一些实施方案中，所述稳定化元件是组蛋白茎环。在一些实施方案中，所述稳定化元件是相对于野生型序列具有增加的GC含量的核酸序列。
本发明各方面提供核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸存在于供体内施用给宿主的配制物中，所述配制物赋予的抗体效价优于针对用于可接受百分率的人类受试者的第一抗原的血清保护的准则。在一些实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的抗体效价是中和抗体效价。在一些实施方案中，所述中和抗体效价大于蛋白质疫苗。在其它实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价大于佐剂蛋白质疫苗。在其它实施方案中，由本发明的mRNA疫苗产生的中和抗体效价为1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和效价通常表述为实现斑块数目的50％减少所需的最高血清稀释度。
在某些方面，本发明的疫苗(例如LNP囊封的mRNA疫苗)在接种疫苗的受试者的血液或血清中产生预防和/或治疗有效水平、浓度和/或效价的抗原特异性抗体。如本文所定义，术语抗体效价是指在受试者(例如人类受试者)体内产生的抗原特异性抗体的量。在例示性实施方案中，抗体效价被表述为最大稀释度(在连续稀释中)的倒数，其仍产生阳性结果。在例示性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定或测量抗体效价。在例示性实施方案中，通过中和测定，例如根据微量中和测定来确定或测量抗体效价。在某些方面，抗体效价测量值表述为比率，例如1:40、1:100等。
在本发明的例示性实施方案中，有效疫苗产生大于1:40、大于1:100、大于1:400、大于1:1000、大于1:2000、大于1:3000、大于1:4000、大于1:500、大于1:6000、大于1:7500、大于1:10000的抗体效价。在例示性实施方案中，截至疫苗接种之后10天、截至疫苗接种之后20天、截至疫苗接种之后30天、截至疫苗接种之后40天或截至疫苗接种之后50天或更多天产生或实现所述抗体效价。在例示性实施方案中，在向受试者施用单一剂量的疫苗之后产生或实现所述效价。在其它实施方案中，在多次剂量之后，例如在第一次剂量和第二次剂量(例如加强剂量)之后产生或实现所述效价。
在本发明的例示性方面，抗原特异性抗体以μg/ml为单位来度量，或以IU/L(国际单位/升)或mlU/ml(毫国际单位/毫升)为单位来度量。在本发明的例示性实施方案中，有效疫苗产生>0.5μg/ml、>0.1μg/ml、>0.2μg/ml、>0.35μg/ml、>0.5μg/ml、>1μg/ml、>2μg/ml、>5μg/ml或>10μg/ml。在本发明的例示性实施方案中，有效疫苗产生>10mlU/ml、>20mlU/ml、>50mlU/ml、>100mlU/ml、>200mlU/ml、>500mlU/ml或>1000mlU/ml。在例示性实施方案中，截至疫苗接种之后10天、截至疫苗接种之后20天、截至疫苗接种之后30天、截至疫苗接种之后40天或截至疫苗接种之后50天或更多天产生或实现所述抗体水平或浓度。在例示性实施方案中，在向受试者施用单一剂量的疫苗之后产生或实现所述水平或浓度。在其它实施方案中，在多次剂量之后，例如在第一次剂量和第二次剂量(例如加强剂量)之后产生或实现所述水平或浓度。在例示性实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定或测量抗体水平或浓度。在例示性实施方案中，通过中和测定，例如根据微量中和测定来确定或测量抗体水平或浓度。还提供了核酸疫苗，所述核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸，其中该RNA多核苷酸存在于供体内施用给宿主的配制物中，从而引发比由具有稳定化元件或用佐剂配制且编码第一抗原多肽的mRNA疫苗引发的抗体效价持续更长时间的高抗体效价。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸被配制成在单次施用的一周内产生中和抗体。在一些实施方案中，佐剂选自阳离子肽和免疫刺激核酸。在一些实施方案中，阳离子肽是鱼精蛋白。
多个方面提供包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，该一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中该RNA多核苷酸存在于供体内施用给宿主的配制物中，使得宿主中的抗原表达水平显著超过由具有稳定化元件或用佐剂配制且编码第一抗原多肽的mRNA疫苗产生的抗原表达水平。
其它方面提供包含一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸的核酸疫苗，该一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，该开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中该疫苗具有与未被修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
本发明各方面也提供疫苗使用单位，所述疫苗使用单位包含10ug与400ug之间的一种或多种具有开放阅读框的RNA多核苷酸，以及药学上可接受的载体或赋形剂，该一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，该开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，所述疫苗使用单位被配制成递送给人类受试者。在一些实施方案中，所述疫苗另外包含阳离子脂质纳米颗粒。
本发明各方面提供在个体或个体群体中产生、维持或恢复针对肿瘤的抗原记忆的方法，所述方法包括向所述个体或群体施用抗原记忆加强核酸疫苗，所述核酸疫苗包含：(a)至少一种RNA多核苷酸，所述多核苷酸包含至少一种化学修饰或任选地无核苷酸修饰，以及两个或更多个密码子优化的开放阅读框，所述开放阅读框编码参考抗原多肽的集合；以及(b)任选地，药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述疫苗通过选自由肌肉内施用、皮内施用和皮下施用组成的组的途径施用给个体。在一些实施方案中，所述施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适用于注射所述组合物的装置接触。在一些实施方案中，所述施用步骤包括使受试者的肌肉组织与适于与电穿孔组合注射所述组合物的装置接触。
本发明各方面提供对受试者接种疫苗的方法，所述方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向受试者施用25ug/kg与400ug/kg之间的单次剂量的核酸疫苗，该核酸疫苗包含一种或多种具有编码第一抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框的RNA多核苷酸。
其它方面提供核酸疫苗，所述核酸疫苗包含具有开放阅读框的一种或多种RNA多核苷酸，该一种或多种RNA多核苷酸包含至少一种化学修饰，所述开放阅读框编码第一抗原多肽或多联体多肽，其中所述疫苗具有与未被修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
其它方面提供包含LNP配制的RNA多核苷酸的核酸疫苗，该RNA多核苷酸具有不包含核苷酸修饰(未被修饰)的开放阅读框，该开放阅读框编码第一抗原多肽或
多联体多肽，其中该疫苗具有与未在LNP中配制的未被修饰的mRNA疫苗产生相等抗体效价所需相比少至少10倍的RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸以25-100微克的剂量存在。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗60岁或以上的老年受试者的方法，该方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向该受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸具有编码抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗17岁或以下的年轻受试者的方法，该方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向该受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸具有编码抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框。
在其它方面，本发明涵盖一种治疗成年受试者的方法，该方法包括以对受试者接种疫苗的有效量向该受试者施用包含一种或多种RNA多核苷酸的核酸疫苗，所述一种或多种RNA多核苷酸具有编码抗原多肽或多联体多肽的开放阅读框。
在一些方面，本发明包含一种对受试者接种组合疫苗的方法，所述组合疫苗包括至少两种编码抗原的核酸序列，其中该疫苗的剂量是组合治疗剂量，其中编码抗原的每一个别核酸的剂量是亚治疗剂量。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的25微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的100微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的50微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的75微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的150微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合剂量是施用给受试者的核酸疫苗中的400微克RNA多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗原的每一个别核酸的亚治疗剂量是1微克、2微克、3微克、4微克、5微克、6微克、7微克、8微克、9微克、10微克、11微克、12微克、13微克、14微克、15微克、16微克、17微克、18微克、19微克或20微克。在其它实施方案中，所述核酸疫苗经历化学修饰，并且在其它实施方案中，所述核酸疫苗未经历化学修饰。
其它组分
LNP(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)还可包括一种或多种除了前述部分中所述组分以外的组分。在一些实施方案中，LNP(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)可包括一种或多种小疏水性分子，例如维生素(例如维生素A或维生素E)或固醇。
脂质纳米颗粒(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)也可包括一种或多种渗透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其它组分。渗透性增强剂分子可以是例如美国专利申请公开第2005/0222064号所述的分子。碳水化合物可包括单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原以及其衍生物和类似物)。
聚合物可包括于LNP中，和/或用于囊封或部分地囊封LNP。聚合物可以是生物可降解的和/或生物相容性的。聚合物可选自但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯(polycarbamate)、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨基甲酸酯(polyurethane)、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚丙烯酸酯。在一些实施方案中，聚合物可包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷酯、聚氨基甲酸酯、聚-L-离氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟基丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-麸氨酸、聚(羟基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷基(例如聚乙烯和聚丙烯)、聚烷二醇(例如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸烷二酯(例如聚(对苯二甲酸乙二酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(例如聚(乙酸乙烯酯))、聚卤化乙烯(例如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、衍生化纤维素(例如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟基丙基纤维素、羧基甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(例如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)以及其共聚物和混合物)、聚二噁烷酮及其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚氧胺、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚(N-丙烯酰基吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)及聚甘油。
表面改变剂可包括但不限于阴离子蛋白(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子表面活性剂，例如二甲基二(十八烷基)-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、化痰剂(例如乙酰基半胱氨酸、艾蒿、菠罗蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、胺溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白、胸腺素β4、阿法链道酶(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))以及DNA酶(例如rhDNase)。表面改变剂可安置于纳米颗粒内和/或LNP的表面上(例如根据涂布、吸附、共价连接或其它方法)。
LNP(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)也可包含一种或多种官能化脂质。在一些实施方案中，脂质可用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可经历环加成反应。具体点说，脂质双层可按此方式，以可用于促进膜渗透、细胞识别或成像的一个或多个基团官能化。LNP(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)的表面也可与一种或多种有用抗体缀合。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能基和缀合物是本领域中众所周知的。
除了这些组分以外，脂质纳米颗粒(例如本公开的空LNP或带负载的LNP)也可包括可用于药物组合物中的任何物质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或附属成分，例如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂以及其它物质。还可包括如蜡、乳酪、着色剂、涂布剂、调味剂和芳香剂之类赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington的The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
稀释剂的实例可包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉糖和/或其组合。造粒剂和分散剂可选自由马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、乙醇酸淀粉钠、粘土、褐藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素及木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯-吡咯烷酮)(交联聚维酮)、羧基甲基淀粉钠(乙醇酸淀粉钠)、羧基甲基纤维素、交联羧基甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧基甲基纤维素钙、硅酸镁铝月桂基硫酸钠、季铵化合物和/或其组合组成的非限制性清单。
表面活性剂和/或乳化剂可包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、褐藻酸、褐藻酸钠、黄芪胶、克罗珠克(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶质粘土(例如膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、三乙酸甘油酯单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、甘油单硬脂酸酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如羧聚乙烯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例如羧基甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯/>聚氧乙烯山梨醇酐/>聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯/>山梨醇酐单棕榈酸酯/>山梨醇酐单硬脂酸酯/>山梨醇酐三硬脂酸酯甘油单油酸酯、山梨醇酐单油酸酯/>)、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯/>聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯及/>)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如/>)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚/>)、聚(乙烯-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、F 68、/> 188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、多库酯钠(docusate sodium)和/或其组合。
粘合剂可以是淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；天然胶和合成胶(例如阿拉伯胶、褐藻酸钠、爱尔兰苔提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、茄替胶、伊莎珀尔果壳的粘液、羧基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、微晶纤维素、纤维素乙酸酯、聚(乙烯-吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；褐藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；以及其组合，或任何其它适合的粘合剂。
防腐剂的实例可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。抗氧化剂的实例包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸单水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。抗微生物防腐剂的实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯甲醇、布罗波尔(bronopol)、溴棕三甲铵(cetrimide)、西吡氯铵、洛赫西定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲苯酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲(imidurea)、苯酚、苯氧乙醇、苯基乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。抗真菌防腐剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。醇类防腐剂的实例包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苄醇、苯酚、酚类化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯基乙醇。酸性防腐剂的实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢抗坏血酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括但不限于生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去铁胺、溴棕三甲铵、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、GLYDANT对羟基苯甲酸甲酯、/> 115、NEOLONETM、KATHONTM和/或/>
缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、乳糖酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、二羟基磷酸钙(calcium hydroxide phosphate)、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氨基-磺酸酯缓冲液(例如HEPES)、氢氧化镁、氢氧化铝、褐藻酸、无热原质水、等渗生理食盐水、林格氏溶液、乙醇和/或其组合。润滑剂可选自由硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、硅石、滑石、麦芽、甘油山嵛酸酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、白氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠及其组合组成的非限制性组。
油的实例包括但不限于扁桃仁、杏仁、鳄梨、巴西棕榈、佛手柑、黑加仑籽、琉璃苣、刺桧、甘菊、芥花、香菜、巴西棕榈、蓖麻、肉桂、可可脂、椰子、鱼肝、咖啡、玉米、棉籽、鸸鹋、桉树、月见草、鱼、亚麻仁、香草醇、葫芦、葡萄子、榛子、海索草、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴、夏威夷核果、熏衣草花、熏衣草、柠檬、山苍子、澳洲坚果、锦葵、芒果核、池花籽、貂、肉豆蔻、橄榄、橙、大西洋胸棘鲷、棕榈、棕榈仁、桃仁、花生、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、米糠、迷迭香、红花、白檀、山茶花、咸油、沙棘、芝麻、乳木果油、硅酮、大豆、向日葵、茶树、蓟、椿花、香根草、胡桃及小麦胚芽油以及硬脂酸丁酯、辛酸三酸甘油酯、癸酸三酸甘油酯、环甲基硅酮、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、西甲硅油、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二醇、油醇、硅酮油和/或其组合。
药物组合物
包含脂质纳米颗粒的配制物可整体或部分地配制为药物组合物。药物组合物可包括一种或多种脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，药物组合物可包括一种或多种脂质纳米颗粒，所述种或多种脂质纳米颗粒包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物可另外包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或附属成分，例如本文所述的成分。关于药物组合物和剂的配制和制造的一般标准可例如在Remington的The Science and Practiceof Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006中获得。常规赋形剂和附属成分可用于任何药物组合物，除非任何常规赋形剂或附属成分可能与本公开配制物中的LNP的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或附属成分与配制物的LNP的组分的组合可导致任何非所需生物效应或在其它方面导致有害效应，则该赋形剂或附属成分可与LNP的该组分不相容。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或附属成分可构成包括LNP的药物组合物的总质量或体积的超过50％。在一些实施方案中，所述一种或多种赋形剂或附属成分可构成药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更高百分比。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂获得批准用于人类和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂获得美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级的。在一些实施方案中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
根据本公开的药物组合物中所述一种或多种脂质纳米颗粒、所述一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、体格和/或状况，并且另外取决于欲施用组合物的途径而变化。例如，药物组合物包含在0.1％与100％(wt/wt)之间的一种或多种脂质纳米颗粒。作为另一实例，药物组合物包含在0.1％与15％(wt/vol)之间的一种或多种两亲性聚合物(例如0.5％、1％、2.5％、5％、10％或12.5％w/v)。
在一些实施方案中，本公开的脂质纳米颗粒和/或药物组合物被冷藏或冷冻用于储存和/或装运(例如储存于4℃或更低温度，例如约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间的温度(例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)。例如，包含一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物是在例如约-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏用于储存和/或装运的溶液或固体(例如通过冻干)。在某些实施方案中，本公开还涉及一种通过将脂质纳米颗粒和/或其药物组合物储存于4℃或更低温度，例如约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间的温度，例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)来增加脂质纳米颗粒的稳定性的方法。
脂质纳米颗粒和/或包括一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物可施用给任何患者或受试者，包括可受益于通过向一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或其群组(例如肾系统)递送治疗剂和/或预防剂而提供的治疗作用的患者或受试者。尽管本文所提供的对于脂质纳米颗粒以及包括脂质纳米颗粒的药物组合物的描述原则上涉及适于施用给人类的组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物一般也适于施用给任何其它哺乳动物。应充分理解，可对适于施用给人类的组合物进行改良以便使所述组合物适于施用给多种动物，并且普通熟习兽医学的药理学家仅需常规(如果需要)实验即可设计和/或执行此类改良。经考虑，施用所述组合物的受试者包括但不限于人类、其它灵长类动物以及其它哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠。
包括一种或多种脂质纳米颗粒的药物组合物可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它附属成分缔合，接着有需要或必要时，将产物分成、成形和/或封装成所需单一剂量或多剂量单元。
根据本公开的药物组合物可大批、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、封装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如脂质纳米颗粒)的药物组合物的个别量。活性成分的量一般等于将施用给受试者的活性成分的剂量，和/或这一剂量的合宜分率，例如这一剂量的一半或三分之一。
药物组合物可制备为适于多种施用途径和方法的多种形式。在一些实施方案中，药物组合物可以制备为液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂及颗粒剂)、供表面和/或透皮施用的剂型(例如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、粉剂及其它形式。
供口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除了活性成分以外，液体剂型也包含本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂以及乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体点说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及山梨醇酐的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物也可包括额外治疗剂和/或预防剂、额外剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在关于肠胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂，例如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合混合。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液，可根据已知技术，使用适合分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制。无菌可注射制剂可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒剂和溶剂有水、林格氏溶液(U.S.P.)及等渗氯化钠溶液。无菌、不挥发油惯常地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可使用任何温和不挥发油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。例如油酸的脂肪酸可用于可注射剂的制备。
可注射配制物可例如根据经细菌截留过滤器过滤，和/或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，该灭菌剂可在使用之前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的效应，通常可需要减慢自皮下或肌肉内注射吸收活性成分。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，而其溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过使药物溶解或悬浮于油媒剂中来实现。可注射储槽形式是通过在例如聚丙交酯-聚乙交酯的生物可降解聚合物中形成药物的微囊封基质而制得。取决于药物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。积存式可注射配制物是通过将药物截留于可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
供直肠或阴道施用的组合物典型地为栓剂，所述栓剂可通过混合组合物与适合的非刺激性赋形剂，例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡制备，所述赋形剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体，并因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。
供口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、薄膜、粉剂及颗粒剂。在所述固体剂型中，将活性成分与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充剂或增量剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)、粘合剂(例如羧基甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如甘油)、崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶解延迟剂(例如石蜡)、吸收促进剂(例如季铵化合物)、润湿剂(例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯)、吸收剂(例如高岭土和膨润土、硅酸盐)和润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)及其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型可包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物可在使用例如乳糖(lactose/milk sugar)和高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊及硬填充明胶胶囊中用作填充剂。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒剂之类固体剂型可用包衣和壳，例如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其它包衣制备。这些固体剂型可任选地包含乳浊剂，并且可具有使其仅释放一种或多种活性成分的组成。在一些实施方案中，固体组合物可任选地包含乳浊剂，并且可具有使其任选地以延迟方式在肠道某一部分中释放一种或多种活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物可在使用例如乳糖(lactose/milksugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充明胶胶囊及硬填充明胶胶囊中用作填充剂。
用于组合物的表面和/或透皮施用的剂型可包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴片。一般而言，活性成分在无菌条件下与可需要的药学上可接受的赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲液混合。另外，本公开涵盖透皮贴片的使用，所述透皮贴片通常具有向身体提供化合物的控制递送的附加优势。此类剂型可例如根据使化合物溶解和/或分散于适当介质中来制备。或者或另外，速率可通过提供速率控制膜和/或通过在聚合物基质和/或凝胶中分散化合物来控制。
用于递送本文所述的皮内药物组合物的适合装置包括短针装置，例如美国专利4,886,499；5,190,521；5,328,483；5,527,288；4,270,537；5,015,235；5,141,496；以及5,417,662中所述者。皮内组合物可通过限制针进入皮肤中的有效穿透长度的装置，例如PCT公开WO99/34850中所述的装置及其功能等效物来施用。通过液体射流注射器和/或通过刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针向真皮递送液体组合物的射流注射装置是适合的。射流注射装置描述于例如美国专利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；PCT公开WO97/37705及WO 97/13537中。使用压缩气体来加速呈粉末形式的疫苗通过皮肤外层到达真皮的弹道粉末/颗粒递送装置是适合的。或者或另外，常规注射器可用于皮内施用的经典曼托方法(mantoux method)中。
适于表面施用的配制物包括但不限于液体和/或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(例如乳膏、软膏和/或糊剂和/或溶液和/或悬浮液)。可表面施用的配制物可例如包含约1％至约10％(wt/wt)活性成分，不过活性成分的浓度可高达该活性成分在溶剂中的溶解度极限。供表面施用的配制物可另外包含一种或多种本文所述的额外成分。
药物组合物可以适于通过口腔进行肺部施用的配制物形式进行制备、封装和/或销售。此类配制物可包括包含活性成分的干燥颗粒。所述组合物宜呈干粉形式以使用包含干粉储集器的装置(推进剂流可被引导至其中以分散粉末)和/或使用自推进溶剂/粉末分配容器(例如包含溶解和/或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置)进行施用。干粉组合物可包括固体细粉状稀释剂，例如糖，并且便利地以单位剂型提供。
低沸点推进剂一般包括在大气压力下具有低于65℉的沸点的液体推进剂。一般而言，推进剂可构成组合物的50％至99.9％(wt/wt)，并且活性成分可构成组合物的0.1％至20％(wt/wt)。推进剂可另外包含额外成分，例如液体非离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其可具有与包含活性成分的颗粒相同级别的粒径)。
被配制用于肺部递送的药物组合物可提供呈溶液和/或悬浮液的小液滴形式的活性成分。所述配制物可作为任选地无菌并且包含活性成分的水性和/或稀醇溶液和/或悬浮液制备、封装和/或销售，并且可便利地使用任何喷雾和/或雾化装置进行施用。所述配制物可另外包含一种或多种额外成分，包括但不限于调味剂(例如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(例如羟基苯甲酸甲酯)。由此施用途径提供的小液滴可具有在约1nm至约200nm范围内的平均直径。
本文中描述为可用于肺部递送的配制物可用于鼻内递送药物组合物。适于鼻内施用的另一配制物是包含活性成分并具有约0.2μm至500μm的平均颗粒的粗粉。此类配制物是以其中采取鼻吸的方式，即通过经鼻道自保持接近鼻子的粉末容器快速吸入来施用。
适于鼻施用的配制物可例如包含约低至0.1％(wt/wt)并高达100％(wt/wt)的活性成分，并且可包含一种或多种本文所述的额外成分。药物组合物可以适于经颊施用的配制物形式制备、封装和/或销售。此类配制物可例如呈使用常规方法制得的片剂和/或口含片形式，并且可以是例如0.1％至20％(wt/wt)活性成分，余下包含口服可溶解和/或可降解组合物并且任选地包含一种或多种本文所述的额外成分。或者，适于经颊施用的配制物可包括包含活性成分的粉末和/或烟雾化和/或雾化溶液和/或悬浮液。当分散时，此类粉状、烟雾化和/或烟雾化配制物可具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均颗粒和/或小液滴大小，并且可另外包含一种或多种本文所述的任何额外成分。
药物组合物可以适于眼科施用的配制物形式制备、封装和/或销售。此类配制物可例如呈包括例如活性成分于水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(wt/wt)溶液和/或悬浮液的滴眼剂形式。此类滴剂可另外包含缓冲剂、盐和/或一种或多种其它本文所述的任何额外成分。可用的其它眼科可施用配制物包括包含呈微晶形式和/或呈脂质体制剂的活性成分者。滴耳剂和/或滴眼剂涵盖在本公开的范围内。
在细胞中产生多肽的方法
本公开提供在哺乳动物细胞中产生所关注的多肽的方法。产生多肽的方法涉及使细胞与本公开的配制物接触，所述配制物包含包括编码所关注多肽的mRNA的LNP。在细胞与脂质纳米颗粒接触时，所述mRNA可在细胞中溶解并翻译以产生所关注的多肽。
一般而言，使哺乳动物细胞与LNP接触的步骤可体内、离体、在培养物中或体外执行，所述LNP包括编码所关注多肽的mRNA。与细胞接触的脂质纳米颗粒的量和/或其中mRNA的量可取决于所接触的细胞或组织的类型、施用方式、脂质纳米颗粒及其中mRNA的生理化学特征(例如大小、电荷和化学组成)以及其它因素。一般而言，有效量的脂质纳米颗粒将允许细胞中的有效多肽产生。关于效率的度量可包括多肽翻译(由多肽表达量指示)、mRNA降解的水平和免疫反应指示剂。
使包括mRNA的LNP与细胞接触的步骤可涉及或引起转染。LNP的脂质组分中包括的磷脂可例如根据与细胞或细胞内膜相互作用和/或融合而促进转染和/或增加转染效率。转染可允许细胞内的mRNA翻译。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可在治疗上使用。例如，LNP中包括的mRNA可编码治疗性多肽(例如在可翻译区中)并在接触和/或进入(例如转染至)细胞中后产生治疗性多肽。在其它实施方案中，LNP中包括的mRNA可编码可改良或增加受试者的免疫性的多肽。在一些实施方案中，mRNA可编码粒细胞-集落刺激因子或曲妥珠单抗(trastuzumab)。
在一些实施方案中，LNP中包括的mRNA可编码重组多肽，该重组多肽可置换可基本上不存在于与脂质纳米颗粒接触的细胞中的一种或多种多肽。所述一种或多种基本上不存在的多肽可归因于编码基因或其调控路径的基因突变而缺乏。或者，通过mRNA翻译产生的重组多肽可拮抗存在于细胞中、细胞表面上或自细胞分泌的内源蛋白的活性。拮抗性重组多肽可需要抗击由该内源蛋白的活性引起的有害效应，例如改变的活性或通过突变引起的定位。在另一替代方案中，通过mRNA翻译产生的重组多肽可间接地或直接地拮抗存在于细胞中、细胞表面上或自细胞分泌的生物部分的活性。被拮抗的生物部分可包括但不限于脂质(例如胆固醇)、脂蛋白(例如低密度脂蛋白)、核酸、碳水化合物及小分子毒素。通过mRNA翻译产生的重组多肽可被工程改造成定位于细胞内，例如特定隔室(例如细胞核)内，或可被工程改造成自细胞分泌或易位至细胞的质膜。
在一些实施方案中，使细胞与包括mRNA的LNP接触可降低细胞对外源核酸的先天免疫反应。细胞可与第一脂质纳米颗粒接触，所述第一脂质纳米颗粒包括第一量的包括可翻译区的第一外源mRNA，并且可确定细胞对第一外源mRNA的先天免疫反应的水平。随后，细胞可与第二组合物接触，所述第二组合物包括第二量的第一外源mRNA，相较于第一量，第二量有较少量的第一外源mRNA。或者，第二组合物可包括第一量的不同于第一外源mRNA的第二外源mRNA。使细胞与第一组合物和第二组合物接触的步骤可重复一次或多次。另外，可任选地确定细胞中多肽产生(例如翻译)的效率，并且细胞可重复地与第一组合物和/或第二组合物再接触，直至实现靶蛋白生产效率。
向细胞和器官递送治疗剂的方法
本公开提供向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂(例如核酸)的方法。向细胞递送治疗剂和/或预防剂涉及向受试者施用本公开的配制物，该配制物包括含治疗剂和/或预防剂(例如核酸)的LNP，其中组合物的施用涉及使细胞与组合物接触。在一些实施方案中，可将蛋白质、细胞毒性剂、放射性离子、化学治疗剂或核酸(例如RNA，例如mRNA)递送至细胞或器官。在治疗剂和/或预防剂为mRNA的情况下，在细胞与脂质纳米颗粒接触时，可翻译mRNA可在细胞中翻译以产生所关注的多肽。然而，基本上不可翻译的mRNA也可递送至细胞。基本上不可翻译的mRNA可用作疫苗和/或可隔绝细胞的翻译组分以降低其它物质在细胞中的表达。
在一些实施方案中，LNP可靶向特定类型或类别的细胞(例如特定器官或其系统的细胞)。在一些实施方案中，包括所关注的治疗剂和/或预防剂的LNP可特异性地递送至哺乳动物肝脏、肾、脾、股骨或肺。特异性递送至特定类别的细胞、器官或其系统或群组暗示例如在将LNP施用至哺乳动物时，相对于其它目的地，较高比例的包括治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒经递送至所关注的目的地(例如组织)。在一些实施方案中，特异性递送可导致如与另一目的地(例如脾)相比，靶向目的地(例如所关注的组织，例如肝脏)的每1g组织中治疗剂和/或预防剂的量的超过2倍、5倍、10倍、15倍或20倍增加。在一些实施方案中，所关注的组织选自由以下组成的组：肝脏、肾、肺、脾、股骨、在血管中(例如冠状动脉内或股动脉内)的血管内皮或肾以及肿瘤组织(例如通过肿瘤内注射)。
作为靶向或特异性递送的另一实例，编码细胞表面上的蛋白质结合搭配物(例如抗体或其功能片段、骨架蛋白或肽)或受体的mRNA可包括在LNP中。mRNA可另外或替代地用于指导脂质、碳水化合物或其它生物部分的合成和细胞外定位。或者，LNP的其它治疗剂和/或预防剂或成分(例如脂质或配体)可基于它对特定受体(例如低密度脂蛋白受体)的亲和力进行选择，由此使LNP能更容易地与包括所述受体的靶细胞群体相互作用。在一些实施方案中，配体可包括但不限于特定结合对的成员、抗体、单克隆抗体、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单结构域抗体、骆驼化抗体及其片段、人源化抗体及其片段以及其多价形式；包括单特异性或双特异性抗体的多价结合试剂，例如二硫化物稳定的Fv片段、scFv串联体、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体；以及适体、受体和融合蛋白。
在一些实施方案中，配体可以是表面结合抗体，该抗体可允许细胞靶向特异性的调整。这是特别有用的，因为高度特异性抗体可针对所需靶向位点的所关注表位而产生。在一个实施方案中，多种抗体表达于细胞的表面上，并且各抗体可对所需目标具有不同特异性。此类方法可增加靶向相互作用的亲合力和特异性。
配体可例如由熟习生物技术人员基于细胞的所需定位或功能进行选择。
在一些实施方案中，LNP可靶向肝细胞。经显示，载脂蛋白，如载脂蛋白E(apoE)与身体中含中性或近中性脂质的脂质纳米颗粒缔合，并且已知它与发现于肝细胞的表面上的受体(例如低密度脂蛋白受体(LDLR))缔合。因此，施用给受试者的包括具有中性或近中性电荷的脂质组分的LNP可在受试者的身体中获得apoE，并且可随后以靶向方式向包括LDLR的肝细胞递送治疗剂和/或预防剂(例如RNA)。
治疗疾病和病症的方法
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的空LNP。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的带负载的LNP。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的LNP配制物。
在一些实施方案中，施用是肠胃外执行的。
在一些实施方案中，施用是肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行的。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的空LNP。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的空LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的带负载的LNP。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的带负载的LNP溶液。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防受试者的疾病或病症的本文所公开的LNP配制物。
在一些方面，本公开提供本文所公开的空LNP在制造用以治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供本文所公开的空LNP溶液在用于制造用以治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供本文所公开的带负载的LNP在制造用以治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供本文所公开的带负载的LNP溶液在制造用以治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
在一些方面，本公开提供一种向受试者施用本文所公开的空LNP的方法。
在一些方面，本公开提供一种向受试者施用本文所公开的空LNP溶液的方法。
在一些方面，本公开提供一种向受试者施用本文所公开的带负载的LNP的方法。
在一些方面，本公开提供一种向受试者施用本文所公开的带负载的LNP溶液的方法。
在一些方面，本公开提供一种向受试者施用本文所公开的LNP配制物的方法。
脂质纳米颗粒可用于治疗疾病、病症或疾患。具体点说，此类组合物可用于治疗以缺失或异常蛋白质或多肽活性为特征的疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，包含包括编码缺失或异常多肽的mRNA的LNP的本公开配制物可施用或递送至细胞。mRNA之后续翻译可产生所述多肽，由此降低或消除由于所述多肽不存在而引起的问题或由所述多肽引起的异常活性。因为翻译可快速地发生，故所述方法和组合物可用于治疗急性疾病、病症或疾患，例如败血症、中风和心肌梗塞。LNP中包括的治疗剂和/或预防剂也能够改变既定物质的转录速率，由此影响基因表达。
本公开提供涉及施用包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(例如核酸)的脂质纳米颗粒以及包括所述脂质纳米颗粒的药物组合物的方法。关于本公开的特征和实施方案，术语治疗剂和预防剂在本文中可互换使用。治疗组合物或其成像、诊断或预防组合物可使用有效预防、治疗、诊断疾病、病症和/或疾患或使疾病、病症和/或疾患成像和/或任何其它目的的任何合理量和任何施用途径施用给受试者。施用给既定受试者的特定量可取决于该受试者的物种、年龄和一般状况；施用目的；特定组成；施用模式等而变化。为便于施用和剂量均一性，根据本公开的组合物可配制为剂量单位形式。然而，应了解，本公开组合物的总每日用量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。针对任何特定患者的特定治疗有效、预防有效或在其它方面适当的剂量水平(例如用于成像)将取决于多种因素，包括所治疗的病症(如果存在)的严重程度和特性；所用一种或多种治疗剂和/或预防剂；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定药物组合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用特定药物组合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。
包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(例如核酸)的LNP可通过任何途径施用。在一些实施方案中，包括一种或多种本文所述的脂质纳米颗粒的组合物，包括预防、诊断或成像组合物在内，是通过多种途径中的一种或多种施用，包括口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、室内、透皮或皮内、皮间、直肠、阴道内、腹膜内、表面(例如根据散剂、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、颊、肠、玻璃体内、肿瘤内、舌下、鼻内；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；作为经口喷雾剂和/或散剂、鼻喷雾剂和/或气雾剂，和/或通过门静脉导管施用。在一些实施方案中，组合物可静脉内、肌肉内、皮内、动脉内、肿瘤内、皮下或通过吸入施用。然而，考虑到药物递送科学的可能进展，本公开涵盖通过任何适当途径递送或施用本文所述的组合物。一般而言，最适当的施用途径将取决于多种因素，包括包含一种或多种治疗剂和/或预防剂的脂质纳米颗粒的性质(例如所述脂质纳米颗粒在例如血流和胃肠道等多种身体环境中的稳定性)、患者状况(例如该患者是否能够耐受特定施用途径)等。
在某些实施方案中，根据本公开的组合物可以既定剂量中足以递送约0.0001mg/kg至约10mg/kg、约0.001mg/kg至约10mg/kg、约0.005mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约0.0001mg/kg至约5mg/kg、约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.005mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约0.0001mg/kg至约2.5mg/kg、约0.001mg/kg至约2.5mg/kg、约0.005mg/kg至约2.5mg/kg、约0.01mg/kg至约2.5mg/kg、约0.05mg/kg至约2.5mg/kg、约0.1mg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约0.0001mg/kg至约1mg/kg、约0.001mg/kg至约1mg/kg、约0.005mg/kg至约1mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.05mg/kg至约1mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.0001mg/kg至约0.25mg/kg、约0.001mg/kg至约0.25mg/kg、约0.005mg/kg至约0.25mg/kg、约0.01mg/kg至约0.25mg/kg、约0.05mg/kg至约0.25mg/kg或约0.1mg/kg至约0.25mg/kg的治疗剂和/或预防剂(例如mRNA)的剂量水平施用，其中1mg/kg(mpk)剂量提供每1kg受试者体重1mg治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，可施用约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的LNP的治疗剂和/或预防剂(例如mRNA)。在其它实施方案中，可施用约0.005mg/kg至约2.5mg/kg剂量的治疗剂和/或预防剂。在某些实施方案中，可施用约0.1mg/kg至约1mg/kg剂量。在其它实施方案中，可施用约0.05mg/kg至约0.25mg/kg剂量。剂量可以按相同或不同量每天施用一次或多次，以获得所需水平的mRNA表达和/或治疗、诊断、预防或成像效应。所需剂量可例如一天三次、一天二次、一天一次、每隔一天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次递送。在某些实施方案中，所需剂量可使用多次施用(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送。在一些实施方案中，单一剂量可例如在手术程序之前或之后或在急性疾病、病症或疾患的情形中施用。
包括一种或多种治疗剂和/或预防剂(例如核酸)的脂质纳米颗粒可与一种或多种其它治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与......组合(in combination with)”不意欲暗示所述剂必须同时施用和/或被配制用于一起递送，不过这些递送方法是在本公开的范围内。在一些实施方案中，可组合施用包括一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂的一种或多种脂质纳米颗粒。组合物可与一种或多种其它所需治疗剂或医学程序并行地、在一种或多种其它所需治疗剂或医学程序之前或之后施用。一般而言，各剂将以针对所述剂确定的剂量和/或时程施用。在一些实施方案中，本公开涵盖组合物或其成像、诊断或预防组合物与改良其生物可用性、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在身体内的分布的剂组合递送。
应进一步了解，组合使用的治疗、预防、诊断或成像活性剂可以单一组合物一起施用，或以不同组合物分开地施用。一般而言，预期组合使用的剂将以不超过其个别地使用时的水平的水平使用。在一些实施方案中，组合使用的水平可低于个别地使用的水平。
用于组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑到所需治疗剂和/或程序的可相容性以及打算实现的所需治疗效应。也应理解，所用疗法可对同一病症实现所需作用(例如可用于治疗癌症的组合物可与化学治疗剂并行地施用)，或它们可实现不同作用(例如控制任何不良作用，例如输注相关反应)。
LNP可与增加所述组合物的有效性和/或治疗窗的剂组合使用。此类剂可以是例如消炎化合物、类固醇(例如皮质类固醇)、斯他汀(statin)、雌二醇、BTK抑制剂、S1P1激动剂、糖皮质激素受体调节剂(GRM)或抗组胺。在一些实施方案中，LNP可与地塞米松(dexamethasone)、甲胺蝶呤(methotrexate)、乙酰胺酚(acetaminophen)、H1受体阻断剂或H2受体阻断剂组合使用。在一些实施方案中，一种治疗有需要的受试者或向受试者(例如哺乳动物)递送治疗剂和/或预防剂的方法可涉及在施用LNP之前用一种或多种剂预治疗该受试者。在一些实施方案中，受试者可用有用量(例如10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg或任何其它有用量)的地塞米松、甲胺蝶呤、乙酰胺酚、H1受体阻断剂或H2受体阻断剂预治疗。预治疗可在施用脂质纳米颗粒之前24小时或更短时间(例如24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟)发生且可按例如递增的剂量发生一次、两次或更多次。
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定根据本文所述的发明的特定实施方案的多种等效物。本公开的范围不意欲局限于以上实施方式，而是如随附权利要求书中所陈述。
除非相反指示或另外自上下文显而易见，否则在权利要求书中，例如“一个(种)”和“所述”之类冠词可意谓一个(种)或超过一个(种)。除非相反指示或另外自上下文显而易见，否则在一组的一个或多个成员之间包括“或”的技术方案或描述在所述组成员中的一者、超过一者或全部存在于、用于既定产物或过程中或以其它方式与既定产物或过程相关时被视为满足条件的。本公开包括如下实施方案，其中确切地该组的一成员存在于、用于既定产物或过程中或以其它方式与既定产物或过程相关。本公开包括如下实施方案，其中所述组成员中的超过一者或全部存在于、用于既定产物或过程中或以其它方式与既定产物或过程相关。
也应注意，术语“包含(comprising)”意欲为开放性的并且允许但不需要包括额外要素或步骤。当术语“包含”在本文中使用时，因此也涵盖并且公开术语“基本上由......组成”和“由......组成”。在本公开中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，经考虑，组合物也基本上由所陈述的组分组成，或由所陈述的组分组成。同样，在方法或工艺被描述为具有、包括或包含特定工艺步骤的情况下，所述工艺也基本上由所陈述的工艺步骤组成，或由所陈述的工艺步骤组成。此外，应理解，步骤的次序或关于执行某些动作的次序并不重要，只要本发明保持可操作即可。此外，两个或更多个步骤或动作可同时进行。
在给出范围的情况下，包括终点。此外，也应理解，除非另外指示或另外从上下文和本领域一般技术人员的理解显而易知，否则以范围表述的值可在本公开的不同实施方案中假设所陈述的范围内的任何特定值或子范围，除非本文另外清楚地指示，否则达到该范围的下限的单位的十分之一。
另外，应理解，在现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案均可明确地从权利要求书的任何一项或多项排除。由于此类实施方案被认为是普通本领域技术人员所知的，故可将其排除在外，即使本文中未明确陈述该排除。
所有引用的来源，例如本文所引用的参考文献、公开、专利申请、数据库、数据库条目和技术，均以引用的方式并入本申请中，即使在引用中未明确陈述。在引用的来源与本申请的陈述有冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。
已经描述了本公开，以下实施例作为说明而非作为限制提供。
实施例
实施例1：由本文所公开的方法制备的例示性空LNP的表征
根据本文所述的方法制造空LNP，并如下所述表征。
迁移率：空LNP是通过毛细管区带电泳(CZE)表征。所述方法使用pH 5的50mM乙酸钠作为缓冲液以及在20cm有效长度的75um二氧化硅毛细管上施加的10kV反向电压。毛细管涂有聚乙烯亚胺(包括在缓冲液中)以产生带正电的壁，以便防止带正电的空LNP与二氧化硅壁的负电荷相互作用。分别针对中性标记物和带正电标记物，即DMSO(设置为0)和苯甲胺(设置为1)计算所测量的LNP群体的迁移率。分布的多分散性是通过测量迁移率峰的半高宽度(扩展)确定。
大小异质性：空LNP的回转半径(rg)是使用不对称流场流分级分离(AF4)与在线18角静态光散射检测器耦合来确定的。所述方法是一种单相分离法，它使用针对膜的垂直流动(交错流)结合平行于膜的通道流动，根据样品的扩散行为对样品进行分级分离。通道流给出拋物线轮廓，并且垂直流驱动大分子朝向膜的边界层。与布朗运动相关的扩散在纵向流动较快的通道中以较高的扩散速率移动较小的颗粒，从而更快地洗脱较小的颗粒。经显示，如Rayleigh-Gans-Debye理论所描述的，本公开的LNP展现出对散射光的角度依赖性。假设球形LNP形状，使用狄拜公式拟合光散射数据以获得Rg。
本公开的例示性空LNP(脂质1和脂质2)的表征结果显示于下表1A和表1B中(所述值是近似值并受仪器变化影响；并且范围是基于一批或多批样品和测量值汇总)：
表1：具有脂质1的空LNP的表征.
表2：具有脂质2的空LNP的表征.
等效内容
本发明的一个或多个实施方案的详情陈述于以上所附描述中。尽管类似于或等效于本文所述方法和材料的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但现在描述优选的方法和材料。本公开的其它特征、目标和优势将从所述描述和权利要求书显而易知。在本说明书和随附权利要求书中，除非本文另外清楚地指示，否则单数形式包括多个提及物。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。本说明书中所引用的所有专利和公开均以引用的方式并入。
前述描述仅出于说明目的提供并且不意欲将本发明局限于所公开的精确形式，而是由随附权利要求书提供。
Claims (124)
1.一种制备空脂质纳米颗粒溶液(空LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；并且
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成所述空LNP溶液。
2.一种制备空脂质纳米颗粒配制物(空LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物。
3.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的所述带负载的LNP溶液。
4.一种制备带负载的脂质纳米颗粒溶液(带负载的LNP溶液)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；并且
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的所述带负载的LNP溶液。
5.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP溶液混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
6.一种制备带负载的脂质纳米颗粒配制物(带负载的LNP配制物)的方法，所述方法包括：
i)纳米沉淀步骤，包括：
i-a)将包含可离子化脂质、结构脂质和磷脂的脂质溶液与包含第一缓冲剂的水性缓冲溶液混合，由此形成包含中间空纳米颗粒(中间空LNP)的中间空脂质纳米颗粒溶液(中间空LNP溶液)；
i-b)将所述中间空LNP溶液保持一定滞留时间；以及
i-c)将稀释溶液添加至所述中间空LNP溶液中，由此形成空LNP溶液；
ii)处理所述空LNP溶液，由此形成空LNP配制物；
iii)将包含核酸的核酸溶液与所述空LNP配制物混合，由此形成包含带负载的脂质纳米颗粒(带负载的LNP)的带负载的LNP溶液；并且
iv)处理所述带负载的LNP溶液，由此形成带负载的LNP配制物。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值是约8.0±2.0、约8.0±1.5、约8.0±1.0、约8.0±0.9、约8.0±0.8、约8.0±0.7、约8.0±0.6、约8.0±0.5、约8.0±0.4、约8.0±0.3、约8.0±0.2或约8.0±0.1(例如约8.0)。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含磷酸盐。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液另外包含PEG脂质。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液不含PEG脂质。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述脂质溶液包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含：
约5mg/mL至约20mg/mL的所述可离子化脂质；
约1mg/mL至约8mg/mL的所述结构脂质；
约1mg/mL至约5mg/mL的所述磷脂；以及
约0.05mg/mL至约5.5mg/mL的所述PEG脂质。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述滞留时间是小于约一秒、约一秒至约一分钟或者约一分钟至约一小时。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液包含乙酸盐。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液不含PEG脂质。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液另外包含PEG脂质。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且稀释溶液另外包含PEG脂质。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
i-d)在步骤i-c)之后，过滤所述空LNP溶液；
任选地，步骤i-d)是在步骤iii)之前执行的；并且
任选地，步骤i-d)是在步骤ii)之前执行的。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤是利用切向流过滤(TFF)执行的。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的有机溶剂；
任选地，所述过滤基本上移除所述空LNP溶液中的乙醇。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤将第二缓冲剂添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述第二缓冲剂的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；并且
任选地，所述过滤将乙酸盐添加至所述空LNP溶液中。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中处理所述空LNP溶液包括添加冷冻保护剂；
任选地，处理所述空LNP溶液包括将所述冷冻保护剂的溶液添加至所述空LNP溶液中；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐；并且
任选地，所述冷冻保护剂是蔗糖。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含约1mol％或更少的所述PEG脂质；
任选地，所述空LNP配制物包含约0.1mol％至约1mol％、约0.2mol％至约0.8mol％、约0.3mol％至约0.7mol％或者约0.4mol％至约0.6mol％的所述PEG脂质。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述空LNP配制物包含乙酸盐；并且
任选地，所述空LNP配制物包含约3mM至约50mM的乙酸盐。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括混合所述核酸溶液、所述空LNP溶液或空LNP配制物及负载缓冲溶液；
任选地，所述负载缓冲溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法另外包括在步骤iii)之前，将预负载缓冲溶液添加至所述空LNP溶液或空LNP配制物中；
任选地，在步骤iii)之前添加至所述空LNP溶液或空LNP配制物中的所述预负载缓冲溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述核酸溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述核酸溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述核酸溶液包含约5mM或更多的乙酸盐。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是RNA；
任选地，所述核酸是mRNA。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)；
任选地，所述带负载的LNP溶液包含乙酸盐；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液包含约10mM至约100mM的乙酸盐。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法另外包括：
iii-a)在处理所述带负载的LNP溶液之前，将所述带负载的LNP溶液保持5秒或更长时间。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液是乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在添加所述包含第三缓冲剂的水性缓冲溶液后，所述带负载的LNP溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，处理所述带负载的LNP溶液包括将所述PEG脂质的溶液添加至所述带负载的LNP溶液中；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述PEG脂质的溶液的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)；
任选地，所述冷冻保护剂的溶液另外包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在添加所述PEG脂质后，所述带负载的LNP溶液包含约1.5mol％至约3.5mol％的所述PEG脂质。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐和tris。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液不含PEG脂质。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液不含PEG脂质，所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液不含PEG脂质。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液另外包含PEG脂质。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且步骤iii)包括将所述核酸溶液、所述空LNP溶液或空LNP配制物及负载缓冲溶液(例如具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值)混合。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述方法另外包括在步骤iii)之前，将预负载缓冲溶液(例如具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值)添加至所述空LNP溶液或空LNP配制物中。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述核酸溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液不含PEG脂质，所述水性缓冲溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，所述稀释溶液的pH值高于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液另外包含PEG脂质。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液不含PEG脂质，所述水性缓冲溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值，并且所述稀释溶液的pH值低于所述可离子化脂质的pKa值。
55.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液是通过如前述权利要求中任一项所述的方法制备的。
56.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物是通过如前述权利要求中任一项所述的方法制备的。
57.一种带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液是通过如前述权利要求中任一项所述的方法制备的。
58.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物是通过如前述权利要求中任一项所述的方法制备的。
59.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以具有至少约70％的分布百分比和约0.4或更小的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
60.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
61.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有约0.35或更小、约0.3或更小、约0.25或更小、约0.2或更小、约0.15或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的扩展。
62.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有约1.5或更小的多分散性；
任选地，所述群体的所述大部分是所述群体的至少约70％。
63.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分是所述群体的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
64.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
65.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以具有至少约70％的分布百分比和约1.5或更小的多分散性的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
66.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中大小异质性模式峰具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的分布百分比。
67.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中大小异质性模式峰具有约1.4或更小、约1.3或更小、约1.2或更小、约1.1或更小、约1.0或更小、约0.9或更小、约0.8或更小、约0.7或更小、约0.6或更小、约0.5或更小、约0.4或更小、约0.3或更小、约0.2或更小、约0.1或更小、约0.09或更小、约0.08或更小、约0.07或更小、约0.06或更小、约0.05或更小、约0.04或更小、约0.03或更小、约0.02或更小或者约0.01或更小的多分散性。
68.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以在约0.4至约0.75处并具有在约0.1至约0.35范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
69.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰在约0.45至约0.7、约0.5至约0.65、约0.52至约0.63处；并且
任选地，所述迁移率峰在约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59、约0.60、约0.61、约0.62、约0.63、约0.64或约0.65处。
70.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.15至约0.33、约0.18至约0.32、约0.19至约0.3、约0.20至约0.28或约0.21至约0.26的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32或约0.33的扩展。
71.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；其中所述群体的特征在于：
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.15至约0.3处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第一迁移率峰；以及
根据毛细管区带电泳(CZE)所测量的在约0.35至约0.5处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的第二迁移率峰。
72.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰在约0.18至约0.28或者约0.2至约0.25处；并且
任选地，所述第一迁移率峰在约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24或约0.25处。
73.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述第一迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述第一迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
74.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰在约0.38至约0.48或者约0.4至约0.45处；并且
任选地，所述第二迁移率峰在约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44或约0.45处。
75.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述第二迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.06至约0.09的扩展；并且
任选地，所述第二迁移率峰具有约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
76.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至40nm范围内的回转半径。
77.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
78.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分的所述回转半径的范围为约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或者17nm至约25nm。
79.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
80.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以在约5nm至40nm处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
81.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约10nm至约35nm、约15nm至约30nm或17nm至约25nm处。
82.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述大小异质性模式峰具有范围为约0.5至约1.5、约0.8至约1.3、约0.9至约1.2或约1.0至约1.1的多分散性。
83.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以在约0.3至约0.4处并具有在0.01至0.5范围内的扩展的迁移率峰为特征，所述迁移率峰是根据毛细管区带电泳(CZE)测量的。
84.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰在约0.32至约0.38、约0.33至约0.37、约0.36至约0.35处；并且
任选地，所述迁移率峰在约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37或约0.38处。
85.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述迁移率峰具有范围为约0.02至约0.2、约0.03至约0.15、约0.4至约0.1或约0.05至约0.08的扩展；并且
任选地，所述迁移率峰具有约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1的扩展。
86.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中根据不对称流场流分级分离(AF4)所测量，所述群体的大部分具有在约5nm至15nm范围内的回转半径。
87.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分是所述群体的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
88.如前述权利要求中任一项所述的LNP群体，其中所述群体的所述大部分的所述回转半径的范围为约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或者6nm至约8nm。
89.一种空LNP群体，所述空LNP群体包含可离子化脂质、磷脂和结构脂质；
其中所述群体以在小于所述群体的平均直径的直径处并具有至少70％的分布百分比的大小异质性模式峰为特征，所述峰是根据不对称流场流分级分离(AF4)测量的。
90.如权利要求24的空LNP群体，其中所述大小异质性模式峰在约5nm至15nm、约5nm至约12nm、约5nm至约10nm或6nm至约8nm处。
91.如前述权利要求中任一项所述的空LNP群体，其中所述CZE被配置成使得中性参考标准以在0处的迁移率峰为特征，并且带电参考标准以在1.0处的迁移率峰为特征。
92.如前述权利要求中任一项所述的空LNP群体，其中所述中性参考标准是DMSO，并且所述带电参考标准是苯甲胺。
93.如前述权利要求中任一项所述的空LNP群体，所述空LNP群体包含约30mol％至约60mol％的所述可离子化脂质、约0mol％至约30mol％的磷脂、约15mol％至约50mol％的结构脂质及约0mol％至约1mol％的PEG脂质。
94.空LNP群体，其中所述群体包含PEG脂质。
95.空LNP群体，其中所述群体不含PEG脂质。
96.一种空LNP溶液，所述空LNP溶液包含如前述权利要求中任一项所述的空LNP群体。
97.一种空LNP配制物，所述空LNP配制物包含如前述权利要求中任一项所述的空LNP群体。
98.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物包含PEG脂质。
99.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物不含PEG脂质。
100.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值。
101.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值并且不含PEG脂质。
102.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物具有高于所述可离子化脂质的pKa值的pH值。
103.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物具有高于所述可离子化脂质的pKa值的pH值并且包含PEG脂质。
104.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物具有低于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物的pH值是约5.0±2.0、约5.0±1.5、约5.0±1.0、约5.0±0.9、约5.0±0.8、约5.0±0.7、约5.0±0.6、约5.0±0.5、约5.0±0.4、约5.0±0.3、约5.0±0.2或约5.0±0.1(例如约5.0)。
105.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物另外包含乙酸盐；
任选地，所述空LNP溶液或空LNP配制物包含约1mM至约100mM、2mM至约80mM或3mM至约50mM的乙酸盐。
106.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，所述空LNP溶液或空LNP配制物另外包含冷冻保护剂。
107.如前述权利要求中任一项所述的空LNP溶液或空LNP配制物，其中张力剂是蔗糖。
108.一种带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
109.一种带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物包括含可离子化脂质、结构脂质、磷脂和PEG脂质的带负载的LNP。
110.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物包含乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、tris或其任何组合；并且
任选地，所述带负载的LNP配制物包含乙酸盐和tris。
111.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物具有高于所述可离子化脂质的pKa值的pH值；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值比所述可离子化脂质的pKa值高约1、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0；
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值是约7.0或更高；并且
任选地，所述带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物的pH值范围为约7.5±1.0、约7.5±0.9、约7.5±0.8、约7.5±0.7、约7.5±0.6、约7.5±0.5、约7.5±0.4、约7.5±0.3、约7.5±0.2或约7.5±0.1(例如约7.5)。
112.如前述权利要求中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质为或其盐。
113.如前述权利要求中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述可离子化脂质为或其盐。
114.如前述权利要求中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述结构脂质是胆固醇。
115.如前述权利要求中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
116.如前述权利要求中任一项所述的方法、群体、空LNP溶液、空LNP配制物、带负载的LNP溶液或带负载的LNP配制物，其中所述PEG脂质是PEG2k-DMG。
117.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP溶液。
118.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP配制物。
119.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是肠胃外执行的。
120.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是肌肉内、皮内、皮下和/或静脉内执行的。
121.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP溶液，所述带负载的LNP溶液用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
122.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP配制物，所述带负载的LNP配制物用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
123.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP溶液在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
124.如前述权利要求中任一项所述的带负载的LNP配制物在制造用于治疗或预防疾病或病症的药剂中的用途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/062369 | 2020-08-06 | ||
| US63/143703 | 2021-01-29 | ||
| US202163226395P | 2021-07-28 | 2021-07-28 | |
| US63/226395 | 2021-07-28 | ||
| PCT/US2021/044928 WO2022032087A1 (en) | 2020-08-06 | 2021-08-06 | Methods of preparing lipid nanoparticles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116916896A true CN116916896A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88361324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180053181.2A Pending CN116916896A (zh) | 2020-08-06 | 2021-08-06 | 制备脂质纳米颗粒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116916896A (zh) |
-
2021
- 2021-08-06 CN CN202180053181.2A patent/CN116916896A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7275111B2 (ja) | 脂質ナノ粒子の生成方法 | |
| US20230364024A1 (en) | Stabilized formulations of lipid nanoparticles | |
| US20220062175A1 (en) | Methods of preparing lipid nanoparticles | |
| US20210378980A1 (en) | Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof | |
| TW202139976A (zh) | 製備脂質奈米顆粒之方法 | |
| JP2022095702A (ja) | 脂質ナノ粒子の安定化製剤 | |
| US20230277457A1 (en) | Methods of preparing lipid nanoparticles | |
| CN116916896A (zh) | 制备脂质纳米颗粒的方法 | |
| WO2024026475A1 (en) | Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |