WO2021117770A1 - 医薬組成物及び処置剤 - Google Patents

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WO2021117770A1
WO2021117770A1 PCT/JP2020/045875 JP2020045875W WO2021117770A1 WO 2021117770 A1 WO2021117770 A1 WO 2021117770A1 JP 2020045875 W JP2020045875 W JP 2020045875W WO 2021117770 A1 WO2021117770 A1 WO 2021117770A1
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carbon atoms
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lipid
pharmaceutical composition
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豊 惠口
野呂　正樹
俊 金海
淳一 井本
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富士フイルム株式会社
株式会社ボナック
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a nucleic acid molecule and a lipid that effectively suppresses the expression of the hepatitis B virus (HBV) gene, and a treatment agent.
  • HBV hepatitis B virus
  • Hepatitis B virus along with hepatitis C virus, is a major cause of chronic hepatitis.
  • Current treatments for chronic hepatitis B include interferon (IFN) therapy and nucleic acid analog preparation therapy.
  • IFN interferon
  • nucleic acid analog preparation calms hepatitis and improves liver function, but it is forced to be taken for a long period of time, and hepatitis relapses in most cases due to discontinuation of the drug. Therefore, the development of a new innovative therapeutic agent different from the current therapeutic method is required (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 3 The mechanism of action of candidates for treatment of chronic hepatitis B is summarized in Non-Patent Document 3. Above all, suppression of translation of all viral proteins by siRNA can be expected to completely block the function as an HBV virus. Nucleic acid drugs can target molecules such as mRNA and miRNA, which cannot be targeted by conventional small molecule drugs and antibody drugs, and are highly expected as next-generation drugs.
  • nucleic acid delivery techniques a method of administering nucleic acid-containing particles in which nucleic acid is encapsulated in particles (liposomes or lipid particles) is known.
  • nucleic acid-containing particles are prepared using lipids having an amino group or the like and becoming cations at a low pH, and delivery of nucleic acids is realized by imparting an appropriate charge to the particles.
  • Patent Document 1 discloses a compound having an ester group, an acetal group or the like as a linking group connecting an aliphatic group and an amino group.
  • Patent Document 2 discloses a compound having a vinyloxy group, an amide group, an oxime group or the like as a linking group connecting an aliphatic group and an amino group.
  • a lipid having an amino group or the like and becoming a cation at a low pH may be referred to as a cationic lipid.
  • Patent Document 3 describes (a) nucleic acids; (b) cationic lipids constituting about 50 mol% to about 85 mol% of total lipids present in particles; (c) approximately 13 mol% of total lipids present in particles. Non-cationic lipids constituting up to about 49.5 mol%; and (d) complex lipids constituting about 0.5 mol% to about 2 mol% of the total lipids present in the particles, which inhibit the aggregation of the particles. Nucleic acid-lipid particles containing are described.
  • Patent Document 4 contains 40 to 65% of cationic lipids having a specific structure, 5 to 10% of neutral lipids, 25 to 40% of sterols, and 0.5 to 10% of PEG or PEG-modified lipids. Lipid preparations containing are described.
  • a nucleic acid drug capable of strongly suppressing the growth of hepatitis B virus is desired.
  • the technique for delivering nucleic acid by a lipid having an amino group is not yet sufficient, and a technique capable of delivering nucleic acid more efficiently is required.
  • the present invention is a pharmaceutical composition in which an artificial siRNA capable of suppressing hepatitis B virus gene expression and a lipid excellent in nucleic acid delivery are combined, and the artificial siRNA is derived from the base sequence represented by the following sequence A.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing a nucleic acid molecule and a treatment agent.
  • a pharmaceutical composition comprising an artificial siRNA capable of suppressing hepatitis B virus gene expression, a lipid represented by the formula (1) or a salt thereof, a cholesterol, and a lipid having a polyethylene glycol structure, which is artificial.
  • siRNA contains a nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by the following sequence A.
  • X represents -NR 1- or -O-
  • R 1 is a hydrogen atom, a hydrocarbon group, or R 21 -L 1 -R 22, 6 to 24 carbon atoms - a group represented by, R 21 represents a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, L 1 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 22 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms, or a group represented by R 31- L 2- R 32- , where R 31 is a hydrocarbon having 1 to 24 carbon atoms.
  • L 2 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 32 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , and R 12 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted.
  • R 4 and R 5 , R 10 and R 5 , R 5 and R 12 , R 4 and R 6 , R 5 and R 6 , R 6 and R 7 , R 6 and R 10 , R 12 and R 7 , and R 7 and any one or more pairs of R 8 may form a linked 4 may contain O atoms to 7-membered ring together, Substituents on alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted are hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups represented by -NR 45 R 46 , substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted heteros.
  • R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • Substituents on the substituted or unsubstituted aryl group and the substituted or unsubstituted heteroaryl group are an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46, and-.
  • a therapeutic agent for hepatitis B which comprises the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6].
  • a therapeutic agent for liver cirrhosis or liver cancer which comprises the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6].
  • [A] A method for treating hepatitis B, which comprises administering the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] to a subject.
  • [B] A method for treating liver cirrhosis or liver cancer, which comprises administering the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] to a subject.
  • [C] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] for use in the treatment of hepatitis B.
  • [D] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] for use in the treatment of liver cirrhosis or liver cancer.
  • [E] Use of the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] for producing a therapeutic agent for hepatitis B.
  • [F] Use of the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [6] for producing a therapeutic agent for liver cirrhosis or liver cancer.
  • hepatitis B virus gene expression can be suppressed, and a therapeutic effect can be efficiently exerted on hepatitis B and related diseases.
  • FIG. 1 shows the relative value of cell viability to drug-free wells 27 days after infection in the anti-HBV assay test in PXB cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes an artificial siRNA capable of suppressing hepatitis B virus gene expression (hereinafter, may be referred to as artificial siRNA), a compound represented by the formula (1) or a lipid as a salt thereof, and a nonionic.
  • the artificial siRNA contains a nucleic acid molecule comprising a sex lipid and a lipid having a nonionic hydrophilic polymer structure, and the artificial siRNA consists of the base sequence represented by the sequence A.
  • the pharmaceutical composition of the present invention preferably contains lipid particles. Lipid particles mean particles composed of components classified as lipids.
  • the lipid particles any structure selected from lipid aggregates, micelles, and liposomes in which lipids are aggregated can be considered, but the structure is not limited to this.
  • the lipids constituting the lipid particles are the lipid represented by the formula (1) or a salt thereof, a nonionic lipid, and a nonionic hydrophilic polymer. It preferably contains a lipid having a structure.
  • the artificial siRNA is preferably encapsulated in lipid particles.
  • the morphology of lipid particles can be confirmed by electron microscope observation or structural analysis using X-rays.
  • the lipid particles have a lipid bilayer structure (lamella structure) and an inner aqueous layer like liposomes, or the electron density inside the particles. It can be confirmed whether or not it has a high core and has a structure packed with constituents such as lipids.
  • the presence or absence of a lipid bilayer structure (lamellar structure) on lipid particles can also be confirmed by X-ray small-angle scattering (SAXS) measurement.
  • SAXS X-ray small-angle scattering
  • the particle size of the lipid particles is not particularly limited, but is preferably 10 to 1000 nm, more preferably 30 to 500 nm, and further preferably 50 to 250 nm.
  • the particle size of the lipid particles can be measured by a general method (for example, dynamic light scattering method, laser diffraction method, etc.).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an artificial siRNA capable of suppressing hepatitis B virus gene expression.
  • the artificial siRNA contains a nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by the following sequence A.
  • Array A 5'- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU (SEQ ID NO: 1)-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG (SEQ ID NO: 2) -3' In the formula, P Is shown.
  • the nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by the sequence A can be synthesized by a commercially available nucleic acid synthesizer based on the phosphoramidite method.
  • RNA amidite for example, EMM amidite (International Publication No. 2013/027843) can be used, and deprotection of the amidite can be performed by a conventional method.
  • the linker represented by P can be introduced into the oligomer using the following L-proline diamide amidite.
  • the content of the artificial siRNA with respect to the total lipid is preferably 1% by mass to 25% by mass, more preferably 1.5% by mass to 20% by mass, and 2% by mass. It is more preferably to 15% by mass.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a lipid which is a compound represented by the formula (1) or a salt thereof.
  • X represents -NR 1- or -O-
  • R 1 is a hydrogen atom, a hydrocarbon group, or R 21 -L 1 -R 22, 6 to 24 carbon atoms - a group represented by, R 21 represents a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, L 1 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 22 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms, or a group represented by R 31- L 2- R 32- , and R 31 is a hydrocarbon having 1 to 24 carbon atoms.
  • L 2 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 32 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , and R 12 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted.
  • R 4 and R 5 , R 10 and R 5 , R 5 and R 12 , R 4 and R 6 , R 5 and R 6 , R 6 and R 7 , R 6 and R 10 , R 12 and R 7 , and R 7 and any one or more pairs of R 8 may form a linked 4 may contain O atoms to 7-membered ring together, Substituents on alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted are hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups represented by -NR 45 R 46 , substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted heteros.
  • R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • Substituents of the substituted or unsubstituted aryl group and the substituted or unsubstituted heteroaryl group are an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46, and -O.
  • the hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms in R 1 and the hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms in R 2 and R 3 are preferably an alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group, and are preferably an alkyl group or an alkenyl group. More preferably it is a group.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms and the alkyl group having 3 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkyl group having 6 to 20 carbon atoms, and the alkyl group having 3 to 24 carbon atoms is more preferably an alkyl group having 6 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms and the alkenyl group having 3 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkenyl group having 6 to 20 carbon atoms, and the alkenyl group having 3 to 24 carbon atoms is more preferably an alkenyl group having 6 to 20 carbon atoms.
  • the alkynyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkynyl group having 6 to 20 carbon atoms, and the alkynyl group having 3 to 24 carbon atoms is more preferably an alkynyl group having 6 to 20 carbon atoms.
  • a hexynyl group a heptynyl group, an octynyl group, a nonynyl group, a decynyl group, an undecynyl group, a dodecynyl group, a tetradecynyl group, a pentadecynyl group, a hexadecynyl group, a heptadecynyl group, and an octadecynyl group.
  • All of the above alkenyl groups preferably have one or two double bonds, and all alkynyl groups preferably have one or two triple bonds.
  • the hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms for R 21 and R 31 is preferably an alkyl group having 10 to 24 carbon atoms, an alkenyl group having 10 to 24 carbon atoms, or an alkynyl group having 10 to 24 carbon atoms. ..
  • the alkyl group having 10 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkyl group having 10 to 24 carbon atoms is preferably an alkyl group having 12 to 24 carbon atoms.
  • heptadecyl group heptadecyl group, octadecyl group, 2-butylhexyl group, 2-butyloctyl group, 1-pentylhexyl group, 2-pentylheptyl group, 3- Pentyloctyl group, 1-hexylheptyl group, 1-hexylnonyl group, 2-hexyloctyl group, 2-hexyldecyl group, 3-hexylnonyl group, 1-heptyloctyl group, 2-heptylnonyl group, 2-heptylundecyl Group, 3-heptyldecyl group, 1-octylnonyl group, 2-octyldecyl group, 2-octyldodecyl group, 3-octylundecyl group, 2-nonylundecyl group, 2-nonylundecyl group,
  • the alkenyl group having 10 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic. Specifically, a decenyl group, an undecenyl group, a dodecenyl group, a dodecadienyl group, a tridecenyl group (preferably (Z) -trideca-8-enyl group), a tetradecenyl group (preferably a tetradeca-9-enyl group), a pentadecenyl group.
  • Group (preferably (Z) -pentadeca-8-enyl group), hexadecenyl group (preferably (Z) -hexadeca-9-enyl group), hexadecadienyl group, heptadecenyl group (preferably (Z)) -Heptadeca-8-enyl group), heptadecadienyl group (preferably (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl group), octadecenyl group (preferably (Z) -octadeca-9-enyl group) ), Octadecadienyl group (preferably (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl group) and the like.
  • the alkynyl group having 10 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic. Specific examples thereof include a decynyl group, an undecynyl group, a dodecinyl group, a tetradecynyl group, a pentadecynyl group, a hexadecynyl group, a heptadecynyl group, and an octadecynyl group. All of the above alkenyl groups preferably have one or two double bonds, and all alkynyl groups preferably have one or two triple bonds.
  • the divalent linking group and the hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms may be an alkylene group having 1 to 18 carbon atoms or an alkaneylene group having 2 to 18 carbon atoms. preferable.
  • the alkylene group having 1 to 18 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the number of carbon atoms is preferably 1 to 12, more preferably 1 to 10, and even more preferably 2 to 10.
  • alkenylene group having 2 to 18 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the number of carbon atoms is preferably 1 to 12, more preferably 2 to 10.
  • L 1 a preferable range of L 1 , -O (CO) O-, -O (CO)-, or-(CO) O- is preferable, and -O (CO)-or- (CO) O- is more preferable.
  • L 2 a preferable range of L 2 , -O (CO) O-, -O (CO)-, or-(CO) O- is preferable, and -O (CO)-or- (CO) O- is more preferable.
  • Alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted for R 4 , R 6 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are linear or branched. It may be in the form of a chain or a ring. The number of carbon atoms is preferably 1 to 12.
  • the substituent is a hydroxyl group, a carboxyl group, -O (CO) OR 41 , -O (CO) -R 42 ,-(CO) OR 43 , or -O.
  • the group represented by —R 44 is preferred, and the group represented by —O (CO) —R 42 or ⁇ (CO) OR 43 is more preferred.
  • Alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted for R 5 , R 7 and R 8 may be linear or branched, and may be chained or cyclic. May be.
  • the number of carbon atoms is preferably 1 to 12, more preferably 1 to 8.
  • the substituent is a hydroxyl group, a carboxyl group, -O (CO) OR 41 , -O (CO) -R 42 ,-(CO) OR 43 , or -O.
  • the group represented by —R 44 is preferred, and the group represented by —O (CO) —R 42 , ⁇ (CO) OR 43 , or —OR 44 is more preferred.
  • Examples of the 4- to 7-membered ring that may contain an O atom include an azetidine ring, a pyrrolidine ring, a piperidine ring, a morpholine ring, and an azepane ring, and a 6-membered ring is preferable, and a piperidine ring and a morpholine ring are preferable.
  • Substituents in alkyl groups with 1-18 carbon atoms that may be substituted are substituted or unsubstituted for R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , and R 12.
  • the aryl group in the case of the aryl group of the number of carbon atoms is preferably 6 to 22, more preferably 6 to 18, and even more preferably 6 to 10. Specific examples thereof include a phenyl group, a naphthyl group, an anthrasenyl group and a phenanthrenyl group.
  • Substituents on the aryl group include an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46 , -O (CO) OR 41 , and -O (CO).
  • the groups represented by —R 42 , — (CO) OR 43 , or —OR 44 are preferred, with hydroxyl or carboxyl groups being more preferred.
  • Specific examples of the substituted aryl group include a hydroxyphenyl group and a carboxyphenyl group.
  • Substituents in alkyl groups with 1-18 carbon atoms that may be substituted are substituted or unsubstituted for R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , and R 12.
  • the heteroaryl group in the case of the heteroaryl group the number of carbon atoms is preferably 1 to 12, and more preferably 1 to 6. Specific examples thereof include a pyridyl group, a pyrazolyl group, an imidazolyl group, a benzoimidazolyl group, a thiazolyl group and an oxazolyl group.
  • Substituents on the heteroaryl group include an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46 , -O (CO) OR 41 , and -O (CO). ) -R 42 ,-(CO) OR 43 , or —OR 44 is preferred, with hydroxyl or carboxyl groups being more preferred.
  • Specific examples of the substituted or unsubstituted heteroaryl group include a hydroxypyridyl group, a carboxypyridyl group, a pyridonyl group and the like.
  • the hydrocarbon groups having 1 to 18 carbon atoms for R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 include alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms, alkenyl groups having 2 to 18 carbon atoms or carbons. It is preferably an alkynyl group having a number of 2 to 18, and more preferably an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms or an alkenyl group having 2 to 18 carbon atoms.
  • the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the number of carbon atoms is preferably 3 to 18, and more preferably 5 to 18.
  • the alkenyl group having 2 to 18 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the number of carbon atoms is preferably 3 to 18, and more preferably 5 to 18.
  • the alkynyl group having 2 to 18 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the number of carbon atoms is preferably 3 to 18, and more preferably 5 to 18.
  • R 1 is a hydrocarbon group or R 21 -L 1 -R 22, 6 to 24 carbon atoms - - X is -NR 1 preferably exhibits a group represented by.
  • one of R 2 and R 3 is a hydrogen atom; the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms, or a group represented by R 31- L 2- R 32-. It is preferable to show.
  • R 2 and R 3 each independently preferably represent a hydrocarbon group having 6 to 24 carbon atoms or a group represented by R 31 ⁇ L 2 ⁇ R 32- .
  • R 4 , R 6 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 are preferably hydrogen atoms.
  • R 5 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with —O (CO) -R 42 or ⁇ (CO) OR 43, and an aryl group. It is preferably an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with, an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with a hydroxyl group, and when it is an alkyl group, R 4 , R 6 , R 10 And R 12 may be linked to each other to form a ring which may contain an O atom.
  • an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with —O (CO) -R 42 or ⁇ (CO) OR 43, or an aryl group is substituted. It is preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted with a hydroxyl group, and an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, —O (CO) —R 42. Alternatively, it is more preferably an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted with ⁇ (CO) OR 43.
  • R 7 and R 8 may be independently substituted with a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms, —O (CO) -R 42 or ⁇ (CO) OR 43 , respectively. It is an alkyl group of 18, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted with an aryl group, or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted with a hydroxyl group, or R 7 and R 8 are mutually exclusive. It is preferable that they are linked to form a 4- to 7-membered ring which may contain an O atom.
  • R 5 and R 7 or R 8 are not connected to each other and do not form a ring.
  • a + b is preferably 1 or 2, more preferably 1.
  • c + d is preferably 1 or 2, more preferably 1.
  • the compound represented by the formula (1) is preferably a compound represented by the following formula (1-1).
  • R 24 is a hydrogen atom, a hydrocarbon group, or R 21 -L 1 -R 22, 6 to 24 carbon atoms - a group represented by, R 21 represents a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, L 1 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 22 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 25 represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms, or a group represented by R 31- L 2- R 32- , and R 31 represents a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, and L 2 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or R 32 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 10 , and R 12 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted.
  • Substituents on alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted are hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups represented by -NR 45 R 46 , substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted heteros.
  • An aryl group a group represented by —O (CO) OR 41 , —O (CO) —R 42 , —— (CO) OR 43 , or —OR 44 , R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms, and the substituents on the substituted or unsubstituted aryl group and the substituted or unsubstituted heteroaryl group are , Alkyl group with 1 to 18 carbon atoms, hydroxyl group, carboxyl group, amino group represented by -NR 45 R 46 , -O (CO) OR 41 , -O (CO) -R 42 ,-(CO) It is a group represented by OR 43 or —OR 44 , and R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently have a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms. Shown.
  • R 4, R 5, R 6 , R 7, R 8, R 10, and R 12 in the formula (1-1) are the same as those of the formula (1).
  • R 24 of the formula (1-1) is preferably an alkyl group or an alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkyl group having 8 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkenyl group having 8 to 20 carbon atoms.
  • R 25 of the formula (1-1) is preferably an alkyl group or an alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkyl group having 7 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms may be linear or branched, and may be chain or cyclic.
  • the alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms is preferably an alkenyl group having 8 to 20 carbon atoms.
  • X indicates -O-;
  • R 2 , R 3 , R 31 , L 2 , and R 32 are synonymous with the definitions in equation (1).
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , and R 12 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted.
  • a substituent on an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted, and a substituent on a substituted or unsubstituted aryl group, and a substituent on a substituted or unsubstituted heteroaryl group are defined in the formula (1).
  • a + b is 1 and c + d is 1 or 2.
  • the compound represented by the formula (1) is a compound represented by the following formula (2).
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms, or a group represented by R 31- L 2- R 32- .
  • R 31 represents a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms.
  • L 2 is -O (CO) O-, -O (CO)-,-(CO) O-, -O-, or Show
  • R 32 is a divalent linking group and represents a hydrocarbon linking group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 5 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted.
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted.
  • Substituents on alkyl groups having 1 to 18 carbon atoms that may be substituted are hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups represented by -NR 45 R 46 , substituted or unsubstituted aryl groups, substituted or unsubstituted heteros.
  • Aryl group a group represented by —O (CO) OR 41 , —O (CO) —R 42 , —— (CO) OR 43 , or —OR 44 .
  • R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aryl group, and a substituted or unsubstituted heteroaryl group.
  • the substituents on the group are an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46 , -O (CO) OR 41 , and -O (CO) -R.
  • R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • e indicates 2 or 3.
  • the definitions of R 2 , R 3 , R 5 , R 7 and R 8 are the same as those in equation (1).
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms and may be substituted with 1 to 18 carbon atoms for R 5.
  • Substituents on the alkyl group of are hydroxyl groups, substituted or unsubstituted aryl groups, —O (CO) OR 41 , —O (CO) —R 42 , ⁇ (CO) OR 43 , or ⁇ . It is a group represented by OR 44 , and R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45 and R 46 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms and are substituted or unsubstituted.
  • Substituents on the aryl group are an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group represented by -NR 45 R 46 , -O (CO) OR 41 , -O (CO)-. It is a group represented by R 42 ,-(CO) OR 43 , or -OR 44 , and R 41 , R 42 , R 43 , R 44 , R 45, and R 46 have 1 carbon atoms, respectively. It shows up to 18 hydrocarbon groups.
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms or a group represented by R 31- L 2- R 32- , where L 2 is.
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms and may be substituted. Substituents on the alkyl groups of numbers 1-18 are unsubstituted aryl groups, —O (CO) -R 42 , or ⁇ (CO) OR 43 , where R 42 and R 43 are independent, respectively. It shows a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 3 to 24 carbon atoms
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom.
  • the substituent on the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms and may be substituted is an unsubstituted aryl group, -O (CO) -R 42 , or-(CO).
  • ) is a group represented by O-R 43, R 42, and R 43 each independently represents a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , where L 2 is -O (CO)-or-(CO).
  • L 2 is -O (CO)-or-(CO).
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and the substituent on the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms which may be substituted is ,
  • An unsubstituted aryl group, a group represented by -O (CO) -R 42 , or-(CO) O-R 43 , and R 42 and R 43 are independently carbonized with 1 to 18 carbon atoms, respectively. Indicates a hydrogen group.
  • R 2 and R 3 each independently represent a group represented by R 31- L 2- R 32- , where L 2 is -O (CO)-or-(. CO) O—, R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms and may be substituted on an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms. Is a substituent represented by an unsubstituted aryl group, -O (CO) -R 42 , or-(CO) O-R 43 , and R 42 and R 43 are independently having 1 to 18 carbon atoms, respectively. Indicates a hydrocarbon group.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 3 to 24 carbon atoms.
  • L 2 represents -O (CO)-or-(CO) O-
  • R 7 and R 8 each independently have a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms.
  • Substituents on alkyl groups with 1-18 carbon atoms that may be shown and substituted are the substituents represented by an unsubstituted aryl group, —O (CO) —R 42 , or ⁇ (CO) OR 43.
  • R 42 and R 43 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • one of R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 6 carbon atoms.
  • Group is indicated, L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-, and R 7 and R 8 each independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms.
  • Substituents on alkyl groups with 1-18 carbon atoms that may be substituted are the groups represented by —O (CO) —R 42 , or ⁇ (CO) OR 43 , R 42 , and R.
  • Each of 43 independently represents a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 6 carbon atoms.
  • Group is indicated, L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-, R 5 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and R 7 and R 8 indicate a group.
  • Independently indicate a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 6 carbon atoms.
  • Group is indicated, L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-, R 5 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and R 7 and R 8 indicate a group.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 has 3 to 5 carbon atoms.
  • L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-
  • R 5 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms
  • R 7 and R independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 has 3 to 5 carbon atoms. It indicates a hydrocarbon group, L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-, R 5 indicates a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and R 7 and R. 8 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms independently, and e represents 2.
  • one of R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 6 carbon atoms.
  • L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-
  • R 5 indicates a hydrogen atom or an substituted alkyl group having 1 to 18 carbon atoms
  • R 7 and R 8 independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms
  • the substituted substituent on the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms is -O (CO) -R 42
  • -(CO) O-R 43 is a group
  • R 42 and R 43 each independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms.
  • R 2 and R 3 represents a group represented by R 31- L 2- R 32- , and the other of R 2 and R 3 is a hydrocarbon having 6 carbon atoms.
  • Group is indicated, L 2 indicates -O (CO)-or-(CO) O-, R 5 indicates a hydrogen atom or an substituted alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and R 7 and R 8 independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and the substituted substituent on the alkyl group having 1 to 18 carbon atoms is -O (CO) -R 42 , or -(CO) O-R 43 is a group, R 42 and R 43 independently represent a hydrocarbon group having 1 to 18 carbon atoms, and e represents 2.
  • the compound represented by the formula (1) may form a salt.
  • Salts in the basic group include, for example, salts with mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitrate and sulfuric acid; formic acid, acetic acid, citrate, oxalic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, malic acid, Salts with organic carboxylic acids such as tartrate, aspartic acid, trichloroacetic acid and trifluoroacetic acid; and salts with sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, mesitylenesulfonic acid and naphthalenesulfonic acid Can be mentioned.
  • Salts in acidic groups include, for example, salts with alkali metals such as sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium; ammonium salts; and trimethylamine, triethylamine, tributylamine, pyridine, N, N- Nitrogen-containing organic bases such as dimethylaniline, N-methylpiperidin, N-methylmorpholin, diethylamine, dicyclohexylamine, procaine, dibenzylamine, N-benzyl- ⁇ -phenethylamine, 1-ephenamine and N, N'-dibenzylethylenediamine. And salt etc.
  • preferred salts include pharmacologically acceptable salts.
  • the compound represented by the formula (1) can be produced by combining known methods, and can be produced, for example, according to the production method shown below.
  • R a and R b are leaving groups; R c , R d and Re are amino protecting groups or imino protecting groups; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 have the same meanings as above.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 have the same meanings as above.
  • As leaving groups for example, chloro group, fluoro group, bromo group, trichloromethoxy group.
  • Examples of the amino-protecting group or the imino-protecting group include a tert-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a 2-nitrobenzenesulfonyl group, a benzyl group and the like.
  • Known compounds of formula [3] include, for example, 4-nitrophenyl chloroformate, 1,1'-carbonyldiimidazole, triphosgene and phosgene.
  • the compound of formula [4] can be produced by reacting the compound of formula [2] with the compound of formula [3] in the presence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides and aromatic hydrocarbons. Examples thereof include hydrogens, and these solvents may be mixed and used.
  • Preferred solvents include ethers, with tetrahydrofuran being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [2].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base.
  • the base is preferably an organic base, and specific examples thereof include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, 4-methylmorpholine, pyridine, and N, N-dimethylaminopyridine.
  • the amount of the base used may be 1 to 50 times mol, preferably 1 to 10 times mol, of the compound of the formula [2].
  • the amount of the compound of the formula [3] to be used is not particularly limited, but may be 0.3 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [2]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • Known compounds of formula [5] include, for example, (9Z, 12Z) -di ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dien-1-yl) amines and dihexadecylamines.
  • the compound of formula [6] can be produced by reacting the compound of formula [4] with the compound of formula [5] in the presence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides and aromatic hydrocarbons. Examples thereof include hydrogens, and these solvents may be mixed and used.
  • Preferred solvents include ethers, with tetrahydrofuran being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [4].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base.
  • the base is preferably an organic base, and specific examples thereof include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, 4-methylmorpholine, pyridine, and N, N-dimethylaminopyridine.
  • the amount of the base used may be 1 to 50 times mol, preferably 1 to 10 times mol, of the compound of the formula [4].
  • the amount of the compound of the formula [5] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [4]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • Compounds of formula [2A] include, for example, tert-butyl (2-((tert-butoxycarbonyl) amino) ethyl) (2-hydroxyethyl) carbamate and tert-butyl (2-((2-hydroxyethyl) (methyl)). ) Amino) ethyl) carbamate and the like are known.
  • the compound of formula [6A] is prepared by reacting the compound of formula [2A] with the compound of formula [3] in the presence of a base, and then combining the compound of formula [4A] with the compound of formula [5] in the presence of a base. It can be produced by reacting with. This reaction may be carried out according to the production methods (1-1) and (1-2).
  • the compound of formula [6] can be produced by deprotecting the compound of formula [6A]. This reaction is, for example, T.I. W. TW Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Edition, pp. 696-926, 2007, John Wiley and Sons. Wiley & Sons, INC.) May be followed.
  • R a and R b are leaving groups; R c , R d and Re are amino protecting groups or imino protecting groups; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 have the same meanings as above.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 have the same meanings as above.
  • As leaving groups for example, chloro group, fluoro group, bromo group, trichloromethoxy group.
  • Examples of the amino-protecting group or the imino-protecting group include a tert-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a 2-nitrobenzenesulfonyl group, a benzyl group and the like.
  • Known compounds of formula [3] include, for example, 4-nitrophenyl chloroformate, 1,1'-carbonyldiimidazole, triphosgene and phosgene.
  • the compound of formula [8] can be produced by reacting the compound of formula [7] with the compound of formula [3] in the presence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (1-1).
  • the compound of formula [9] can be produced by reacting the compound of formula [8] with the compound of formula [2] in the presence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides and aromatic hydrocarbons. Examples thereof include hydrogens, and these solvents may be mixed and used. Preferred solvents include ethers, with tetrahydrofuran being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [8].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base.
  • the base is preferably an organic base, and specific examples thereof include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, 4-methylmorpholine, pyridine, and N, N-dimethylaminopyridine.
  • the amount of the base used may be 1 to 50 times mol, preferably 1 to 10 times mol, of the compound of the formula [8].
  • the amount of the compound of the formula [2] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [8]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • Compounds of formula [2A] include, for example, tert-butyl (2-((tert-butoxycarbonyl) amino) ethyl) (2-hydroxyethyl) carbamate and tert-butyl (2-((2-hydroxyethyl) (methyl)). ) Amino) ethyl) carbamate and the like are known.
  • the compound of formula [9] is produced by reacting the compound of formula [8] with the compound of formula [2A] in the presence of a base, and then deprotecting the compound of formula [9A] in the presence of a base. can do. This reaction may be carried out according to the production methods (2-2) and (1-4).
  • R a , R b and R g are leaving groups;
  • R f is an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms;
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 and R 42 have the same meanings as above.
  • As leaving groups for example, chloro group, fluoro group, bromo group, trichloromethoxy.
  • Known compounds of formula [3] include, for example, 4-nitrophenyl chloroformate, 1,1'-carbonyldiimidazole, triphosgene and phosgene.
  • the compound of formula [8] can be produced by reacting the compound of formula [7] with the compound of formula [3] in the presence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (1-1).
  • Compounds of formula [2B] include, for example, 2,2'-((2- (diethylamino) ethyl) azandyl) bis (ethane-1-ol) and 2,2'-((3- (diethylamino) propyl) azandyl). ) Bis (ethane-1-all) is known.
  • the compound of formula [9B] can be produced by reacting the compound of formula [8] with the compound of formula [2B] in the presence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (2-2).
  • the compound of formula [10A] for example, dodecanoic acid, decanoic acid, nonanoic acid, octanoic acid and the like are known.
  • the compound of formula [9C] can be produced by reacting the compound of formula [9B] with the compound of formula [10A] in the presence of a condensing agent or an acid halide in the presence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides and aromatic hydrocarbons. Examples thereof include hydrogens, and these solvents may be mixed and used.
  • Preferred solvents include ethers, with tetrahydrofuran being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [9B].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base.
  • the base is preferably an organic base, and specific examples thereof include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, 4-methylmorpholine, pyridine, and N, N-dimethylaminopyridine.
  • the amount of the base used may be 1 to 50 times mol, preferably 1 to 10 times mol, of the compound of the formula [9B].
  • Condensing agents used in this reaction include, for example, carbodiimides such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; carbonyls such as carbonyldiimidazole; diphenylphosphoryl.
  • carbodiimides such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • carbonyls such as carbonyldiimidazole
  • diphenylphosphoryl diphenylphosphoryl.
  • Acid azides such as azides
  • Acid cyanides such as diethylphosphoryl cyanide
  • Examples of the acid halides used in this reaction include carboxylic acid halides such as acetyl chloride and trifluoroacetyl chloride; sulfonic acid halides such as methanesulfonyl chloride and tosyl chloride; ethyl chloroformate and isobutyl chloroformate. Chloroformates and the like can be mentioned.
  • the amount of the compound of the formula [10A] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [9B]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • the compound of the formula [10B] for example, dodecanoic acid chloride, decanoic acid chloride, nonanoic acid chloride, octanoic acid chloride and the like are known.
  • the compound of formula [9C] can be produced by reacting the compound of formula [9B] with the compound of formula [10B] in the presence of a base.
  • the compound of the formula [10B] can be produced by reacting the compound of the formula [10A] with thionyl chloride, oxalyl chloride and the like.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides and aromatic hydrocarbons. Examples thereof include hydrogens, and these solvents may be mixed and used. Preferred solvents include ethers, with tetrahydrofuran being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [9B].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base. The amount of the base used may be 1 to 50 times mol, preferably 1 to 10 times mol, of the compound of the formula [9B].
  • the amount of the compound of the formula [10B] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [2B]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • R h and R i are leaving groups; R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 and R 12 have the same meanings as above.
  • the leaving group include a chloro group, a bromo group, an iodo group, a methanesulfonyl group, a 4-toluenesulfonyl group, a chloromethanesulfonyl group, a trifluoromethanesulfonyl group, and the like.
  • Compounds of formula [12] include, for example, 2-chloro-N, N-dimethylethane-1-amine, 4- (2-chloroethyl) morpholine and 2-chloro-N, N-diethylethane-1-amine, 2, -Bromo-N, N-diethylethane-1-amine, 3-chloro-N, N-diethylethane-1-amine and the like are known.
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [11] with the compound of formula [12] in the presence or absence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, alcohols, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides, etc. Examples include aromatic hydrocarbons and water, and these solvents may be mixed and used.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [11].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base. The amount of the base used may be 1 to 10000 times mol, preferably 1 to 5000 times mol, of the compound of the formula [11].
  • the amount of the compound of the formula [12] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [11]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [13] with the compound of formula [14] in the presence or absence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (4-1).
  • R j is a leaving group
  • R k is an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 and R 43 have the same meanings as above.
  • As leaving groups for example, chloro group, bromo group, iodo group, methanesulfonyl group, 4-toluenesulfonyl group, chloromethanesulfonyl group, trifluoromethanesulfonyl. Group, etc.
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [2C] with the compound of formula [15A] in the presence or absence of a base.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, alcohols, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides, etc. Examples include aromatic hydrocarbons and water, and these solvents may be mixed and used.
  • Preferred solvents include ethers or nitriles, with tetrahydrofuran or acetonitrile being more preferred.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [2C].
  • Examples of the base used in this reaction include an inorganic base and an organic base.
  • the amount of the base used may be 1 to 10000 times mol, preferably 1 to 5000 times mol, of the compound of the formula [2C].
  • the amount of the compound of the formula [15A] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [13].
  • This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • R g and R l are leaving groups;
  • R m is an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms;
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 and R 42 have the same meanings as above.
  • ”As the leaving group for example, a chloro group, a bromo group, an iodo group, a methanesulfonyl group, a 4-toluenesulfonyl group, a chloromethanesulfonyl group, Trifluoromethanesulfonyl group, trichloromethoxy group, 4-nitro-phenoxy group, 2,4-dinitrophenoxy group, 2,4,6-trichlorophenoxy group, pentafluorophenoxy group, 2,3,5,6-tetrafluorophenoxy Examples thereof include a group, an imidazolyl group, a triazolyl group, a 3,5-dioxo-4-methyl-1,2,4-oxadiazolidyl group, and an N-hydroxysuccinimidyl group.
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [2B] with the compound of formula [10A] in the presence of a condensing agent or an acid halide in the presence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (3-3).
  • the compound of formula [10B] for example, dodecanoic acid chloride, decanoic acid chloride, nonanoic acid chloride, octanoic acid chloride and the like are known.
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [2B] with the compound of formula [10B] in the presence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (3-4).
  • the compound of formula [2] can be produced by reacting the compound of formula [2C] with the compound of formula [16] in the presence or absence of a base. This reaction may be carried out according to the production method (4-1).
  • R n , Ro and R p are alkyl groups having 1 to 17 carbon atoms; R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 12 , R 42 and R 43 have the same meaning as above. "
  • Known compounds of formula [17A] include, for example, formaldehyde, acetaldehyde, propanal, butanal, pentanal, hexanal, heptanal and octanal.
  • the compound of the formula [2] is such that the compound of the formula [2C] is reacted with the compound of the formula [17A] in the presence of a reducing agent, the presence or absence of a reduction catalyst, and the presence or absence of an acid.
  • the solvent used in this reaction is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, but for example, alcohols, halogen hydrocarbons, ethers, esters, amides, nitriles, sulfoxides, etc.
  • Examples include aromatic hydrocarbons and water, and these solvents may be mixed and used.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but may be 1 to 500 times (v / w) the amount of the compound of the formula [2C].
  • Examples of the acid used in this reaction include inorganic acids and organic acids. The amount of the acid used may be 0.01 to 10000 times mol, preferably 0.05 to 100 times mol, of the compound of the formula [2C].
  • Examples of the reducing agent used in this reaction include sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, 2-picoline borane, formic acid and hydrogen.
  • Examples of the reduction catalyst used in this reaction include palladium-carbon, palladium hydroxide-carbon, platinum-carbon, rhodium-carbon and ruthenium-carbon.
  • the amount of the compound of the formula [17A] to be used is not particularly limited, but may be 1 to 10 times (v / w) the amount of the compound of the formula [13]. This reaction may be carried out at ⁇ 30 to 150 ° C., preferably 0 to 100 ° C. for 5 minutes to 48 hours.
  • the compound of the formula [17C] for example, heptyl 3-oxopropanoate and octyl 3-oxopropanoate are known.
  • the compound of the formula [2] is such that the compound of the formula [2C] is reacted with the compound of the formula [17C] in the presence of a reducing agent, the presence or absence of a reduction catalyst, and the presence or absence of an acid. Can be manufactured by This reaction may be carried out according to the production method (7-1).
  • isomers for example, optical isomers, geometric isomers, tautomers, etc.
  • these isomers can also be used.
  • solvates, hydrates and crystals of various shapes are present, these solvates, hydrates and crystals of various shapes can also be used.
  • a compound having an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group or the like is known in advance after the reaction by protecting these groups with ordinary protecting groups. These protecting groups can be removed by the above method.
  • the compound obtained by the above-mentioned production method is subjected to a reaction known per se such as condensation, addition, oxidation, reduction, rearrangement, substitution, halogenation, dehydration or hydrolysis, or a combination of these reactions is appropriately combined. This can lead to other compounds.
  • the content of the lipid represented by the formula (1) or a salt thereof with respect to the total lipid is preferably 40 mol% to 70 mol%, preferably 45 mol% to 65 mol. It is more preferably%, and even more preferably 50 mol% to 60 mol%.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains cholesterol. By containing cholesterol, the membrane fluidity can be lowered and the effect of stabilizing lipid particles can be obtained.
  • the content of cholesterol with respect to total lipid is preferably 25 mol% to 60 mol%, more preferably 30 mol% to 55 mol%, and 35 mol% to 55 mol. It is more preferably%, and particularly preferably 40 mol% to 50 mol%.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains a lipid having a polyethylene glycol structure.
  • a lipid having a polyethylene glycol structure By containing a lipid having a polyethylene glycol structure, the effect of stabilizing the dispersion of lipid particles can be obtained.
  • the lipid having a polyethylene glycol structure is not particularly limited, and examples thereof include PEG-modified phosphoethanolamine, diacylglycerol PEG derivative, dialkylglycerol PEG derivative, cholesterol PEG derivative, and ceramide PEG derivative.
  • diacylglycerol PEG is preferable. That is, the lipid having a polyethylene glycol structure is preferably a lipid having a diacylglycerol structure and a polyethylene glycol structure, and more preferably an acyl group having a diacylglycerol structure having 12 to 22 carbon atoms. ..
  • the weight average molecular weight of the PEG chain of the polyethylene glycol derivative is preferably 500 to 5000, more preferably 750 to 3000.
  • the content of the lipid having a nonionic hydrophilic polymer with respect to the total lipid is preferably 0.5 mol% to 10 mol%, preferably 0.5 mol% to 5 mol%. Is more preferable, 0.5 mol% to 3 mol% is more preferable, and 0.5 mol% to 2 mol% is most preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain a zwitterionic lipid.
  • a phospholipid is preferable.
  • the phospholipid is not particularly limited, and examples thereof include phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, and phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine are preferable.
  • the phosphatidylcholine is not particularly limited, but is soy lecithin (SPC), hydrogenated soy lecithin (HSPC), egg yolk lecithin (EPC), hydrogenated egg yolk lecithin (EPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- Phosphatidyl (DMPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl (DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl (DSPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl- Examples thereof include sn-glycero-3-phosphatidolin (POPC) and 1,2-dioreoil-sn-glycero-3-phosphatidolin (DOPC).
  • SPC soy lecithin
  • HSPC hydrogenated soy lecithin
  • EPC egg yolk lecithin
  • EPC hydrogenated egg yolk lecithin
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl
  • DMPC 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl
  • the phosphatidylethanolamine is not particularly limited, but is limited to 1,2-dimyristyl-sn-glycero-3-phoethanolamine (DMPE) and 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phoethanolamine (DPPE).
  • DMPE 1,2-dimyristyl-sn-glycero-3-phoethanolamine
  • DPPE 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phoethanolamine
  • DSPE 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phoethanolamine
  • DOPE 1,2-diore oil-sn-glycero-3-phoethanolamine
  • DOPE 1,2-dilinole oil-sn -Glycero-3-phophoethanolamine
  • DOPE 1,2-difitanoyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine
  • POPE 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-Phosphoethanolamine
  • POPE 1,2-ditetradecyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine, 1,2-dihexadecyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine, 1,2-dioctadecyl Examples thereof include -sn-glycero-3-phophoethanolamine and 1,2-diphytanyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine.
  • distearoylphosphatidylcholine DSPC
  • 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC
  • 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DMPC
  • 1,2-Dioreoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine DOPE
  • distearoylphosphatidylcholine DSPC
  • 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC
  • Distearoylphosphatidylcholine DSPC
  • DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • the content of the zwitterionic lipid with respect to the total lipid is preferably 0 mol% to 30 mol%, more preferably 0 mol% to 20 mol%, and 0 mol. It is more preferably% to 10 mol%.
  • the method for producing the pharmaceutical composition of the present invention will be described.
  • the method for producing the pharmaceutical composition is not limited, but is classified into lipids such as lipids which are compounds represented by the formula (1) or salts thereof, nonionic lipids, and lipids having a nonionic hydrophilic polymer structure. All or some of the oil-soluble components can be dissolved in an organic solvent or the like to form an oil phase, and water-soluble components such as artificial siRNA can be dissolved in water to form an aqueous phase, and the oil phase and the aqueous phase can be mixed for production. it can.
  • a micromixer may be used for mixing, or an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier, or the like may be used for emulsification.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier, or the like may be used for emulsification.
  • a dry mixture containing lipids is prepared by vacuum-drying the solution containing lipids with an evaporator or the like or spray-drying with a spray dryer or the like, adding this mixture to an aqueous solvent, and further emulsifying with the above-mentioned emulsifier or the like. It can also be manufactured by doing so.
  • a component classified as a lipid such as a lipid represented by the formula (1) or a salt thereof, a nonionic lipid, and a lipid having a nonionic hydrophilic polymer structure, is dissolved in an organic solvent to form an oil phase.
  • the step (a) includes dissolving a component classified as a lipid in an organic solvent (alcohol such as ethanol, ester, etc.).
  • the total lipid concentration after dissolution in an organic solvent is not particularly limited, but is generally 1 mmol / L to 100 mmol / L, preferably 5 mmol / L to 50 mmol / L, and more preferably 10 mmol / L to. It is 30 mmol / L.
  • the aqueous phase can be obtained by dissolving the artificial siRNA in water or buffer. Ingredients such as antioxidants can be added as needed.
  • the mixing ratio (mass ratio) of the aqueous phase and the oil phase is preferably 5: 1 to 1: 1 and more preferably 4: 1 to 2: 1.
  • step (d) the method for removing the organic solvent from the dispersion liquid of lipid particles is not particularly limited, and a general method can be used. For example, dialysis using phosphate buffered saline is used. The organic solvent can be removed by performing the above.
  • the concentration of the dispersion liquid obtained in the step (d) can be adjusted.
  • concentration phosphate buffered saline, physiological saline or the like can be used as a diluent to dilute to an appropriate concentration.
  • concentration the dispersion liquid obtained in step (d) can be concentrated by ultrafiltration using an ultrafiltration membrane or the like. It is preferable to use the concentrated dispersion as it is, and it is also preferable to adjust the concentration to a desired concentration by using the above-mentioned diluent after concentration.
  • Aseptic filtration is preferable in order to obtain the dispersion liquid of the lipid particles of the present invention as a pharmaceutical composition.
  • a filtration method a hollow fiber membrane, a reverse osmosis membrane, a membrane filter, or the like can be used to remove unnecessary substances from the dispersion liquid of lipid particles.
  • it is not particularly limited, but it is preferable to filter with a filter having a pore size capable of sterilization (preferably a filtration sterilization filter of 0.2 ⁇ m).
  • aseptic filtration is preferably performed after step (c) or step (d).
  • the dispersion liquid of the lipid particles of the present invention can be freeze-dried.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be added with an additive including a pharmaceutically acceptable medium such as an aqueous solution, a salt, a preservative, and a buffer.
  • a pharmaceutically acceptable medium such as an aqueous solution, a salt, a preservative, and a buffer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a treatment agent.
  • a method for treating hepatitis B which comprises administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • a method for treating liver cirrhosis or liver cancer which comprises administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is provided for use in the treatment of hepatitis B.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is provided for use in the treatment of liver cirrhosis or liver cancer.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present invention for the production of a therapeutic agent for hepatitis B is provided.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present invention for the production of a therapeutic agent for liver cirrhosis or liver cancer is provided.
  • Targets of therapeutic agents include humans and non-human mammals. Examples of mammals other than humans include monkeys, dogs, cats, cows, horses, mice, rats and the like.
  • Treatment may be any treatment and therapy that achieves the desired therapeutic effect, eg, inhibition or delay of progression of the condition, slowing the rate of progression, pausing the rate of progression, improving the condition, healing the condition. Or remission (whether partial or complete), prevention, delay, alleviation or arrest of one or more symptoms and / or signs of the condition, or treatment of the subject or subject survival Includes being extended beyond what is expected in the absence of. Treatment also includes prevention. For example, treating a subject who is prone to or at risk of developing or recurring hepatitis B, cirrhosis or liver cancer can prevent the onset or reoccurrence of hepatitis B, cirrhosis or liver cancer in the subject. Or it can be delayed.
  • the target disease of the treatment agent is hepatitis B.
  • the target disease of the therapeutic agent can also be applied to liver cirrhosis or liver cancer, which is a disease related to hepatitis B.
  • the administration route when administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be administered by any method.
  • Oral administration, parenteral administration intra-articular administration, intravenous administration, intra-arterial administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intravitreal administration, intravitreal administration, intramuscular administration, intravaginal administration, intravesical administration
  • parenteral administration is preferable.
  • intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intraperitoneal injection or intramuscular injection is preferable.
  • the dose for example, the dose can be selected in the range of 0.01 mg to 100 mg per 1 kg of the body weight of the subject per administration.
  • purification by column chromatography was carried out using an automatic purification device ISOLERA (Biotage) or a medium pressure liquid chromatograph YFLC W-prep 2XY (Yamazen Corporation).
  • the carrier in silica gel column chromatography is Chro [Example matorex Q-Pack SI 50 (Fuji Silysia Chemical Ltd.), High Flash Columns W001, W002, W003, W004 or W005 (Yamazen Corporation). used.
  • NH silica gel Chromatolex Q-Pack NH 60 (Fuji Silysia Chemical Ltd.) was used.
  • the NMR spectrum was measured using Bruker AV300 (manufactured by Bruker) or Bruker AV400 (manufactured by Bruker) using tetramethylsilane as an internal reference, and the total ⁇ value was shown in ppm.
  • the MS spectrum was measured using an ACQUITY SQD LC / MS System (manufactured by Waters).
  • the reaction mixture was poured into a 10% aqueous sulfuric acid solution (330 mL) under ice-cooling, hexane (300 mL) was added, the organic layer was separated, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • Tetrahydrofuran (200 mL), ethanol (100 mL) and a 10 mol / L potassium hydroxide aqueous solution were added to the obtained residue, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour.
  • Hexane (200 mL) and water (100 mL) were added to the reaction mixture, the organic layer was separated, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane) to obtain 7-hydroxytridecane-1,13-diylbis (2-hexyldecanoate) as a colorless oil.
  • 4-Nitrophenyl chloroformate was added to a mixture of 7-hydroxytridecane-1,13-diylbis (2-hexyldecanoate), triethylamine and tetrahydrofuran, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol-ethyl acetate) and silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane, NH silica gel) to make a colorless oil 7-(((2-((2- (2- (). Diethylamino) ethyl) (ethyl) amino) ethoxy) carbonyl) oxy) tridecane-1,13-diylbis (2-hexyldecanoate) was obtained.
  • Tetraisopropyl orthotitanium was added to a mixture of ethyl 10-oxoicosanoic acid and 2-butyloctane-1-ol, and the mixture was stirred at 110 ° C. for 17 hours.
  • Water and ethyl acetate were added to the reaction mixture, the organic layer was separated, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane) to obtain 2-butyloctyl 10-oxoicosanoic acid as a pale yellow solid.
  • 4-Nitrophenyl chloroformate was added to a mixture of 2-butyloctyl 10-hydroxyicosanoate, triethylamine and tetrahydrofuran, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Water and ethyl acetate were added to the reaction mixture, the organic layer was separated, washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane) to obtain 2-butyloctyl 10- (((4-nitrophenoxy) carbonyl) oxy) icosanoate as a colorless oil.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol-ethyl acetate) and silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane, NH silica gel), and the colorless oil 2-butyloctyl 12-decyl-3-ethyl- 6-Isopropyl-10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-oate was obtained.
  • Tetraisopropyl orthotitanium was added to a mixture of methyl 10-oxohexadecane and 2-butyloctane-1-ol, and the mixture was stirred at 110 ° C. for 1 hour. Water was added to the reaction mixture, the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes, and then purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane) to obtain 2-butyloctyl 10-oxohexadecanoate as a colorless oil.
  • 4-Nitrophenyl chloroformate was added to a mixture of 2-butyloctyl 10-hydroxyhexadecanoate, triethylamine and tetrahydrofuran, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. Water and ethyl acetate were added to the reaction mixture, the organic layer was separated, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane) to obtain 2-butyloctyl 10- (((4-nitrophenoxy) carbonyl) oxy) hexadecane acid as a colorless oil.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol-ethyl acetate) and silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane, NH silica gel), and the colorless oil 2-butyloctyl 3-ethyl-12-hexyl- 6- (2-Hydroxyethyl) -10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-oate was obtained.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol-ethyl acetate) and silica gel column chromatography (ethyl acetate-hexane, NH silica gel), and the colorless oil 2-hexyldecyl 3-ethyl-12-hexyl- 6-Isopropyl-10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-oate was obtained.
  • the HBV gene expression-suppressing sequences represented by the following sequences A and B were synthesized as described above.
  • P It is a linker indicated by It was introduced into the oligomer using L-proline diamide amidite shown in.
  • the underlined part is a gene expression-suppressing sequence.
  • Reference Examples 101 to 103 include 7-(((2-((2- (diethylamino) ethyl) (ethyl) amino) ethoxy) carbonyl) oxy) tridecane-1,13-diylbis (2-) produced in Production Example 1. Hexyldecanoate), or 2-butyloctyl-12-decyl-3-ethyl-6-isopropyl-10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-oate prepared in Production Example 2. Used as a cationic lipid. In Comparative Example 101, a lipid having the following structure (Comparative Compound A) was synthesized by the method described in Patent Document 4 and used as a cationic lipid.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • product name COATSOME MC-8080; NOF Corporation
  • cholesterol product name: Cholesterol HP; Nippon Seika Co., Ltd.
  • DMG-PEG2000 product name: SUNBRIGHT (R) GM-020; NOF corporation
  • Comparative Examples 101 and 102 Luc2 siRNA having the sequence described in Biomacromolecules 2013; 14, 3903-3915 was used, and in Comparative Example 103 and Reference Examples 101 to 103, the single-stranded nucleic acid of sequence B prepared in Production Example 5 (hereinafter referred to as “1”). , SiRNA01) were dissolved in 1 mL of sterile water and diluted with 10 mmol / L acetate buffer of pH 4 so that the nucleic acid concentration became 19.7 ⁇ mol / L to obtain an aqueous phase. Subsequently, the mixture is mixed with a micromixer (see Patent No.
  • the particle size of the lipid particles containing siRNA01 was measured for the lipid particle dispersion using the particle size measurement system ELS-Z2 (Otsuka Electronics Co., Ltd.) as the undiluted solution.
  • ⁇ Evaluation of siRNA inclusion rate> (Quantitative total nucleic acid concentration) To 60 ⁇ L of lipid particles holding nucleic acid, 30 ⁇ L of 3 mol / L sodium acetate aqueous solution and 9 ⁇ L of glycogen were added, and then 1.5 mL of ethanol was added to dissolve the lipid and precipitate only the nucleic acid. Then, centrifugation was performed to remove the supernatant. After air-drying for 15 minutes or more, water was added to redissolve the nucleic acid, and the concentration was measured using Nanodrop NF1000 (Thermo Fisher Scientific) to quantify the total nucleic acid concentration.
  • Nanodrop NF1000 Thermo Fisher Scientific
  • Quantum-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) was used and quantified according to the protocol.
  • the 20 ⁇ TE buffer included in the above kit was diluted with water to obtain a 1 ⁇ TE buffer.
  • TE represents Tris / EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid).
  • the lipid particle dispersion liquid holding the nucleic acid was diluted 10000 times with 1 ⁇ TE buffer.
  • a RiboGreen reagent (a reagent contained in the above-mentioned Quanti-iT Ribogreen RNA Assay Kit) diluted 2000-fold with a 1 ⁇ TE buffer. was added to the sample, and the nucleic acid concentration in the external aqueous phase was quantified by measuring fluorescence (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 535 nm) using a plate reader Infinit EF200 (TECAN).
  • nucleic acid inclusion rate (total nucleic acid concentration-nucleic acid concentration in the outer aqueous phase) ⁇ total nucleic acid concentration x 100 The results are shown in Table 2.
  • the anti-HBV assay test in PXB cells was performed using the nucleic acid-encapsulating lipid particle dispersion of the present invention as follows.
  • Anti-HBV assay in PXB-cells Anti-HBV activity was evaluated using fresh human hepatocytes (PXB-cells, manufactured by Phoenix Bio) collected from PXB mice (human hepatocyte chimeric mice) by the following procedure. The following was used as the medium.
  • DMEM (manufactured by Sigma) + 0.25 ⁇ g / mL insulin (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma-Aldrich) + 20 mmol / L HEPES (manufactured by Sigma-Aldrich) + 15 ⁇ g / mL L-proline (Sigma-Aldrich) + 50 nmol / L Dexametazone (Sigma-Aldrich) + 5 ng / mL EGF (Peprotech) + 0.1 mmol / L Ascorbic acid diphosphate (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) + 10% FBS + 2% DMSO Further, drugs prepared with D-PBS (-) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration 20 times the test concentration were added to the above medium to prepare test solutions having various concentrations of each drug.
  • the culture supernatant was removed, the above medium was added to a plate (100 ⁇ L / well), and the mixture was incubated in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 5 days. Medium exchange was also performed for the non-drug-added control.
  • the culture supernatant 22 days after infection was collected, the above medium was added to a plate (100 ⁇ L / well), and the cells were incubated in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 5 days. Medium exchange was also performed for the non-drug-added control.
  • the culture supernatant 27 days after infection was collected.
  • HBsAg in the collected culture supernatants on the 22nd and 27th days after infection was absolutely quantified using Lumipulse (registered trademark) HBsAg-HQ (manufactured by Fujirebio).
  • HBsAg-HQ manufactured by Fujirebio
  • the concentration was plotted logarithmically and the relative value was plotted as a real number, and the IC 50 of the drug was calculated using the FORECAST function (first-order regression method) of Microsoft Office Excel 2007.
  • the results are shown in Table 3 and FIG. In FIG. 1, the cell viability 27 days after infection was shown as a relative value to the drug-free well. The mean and standard deviation of 3 wells are shown.
  • the single-stranded nucleic acid of Sequence B used in Reference Examples 101 to 103 is similar in structure to the single-stranded nucleic acid of Sequence A, and has a better effect than Comparative Examples 101 and 102 in the above-mentioned test. Was obtained.
  • Reference Example 201 includes the 7-(((2-((2- (diethylamino) ethyl) (ethyl) amino) ethoxy) carbonyl) oxy) tridecane-1,13-diylbis (2-hexyldeca) produced in Production Example 1. Noate), and in Reference Example 202, 2-butyloctyl 12-decyl-3-ethyl-6-isopropyl-10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-produced in Production Example 2 Oate was used as a cationic lipid.
  • a lipid having the following structure was synthesized by the method described in Patent Document 4 and used as a cationic lipid.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • product name COATSOME MC-8080; NOF Corporation
  • cholesterol product name: Cholesterol HP; Nippon Seika Co., Ltd.
  • DMG-PEG2000 product name: SUNBRIGHT (R) GM-020; NOF corporation
  • a micromixer see Patent No. 5288254
  • Table 5 shows the results of preparing the formulations used in Comparative Examples 201 and 202 and Reference Examples 201 and 202 twice by the above method and measuring the particle size and the siRNA inclusion ratio.
  • the first administration day was set to day 0, and blood was collected from the orbital venous plexus on day-2, day6, day13 and day20 using sevoflurane anesthesia. Furthermore, the final administration was performed on day 25, and 30 minutes after the administration, the abdomen was opened under sevoflurane anesthesia, and blood was collected from the inferior vena cava. Serum was separated from the collected blood and purified with the QIAamp® DNA Blood Mini Kit (manufactured by QIAGEN). The amount of HBV-DNA in the obtained solution was absolutely quantified by the real-time PCR method.
  • the single-stranded nucleic acid of Sequence B used in Reference Examples 201 and 202 is similar in structure to the single-stranded nucleic acid of Sequence A, and has a better medicinal effect than Comparative Examples 201 and 202. ..
  • Example 301 2-hexyldecyl 3-ethyl-12-hexyl-6-isopropyl-10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21-oate prepared in Production Example 4 and Example 302. 2-Butyloctyl 3-ethyl-12-hexyl-6- (2- (octanoyloxy) ethyl) -10-oxo-9,11-dioxa-3,6-diazahenicosan-21 produced in Production Example 3 -Oate was used as a cationic lipid.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • product name COATSOME MC-8080; NOF Corporation
  • cholesterol product name: Cholesterol HP; Nippon Seika Co., Ltd.
  • DMG-PEG2000 product name: SUNBRIGHT (R) GM-020; NOF corporation
  • siRNA02 single-stranded nucleic acid of Sequence A (hereinafter referred to as siRNA02) prepared in Production Example 5 was dissolved in 1 mL of sterile water, and Example 301 was prepared with 50 mmol / L citrate buffer of pH 4, and Production Example 302 was prepared. An aqueous phase was obtained by diluting each with a pH 4 10 mmol / L acetate buffer so that the nucleic acid concentration was 19.7 ⁇ mol / L. Subsequently, the mixture is mixed with a micromixer (see Patent No.
  • Table 8 shows the results of preparing the preparations used in Examples 301 and 302 three times by the above method and measuring the particle size and the siRNA inclusion ratio.
  • Example 301 and Example 302 were intravenously administered at 1 mg / kg twice a week for 6 weeks, respectively.
  • the remaining 1 group was intravenously administered with phosphate buffer twice a week for 6 weeks as a control group.
  • the first administration day was set to day 0, and blood was collected from the orbital venous plexus on day-1, day6, day14, day20, day27 and day34 using sevoflurane anesthesia.
  • the final administration was performed on day 37, and 30 minutes after the administration, the abdomen was opened under sevoflurane anesthesia, and blood was collected from the inferior vena cava. Serum was separated from the collected blood and purified with the QIAamp® DNA Blood Mini Kit (manufactured by QIAGEN). The amount of HBV-DNA in the obtained solution was absolutely quantified by the real-time PCR method. In addition, the amount of HBsAg in serum was absolutely quantified by chemiluminescent enzyme immunoassay using Lumipulse (registered trademark) HBsAg-HQ (manufactured by Fujirebio). The results are shown in Table 9.
  • the administration of the pharmaceutical product of the present invention reduced HBV-DNA and HBsAg in serum, and the drug efficacy was confirmed in human hepatocyte chimeric mice.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can efficiently deliver artificial siRNA and has an excellent translation-suppressing effect. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a pharmaceutical product.

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Abstract

本発明の課題はＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡと、核酸送達に優れた脂質とを組み合わせた医薬組成物、及び処置剤を提供することである。本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡ、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む医薬組成物であって、人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、医薬組成物が提供される。 （配列Ａ） 5'- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG -3' 式中、Pは所定のリンカーを示す。 式中、Ｘ、Ｒ２～Ｒ１２、ａ、ｂ、ｃ及びｄは本明細書に定義の意味を有する。

Description

医薬組成物及び処置剤
　本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子の発現を効果的に抑制する核酸分子と脂質を含む医薬組成物、及び処置剤に関する。
　Ｂ型肝炎ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスと共に慢性肝炎の主な原因となっている。慢性Ｂ型肝炎の現在の治療法には、インターフェロン（ＩＦＮ）療法と核酸アナログ製剤療法がある。ＩＦＮ療法の奏効率は３０～４０％に留まり、強い副作用も伴う。一方の核酸アナログ製剤は服用により肝炎が沈静化し肝機能が改善するが、長期の服用を余儀なくされ、等薬中止によりほとんどの症例で肝炎が再燃する。したがって、現在の治療法とは異なる新たな革新的治療薬の開発が求められている（非特許文献１、２）。
　慢性Ｂ型肝炎治療約候補の作用機序が、非特許文献３にまとめられている。中でも、ｓｉＲＮＡによる全ウイルスタンパク質の翻訳抑制は、ＨＢＶウイルスとして機能を完全に遮断することが期待できる。
　核酸医薬品は従来の低分子医薬品や抗体医薬品では狙えないｍＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の分子を創薬ターゲットとすることが可能であり、次世代の医薬品として高い期待が寄せられている。
　一方、核酸を細胞に送達できる技術が開発されてきたことから、核酸医薬品の開発が活発に行われている。核酸の送達技術の一つとして、核酸を粒子（リポソームまたは脂質粒子）に内包した核酸含有粒子を投与する方法が知られている。この技術においては、アミノ基などを有し低ｐＨでカチオンとなる脂質を用いて核酸含有粒子を調製しているが、粒子に適切な電荷を付与することにより核酸の送達を実現している。例えば、脂質粒子に含有させる化合物として、特許文献１には、脂肪族基とアミノ基とを繋ぐ連結基としてエステル基、アセタール基などを有する化合物が開示されている。特許文献２には、脂肪族基とアミノ基とを繋ぐ連結基としてビニルオキシ基やアミド基、オキシム基などを有する化合物が開示されている。なお、本明細書中では、アミノ基などを有し低ｐＨでカチオンとなる脂質のことを、カチオン性脂質と呼ぶことがある。
　さらに核酸含有粒子を製造する際に使用する脂質化合物の種類及び組成比を変更することについても検討されている。特許文献３には、（ａ）核酸；（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質；（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質；及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する複合化脂質、を含む核酸－脂質粒子が記載されている。特許文献４には、４ ０～６５％の特定の構造のカチオン性脂質、５～１０％の中性脂質、２５～４０％のステロール、及び０．５～１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む脂質製剤が記載されている。
国際公開公報２０１０／０５４４０１号パンフレット 国際公開公報２０１０／０５４４０５号パンフレット 国際公開公報２００９／１２７０６０号パンフレット 国際公開公報２０１０／１４４７４０号パンフレット
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　＆　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２０１６；１２（１１）６７９－６８９ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２０１６；６４，Ｓ４１-Ｓ４８ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ　Ｍｅｄ．２０１５；５（４）ａ０２１５０１
　Ｂ型肝炎の治療のために、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖を強力に抑制することのできる核酸医薬が望まれている。
　一方、アミノ基を有する脂質による核酸の送達技術はまだ十分ではなく、核酸をさらに効率的に送達できる技術が求められている。
　そこで、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡと、核酸送達に優れた脂質とを組み合わせた医薬組成物であって、人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる、核酸分子を含む医薬組成物、及び処置剤の提供を目的とする。
（配列Ａ）5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG -3’
　即ち、課題を解決するための手段は以下の通りである。
［１］　Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡ、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む医薬組成物であって、人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、医薬組成物。
（配列Ａ）
5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG -3’
式中、Pは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 式中、Ｘは－ＮＲ１－または－Ｏ－を示し、
Ｒ１は、水素原子、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ２１－Ｌ１－Ｒ２２－で示される基を示し、Ｒ２１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ１は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 を示し、Ｒ２２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ３１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 を示し、Ｒ３２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
Ｒ４およびＲ５、Ｒ１０およびＲ５、Ｒ５およびＲ１２、Ｒ４およびＲ６、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７、Ｒ６およびＲ１０、Ｒ１２およびＲ７、並びにＲ７およびＲ８の何れか一組以上は互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい４～７員環を形成してもよく、
置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のヘテロアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
置換もしくは無置換のアリール基、および置換もしくは無置換のヘテロアリール基上の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に０～３の整数を示し、但し、ａ＋ｂは１以上であり、ｃ＋ｄは１以上である。
［２］　ポリエチレングリコール構造を有する脂質が、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］　全脂質に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有量が４０～７０モル％である、［１］又は［２］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［４］　全脂質に対するコレステロールの含有量が２５～６０モル％である、［１］～［３］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［５］　全脂質に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有量が０．５～１０モル％である、［１］～［４］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［６］　全脂質に対するＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡの含有量が１～２５質量％である、［１］～［５］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［７］　［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物を含む、Ｂ型肝炎の処置剤。
［８］　［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物を含む、肝硬変または肝臓がんの処置剤。
［Ａ］　［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、Ｂ型肝炎を処置する方法。
［Ｂ］　［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、肝硬変または肝臓がんを処置する方法。
［Ｃ］　Ｂ型肝炎の処置において使用するための、［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［Ｄ］　肝硬変または肝臓がんの処置において使用するための、［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物。
［Ｅ］　Ｂ型肝炎の処置剤の製造のための、［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物の使用。
［Ｆ］　肝硬変または肝臓がんの処置剤の製造のための、［１］～［６］の何れか一つに記載の医薬組成物の使用。
　本発明の医薬組成物を用いることにより、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制でき、Ｂ型肝炎及び関連疾患に対し治療効果を効率的に発揮することができる。
図１は、ＰＸＢ細胞での抗ＨＢＶアッセイ試験の感染27日後の薬剤非添加ウェルに対するcell viabilityの相対値を示す。
　本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡ（以下、人工ｓｉＲＮＡと称することがある。）、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、非イオン性脂質、及び非イオン性親水性高分子構造を有する脂質を含み、人工ｓｉＲＮＡが、配列Ａで表される塩基配列からなる、核酸分子を含む。
　本発明の医薬組成物は、脂質粒子を含むことが好ましい。脂質粒子は、脂質に分類される成分から構成される粒子を意味する。
　脂質粒子の構造としては、脂質が凝集している脂質凝集体、ミセル、リポソームから選択されるいずれかの構造が考えられるが、これに限定されない。
　本発明の医薬組成物が脂質粒子を含む場合、脂質粒子を構成する脂質は、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、非イオン性脂質、及び非イオン性親水性高分子構造を有する脂質を含むことが好ましい。また、人工ｓｉＲＮＡは脂質粒子に内包されることが好ましい。
　脂質粒子の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）及び内水層を持つ構造であるか、粒子内部に電子密度が高いコアを持ち、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有しているか、などが確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子についての脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。
　脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは１０～１０００ｎｍであり、より好ましくは３０～５００ｎｍであり、さらに好ましくは５０～２５０ｎｍである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法（例えば、動的光散乱法、レーザー回折法など）により測定することができる。
　本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡを含む。人工ｓｉＲＮＡは、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子を含む。
配列Ａ：
5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU（配列番号１）-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG（配列番号２） -3’
式中、Pは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 を示す。
　配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子は、ホスホロアミダイト法に基づき、市販の核酸合成機により合成することができる。ＲＮＡアミダイトとしては、例えば、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いることができ、アミダイトの脱保護は、定法により行うことができる。Pで示されるリンカーは、下記のＬ－プロリンジアミドアミダイトを用いてオリゴマーに導入することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
　本発明の医薬組成物において、全脂質に対する人工ｓｉＲＮＡの含有量は、１質量％～２５質量％であることが好ましく、１．５質量％～２０質量％であることがより好ましく、２質量％～１５質量％であることがさらに好ましい。
　本発明の医薬組成物は、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式中、Ｘは－ＮＲ１－または－Ｏ－を示し、
　Ｒ１は、水素原子、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ２１－Ｌ１－Ｒ２２－で示される基を示し、Ｒ２１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ１は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 を示し、Ｒ２２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
　Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ３１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 を示し、Ｒ３２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
　Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
　Ｒ４及びＲ５、Ｒ１０及びＲ５、Ｒ５及びＲ１２、Ｒ４及びＲ６、Ｒ５及びＲ６、Ｒ６及びＲ７、Ｒ６及びＲ１０、Ｒ１２及びＲ７、並びにＲ７及びＲ８の何れか一組以上は互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい４～７員環を形成してもよく、
　置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のヘテロアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
　置換もしくは無置換のアリール基、及び置換もしくは無置換のヘテロアリール基の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
　ａ、ｂ、ｃ、及びｄはそれぞれ独立に０～３の整数を示し、但し、ａ＋ｂは１以上であり、ｃ＋ｄは１以上である。
　Ｒ１における炭素数６～２４の炭化水素基、並びにＲ２及びＲ３における炭素数３～２４の炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であることが好ましく、アルキル基またはアルケニル基であることがより好ましい。炭素数６～２４のアルキル基及び炭素数３～２４のアルキル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルキル基は炭素数６～２０のアルキル基であることが好ましく、炭素数３～２４のアルキル基は、炭素数６～２０のアルキル基であることがより好ましい。具体的には、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、トリメチルドデシル基（好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基)、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、テトラメチルヘキサデシル基（好ましくは、３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基）、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基などが挙げられる。炭素数６～２４のアルケニル基及び炭素数３～２４のアルケニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルケニル基は炭素数６～２０のアルケニル基であることが好ましく、炭素数３～２４のアルケニル基は、炭素数６～２０のアルケニル基であることがより好ましい。具体的には、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、ドデカジエニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニル基）、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エニル基）、ヘプタデカジエニル基（好ましくは、（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカ－８，１１－ジエニル基）、オクタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニル基）、オクタデカジエニル基（好ましくは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル基）、ノナデセニル基、イコセニル基（好ましくは、（Ｚ）－イコサ－１１－エニル基）、イコサジエニル基（好ましくは、（１１，１４）－イコサ－１１，１４－ジエニル基）、などが挙げられる。炭素数６～２４のアルキニル基は炭素数６～２０のアルキニル基であることが好ましく、炭素数３～２４のアルキニル基は、炭素数６～２０のアルキニル基であることがより好ましい。具体的には、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基、ウンデシニル基、ドデシニル基、テトラデシニル基、ペンタデシニル基、ヘキサデシニル基、ヘプタデシニル基、オクタデシニル基などが挙げられる。上記のアルケニル基はいずれも二重結合を１つまたは２つ有することが好ましく、アルキニル基はいずれも三重結合を１つまたは２つ有することが好ましい。
　Ｒ２１及びＲ３１についての炭素数１～２４の炭化水素基としては、炭素数１０～２４のアルキル基、炭素数１０～２４のアルケニル基または炭素数１０～２４のアルキニル基であることが好ましい。炭素数１０～２４のアルキル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数１０～２４のアルキル基は炭素数１２～２４のアルキル基であることが好ましい。具体的には、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、トリメチルドデシル基（好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基)、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、テトラメチルヘキサデシル基（好ましくは、３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基）、ヘプタデシル基、オクタデシル基、２－ブチルヘキシル基、２－ブチルオクチル基、１－ペンチルヘキシル基、２－ペンチルヘプチル基、３－ペンチルオクチル基、１－ヘキシルヘプチル基、１－ヘキシルノニル基、２－ヘキシルオクチル基、２－ヘキシルデシル基、３－ヘキシルノニル基、１－ヘプチルオクチル基、２－ヘプチルノニル基、２－ヘプチルウンデシル基、３－ヘプチルデシル基、１－オクチルノニル基、２－オクチルデシル基、２－オクチルドデシル基、３－オクチルウンデシル基、２－ノニルウンデシル基、３－ノニルドデシル基、２－デシルドデシル基、２－デシルテトラデシル基、３－デシルトリデシル基、２－（４，４－ジメチルペンタン－２－イル）－５，７，７－トリメチルオクチル基などが挙げられる。炭素数１０～２４のアルケニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。具体的には、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、ドデカジエニル基、トリデセニル基(好ましくは、（Ｚ）－トリデカ－８－エニル基)、テトラデセニル基（好ましくは、テトラデカ－９－エニル基）、ペンタデセニル基(好ましくは、（Ｚ）－ペンタデカ－８－エニル基)、ヘキサデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニル基）、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エニル基）、ヘプタデカジエニル基（好ましくは、（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカ－８，１１－ジエニル基）、オクタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニル基）、オクタデカジエニル基（好ましくは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル基）などが挙げられる。炭素数１０～２４のアルキニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。具体的には、デシニル基、ウンデシニル基、ドデシニル基、テトラデシニル基、ペンタデシニル基、ヘキサデシニル基、ヘプタデシニル基、オクタデシニル基などが挙げられる。上記のアルケニル基はいずれも二重結合を１つまたは２つ有することが好ましく、アルキニル基はいずれも三重結合を１つまたは２つ有することが好ましい。
　Ｒ２２及びＲ３２についての、二価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基としては、炭素数１～１８のアルキレン基または炭素数２～１８のアルケニレン基であることが好ましい。炭素数１～１８のアルキレン基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は１～１２が好ましく、１～１０がより好ましく、２～１０がさらに好ましい。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基、ウンデカメチレン基、ドデカメチレン基などが挙げられる。炭素数２～１８のアルケニレン基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は１～１２が好ましく、２～１０がより好ましい。
　Ｌ１の好ましい範囲としては、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－が好ましく、－Ｏ（ＣＯ）－または－（ＣＯ）Ｏ－がより好ましい。
　Ｌ２の好ましい範囲としては、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－が好ましく、－Ｏ（ＣＯ）－または－（ＣＯ）Ｏ－がより好ましい。
　Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２についての、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基の炭素数１～１８のアルキル基は、直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は１～１２が好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。アルキル基が置換基を有する場合の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基が好ましく、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基がより好ましい。
　Ｒ５、Ｒ７、及びＲ８についての、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基の炭素数１～１８のアルキル基は、直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は１～１２が好ましく、１～８がより好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。アルキル基が置換基を有する場合の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基が好ましく、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基がより好ましい。
　Ｏ原子を含んでいてもよい４～７員環としてはアゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、モルホリン環、アゼパン環が挙げられ、６員環であることが好ましく、ピペリジン環、モルホリン環が好ましい。
　Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２について、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基における置換基が置換もしくは無置換のアリール基である場合におけるアリール基としては、炭素数６～２２が好ましく、６～１８がより好ましく、６～１０がさらに好ましい。具体的には、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基などが挙げられる。アリール基上の置換基としては、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基が好ましく、ヒドロキシル基またはカルボキシル基がより好ましい。置換アリール基としては、具体的には、ヒドロキシフェニル基、カルボキシフェニル基、などが挙げられる。
　Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２について、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基における置換基が置換もしくは無置換のヘテロアリール基である場合におけるヘテロアリール基としては、炭素数１～１２が好ましく、１～６がより好ましい。具体的には、ピリジル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基などが挙げられる。ヘテロアリール基上の置換基としては、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基が好ましく、ヒドロキシル基またはカルボキシル基がより好ましい。置換もしくは無置換のヘテロアリール基としては、具体的には、ヒドロキシピリジル基、カルボキシピリジル基、ピリドニル基、などが挙げられる。
　Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６についての炭素数１～１８の炭化水素基としては、炭素数１～１８のアルキル基、炭素数２～１８のアルケニル基または炭素数２～１８のアルキニル基であることが好ましく、炭素数１～１８のアルキル基または炭素数２～１８のアルケニル基であることがより好ましい。炭素数１～１８のアルキル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は３～１８が好ましく、５～１８がより好ましい。具体的には、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、トリメチルドデシル基（好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基)、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。炭素数２～１８のアルケニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は３～１８が好ましく、５～１８がより好ましい。具体的には、アリル基、プレニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基(好ましくは、（Ｚ）－２－ノネニル基または、（Ｅ）－２－ノネニル基)、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、ドデカジエニル基、トリデセニル基(好ましくは、（Ｚ）－トリデカ－８－エニル基)、テトラデセニル基（好ましくは、テトラデカ－９－エニル基）、ペンタデセニル基(好ましくは、（Ｚ）－ペンタデカ－８－エニル基)、ヘキサデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニル基）、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エニル基）、ヘプタデカジエニル基（好ましくは、（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカ－８，１１－ジエニル基）、オクタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニル基）、オクタデカジエニル基（好ましくは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル基）などが挙げられる。炭素数２～１８のアルキニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数は３～１８が好ましく、５～１８がより好まししい。具体的には、プロパルギル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基、ウンデシニル基、ドデシニル基、テトラデシニル基、ペンタデシニル基、ヘキサデシニル基、ヘプタデシニル基、オクタデシニル基などが挙げられる。
　Ｘが－ＮＲ１－を示すとき、Ｒ１が炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ２１－Ｌ１－Ｒ２２－で示される基を示すことが好ましい。このとき、Ｒ２及びＲ３の一方が、水素原子であり；Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示すことが好ましい。
　Ｘが－Ｏ－を示すとき、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示すことが好ましい。
　Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は水素原子であることが好ましい。
　Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１８のアルキル基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基、アリール基で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基であることが好ましく、アルキル基であるときＲ４、Ｒ６、Ｒ１０及びＲ１２と互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい環を形成していてもよい。なかでも、炭素数１～１８のアルキル基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基、アリール基で置換されてもよい炭素数１～１２のアルキル基、ヒドロキシル基で置換されてもよい炭素数１～８のアルキル基であることが好ましく、炭素数１～１８のアルキル基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基であることがより好ましい。
　Ｒ７及びＲ８がそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１８の炭化水素基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基、アリール基で置換されてもよい炭素数１～８のアルキル基、またはヒドロキシル基で置換されてもよい炭素数１～８のアルキル基であるか、Ｒ７及びＲ８が互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい４～７員環を形成していることが好ましい。
　Ｒ５とＲ７またはＲ８とは、互いに連結することはなく、環を形成することはない。
　ａ＋ｂは１または２であることが好ましく、１であることがより好ましい。ｃ＋ｄは１または２であることが好ましく、１であることがより好ましい。
　式（１）で表される化合物は、下記式（１－１）で表される化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　Ｒ２４は、水素原子、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ２１－Ｌ１－Ｒ２２－で示される基を示し、Ｒ２１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ１は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 を示し、Ｒ２２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示す。
　Ｒ２５は、水素原子、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ３１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 を示し、Ｒ３２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示す。
　Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、及びＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
　Ｒ４及びＲ５、Ｒ１０及びＲ５、Ｒ５及びＲ１２、 Ｒ４及びＲ６、Ｒ５及びＲ６、Ｒ６及びＲ７、Ｒ６及びＲ１０、Ｒ１２及びＲ７、 並びにＲ７及びＲ８の何れか一組以上は互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい４～７員環を形成してもよい。ただし、好ましきは、Ｒ５とＲ７またはＲ８とは、互いに連結することはなく、環を形成することはない。
　置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のヘテロアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、置換もしくは無置換のアリール基、及び置換もしくは無置換のヘテロアリール基上の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（１－１）におけるＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、及びＲ１２の定義及び好ましい範囲は式（１）のものと同じである。
　式（１－１）のＲ２４は炭素数６～２４のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましい。炭素数６～２４のアルキル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルキル基は炭素数８～２０のアルキル基であることが好ましい。具体的には、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、トリメチルドデシル基（好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基)、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、テトラメチルヘキサデシル基（好ましくは、３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基）、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基などが挙げられる。炭素数６～２４のアルケニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルケニル基は炭素数８～２０のアルケニル基であることが好ましい。具体的には、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、ドデカジエニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニル基）、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エニル基）、ヘプタデカジエニル基（好ましくは、（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカ－８，１１－ジエニル基）、オクタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニル基）、オクタデカジエニル基（好ましくは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル基）、ノナデセニル基、イコセニル基（好ましくは、（Ｚ）－イコサ－１１－エニル基）、イコサジエニル基（好ましくは、（１１，１４）－イコサ－１１，１４－ジエニル基）、などが挙げられる。
　上記のアルケニル基はいずれも二重結合を１つまたは２つ有することが好ましい。
　式（１－１）のＲ２５は炭素数６～２４のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましい。炭素数６～２４のアルキル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルキル基は炭素数７～２０のアルキル基であることが好ましい。具体的には、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、トリメチルドデシル基（好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基)、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、テトラメチルヘキサデシル基（好ましくは、３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基）、ヘプタデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。炭素数６～２４のアルケニル基は直鎖でも分岐であってもよく、鎖状でも環状であってもよい。炭素数６～２４のアルケニル基は炭素数８～２０のアルケニル基であることが好ましい。具体的には、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、ドデカジエニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘキサデカ－９－エニル基）、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エニル基）、ヘプタデカジエニル基（好ましくは、（８Ｚ，１１Ｚ）－ヘプタデカ－８，１１－ジエニル基）、オクタデセニル基（好ましくは、（Ｚ）－オクタデカ－９－エニル基）、オクタデカジエニル基（好ましくは、（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル基）、ノナデセニル基、イコセニル基（好ましくは、（Ｚ）－イコサ－１１－エニル基）、イコサジエニル基（好ましくは、（１１，１４）－イコサ－１１，１４－ジエニル基）、などが挙げられる。
　上記のアルケニル基はいずれも二重結合を１つまたは２つ有することが好ましい。
　好ましい態様においては、
Ｘが－Ｏ－を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３１、Ｌ２    、及びＲ３２の定義は、式（１）における定義と同義であり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基、及び置換もしくは無置換のアリール基、及び置換もしくは無置換のヘテロアリール基上の置換基の定義は、式（１）における定義と同義であり、
ａ＋ｂは１であり、ｃ＋ｄは１または２である。
　さらに好ましい態様においては、式（１）で示される化合物が、下記式（２）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、
Ｒ３１は、炭素数１～２４の炭化水素基を示し、
Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 を示し、
Ｒ３２は、２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
Ｒ５は、水素原子、または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または      置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のヘテロアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、
Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、置換もしくは無置換のアリール基、及び置換もしくは無置換のヘテロアリール基上の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、
Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
ｅは２または３を示す。
　Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８の定義は式（１）のものと同じである。
　式（２）において、好ましくは、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ５についての、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、置換もしくは無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、置換もしくは無置換のアリール基上の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５及びＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３であり、Ｒ４２及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、R２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、または炭素数３～２４の炭化水素基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、好ましくは、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立に、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数３～２４の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または 炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、無置換のアリール基、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または 炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、ｅは２を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数３～５の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数３～５の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、ｅは２を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または置換された炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換された炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示す。
　式（２）において、さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３の一方が、Ｒ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ２及びＲ３の他方が、炭素数６の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）－、または－（ＣＯ）Ｏ－を示し、Ｒ５は、水素原子、または置換された炭素数１～１８のアルキル基を示し、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、または炭素数１～１８のアルキル基を示し、置換された炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、または－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３で示される基であり、Ｒ４２、及びＲ４３はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、ｅは２を示す。
　式（１）で表される化合物は塩を形成していてもよい。
　塩基性基における塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸及び硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
　酸性基における塩としては、たとえば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミン及びＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
　上記した塩の中で、好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられる。
　式（１）で表される化合物の製造法について説明する。
　式（１）で表される化合物は、公知の方法を組み合わせることにより製造することができるが、例えば、以下に示す製造法に従い、製造することができる。
［製造法１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 「式中、Ｒａ及びＲｂは、脱離基を；Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは、アミノ保護基またはイミノ保護基を；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、フルオロ基、ブロモ基、トリクロロメトキシ基、４－ニトロ－フェノキシ基、２，４－ジニトロフェノキシ基、２，４，６－トリクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、３，５－ジオキソ－４－メチル－１，２，４－オキサジアゾリジル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル基などが挙げられる。アミノ保護基またはイミノ保護基として、例えば、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンゼンスルホニル基、ベンジル基などが挙げられる。
（１－１）
　式［３］の化合物として、たとえば、クロロギ酸４－ニトロフェニル、１，１'－カルボニルジイミダゾール、トリホスゲン及びホスゲンなどが知られている。
　式［４］の化合物は、塩基の存在下、式［２］の化合物を式［３］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類及び芳香族炭化水素類が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類が挙げられ、テトラヒドロフランがより好ましい。　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［２］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。塩基は有機塩基が好ましく、具体的には、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－メチルモルホリン、ピリジン、またはＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。
　塩基の使用量は、式［２］の化合物に対して、１～５０倍モル、好ましくは、１～１０倍モルであればよい。
　式［３］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［２］の化合物に対して、０．３～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（１－２）
　式［５］の化合物として、たとえば、（９Ｚ，１２Ｚ）－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）アミン及びジヘキサデシルアミンなどが知られている。
　式［６］の化合物は、塩基の存在下、式［４］の化合物を式［５］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類及び芳香族炭化水素類が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類が挙げられ、テトラヒドロフランがより好ましい。　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［４］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。塩基は有機塩基が好ましく、具体的には、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－メチルモルホリン、ピリジン、またはＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。
　塩基の使用量は、式［４］の化合物に対して、１～５０倍モル、好ましくは、１～１０倍モルであればよい。
　式［５］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［４］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（１－３）
　式［２Ａ］の化合物として、たとえば、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシエチル）カルバメート及びｔｅｒｔ－ブチル（２－（（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エチル）カルバメートなどが知られている。
　式［６Ａ］の化合物は、塩基の存在下、式［２Ａ］の化合物を式［３］の化合物と反応させた後、塩基の存在下、式［４Ａ］の化合物を式［５］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（１－１）及び（１－２）に準じて行えばよい。
（１－４）
　式［６］の化合物は、式［６Ａ］の化合物を脱保護することにより製造することができる。
　この反応は、たとえば、Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）第４版、第６９６～９２６頁、２００７年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＩＮＣ．）に記載の方法に準じて行えばよい。
［製造法２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 「式中、Ｒａ及びＲｂは、脱離基を；Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは、アミノ保護基またはイミノ保護基を；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、フルオロ基、ブロモ基、トリクロロメトキシ基、４－ニトロ－フェノキシ基、２，４－ジニトロフェノキシ基、２，４，６－トリクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、３，５－ジオキソ－４－メチル－１，２，４－オキサジアゾリジル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル基などが挙げられる。アミノ保護基またはイミノ保護基として、例えば、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、２－ニトロベンゼンスルホニル基、ベンジル基などが挙げられる。
（２－１）
　式［３］の化合物として、たとえば、クロロギ酸４－ニトロフェニル、１，１'－カルボニルジイミダゾール、トリホスゲン及びホスゲンなどが知られている。
　式［８］の化合物は、塩基の存在下、式［７］の化合物を式［３］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（１－１）に準じて行えばよい。
（２－２）
　式［９］の化合物は、塩基の存在下、式［８］の化合物を式［２］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類及び芳香族炭化水素類が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類が挙げられ、テトラヒドロフランがより好ましい。　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［８］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。塩基は有機塩基が好ましく、具体的には、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－メチルモルホリン、ピリジン、またはＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。
　塩基の使用量は、式［８］の化合物に対して、１～５０倍モル、好ましくは、１～１０倍モルであればよい。
　式［２］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［８］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（２－３）
　式［２Ａ］の化合物は、たとえば、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシエチル）カルバメート及びｔｅｒｔ－ブチル（２－（（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アミノ）エチル）カルバメートなどが知られている。
　式［９］の化合物は、塩基の存在下、式［８］の化合物を式［２Ａ］の化合物と反応させた後、塩基の存在下、式［９Ａ］の化合物を脱保護することにより製造することができる。
　この反応は、製造法（２－２）及び（１－４）に準じて行えばよい。
［製造法３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 「式中、Ｒａ、Ｒb及びＲgは、脱離基を；Ｒfは、炭素数１～１８のアルキル基を；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ４２は、上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、フルオロ基、ブロモ基、トリクロロメトキシ基、４－ニトロ－フェノキシ基、２，４－ジニトロフェノキシ基、２，４，６－トリクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、３，５－ジオキソ－４－メチル－１，２，４－オキサジアゾリジル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル基などが挙げられる。
（３－１）
　式［３］の化合物として、たとえば、クロロギ酸４－ニトロフェニル、１，１'－カルボニルジイミダゾール、トリホスゲン及びホスゲンなどが知られている。
　式［８］の化合物は、塩基の存在下、式［７］の化合物を式［３］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（１－１）に準じて行えばよい。
（３－２）
　式［２Ｂ］の化合物として、たとえば、２，２’－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）アザンジイル）ビス（エタン－１－オール）及び２，２’－（（３－（ジエチルアミノ）プロピル）アザンジイル）ビス（エタン－１－オール）などが知られている。
　式［９Ｂ］の化合物は、塩基の存在下、式［８］の化合物を式［２Ｂ」の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（２－２）に準じて行えばよい。
（３－３）
　式［１０Ａ］の化合物として、たとえば、ドデカン酸、デカン酸、ノナン酸及びオクタン酸などが知られている。
　式［９Ｃ］の化合物は、縮合剤または酸ハロゲン化物の存在下、塩基の存在下、式［９Ｂ］の化合物を式［１０Ａ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類及び芳香族炭化水素類が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類が挙げられ、テトラヒドロフランがより好ましい。　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［９Ｂ］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。塩基は有機塩基が好ましく、具体的には、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、４－メチルモルホリン、ピリジン、またはＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。
　塩基の使用量は、式［９Ｂ］の化合物に対して、１～５０倍モル、好ましくは、１～１０倍モルであればよい。
　この反応に使用される縮合剤としては、たとえば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのカルボジイミド類；カルボニルジイミダゾールなどのカルボニル類；ジフェニルホスホリルアジドなどの酸アジド類；ジエチルホスホリルシアニドなどの酸シアニド類；２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン；Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム＝ヘキサフルオロホスフェートならびにＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム＝ヘキサフルオロホスフェートなどが挙げられる。
　この反応に使用される酸ハロゲン化物としては、たとえば、塩化アセチル及びトリフルオロアセチルクロリドなどのカルボン酸ハロゲン化物類；塩化メタンスルホニル及び塩化トシルなどのスルホン酸ハロゲン化物類；クロロギ酸エチル及びクロロギ酸イソブチルなどのクロロギ酸エステル類などが挙げられる。
　式［１０Ａ］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［９Ｂ］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（３－４）
　式［１０Ｂ］の化合物として、たとえば、ドデカン酸クロリド、デカン酸クロリド、ノナン酸クロリド及びオクタン酸クロリドなどが知られている。
　式［９Ｃ］の化合物は、塩基の存在下、式［９Ｂ］の化合物を式［１０Ｂ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　式［１０Ｂ］の化合物は、式［１０Ａ］の化合物をチオニルクロリドまたはオキサリルクロリドなどと反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類及び芳香族炭化水素類が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類が挙げられ、テトラヒドロフランがより好ましい。　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［９Ｂ］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。
　塩基の使用量は、式［９Ｂ］の化合物に対して、１～５０倍モル、好ましくは、１～１０倍モルであればよい。
　式［１０Ｂ］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［２Ｂ］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
　次に本発明化合物の製造の原料である式［２］の化合物の合成について説明する。
［製造法４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 「式中、Ｒh及びＲiは、脱離基を；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、メタンスルホニル基、４－トルエンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、などが挙げられる。
（４－１）
　式［１２］の化合物として、たとえば、２－クロロ－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタン－１－アミン、４－（２－クロロエチル）モルホリン及び２－クロロ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエタン－１－アミン、２－ブロモ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエタン－１－アミン、３－クロロ－Ｎ，Ｎ－ジエチルエタン－１－アミンなどが知られている。
　式［２］の化合物は、塩基の存在下もしくは不存在下、式［１１］の化合物を式［１２］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、アルコール類、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類、芳香族炭化水素類及び水が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［１１］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。　塩基の使用量は、式［１１］の化合物に対して、１～１００００倍モル、好ましくは、１～５０００倍モルであればよい。
　式［１２］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［１１］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（４－２）
　式［１４］の化合物として、たとえば、２－ブロモエタン－１－オール及び３－ブロモプロパン－１－オールなどが知られている。
　式［２］の化合物は、塩基の存在下もしくは不存在下、式［１３］の化合物を式［１４］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（４－１）に準じて行えばよい。
［製造法５］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 「式中、Ｒｊは、脱離基を；Ｒｋは、炭素数１～１８のアルキル基を；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ４３は上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、メタンスルホニル基、４－トルエンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、などが挙げられる。
（５－１）
　式［１５Ａ］の化合物として、たとえば、ヘプチルアクリレートなどが知られている。
　式［２］の化合物は、塩基の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１５Ａ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、アルコール類、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類、芳香族炭化水素類及び水が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　好ましい溶媒としては、エーテル類またはニトリル類が挙げられ、テトラヒドロフランまたはアセトニトリルがより好ましい。
　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［２Ｃ］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる塩基としては、無機塩基または有機塩基が挙げられる。
　塩基の使用量は、式［２Ｃ］の化合物に対して、１～１００００倍モル、好ましくは、１～５０００倍モルであればよい。
　式［１５Ａ］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［１３］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（５－２）
　式［１５Ｂ］の化合物として、たとえば、３－クロロプロパン酸ヘプチルなどが知られている。
　式［２］の化合物は、塩基の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１５Ｂ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（４－１）に準じて行えばよい。
［製造法６］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 「式中、Ｒｇ及びＲｌは、脱離基を；Ｒｍは、炭素数１～１８のアルキル基を；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ４２は上記と同様の意味を有する。」脱離基として、例えば、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、メタンスルホニル基、４－トルエンスルホニル基、クロロメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、トリクロロメトキシ基、４－ニトロ－フェノキシ基、２，４－ジニトロフェノキシ基、２，４，６－トリクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２，３，５，６－テトラフルオロフェノキシ基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、３，５－ジオキソ－４－メチル－１，２，４－オキサジアゾリジル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル基などが挙げられる。
（６－１）
　式［１０Ａ］の化合物として、たとえば、ドデカン酸、デカン酸、ノナン酸及びオクタン酸などが知られている。
　式［２］の化合物は、縮合剤または酸ハロゲン化物の存在下、塩基の存在下、式［２Ｂ］の化合物を式［１０Ａ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（３－３）に準じて行えばよい。
（６－２）
　式［１０Ｂ］の化合物として、たとえば、ドデカン酸クロリド、デカン酸クロリド、ノナン酸クロリド及びオクタン酸クロリドなどが知られている。
　式［２］の化合物は、塩基の存在下、式［２Ｂ］の化合物を式［１０Ｂ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（３－４）に準じて行えばよい。
（６－３）
　式［１６］の化合物として、たとえば、３－クロロプロパン酸ヘプチルなどが知られている。     
　式［２］の化合物は、塩基の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１６］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（４－１）に準じて行えばよい。
［製造法７］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 「式中、Ｒｎ、Ｒｏ及びＲｐは、炭素数１～１７のアルキル基を；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ４２及びＲ４３は上記と同様の意味を有する。」
（７－１）
　式［１７Ａ］の化合物として、たとえば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロパナール、ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール及びオクタナールなどが知られている。
　式［２］の化合物は、還元剤の存在下、還元触媒の存在下もしくは不存在下、酸の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１７Ａ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応に使用される溶媒としては、反応に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、たとえば、アルコール類、ハロゲン炭化水素類、エーテル類、エステル類、アミド類、ニトリル類、スルホキシド類、芳香族炭化水素類及び水が挙げられ、これらの溶媒は混合して使用してもよい。
　溶媒の使用量は、特に限定されないが、式［２Ｃ］の化合物に対して、１～５００倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応に用いられる酸としては、無機酸または有機酸が挙げられる。
　酸の使用量は、式［２Ｃ］の化合物に対して、０．０１～１００００倍モル、好ましくは、０．０５～１００倍モルであればよい。
　この反応に使用される還元剤としては、たとえば、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、２－ピコリンボラン、ギ酸及び水素などが挙げられる。
　この反応に使用される還元触媒としては、たとえば、パラジウム－炭素、水酸化パラジウム－炭素、白金－炭素、ロジウム－炭素及びルテニウム－炭素などが挙げられる。
　式［１７Ａ］の化合物の使用量は、特に限定されないが、式［１３］の化合物に対して、１～１０倍量（ｖ／ｗ）であればよい。
　この反応は、－３０～１５０℃、好ましくは０～１００℃で５分間～４８時間実施すればよい。
（７－２）
　式［１７Ｂ］の化合物として、たとえば、２－オキソエチルオクタノエート及び２－オキソエチルノナノエートなどが知られている。
　式［２］の化合物は、還元剤の存在下、還元触媒の存在下もしくは不存在下、酸の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１７Ｂ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（７－１）に準じて行えばよい。
（７－３）
　式［１７Ｃ］の化合物として、たとえば、ヘプチル３－オキソプロパノエート及びオクチル３－オキソプロパノエートなどが知られている。
　式［２］の化合物は、還元剤の存在下、還元触媒の存在下もしくは不存在下、酸の存在下もしくは不存在下、式［２Ｃ］の化合物を式［１７Ｃ］の化合物と反応させることにより製造することができる。
　この反応は、製造法（７－１）に準じて行えばよい。
　上記した製造法で使用される化合物において、異性体（たとえば、光学異性体、幾何異性体及び互変異性体など）が存在する場合、これらの異性体も使用することができる。　また、溶媒和物、水和物及び種々の形状の結晶が存在する場合、これらの溶媒和物、水和物及び種々の形状の結晶も使用することができる。
　上記した製造法で使用される化合物において、たとえば、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基などを有している化合物は、予めこれらの基を通常の保護基で保護しておき、反応後、自体公知の方法でこれらの保護基を脱離することができる。
　上記した製造法で得られる化合物は、たとえば、縮合、付加、酸化、還元、転位、置換、ハロゲン化、脱水もしくは加水分解などの自体公知の反応に付すことにより、または、それらの反応を適宜組み合わせることにより、他の化合物に誘導することができる。
　本発明の医薬組成物において、全脂質に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有量は、４０モル％～７０モル％であることが好ましく、４５モル％～６５モル％であることがより好ましく、５０モル％～６０モル％であることがさらに好ましい。
　本発明の医薬組成物は、コレステロールを含む。
コレステロールを含むことで、膜流動性を低下させ、脂質粒子の安定化効果を得ることができる。
　本発明の医薬組成物において、全脂質に対するコレステロールの含有量は、２５モル％～６０モル％であることが好ましく、３０モル％～５５モル％であることがより好ましく、３５モル％～５５モル％であることがさらに好ましく、４０モル％～５０モル％であることが特に好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む。ポリエチレングリコール構造を有する脂質を含むことで、脂質粒子の分散安定化効果を得ることができる。
　ポリエチレングリコール構造を有する脂質としては、特に限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールＰＥＧ誘導体、ジアルキルグリセロールＰＥＧ誘導体、コレステロールＰＥＧ誘導体、セラミドＰＥＧ誘導体などが挙げられる。これらの中でも、ジアシルグリセロールＰＥＧが好ましい。すなわち、ポリエチレングリコール構造を有する脂質としては、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質であることが好ましく、ジアシルグリセロール構造のアシル基が炭素数１２～２２であるアシル基であることがより好ましい。
　上記ポリエチレングリコール誘導体のＰＥＧ鎖の重量平均分子量は、５００～５０００が好ましく、７５０～３０００がより好ましい。
　本発明の医薬組成物において、全脂質に対する非イオン性親水性高分子を有する脂質の含有量は、０．５モル％～１０モル％であることが好ましく、０．５モル％～５モル％であることがより好ましく、０．５モル％～３モル％であることがさらに好ましく、０．５モル％～２モル％が最も好ましい。
　本発明の医薬組成物は、双性イオン性脂質を含むことができる。双性イオン性脂質としては、リン脂質が好ましい。リン脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられ、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
　ホスファチジルコリンとしては、特に限定されないが、大豆レシチン（ＳＰＣ）、水添大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、卵黄レシチン（ＥＰＣ）、水添卵黄レシチン（ＥＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）などが挙げられる。なかでも、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）が好ましい。
　ホスファチジルエタノールアミンとしては特に限定されないが、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジテトラデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジオクタデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジフィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミンなどが挙げられる。
　これらリン脂質のなかでも、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）がより好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）がさらに好ましく、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）が最も好ましい。
　本発明の医薬組成物において、全脂質に対する双性イオン性脂質の含有量は、０モル％～３０モル％であることが好ましく、０モル％～２０モル％であることがより好ましく、０モル％～１０モル％であることがさらに好ましい。
　本発明の医薬組成物の製造方法について説明する。
　医薬組成物の製造方法は限定されないが、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、非イオン性脂質、及び非イオン性親水性高分子構造を有する脂質など、脂質に分類される成分全てまたは一部の油溶性成分を有機溶媒等に溶解させ油相とし、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を水に溶解させ水相とし、油相と水相を混合して製造することができる。混合にはマイクロミキサーを使用してもよく、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化してもよい。
　あるいは、脂質を含む溶液をエバポレータなどによる減圧乾固または噴霧乾燥機などによる噴霧乾燥などにより脂質を含む乾燥した混合物を調製し、この混合物を水系溶媒に添加し、さらに前述の乳化機などで乳化することで製造することもできる。
　医薬組成物の製造方法の一例としては、
　式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、非イオン性脂質、及び非イオン性親水性高分子構造を有する脂質など、脂質に分類される成分を有機溶媒に溶解して油相を得る工程（ａ）；
　工程（ａ）で得た油相と、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を含む水相と、を混合する工程（ｂ）；
　工程（ｂ）で得た油相および水相を含む混合液を希釈して、脂質粒子の分散液を得る工程（ｃ）；
　工程（ｃ）で得られた脂質粒子の分散液から上記有機溶媒を除去する工程（ｄ）；
　工程（ｄ）で得られた脂質粒子の分散液の濃度を調節する工程（ｅ）； 
を含む方法が挙げられる。
　工程（ａ）においては、脂質に分類される構成成分を、有機溶媒（エタノールなどのアルコール、またはエステルなど）に溶解させることを含む。有機溶媒に溶解させた後の総脂質濃度は特に限定されないが、一般的には１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ～３０ｍｍｏｌ／Ｌである。
　工程（ｂ）において、水相は、人工ｓｉＲＮＡを、水または緩衝液に溶解することで得ることができる。必要に応じて酸化防止剤などの成分を添加することができる。水相と油相を混合する比率（質量比）は、５：１～１：１が好ましく、４：１～２：１がより好ましい。
　工程（ｄ）において、脂質粒子の分散液から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法を使用することができるが、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を用いて透析を行うことにより有機溶媒を除去することができる。
　工程（ｅ）において、工程（ｄ）で得られた分散液の濃度を調整することができる。希釈する場合は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水などを希釈液として用いて適切な濃度に希釈することができる。濃縮する場合は、工程（ｄ）で得られた分散液を限外ろ過膜を用いた限外ろ過などにより濃縮することができる。濃縮した分散液をそのまま用いても好ましく、濃縮した後に上記希釈液を用いて所望の濃度に調整しても好ましい。
　本発明の脂質粒子の分散液を医薬組成物とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルターなどを用いて、脂質粒子の分散液から不要なものを除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径を有するフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。また、無菌ろ過を行うのは、工程（ｃ）または工程（ｄ）のあとが好ましい。
　さらに必要に応じて本発明の脂質粒子の分散液を、凍結乾燥を施すことができる。
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される水溶液などの媒体、塩、保存剤、緩衝剤などを含めた添加剤を添加することができる。
　本発明の医薬組成物は、処置剤として用いることができる。
　本発明によれば、本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含む、Ｂ型肝炎を処置する方法が提供される。
　本発明によれば、本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含む、肝硬変または肝臓がんを処置する方法が提供される。
　本発明によれば、Ｂ型肝炎の処置において使用するための、本発明の医薬組成物が提供される。
　本発明によれば、肝硬変または肝臓がんの処置において使用するための、本発明の医薬組成物が提供される。
　本発明によれば、Ｂ型肝炎の処置剤の製造のための、本発明の医薬組成物の使用が提供される。
　本発明によれば、肝硬変または肝臓がんの処置剤の製造のための、本発明の医薬組成物の使用が提供される。
　処置剤の対象は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。ヒト以外の哺乳動物として、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等が挙げられる。
　処置は、所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害または遅延が実現される任意の処置および療法であってよく、進行の速度の低下、進行の速度の休止、状態の好転、状態の治癒もしくは寛解（部分的なものであるか完全なものであるかにかかわらず）、状態の１つもしくは複数の症状および／もしくは徴候の予防、遅延、軽減もしくは停止、または対象もしくは対象の生存が処置の不在下で予測されるものよりも延長されることを含む。
　処置は予防も含む。例えば、Ｂ型肝炎、肝硬変または肝臓がんが発症または再発症しやすいまたはそのリスクがある対象を処置することにより、対象におけるＢ型肝炎、肝硬変または肝臓がんの発症または再発症が予防され得るまたは遅延し得る。
　処置剤の対象疾患は、Ｂ型肝炎である。また、処置剤の対象疾患としては、Ｂ型肝炎の関連疾患である、肝硬変または肝臓がんにおいても適用し得る。
　本発明の医薬組成物を投与する際の投与経路は、特に限定されず、任意の方法で投与することができる。投与方法としては、経口投与、非経口投与（関節内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、硝子体内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、膣内投与、膀胱内投与、髄腔内投与、肺投与、直腸投与、結腸投与、頬投与、鼻投与、大槽内投与、吸入など）が挙げられるが、非経口投与が好ましい。非経口投与方法としては、静脈注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射または筋肉内注射が好ましい。
　投与量としては、例えば、一回の投与につき対象の体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。
　特に記載のない場合、カラムクロマトグラフィーによる精製は、自動精製装置ＩＳＯＬＥＲＡ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）または中圧液体クロマトグラフＹＦＬＣ　Ｗ－ｐｒｅｐ　２ＸＹ　（山善株式会社）を使用した。
　特に記載のない場合、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおける担体は、Ｃｈｒｏ［実施例ｍａｔｏｒｅｘ　Ｑ－Ｐａｃｋ　ＳＩ　５０（富士シリシア化学株式会社）、ハイフラッシュカラムＷ００１、Ｗ００２、Ｗ００３、Ｗ００４またはＷ００５（山善株式会社）を使用した。
　ＮＨシリカゲルは、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ　Ｑ－Ｐａｃｋ　ＮＨ　６０（富士シリシア化学株式会社）を使用した。
　ＮＭＲスペクトルは、内部基準としてテトラメチルシランを用い、Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＶ３００（Ｂｒｕｋｅｒ社製）またはＢｒｕｋｅｒ　ＡＶ４００（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いて測定し、全δ値をｐｐｍで示した。
　ＭＳスペクトルは、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＳＱＤ　ＬＣ／ＭＳ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて測定した。
＜化合物の合成＞
[製造例１] 
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　２－（エチルアミノ）エタン－１－オール(4.0g)、２－ブロモ－Ｎ、Ｎ－ジエチルエタン－１－アミン臭化水素酸塩(17.6g)およびエタノール(80mL)の混合物に、炭酸カリウム(18.6g)を加え、加熱還流下で7時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、不要物を濾去し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、淡黄色油状物の２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（エチル）アミノ）エタン－１－オール(6.5g)を得た。
MSm/z(M+H):189.
（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　ベンズアルデヒド(30.0g)、６－ブロモヘキサン－１－オール(56.1g)、トリエチルシラン(67.5mL)、トルエン(300mL)の混合物に、氷冷下で三ふっ化ほう素ジエチルエーテル錯体(46.2mL)を加え、同温度で40分撹拌した。反応混合物に水を加え、有機層を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン)で精製し、無色油状物の（（（６－ブロモヘキシル）オキシ）メチル）ベンゼン(73.5g)を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.38-7.23 (5H, m), 4.50 (2H, s), 3.47 (2H, t, J=6.6Hz), 3.40 (2H, t, J=6.6Hz), 1.92-1.81 (2H, m), 1.68-1.58 (2H, m), 1.52-1.35 (4H, m).
　（（（６－ブロモヘキシル）オキシ）メチル）ベンゼン(66.7g)およびテトラヒドロフラン(200mL)の混合物を、マグネシウム(7.5g)およびテトラヒドロフラン(40mL)の混合物に滴下し、室温で1時間撹拌した。反応混合物に氷冷下でギ酸エチル(8.3g)およびテトラヒドロフラン(100mL)の混合物を加え、同温度で1時間撹拌した。反応混合物を氷冷下で10%硫酸水溶液(330mL)に注ぎ込んだ後、ヘキサン(300mL)を加え、有機層を分取し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物に、テトラヒドロフラン(200mL)、エタノール(100mL)および10mol/L水酸化カリウム水溶液を加え、40℃で1時間撹拌した。反応混合物にヘキサン(200mL)および水(100mL)を加え、有機層を分取した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、無色油状物の１，１３－ビス（ベンジルオキシ）トリデカン－７－オール(25.3g)を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36-7.24 (10H, m), 4.50 (4H, s), 3.61-3.54 (1H, m), 3.46 (4H, t, J=6.6Hz), 1.68-1.56 (4H, m), 1.48-1.26 (16H, m).
　１，１３－ビス（ベンジルオキシ）トリデカン－７－オール(24.0g)、10%水酸化パラジウム－炭素(10.0g)およびメタノール(240mL)の混合物を、水素雰囲気下、50℃で3時間攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、不溶物をセライト濾去した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残留物に酢酸エチル(40mL)を加え、固形物を濾取し、酢酸エチルで洗浄後、減圧下で乾燥させ、白色固体のトリデカン－１，７，１３－トリオール(11.7g)を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.70-3.55 (5H, m), 1.64-1.24 (20H, m).
（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　トリデカン－１，７，１３－トリオール、２－ヘキシルデカン酸、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジンおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの混合物に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を加え、室温で15時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン)で精製し、無色油状物の７－ヒドロキシトリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）を得た。
　７－ヒドロキシトリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、クロロギ酸４－ニトロフェニルを加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、淡黄色油状物の７－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）トリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ: 8.28 (2H, dd, J=7.2H, 2,1Hz), 7.39 (2H, dd, J=7.2Hz, 2.1Hz), 4.86-4.76 (1H, m), 4.07 (4H, t, J=6.6Hz), 2.36-2.25 (2H, m), 1.72-1.20 (68H, m), 0.87 (12H, t, J=6.0Hz).
（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　７－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）トリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）、２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（エチル）アミノ）エタン－１－オール、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、４－ジメチルアミノピリジンを加え、加熱還流下で8時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール－酢酸エチル)およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、無色油状物の７－（（（２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（エチル）アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）トリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:4.73-4.61 (1H, m), 4.17 (2H, t, J=6.6Hz), 4.05 (4H, t, J=6.6Hz), 2.76 (2H, t, J=6.6Hz), 2.67-2.46 (10H, m), 2.36-2.23 (2H, m), 1.68-1.16 (68H, m), 1.09-0.97 (9H, m), 0.94-0.81 (12H, m).MSm/z(M+H):924.
[製造例２]　
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　２－（イソプロピルアミノ）エタン－１－オール(2.0g)、２－ブロモ－Ｎ、Ｎ－ジエチルエタン－１－アミン臭化水素酸塩(7.6g)およびエタノール(20mL)の混合物に、炭酸カリウム(8.0g)を加え、加熱還流下で7時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、不要物を濾去し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、淡黄色油状物の２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（イソプロピル）アミノ）エタン－１－オール(3.5g)を得た。
MSm/z(M+H):203.
（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　１０－エトキシ－１０－オキソデカン酸、塩化チオニルおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの混合物を、加熱還流下で1時間30分撹拌した。溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物のエチル１０－クロロ－１０－オキソデカノエートを粗生成物として得た。
　塩化亜鉛（II）のテトラヒドロフラン懸濁液に、-78℃で1.0mol/Lデシルマグネシウムブロミド－ジエチルエーテル溶液を滴下し、0℃まで昇温した後、同温度で30分撹拌した。反応混合物にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(０)およびエチル１０－クロロ－１０－オキソデカノエートを加え、0℃で1時間撹拌した。反応混合物に1.0mol/L塩酸水溶液および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、褐色油状物のエチル１０－オキソイコサン酸を得た。
　エチル１０－オキソイコサン酸および２－ブチルオクタン－１－オールの混合物に、オルトチタン酸テトライソプロピルを加え、110℃で17時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、淡黄色固体の２－ブチルオクチル１０－オキソイコサン酸を得た。
　２－ブチルオクチル１０－オキソイコサン酸、メタノールおよびテトラヒドロフランの混合物に、氷冷下で水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物を氷および水の混合物に注ぎ込んだ後、1.0mol/L塩酸水溶液を加え、有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、白色固体の２－ブチルオクチル１０－ヒドロキシイコサノエートを得た。
　２－ブチルオクチル１０－ヒドロキシイコサノエート、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、クロロギ酸４－ニトロフェニルを加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）イコサノエートを得た。
　２－ブチルオクチル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）イコサノエート、２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（イソプロピル）アミノ）エタン－１－オール、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、４－ジメチルアミノピリジンを加え、加熱還流下で撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール－酢酸エチル)およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル１２－デシル－３－エチル－６－イソプロピル－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:4.73-4.61 (1H, m), 4.10 (2H, t, J=6.6Hz), 3.97 (2H, d, J=6.0Hz), 2.99-2.83 (1H, m), 2.68 (2H, t, J=6.6Hz), 2.62-2.41 (8H, m), 2.29 (2H, t, J=7.2Hz), 1.69-1.47 (7H, m), 1.40-1.19 (42H, m), 1.10-0.96 (12H, m), 0.94-0.83 (9H, m).
MSm/z(M+H):726.
［製造例３］
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　２，２’－アザンジイルビス（エタン－１－オール）(2.0g)、２－ブロモ－Ｎ、Ｎ－ジエチルエタン－１－アミン臭化水素酸塩(7.4g)およびエタノール(40mL)の混合物に、炭酸カリウム(7.9g)を加え、加熱還流下で8時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、不要物を濾去し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、淡黄色油状物の２，２’－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）アザンジイル）ビス（エタン－１－オール）(2.3g)を得た。
MSm/z(M+H):205.
（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　１０－メトキシ－１０－オキソデカン酸、塩化チオニルおよびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの混合物を、加熱還流下で1時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、褐色油状物のメチル１０－クロロ－１０－オキソデカノエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.67 (3H, s), 2.88 (2H, t, J=7.2Hz), 2.30 (2H, t, J=7.2Hz), 1.75-1.57 (4H, m), 1.38-1.25 (8H, m).
　塩化亜鉛（II）のテトラヒドロフラン懸濁液に、-78℃で1.0mol/Lヘキシルマグネシウムブロミド－ジエチルエーテル溶液を滴下し、0℃まで昇温した後、同温度で30分撹拌した。反応混合物に氷冷下でテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(０)を加えた後、メチル１０－クロロ－１０－オキソデカノエートを同温度で滴下し、同温度で1時間撹拌した。反応混合物に1.0mol/L塩酸水溶液および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、白色固体の１０－オキソヘキサデカン酸メチルを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.67 (3H, s), 2.38 (4H, t, J=7.2Hz), 2.30 (2H, t, 7.2Hz), 1.65-1.49 (6H, m), 1.35-1.20 (14H, m), 0.88 (3H, t, J=7.2Hz).
　１０－オキソヘキサデカン酸メチルおよび２－ブチルオクタン－１－オールの混合物に、オルトチタン酸テトライソプロピルを加え、110℃で1時間撹拌した。反応混合物に水を加え、室温で15分間撹拌した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル１０－オキソヘキサデカノエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.97 (2H, d, J=5.6Hz), 2.38 (4H, t, J=7.6Hz), 2.29 (2H, t, J=7.6Hz), 1.65-1.50 (7H, m), 1.35-1.20 (30H, m), 0.92-0.83 (9H, m).
　２－ブチルオクチル１０－オキソヘキサデカノエート、メタノールおよびテトラヒドロフランの混合物に、氷冷下で水素化ホウ素ナトリウムを加え、同温度で30分間撹拌した。反応混合物を氷および水の混合物に注ぎ込んだ後、1.0mol/L塩酸水溶液および酢酸エチルを加え、有機層を分取した後、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル－ヘキサン）で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル１０－ヒドロキシヘキサデカノエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:3.97 (2H, d, J=6.0Hz), 3.61-3.54 (1H, m), 2.30 (2H, t, J=7.6Hz), 1.65-1.56 (3H, m), 1.48-1.22 (38H, m), 0.92-0.83 (9H, m).
　２－ブチルオクチル１０－ヒドロキシヘキサデカノエート、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、クロロギ酸４－ニトロフェニルを加え、室温で4時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン)で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカン酸を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.28 (2H, dd, J=7.2Hz, 2.1Hz), 7.39 (2H, dd, J=7.2Hz, 2.1Hz), 4.86-4.76 (1H, m), 3.97 (2H, d, J=5.7Hz), 2.30 (2H, t, J=7.2Hz), 1.74-1.20 (41H, m), 0.92-0.85 (9H, m).
（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　２－ブチルオクチル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカン酸、２，２’－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）アザンジイル）ビス（エタン－１－オール）、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、４－ジメチルアミノピリジンを加え、80℃で8時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール－酢酸エチル)およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、無色油状物の２－ブチルオクチル３－エチル－１２－ヘキシル－６－（２－ヒドロキシエチル）－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:4.75-4.61 (1H, m), 4.21 (2H, t, J=6.6Hz), 3.97 (2H, d, J=5.7Hz), 3.55 (2H, t, J=5.1Hz), 2.89 (2H, t, J=6.6Hz), 2.76-2.65 (4H, m), 2.64-2.41 (6H, m), 2.30 (2H, t, J=8.1Hz), 1.72-1.45 (7H, m), 1.40-1.20 (34H, m), 1.13-0.98 (6H, m), 0.96-0.81 (9H, m).
MSm/z(M+H):672.
（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　２－ブチルオクチル３－エチル－１２－ヘキシル－６－（２－ヒドロキシエチル）－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエート、オクタン酸、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジンおよびジクロロメタンの混合物に、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を加え、室温で6時間撹拌した。反応混合物に水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール－酢酸エチル)およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製することによって、無色油状物の２－ブチルオクチル３－エチル－１２－ヘキシル－６－（２－（オクタノイルオキシ）エチル）－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:4.71-4.62 (1H, m), 4.20-4.08 (4H, m), 3.97 (2H, d, J=5.6Hz), 2.89-2.77 (4H, m), 2.73-2.42 (8H, m), 2.29 (4H, t, J=7.6Hz), 1.68-1.48 (9H, m), 1.39-1.18 (42H, m), 1.10-0.98 (6H, m), 0.94-0.81 (12H, m).
MSm/z(M+H):798.
［製造例４］
（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　製造例３において、２－ブチルオクタン－１－オールを用いた代わりに２－ヘキシルデカン－１－オールを用いること以外は実施例３（２）と同様の方法で、無色油状物の２－ヘキシルデシル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.28 (2H, dd, J=7.2Hz, 2.4Hz), 7.39 (2H, dd, J=7.2Hz, 2.4Hz), 4.85-4.77 (1H, m), 3.97 (2H, d, J=5.6Hz), 2.30 (2H, t, J=7.6Hz), 1.72-1.20 (49H, m), 0.92-0.85 (9H, m).
（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　２－ヘキシルデシル１０－（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノエート、２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（イソプロピル）アミノ）エタン－１－オール、トリエチルアミンおよびテトラヒドロフランの混合物に、４－ジメチルアミノピリジンを加え、80℃で8時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、水および酢酸エチルを加え、有機層を分取し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール－酢酸エチル)およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル－ヘキサン、ＮＨシリカゲル)で精製し、無色油状物の２－ヘキシルデシル３－エチル－１２－ヘキシル－６－イソプロピル－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:4.72-4.61 (1H, m), 4.10 (2H, t, J=6.6Hz), 3.97 (2H, d, J=5.7Hz), 2.97-2.87 (1H, m), 2.68 (2H, t, J=6.6Hz), 2.62-2.40 (8H, m), 2.29 (2H, t, J=7.2Hz), 1.69-1.49 (7H, m), 1.40-1.19 (42H, m), 1.12-0.95 (12H, m), 0.93-0.82 (9H, m).MSm/z(M+H):726.
＜人工ｓｉＲＮＡの作製＞
［製造例５］
（１）一本鎖核酸分子の合成
　以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、ＡＢＩ３９００核酸合成機（商品名、アプライドバイオシステムス）により合成した。上記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた（以下、同様）。上記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣによる精製した。
　一本鎖核酸分子として、下記配列Ａ及び配列Ｂで表わされるHBV遺伝子発現抑制配列を、それぞれ上記のように合成した。各々の一本鎖核酸分子において、Pは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
で示されるリンカーであり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
で示されるＬ－プロリンジアミドアミダイトを用いてオリゴマーに導入した。各配列において、下線部は遺伝子発現抑制配列である。
（配列Ａ）
5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU（配列番号１）-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG（配列番号２） -3’
（配列Ｂ）
5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCCC（配列番号３）-P-GGGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG（配列番号４） -3’　
１．in vitro試験
＜核酸内包脂質粒子の調製＞
　参考例１０１～１０３には製造例１で製造した７－（（（２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（エチル）アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）トリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）、または製造例２で製造した２－ブチルオクチル１２－デシル－３－エチル－６－イソプロピル－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを、カチオン性脂質として使用した。
　比較例１０１には以下の構造を有する脂質（比較化合物Ａ）を特許文献４に記載の方法で合成し、カチオン性脂質として使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　上記のカチオン性脂質、リン脂質としてＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、製品名：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ－８０８０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コレステロール（製品名：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ＨＰ；日本精化株式会社）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（Ｒ）ＧＭ－０２０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、表１に記載のモル比で、総脂質濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解させ、油相を得た。
　比較例１０１および１０２にはＢｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　２０１３；１４，３９０３－３９１５に記載の配列のＬｕｃ２　ｓｉＲＮＡを、比較例１０３および参考例１０１～１０３には製造例５で作製した配列Ｂの一本鎖核酸（以下、ｓｉＲＮＡ０１と称す。）を、それぞれ ５ｍｇを滅菌水１ｍＬに溶解し、ｐＨ４の１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファーで核酸濃度が１９．７μｍｏｌ／Ｌになるように希釈して水相を得た。続いて水相と油相の体積比が水相：油相＝３：１となるようにシリンジポンプを用いてマイクロミキサー（特許第５２８８２５４号公報を参照）で混合し、混合液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈した。さらにＰＢＳを用いて透析を行ってエタノールを除去して核酸脂質粒子の分散物を得た。得られた分散物を０．２２μｍ径のフィルター（ザルトリウス社　Ｍｉｎｉｓａｒｔ　１６５３４－Ｋ）でろ過して滅菌した。混合時の全脂質に対するｓｉＲＮＡの質量比を表１に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
＜粒子径とｓｉＲＮＡ内包率の測定＞
＜粒子径の測定＞
　ｓｉＲＮＡ０１を内包した脂質粒子の粒子径は、脂質粒子分散液について、粒径測定システムＥＬＳ－Ｚ２（大塚電子）を用いて、原液のまま測定した。
＜ｓｉＲＮＡの内包率の評価＞
（総核酸濃度定量）
　核酸を保持する脂質粒子６０μＬに、３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液３０μＬとグリコーゲン９μＬを添加し、つづいてエタノール１．５ｍＬを添加することで脂質を溶解し、核酸のみを沈殿させた。その後、遠心分離を行い、上清を除去した。１５分以上風乾させた後、水を加えて再溶解させ、ナノドロップＮＦ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定することで、総核酸濃度を定量した。
（外水相における核酸濃度の定量）
　Ｑｕａｎｔ－ｉＴ　ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、プロトコルに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる２０×ＴＥバッファーを水で希釈し、１×ＴＥバッファーとした。なお、ＴＥは、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を示す。外水相の核酸のみを定量するため、核酸を保持する脂質粒子分散液を１×ＴＥバッファーで１００００倍に希釈した。
　１００００倍に希釈した脂質粒子分散液１００μＬを、９６ウェルプレートに入れ、つづいて１×ＴＥバッファーで２０００倍に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬（上記したＱｕａｎｔｉ－ｉＴ　Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ　ＲＮＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに含まれている試薬）１００μＬをサンプルに加え、プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔ　ＥＦ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて蛍光（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）を測定することで、外水相における核酸濃度を定量した。
（内包率の算出）
　上述の工程で得られた総核酸濃度および外水相での核酸濃度の定量結果を用いて、下記式に従って、核酸脂質粒子の核酸内包率を算出した。
核酸内包率（％）＝（総核酸濃度－外水相における核酸濃度）÷総核酸濃度×１００
結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
＜in vitro試験＞
　本発明の核酸内包脂質粒子分散物を用いて以下のようにＰＸＢ細胞での抗ＨＢＶアッセイ試験を行った。
（PXB-cellsでの抗HBVアッセイ）
　PXBマウス（ヒト肝細胞キメラマウス）から採取した新鮮ヒト肝細胞（PXB-cells、フェニックスバイオ社製）を用いて抗HBV活性を以下の手順で評価した。
　培地として、以下を用いた。
DMEM（Sigma社製）＋0.25μg/mLインスリン（富士フイルム和光純薬社製）＋1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社製）＋20mmol/L HEPES（Sigma-Aldrich社製）＋15μg/mL L-プロリン（Sigma-Aldrich社製）＋50nmol/Lデキサメタゾン（Sigma-Aldrich社製）＋5ng/mL EGF（Peprotech社製）＋0.1mmol/L アスコルビン酸２リン酸（富士フイルム和光純薬社製）＋10％FBS＋2％DMSO
　さらに上記培地にD-PBS（-）（富士フイルム和光純薬社製）で試験濃度の20倍濃度に調製した薬剤をそれぞれ加え、各薬剤の種々濃度の試験液を調製した。
（１）7×104cells/ウェルで96穴マイクロタイタープレートに播種されたPXB-cellsを、5％CO2インキュベーターにて37℃で感染日までインキュベートした。
（２）PXB-cells培養上清由来HBV（genotype C_JPNAT）を、4％PEG-8000含上記培地に懸濁し、約10 copies/cellとなるよう（１）のプレートに加えて感染させ（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で1日間インキュベートした。
（３）感染後1日目の培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で1日間インキュベートした。
（４）感染後２日目の培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（５）感染後7日目の培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（６）感染後12日目の培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（７）感染後17日目の培養上清を除き、試験液をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃でインキュベートした。薬剤非添加の対照には、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃でインキュベートした。試験液処理6時間後に、培養上清を除き上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。薬剤非添加の対照も同様に培地交換を実施した。
（８）感染後22日目の培養上清を回収し、上記培地をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。薬剤非添加の対照も同様に培地交換を実施した。
（９）感染後27日目の培養上清を回収した。残りの細胞に対し、D-PBS（-）で10倍希釈したCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社製）を100μL/ウェル添加し，5％CO2インキュベーターにて37℃で1～2時間染色後，490及び655 nmの吸光度を測定し、cell viabilityを評価した。Cell viabilityのT/C%は以下の式に示す方法で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000043
（１０）回収した感染後22および27日目の培養上清中のHBsAgを、ルミパルス（登録商標）HBsAg-HQ（富士レビオ社製）を用いて絶対定量した。それぞれについて薬剤非添加の対照に対する相対値(％)を算出した。濃度を対数、相対値を実数でプロットし、Microsoft Office Excel 2007のFORECAST関数（1次回帰法）を用いて薬剤のIC50を算出した。
　結果を表３、図１に示す。なお、図１では、感染27日後のcell viabilityを薬剤非添加ウェルに対する相対値として示した。3ウェルの平均値及び標準偏差を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　なお、参考例１０１～１０３で使用した配列Ｂの一本鎖核酸は、配列Ａの一本鎖核酸と構造が異なるが類似しており、比較例１０１、１０２よりも上述の試験において優れた効果を得られた。
２．in vivo試験I
＜核酸内包脂質粒子の調製＞
　参考例２０１には製造例１で製造した７－（（（２－（（２－（ジエチルアミノ）エチル）（エチル）アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）トリデカン－１，１３－ジイルビス（２－ヘキシルデカノエート）、および参考例２０２には製造例２で製造した２－ブチルオクチル１２－デシル－３－エチル－６－イソプロピル－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを、カチオン性脂質として使用した。
　比較例２０１および比較例２０２には以下の構造を有する脂質（比較化合物Ａ）を特許文献４に記載の方法で合成し、カチオン性脂質として使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　上記のカチオン性脂質、リン脂質としてＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、製品名：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ－８０８０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コレステロール（製品名：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ＨＰ；日本精化株式会社）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（Ｒ）ＧＭ－０２０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、表４に記載のモル比で、総脂質濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解させ、油相を得た。
　比較例２０１には下記に示す配列Ｃの核酸を、比較例２０２および参考例２０１、２０２には、製造例５で作成したｓｉＲＮＡ０１　５ｍｇを滅菌水１ｍＬに溶解し、ｐＨ４の１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファーで核酸濃度が１９．７μｍｏｌ／Ｌになるように希釈して水相を得た。続いて水相と油相の体積比が水相：油相＝３：１となるようにシリンジポンプを用いてマイクロミキサー（特許第５２８８２５４号公報を参照）で混合し、混合液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈した。さらにＰＢＳを用いて透析を行ってエタノールを除去して核酸脂質粒子の分散物を得た。得られた分散物を０．２２μｍ径のフィルター（ザルトリウス社　Ｍｉｎｉｓａｒｔ　１６５３４－Ｋ）でろ過して滅菌し、アミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（メルク社製）を用いて限外ろ過膜により濃縮したのち、所望の濃度になるようにＰＢＳで希釈して投与製剤を得た。混合時の全脂質に対するｓｉＲＮＡの質量比を表４に示す。
 下記に示す配列Ｃの核酸は、製造例５と同様にして合成した。
（配列Ｃ）
GUACCGCACGUCAUUCGUAUCCC（配列番号５）-P-GGGAUACGAAUGACGUGCGGUACGU（配列番号６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　上述の方法にて、比較例２０１、２０２および参考例２０１、２０２に用いた製剤を２回作製し、粒子径とｓｉＲＮＡ内包率を測定した結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
＜in vivo試験＞
（ヒト肝細胞キメラマウスでのin vivo薬効試験）
　HBV genotype Cに感染後10週が経過した、雄性、25週齢以上、体重17g以上のPXBマウス（ヒト肝細胞キメラマウス）マウスを5群（各2又は3匹）に振り分け使用した。
　参考例２０１、参考例２０２、比較例２０２、陰性対照の比較例２０１の製剤をそれぞれ1 mg/kgで週2回、4週間静脈内投与した。残り1群はコントロール群としてリン酸バッファーを週2回、4週間静脈内投与した。初回投与日をday0とし、day-2、day6、day13及びday20に、セボフルラン麻酔を使用し、眼窩静脈叢より採血を実施した。さらに、day25に最終投与を実施し、投与後30分にセボフルラン麻酔下で開腹し、下大静脈より採血を実施した。採取した血液から血清を分離し、QIAamp（登録商標） DNA Blood Mini Kit（QIAGEN社製）で精製した。得られた溶液中のHBV-DNA量を、リアルタイムPCR法にて絶対定量した。また血清中のHBsAg量をルミパルス（登録商標）HBsAg-HQ（富士レビオ社製）を用いた化学発光酵素免疫測定法にてそれぞれ絶対定量した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　製剤投与により、血清中HBV-DNA及びHBsAgが減少し、ヒト肝細胞キメラマウスにおいても薬効が確認された。
　なお、参考例２０１、２０２で使用した配列Ｂの一本鎖核酸は、配列Ａの一本鎖核酸と構造が異なるが類似しており、比較例２０１、２０２よりも優れた薬効を得られた。
３．in vivo試験II
＜核酸内包脂質粒子の調製＞
　実施例３０１には製造例４で製造した２－ヘキシルデシル３－エチル－１２－ヘキシル－６－イソプロピル－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエート、実施例３０２には製造例３で製造した２－ブチルオクチル３－エチル－１２－ヘキシル－６－（２－（オクタノイルオキシ）エチル）－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートを、カチオン性脂質として使用した。
　上記のカチオン性脂質、リン脂質としてＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、製品名：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ－８０８０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コレステロール（製品名：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ＨＰ；日本精化株式会社）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（Ｒ）ＧＭ－０２０；ＮＯＦ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、表７に記載のモル比で、総脂質濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解させ、油相を得た。
　製造例５で作成した配列Ａの一本鎖核酸（以下、ｓｉＲＮＡ０２と称す。） ５ｍｇを滅菌水１ｍＬに溶解し、実施例３０１にはｐＨ４の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファーで、製造例３０２にはｐＨ４の１０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファーで、それぞれ核酸濃度が１９．７μｍｏｌ／Ｌになるように希釈して水相を得た。続いて水相と油相の体積比が水相：油相＝３：１となるようにシリンジポンプを用いてマイクロミキサー（特許第５２８８２５４号公報を参照）で混合し、混合液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈した。さらにＰＢＳを用いて透析を行ってエタノールを除去して核酸脂質粒子の分散物を得た。得られた分散物を０．２２μｍ径のフィルター（ザルトリウス社　Ｍｉｎｉｓａｒｔ　１６５３４－Ｋ）でろ過して滅菌し、アミコンウルトラ遠心式フィルターユニット（メルク社製）を用いて限外ろ過膜により濃縮したのち、所望の濃度になるようにＰＢＳで希釈して投与製剤を得た。混合時の全脂質に対するｓｉＲＮＡの質量比を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
＜粒子径とｓｉＲＮＡ内包率の測定＞
　上述の方法にて、実施例３０１、３０２に用いる製剤を３回作製し、粒子径とｓｉＲＮＡ内包率を測定した結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
＜in vivo試験＞
（ヒト肝細胞キメラマウスでのin vivo薬効試験）
　HBV genotype Cに感染後9週が経過した、雄性、26週齢以上、体重15g以上のPXBマウス（ヒト肝細胞キメラマウス）マウスを3群（各3匹）に振り分け使用した。
　実施例３０１、実施例３０２の製剤をそれぞれ1 mg/kgで週2回、6週間静脈内投与した。残り1群はコントロール群としてリン酸バッファーを週2回，6週間静脈内投与した。初回投与日をday0とし、day-1、day6、day14、day20、day27及びday34に、セボフルラン麻酔を使用し、眼窩静脈叢より採血を実施した。さらに、day37に最終投与を実施し、投与後30分にセボフルラン麻酔下で開腹し、下大静脈より採血を実施した。採取した血液から血清を分離し、QIAamp（登録商標） DNA Blood Mini Kit（QIAGEN社製）で精製した。得られた溶液中のHBV-DNA量を、リアルタイムPCR法にて絶対定量した。また血清中のHBsAg量をルミパルス（登録商標）HBsAg-HQ（富士レビオ社製）を用いた化学発光酵素免疫測定法にてそれぞれ絶対定量した。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　本発明の製剤投与により、血清中HBV-DNA及びHBsAgが減少し、ヒト肝細胞キメラマウスにおいても薬効が確認された。
　本発明の医薬組成物は、人工ｓｉＲＮＡを効率的に送達することができ、翻訳抑制効果に優れる。そのため、本発明の医薬組成物は、医薬品として有用である。

Claims (8)

  1. Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡ、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む医薬組成物であって、人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、医薬組成物。
    （配列Ａ）
    5’- CGUCUGUGCCUUCUCAUCUUCAU-P-AUGAAGAUGAGAAGGCACAGACGGG -3’
    式中、Pは
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    式中、Ｘは－ＮＲ１－または－Ｏ－を示し、
    Ｒ１は、水素原子、炭素数６～２４の炭化水素基、またはＲ２１－Ｌ１－Ｒ２２－で示される基を示し、Ｒ２１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ１は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    を示し、Ｒ２２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
    Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数３～２４の炭化水素基、またはＲ３１－Ｌ２－Ｒ３２－で示される基を示し、Ｒ３１は炭素数１～２４の炭化水素基を示し、Ｌ２は、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ（ＣＯ）－、－（ＣＯ）Ｏ－、－Ｏ－、または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    を示し、Ｒ３２は２価の連結基であって炭素数１～１８の炭化水素連結基を示し、
    Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２はそれぞれ独立に、水素原子または置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基を示し、
    Ｒ４およびＲ５、Ｒ１０およびＲ５、Ｒ５およびＲ１２、Ｒ４およびＲ６、Ｒ５およびＲ６、Ｒ６およびＲ７、Ｒ６およびＲ１０、Ｒ１２およびＲ７、並びにＲ７およびＲ８の何れか一組以上は互いに連結してＯ原子を含んでいてもよい４～７員環を形成してもよく、
    置換されてもよい炭素数１～１８のアルキル基上の置換基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のヘテロアリール基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
    置換もしくは無置換のアリール基、および置換もしくは無置換のヘテロアリール基上の置換基は、炭素数１～１８のアルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、－ＮＲ４５Ｒ４６で示されるアミノ基、－Ｏ（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４１、－Ｏ（ＣＯ）－Ｒ４２、－（ＣＯ）Ｏ－Ｒ４３、または－Ｏ－Ｒ４４で示される基であり、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５およびＲ４６はそれぞれ独立に、炭素数１～１８の炭化水素基を示し、
    ａ、ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ独立に０～３の整数を示し、但し、ａ＋ｂは１以上であり、ｃ＋ｄは１以上である。
  2. ポリエチレングリコール構造を有する脂質が、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 全脂質に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有量が４０～７０モル％である、請求項１又は２の何れか一項に記載の医薬組成物。
  4. 全脂質に対するコレステロールの含有量が２５～６０モル％である、請求項１～３の何れか一項に記載の医薬組成物。
  5. 全脂質に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有量が０．５～１０モル％である、請求項１～４の何れか一項に記載の医薬組成物。
  6. 全脂質に対するＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できる人工ｓｉＲＮＡの含有量が１～２５質量％である、請求項１～５の何れか一項に記載の医薬組成物。
  7. 請求項１～６の何れか一項に記載の医薬組成物を含む、Ｂ型肝炎の処置剤。
  8. 請求項１～６の何れか一項に記載の医薬組成物を含む、肝硬変または肝臓がんの処置剤。
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