KR20240016244A - Mrna의 표적 전달을 위한 지질 나노입자 - Google Patents

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KR20240016244A
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챠오빙 쑤
민 치우
얀 탕
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트러스티즈 오브 터프츠 칼리지
더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

지질 조성물과 조립된 약제학적 작용제(pharmaceutical agent)를 포함하는 조성물이 개시되며, 지질 조성물은 화학식 Ⅰ을 갖는 리피도이드(lipidoid) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
[화학식 Ⅰ]

여기서 Ra, Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, n1 및 n2는 본원에 기술된 바와 같다.

Description

MRNA의 표적 전달을 위한 지질 나노입자
관련 출원
본 출원은 2021년 1월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 63/138,047; 2021년 10월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 63/256,811; 및 2021년 10월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 63/251,791에 대한 우선권 이익을 주장하며; 이들 모두의 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 UG3 TR002636-01 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
게놈 편집 기술은 질환을 유발하는 유전적 돌연변이의 영구적 복구를 가능하게 한다. 그러나 이 기술의 적용은 CRISPR-Cas9 게놈 편집 구성 요소의 안전하고 효과적이며 특이적인 생체 내 전달을 달성해야 하는 기술적 과제로 인해 제한되었다.
CRISPR-Cas9 mRNA를 폐 또는 간으로 특이적으로 전달하기 위한 새롭게 확인된 지질 나노입자(lipid nanoparticle, LNP)의 개발이 본원에 개시된다. LNP는 최근 간으로의 siRNA 전달용으로 FDA 승인을 받았지만, 본원에 기술된 것은 게놈 편집을 위한 이의 적용이다. 일대일 비교 시, 개시된 전달 플랫폼은 승인된 플랫폼의 안전성 및 특이성과 일치하면서 Angptl3 유전자의 녹다운 및 고콜레스테롤혈증의 후속 조절을 위한 Cas9 mRNA의 효율적인 전달에서 FDA 승인된 LNP를 유의미하게 능가한다.
도 1은 혈중 지질 수준을 낮추기 위해 Angptl3에서 기능 상실 돌연변이(loss-of-function mutation)를 유도하기 위한 비바이러스성 지질 나노입자(LNP) 매개된 생체 내 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집의 개략도이다. Cas9 mRNA 및 Angptl3 특이적 단일 가이드 RNA(sgAngptl3)는 LNP에 캡슐화되고 간의 간세포로 전달되어 Angptl3 표적 유전자좌를 절단하여 ANGPTL3 단백질을 감소시킨다. 감소된 ANGPTL3 수준은 지단백 리파제(Lipoprotein lipase, LPL)의 탈억제(dis-inhibition)를 초래하여 LPL이 저밀도 지단백 콜레스테롤(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C) 및 트리글리세라이드(triglyceride, TG)와 같은 치료에 적절한 순환 지질의 수준을 조절할 수 있게 한다.
도 2a-2c는 예시적인 리피도이드 나노입자 합성을 보여준다. 도 2a는 테일-분지형 생환원성 리피도이드(tail-branched bioreducible lipidoid)의 화학 구조를 갖는 리피도이드 나노입자 합성을 보여준다.
도 2b는 0.5mg/kg 용량의 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)(fLuc) mRNA의 투여 후 6시간에 Balb/c 마우스(n = 3)에서 측정된 MC3 LNP 대 생환원성 LNP의 전신 루시퍼라제 생물발광 강도(whole body luciferase bioluminescence intensity)를 보여준다. 제형: 지질/콜레스테롤/DSPC/DMG-PEG = 50/38.5/10/1.5(몰비), 지질/mRNA = 12.5/1(중량비).
도 2c는 DLS로 측정된, fLuc mRNA로 제형화된 306-O12B LNP의 크기 및 분포이다.
도 3a-3f는 fLuc mRNA 306-O12B LNP 제형의 최적화를 보여준다. 도 3a는 세 가지 상이한 인지질의 화학 구조를 보여준다.
도 3b는 도 3a의 3가지 상이한 인지질의 생체분포(biodistribution)를 보여준다.
도 3c는 콜레스테롤, DMG-PEG 및 상이한 인지질(DSPC 또는 DOPE 또는 DOPC)로 제형화된 fLuc mRNA LNP의 생체분포를 보여준다. 대표 마우스의 심장, 간, 비장, 폐 및 신장으로부터의 발광 신호가 위에서 아래로 표시되어 있다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 3d는 콜레스테롤, DOPC 및 DMG-PEG로 제형화된 LNP의 7개의 상이한 몰비의 제형 파라미터를 보여준다.
도 3e는 306-O12B/mRNA 중량비를 다르게 하면서 콜레스테롤, DOPC 및 DMG-PEG의 50/38.5/10/1.5의 몰비로 제형화된 LNP에 대한 0.5mg/kg fLuc mRNA의 주사 후 6시간에 전신 루시퍼라제 생물발광 강도를 보여준다. (n = 3).
도 3f는 0.5mg/kg의 fLuc mRNA 용량의 주사 후 6시간에 Balb/c 마우스에서 상이한 제형의 전신 루시퍼라제 생물발광 강도를 보여준다.
도 4a 및 4b는 야생형 C57BL/6 마우스에서 Angptl3의 306-O12B LNP 매개된 유의한 수준의 생체 내 게놈 편집을 보여준다. 도 4a는 야생형 C57BL/6 마우스에서 Angptl3의 생체 내 게놈 편집의 306-O12B LNP 매개된 삽입-결실(indel) 백분율 및 혈청 ANGPTL3 수준을 보여준다.
도 4b는 2:1, 1:1.2 및 1:2의 질량비의 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3으로 제형화된 306-O12B LNP의 주사 후 306-O12B LNP 매개된 삽입-결실 백분율을 보여준다. (n = 5). 306-O12B LNP는 7.5/1 중량비의 306-O12B/총 RNA로 [306-O12B:콜레스테롤:DSPC:DMG-PEG]의 [50:38.5:10:1.5]의 몰비로 제형화되었다.
도 5a-5c는 306-O12B LNP가 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 통해 Angptl3에서 기능 상실 돌연변이를 유도하는 데 있어 MC-3 LNP보다 더 효율적임을 보여준다. 도 5a는 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3이 동시 로딩된(co-loading) 306-O12B LNP를 3.0mg/kg의 총 RNA 용량으로 투여한 후 7일차에 마우스의 ANGPTL3 단백질, 트리글리세라이드 및 LDL-C 수준의 간 및 혈청 분석에서 삽입-결실의 차세대 서열 분석을 보여준다. MC-3 LNP를 양성 대조군으로 사용하였다. (n = 5 또는 6). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 5b는 각각의 처리 그룹에서 특정한 편집된 대립유전자의 편집 빈도를 보여준다.
도 5c는 9개의 상위 예측 표적 외 부위에서의 편집 빈도를 보여준다.
도 6a 및 6b는 306-O12B LNP 매개된 CRISPR 편집이 100일 후에도 내구성을 유지함을 보여준다. 도 6a는 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3이 동시 로딩된 306-O12B LNP의 투여 후 100일차에 마우스의 ANGPTL3 단백질, 트리글리세라이드 및 LDL-C 수준의 간 및 혈청 분석에서 삽입-결실의 차세대 서열 분석을 보여준다.
도 6b는 주사 후 100일차에 측정된 AST 및 ALT 및 TNF-알파의 혈청 수준을 보여준다. 암컷 C57BL/6 마우스에 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3과 공동 제형화된 306-O12B LNP를 총 RNA 1.0, 2.0 및 3.0mg/kg의 단일 용량으로 전신 주사하였다. 주사 후 100일차에 마우스 혈청을 수집하였다. (n = 5) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 7a는 fLuc mRNA로 제형화되기 전의 306-O12B LNP의 대표적인 TEM 이미지이다. (스케일 바(Scale bar): 500nm).
도 7b는 fLuc mRNA로 제형화된 후의 306-O12B LNP의 대표적인 TEM 이미지이다. (스케일 바: 500nm).
도 8은 306-O12B, 113-O12B, 306-O10B LNP 및 MC-3 LNP가 로딩된 fLuc mRNA를 주사한 마우스의 생체 내 이미징을 보여준다. 주사 후 6시간에 IVIS 이미징 시스템으로 이미지를 촬영하였다.
도 9는 fLuc mRNA에 대한 306-O12B LNP의 캡슐화 효율을 보여준다.
도 10a 및 10b는 Ai14/Cas9 교차 마우스에서 306-O12B LNP 가능한 sgLoxP 매개된 게놈 편집을 보여준다. 도 10a는 sgLoxP를 캡슐화하는 LNP를 0.75mg/kg의 용량으로 투여한 Ai14/Cas9 마우스로부터 수집한 기관의 생체 외 이미지이며, tdTomato 형광은 IVIS 이미징 시스템으로 검출되었다.
도 10b는 tdTomato 신호가 간의 간세포에서 주로 발현됨을 보여주는 간 절편의 대표적인 면역형광 이미지이다. (스케일 바: 20μm).
도 11a-11c는 Ai14 마우스에서 306-O12B LNP 가능한 Cas9/sgLoxP 매개된 게놈 편집을 보여준다. 도 11a는 유전자 조작된 tdTomato 리포터 Ai14 마우스에 대한 Cas9 mRNA 및 LoxP 표적화 단일 가이드 RNA(sgLoxP)의 동시 전달의 개략도를 보여준다.
도 11b는 Cas9 mRNA/sgLoxP(1/1.2, 중량)를 캡슐화하는 LNP를 1.65mg/kg의 총 RNA 용량으로 투여한 Ai14 마우스로부터 수집한 기관의 생체 외 이미지 및 ROI의 정량화를 보여준다. tdTomato 형광은 IVIS 이미징 시스템으로 검출되었다.
도 11c는 간 절편의 공초점 형광 현미경이 tdTomato 신호가 주로 간의 간세포에서 발현되었음을 보여준다. (스케일 바: 20μm).
도 12는 Cas9 mRNA/sgAngptl3이 동시 로딩된 306-O12B LNP의 크기 분포를 보여준다.
도 13은 Cas9 mRNA/sgAngptl3이 동시 로딩된 306-O12B LNP 및 MC-3 LNP를 받은 지 7일 후에 취한 마우스의 간 샘플로부터의 게놈 DNA로 수행된 T7E1 검정을 보여준다. 화살표는 T7E1 검정으로 생성된 절단 산물을 보여준다.
도 14는 주사 후 2일차에 측정된 AST, ALT 및 TNF-알파의 혈청 수준을 보여준다. (n = 5).
도 15는 마우스에서 IFN-α, IL-6 및 IP-10의 혈청 수준을 보여준다. 마우스를 3.0mg/kg의 총 RNA로 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3과 공동 제형화된 306-O12B LNP로 처리하였다(n = 5).
도 16은 단일 투여 후 Angptl3의 기관 편집을 유도하는 306-O12B LNP를 보여준다. C57BL/6 마우스에 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3과 공동 제형화된 306-O12B LNP를 3mg/kg으로 투여하였다. (7일 및 100일 시점의 경우 n = 5, 150일 시점의 경우 n = 3).
도 17은 지질을 표적으로 하는 대표적인 간을 보여준다.
도 18a-18d는 다양한 지질의 주사 효과를 보여준다. 이들은 생체 외 - 8시간- 주사 후를 보여준다.
도 19a-19e는 Ai14 Cre/lox 리포터 마우스를 사용하여 형질감염된 폐세포 유형의 분석을 보여준다. 제형: 지질/Chol/DOPC/DMG-PEG = 50/38.5/10/1.5(몰비), 지질/mRNA = 12.5/1(중량비), 투여량: 0.5mg/kg(10ug/마우스)(변형되지 않은 fLuc-mRNA).
도 19d는 주사 6시간 후 폐의 루시퍼라제 단백질/총 단백질을 보여준다.
도 19e는 Ai14 Cre/lox 리포터 마우스를 사용하여 형질감염된 폐세포 유형의 분석을 보여준다.
도 20은 생체 내 Cre-mRNA 전달 - 306-N16B, Cre-mRNA 투여량에 대한 개략도를 보여준다: 7.5ug/마우스/주사, 총 2회 주사.
도 21a-21c는 mRNA 캡슐화된 LNP의 생체 내 선택성이 활성 리피도이드의 화학 구조에 의해 좌우됨을 예시한다. 도 21a는 리피도이드 테일에서 링커 그룹의 단순 변경에 의한 mRNA 로딩된 LNP의 생체 내 기관 표적화 거동의 미세 조정의 개략도이다.
도 21b는 리피도이드의 합성 경로 및 대표적인 화학 구조를 보여준다.
도 21c는 IVIS 영상화 시스템으로 촬영된 마우스의 대표적인 전신 생물발광 이미지를 보여준다. Luc mRNA 로딩된 306-O12B LNP 또는 306-N12B LNP를 0.5mg/kg의 단일 용량으로 마우스에 주사하였다. 주사 6시간 후에 사진을 찍었다. (n = 3).
도 22a 및 22b는 링커 통제된 폐 선택성(linker-governed lung selectivity)이 확인된 N-시리즈 LNP의 2세대 라이브러리를 보여준다. N16B 테일을 도 22a에 나타낸 아민과 반응시켜 2세대 N-시리즈 LNP를 생성하였다.
도 22b는 IVIS 이미지가 N-시리즈 LNP가 fLuc mRNA의 폐로의 특이적 전달을 매개함을 보여주었다는 것을 보여준다.
도 23a-23d는 306-N16B LNP가 폐 내피 세포로의 Cre mRNA의 특이적 전달을 가능하게 한다는 것을 예시한다. 도 23a는 tdTomato 트랜스제닉 Ai14 마우스에서 정지 카세트(stop cassette)의 Cre 매개된 유전적 결실을 통해 tdTomato 발현을 활성화하기 위해 Cre mRNA를 폐로 전달하는 개략도를 보여준다.
도 23b는 IVIS 이미징 시스템을 사용하여 캡처한 편집된 Ai14 마우스 기관에서 tdTomato 형광의 대표적인 생체 외 이미지를 보여준다. 마우스에 Cre mRNA 로딩된 306-N16B LNP를 0.75mg mRNA 당량/kg의 단일 용량으로 i.v. 주사하였다.
도 23c는 공초점 현미경으로 찍은 폐 조직의 대표적인 면역형광 이미지를 보여준다. 내피세포는 FITC-CD31 항체로 염색하고, 상피세포는 CD326-APC 항체로 염색하고, 대식세포는 F4/80-eFluor 660 항체로 염색하였다. 바: 20μm.
도 23d는 FACS에 의한 폐의 규정된 세포 유형 내 tdTomato+ 세포의 백분율의 정량화를 보여준다. (n = 3).
도 24a-24e는 코로나 성분의 생물정보학적 분류를 보여준다. 도 24a는 306-O12B LNP의 단백질 코로나에서 상위 3개 단백질 성분의 총 단백질의 % 정량화를 보여준다(n=3).
도 24b는 306-N16B LNP의 단백질 코로나에서 상위 3개 단백질 성분의 총 단백질의 % 정량화를 보여준다(n=3).
도 24c는 계산된 분자량에 기초하여 분류된 가장 풍부한 코로나 단백질 상위 20개를 보여준다.
도 24d는 가장 풍부한 코로나 단백질 상위 20개를 이의 등전점에 기초하여 분류한 것을 보여준다.
도 24e는 생물학적 기능에 기초하여 분류된 가장 풍부한 코로나 단백질 상위 20개을 보여준다.
도 25a는 306-O12B 및 306-N16 LNP로 처리된 마우스에서 루시퍼라제 단백질 발현의 분포를 보여준다. mRNA 캡슐화된 306-O12B LNP 투여 6시간 후 마우스 기관의 생체 외 이미지 및 다른 기관의 루시퍼라제 단백질 정량화.
도 25b는 306-O12B 및 306-N16 LNP로 처리된 마우스에서 루시퍼라제 단백질 발현의 분포를 보여준다. mRNA 캡슐화된 306-N16B LNP 투여 6시간 후 마우스 기관의 생체 외 이미지 및 다른 기관의 루시퍼라제 단백질 정량화.
도 26은 Cas9 mRNA와 공동 제형화된 306-N16B LNP의 주사 후 Babl/c 마우스의 상이한 기관에서의 Cas9 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 투여량: 0.5mg 당량 Cas 9 mRNA/kg. 기관은 주입 후 6시간에 수집하였다.
도 27은 306-O12B LNP(연녹색) 및 306-N16B LNP(연청색)에 흡수된 공통 및 고유 단백질을 보여주는 벤다이어그램이다.
도 28a-28c는 N-시리즈 LNP의 합성 및 생체 내 스크리닝을 보여준다.
도 28a는 리피도이드의 합성 경로 및 대표적인 화학 구조를 보여준다. 마우스의 대표적인 전신 생물발광 이미지.
도 28b 및 도 28c는 IVIS 이미징 시스템으로 측정된 N-시리즈 LNP의 생체 내 mRNA 전달 효능을 보여준다. 마우스에 Luc mRNA 로딩된 N-시리즈 LNP를 0.5mg/kg의 단일 용량으로 주사하였다. 주입 후 6시간에 이미지를 촬영하였다. (n = 3).
도 29a-29c는 N-시리즈 LNP의 헤드 구조를 조정함으로써 상이한 폐세포 유형이 표적화될 수 있음을 보여준다.
도 29a는 tdTomato 트랜스제닉 Ai14 마우스에서 정지 카세트의 Cre 매개된 유전적 결실을 통해 tdTomato 발현을 활성화하기 위해 Cre mRNA를 폐로 전달하는 개략도를 보여준다.
도 29b는 화학 구조, IVIS 이미징 시스템을 사용하여 캡처한 편집된 Ai14 마우스 기관에서 tdTomato 형광의 대표적인 생체 외 이미지, 공초점 현미경으로 촬영한 폐 조직의 대표적인 면역형광 이미지, 및 306-N16B LNP의 FACS에 의한 폐의 규정된 세포 유형 내 tdTomato+ 세포의 백분율 정량화를 보여준다. 마우스에 Cre mRNA 로딩된 LNP를 0.75mg mRNA 당량/kg의 단일 용량으로 i.v. 주사하였다. 내피 세포는 FITC-CD31 항체로 염색하고, 상피 세포는 CD326-PE-Cy7 항체로 염색하고, 대식세포는 F4/80-eFluor 660 항체로 염색하였다. 바: 20μm. FACS에 의한 폐의 규정된 세포 유형 내 tdTomato+ 세포의 백분율 정량화. (n = 3).
도 29c는 화학 구조, IVIS 이미징 시스템을 사용하여 캡처한 편집된 Ai14 마우스 기관에서 tdTomato 형광의 대표적인 생체 외 이미지, 공초점 현미경으로 촬영한 폐 조직의 대표적인 면역형광 이미지, 및 113-N16B LNP에 의한 폐의 규정된 세포 유형 내 tdTomato+ 세포의 백분율 정량화를 보여준다. 마우스에 Cre mRNA 로딩된 LNP를 0.75mg mRNA 당량/kg의 단일 용량으로 i.v. 주사하였다. 내피 세포는 FITC-CD31 항체로 염색하고, 상피 세포는 CD326-PE-Cy7 항체로 염색하고, 대식세포는 F4/80-eFluor 660 항체로 염색하였다. 바: 20μm. FACS에 의한 폐의 규정된 세포 유형 내 tdTomato+ 세포의 백분율 정량화. (n = 3).
도 30a-30b는 LNP에 형성된 단백질 코로나의 프로테오믹스(proteomics) 연구를 보여준다.
도 30a는 O- 및 N-시리즈 LNP의 상이한 기관 표적화 가능성(targetability)의 개략도이다.
도 30b는 혈관 내 단백질과 LNP의 상호작용의 개략도를 보여준다.
도 31a는 Ai14 마우스에서 tdTomato 발현을 활성화하기 위한 Cas9 mRNA 및 sgLoxP의 동시 전달의 개략도이다.
도 31b는 Ca9 mRNA 및 sgLoxP가 공동 로딩된 306-N16B LNP로 처리된 트랜스제닉 Ai14 마우스로부터 수집한 기관의 대표적인 생체 외 이미지를 보여준다. 1.67mg/kg의 총 RNA 용량으로 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주사하였다.
도 31c는 Cas9 mRNA 및 sgLoxP가 공동 캡슐화된 306-N16B LNP로 처리된 Ai14 마우스로부터 절개한 폐 및 간의 대표적인 현미경 이미지를 보여준다. 바: 100μm
도 32a-32c는 하이브리드 LNP(hLNP)가 생체 내에서 TTJ 종양 세포로의 mRNA의 특이적 전달을 가능하게 한다는 것을 보여준다.
도 32a는 하이브리드 LNP 제조의 개략도이다. hLNP는 306-N16B:306-O12B:콜레스테롤:DOPC:DMG-PEG2000의 25:25:38.5:10:1.5의 몰비로 제형화되었다.
도 32b는 마우스 LAM 폐에서 EGFP의 면역조직화학(IHC) 분석의 대표적인 이미지를 보여준다. 동계(syngeneic) C57BL/6J 마우스에 TSC2-결핍(deficient) TTJ 세포를 꼬리 정맥에 주사하여 폐에 종양 결절을 형성하였다. 마우스에 GFP mRNA가 로딩된 hLNP를 꼬리 정맥 주사하였다. 주사 6시간 후에 폐를 수집하였다.
도 32c는 pS6(종양 세포의 마커) 및 EGFP의 공동 국소화를 보여주는 다중 면역형광 염색이다. (왼쪽) pS6의 염색; (오른쪽) EGFP의 염색.
도 33a-33e는 항종양 성장에서 TSC2 mRNA 로딩된 hLNP의 치료 효과를 보여준다.
도 33a는 치료 설계를 보여준다. 동계 C57BL/6J 마우스에 2×106개의 TSC2-결핍 TTJ 세포를 꼬리 정맥 주사하여 폐에 종양 결절을 형성하였다. 종양 세포 접종 후 24일차에, 마우스를 3개의 그룹으로 무작위로 배정하였다: 미처리 대조군, 빈 LNP 처리, 및 LNP/mRNA-TSC2(주사당 mRNA 0.75mg/kg) 처리. 마우스는 격일로 총 5회 처리하였다. (n = 2).
도 33b는 상이한 처리를 받은 마우스로부터 절개한 폐의 H&E 이미지를 보여준다.
도 33c는 3개의 치료 그룹에서 폐당 종양 결절의 분율을 보여준다.
도 33d는 빈 hLNP 및 TSC2 mRNA 로딩된 hLNP에서 ki67, 절단된 카스파제 3, 대식세포 및 CD3의 IHC 평가의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 33e는 도 33d의 정량 분석을 보여준다. 각 그룹에 대해 10개의 이미지를 분석하였다. T 세포: CD3 IHC; 아폽토시스: 절단된 카스파제 3 IHC; 증식: Ki67 IHC; 대식세포: F4/80 IHC.
도 34a는 TTJ 세포에서 LNP의 시험관 내 형질감염 효율을 보여준다. 유세포분석으로 측정한 EGFP 양성 TTJ 세포의 백분율.
도 34b는 형질감염된 세포의 대표적인 형광 EGFP 이미지를 보여준다.
도 35a는 생체분석기로 평가된 전장 마우스 Tsc2 mRNA의 시험관 내 전사를 보여주며, mRNA의 무결성 및 전장을 보여준다.
도 35b는 면역블롯팅이 마우스 유래 TSC2-결손(null) TTJ 세포에서 야생형 Tsc2 mRNA 재발현에 의한 포스포-S6의 억제를 보여준다는 것을 보여준다.
도 35c는 생체분석기로 평가된 전장 인간 TSC2 mRNA의 시험관 내 전사를 보여준다.
도 35d는 면역블롯팅이 환자 유래 TSC2-결핍 세포에서 야생형 TSC2 mRNA 재발현에 의한 포스포-S6의 억제를 보여준다는 것을 보여준다. 621-101: 환자 유래 TSC2-결핍 세포; 621-103: 621-101 세포에서 TSC2 재발현됨; 마지막 2개의 컬럼: 24시간 동안 621-101 세포에 대한 TSC2 mRNA 처리된 2개의 복제물
도 36은 다양한 처리를 받은 마우스로부터 절개한 폐의 대표 이미지를 보여준다(각 그룹에서 n = 2 마우스).
한 측면에서, Cas9 mRNA의 간 전달을 위한 매우 강력한 신규 비바이러스성 LNP 매개된 CRISPR-Cas9 전달 시스템이 개시되며, Angptl3 유전자를 표적화함으로써 그 효능을 입증한다. 상기 시스템은 부형제 지질 분자의 최적화된 혼합물과 공동 제형화된 선도적인 테일-분지형(tail-branched) 생환원성 리피도이드(306-O12B)로 구성되어 있으며, SpCas9 mRNA 및 Angptl3을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgAngptl3)를 적어도 단일 투여를 통해 성공적으로 동시 전달한다(도 1).
라이브러리 스크리닝 접근법을 사용하여 mRNA를 간으로 전달하는 경향이 있는 O-시리즈 LNP(테일에 에스테르 결합 함유)와 달리 N-시리즈 LNP(테일에 아미드 결합 함유)는 mRNA를 마우스 폐에 선택적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 단백질 코로나는 LC/MS를 사용하여 간 및 폐 표적화 LNP에서 분석하였으며 이러한 LNP의 표적화 가능성에 기여할 수 있는 표면에 특이적으로 흡수된 고유 혈장 단백질 그룹을 확인하였다. 리피도이드 테일 구조는 LNP와 혈청 단백질의 상호작용에 중대한 영향을 미치며 LNP의 기관-선택성을 실질적으로 통제한다. N-시리즈 LNP의 헤드 그룹 구조를 간단히 조정하여 다양한 폐세포 유형을 표적화할 수 있다. LNP 기반 RNA 치료의 첫 번째 성공은 Tsc2 유전자의 기능 상실 돌연변이로 인한 파괴적인 폐 질환인 림프관평활근종증(Lymphangioleiomyomatosis, LAM)의 전임상 모델에서 입증되었다. LNP를 표적으로 하는 폐는 종양에서 TSC2 종양 억제제의 회복을 위한 마우스 복합 결절성 경화증 2(Tuberous Sclerosis Complex 2, Tsc2) mRNA의 매우 효율적인 전달을 나타냈고, 종양 부하를 감소시키는 현저한 치료 효과를 달성하였다. 전반적으로, 이 연구는 mRNA 기반 치료를 위한 차세대 기관 및 세포 표적화 LNP의 합리적이고 예측 가능한 설계 및 조작에 대한 새로운 통찰력을 제공한다.
생체 내 특정 기관 및 세포로의 메신저 RNA(mRNA)의 안전하고 효과적인 전신 전달은 mRNA 기반 치료제 개발의 주요 과제로 남아 있다. mRNA와 공동 제형화된 전신 투여되는 지질 나노입자(LNP)의 표적화는 주로 간 및 비장에 국한되어 왔다. 현재의 LNP 개발 전략은 주로 노동력 및 비용 집약적인 시험관 내 및 생체 내 스크리닝 과정에 의존하며 현재 예측 가능한 방식으로 조직 특이적 표적화 LNP를 설계하는 것은 어려운 일이다. 라이브러리 스크리닝 접근법을 사용하여 mRNA를 간으로 전달하는 경향이 있는 O-시리즈 LNP(테일에 에스테르 결합 함유)와 달리 N-시리즈 LNP(테일에 아미드 결합 함유)는 mRNA를 마우스 폐에 선택적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 단백질 코로나는 LC/MS를 사용하여 간 및 폐 표적화 LNP에서 분석하였으며 이러한 LNP의 표적화 가능성에 기여할 수 있는 표면에 특이적으로 흡수된 고유 혈장 단백질 그룹을 확인하였다. 리피도이드 테일 구조는 LNP와 혈청 단백질의 상호작용에 중대한 영향을 미치며 LNP의 기관-선택성을 실질적으로 통제한다. N-시리즈 LNP의 헤드 그룹 구조를 간단히 조정하여 다양한 폐세포 유형을 표적화할 수 있다. 중요하게도, LNP 기반 RNA 치료의 첫 번째 성공은 Tsc2 유전자의 기능 상실 돌연변이로 인해 발생하는 파괴적인 폐 질환인 림프관평활근종증(LAM)의 전임상 모델에서 입증되었다. LNP를 표적으로 하는 개시된 폐는 종양에서 TSC2 종양 억제제의 회복을 위한 마우스 복합 결절성 경화증 2(Tsc2) mRNA의 매우 효율적인 전달을 나타냈고, 종양 부하를 감소시키는 현저한 치료 효과를 달성하였다. 전반적으로, 이 연구는 mRNA 기반 치료를 위한 차세대 기관 및 세포 표적화 LNP의 합리적이고 예측 가능한 설계 및 조작에 대한 새로운 통찰력을 제공한다.
표적화 LNP 개발의 주요 장애물은 나노입자(NP)와 생물학적 구성 요소 간의 나노-바이오 상호작용에 대한 제한된 이해로 인해 새롭게 설계된 LNP의 생체 내 표적화 거동을 예측하는 데 어려움이 있다는 것이다. NP의 외부 표면은 NP의 표면 특성을 개조하고 NP와 기관 및 세포의 상호작용에 실질적으로 영향을 미치는 "단백질 코로나"라고 하는 혈청 단백질 층으로 빠르게 덮일 수 있다. 리피도이드 아민 헤드 구조는 전달 효능 및 심지어 mRNA 로딩된 LNP의 생체 내 표적화 가능성에 영향을 미칠 수 있다. 이미다졸 기반 합성 리피도이드는 우선적으로 mRNA를 비장으로 표적화한다(X. Zhao 등, Imidazole-Based Synthetic Lipidoids for In Vivo mRNA Delivery into Primary T Lymphocytes. Angew Chem Int Ed Engl 59, 20083-20089 (2020). 리피도이드 테일 화학의 경우, 리피도이드 테일 길이, 불포화 정도 및 mRNA 전달 효능의 영향에 대한 분지 정도에 대한 이해에서 상당한 진전이 있었지만 LNP의 생체 내 선택성에 대한 리피도이드 테일 구조의 영향은 잘 이해되지 않고 있다.
이 중요한 지식 격차를 해소하기 위해, 아민 헤드와 아크릴아미드 테일 사이의 마이클 첨가(Michael-Addition) 반응을 통해 아미드 결합 함유 리피도이드(N-시리즈 LNP)의 라이브러리를 합성하였다(도 28a). 놀랍게도, 생체 내 스크리닝으로부터, 전신 투여 후 N-시리즈 LNP가 거의 독점적으로 mRNA를 폐로 전달하는 것으로 밝혀졌다(도 28b 및 28c). 이전 연구에서는 테일에 에스테르 결합을 함유하는 O-시리즈 리피도이드가 mRNA를 간으로 전달하는 경향이 있음이 입증되었다(M. Qiu 등, Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118, e2020401118 (2021)). 이러한 작은 변화가 그러한 현저한 기관 특이성을 유발하는 이유를 더 잘 이해하기 위해 이러한 전달 차이의 기본 메커니즘을 추가로 조사하였다. LNP는 일단 혈류에 주입되면 특정 혈장 단백질의 흡착을 선택적으로 통제하여 LNP를 선택된 기관으로 보내는 표적화 리간드 역할을 할 수 있다. 실제로, 프로테오믹스를 사용하여 LNP의 표적화 가능성에 영향을 줄 수 있는, 두 가지 대표적인 LNP 후보인 306-O12B 및 306-N16B의 표면에 특이적으로 흡수되는 고유 혈장 단백질 그룹을 확인하였다. 더 중요한 것은 N-시리즈 LNP의 리피도이드 헤드 구조를 변경하여 상이한 폐 세포 이하(subcellular) 집단을 표적으로 삼을 수 있다는 것이다. 또한, 이중대립유전자 돌연변이(biallelic mutation) 및 TSC 복합 유전자의 기능 상실에 의해 유발되는 희귀 유전 질환인 폐 림프관평활근종증(LAM)의 치료를 위한 TSC2 종양 억제제의 발현을 회복시키기 위해 Tsc2 mRNA의 Tsc2-결핍 세포로의 생체 내 표적 전달에 대해 폐를 표적으로 하는 LNP를 평가하였다. 이 연구는 간단한 화학을 통해 단백질 코로나의 구성을 조정함으로써 LNP의 생체 내 기관 표적화 거동을 조정할 수 있다는 개념 증명을 제공한다. 이 작업은 mRNA 기반 치료를 위한 매우 특이적인 기관 및 세포 선택적 LNP의 합리적 설계를 위한 새로운 전략을 제공한다.
한 측면에서, 개시된 것은
약제학적 조성물
본 발명의 조성물 및 방법은 이를 필요로 하는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 약제학적 조성물은 치료적 또는 예방적 조성물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리피도이드 조성물은 항원, 면역 조절제, 또는 이들의 임의의 조합과 조립될 수 있다. 특정 실시양태에서, 개체는 포유동물, 예컨대 인간 또는 인간이 아닌 포유동물이다. 인간과 같은 동물에게 투여되는 경우, 상기 조성물 또는 리피도이드 조성물은 바람직하게는, 예를 들어, 본 발명의 리피도이드 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 투여된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 물 또는 생리학적 완충 식염수와 같은 수용액, 또는 글리콜, 글리세롤, 올리브 오일과 같은 오일 또는 주사 가능한 유기 에스테르와 같은 다른 용매 또는 비히클을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 약제학적 조성물이 인간 투여용, 특히 침습성 투여 경로(즉, 상피 장벽을 통한 수송 또는 확산을 회피하는 주사 또는 이식과 같은 경로)용일 때, 수용액은 발열원이 없거나(pyrogen-free), 실질적으로 발열원이 없다. 부형제는, 예를 들어, 작용제의 지연 방출을 수행하거나 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관을 선택적으로 표적화하도록 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 정제, 캡슐제(스프링클 캡슐제(sprinkle capsule) 및 젤라틴 캡슐제 포함), 입제, 재구성을 위한 동결건조물, 산제, 용액제, 시럽, 좌약, 주사제 등과 같은 투여 단위 형태일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 경피 전달 시스템, 예를 들어, 피부 패치에 존재할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 로션, 크림 또는 연고와 같은 국소 투여에 적합한 용액에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 본 발명의 리피도이드 조성물과 같은 리피도이드 조성물의 흡수를 증가시키거나 안정화시키거나 용해도를 증가시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용되는 작용제를 함유할 수 있다. 이러한 생리학적으로 허용되는 작용제는, 예를 들어, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 기타 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 생리학적으로 허용되는 작용제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은, 예를 들어, 조성물의 투여 경로에 따라 달라진다. 제제(preparation) 또는 약제학적 조성물은 자가 유화 약물 전달 시스템(self-emulsifying drug delivery system) 또는 자가 미세유화 약물 전달 시스템(self-microemulsifying drug delivery system)일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물(제제)은, 예를 들어, 본 발명의 리피도이드 조성물과 같이 내부에 혼입될 수 있는 리포좀 또는 다른 중합체 매트릭스일 수 있다. 예를 들어, 인지질 또는 다른 지질을 포함하는 리포좀은 무독성이고, 생리학적으로 허용되며, 비교적 간단하게 만들고 투여할 수 있는 대사 가능한 담체이다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 어구는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 합당한 이익/위험 비율과 잘 맞는, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 리피도이드 조성물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 어구는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트(powdered tragacanth); (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제(buffering agent), 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원 제거수(pyrogen-free water); (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산염 버퍼 용액; 및 (21) 약제학적 제형에 사용되는 기타 무독성 상용성 물질.
약제학적 조성물(제제)은, 예를 들어, 경구(예를 들어, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액에서와 같은 관주(drench), 정제, 캡슐제(스프링클 캡슐제 및 젤라틴 캡슐제 포함), 볼루스(bolus), 산제, 입제, 혀 도포용 페이스트); 구강 점막을 통한 흡수(예를 들어, 설하); 피하; 경피(예를 들어, 피부에 적용되는 패치로서); 및 국소(예를 들어, 피부에 바르는 크림, 연고 또는 스프레이)를 포함하는 다수의 투여 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 또한, 리피도이드 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 리피도이드 조성물은 단순히 멸균수에 용해되거나 현탁될 수 있다. 적절한 투여 경로 및 그에 적합한 조성물의 세부사항은, 예를 들어, 미국 특허 제6,110,973호, 제5,763,493호, 제5,731,000호, 제5,541,231호, 제5,427,798호, 제5,358,970호 및 제4,172,896호와 여기에 인용된 특허에서 찾을 수 있다.
제형은 편리하게는 단위 투여형으로 제공될 수 있고 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주, 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 리피도이드 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이 양은, 100% 중에서, 활성 성분의 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30% 범위일 것이다.
이러한 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 활성 조성물, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 리피도이드(예를 들어, 나노입자) 조성물을 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기술된 바와 같은 리피도이드(예를 들어, 나노입자) 조성물을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체, 또는 이들 모두와 균일하고 친밀하게 회합시킨 다음, 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 캡슐제(스프링클 캡슐제 및 젤라틴 캡슐제 포함), 카세제(cachet), 환제, 정제, 로젠지(풍미 기재, 보통 수크로즈 및 아카시아 또는 트라가칸트 사용), 동결건조물, 산제, 입제, 또는 수성 또는 비수성 액체 중 용액제 또는 현탁액제, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르(elixir) 또는 시럽, 또는 파스티유(pastille)(젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로즈 및 아카시아와 같은 불활성 염기 사용) 및/또는 구강 세정제 등의 형태일 수 있으며, 각각 활성 성분으로서 본 발명의 본원에 기술된 바와 같은 리피도이드(예를 들어, 나노입자) 조성물의 미리 결정된 양을 함유한다. 또한, 리피도이드 조성물은 볼루스, 연약(electuary) 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여형(캡슐제(스프링클 캡슐제 및 젤라틴 캡슐제 포함), 정제, 환제, 드라제(dragee), 산제, 입제 등)을 제조하기 위해, 활성 성분을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 인산이칼슘, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합한다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 리피도이드 조성물; (7) 습윤제, 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물; (10) 착화제, 예컨대 변형 및 비변형 사이클로덱스트린; 및 (11) 착색제. 캡슐제(스프링클 캡슐제 및 젤라틴 캡슐제 포함), 정제 및 환제의 경우, 약제학적 조성물은 완충제도 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당(milk sugar)과 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로도 사용될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형으로 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스), 계면활성제 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말형 리피도이드 조성물의 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 만들 수 있다.
약제학적 조성물의 정제 및 기타 고체 투여형, 예컨대 드라제, 캡슐제(스프링클 캡슐제 및 젤라틴 캡슐제 포함), 환제 및 입제는 선택적으로 코팅 및 쉘, 예컨대 장용 코팅 및 약제학적 제형화 분야에서 잘 알려진 다른 코팅으로 스코어링되거나 제조될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 원하는 방출 프로파일, 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구를 제공하기 위해 다양한 비율로, 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스를 사용하여 활성 성분의 서방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 직전에 멸균수 또는 일부 다른 멸균 주사 가능한 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있고 활성 성분(들)만을 방출하거나 우선적으로 위장관의 특정 부분에서 선택적으로 지연 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 매립 조성물(embedding composition)의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한 적절하다면 상술된 부형제 중 하나 이상과 함께 마이크로-캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여에 유용한 액체 투여형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 재구성을 위한 동결건조물, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 액체 투여형은 활성 성분에 더하여 당업계에서 통상 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
또한, 경구용 조성물은 불활성 희석제 외에도 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 향미제 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
현탁액제는 활성 리피도이드 조성물에 더하여 현탁제, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
국소 또는 경피 투여용 투여형은 산제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 리피도이드 조성물은 멸균 조건 하에서 약제학적으로 허용되는 담체 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 버퍼 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 젤은 활성 리피도이드 조성물에 더하여 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 함유할 수 있다.
산제 및 스프레이는 활성 리피도이드 조성물에 더하여 락토스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이들 물질의 혼합물과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로하이드로카본 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판과 같은 통상적인 분사제를 추가로 함유할 수 있다.
경피 패치는 신체에 본 발명의 리피도이드 조성물의 제어된 전달을 제공하는 부가적인 이점이 있다. 이러한 투여형은 활성 리피도이드 조성물을 적절한 매질에 용해 또는 분산시켜 제조할 수 있다. 또한, 피부를 가로지르는 리피도이드 조성물의 플럭스를 증가시키기 위해 흡수 증진제가 사용될 수 있다. 이러한 플럭스의 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 젤에 리피도이드 조성물을 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
본원에서 사용되는 "비경구 투여(parenteral administration)" 및 "비경구 투여되는(administered parenterally)"이라는 어구는 경장(enteral) 및 국소 투여 이외의, 대개 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 피막 내(intracapsular), 안와 내(intraorbital), 심장 내, 피 내, 복강 내, 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 피부 밑(subcuticular), 관절 내, 피막하, 지주막하, 척수 내 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다. 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전 멸균 주사액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 하나 이상의 활성 리피도이드 조성물을 포함하며, 항산화제, 버퍼, 정균제, 의도된 수용자의 혈액과 제형을 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 사용하여 유지할 수 있다.
또한, 이러한 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 보장될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사 가능한 약제학적 형태의 장기간 흡수를 야기할 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 지속시키기 위해 피하 또는 근육 내 주사를 통해 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 수용성이 불량한 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성할 수 있다. 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 다르며, 결국 결정 크기 및 결정 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여되는 약물 형태의 지연 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사 가능한 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에서 대상 리피도이드 조성물의 마이크로캡슐화 매트릭스를 형성함으로써 제조한다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 또한, 주사 가능한 데포 제형은 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포획하여 제조한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위해, 활성 리피도이드 조성물은 그 자체로 제공되거나, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 예를 들어, 0.1 내지 99.5%(더욱 바람직하게는 0.5 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.
또한, 도입 방법은 재충전식 또는 생분해성 장치에 의해 제공될 수 있다. 다양한 서방형 중합체 장치가 최근 몇 년 동안 단백질성 생물약제를 포함한 약물의 제어된 전달을 위해 개발되고 생체 내에서 시험되었다. 생분해성 및 비분해성 중합체 모두를 포함하는 다양한 생체적합성 중합체(하이드로젤(hydrogel) 포함)가 특정 표적 부위에서 리피도이드 조성물의 지속 방출을 위한 이식체를 형성하는 데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 유독하지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변경될 수 있다.
선택되는 투여량 수준은 특정 리피도이드 조성물 또는 사용되는 리피도이드 조성물의 조합, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 리피도이드 조성물(들)의 배출 속도, 치료 기간, 다른 약물, 사용되는 특정 리피도이드 조성물(들)과 함께 사용되는 리피도이드 조성물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
당업계의 숙련된 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약제학적 조성물 또는 리피도이드 조성물의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 낮은 수준에서 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. "치료적 유효량"이란 원하는 치료 효과를 도출하기에 충분한 리피도이드 조성물의 농도를 의미한다. 리피도이드 조성물의 유효량은 대상체의 체중, 성별, 연령 및 병력에 따라 달라질 것이라는 것이 일반적으로 이해된다. 유효량에 영향을 미치는 다른 인자는 환자 병태의 중증도, 치료되는 장애, 리피도이드 조성물의 안정성, 및 원하는 경우 본 발명의 리피도이드 조성물과 함께 투여되는 다른 유형의 치료제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 작용제를 여러 번 투여하면 더 큰 총 용량을 전달할 수 있다. 효능 및 투여량을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(Isselbacher 등, (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882, 본원에 참조로 포함됨).
일반적으로, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 활성 리피도이드 조성물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 가장 낮은 용량인 리피도이드 조성물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상술한 인자에 따라 달라진다.
원하는 경우, 활성 리피도이드 조성물의 1일 유효 용량은 선택적으로 단위 투여형으로 하루 종일 적절한 간격으로 별도로 투여되는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 하위 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 활성 리피도이드 조성물은 1일 2회 또는 3회 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성 리피도이드 조성물은 1일 1회 투여될 것이다.
이 치료를 받는 환자는 일반적으로 영장류, 특히 인간; 및 말, 소, 돼지, 양, 고양이 및 개와 같은 기타 포유동물; 가금류; 애완 동물을 포함한 필요한 임의의 동물이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 리피도이드 조성물은 단독으로 또는 다른 유형의 치료제와 공동으로 투여될 수 있다.
본 개시내용은 본 발명의 조성물 및 방법에서 본 발명의 리피도이드 조성물의 약제학적으로 허용되는 염의 용도를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 고려되는 염은 알킬, 디알킬, 트리알킬 또는 테트라-알킬 암모늄염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 고려되는 염은 L-아르기닌, 베넨타민(benenthamine), 벤자틴(benzathine), 베타인(betaine), 수산화칼슘, 콜린(choline), 데아놀(deanol), 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 하이드라바민(hydrabamine), 1H-이미다졸, 리튬, L-라이신, 마그네슘, 4-(2-하이드록시에틸)모르폴린, 피페라진, 칼륨, 1-(2-하이드록시에틸)피롤리딘, 나트륨, 트리에탄올아민, 트로메타민(tromethamine) 및 아연 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 고려되는 염은 Na, Ca, K, Mg, Zn 또는 기타 금속 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 고려되는 염은 1-하이드록시-2-나프토산, 2,2-디클로로아세트산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-옥소글루타르산, 4-아세트아미도벤조산, 4-아미노살리실산, 아세트산, 아디프산, l-아스코르브산, l-아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, (+)-캄퍼산(camphoric acid), (+)-캄퍼-10-설폰산, 카프르산(데칸산), 카프로산(헥산산), 카프릴산(옥탄산), 탄산(carbonic acid), 신남산, 시트르산, 사이클라민산(cyclamic acid), 도데실황산(dodecylsulfuric acid), 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산(galactaric acid), 겐티스산(gentisic acid), d-글루코헵톤산(glucoheptonic acid), d-글루콘산(gluconic acid), d-글루쿠론산(glucuronic acid), 글루탐산, 글루타르산, 글리세로인산(glycerophosphoric acid), 글리콜산, 히푸르산(hippuric acid), 브롬화수소산, 염산, 이소부티르산, 락트산, 락토바이온산(lactobionic acid), 라우르산, 말레산, l-말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 니코틴산, 질산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, l-피로글루탐산, 살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 황산, l-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 및 운데실렌산(undecylenic acid) 산 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용되는 산 부가염은 물, 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드 등과 같은 다양한 용매화물로도 존재할 수 있다. 이러한 용매화물의 혼합물이 또한 제조될 수 있다. 이러한 용매화물의 공급원은 결정화 용매로부터 유래되거나, 제조 또는 결정화 용매에 내재되어 있거나 이러한 용매에 우연히 있을 수 있다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 향료, 방부제 및 항산화제도 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미이다. 일반적으로, 본원에 기술된 화학, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 신경생물학, 신경화학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 약리학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 달리 나타내지 않는 한, 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적인 참고문헌과 더 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, "Principles of Neural Science", McGraw-Hill Medical, New York, N.Y. (2000); Motulsky, "Intuitive Biostatistics", Oxford University Press, Inc. (1995); Lodish 등, "Molecular Cell Biology, 4th ed.", W. H. Freeman & Co., New York (2000); Griffiths 등, "Introduction to Genetic Analysis, 7th ed.", W. H. Freeman & Co., N.Y. (1999); 및 Gilbert 등, "Developmental Biology, 6th ed.", Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (2000) 참조.
본원에서 사용되는 화학 용어는 본원에서 달리 정의되지 않는 한, "The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms", Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985)에 예시된 바와 같이 당업계의 통상적인 용법에 따라 사용된다.
상기 모든 것, 및 본 출원에서 언급된 임의의 다른 간행물, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 상충하는 경우, 특정 정의를 포함하여 본 명세서가 우선한다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 뒤에 기술되는 이벤트 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 상기 기술이 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우뿐만 아니라 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은 알킬이 치환될 수 있을 뿐만 아니라 알킬이 치환되지 않은 경우를 지칭한다.
본 발명의 화합물 상의 치환체 및 치환 패턴은 쉽게 구할 수 있는 출발 물질로부터 당업계에 공지된 기술뿐만 아니라 아래에 제시된 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있는 화학적으로 안정한 화합물을 생성하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있다. 치환체 자체가 하나 초과의 그룹으로 치환되는 경우, 이러한 다중 그룹은 안정한 구조가 생성되는 한 동일한 탄소 또는 상이한 탄소에 있을 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적으로 치환된"은 주어진 구조에서 1 내지 6개의 수소 라디칼이 하이드록실, 하이드록시알킬, 알콕시, 할로겐, 알킬, 니트로, 실릴, 아실, 아실옥시, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아미노, 아미노알킬, 시아노, 할로알킬, 할로알콕시, -OCO-CH2-O-알킬, -OP(O)(O-알킬)2 또는 -CH2-OP(O)(O-알킬)2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 치환체의 라디칼로 대체된 것을 지칭한다. 바람직하게는, "선택적으로 치환된"은 주어진 구조에서 1 내지 4개의 수소 라디칼이 상기 언급된 치환체로 대체된 것을 지칭한다. 더 바람직하게는, 1 내지 3개의 수소 라디칼이 상기 언급된 치환체로 대체된다. 치환체는 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
"a", "an" 및 "the"와 같은 관사는 반대로 나타내거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 반대로 나타내거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 그룹의 구성원 중 하나, 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 관련이 있는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 정확히 그룹의 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 관련이 있는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 그룹의 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 그렇지 않으면 관련이 있는 실시양태를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 C1-C10 직쇄 알킬 그룹 또는 C1-C10 분지쇄 알킬 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포화 지방족 그룹을 지칭한다. 바람직하게는, "알킬" 그룹은 C1-C6 직쇄 알킬 그룹 또는 C1-C6 분지쇄 알킬 그룹을 지칭한다. 가장 바람직하게는, "알킬" 그룹은 C1-C4 직쇄 알킬 그룹 또는 C1-C4 분지쇄 알킬 그룹을 지칭한다. "알킬"의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 네오-펜틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 1-헵틸, 2-헵틸, 3-헵틸, 4-헵틸, 1-옥틸, 2-옥틸, 3-옥틸 또는 4-옥틸 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "알킬" 그룹은 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "아실"은 당해 분야에서 인지되어 있고 화학식 하이드로카빌C(O)-, 바람직하게는 알킬C(O)-로 표시되는 그룹을 지칭한다.
용어 "아실아미노"는 당해 분야에서 인지되어 있고 아실 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 지칭하며, 예를 들어, 화학식 하이드로카빌C(O)NH-로 표시될 수 있다.
용어 "아실옥시"는 당해 분야에서 인지되어 있고 화학식 하이드로카빌C(O)O-, 바람직하게는 알킬C(O)O-로 표시되는 그룹을 지칭한다.
용어 "알콕시"는 산소가 부착된 알킬 그룹을 지칭한다. 대표적인 알콕시 그룹은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, tert-부톡시 등을 포함한다.
용어 "알콕시알킬"은 알콕시 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭하며, 화학식 알킬-O-알킬로 표시될 수 있다.
용어 "알킬"은 직쇄 알킬 그룹, 분지쇄 알킬 그룹, 사이클로알킬(지환족) 그룹, 알킬 치환된 사이클로알킬 그룹 및 사이클로알킬 치환된 알킬 그룹을 포함하는 포화 지방족 그룹을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 백본에 30개 이하(예를 들어, 직쇄의 경우 C1-30, 분지쇄의 경우 C3-30), 더 바람직하게는 20개 이하의 탄소 원자를 갖는다.
또한, 명세서, 실시예 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "알킬"은 비치환 및 치환된 알킬 그룹 모두를 포함하는 것으로 의도되며, 후자는 트리플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등과 같은 할로알킬 그룹을 포함하는, 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소에 수소를 대체하는 치환체를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다.
용어 "Cx-y" 또는 "Cx-Cy"는 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시와 같은 화학적 모이어티와 함께 사용되는 경우 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 그룹을 포함하는 것을 의미한다. C0알킬은 해당 그룹이 말단 위치에 있는 경우 수소를 나타내고, 내부에 있는 경우 결합을 나타낸다. 예를 들어, C1-6알킬 그룹은 사슬에 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬아미노"는 적어도 하나의 알킬 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬티오"는 알킬 그룹으로 치환된 티올 그룹을 지칭하며 화학식 알킬S-로 표시될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미드"는 그룹 을 지칭하고,
여기서 R9 및 R10은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 그룹을 나타내거나, R9 및 R10은 이들이 부착된 N 원자와 함께 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다. 구성 질소 원자에 원자가에 필요한 그룹을 묘사하지 않고 아미드를 그리는 경우(예를 들어, -C(O)-NR9에서와 같이), 앞서 언급한 원자가 요구 사항을 충족하기 위해 수소 원자가 질소 원자에 존재하는 것으로 암시되고 이해된다.(예를 들어, -C(O)-NHR9에서와 같이).
용어 "아민" 및 "아미노"는 당해 분야에서 인지되어 있고 비치환 및 치환된 아민 및 이의 염, 예를 들어, 또는 로 나타낼 수 있는 모이어티를 지칭하며,
여기서 R9, R10 및 R10'은 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 그룹을 나타내거나, R9 및 R10은 이들이 부착된 N 원자와 함께 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노알킬"은 아미노 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "아르알킬"은 아릴 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 고리의 각 원자가 탄소인 치환 또는 비치환된 단일 고리 방향족 그룹을 포함한다. 바람직하게는, 고리는 5- 내지 7-원 고리, 더 바람직하게는 6-원 고리이다. 또한, 용어 "아릴"은 2개 이상의 탄소가 2개의 인접 고리에 공통인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서 고리 중 적어도 하나는 방향족이고, 예를 들어, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴이다. 아릴 그룹은 벤젠, 나프탈렌, 페난트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다.
용어 "카바메이트"는 당해 분야에 인지되어 있고 그룹 또는 를 지칭하며,
여기서 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 그룹을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "카보사이클릴알킬"은 카보사이클 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
용어 "카보사이클"은 5-7원 모노사이클릭 및 8-12원 바이사이클릭 고리를 포함한다. 바이사이클릭 카보사이클의 각 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 카보사이클은 2개의 고리 사이에 1개, 2개 또는 3개 이상의 원자가 공유되는 바이사이클릭 분자를 포함한다. 용어 "융합 카보사이클"은 각 고리가 다른 고리와 2개의 인접한 원자를 공유하는 바이사이클릭 카보사이클을 지칭한다. 융합 카보사이클의 각 고리는 포화, 불포화 및 방향족 고리로부터 선택될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 방향족 고리, 예를 들어, 페닐은 포화 또는 불포화 고리, 예를 들어, 사이클로헥산, 사이클로펜탄 또는 사이클로헥센에 융합될 수 있다. 원자가가 허용하는 한 포화, 불포화 및 방향족 바이사이클릭 고리의 임의의 조합이 카보사이클릭의 정의에 포함된다. 예시적인 "카보사이클"은 사이클로펜탄, 사이클로헥산, 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 1,5-사이클로옥타디엔, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌, 바이사이클로[4.2.0]옥트-3-엔, 나프탈렌 및 아다만탄을 포함한다. 예시적인 융합 카보사이클은 데칼린(decalin), 나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌, 바이사이클로[4.2.0]옥탄, 4,5,6,7-테트라하이드로-1H-인덴 및 바이사이클로[4.1.0]헵트-3-엔을 포함한다. "카보사이클"은 수소 원자를 보유할 수 있는 임의의 하나 이상의 위치가 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "카보사이클릴알킬"은 카보사이클 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
용어 "카보네이트"는 당해 분야에 인지되어 있고 -OCO2- 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "카복시"는 화학식 -CO2H로 표시되는 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "에스테르"는 -C(O)OR9 그룹을 지칭하며, 여기서 R9는 하이드로카빌 그룹을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "에테르"는 산소를 통해 다른 하이드로카빌 그룹에 연결된 하이드로카빌 그룹을 지칭한다. 따라서, 하이드로카빌 그룹의 에테르 치환체는 하이드로카빌-O-일 수 있다. 에테르는 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 에테르의 예는 헤테로사이클-O-헤테로사이클 및 아릴-O-헤테로사이클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에테르는 화학식 알킬-O-알킬로 표시될 수 있는 "알콕시알킬" 그룹을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "할로" 및 "할로겐"은 할로겐을 의미하고 클로로, 플루오로, 브로모 및 요오도를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤타르알킬" 및 "헤테로아르알킬"은 헤타릴 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 의미한다.
용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 치환 또는 비치환된 방향족 단일 고리 구조, 바람직하게는 5- 내지 7-원 고리, 더 바람직하게는 5- 내지 6-원 고리를 포함하며, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자, 더 바람직하게는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 또한, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 2개 이상의 탄소가 2개의 인접 고리에 공통인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서 고리 중 적어도 하나는 헤테로방향족이고, 예를 들어, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로아릴 그룹은, 예를 들어, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 질소, 산소 및 황이다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 의미한다.
용어 "헤테로사이클릴", "헤테로사이클" 및 "헤테로사이클릭"은 치환 또는 비치환된 비방향족 고리 구조, 바람직하게는 3- 내지 10-원 고리, 더 바람직하게는 3- 내지 7-원 고리를 지칭하며, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 바람직하게는 1 내지 4개의 헤테로원자, 더 바람직하게는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 또한, 용어 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭"은 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서 고리 중 적어도 하나는 헤테로사이클릭이고, 예를 들어, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 그룹은, 예를 들어, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 모르폴린, 락톤, 락탐 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드로카빌"은 =O 또는 =S 치환체를 갖지 않는, 탄소 원자를 통해 결합된 그룹을 지칭하며, 전형적으로 적어도 하나의 탄소-수소 결합 및 주로 탄소 백본을 갖지만, 선택적으로 헤테로원자를 포함할 수 있다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜 및 심지어 트리플루오로메틸과 같은 그룹은 본 출원의 목적을 위해 하이드로카빌로 간주되지만, 아세틸(연결 탄소에 =O 치환체를 가짐) 및 에톡시(탄소가 아닌 산소를 통해 결합됨)와 같은 치환체는 아니다. 하이드로카빌 그룹은 아릴, 헤테로아릴, 카보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드록시알킬"은 하이드록시 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
용어 "저급"은 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시와 같은 화학적 모이어티와 함께 사용될 때 치환체에 10개 이하, 바람직하게는 6개 이하의 원자가 있는 그룹을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어 "저급 알킬"은 10개 이하, 바람직하게는 6개 이하의 탄소 원자를 함유하는 알킬 그룹을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 정의되는 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 알콕시 치환체는 단독으로 나타나든 하이드록시알킬 및 아르알킬의 인용에서와 같이(이 경우, 예를 들어, 알킬 치환체의 탄소 원자를 계수할 때 아릴 그룹 내의 원자는 계수되지 않음) 다른 치환체와 조합되어 나타나든 각각 저급 아실, 저급 아실옥시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐 또는 저급 알콕시이다.
용어 "폴리사이클릴", "폴리사이클" 및 "폴리사이클릭"은 2개 이상의 원자가 2개의 인접한 고리에 공통인 2개 이상의 고리(예를 들어, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및/또는 헤테로사이클릴)를 지칭하며, 예를 들어, 고리는 "융합 고리"이다. 폴리사이클의 각 고리는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리사이클의 각 고리는 고리에 3 내지 10개, 바람직하게는 5 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "설페이트"는 당해 분야에 인지되어 있고 -OSO3H 그룹 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다.
용어 "설폰아미드"는 당해 분야에 인지되어 있고 화학식 또는 로 표시되는 그룹을 지칭하며,
여기서 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌을 나타낸다.
용어 "설폭사이드"는 당해 분야에 인지되어 있고 -S(O)- 그룹을 지칭한다.
용어 "설포네이트"는 당해 분야에 인지되어 있고 SO3H 그룹 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다.
용어 "설폰"은 당해 분야에 인지되어 있고 -S(O)2- 그룹을 지칭한다.
용어 "치환된"은 백본의 하나 이상의 탄소에 수소를 대체하는 치환체를 갖는 모이어티를 지칭한다. "치환" 또는 "~ 로 치환된"은 그러한 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가에 따르며 치환이, 예를 들어, 재배열, 고리화, 제거 등과 같은 변환을 자발적으로 겪지 않는 안정한 화합물을 생성한다는 암시적 단서를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환체를 포함하는 것으로 간주된다. 넓은 측면에서, 허용 가능한 치환체는 유기 화합물의 비사이클릭 및 사이클릭, 분지형 및 비분지형, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비방향족 치환체를 포함한다. 적절한 유기 화합물에 대해 허용 가능한 치환체는 하나 이상일 수 있고 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환체 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기술된 유기 화합물의 임의의 허용 가능한 치환체를 가질 수 있다. 치환체는 본원에 기술된 임의의 치환체, 예를 들어, 할로겐, 하이드록실, 카보닐(예컨대 카복실, 알콕시카보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카보닐(예컨대 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬의 치환된 모이어티는 적절한 경우 그 자체로 치환될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "티오알킬"은 티올 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "티오에스테르"는 -C(O)SR9 또는 -SC(O)R9 그룹을 지칭하며,
여기서 R9는 하이드로카빌을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "티오에테르"는 산소가 황으로 대체된 에테르와 동등하다.
용어 "우레아"는 당해 분야에 인지되어 있고 화학식 로 표시될 수 있으며,
여기서 R9 및 R10은 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "조절하다"는 기능 또는 활성(예컨대 세포 증식)의 억제 또는 억압뿐만 아니라 기능 또는 활성의 향상을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 어구는 당해 분야에 인지되어 있다. 특정 실시양태에서, 상기 용어는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 합리적인 이익/위험 비율과 맞게 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 조성물, 부형제, 보조제, 중합체 및 기타 물질 및/또는 투여형을 포함한다.
"염"은 본원에서 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭하는 데 사용된다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 유용한 많은 리피도이드 조성물(예를 들어, 나노입자)은 구조에 적어도 하나의 입체 중심을 갖는다. 이 입체 중심은 R 또는 S 배열로 존재할 수 있으며, 상기 R 및 S 표기법은 Pure Appl. Chem. (1976), 45, 11-30에 기술된 규칙에 따라 사용된다. 본 개시내용은 화합물의 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 형태와 같은 모든 입체이성질체 형태, 염, 전구약물 또는 이들의 혼합물(입체이성질체의 모든 가능한 혼합물 포함)을 고려한다. 예를 들어, WO 01/062726 참조.
또한, 알케닐 그룹을 함유하는 특정 화합물은 Z(zusammen) 또는 E(entgegen) 이성질체로서 존재할 수 있다. 각각의 경우에, 본 개시내용은 혼합물 및 별도의 개별 이성질체를 모두 포함한다. 또한, 일부 리피도이드 조성물(예를 들어, 나노입자)은 호변이성질체 형태로 존재하는 화학적 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 형태는 본원에 기술된 화학식에 명시적으로 나타내지는 않았지만, 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
"약제학적으로 허용되는"은 미국 이외의 국가에서 연방 또는 주 정부의 규제 기관 또는 상응하는 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있는 것 또는 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에게 사용하기 위한 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적으로 허용되고 모(parent) 화합물의 원하는 약리학적 활성을 갖는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 이러한 염은 무독성이며 무기산 또는 유기산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 이러한 염은 다음을 포함한다: (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되는 산 부가염; 또는 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토류 이온 또는 알루미늄 이온으로 대체되거나 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기와 배위할 때 형성되는 염. 염은 단지 예로서 나트륨 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등을 추가로 포함하고; 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 무독성 유기산 또는 무기산의 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트 등을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염기 부가염"은 본원에 개시된 임의의 산 화합물의 임의의 무독성 유기 또는 무기 염기 부가염을 의미한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 무기 염기는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 또는 수산화바륨을 포함한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 유기 염기는 메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린과 같은 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민 또는 암모니아를 포함한다. 적절한 염의 선택은 당업자에게 알려져 있을 것이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 양이온"은 산성 작용기의 허용되는 양이온성 반대이온을 지칭한다. 이러한 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등으로 예시된다(예를 들어, Berge, 등, J. Pharm. Sci. 66(1):1-79(January 77) 참조).
"약제학적으로 허용되는 비히클"은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 대사적으로 절단 가능한 그룹"은 생체 내에서 절단되어 본원에 표시된 화학식의 모 분자를 생성하는 그룹을 지칭한다. 대사적으로 절단 가능한 그룹의 예는 -COR, -COOR, -CONRR 및 -CH2OR 라디칼을 포함하며, 여기서 R은 각 경우에 알킬, 트리알킬실릴, 카보사이클릭 아릴, 또는 하나 이상의 알킬, 할로겐, 하이드록시 또는 알콕시로 치환된 카보사이클릭 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 대표적인 대사적으로 절단 가능한 그룹의 특정 예는 아세틸, 메톡시카보닐, 벤조일, 메톡시메틸 및 트리메틸실릴 그룹을 포함한다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 어구는 의약적 또는 치료적 용도를 위해 약물을 제형화하는 데 유용한 액체 또는 고체 필터, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.
"전구약물"은 본 발명의 화합물의 유도체를 포함하여, 절단 가능한 그룹을 갖고 가용매분해(solvolysis)에 의해 또는 생리학적 조건하에 생체 내에서 약제학적으로 활성인 본 발명의 화합물이 되는 화합물을 지칭한다. 이러한 예는 콜린 에스테르 유도체 등, N-알킬모르폴린 에스테르 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물의 다른 유도체는 산 및 산 유도체 형태 모두 활성이 있지만, 산 민감성 형태는 종종 용해도, 조직 적합성 또는 포유동물 유기체에서의 지연 방출의 이점을 제공한다(Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985 참조). 전구약물은, 예를 들어, 모 산과 적합한 알코올의 반응에 의해 제조된 에스테르, 또는 모 산 화합물과 치환 또는 비치환된 아민, 또는 산 무수물 또는 혼합 무수물의 반응에 의해 제조된 아미드와 같은 당업자에게 잘 알려진 산 유도체를 포함한다. 본 발명의 화합물에 부착된 산성 그룹으로부터 유도된 단순 지방족 또는 방향족 에스테르, 아미드 및 무수물은 특정 전구약물이다. 일부 경우에, (아실옥시)알킬에스테르 또는 (알콕시카보닐)옥시)알킬에스테르와 같은 이중 에스테르형 전구약물을 제조하는 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 화합물의 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, 아릴, C7-C12 치환된 아릴 및 C7-C12 아릴알킬 에스테르.
"용매화물"은 보통 가용매분해 반응에 의해 용매 또는 물("수화물"이라고도 함)과 회합되는 화합물의 형태를 지칭한다. 이 물리적 회합은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매는 물, 에탄올, 아세트산 등을 포함한다. 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 결정질 형태로 제조될 수 있고 용매화되거나 수화될 수 있다. 적합한 용매화물은 약제학적으로 허용되는 용매화물, 예컨대 수화물을 포함하고, 추가로 화학량론적 용매화물 및 비화학량론적 용매화물 모두를 포함한다. 특정 경우에, 용매화물은, 예를 들어, 하나 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 혼입될 때 분리될 수 있을 것이다. "용매화물"은 용액상 및 분리 가능한 용매화물을 모두 포함한다. 대표적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.
투여가 고려되는 "대상체"는 인간(즉, 임의의 연령 그룹의 남성 또는 여성, 예를 들어, 소아 대상체(예를 들어, 유아, 아동, 청소년) 또는 성인 대상체(예를 들어, 청년, 중년 또는 고령자) 및/또는 인간이 아닌 동물, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 사이노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey), 레서스 원숭이(rhesus monkey)), 소, 돼지, 말, 양, 염소, 설치류, 고양이 및/또는 개와 같은 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이 아닌 동물이다. 용어 "인간", "환자" 및 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"유효량"은 질환을 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 투여될 때 이러한 치료 또는 예방을 가져오기에 충분한 화합물의 양을 의미한다. "유효량"은 화합물, 질환 및 그 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 수 있다. "치료적 유효량"은 치료적 치료를 위한 유효량을 지칭한다. "예방적 유효량"은 예방적 치료를 위한 유효량을 의미한다.
"예방하는" 또는 "예방" 또는 "예방적 치료"는 질환 또는 장애를 얻거나 발병할 위험의 감소를 지칭한다(즉, 아직 질환 유발 인자에 노출되지 않았거나 질환 발병 이전의 질환에 걸리기 쉬운 대상체에서 질환의 임상 증상 중 적어도 하나가 발병하지 않도록 한다.
용어 "예방법(prophylaxis)"은 "예방(prevention)"과 관련되며, 질환을 치료하거나 치유하기보다는 예방하는 것이 목적인 조치 또는 절차를 지칭한다. 예방적 조치의 비제한적 예에는 백신 투여; 예를 들어, 부동(immobilization)으로 인해 혈전증 위험이 있는 병원 환자에게 저분자량 헤파린 투여, 및 말라리아가 유행하거나 말라리아에 걸릴 위험이 높은 지역을 방문하기 전에 클로로퀸(chloroquine)과 같은 항말라리아제의 투여가 포함될 수 있다.
임의의 질환 또는 장애를 "치료하는" 것 또는 이의 "치료" 또는 "치료적 치료"는 한 실시양태에서 질환 또는 장애를 개선하는 것(즉, 질환을 정지시키거나 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발현, 범위 또는 중증도를 감소시키는 것)을 지칭한다. 다른 실시양태에서 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체가 식별할 수 없을 수 있는 적어도 하나의 신체적 파라미터를 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로(예를 들어, 확인할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화) 또는 둘 다로 조절하는 것을 지칭한다. 추가 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환의 진행을 늦추는 것과 관련된다.
대상체에게 물질, 화합물 또는 작용제를 "투여하는" 것 또는 이의 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 작용제는 정맥 내, 동맥, 피 내, 근육 내, 복강 내, 피하, 안구, 설하, 경구(섭취에 의해), 비강 내(흡입에 의해), 척수 내, 뇌 내 및 경피(예를 들어, 피부 덕트를 통한 흡수에 의해) 투여될 수 있다. 또한, 화합물 또는 작용제는 재충전식 또는 생분해성 중합체성 장치 또는 다른 장치, 예를 들어, 패치 및 펌프에 의해, 또는 화합물 또는 작용제의 연장 방출, 서방출 또는 제어 방출을 제공하는 제형에 의해 적절하게 도입될 수 있다. 또한, 투여는, 예를 들어, 1회, 복수 회 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 또한, 물질, 화합물 또는 작용제를 대상체에게 투여하는 적절한 방법은, 예를 들어, 대상체의 연령 및/또는 신체 상태 및 화합물 또는 작용제의 화학적 및 생물학적 특성(예를 들어, 용해도, 소화율, 생체 이용률, 안정성 및 독성)에 따라 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물 또는 작용제는 경구로, 예를 들어, 섭취에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 경구 투여되는 화합물 또는 작용제는 연장 방출 또는 서방형 제형이거나, 이러한 서방출 또는 연장 방출용 장치를 사용하여 투여된다.
본원에서 사용되는 "공동 투여(conjoint administration)"라는 어구는 이전에 투여된 치료제가 신체에서 여전히 효과적인 동안 제2 작용제가 투여되도록 하는 두 가지 이상의 상이한 치료제의 임의의 투여 형태를 지칭한다(예를 들어, 두 가지 작용제가 환자에게 동시에 효과적인 것으로, 두 가지 작용제의 상승 효과를 포함할 수 있음). 예를 들어, 상이한 치료적 화합물은 동일한 제형으로 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료를 받는 개체는 상이한 치료제의 조합된 효과로부터 이익을 얻을 수 있다.
약물 또는 작용제의 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량"은 대상체에게 투여될 때 의도된 치료 효과가 있을 약물 또는 작용제의 양이다. 완전한 치료 효과는 1회 용량의 투여로 반드시 발생하는 것은 아니며, 일련의 투여 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 치료적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 대상체에게 필요한 정확한 유효량은, 예를 들어, 대상체의 체격, 건강 및 연령, 및 암 또는 MDS와 같이 치료되는 병태의 특성 및 정도에 따라 달라질 것이다. 당업자는 일상적인 실험을 통해 주어진 상황에 대한 유효량을 쉽게 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동위원소 변이체"는 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에서 비천연 비율의 동위원소를 함유하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 화합물의 "동위원소 변이체"는, 예를 들어, 중수소(2H 또는 D), 탄소-13(13C), 질소-15(15N) 등과 같은 하나 이상의 비방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 그러한 동위원소 치환이 이루어진 화합물에서, 존재하는 경우 다음 원자가 변할 수 있어서, 예를 들어, 임의의 수소가 "2H/D"일 수 있거나, 임의의 탄소가 13C일 수 있거나, 임의의 질소가 15N일 수 있고 이러한 원자의 존재 및 배치는 당업계의 기술 내에서 결정될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명은, 예를 들어, 생성된 화합물이 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 사용될 수 있는 경우에 방사성 동위원소를 갖는 동위원소 변이체의 제조를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 3H, 및 탄소-14, 즉 14C는 혼입이 용이하고 준비된 검출 수단이라는 점에서 이러한 목적에 특히 유용하다. 또한, 11C, 18F, 15O 및 13N과 같은 양전자 방출 동위원소로 치환된 화합물을 제조할 수 있으며, 이는 기질 수용체 점유율을 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(Positron Emission Topography, PET) 연구에 유용할 것이다. 본원에 제공된 화합물의 모든 동위원소 변이체는 방사성이든 아니든 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
분자식은 동일하지만 원자 결합의 특성이나 순서 또는 공간에서의 원자 배열이 다른 화합물을 "이성질체"라고 하는 것도 이해해야 한다. 공간에서의 원자의 배열이 다른 이성질체를 "입체이성질체"라고 한다.
서로의 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"라고 하고, 서로 중첩되지 않는 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체"라고 한다. 예를 들어, 화합물이 비대칭 중심을 가질 때 4개의 상이한 그룹에 결합되어 한 쌍의 거울상이성질체가 가능하다. 거울상이성질체는 비대칭 중심의 절대 구성으로 특징지어질 수 있으며 Cahn과 Prelog의 R - 및 S - 시퀀싱 규칙으로 또는 분자가 편광면을 회전하고 우회전 또는 좌회전으로 지정되는(즉, 각각 (+)- 또는 (-)- 이성질체) 방식으로 설명된다. 키랄 화합물은 개별 거울상이성질체 또는 이들의 혼합물로 존재할 수 있다. 동일한 비율의 거울상이성질체를 함유하는 혼합물을 "라세미 혼합물"이라고 한다.
"호변이성질체"는 특정 화합물 구조의 상호교환가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 변위가 다양한 화합물을 지칭한다. 따라서, 두 구조가 전자와 원자(일반적으로 H)의 이동을 통해 평형 상태에 있을 수 있다. 예를 들어, 에놀과 케톤은 산이나 염기로 처리하면 신속하게 상호변환되기 때문에 호변이성질체이다. 호변이성질체의 또 다른 예는 마찬가지로 산이나 염기로 처리하여 형성되는 페닐니트로메탄의 아시-(aci-) 및 니트로-형태이다. 호변이성질체 형태는 관심 화합물의 최적의 화학적 반응성 및 생물학적 활성의 달성과 관련이 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 순수한 거울상이성질체 화합물은 화합물의 다른 거울상이성질체 또는 입체이성질체가 실질적으로 없다(즉, 거울상이성질체 과잉(enantiomeric excess)). 다시 말해서, 화합물의 "S" 형태는 실질적으로 화합물의 "R" 형태가 없고, 따라서 "R" 형태의 거울상이성질체 과잉이다. 용어 "거울상이성질체적으로 순수한" 또는 "순수한 거울상이성질체"는 화합물이 95중량% 초과, 96중량% 초과, 97중량% 초과, 98중량% 초과, 98.5중량% 초과, 99중량% 초과, 99.2중량% 초과, 99.5중량% 초과, 99.6중량% 초과, 99.7중량% 초과, 99.8중량% 초과 또는 99.9중량% 초과의 거울상이성질체를 포함함을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 중량은 화합물의 모든 거울상이성질체 또는 입체이성질체의 총 중량을 기준으로 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "거울상이성질체적으로 순수한 R-화합물"은 적어도 약 95중량%의 R-화합물 및 최대 약 5중량%의 S-화합물, 적어도 약 99중량%의 R-화합물 및 최대 약 1중량%의 S-화합물, 또는 적어도 약 99.9중량%의 R-화합물 및 최대 약 0.1중량%의 S-화합물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 중량은 화합물의 총 중량을 기준으로 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "거울상이성질체적으로 순수한 S-화합물" 또는 "S-화합물"은 적어도 약 95중량%의 S-화합물 및 최대 약 5중량%의 R-화합물, 적어도 약 99중량%의 S-화합물 및 최대 약 1중량%의 R-화합물 또는 적어도 약 99.9중량%의 S-화합물 및 최대 약 0.1중량%의 R-화합물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 중량은 화합물의 총 중량을 기준으로 한다.
본원에서 제공되는 조성물에서, 거울상이성질체적으로 순수한 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 전구약물은 다른 활성 또는 불활성 성분과 함께 존재할 수 있다. 예를 들어, 거울상이성질체적으로 순수한 R-화합물을 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 약 90%의 부형제 및 약 10%의 거울상이성질체적으로 순수한 R-화합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 조성물에서 거울상이성질체적으로 순수한 R-화합물은, 예를 들어, 화합물의 총 중량을 기준으로 적어도 약 95중량%의 R-화합물 및 최대 약 5중량%의 S-화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 거울상이성질체적으로 순수한 S-화합물을 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 약 90%의 부형제 및 약 10%의 거울상이성질체적으로 순수한 S-화합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 조성물에서 거울상이성질체적으로 순수한 S-화합물은, 예를 들어, 화합물의 총 중량을 기준으로 적어도 약 95중량%의 S-화합물 및 최대 약 5중량%의 R-화합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성 성분은 부형제 또는 담체가 거의 또는 전혀 없이 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며; 따라서 이러한 화합물은 개별 (R)- 또는 (S)-입체이성질체 또는 이들의 혼합물로 생성될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 특정 화합물의 설명 또는 명명은 개별 거울상이성질체 및 이의 혼합물, 라세미체 또는 그 외의 것을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 입체화학의 결정 및 입체이성질체의 분리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
유기 합성 분야의 당업자는 방향족이든 비방향족이든 안정하고 화학적으로 실현 가능한 헤테로사이클릭 고리에서 헤테로원자의 최대 수가 고리의 크기, 불포화 정도 및 헤테로원자의 원자가에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로 헤테로사이클릭 고리는 헤테로방향족 고리가 화학적으로 실현 가능하고 안정한 한 1 내지 4개의 헤테로원자를 가질 수 있다.
실시양태 목록
본 발명의 실시양태의 다음 목록은 본 발명의 다양한 특징을 개시하는 것으로 간주되어야 하며, 이러한 특징은 논의되는 특정 실시양태에 특정한 것으로 간주될 수 있거나 다른 실시양태에 열거된 바와 같은 다양한 다른 특징과 결합 가능하다. 따라서, 하나의 특징이 한 특정 실시양태에서 논의된다는 이유로 그 특징의 사용을 반드시 그 실시양태로 제한하는 것은 아니다.
실시양태 1. 지질 조성물과 조립된 약제학적 작용제를 포함하는 조성물로서, 지질 조성물은 화학식 Ⅰ을 갖는 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물:
[화학식 Ⅰ]
여기서:
Ra는 알킬이고;
n1 및 n2는 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 각각 독립적으로 H, 또는 이고,
여기서:
*는 N에 대한 부착점을 나타내고;
각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각각의 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
각각의 Rc는 독립적으로 알킬(예를 들어, C4-C20) 또는 알케닐(예를 들어, C4-C20)이고;
여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나는 H가 아니다.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 표적 기관 또는 표적 세포로의 우선적 전달을 위한 조성물.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 표적 기관 또는 표적 세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 발현 프로파일을 변형하기 위한 것인 조성물.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 표적 유전자 또는 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체, 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 5. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 치료제, 유전자 조정제 또는 백신인 조성물.
실시양태 6. 실시양태 1-5에 있어서, Ra가 C1-C4 알킬 조성물.
실시양태 7. 실시양태 1-6에 있어서, Ra가 C1-C3 알킬인 조성물.
실시양태 8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, Ra가 C1 알킬인 조성물.
실시양태 9. 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, n1이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, n1이 2 또는 3인 조성물.
실시양태 11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, n2가 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, n2가 2 또는 3인 조성물.
실시양태 13. 실시양태 1-12 중 어느 하나에 있어서, n1과 n2가 동일한 조성물.
실시양태 14. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개가 H가 아닌 조성물.
실시양태 15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 3개가 H가 아닌 조성물.
실시양태 16. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 어느 것도 H가 아닌 조성물.
실시양태 17. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 또는 인 조성물.
실시양태 18. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 인 조성물.
실시양태 19. 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 인 조성물.
실시양태 20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
실시양태 21. 실시양태 1-20 중 어느 하나에 있어서, Rc가 독립적으로 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 22. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C20 알킬(예를 들어, C4-C16 알킬, 예컨대 C4-C12 알킬)인 조성물.
실시양태 23. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C16 알킬인 조성물.
실시양태 24. 실시양태 1-23 중 어느 하나에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C12 알킬인 조성물.
실시양태 25. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 각각의 m이 독립적으로 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 각각의 m이 독립적으로 1 또는 2인 조성물.
실시양태 27. 실시양태 25에 있어서, 각각의 m이 1인 조성물.
실시양태 28. 실시양태 1-27 중 어느 하나에 있어서, 각각의 q가 독립적으로 1, 2, 3 또는 4인 조성물.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 각각의 q가 독립적으로 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 30. 실시양태 28에 있어서, 각각의 q가 2인 조성물.
실시양태 31. 실시양태 1-30 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 60% 이하의 몰 백분율(molar percentage)로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 32. 실시양태 1-31 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 50% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 33. 실시양태 1-32 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 40% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 34. 실시양태 1-33 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 35. 실시양태 1-34 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 36. 실시양태 35에 있어서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체가 약 50% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 37. 실시양태 1-36 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 중합체 접합된 지질(polymer-conjugated lipid)을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 38. 실시양태 1-37 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 접합된 지질을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 39. 실시양태 37 또는 38에 있어서, 중합체 접합된 지질이 약 10% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 40. 실시양태 1-39 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 인지질을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 41. 실시양태 1-40 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 포스포에탄올아민 지질 또는 포스포콜린 지질을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 42. 실시양태 40에 있어서, 인지질이 약 30% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 43. 실시양태 1-42 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 1:1 내지 약 200:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 44. 실시양태 1-43 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 1:1 내지 약 100:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 45. 실시양태 1-44 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
실시양태 46. 실시양태 1-44 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 메신저 리보핵산(mRNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 소분자 화합물 또는 이들의 임의의 조합인 조성물.
실시양태 47. 실시양태 46에 있어서, 폴리펩티드가 단백질인 조성물.
실시양태 48. 실시양태 45에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 상향 조절하거나 하향 조절하도록 구성되는 조성물.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 50. 실시양태 1-49 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
실시양태 51. 실시양태 50에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 상향조절 또는 하향조절하도록 구성된 메신저 리보핵산(mRNA)인 조성물.
실시양태 52. 실시양태 51에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 53. 실시양태 1-52 중 어느 하나에 있어서, 표적 전사체가 표적 기관 또는 표적 세포에 있는 조성물.
실시양태 54. 실시양태 1-53 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 다음을 포함하는 조성물:
(a) 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 적어도 일부에 특이적으로 결합하도록 구성된 유전자 조절 모이어티(gene modulating moiety); 또는
(b) (a)의 유전자 조절 모이어티를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 적어도 일부와 복합체를 형성하도록 구성된 가이드 핵산, 또는 가이드 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
실시양태 56. 실시양태 54 또는 55에 있어서, 표적 유전자 또는 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 57. 실시양태 54-56 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 (a)의 유전자 조절 모이어티를 암호화하는 메신저 리보핵산(mRNA)인 조성물.
실시양태 58. 실시양태 54-57 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 이종 엔도뉴클레아제, 또는 이종 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
실시양태 59. 실시양태 54-58 중 어느 하나에 있어서, 이종 엔도뉴클레아제가 CRSIPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 관련 (Cas) 뉴클레아제인 조성물.
실시양태 60. 실시양태 54-69 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 메신저 리보핵산(mRNA)인 조성물.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, 이종 엔도뉴클레아제가 가이드 핵산에 대해 약 1:20 내지 약 20:1의 질량비 또는 중량비로 유전자 조절 모이어티에 존재하는 조성물.
실시양태 62. 실시양태 61에 있어서, 이종 엔도뉴클레아제가 가이드 핵산에 대해 약 1:10 내지 약 10:1의 질량비 또는 중량비로 유전자 조절 모이어티에 존재하는 조성물.
실시양태 63. 실시양태 1-62 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 대상체의 표적 기관 또는 표적 세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 조성물.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 65. 실시양태 63 또는 64에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 기관 또는 표적 세포의 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
실시양태 66. 실시양태 54-65 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 대상체의 표적 기관 또는 표적 세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
실시양태 67. 실시양태 1-66 중 어느 하나에 있어서, 표적 기관이 폐 또는 간인 조성물.
실시양태 68. 실시양태 1-67 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포가 폐세포 또는 간세포인 조성물.
실시양태 69. 실시양태 1-68 중 어느 하나에 있어서, 전신 투여용으로 제형화되는 조성물.
실시양태 70. 실시양태 1-68 중 어느 하나에 있어서, 국소 투여용으로 제형화되는 조성물.
실시양태 71. 실시양태 1-70 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에서,
Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 H 또는 이고;
Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나가 인 조성물.
실시양태 72. 실시양태 71에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3개 또는 4개 모두)가 각각 독립적으로 인 조성물.
실시양태 73. 실시양태 72에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 3개가 각각 독립적으로 인 조성물.
실시양태 74. 실시양태 73에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 4개 모두가 각각 독립적으로 인 조성물.
실시양태 75. 실시양태 71-74 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제를 폐로 우선적으로 전달하기 위한 조성물.
실시양태 76. 실시양태 71-75 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE를 갖는 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물:
[화학식 ⅡA]
[화학식 ⅡB]
[화학식 ⅡC]
[화학식 ⅡD]
, 또는
[화학식 ⅡE]
여기서:
m1, m2, m3 및 m4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고;
q1, q2, q3 및 q4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
Rc1, Rc2, Rc3 및 Rc4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 C4-C20 알킬 또는 C4-C20 알케닐이다.
실시양태 77. 실시양태 76에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅡE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물.
실시양태 78. 실시양태 76 또는 77에 있어서, Rc1이 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16 (예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 79. 실시양태 78에 있어서, Rc1이 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 80. 실시양태 76-79 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc2가 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 81. 실시양태 76-80 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc2가 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 81. 실시양태 76-81 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc3이 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 83. 실시양태 76-82 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc3이 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시형태 84. 실시형태 76-82 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡE에서 Rc4가 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16 (예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 85. 실시양태 76-84 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡE에서 Rc4가 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 86. 실시양태 76-85 중 어느 하나에 있어서, m1이 1 또는 2인 조성물.
실시양태 87. 실시양태 76-86 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 m2가 1 또는 2인 조성물.
실시양태 88. 실시양태 76-86 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 m3이 1 또는 2인 조성물.
실시양태 89. 실시양태 76-86 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡE에서 m4가 1 또는 2인 조성물.
실시양태 90. 실시양태 76-89 중 어느 하나에 있어서, q1이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 91. 실시양태 76-90 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 q2가 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 92. 실시양태 76-91 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 q3이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 93. 실시양태 76-92 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅡE에서 q4가 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 94. 실시양태 71에 있어서, 리피도이드가 하기 및 이 중 임의의 것의 임의의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 조성물:
.
실시양태 95. 실시양태 71-94 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE의 리피도이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 96. 실시양태 71-95 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 약 10% 내지 약 50%의 몰 백분율로 포함하는 조성물.
실시양태 97. 실시양태 71-96 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE의 리피도이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 5:1 내지 약 100:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 98. 실시양태 71-97 중 어느 하나에 있어서, 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포로의 전달과 비교하여 약제학적 작용제를 폐 또는 폐세포로 우선적으로 전달하기 위한 조성물.
실시양태 99. 실시양태 98에 있어서, 약제학적 작용제가 대상체의 폐 또는 폐세포에 전달되는 조성물.
실시양태 100. 실시양태 98에 있어서, 폐가 아닌 기관이 간, 심장, 비장 또는 신장이고, 폐세포가 아닌 세포가 간세포, 심장세포, 비장세포 또는 신장세포인 조성물.
실시양태 101. 실시양태 98에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 또는 폐세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 상향 조절하도록 구성되는 조성물.
실시양태 102. 실시양태 98에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 또는 폐세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 하향 조절하도록 구성되는 조성물.
실시양태 103. 실시양태 71-103 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체인 조성물.
실시양태 104. 실시양태 101에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
실시양태 105. 실시양태 98-104 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
실시양태 106. 실시양태 71-105 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양(예를 들어, 2배 더 많은 양)의 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 107. 실시양태 106에 있어서, 실시양태 71-105 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 적어도 5배 더 많은 양 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 108. 실시양태 106에 있어서, 실시양태 71-105 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 적어도 10배 더 많은 양 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 109. 실시양태 71-108 중 어느 하나에 있어서, 폐가 아닌 기관이 간, 심장, 비장 또는 신장이고, 폐세포가 아닌 세포가 간세포, 심장세포, 비장세포 또는 신장세포인 방법.
실시양태 110. 실시양태 71-109 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양(예를 들어, 적어도 약 2배 더 많은 양)의 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 111. 실시양태 110에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드가 에스테르 함유 테일을 갖는 방법.
실시양태 112. 실시양태 106 또는 110에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 더 많은 양(예를 들어, 적어도 약 2배 더 많은 양)의 활성을 조절하는 방법.
실시양태 113. 실시양태 112에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드가 에스테르 함유 테일을 갖는 방법.
실시양태 114. 실시양태 112에 있어서, 대상체의 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하는 방법.
실시양태 115. 실시양태 1-114 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에서,
Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 H 또는 이고;
Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나가 인 조성물.
실시양태 116. 실시양태 115에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3개 또는 4개 모두)가 독립적으로 인 조성물.
실시양태 117. 실시양태 116에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 3개가 독립적으로 인 조성물.
실시양태 118. 실시양태 117에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 4개 모두가 독립적으로 인 조성물.
실시양태 119. 실시양태 115-118 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE를 갖는 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물:
[화학식 ⅢA]
[화학식 ⅢB]
[화학식 ⅢC]
[화학식 ⅢD]
, 또는
[화학식 ⅢE]
여기서:
m5, m6, m7 및 m8은 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고;
q5, q6, q7 및 q8은 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
Rc5, Rc6, Rc7 및 Rc8은 존재하는 경우 각각 독립적으로 C4-C20 알킬 또는 C4-C20 알케닐이다.
실시양태 120. 실시양태 119에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅢE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물.
실시양태 121. 실시양태 119 또는 120에 있어서, Rc5가 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 122. 실시양태 119-121 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc6이 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 123. 실시양태 119-122 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc6이 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 124. 실시양태 119-123 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc7이 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 125. 실시양태 119-124 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc7이 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 126. 실시양태 119-125 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢE에서 Rc8이 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알킬 또는 C4-C16(예를 들어, C6-C12) 알케닐인 조성물.
실시양태 127. 실시양태 119-126 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢE에서 Rc8이 C6-C12 알킬 또는 C6-C12 알케닐인 조성물.
실시양태 128. 실시양태 119-127 중 어느 하나에 있어서, m5가 1 또는 2인 조성물.
실시양태 129. 실시양태 119-128 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 m6이 1 또는 2인 조성물.
실시양태 130. 실시양태 119-129 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 m7이 1 또는 2인 조성물.
실시양태 131. 실시양태 119-130 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢE에서 m8이 1 또는 2인 조성물.
실시양태 132. 실시양태 119-131 중 어느 하나에 있어서, q5가 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 133. 실시양태 119-132 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 q6이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 134. 실시양태 119-133 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 q7이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 135. 실시양태 119-134 중 어느 하나에 있어서, 화학식 ⅢE에서 q8이 1, 2 또는 3인 조성물.
실시양태 136. 실시양태 115에 있어서, 리피도이드가 하기 및 이 중 임의의 것의 임의의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 조성물:
실시양태 137. 실시양태 115-136 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE의 리피도이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 138. 실시양태 115-137 중 어느 하나에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 약 10% 내지 약 50%의 몰 백분율로 포함하는 조성물.
실시양태 139. 실시양태 115-138 중 어느 하나에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE의 리피도이드, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 5:1 내지 약 100:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
실시양태 140. 실시양태 115-139 중 어느 하나에 있어서, 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포로의 전달과 비교하여 약제학적 작용제를 간 또는 간세포로 우선적으로 전달하기 위한 조성물.
실시양태 141. 실시양태 140에 있어서, 간이 아닌 기관이 폐이고, 간세포가 아닌 세포가 폐세포인 조성물.
실시양태 142. 실시양태 140 또는 141에 있어서, 약제학적 작용제가 간 또는 간세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 상향 조절하도록 구성되는 조성물.
실시양태 143. 실시양태 140 또는 141에 있어서, 약제학적 작용제가 간 또는 간세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 하향 조절하도록 구성되는 조성물.
실시양태 144. 실시양태 140-143 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자가 안지오포이에틴 유사 3(angiopoietin-like 3, ANGPTL3) 유전자인 조성물.
실시양태 145. 실시양태 142 또는 143에 있어서, 약제학적 작용제가 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물(예를 들어, 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 표적 전사체)의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
실시양태 146. 실시양태 140-145 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 작용제가 간 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
실시양태 147. 실시양태 115-146 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양(예를 들어, 적어도 약 2배 더 많은 양)의 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 148. 실시양태 115-146 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 적어도 약 5배 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 149. 실시양태 115-146 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 적어도 약 10배 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 150. 실시양태 147-149 중 어느 하나에 있어서, 간이 아닌 기관이 폐이고, 간세포가 아닌 세포가 폐세포인 방법.
실시양태 151. 실시양태 115-150 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양(예를 들어, 적어도 약 2배 더 많은 양)의 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 152. 실시양태 115-150 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 적어도 약 5배 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 153. 실시양태 115-150 중 어느 하나에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 적어도 약 10배 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제를 우선적으로 전달하는 방법.
실시양태 154. 실시양태 151-153 중 어느 하나에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드가 아미드 함유 테일을 갖는 방법.
실시양태 155. 실시양태 154에 있어서, 아미드 함유 테일이 화학식 ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE를 갖는 상응하는 리피도이드를 갖는 방법.
실시양태 156. 실시양태 147 또는 155 중 어느 하나에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 더 많은 양 또는 활성을 조절하는 방법.
실시양태 157. 실시양태 156에 있어서, 표적 유전자가 안지오포이에틴 유사 3(ANGPTL3) 유전자인 방법.
실시양태 158. 실시양태 156 또는 157에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드가 아미드 함유 테일인 방법.
실시양태 159. 실시양태 158에 있어서, 아미드 함유 테일이 화학식 ⅡA, ⅡB, ⅡC, IID 또는 ⅡE를 갖는 상응하는 리피도이드를 갖는 방법.
실시양태 160. 실시양태 156-159 중 어느 하나에 있어서, 대상체의 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하는 방법.
실시양태 161. 실시양태 1-160 중 어느 하나에 있어서, 유전자 산물이 표적 단백질 또는 이의 기능적 변이체 표적 전사체인 방법.
실시예
본원에 기술된 본 발명이 더 완전히 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 본 출원에 기술된 실시예는 본원에 제공된 화합물, 조성물, 물질, 장치 및 방법을 예시하기 위해 제공되며 어떤 식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
재료 및 방법
연구 설계:
본 연구의 전반적인 목적은 혈중 지질 조절을 위해 Angptl3의 생체 내 기관 특이적 게놈 편집을 위한 비바이러스성 지질 나노입자(LNP) 매개된 CRISPR-Cas9 mRNA 기반 전략을 탐색하는 것이다. 본 연구는 (ⅰ) mRNA를 간세포에 효과적으로 전달할 수 있는 간 표적화 생환원성 지질 나노입자 플랫폼을 확인하고; (ⅱ) LNP 제형을 최적화하여 생체 내 mRNA 전달 효능을 최대화하며; (ⅲ) 치료에 적절한 Angptl3 유전자를 표적으로 함으로써 306-O12B LNP 매개된 Cas9 mRNA 전달의 생체 내 게놈 편집 효과를 입증하여 혈청 ANGPTL3, 저밀도 지단백 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수치를 크게 감소시키고; (ⅳ) Angptl3의 LNP 매개된 CRISPR-Cas9 mRNA 기반 게놈 편집의 치료 효과가 단일 용량 투여 후 적어도 100일 동안 안정하다는 것을 밝히는 것을 포함한다. 모든 동물 실험은 Tufts University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하였으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 National Institutes of Health(NIH) 지침에 따라 수행하였다. 게놈 편집 효능, 표적 외 부작용, 안전성 프로파일 및 지질 수준의 변화를 철저히 평가하였다.
LNP 제형:
리피도이드를 이전 보고서(S. Tenzer 등, Rapid formation of plasma protein corona critically affects nanoparticle pathophysiology. Nat Nanotechnol 8, 772-781 (2013), K. A. Hajj 등, Branched-Tail Lipid Nanoparticles Potently Deliver mRNA In Vivo due to Enhanced Ionization at Endosomal pH. Small 15, e1805097 (2019))에 따라 합성하였다. LNP를 NanoAssemblr 미세유체 시스템(Precision Nanosystems)을 사용하여 제조하였다. 간단히 말해, 리피도이드, 콜레스테롤(Sigma), 인지질(DSPC, DOPE 및 DOPC, Avanti Polar Lipids) 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG2000)(Avanti Polar Lipids)을 50/38.5/10/1.5의 몰비로 100% 에탄올에 10mg/mL의 최종 리피도이드 농도로 용해시켰다. MC-3 LNP 제형을 Sedic 등이 이전에 기술한 절차에 따라 약간 수정하여 제조하였다. 간단히 말해, 지질(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC-3), DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000을 50%의 MC-3, 38.5%의 콜레스테롤, 10%의 DSPC 및 1.5%의 DMG-PEG2000의 몰비로 순수 에탄올에 10mg/mL의 최종 MC-3 농도로 용해시켰다. 이어서 지질 용액을 NanoAssemblr 미세유체 시스템을 사용하여 mRNA를 함유하는 산성 나트륨 아세테이트 버퍼(0.45mg/mL, pH 4.0)와 혼합하였다. 생성된 LNP를 PBS(pH 7.4, 10mM)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. Cas9 mRNA 및 gRNA(sgANGPTL3 또는 sgLoxP)를 나트륨 아세테이트 버퍼(25mM, pH 5.2)에서 적절한 중량비로 혼합하였다. mRNA 용액과 지질 용액을 3:1의 비율로 NanoAssemblr 미세유체 장치에 각각 주입하였고, 장치가 두 성분을 빠르게 혼합하여 LNP의 자가 조립이 이루어졌다. 제형을 4℃에서 밤새 투석 카세트에서 PBS(10mM, pH 7.4)에 대해 추가로 투석하였다. 제형의 입자 크기를 ZetaPALS DLS 기계(Brookhaven Instruments)를 사용하여 동적 광 산란(DLS)으로 측정하였다. RNA 캡슐화 효율은 Ribogreen 검정으로 특성화하였다.
생체 내 LNP 전달
동물 실험을 위한 모든 절차는 Tufts University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 National Institutes of Health(NIH) 지침에 따라 수행하였다. 모든 동물은 Charles River에서 주문하였다. 암컷 Balb/c 마우스(6-8주)를 생체 내 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(fLuc mRNA, TriLink Biotechnologies) 캡슐화된 LNP 스크리닝 및 제형 최적화에 사용하였다. 간단히 말해, fLuc mRNA LNP를 0.5mg/kg mRNA의 용량으로 마우스에 정맥 내 주사하였다. 미리 결정된 시점에서 마우스에 100μL의 D-루시페린 칼륨염(D-Luciferin potassium salt)(Goldbio) 용액(PBS 중 15mg/mL)을 주사하고, 이소플루란(isoflurane) 마취로 마취시키고, IVIS 이미징 시스템(Caliper Life Sciences)으로 측정하였다.
상업적으로 공급되는 핵산
Cas9 mRNA는 Tri-Link Biotechnologies에서 공급받았다. "말단 변형된" 합성을 사용한 본원에 사용된 모든 sgRNA는 Synthego에서 공급받았다. 간단히 말해, 이러한 gRNA의 처음과 마지막 3개의 염기는 2'-O-메틸-뉴클레오시드를 사용하여 합성된 것으로 3' 포스포로티오에이트 결합을 통해 연결된다. 나머지 분자 전체의 다른 모든 염기는 전통적인 리보뉴클레오시드 및 인산염 결합으로 전형적인 천연 RNA이다.
생체 내 Cas9 mRNA/sgLoxP 전달
Cas9 mRNA(TriLink Biotechnologies) 및 LoxP 표적화 단일 가이드 RNA(sgLoxP, 서열: 5'-AAGTAAAACCTCTACAAATG, 말단 변형됨, Synthego)를 306-O12B LNP에 동시 로딩하고 암컷 Ai14 마우스에 1.65mg/kg 용량의 총 RNA를 정맥 내 주사하였다. 주사 후 7일차에 마우스 기관을 수집하고 IVIS로 이미지화하여 tdTomato 발현을 검출하였다. 간 조직을 추가로 절개하였다.
면역염색
조직 샘플을 OCT로 매립하고, 액체 질소에서 완전히 냉동시키고, 절개할 준비가 될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 동결된 조직 블록(tissue block)을 cryotome을 사용하여 원하는 두께(10μm)로 절단하고 면역형광 염색에 적합한 유리 슬라이드 위에 놓았다. 조직 절편(tissue section)을 미리 냉각된 아세톤(-20℃)으로 10분 동안 고정한 다음, PBS로 5분씩 2회 세척하였다. 고정된 조직 절편을 실온(r.t.)에서 1시간 동안 10% BSA 차단 버퍼(blocking buffer) 중에서 인큐베이션한 다음 PBS로 세척하였다. 간세포 특이적 1차 항체(1% BSA 버퍼에 1:100 희석됨, 항-간세포 특이적 항원(HepPar1), Novus)(43)를 슬라이드 위의 절편에 도포하고 4℃의 가습 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다. 슬라이스를 PBS로 5분씩 2회 헹구고, eFlour660 접합된 F(ab')2-염소 항-마우스 2차 항체(1:50, Invitrogen)로 염색하고, 실온에서 1시간 동안 차광된 가습 챔버에서 인큐베이션한 다음 PBS로 3회 세척하였다. DAPI(Sigma)가 함유된 형광 마운팅 매질(Fluorescent mounting medium)을 사용하여 슬라이드를 커버슬립하였다. 절편은 Leica SP8 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다.
Angptl3 의 생체 내 게놈 편집:
Benchling 소프트웨어를 사용하여 Angptl3을 표적으로 하는 가이드 RNA 서열을 설계하였다. 6-8주령의 암컷 야생형 C57BL/6 마우스에 Cas9 mRNA 및 ANGPTL3 표적화 단일 가이드 RNA(sgAngptl3, 서열: 5'-AGCCCTTCAACACAAGGTCA, 말단 변형됨, Synthego)가 동시 로딩된 306-O12B LNP를 1.0, 2.0 및 3.0mg/kg 용량의 총 RNA로 정맥 내 투여하였다. PBS가 투여된 마우스를 음성 대조군으로 취급하였다. 주사 후 7일차에, 마우스를 희생(금식 없이)시키고, 순환 ANGPTL3 단백질 및 ELISA에 의한 혈중 지질 정량을 위해 채혈하고, DNA 추출 및 차세대 서열(NGS) 분석을 위해 정중엽(median lobe) 및 좌측엽(left lateral lobe)으로부터 간 조직을 수집하였다. 혈청 지질 수준에 대한 일주기 리듬(circadian rhythm)의 영향을 제어하기 위해 모든 실험에서 혈청을 거의 같은 시간(이른 오후)에 수집하였다. 또한, 생체 내 독성 및 면역반응을 평가하기 위해 주사 2일 후 마우스로부터 채혈하여 혈청으로 진행하였다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT)와 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)를 제조업체의 프로토콜에 따라 AST(G-Biosciences), ALT(G-Biosciences) 및 TNF-알파(R&D Systems)용 검정 키트를 사용하여 측정하였다. IFN-α, IL-6 및 IP-10의 혈청 수준은 각각 마우스 IFN-α ELISA 키트(PBL Assay Science), 마우스 IL-6 Quantikine ELISA 키트(R&D Systems) 및 Abcam 마우스 IP-10 ELISA 키트로 측정하였다.
NGS 시퀀싱 분석:
시판 추출 키트(Qiagen DNEasy Blood & Tissue)를 사용하여 간의 정중엽 및 좌측엽으로부터 DNA를 추출하였다. PCR 프라이머는 Angptl3 유전자의 표적 부위 주변 영역 또는 예측된 표적 외 부위 주변 영역을 증폭하도록 설계하였다(표 1). 표적 외 부위는 Cas-Off-Finder 소프트웨어(rgenome.net/cas-offinder/)를 사용하여 예측하였다. Illumina MiSeq(Tufts Genomics Core Facility)에서의 시퀀싱을 위해 PCR 앰플리콘을 준비하였다. 시퀀싱 데이터는 OutKnocker 2 소프트웨어(outknocker.org/outknocker2.htm)를 사용하여 분석하였다.
혈청 ANGPTL3 단백질, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 및 트리글리세라이드(TG) 분석
항응고제를 사용하지 않고 마우스로부터 채혈하고 실온에서 2시간 동안 응고되도록 하고 실온에서 15-20분 동안 2000 × g에서 원심분리하여 마우스 혈청을 수집하였다. ANGPTL3 단백질, LDL-C 및 TG의 혈청 수준은 각각 마우스 안지오포이에틴 유사 3 Quantikine ELISA 키트(R&D systems), 마우스 LDL-콜레스테롤 키트(Crystal Chem) 및 트리글리세라이드 비색 검정(Triglyceride Colorimetric Assay) 키트(Cayman Chemical)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 다음과 같이 측정하였다.
T7E1 절단 검정:
추출된 게놈 DNA 주형, Platinum SuperFi Green DNA 중합효소(Invitrogen) 및 특정 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 대상 표적 부위 옆에 있는 게놈 영역을 증폭시켰다. 다음 주기를 실행하였다: 98℃에서 30초에 이어 98℃에서 10초의 33주기, 65℃에서 15초, 및 72℃에서 30초에 이어 72℃에서 10분. GeneJET PCR 정제 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 400ng의 정제된 PCR 산물을 NEBuffer 2(New England Biolabs)에서 5분 동안 95℃로 가열한 후 AppliedBiosystems PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 2℃/초로 85℃까지 낮추고 0.1℃/초로 25℃까지 낮추면서 혼성화하였다. 어닐링된 샘플을 T7 엔도뉴클레아제 I(New England Biolabs)로 37℃에서 15분 동안 분해한 다음, 반응을 중지시키기 위해 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 산물을 추가로 정제하고 4-20% Novex TBE 젤(Invitrogen)에서 실행시켰다.
통계 분석:
데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. 모든 데이터는 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 통계적 차이는 One-Way ANOVA로 분석하였다. *p < 0.05는 유의한 것으로 간주하였고, **p < 0.01, ***p < 0.001은 매우 유의한 것으로 간주하였다.
리피도이드 나노입자 합성.
리피도이드는 이전 보고와 같이 아민 헤드와 알킬-아크릴레이트 테일 사이의 마이클 첨가 반응을 통해 합성하였다. 리피도이드 나노입자는 활성 리피도이드, 콜레스테롤(Sigma Aldrich), DOPC(Avanti Polar Lipids) 및 mPEG2000-DMG(Avanti Polar Lipids)를 50:38.5:10:1.5의 몰비로 에탄올 용액 중에서 NanoAssemblr 미세유체 시스템을 사용하여 mRNA를 함유하는 나트륨 아세테이트 버퍼(pH 5.2, 25mM)와 빠르게 혼합하여 제형화하였다. 활성 리피도이드 대 mRNA의 최종 중량비는 10/1로 설정하였다. 생성된 LNP를 3,500 MWCO 카세트(Thermo Scientific)에서 PBS(10mM, pH 7.4)에 대해 4℃에서 밤새 추가로 투석하였다. LNP의 크기 및 표면 제타 전위는 ZetaPALS DLS 기계(Brookhaven Instruments)를 사용하여 측정하였다.
생체 내 mRNA 전달
모든 동물 실험은 승인된 동물 프로토콜에 따라 수행하였다. 생체 내 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(fLuc mRNA) 형질감염을 위해, Charles River에서 구입한 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스에 fLuc mRNA 로딩된 LNP(0.5mg/kg mRNA)를 정맥 내(i.v.) 투여하였다. 주입 후 6시간에 마우스에 D-루시페린(Goldbio, PBS 중 15mg/mL)을 복강 내 주사하고 IVIS 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 이미지화하였다. 상이한 기관의 루시퍼라제 단백질 발현을 추가로 정량화하기 위해, 조직을 수확하고, 균질화하고, 원심분리하여 상청액을 수집하였다. 상청액은 반딧불이 루시퍼라제 검정 키트(Firefly Luciferase Assay Kit) 2.0(Biotium)을 사용하여 루시퍼라제 발현에 대해 검정하였다. 결과를 조직 그램 당 루시퍼라제 단백질 나노그램으로 표시하였다.
유전자 재조합 Cre mRNA 전달을 위해, Cre mRNA와 공동 제형화된 LNP를 Ai14 Cre 리포터 마우스(Jackson Laboratory)에 i.v. 주사하였다. 7일 후, 마우스를 희생시키고, 주요 기관을 수집하고 IVIS 이미징 시스템을 사용하여 이미지화하였다. 형질감염된 특정 세포 집단을 추가로 확인하기 위해 조직을 10μm 깊이로 동결 절개하고 SP8 공초점 현미경(Leica)을 사용하여 추가로 이미지화하였다. 유세포분석 연구를 위해 폐를 다진 다음 마우스 폐 해리 키트(Lung Dissociation Kit)(Milteny Biotec)로 처리하였다. 다음으로, 폐 용액을 70-μm 스트레이너(strainer)를 통해 여과하여 단세포 현탁액으로 진행하고, 원심분리한 후 적혈구 용해 버퍼(eBioscience)로 5분 동안 처리하였다. 이어서, 용액을 다시 원심분리하여 세포 펠릿을 수확하였다. 세포를 유세포분석 염색 버퍼(eBioscience)에 재현탁시킨 다음, 항체를 첨가하고 암실에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, PBS에 재현탁시키고, LSR-II 유세포분석기(BD Bioscience)를 사용하여 측정하였다. 본 연구에 사용된 항체는 다음과 같다: CD326-PE-Cy7(eBioscience), CD31-FITC(Biolegend) 및 F4/80-eFluor 660(eBioscience). 모든 항체의 희석 비율은 제조업체의 제안에 따라 사용하였다.
게놈 편집 Cas9 mRNA 전달을 위해, Cas9 mRNA가 로딩된 LNP를 Balb/c 마우스에 i.v. 주사하였다(0.5mg/kg). 주사 6시간 후, 마우스를 희생시키고, 기관을 수집하고, 상이한 기관의 Cas9 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 간단히 말해, 기관을 용해 버퍼에서 균질화하고 4℃에서 10분 동안 13,000g에서 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, BCA 검정 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이어서, 총 단백질 20μg을 4-20% 폴리아크릴아미드 젤(Thermo Fisher) 상에 로딩한 다음 120V의 안정적인 전압에서 90분 동안 젤을 실행시켰다. 젤을 절단하고 PVDF 막으로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단하고 항-CRISPR-Cas9 1차 항체(Abcam, ab189380)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 5회 세척하고, HRP 토끼 항-마우스 2차 항체(Abcam)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 젤 이미징 시스템을 사용하여 ECL 기질로 이미지화하였다.
단백질 코로나의 분리
마우스 혈장을 4℃에서 13,000g에서 원심분리하여 사용 전에 단백질 응집체를 제거하였다. LNP를 동일한 부피의 C57BL/6 마우스 혈장과 혼합하여 생체 내 단백질 농도를 모방하고 진탕 하에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 코로나 코팅된 LNP를 13,000g에서 30분 동안 원심분리로 분리한 후, 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 단백질 침전이 없음을 확인하기 위해 LNP를 첨가하지 않고 혈장 분취량에 대해 동일한 절차를 수행하였다. 모든 실험은 세 번 수행하였다. 단백질 코로나 코팅된 LNP의 단백질 양은 BCA 검정 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 결정하였다. 얻은 단백질 샘플을 추가 실험을 위해 추가로 동결건조시켜 -20℃에서 보관하였다.
단백질의 환원, 알킬화 및 분해
동결건조된 단백질 샘플을 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(Mammalian Protein Extraction Reagent)(Thermo Scientific) 중에서 1mg/mL로 재구성하였다. 각 샘플에 대해 100μg의 단백질을 2.1μL의 500mM 디티오에리트리톨(dithioerythritol, DTT), 99+%(Acros Organics)로 50℃에서 45분 동안 환원하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 30분 동안 암실에서 11.5ul의 요오도아세트아미드(Acros Organics)로 알킬화하였다. 이어서, 샘플을 트립신/Lys-C Mix(Mass Spec Grade, Promega)로 37℃에서 밤새 1-50의 단백질에 대한 효소의 비율로 분해하였다. 이어서, 샘플을 LC-MS 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다.
질량 분석법
생성된 샘플을 EASY-nLC 1200(Thermo Fisher)에 온라인으로 연결된 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분석기(Thermo Fisher)를 사용하여 전기분무 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 추가로 분석하였다. 샘플은 다음 구배를 사용하여 300nL/분의 유속으로 실행시켰다: 0-4분 0-5% B, 4-74분 0-30% B, 74-79분 30-90% B, 79-89분 90% B분, 89-94분 90-0% B 및 컬럼 재평형을 위해 94-105분 0% B. 이동상 A는 96.1:3.9의 물 중 0.1% FA/ACN 중 0.1% FA였다. 이동상 B는 80.0:20.0의 물 중 0.1% FA/ACN 중 0.1% FA였다. Thermo Fisher Scientific PepMap RSLC C18 EASY-Spray 컬럼(입자 크기 3μm, 75μm × 15cm, 100Å)에서 분리하기 전에 먼저 Thermo Fisher Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼(입자 크기 3μm, 75μm × 2cm, 100Å)에서 샘플을 탈염하였다. Proteome Discoverer 2.1.0.81 소프트웨어(Thermo Fisher)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터는 코로나의 마우스 단백질을 확인하기 위해 Mus musculus Uniprot FASTA 파일(2020년 8월 26일 수정됨)에 대해 실행시켰다.
시험관 내 mRNA 전달
TSC2-결핍 TTJ 세포를 웰당 1×104개의 세포로 48-웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 후, 세포를 24시간 동안 LNP(웰당 100ng의 mRNA)를 사용하여 EGFP mRNA로 형질감염시켰다. Lipofectamine2k를 양성 대조군으로 사용하였다. 형질감염 효율을 측정하기 위해, 세포를 트립신으로 분해하고, 수집하고, 유세포분석(Attune NxT Cytometer, ThermoFisher)을 사용하여 GFP 발현을 추가로 평가하였다. EGFP 양성 세포의 백분율은 Flowjo로 계산하였다.
TSC2 mRNA를 이용한 TTJ 종양의 생체 내 치료
C57BL/6 마우스에 2×106개의 TSC2-결핍 TTJ 세포를 꼬리 정맥 주사하여 폐에 종양 결절을 형성시켰다. 종양 세포 접종 후 24일차에, 마우스를 무작위로 3개의 그룹, 즉 미처리 대조군, 빈 LNP 처리 그룹 및 Tsc2 mRNA 로딩된 LNP(투여량: 주사당 0.75mg/kg의 mRNA) 처리 그룹으로 할당하였다. 마우스는 격일로 총 5회 처리하였다. 처리 후, 마우스를 안락사시키고, 추가 형태학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 폐를 수집하였다.
본원에서는 Cas9 mRNA의 간 전달을 위한 매우 강력한 신규 비바이러스성 LNP 매개된 CRISPR-Cas9 전달 시스템을 개시하고, Angptl3 유전자를 표적화함으로써 그 효능을 입증한다. 상기 시스템은 부형제 지질 분자의 최적화된 혼합물과 함께 공동 제형화된 선도적인 테일-분지형 생환원성 리피도이드(306-O12B)로 구성되어 있으며, 단일 투여를 통해 Angptl3을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgAngptl3)와 SpCas9 mRNA를 성공적으로 동시 전달한다(도 1). 306-O12B LNP는 야생형 C57BL/6 마우스 간의 간세포에 Cas9 mRNA 및 sgAngptl3을 특이적으로 전달하여 편집률 중앙값 38.5%와 혈청 ANGPTL3 단백질의 상응하는 65.2% 감소를 야기하였다. 306-O12B LNP를 사용한 전달은 핵산의 간 표적화 전달에 대해 최근 FDA 승인을 받은 금표준(gold standard) LNP인 MC-3 LNP를 사용한 전달보다 더 효율적이었다. 더욱이, Angptl3의 간 특이적 녹다운은 LDL-C 및 TG 수준의 현저한 저하를 초래하였다. 중요하게도, 9개의 상위 예측 부위에서 표적 외 돌연변이유발의 증거가 관찰되지 않았으며, 어떠한 명백한 간 독성도 관찰되지 않았다. CRISPR 매개된 게놈 편집은 단일 용량 주사 후 적어도 100일 동안 치료에 적절한 수준으로 유지되었다. 이 시스템은 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 도구의 간 특이적 전달을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공한다.
실시예 1: mRNA 전달을 위한 지질 나노입자의 생체 내 스크리닝
테일-분지형 생환원성 리피도이드를 이전 보고에 따라 디설파이드 결합-혼입된 아크릴레이트 지질 테일과 아민 함유 헤드 사이의 조합 무용매 마이클 첨가 반응을 통해 제조하였다(도 2a). 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(fLuc mRNA)를 LNP 내로 캡슐화하고 이러한 LNP를 암컷 야생형 Balb/c 마우스에 정맥 내로 전달함으로써 이러한 지질의 생체 내 mRNA 전달 효능을 평가하였다. 이러한 LNP를 부형제 화합물 콜레스테롤, DSPC 및 DMG-PEG와 함께 개시된 합성 이온화 지질로 제형화하였다. 블랭크(로딩되지 않음) 및 fLuc mRNA 로딩된 LNP의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지가 도 7a 및 도 7b에 나와 있다. 콜레스테롤, DSPC 및 DMG-PEG로 제형화된 금표준 MC-3 LNP가 양성 대조군으로 포함되었다. mRNA 전달 6시간 후, 마우스에 루시페린 기질을 복강 내 주사하고 전신 fLuc 활성을 IVIS 생체 내 이미징 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 측정하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 306-O12B, 113-O12B 및 306-O10B LNP를 사용한 mRNA 전달은 MC-3 LNP 전달과 비교하여 유사한 루시퍼라제 생물발광 강도를 나타냈다. 마우스의 생체 내 이미지는 루시퍼라제 단백질이 주로 간에서 발현됨을 보여주었다(도 8). 이러한 예비 결과를 바탕으로 306-O12B LNP는 상대적으로 높은 루시퍼라제 발현과 높은 특이성으로 인해 추가 개발 대상으로 선택되었다. fLuc mRNA는 약 96%의 캡슐화 효율로 306-O12B LNP 내로 효율적으로 캡슐화될 수 있었다(도 9). fLuc mRNA의 캡슐화 후, 306-O12B LNP는 평균 지름이 112nm였다(도 2c).
실시예 2: 306-O12B LNP 제형의 최적화
생체 내 루시퍼라제 발현을 추가로 증가시키기 위해, 부형제 인지질 아이덴티티(identity), LNP 제형의 4개 성분의 몰 조성비, 및 fLuc mRNA 캡슐화된 306-O12B LNP의 지질/mRNA 중량비를 포함하여 이러한 LNP의 조립에 사용되는 다양한 제형 파라미터를 최적화하였다.
먼저, 생체 내 루시퍼라제 발현의 효능에 대한 인지질 부형제의 효과를 평가하기 위해, 구조는 유사하지만 원래의 DSPC 인지질과는 헤드 그룹 및 테일 포화도가 상이한 2개의 추가의 인지질 DOPE 및 DOPC(도 3a)를 선택하였다. DOPC와 DOPE는 각각 탄소 테일에 불포화도 1을 함유하는 반면 DSPC는 완전히 포화되어 있다. 또한, DSPC와 DOPC는 각각 4차 아민 헤드 그룹을 함유하는 반면 DOPE는 1차 아민 헤드 그룹을 함유한다. 이러한 각 특징은 문헌에서 LNP 전달 효율에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 4차화 아민 헤드 그룹은 1차 아민 헤드 그룹보다 더 강한 양성자 스폰지 효과를 나타내는 것으로 보고되었으며, 이는 카고(cargo) mRNA의 세포질로의 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 용이하게 하여 mRNA의 번역을 증가시킬 수 있다. 또한, 지질 테일의 포화도는 막 유동성에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 엔도솜 탈출에도 영향을 미칠 수 있다. 불포화 지질 테일은 더 높은 막 유동성을 초래할 수 있으며, 이는 LNP와 막의 융합 시 엔도솜 막의 불안정화를 통해 엔도솜 탈출을 개선하는 데 도움이 될 수도 있다. 4차 아민과 불포화 테일을 함유하는 DOPC로 형성된 LNP는 가장 효율적인 fLuc 전달을 보일 것이다. 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, DOPC로 제형화된 fLuc mRNA LNP는 실제로 DOPE 및 원래의 DSPC 인지질을 함유한 제형보다 간에서 훨씬 더 높은 루시퍼라제 발현을 초래하였다. DOPC 함유 LNP와 함께 전달된 fLuc mRNA는 원래의 DSPC 함유 LNP와 비교하여 약 4배 더 높은 발광 신호를 생성하였다.
초기 스크리닝에서, 활성 지질 및 부형제 성분을 [50:38.5:10:1.5]의 [지질:콜레스테롤:DSPC:DMG-PEG]의 몰비로 제형화하였다. 이 부형제 비율은 효과적인 것으로 문헌에 보고되었다. 최적의 인지질을 DOPC로 확인하고 그에 따라 제형을 조정한 후, 다양한 몰비로 제형화된 LNP를 시험하여 최적의 파라미터를 확인하였다(도 3d). 도 3e에 나타낸 바와 같이, 원래의 제형 O(50:38.5:10:1.5의 몰비의 306-O12B:콜레스테롤:DOPC:DMG-PEG)는 가장 높은 루시퍼라제 생물발광 강도를 나타냈고; 새로운 제형 파라미터 중 어느 것도 원래의 것을 능가하지 않았다.
생체 내 효능을 추가로 증가시키기 위한 노력의 일환으로, 최적 비율의 4개 성분을 갖는 LNP를 5:1 내지 25:1 범위의 활성 지질 306-O12B:mRNA의 상이한 중량비로 제형화하였다. 중량비가 7.5:1일 때 가장 높은 효능이 달성되었다. 이 시점을 초과하여 지질의 양을 증가시키는 것은 생체 내 전달 효능을 향상시키지 않는 것으로 보인다(도 3f). 총체적으로, 이러한 결과는 306-O12B LNP의 최적화된 제형이 306-O12B/mRNA의 7.5/1 중량비와 함께 50%의 306-O12B, 38.5%의 콜레스테롤, 10%의 DOPC 및 1.5%의 DMG-PEG 몰 조성을 가짐을 나타냈다.
실시예 3: mRNA 최적화된 306-O12B LNP를 사용한 Cas9 mRNA 및 sgRNA의 생체 내 간세포 특이적 동시 전달
Cas9 mRNA/sgRNA LNP에 의해 우선적으로 편집되는 특정 세포 유형의 확인은 CRISPR 전달 시스템의 잠재적 적용을 평가하는 데 중요하다. tdTomato 발현을 제어하는 LoxP 측면 정지 카세트(LoxP-Flanked STOP cassette)로 유전자 조작된 Ai14 리포터 마우스 라인을 사용하였다. 이 마우스 라인은 Cre 재조합효소(recombinase)와 함께 자주 사용되지만 LoxP 측면 정지 코돈(LoxP-flanked stop codon)의 성공적인 CRISPR 매개된 절제(excision)도 tdTomato의 발현을 유도할 것이다. 이 부위를 표적으로 하는 Cas9 및 가이드 RNA가 쌍을 이루는 경우, tdTomato 발현이 있는 세포를 조사하면 LNP 전달 시스템이 표적으로 하는 세포 유형을 알 수 있다.
이 접근법을 검증하기 위해, 306-O12B LNP를 사용하여 LoxP 표적화 sgRNA(sgLoxP)를 Ai14 작제물 및 상시 발현되는 Cas9 작제물(Ai14+/Cas9+ 마우스 모델) 모두를 발현하도록 조작된 마우스에 전달하였다. 도 10a 및 10b는 Ai14/Cas9 교차 마우스에서 306-O12B LNP 가능한 sgLoxP 매개된 게놈 편집을 보여준다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 최적화된 306-O12B LNP 시스템을 사용한 sgLoxP의 전달은 간에서 특이적으로 검출되는 적색 형광을 초래하였다. 흥미롭게도, 도 10b에 나타낸 바와 같은 추가 조직학적 분석으로 tdTomato 신호가 간의 간세포에서 주로 관찰되고, 이는 306-O12B LNP가 또한 치료에 적절한 이 세포 유형에 특이적으로 sgRNA를 전달할 수 있음을 나타냄을 밝혀냈다.
다음으로, Cas9 mRNA 및 sgLoxP를 하나의 단일 LNP 내로 공동 제형화하고 Ai14 마우스에 꼬리 정맥을 통해 1.65mg/kg의 총 RNA 용량으로 주사하였다(도 11a). 전달 7일 후, 기관을 수확하고 IVIS 시스템을 사용하여 생체 외 이미지화하였다. 마우스 기관의 이미징은 이 시스템이 실제로 적색 형광을 유도할 수 있고, 이는 mRNA 및 sgRNA 구성요소 모두의 성공적인 기능적 동시 전달을 나타내며, tdTomato 신호가 주로 간에서 검출됨을 나타냈다(도 11b). 간세포 특이적 항원에 대한 면역형광 염색도 수행하였고, 공초점 이미지는 대부분의 tdTomato 단백질이 간세포에서 발현됨을 입증하였다(도 11c). 이러한 결과는 306-O12B LNP가 Cas9 mRNA 및 gRNA를 간의 간세포로 특이적으로 수송할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: Angptl3 의 생체 내 게놈 편집
위에서 달성한 긍정적인 결과에 고무되어, 기능적 내인성 유전자 Angptl3의 발현을 조작하기 위해 Cas9 mRNA를 전달하는 306-O12B LNP의 능력을 시험하였다. Angptl3은 지단백 리파제 및 내피 리파제 활성 모두를 억제하는 지단백 대사의 중앙 조절자인 안지오포이에틴 유사 3(ANGPTL3)을 암호화한다. C57BL/6 마우스에 Cas9 mRNA 대 sgAngptl3의 상이한 질량비 2:1, 1:1.2 및 1:2로 공동 제형화된 306-O12B LNP를 총 RNA 용량 3.0mg/kg으로 주사하여 생체 내 게놈 편집 효능에 영향을 미칠 수 있는 Cas9 및 가이드 RNA의 비율을 탐색하였다. 위에서 결정된 최적화된 제형 파라미터, 즉, 몰비가 50:37.5:10:1.5(306-O12B:콜레스테롤:DOPC:PEG)이고 306-O12B:총 RNA 중량비가 7.5:1인 헬퍼 분자를 사용하여 나노입자를 제형화하였다. 주사 후 7일차에 혈청 ANGPTL3 단백질 수준의 ELISA 분석을 위해 혈청을 수집하고 DNA 추출 및 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 간 조직 샘플을 수집하여 표적화 Cas9 매개된 게놈 편집을 결정하였다. 간 조직의 게놈 편집이 도 4a에 나와 있고, 모든 Cas9 mRNA/sgAngptl3 비율에서 혈청 ANGPTL3 단백질 수준의 감소(도 4b)가 있지만, 이들 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 1:1.2의 Cas9 mRNA/sgAngptl3 비율을 다음 실험에 사용하였다. Cas9 mRNA/sgAngptl3 캡슐화된 306-O12B LNP는 평균 크기가 110nm인 fLuc mRNA LNP와 특성이 유사하였다(도 12).
상당한 수준의 편집을 감안할 때, 더 상세한 생체 내 편집 실험을 수행하였다. 금표준으로서 306-O12B LNP를 FDA 승인된 간 표적화 지질 MC-3(MC3 LNP라고 함)로 구성된, 동일한 RNA 성분을 캡슐화하는 LNP와 비교하였다. 마우스에 306-O12B LNP 또는 MC-3 LNP를 총 RNA 용량 3.0mg/kg으로 투여하였다. 투여 후 7일차에 T7E1 검정을 사용하여 간의 원하는 부위에서의 편집을 관찰하였다(도 13). 간 샘플에서 Angptl3 표적 부위의 NGS는 306-O12B LNP 매개된 전달이 MC-3 LNP 매개된 전달(14.6%)보다 상당히 높은 38.5%의 중앙 편집률을 초래함을 추가로 입증하였다(도 5a). 더욱 중요한 것은 혈청 분석 결과 306-O12B LNP 처리 그룹에서 혈청 ANGPTL3 단백질, LDL-C 및 TG 수치(각각 65.2%, 56.8%, 29.4% 감소)가 MC-3 LNP 처리된 마우스의 수치(각각 25%, 15.7%, 16.3% 감소)보다 유의하게 낮았다는 것이다(도 5a). NGS 시퀀싱 결과의 상세한 분석으로 가장 빈번한 편집 이벤트가 예측된 Cas9 절단 부위에서 정확히 1-nt 결실이었으며, 그 다음 동일한 위치에서 1-nt 삽입임이 밝혀졌다(도 5b). 예상대로 MC3 LNP 및 306-O12B LNP 처리된 간 모두에서 동일한 편집 이벤트가 관찰되었으며 주요 차이점은 이러한 이벤트의 빈도였다. 이것은 관찰된 혈청 성분 감소가 Cas9 매개된 게놈 편집의 결과일 가능성이 있음을 나타내며, 두 지질 사이에서 관찰된 결과의 차이는 순전히 전달 효율의 결과이지, Cas9 mRNA의 선천적 활성의 변화가 아님을 나타낸다.
임의의 CRISPR 전달 시스템에서, 표적 외 편집 이벤트 또는 전달 유도된 독성을 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 가장 가능성이 높은 표적 외 게놈 돌연변이유발 부위 상위 9개를 컴퓨터로 예측하고 간에서 추출한 DNA의 NGS를 통해 이러한 유전자좌를 조사하였다. 상위 9개의 예측된 표적 외 돌연변이유발 부위 중 어느 것에서도 편집의 증거가 관찰되지 않았다(도 5c). 생체 내 독성 및 잠재적인 면역염증 반응을 평가하기 위해, 간 기능 마커인 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 전염증성 사이토카인 종양 괴사 인자-알파(TNF-alpha)의 혈청 수준을 투여 후 48시간에 측정하였다. Cas9 LNP로 처리한 후 이들 마커에서 어떠한 유의한 변화도 검출되지 않았다(도 14). 또한, 혈청 사이토카인 수준, 즉 IFN-α, IL-6 및 IP-10이 투여 후 6시간에 상향 조절되는 것이 관찰되었다. 그러나 투여 후 48시간까지 모든 사이토카인의 수준이 기준선으로 돌아왔고, 이는 전달이 장기적인 전신 염증 반응을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다(도 15)."
다른 치료에 비해 CRISPR-Cas9의 엄청난 이점 중 하나는 단 한 번의 주사로 장기간 치료 효능을 생성할 수 있는 잠재력이다. 간에서의 편집 및 녹다운의 장기 지속성을 평가하기 위해, 306-O12B LNP를 총 RNA 용량 1.0, 2.0 또는 3.0mg/kg으로 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 중요하게도 단일 용량 투여 후 적어도 100일 동안 치료 효과가 안정적이라는 것이 밝혀졌다. 단일 투여 100일 후, 간에서 Angptl3의 용량 의존적 게놈 편집 및 혈청 ANGPTL3의 녹다운이 여전히 관찰되었으며, 최고 용량에서 혈청 ANGPTL3, LDL-C 및 TG 수준이 크게 감소하였다(각각 60%, 48.1% 및 8.6% 감소)(도 6a). 이것은 총 RNA 용량을 변화시켜 녹다운 효과를 적정할 수 있는 잠재적인 능력과 더 긴 시간 척도에 걸쳐 치료에 적절한 녹다운 효과를 생성하는 단일 용량의 능력을 모두 나타낸다. 장기적인 전신 독성의 증거는 관찰되지 않았다(도 6b). 또한, 지속적인 관찰은 게놈 편집이 306-O12B LNP의 단일 초기 투여 후 적어도 150일 동안 여전히 검출될 수 있음을 나타냈다(도 16). 단일 투여 후 게놈 편집 효과의 최대 지속 시간을 설정하고 혈청 지질 프로파일이 더 오랜 기간 동안 게놈 편집 프로파일과 함께 계속 추적된다는 것을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요하지만, 이는 전달 플랫폼의 장기간 효능의 유망한 지표이다.
종합하면, 이러한 결과는 306-O12B LNP가 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 통해 Angptl3에서 기능 손실 돌연변이를 유도하는 데 있어 금표준 MC-3 LNP보다 더 효율적임을 나타냈다. 간에서 Angptl3의 비바이러스성 LNP 매개된 생체 내 게놈 편집은 최소한의 표적 외 편집 이벤트, 전신 독성 또는 마우스의 염증과 함께 혈중 지질 수준의 치료에 적절한 감소를 가져왔다.
논의
생체 내 Angptl3 편집을 위한 Cas9 mRNA 및 gRNA의 간 특이적 전달이 가능한 합성, 생환원성 리피도이드 306-O12B로 구성된 매우 강력한 리피도이드 나노입자가 본원에 개시된다. 최근 몇 년 동안 CRISPR-Cas9 시스템은 질환 치료를 위해 유전적 장애를 교정하는 강력한 치료 플랫폼으로 부상하였다. 그러나 이 기술의 적용은 안전하고 효율적인 전달 비히클의 부족과 관련된 많은 이유로 인해 상당히 방해를 받았다. 첫째, Cas9-gRNA 복합체의 크기가 크기 때문에 단일 바이러스 게놈 내에서 전체 복합체를 암호화하거나 160kDa 단백질을 세포에 직접 전달하는 것이 어렵다. 둘째, 인간의 기존 항-Cas9 항체 또는 항-AAV-항체뿐만 아니라 CRISPR 시스템 또는 전달 벡터 자체에 대한 숙주 면역 반응은 극적으로 감소된 CRISPR 효능 및 잠재적인 면역독성을 초래할 수 있다. 마지막으로, CRISPR 작제물의 잠재적인 원치 않는 숙주 게놈 삽입 돌연변이유발 또는 CRISPR 시스템의 불충분한 특이성으로 인한 표적 외 게놈 편집 이벤트가 치명적인 유전독성(genotoxicity)을 유발할 수 있다. 이러한 문제 중 일부는 gRNA와 복합체를 이루는 mRNA로서 Cas9를 전달함으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA나 바이러스와 달리 mRNA는 세포핵으로 운반될 필요가 없다; mRNA의 단백질로의 번역은 세포질에서 발생하므로 전달 경로를 단순화하고 CRISPR 시스템의 삽입 돌연변이유발 가능성을 피한다. 더욱이, mRNA 화합물의 전달은 연장된 발현을 초래할 수 있는 바이러스 전달과 달리 CRISPR 구성요소의 일시적인 발현을 초래한다. 일시적인 발현은 단순히 그러한 불리한 편집 이벤트가 발생할 기회를 줄임으로써 표적 외 게놈 편집을 줄일 수 있는 것으로 시사되었다.
mRNA 매개된 CRISPR 기술의 임상 번역을 용이하게 하기 위해, 우수한 안전성, 높은 특이성 및 효능을 갖는 전달 시스템이 필요하다. 합성 바이오소재로 제조된 비바이러스성 나노입자는 생체 내에서 핵산의 세포질 전달을 개선할 가능성이 있는 것으로 나타났다. 지질 나노입자(LNP)는 RNA 전달을 위해 가장 발전된 제형 중 하나이다. 2018년 8월 미국 식품의약국(FDA)은 최초의 LNP 기반 siRNA 제형을 승인하였다. LNP의 성공에 힘입어 생체 내 mRNA 형질감염을 위해 LNP를 사용하는 엄청난 노력이 이루어졌다.
그러나 LNP 제형의 시험관 내 효능은 그 생체 내 성능을 거의 반영하지 않으며, 따라서 테일 분지형 생환원성 리피디오드 라이브러리의 생체 내 스크리닝을 직접 수행하였다. 리피도이드의 아민 헤드와 소수성 사슬 길이가 생체 내 mRNA 전달 효능을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 지질 나노입자 제형은 전형적으로 이온화 가능한 활성 지질, 인광 헬퍼 지질(phosphor helper lipid), 콜레스테롤 및 지질 고정된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된다. 이러한 구성요소의 상대적 비율은 생체 내 mRNA 전달 효능에 중대한 영향을 미칠 수 있다. 출발 제형으로서 MC-3 LNP의 공개된 제형 조건을 사용하였다. 사용된 리피도이드의 구조는 MC-3와 다르지만 공개된 LNP는 MC-3 LNP에 사용된 것과 유사한 부형제 지질을 사용한다. 부형제 지질 성분은 두 가지 유형의 LNP에서 유사한 역할을 할 수 있으므로, 유사한 부형제 비율을 사용하면 유효한 출발점이 제공된다. 생체 내 단백질 발현을 추가로 최대화하기 위해, 이러한 제형 파라미터를 본원에서 사용된 LNP에 대해 최적화하였다. LNP에 대한 최적의 제형은 306-O12B/mRNA의 중량비 7.5/1과, 50%의 306-O12B, 38.5%의 콜레스테롤, 10%의 DOPC 및 1.5%의 DMG-PEG(몰비)를 함유하였다.
이전 보고서는 ANGPTL3 항체 또는 ASO에 의한 ANGPTL3 활성의 억제가 인간에서 트리글리세라이드 및 LDL 콜레스테롤 수준의 치료적으로 유익한 감소를 제공한다는 것을 보여주었다. 또한, 특정 가족에서 자연적으로 발생하는 것으로 밝혀진 Angptl3의 완전한 기능 상실은 인간의 건강에 부정적인 결과를 초래하지 않는 것으로 보인다. Angptl3은 정맥 주사에 의한 조직 접근성으로 인해 생체 내 게놈 편집을 위한 이상적인 표적 기관인 간에서 주로 발현된다. 더불어, 이러한 특징은 Angptl3을 게놈 편집을 위한 매력적인 치료 표적으로 만든다. 306-O12B LNP와 함께 Cas9 mRNA 및 gRNA의 전달에 의해 가능해진 게놈 편집은 Ai14 모델 마우스 라인에서 형광 신호의 생체분포에 의해 결정되는 바와 같이 주로 간세포에서 발생한다. 더욱이, Angptl3의 간세포 특이적 파괴의 결과로서 혈청 트리글리세라이드 및 LDL-C 수준이 효과적으로 감소된다.
306-O12B LNP는 동일한 용량의 mRNA에서 MC-3 LNP보다 더 효율적인 게놈 편집을 유도하였다. 특히 유사한 마우스 모델에서 Angptl3의 ASO 매개된 침묵에 대한 최근의 전임상 연구는 혈청 ANGPTL3 단백질 수준의 50% 감소, LDL-C의 7% 감소 및 TG 수준의 35% 감소를 달성하였다. 306-O12B LNP를 사용한 CRISPR 매개된 녹다운의 단일 용량은 이러한 녹다운 벤치마크와 일치하거나 초과한 반면(각각 65.2%, 56.8% 및 29.4% 감소), MC3 LNP는 그렇지 않았다(각각 25%, 15.7% 및 16.3% 감소). 그 특정 ASO 마우스 연구는 1상 인간 임상 시험으로 이어졌는데, 이는 달성된 녹다운 수준이 치료적으로 적절할 가능성이 있음을 시사한다. 그러나 ANGPTL3 항체 또는 ASO 치료에 대한 인간 임상 시험과 마우스 연구를 직접 비교하는 것은 종 및 투여 요법의 차이로 인해 어려운 일이다. ASO 및 항체 치료 모두에 대한 임상 시험은 투여량 및 빈도를 기준으로 이러한 인자의 녹다운 백분율을 역가화할 수 있는 능력을 입증하였으며, 특히 최고의 실험 투여량 수준으로 환자당 약물을 여러 번 반복 투여했을 때 가장 강력한 효과를 보였다. 306-O12B LNP의 단일 주사 시 혈청 ANGPTL3 수준의 용량 의존적 감소가 관찰되었다. 이것은 임상 환경에서 LNP 시스템이 유사한 용량 및 빈도 의존적 녹다운을 달성할 수 있고 올바른 투여 계획이 이러한 임상 시험에서 보고된 것과 유사한 수준의 녹다운을 달성할 수 있음을 나타낸다. 게놈 및 단백질 수준에서뿐만 아니라 다운스트림 치료 지표에서도 검출할 수 있는 단일 용량의 녹다운 효과는 적어도 100일 동안 안정적이었다. 인간 임상 시험은 약을 투여받은 후 1주일 이내에 최대 녹다운 효과를 나타냈으며, 이후 몇 달 동안 혈청 수치가 서서히 기준선으로 돌아왔다. 이러한 결과는 예상된 것이지만 CRISPR은 표적 세포의 게놈에 영구적인 변화를 일으키는 반면 ASO와 항체는 일시적인 치료이므로 이 차이는 특히 주목할 만하며 엄청난 치료 결과를 가져올 수 있다.
생체 내 CRISPR mRNA 전달은 투여 후 적어도 1년 동안 지속되는 게놈 녹다운을 초래할 수 있다. 혈청 지질 수준의 철저한 분석은 투여 후 100일까지만 수행하였지만 시퀀싱 데이터는 적어도 150일까지 지속되는 게놈 편집을 나타냈다. 개시된 데이터는 시간이 지남에 따라 게놈 편집 효율성이 매우 약간 감소함을 나타내며 이는 예상 수명이 약 300일인 간의 간세포의 느린 턴오버(turnover)를 반영할 수 있다. 주사 후 150일에 검출된 3mg/kg 용량의 게놈 편집 효율(31%)은 주사 후 100일 만에 검출된 낮은 2mg/kg 용량의 편집 효율(22%)보다 여전히 더 높다. 22%의 게놈 편집률은 ANGPTL3 단백질과 혈청 콜레스테롤 및 LDL-C를 통계적으로 유의하게 감소시키기에 충분하였다. 따라서, 전체 치료 측정 지표도 5개월 이상까지 상당한 녹다운을 보일 가능성이 높다. 이 점은 추가 연구가 필요하다.
게놈 편집 효능에 더하여, 표적 외 효과가 CRISPR-Cas9 기술의 임상 번역에 대한 주요 관심사이다. 표적 외 효과는 표적 외 전달 효과(즉, 간 약물을 신장으로 전달하는 것)와 생물학적 표적 외 편집(즉, 의도하지 않은 게놈 유전자좌에서의 편집 이벤트)의 두 가지 맥락에서 논의될 수 있다. 이 작업에서 루시퍼라제 및 tdTomato 모델 시스템은 간, 특히 간세포로의 특정 전달을 입증하는 데 사용되어 표적 외 전달 효과를 크게 최소화한다. 생물학적 표적 외 편집 문제를 해결하기 위해, Angptl3에 대한 고도로 특정한 sgRNA 표적은 표적 외 편집 이벤트를 완화하기 위해 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 기반 설계 도구를 사용하여 설계하였다. 표적화 NGS 데이터로 Cas-Off-Finder가 예측한 상위 9개의 표적 외 위치에서 간에서의 편집이 검출되지 않았음을 확인하였다. 전체 게놈 시퀀싱 및 바이러스 매개된 CRISPR 전달 또는 기타 가이드 서열에 대한 직접 비교와 같은 기술을 사용하는 추가 연구가 일반적인 간 전달 적용을 위한 개시된 플랫폼의 안전성을 추가로 검증하는 데 필요할 수 있지만, 여기에 제시된 데이터는 조사된 조건 하에서 306-O12B LNP가 표적 외 전달 및 표적 외 편집 모두와 관련하여 매우 특이적인 것으로 밝혀졌음을 시사한다. 전신 관점에서, LNP 시스템은 간 건강의 마커인 ALT 또는 AST 수준에 유의한 변화를 일으키지 않았으며, 개시된 데이터는 LNP가 간에서 검출할 수 있을 정도의 독성은 없음을 나타낸다. 유사하게, TNF-알파의 상당한 변화의 결여는 LNP 전달이 상당한 면역 반응을 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. 더불어, 이것은 개시된 처리가 마우스에서 안전하다는 것을 나타낸다.
이 연구의 결과는 클리닉에서 CRISPR 게놈 편집 시스템의 전신 전달을 발전시킬 수 있다. 최종 임상 적용을 실현하기 위해서는 만성 내약성, 표적 외 효과 및 대형 동물에서의 효능에 대한 더 상세한 전임상 연구가 진행되어야 한다. 전반적으로 306-O12B LNP는 임상적으로 적절한 간 특이적 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 위한 매우 강력하고 안전한 비바이러스성 전달 플랫폼이다.
실시예 5: 리피도이드의 합성 및 mRNA 로딩된 LNP의 생체 내 스크리닝
생체 내 siRNA, ASO 및 mRNA 전달을 위한 유망한 아민 후보로서 이전에 입증된 306 아민 헤드로 지칭되는 특정 아민 헤드 3,3'-디아미노-N-메틸디프로필아민을 기반으로 생환원성 리피도이드 세트를 생성하였다. 이러한 리피도이드는 무용매 마이클 첨가 반응을 사용하여 306 아민 헤드를 3개의 에스테르 결합이 포함된 알킬-아크릴레이트 테일(O-시리즈) 및 아미드 결합을 함유하는 3개의 알킬-아크릴레이트 테일(N-시리즈)과 반응시켜 생성하였다(도 21b). 이어서, LNP를 50%의 합성 활성 리피도이드, 38.5%의 콜레스테롤, 10%의 DOPC 및 1.5%의 DMG-PEG2000 몰비로 mRNA 전달을 위한 306-O12B LNP의 이전에 최적화된 제형화 조건으로 제형화하였다. 이러한 LNP의 생체 내 전신 mRNA 전달 프로파일을 조사하기 위해, IVIS 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 생체 내에서 쉽게 시각화할 수 있는 리포터 단백질인 반딧불이 루시퍼라제를 암호화하는 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(fLuc mRNA)를 캡슐화하였다. O-시리즈 LNP(306-O12B, 306-O14B 및 306-O16B) 처리된 마우스의 생물발광 신호는 주로 간에 위치하였다(도 21a, 도 21c 및 도 25a). 놀랍게도, fLuc mRNA는 거의 전적으로 N-시리즈 LNP(306-N12B, 306-N14B 및 306-N16B)에 의해 폐로 전달되었다(도 21a, 도 21c 및 도 25b). 상이한 조직 균질액에서의 루시퍼라제 단백질의 정량화는 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP를 사용한 루시퍼라제 암호화된 mRNA의 번역이 각각 주로 간 및 폐에 위치함을 추가로 입증하였다(도 25a 및 도 25b). 상이한 기관 표적화 프로파일에 더하여, 테일 길이는 이 두 시리즈 LNP의 mRNA 전달 효능에 대해 정확히 반대 효과를 나타냈다. O-시리즈 LNP의 경우 306-O12B가 가장 높은 효능을 보였고, N-시리즈 LNP의 경우 306-N16B > 306-N14B > 306-N12B의 순으로 효능 경향을 보였다.
실시예 6: N-시리즈 LNP의 2세대 라이브러리로 테일 구조 의존적 폐 선택성을 확인하였다
아민 헤드 구조가 리피도이드와 생성된 LNP의 물리적-화학적 특성에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 고려하면, LNP의 생체 내 운명에 후속적으로 영향을 미칠 것이다. 상이한 아민 및 알킬-테일 구조를 함유하는 O-시리즈 LNP에 의해 허용되는 간 표적화 mRNA 전달은 광범위하게 탐구되고 입증되었다. 따라서, 306 이외의 아민을 사용하는 N-시리즈 LNP에 의해 가능한 테일 구조 의존적 폐 표적화 mRNA 전달이 확인되었다. 따라서, N16 테일을 80, 113, 304, 400 및 401 아민과 반응시켜 N-시리즈 리피도이드의 2차 라이브러리를 합성하였다(도 22a). 이러한 리피도이드를 갖는 fLuc mRNA 캡슐화 LNP를 제조하고 생성된 LNP의 생체 내 기관 선택성을 조사하였다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, 루시퍼라제 생물발광 신호는 이러한 모든 N-시리즈 LNP에 대해 폐에서 주로 관찰되었으며, 이는 이러한 LNP의 폐 선택성이 리피도이드 링커 테일 구조, 즉 아미드 연결에 의해 결정됨을 확인시켜준다.
실시예 7: 306-N16B LNP는 mRNA의 폐 내피 세포로의 전달을 가능하게 한다
mRNA 기반 치료제의 임상 번역은 관심 기관 및 세포 유형으로의 특정 mRNA 전달을 필요로 한다. N-시리즈 LNP가 mRNA를 인간 호흡기 시스템의 주요 기관인 폐에 특이적으로 전달하는 능력을 감안할 때. 폐는 내피, 상피 및 면역 세포의 기능 장애로 인한 많은 호흡기 질환의 영향을 받을 수 있다. 따라서, 폐 질환의 치료에서 개시된 폐 표적화 LNP의 잠재적 적용에 대한 추가 평가를 위해 어떤 폐세포 하위집단이 특이적으로 형질감염되었는지 확인하는 것이 중요하다. tdTomato 단백질의 세포 유형별 발현을 달성하기 위해 널리 사용되는 유전자 조작된 Cre/LoxP Ai9 리포터 마우스 라인을 활용하였다. 편집된 세포에서 tdTomato 형광 신호의 발현을 활성화하기 위해 정지 카세트를 절단하는 Cre 재조합효소를 암호화하는, Cre mRNA를 운반하는 306-N16B LNP를 Ai9 마우스에 주사하였다(도 23a). 처리된 마우스로부터 수집한 기관의 생체 외 이미지에 나타난 바와 같이, 적색 tdTomato 신호가 폐에서 특이적으로 검출되었다(도 23b). 조직 절편을 내피, 상피 및 대식세포 세포에 대한 형광 염료 표지 항체로 면역 염색하여 폐에서 편집된 특정 하위 세포 집단에 대한 초기 통찰력을 얻었다. 흥미롭게도, 적색 tdTomato 신호는 주로 폐 내피 세포에 국한된 반면, 상피 또는 대식세포 세포와의 공동 국소화는 거의 관찰되지 않았다(도 23c). 폐에서 형질감염된 특정 세포 유형을 추가로 정량화하기 위해, 폐 조직을 단일 세포 현탁액으로 진행하고 유세포분석을 사용하여 분석하였다. 폐 내피의 ~33.6%가 형질감염된 반면, 상피(~1.66%) 및 대식세포 세포(~1.92%)의 매우 작은 부분이 형질감염되었다(도 23d). 이러한 결과는 306-N16 LNP가 mRNA를 폐 내피 세포에 선택적으로 전달할 수 있음을 시사하며, 이는 내피 세포와 관련된 폐 질환에 대한 잠재적인 치료 적용의 추가 개발에 중요하다.
실시예 8: 306-N16B LNP는 게놈 편집 Cas9 mRNA의 폐 특이적 전달을 가능하게 한다
위에서 입증된 바와 같이, 306-N16B LNP는 fLuc mRNA 및 Cre mRNA를 폐에 특이적으로 전달할 수 있고, 이 두 mRNA의 길이는 2000개의 뉴클레오티드 미만(fLuc mRNA의 경우 1960개의 뉴클레오티드이고 Cre mRNA의 경우 1350개의 뉴클레오티드)이다. 일부 특정 질환은 더 큰 mRNA 분자의 전달이 필요할 수 있다. 306-N16B LNP가 유사하게 더 긴 mRNA를 폐로 전달할 수 있는 가능성을 가질 수 있는지를 시험하였다. 306-N16B LNP를 fLuc mRNA보다 3배 넘게 긴 4521개의 뉴클레오티드를 가진 게놈 편집 mRNA인 Cas9 mRNA로 제형화한 다음 LNP를 Babl/c 마우스에 주사하였다. 6시간 후, 마우스를 희생시키고, 다양한 기관에서 Cas9 단백질 발현을 검출하기 위한 추가 웨스턴 블롯 분석을 위해 기관을 수집하였다. 특히, Cas9 단백질은 폐에서만 검출될 수 있으며(도 26), 이는 Cas9 mRNA의 폐로의 306-N16B LNP 매개된 특이적 전달을 나타낸다. 306-N16B LNP는 특정 게놈 편집을 통해 유전성 폐 질환을 치료하는 데 엄청난 잠재력을 가지고 있다.
실시예 9: 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에서 단백질 코로나를 구성하는 단백질의 특성화
나노입자(NP)의 외부 표면은 정맥 내 투여 직후에 생체분자 코로나 층으로 즉시 차폐되며, 이는 NP의 표면 특성을 극적으로 변경하고 이의 생체 내 운명을 결정할 수 있는 것으로 여겨진다. NP 표면에서의 특정 혈장 단백질의 제어된 흡착은 NP를 특정 기관으로 선택적으로 보낼 수 있는 표적 분자 역할을 할 것이다. 306-O12B 및 306-N16B LNP의 극적으로 상이한 생체 내 기관 표적화 가능성은 표면에 형성된 혈청 단백질 때문일 수 있다. 306-O12B 및 306-N16B LNP의 단백질을 확인하고 정량화하기 위해, 이 두 LNP를 마우스 혈장과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 원심분리 후 PBS로 광범위하게 세척하여 단백질 코팅된 LNP를 분리 및 회수하였다. 이어서, LNP의 단백질 구성을 분석하기 위해 프로테오믹스를 수행하였다. 1838개 및 1088개의 단백질이 각각 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에서 확인되고 정량화되었다. 벤다이어그램은 306-O12B LNP와 306-N16B LNP 사이의 공통 단백질과 고유 단백질을 보여주었다(도 27). 각 LNP에 대해 단백질 코로나에서 우세한 역할을 할 수 있는 가장 풍부한 코로나 단백질 상위 20개를 상기 표 1에 나열하였다. 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP는 상위 20개 단백질 중에서 6개의 공통 단백질만 공유했으며, 이는 LNP 표면에 흡수된 단백질이 LNP의 생체 내 표적화 가능성을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 이전 연구에서는 LNP의 간으로의 아포지단백 E(ApoE) 매개된 전달이 보고되었다. ApoE는 간 표적화 306-O12B LNP의 코로나에서 두 번째 우세한 단백질 구성으로 확인되었으며(도 24a), 이는 문헌 보고와 일치한다. 반대로, 폐 표적화 306-N16B LNP의 코로나에서 상위 3개 단백질 구성은 혈청 알부민, 피브리노겐 베타 사슬 및 피브리노겐 감마 사슬이다(도 24b). 피브리노겐의 코팅은 내피 세포 부착과 내피화(endothelialization)를 향상시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나 mRNA의 폐 내피로의 306-N16B LNP 매개된 전달이 피브리노겐 의존적 메커니즘을 통한 것인지는 더 입증되어야 한다.
상위 20개 단백질을 분자량(Mw)에 따라 분류한다(도 24c). 이 두 LNP 사이에 약간의 차이가 관찰되었는데, 306-O12B LNP의 단백질 코로나는 Mw < 60kDa인 단백질이 80%로 저분자량 단백질이 풍부하였다. 그러나 306-N16B LNP의 단백질 코로나에 있는 단백질의 55%는 60kDa 초과이다. 단백질을 등전점(isoelectric point, pI)에 따라 분류하였다. 도 24d에 나타낸 바와 같이, 생리학적 pH 7.4에서 음전하를 나타내는 단백질(pI < 7)의 50% 및 80%가 각각 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP의 단백질 코로나를 구성한다. 양으로 하전된 NP는 음으로 하전된 단백질을 끌어당기는 것을 선호하는 것으로 시사되었다(M. P. Monopoli 등, Physical-Chemical Aspects of Protein Corona: Relevance to in Vitro and in Vivo Biological Impacts of Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 133, 2525-2534 (2011)). 그러나 두 LNP의 제타 전위의 유의한 차이는 관찰되지 않았고, 두 LNP 모두 약간의 표면 음전하를 나타냈으며(표 2), 이는 표면 전하가 생물학적 유체에서 나노입자와 단백질 사이의 상호작용에 영향을 미치는 유일한 요인이 아닐 수 있음을 나타낸다. 이들의 생물학적 기능에 관한 단백질을 도 24e에 나타낸 바와 같이 추가로 분류하였다. 기능적 관점에서 306-O12B LNP와 306-N16B LNP에 풍부한 단백질은 매우 유사한 기능을 하는 것으로 밝혀졌으며 모두 지질 대사, 보체 활성화, 면역 반응, 급성기 반응 및 응고와 관련이 있다. 그러나 다른 혈장 단백질을 제외하고 306-O12B LNP의 코로나에서 가장 풍부한 단백질은 지질 및 콜레스테롤 대사에 관여하는 아포지단백이라는 점에 유의해야 한다(도 24e). 응고 관련 코로나 단백질은 306-N16B LNP의 코로나에서 가장 큰 부분을 나타내는 반면(도 24E).
총체적으로, 이러한 발견은 이들 두 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에 형성된 단백질 코로나가 이들 두 LNP의 생체 내 운명을 결정하는 데 지배적인 역할을 하는, 단백질 조성, 분획 및 생물학적 기능에 있어서 상이하다는 것을 설명한다.
논의
최근 몇 년 동안 메신저 RNA(mRNA) 치료제를 전달하기 위해 LNP를 사용하는 데 관심이 증가하고 있다. 시험관 내 합성 mRNA는 AIDS, 지카(Zika), 희귀 질환, 암 및 코로나바이러스를 포함한 광범위한 질환을 제어하고 치료하기 위해 "생체 내"에서 치료에 적절한 단백질을 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 인간의 건강에 도움이 되는 이 변형 기술을 활용하려면 이환된 기관과 세포에 mRNA를 보내 치료 단백질의 특정 발현을 가능하게 하고, 후속적으로 원하는 치료 효과를 생성해야 한다. 지질 나노입자(LNP)는 핵산 전달을 위한 선도적인 비바이러스성 전달 시스템 중 하나이며 mRNA 전달을 위해 LNP를 사용하기 위해 상당한 노력을 기울였다. 그러나 개발된 LNP의 대부분은 전신 투여 후 간을 표적으로 하므로 LNP를 폐, 신장, 심장 및 뇌와 같은 다른 기관으로 보내기 위한 새로운 전략이 요구되는 것이 사실이다. 이미다졸, 아다만틸 및 신경전달물질과 같은 특정 아민 헤드를 함유하는 일부 LNP는 mRNA, siRNA 및 ASO를 비장과 뇌로 전달하는 것으로 알려져 있다. 이러한 LNP는 노동 집약적인 스크리닝 접근법을 통해 확인되었으며, 예측 가능한 기관 선택성을 가진 LNP의 합리적인 설계를 안내하는 공통 규칙을 생성하는 것은 현재 여전히 불가능하다. 최근에 Siegwart 연구실은 여분의 부형제를 추가하여 간외 조직, 예를 들어, 폐 및 비장을 표적으로 하도록 LNP를 조작하는 선택적 기관 표적화(selective organ targeting, SORT) 전략을 발견하고 개발하였다. 이러한 발전은 흥미롭지만 원래의 4개 구성 요소 시스템을 5개 구성 요소로 만들었기 때문에 제형이 다소 불리하게 복잡해졌다.
LNP 제형을 복잡하게 하지 않으면서 리피도이드 테일의 링커 구조를 간단히 변경함으로써 LNP의 생체 내 기관 선택성이 정밀하게 조정될 수 있다는 것이 본원에 개시되어 있다. 링커를 에스테르 결합(O-시리즈라고 함)에서 아미드 결합(N-시리즈라고 함)으로 변경함으로써, LNP로 가능한 mRNA 전달 특이성이 간에서 폐로 전환되었다. 이 발견은 306-아민 헤드 기반 O-시리즈 및 N-시리즈 LNP에서 처음 관찰되었다. N-시리즈 LNP의 2차 라이브러리의 mRNA 전달 표적화 가능성을 조사함으로써, 아미드 결합 연결에 의해 가능한 폐 표적화 능력이 일반적으로 다른 종류의 아민 헤드에 적용 가능하다는 것을 확인하였다. 폐로의 표적화 RNA 전달은 매력적인 개념으로, 다양한 폐 질환 치료를 위해 현재 "약물 치료가 불가능한(undruggable)" 표적으로 정의되는 표적에 엄청난 기회를 제공한다. 이 연구에서 306-N16B LNP는 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 염증 및 혈전증과 관련된 중요한 치료 표적인 폐 내피 세포로 mRNA를 특이적으로 수송할 수 있음이 입증되었다.
O-시리즈 LNP와 N-시리즈 LNP 간의 이러한 작은 구조적 차이가 기관 선택성이 극적으로 다르게 하는 이유를 설명하기 위해 프로테오믹스 연구를 수행하였다. 이 두 테일 구조는 순환 중에 LNP의 표면에 형성된 코로나의 단백질 구성을 어떻게든 조절하는 약간의 별개의 혈청 단백질에 대한 특정 친화력을 가질 수 있다. 단백질 코로나가 나노입자의 생체 내 운명을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 개시된 결과는 306-O12B와 306-N16 LNP의 단백질 코로나에서 흡수된 혈장 단백질의 수와 유형이 다르다는 것을 보여준다. 이 두 LNP에서 가장 풍부한 상위 20개 단백질 중에서 6개의 공통 단백질만 발견되었다. 두 단백질 코로나에서 동일한 단백질 세트가 발견되더라도, 단백질 코로나 층에서 무작위로 배향되기 때문에 생물학적 기능이 완전히 상이할 수 있다. 한 가지 예는 ApoE이다. 한편으로는, 내인성 ApoE가 정맥 주사 후 LNP 표면에 흡수되어 지단백 수용체 매개된 엔도사이토시스에 의해 캡슐화된 RNA의 간세포로의 수송을 촉진하는 반면, ApoE는 나노입자를 뇌로 유도하기 위해 배치될 수도 있다고 널리 보고되었다.
요약하면, 본 연구는 리피도이드 테일 화학과 mRNA 전달을 위한 기관 선택성 사이의 구조-활성 관계의 강한 상관관계를 입증하였다. 프로테오믹스를 사용한 기계론적 연구는 이 두 LNP의 단백질 코로나의 단백질 구성이 다르다는 것을 보여주었고, 이는 고유 테일 구조가 LNP의 표적화 가능성에 영향을 미칠 수 있는 생물학적 유체와 LNP의 상호작용에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 그러나 이러한 고유 단백질이 기관 표적화 가능성에 미치는 영향을 완전히 밝히기 위해서는 추가 연구가 수행되어야 한다. 이 작업의 결과는 지질 구조가 단백질 코로나 기능을 조작하여 LNP의 생체 내 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 근본적인 이해를 제공한다.
실시예 10: N-시리즈 리피도이드의 합성 및 mRNA 로딩된 LNP의 생체 내 스크리닝
아크릴아미드 테일(N16B, N14B 및 N12B)을 무용매 마이클 첨가 반응을 사용하여 상업적으로 이용 가능한 상이한 아민 헤드와 반응시켜 9개의 생환원성 N-시리즈 리피도이드를 생성하였다(도 28a). 이어서, LNP를 50%의 합성 활성 리피도이드, 38.5%의 콜레스테롤, 10%의 DOPC 및 1.5%의 DMG-PEG2000 몰비로 mRNA 전달을 위해 이전에 최적화된 LNP의 제형화 조건으로 제형화하였다. 이러한 LNP의 생체 내 전신 mRNA 전달 프로파일을 조사하기 위해, IVIS 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여 생체 내에서 가시화할 수 있는 리포터 단백질인 반딧불이 루시퍼라제를 암호화하는 반딧불이 루시퍼라제 mRNA(fLuc mRNA)를 캡슐화하였다. 흥미롭게도, N-시리즈 LNP 처리된 마우스의 생물발광 신호는 주로 폐에 위치하였다(도 28b). 또한, 리피도이드의 화학 구조가 제형화된 LNP의 생체 내 mRNA 전달 효능을 결정하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 도 28c에 나타낸 바와 같이, 주사 후 6시간에 폐에서 정량화된 루시퍼라제 생물발광 강도는 306 아민 헤드와 통합된 LNP가 304 및 113 LNP와 비교하여 가장 높은 전달 효능을 나타냄을 입증한다. 또한, 전달 효능은 리피도이드의 테일 길이가 증가함에 따라 증가하는데, N16B 테일을 갖는 리피도이드가 N14B 및 N12B 테일을 갖는 것보다 가장 높은 효능을 나타냈다.
실시예 11: N-시리즈 LNP의 아민 헤드 구조의 변경에 의한 상이한 폐 세포 이하 집단의 표적화
mRNA 기반 치료제의 임상 번역은 관심 기관 및 세포 유형으로의 특정 mRNA 전달을 필요로 한다. 폐는 내피, 상피 및 면역 세포를 포함한 여러 세포 구획의 기능 장애로 인해 발생하는 많은 질병의 영향을 받을 수 있다. 특이적으로 형질감염된 폐세포 하위 집단을 확인하기 위해, 유전자 조작된 Cre/LoxP Ai14 리포터 마우스 라인을 사용하여 tdTomato 단백질의 세포 유형별 발현을 달성하였다. Ai14 마우스에 2개의 가장 강력한 폐 표적화 LNP(306-N16B 및 113-N16B)를 주사하였다. Cre 재조합효소를 암호화하는 Cre mRNA가 이러한 실험에서 mRNA 카고로 사용되었다. Cre 재조합효소는 일단 세포로 전달되면 정지 카세트를 제거하고 편집된 세포에서 tdTomato 형광 신호의 발현을 활성화한다(도 29a). 처리된 마우스로부터 수집한 기관의 생체 외 이미지(도 29b 및 29c)에 나타난 바와 같이, 적색 tdTomato 신호는 306 및 113-N16B LNP 처리된 마우스 모두의 폐에서 특이적으로 검출되었고, tdTomato 양성 세포는 폐 절편의 공초점 이미징을 사용하여 관찰하였다. 폐에서 형질감염된 특정 세포 유형을 추가로 확인하고 정량화하기 위해, 폐 조직을 단일 세포 현탁액으로 처리하고 유세포분석을 사용하여 분석하였다. 306-N16B LNP의 경우, 상피의 1.5% 및 대식세포의 1.9%와 비교하여 폐 내피의 33.6%가 형질감염되었으며(도 29b), 이는 306-N16 LNP가 폐 내피 세포에 선택적으로 mRNA를 전달할 수 있음을 나타낸다. 대조적으로, 113-N16B LNP는 Cre mRNA를 내피 세포(전체 내피 세포의 69.6%가 형질감염됨)에 우선적으로 전달했지만, 대식세포(18.9%) 및 상피(7.3%)에도 전달하였다(도 29c). 이러한 발견은 N-시리즈 LNP의 헤드 구조를 간단히 조정함으로써 다양한 폐세포 집단을 표적으로 하여 특정 폐세포와 관련된 폐 질환에 대한 잠재적인 치료 적용을 위한 단계를 설정할 수 있음을 보여준다.
실시예 12: 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에서 단백질 코로나를 구성하는 단백질의 특성화
나노입자(NP)의 외부 표면은 정맥 내 투여 직후 생체분자 코로나 층으로 즉시 차폐되며, 이는 NP의 표면 특성을 극적으로 변화시키고 생체 내 운명을 결정할 수 있는 것으로 여겨진다. NP 표면에서 특정 혈장 단백질의 제어된 흡착은 NP를 특정 기관으로 선택적으로 유도할 수 있다. O-시리즈 LNP가 mRNA를 간으로 특이적으로 전달할 수 있다는 것이 이전에 보고되었다(M. Qiu 등, Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118, e2020401118 (2021)). O- 및 N-시리즈 LNP의 극적으로 상이한 생체 내 기관-표적화 가능성(도 30a)은 그 표면에 형성된 혈청 단백질에 기인할 수 있다(도 30b). 이를 시험하기 위해, 2개의 대표적인 LNP인 306-O12B 및 306-N16B의 단백질을 확인하고 정량화하였다. 이 두 LNP를 마우스 혈장과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 원심분리 후 PBS로 광범위하게 세척하여 단백질 코팅된 LNP를 분리 및 회수하였다. 이어서, LNP의 단백질 구성을 분석하기 위해 프로테오믹스를 수행하였다. 1838 및 1088 단백질이 각각 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에서 확인되고 정량화되었다.
표 3에 각 LNP에 대해 단백질 코로나에서 우세한 역할을 할 수 있는 가장 풍부한 코로나 단백질 상위 20개를 나열하였다. 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP는 상위 20개 중에서 6개의 공통 단백질만을 공유하였으며, 이는 LNP 표면에 흡수된 단백질이 생체 내 표적화 가능성에 참여할 수 있음을 시사한다. ApoE는 간 표적화 306-O12B LNP의 코로나에서 두 번째 우세한 단백질 구성으로 확인되었으며, 이는 간으로의 LNP의 아포지단백 E(ApoE) 매개된 전달을 입증하는 선행 연구와 일치한다(도 24a). 대조적으로, 폐 표적화 306-N16B LNP의 코로나에 있는 상위 3개 단백질은 혈청 알부민, 피브리노겐 베타 사슬 및 피브리노겐 감마 사슬이다(도 24b). 피브리노겐 코팅이 내피 세포 접착 및 내피화를 향상시킬 수 있다고 보고되었다.
진한 파란색으로 강조 표시된 단백질은 표시된 LNP의 상위 20개 중 고유한 단백질이다.
상위 20개 단백질을 분자량(Mw)에 따라 추가로 분류하였다(도 24c). 306-O12B LNP의 단백질 코로나는 Mw < 60kDa인 단백질이 80%로 저분자량 단백질이 풍부한 반면, 306-N16B LNP의 단백질 코로나에 있는 단백질의 55%는 60kDa 초과이다. 단백질은 또한 등전점(pI)에 따라 분류하였다. 도 24d에 나타낸 바와 같이, 생리학적 pH 7.4에서 음전하를 나타내는 단백질(pI < 7)의 50% 및 80%가 각각 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP의 단백질 코로나를 구성한다.
마지막으로, 단백질을 생물학적 기능에 따라 분류하였다(도 24e). 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에 풍부한 단백질은 지질 대사, 보체 활성화, 면역 반응, 급성기 반응 및 응고와 관련이 있다. 그러나 다른 혈장 단백질을 제외하고 306-O12B LNP의 코로나에서 가장 풍부한 단백질은 지질 및 콜레스테롤 대사에 관여하는 아포지단백인 반면(도 24e), 응고 관련 코로나 단백질이 306-N16B LNP의 코로나에서 가장 큰 부분(도 24e)을 나타낸다. 종합적으로, 이러한 발견은 306-O12B LNP 및 306-N16B LNP에 형성된 단백질 코로나가 생체 내 조직 표적화를 결정하는 데 중요한 역할을 할 수 있는, 단백질 조성, 분획 및 생물학적 기능이 상이하다는 것을 보여준다.
실시예 13: 306-N16B LNP는 게놈 편집 Cas9 mRNA의 폐 특이적 전달을 가능하게 한다
본원에서 입증된 바와 같이, 306-N16B LNP는 fLuc mRNA 및 Cre mRNA를 폐로 특이적으로 전달할 수 있다. 이 두 mRNA의 길이는 2000개의 뉴클레오티드 미만이다(fLuc mRNA의 경우 1960개의 뉴클레오티드이고 Cre mRNA의 경우 1350개의 뉴클레오티드). 일부 특정 질환은 더 큰 mRNA 분자의 전달이 필요할 수 있다. 306-N16B LNP가 유사하게 더 긴 mRNA를 폐로 전달할 수 있는 가능성이 있는지를 시험하였다. 306-N16B LNP를 fLuc mRNA보다 3배 넘게 긴 4521개의 뉴클레오티드를 가진 게놈 편집 mRNA인 Cas9 mRNA로 제형화한 다음 LNP를 Babl/c 마우스에 주사하였다. 6시간 후, 마우스를 희생시키고, 다양한 기관에서 Cas9 단백질 발현을 검출하기 위한 추가 웨스턴 블롯 분석을 위해 기관을 수집하였다. 특히, Cas9 단백질은 폐에서만 검출될 수 있으며(도 35), 이는 Cas9 mRNA의 폐로의 306-N16B LNP 매개된 특이적 전달을 나타낸다.
306-N16B LNP가 Cas9 mRNA를 폐에 특이적으로 전달할 수 있음을 확인한 후, 306-N16B LNP의 Cas9 mRNA 및 s 단일 가이드 RNA가 폐에 함께 전달되어 폐 특이적 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 가능하게 하는지 시험하였다. 이를 시험하기 위해, Ai14 마우스에 Cas9 mRNA 및 LoxP 표적화 sgRNA(sgLoxP) 로딩된 306-N16B LNP를 1.67mg/kg의 총 RNA 용량(Cas9 mRNA/sgLoxP = 1/1.2, 중량/중량)으로 주사하고 주사 후 7일차에 유전자 편집 특이성을 분석하였다(도 31a). 도 31b에 나타낸 바와 같이, 주로 폐에서 형광 신호가 관찰되었고 간에서도 약한 형광 신호가 관찰되었다. tdTomato 양성 세포는 조직 절편의 현미경 이미지에서 볼 수 있다(도 31c). 결과는 306-N16B LNP가 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 마우스의 폐와 간 모두에 동시 전달하여 게놈 편집 적용을 허용할 수 있음을 나타냈다. 그러나 306-N16B LNP는 거의 독점적으로 mRNA를 폐로 전달할 수 있는 단일 mRNA 전달과 비교하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 동시 전달하는 데 있어 조직 선택성이 덜한 것으로 밝혀졌다. 이것은 더 짧은 sgRNA의 통합이 형성된 LNP의 물리적 특성을 변경하고 LNP의 기관 향성(organ-tropism)을 변경할 수 있음을 나타낸다. LNP 제형에 추가 구성 요소를 포함시키면 전달 효율과 향성을 변경할 수 있다.
실시예 14: 생체 내 LAM 치료를 위한 폐 표적화 TSC2 mRNA 전달용 LNP
폐 림프관평활근종증(LAM)은 복합 결절성 경화증 1 또는 2(TSC1 또는 TSC2) 유전자의 돌연변이 불활성화에 의해 야기되는 이상 mTORC1 과잉활성을 특징으로 하는 희귀 유전성 폐 질환이다. mTORC1 억제제인 라파마이신(시놀리무스)(rapamycin(sirolimus))은 LAM 치료용으로 FDA 승인을 받았지만 폐 기능의 지속적인 상실과 폐 이식의 필요성이 여전히 발생할 수 있다. 따라서, LAM 치료를 위한 새로운 치료법을 개발하는 것이 시급하다. 따라서, 폐를 표적으로 하는 LNP가 LAM의 치료를 위해 TSC2 유전자를 암호화하는 mRNA를 전달할 수 있는지를 평가하였다.
확립된 LAM 모델에서 사용되는, 마우스 TSC2-결손 TTJ 세포로 EGFP mRNA를 전달하는 LNP의 실현 가능성을 시험하였다. 시험관 내에서, 폐를 표적으로 하는 306-N16B LNP는 mRNA를 TTJ 세포로 수송하는데 낮은 전달 효능을 보였지만, 간을 표적으로 하는 306-O12B LNP는 상대적으로 더 높은 형질감염 효율을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 34a). 따라서, 50%의 306-O12B 및 50%의 306-N16B의 몰비로 제형화된 하이브리드 LNP(hLNP로 지칭됨)를 설계하였다(도 32a). 이러한 하이브리드 LNP는 카고를 TTJ 세포로 효율적으로 전달할 수 있으며 생체 내 폐 표적화 전달도 달성할 수 있다. 흥미롭게도, 이러한 hLNP는 306-O12B 및 306-N16B LNP와 비교할 때 TTJ 세포에 대해 훨씬 더 높은 형질감염 효율을 나타냈고, EGFP의 균일한 발현이 관찰되었다(도 34b).
hLNP가 생체 내에서 TSC2-결핍 세포에 mRNA를 전달할 수 있는지를 결정하기 위해, 이전에 보고된 바와 같이 TTJ 세포를 동계 6주령 C57BL/6J 마우스에 정맥 내 주사하여 폐에 LAM 유사 결절을 형성시켰다. EGFP mRNA를 캡슐화하는 hLNP를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 마우스를 희생시키고 주사 후 6시간 후에 폐를 수집하였다. 폐에서의 EGFP 발현은 면역조직화학(IHC)을 통해 분석하였다. 놀랍게도, 도 32b에 나타낸 바와 같이, EGFP 발현은 TTJ 유래 종양 결절에서 주로 검출되었지만 인접한 정상 폐 조직에서는 검출되지 않았다. 포스포-S6(TSC2-결핍 세포의 마커) 면역염색은 포스포-S6 및 EGFP의 강력한 공동 국소화를 나타냈고(도 32c), 이는 hLNP가 TTJ 세포로의 EGFP mRNA의 특이적 전달을 가능하게 한다는 것을 확인시켜 주었다.
다음으로 이 전임상 모델에서 Tsc2 mRNA가 로딩된 hLNP의 치료 효과를 평가하였다. 전체 길이(5445개의 뉴클레오티드) 마우스 야생형 Tsc2 mRNA를 시험관 내에서 전사하였다. 시험관 내에서, 이 mRNA는 TSC2-결핍 세포에서 포스포-S6의 발현을 억제했으며(도 26a-26b), 이는 mTORC1 경로의 성공적인 억제를 나타낸다. 유사하게, 환자 유래 TSC2-결손 세포에서 야생형 TSC2 mRNA의 재발현은 mTORC1 신호전달을 상당히 억제하였다(도 26c-26d). TTJ 종양 보유 마우스를 각 그룹에서 2마리의 마우스로 Tsc2 mRNA 캡슐화된 hLNP(0.75mg/kg) 또는 빈 hLNP로 격일로 TTJ 세포 접종 후 24일차부터 시작하여 총 5회 용량으로 처리하였다. 또한, 처리하지 않은 마우스를 대조군으로 포함시켰다(도 33a). Tsc2 mRNA 로딩된 hLNP는 빈 LNP 또는 처리하지 않은 것과 비교하여 종양 성장을 상당히 억제하였다(도 36). Tsc2 mRNA LNP로 처리된 마우스에서 종양 결절의 전체 크기는 미처리 그룹 또는 빈 LNP로 처리된 그룹에 비해 각각 60% 또는 44% 감소하였다(도 33b 및 33c). 빈 LNP 처리 그룹과 미처리 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 각각 Ki67 및 절단된 카스파제 3에 대한 IHC를 사용한 종양 증식 및 아폽토시스(apoptosis)를 추가로 평가하였다(도 33d 및 33e). 빈 LNP 처리에 비해 Tsc2 mRNA LNP 처리에 의해 종양 모듈 내 세포 증식이 감소하였다. 두 그룹 간의 아폽토시스에 유의한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 종양 아폽토시스가 이 모델에서 종양 감소의 주요 메커니즘이 아님을 시사한다. 따라서 mRNA 전달을 통한 야생형 TSC2 회복은 TTJ 세포 종양 부담을 줄이는 면역 매개된 메커니즘을 유도할 수 있다. 이 가능성을 시험하기 위해, F4/80 및 CD3에 대한 IHC에 의한 대식세포 및 T 세포 종양 침윤을 평가하였다. 그룹 간에 대식세포 침윤의 차이는 관찰되지 않았지만, Tsc2 mRNA 로딩된 hLNP 처리 그룹은 향상된 종양 T 세포 침윤을 나타냈고(도 33e), 이는 TSC2 단백질 발현의 회복이 LAM의 이 전임상 모델에서 면역 매개된 치료 반응을 유도함을 입증한다.
논의
최근 몇 년 동안 메신저 RNA(mRNA) 치료제를 전달하기 위해 LNP를 사용하는 데 관심이 증가하고 있다. 시험관 내 합성 mRNA는 AIDS, 지카, 희귀 질환, 암 및 코로나바이러스를 포함한 광범위한 질환을 제어하고 치료하기 위해 "생체 내"에서 치료에 적절한 단백질을 생산할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 인간의 건강에 도움이 되는 이 변형 기술을 활용하려면 이환된 기관과 세포에 mRNA를 보내 치료 단백질의 특정 발현을 가능하게 하고, 후속적으로 원하는 치료 효과를 생성해야 한다. 지질 나노입자(LNP)는 핵산 전달을 위한 선도적인 비바이러스성 전달 시스템 중 하나이며 mRNA 전달을 위해 LNP를 사용하기 위해 상당한 노력을 기울였다. 그러나 개발된 LNP의 대부분은 전신 투여 후 간을 표적으로 하므로 LNP를 폐, 신장, 심장 및 뇌와 같은 다른 기관으로 보내기 위한 새로운 전략이 요구되는 것이 사실이다. 이러한 LNP는 노동 집약적인 스크리닝 접근법을 통해 확인되었으며, 예측 가능한 기관 선택성을 가진 LNP의 합리적인 설계를 안내하는 공통 규칙을 생성하는 것은 현재 여전히 불가능하다. 최근에 Siegwart 연구실은 여분의 부형제를 추가하여 간외 조직, 예를 들어, 폐 및 비장을 표적으로 하도록 LNP를 조작하는 선택적 기관 표적화(SORT) 전략을 발견하고 개발하였다. 이러한 발전은 흥미롭지만 원래의 4개 구성 요소 시스템을 5개 구성 요소로 만들었기 때문에 제형이 다소 불리하게 복잡해졌다.
LNP 제형을 복잡하게 하지 않으면서 리피도이드 테일의 링커 구조를 간단히 변경함으로써 LNP의 생체 내 기관 선택성이 정밀하게 조정될 수 있다는 것이 본원에 개시되어 있다. 링커를 에스테르 결합(O-시리즈라고 함)에서 아미드 결합(N-시리즈라고 함)으로 변경함으로써, LNP로 가능한 mRNA 전달 특이성이 간에서 폐로 전환되었다. O-시리즈 LNP와 N-시리즈 LNP 간의 이러한 작은 구조적 차이가 기관 선택성을 극적으로 상이하게 만드는 이유를 설명하기 위해 프로테오믹스 연구를 수행하였다. 이 두 테일 구조는 순환 중에 LNP의 표면에 형성된 코로나의 단백질 구성을 어떻게든 조절하는 약간의 별개의 혈청 단백질에 대한 특정 친화력을 가질 수 있다. 단백질 코로나가 나노입자의 생체 내 운명을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 개시된 결과는 306-O12B와 306-N16 LNP의 단백질 코로나에서 흡수된 혈장 단백질의 수와 유형이 다르다는 것을 보여준다. 이 두 LNP에서 가장 풍부한 상위 20개 단백질 중에서 14개의 별개의 단백질이 발견되었다. 두 단백질 코로나에서 동일한 단백질 세트가 발견되더라도, 단백질 코로나 층에서 무작위로 배향되기 때문에 생물학적 기능이 상이할 수 있다. 한 가지 예는 ApoE로서, 한편으로는, 내인성 ApoE가 정맥 주사 후 LNP 표면에 흡수되어 지단백 수용체 매개된 엔도사이토시스에 의해 캡슐화된 RNA의 간세포로의 수송을 촉진하는 반면, ApoE는 나노입자를 뇌로 유도하기 위해 배치될 수도 있다고 널리 보고되었다. 이 두 LNP의 단백질 코로나에서 확인된 가장 풍부한 단백질인 알부민에 대한 306-O12B 및 306-N16B의 결합 모델이 상이하여 이후에 LNP의 표면의 알부민의 방향 및 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다.
폐로의 표적화 RNA 전달은 매력적인 개념으로, 다양한 폐 질환 치료를 위해 현재 "약물 치료가 불가능한" 표적으로 정의되는 표적에 엄청난 기회를 제공한다. 본원에서는 LNP의 헤드 구조를 조정하여 상이한 폐세포를 쉽게 표적으로 할 수 있음이 입증되었다. 본원에는 306-N16B LNP가 급성 호흡 곤란 증후군, 염증 및 혈전증을 포함하는 중요한 치료 표적인 폐 내피 세포로 mRNA를 특이적으로 수송할 수 있다는 것이 개시되어 있다. 그러나 mRNA 함유 113-N16B LNP는 전신 투여 후 폐 내피 세포뿐만 아니라 대식세포 및 심지어 상피 세포까지 형질감염시킬 수 있었다. 또한, Cas9 mRNA와 sgRNA를 하나의 단일 306-N16B LNP로 동시 전달하면 마우스의 폐에서 게놈 편집을 달성하여 폐 유전 질환 치료를 위한 게놈 편집 기반 치료의 추가 개발을 가능하게 할 수 있음이 입증되었다. 더 중요하게는, 개시된 개발된 하이브리드 LNP가 전임상 LAM 모델에서 Tsc2-결핍 TTJ 종양 세포에 Tsc2 mRNA를 특이적으로 전달할 수 있고 종양 세포 성장을 상당히 억제할 수 있다는 것이 입증되어 폐 질환의 치료를 위한 LNP의 사용에 대한 중요한 개념 증명을 제공한다.
요약하면, 본 연구는 리피도이드 테일 화학과 mRNA 전달을 위한 기관 및 세포 선택성 사이의 구조-활성 관계의 강한 상관관계를 입증하였다. 프로테오믹스를 사용한 기계론적 연구는 이 두 LNP의 단백질 코로나의 단백질 구성이 다르다는 것을 보여주었고, 이는 고유 테일 링커 구조가 LNP의 표적화 가능성에 실질적으로 영향을 미치는 생물학적 유체와 LNP의 상호작용에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 그러나 이러한 고유 단백질이 기관 표적화 가능성에 미치는 영향을 완전히 밝히기 위해서는 추가 연구가 수행되어야 한다. 이 작업의 결과는 지질 구조가 단백질 코로나 기능을 조작하여 LNP의 생체 내 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 근본적인 이해를 제공한다.
참조에 의한 통합
본원에 언급된 모든 미국 및 PCT 특허 공보와 미국 특허는 각각의 개별 특허 공보 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것처럼 그 전체가 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다.
다른 실시양태
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 특정 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 실시양태의 범위는 상기 설명에 한정되는 것이 아니라 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다. 당업자는 다음의 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 설명에 대한 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, INC. <120> LIPID NANOPARTICLES FOR TARGETED DELIVERY OF MRNA <130> TUV-15325 <140> PCT/US2022/012786 <141> 2022-01-18 <150> 63/256,811 <151> 2021-10-18 <150> 63/251,791 <151> 2021-10-04 <150> 63/138,047 <151> 2021-01-15 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 aagtaaaacc tctacaaatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 agcccttcaa cacaaggtca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ctccaaagcc ctgaccttgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 ttctgcacct tcagagccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 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Claims (96)

  1. 지질 조성물과 조립된 약제학적 작용제(pharmaceutical agent)를 포함하는 조성물로서, 지질 조성물은 화학식 Ⅰ을 갖는 리피도이드(lipidoid) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물:
    [화학식 Ⅰ]

    여기서:
    Ra는 알킬이고;
    n1 및 n2는 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
    Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 각각 독립적으로 H, 또는 이고,
    여기서:
    *는 N에 대한 부착점을 나타내고;
    각각의 m은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    각각의 q는 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    각각의 Rc는 독립적으로 알킬 또는 알케닐이고;
    여기서 Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나는 H가 아님.
  2. 제1항에 있어서, Ra가 C1-C3 알킬인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, n1이 1, 2 또는 3인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, n1이 2 또는 3인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, n2가 1, 2 또는 3인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, n2가 2 또는 3인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, n1과 n2가 동일한 조성물.
  8. 제1항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개가 H가 아닌 조성물.
  9. 제1항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 어느 것도 H가 아닌 조성물.
  10. 제1항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 또는 인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C16 알킬 또는 C4-16 알케닐인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 각각의 Rc가 독립적으로 C4-C20 알킬인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 각각의 m이 독립적으로 1, 2 또는 3인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 각각의 m이 독립적으로 1 또는 2인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 각각의 m이 1인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 각각의 q가 독립적으로 1, 2, 3 또는 4인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 각각의 q가 독립적으로 1, 2 또는 3인 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 각각의 q가 2인 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 화학식 I의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 60% 이하의 몰 백분율(molar percentage)로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체가 약 50% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 지질 조성물이 중합체 접합된 지질(polymer-conjugated lipid)을 추가로 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 중합체 접합된 지질이 약 10% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 지질 조성물이 인지질을 추가로 포함하는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 인지질이 약 30% 이하의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 화학식 I의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 1:1 내지 약 200:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 약제학적 작용제가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 조절하는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 소분자 화합물 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 약제학적 작용제가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 조절하도록 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 약제학적 작용제가 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 적어도 일부에 특이적으로 결합하도록 구성된 유전자 조절 모이어티(gene modulating moiety); 또는
    (b) (a)의 유전자 조절 모이어티를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 적어도 일부와 복합체를 형성하도록 구성된 가이드 핵산, 또는 가이드 핵산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 이종 엔도뉴클레아제, 또는 이종 엔도뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 이종 엔도뉴클레아제가 가이드 핵산에 대해 약 1:20 내지 약 20:1의 질량비 또는 중량비로 유전자 조절 모이어티에 존재하는 조성물.
  35. 제30항에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물)이 대상체의 표적 기관 또는 표적 세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물이 표적 기관 또는 표적 세포의 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
  37. 제31항에 있어서, 유전자 조절 모이어티가 대상체의 표적 기관 또는 표적 세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
  38. 제1항에 있어서, 표적 기관이 폐 또는 간인 조성물.
  39. 제1항에 있어서, 표적 세포가 폐세포 또는 간세포인 조성물.
  40. 제1항에 있어서, 투여용으로 제형화되는 조성물.
  41. 제1항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에서,
    Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 H 또는 이고;
    Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나가 인 조성물.
  42. 제41항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개가 각각 독립적으로 인 조성물.
  43. 제41항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE를 갖는 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물:
    [화학식 ⅡA]

    [화학식 ⅡB]

    [화학식 ⅡC]

    [화학식 ⅡD]
    , 또는
    [화학식 ⅡE]

    여기서:
    m1, m2, m3 및 m4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고;
    q1, q2, q3 및 q4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
    Rc1, Rc2, Rc3 및 Rc4는 존재하는 경우 각각 독립적으로 C4-C20 알킬 또는 C4-C20 알케닐임.
  44. 제43항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅡE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물.
  45. 제43항에 있어서, Rc1이 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  46. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc2가 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  47. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 Rc3이 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  48. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡE에서 Rc4가 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  49. 제43항에 있어서, m1이 1 또는 2인 조성물.
  50. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 m2가 1 또는 2인 조성물.
  51. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 m3이 1 또는 2인 조성물.
  52. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡE에서 m4가 1 또는 2인 조성물.
  53. 제43항에 있어서, q1이 1, 2 또는 3인 조성물.
  54. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡB, ⅡD 또는 ⅡE에서 q2가 1, 2 또는 3인 조성물.
  55. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE에서 q3이 1, 2 또는 3인 조성물.
  56. 제43항에 있어서, 화학식 ⅡE에서 q4가 1, 2 또는 3인 조성물.
  57. 제41항에 있어서, 리피도이드가 하기 및 이 중 임의의 것의 임의의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 조성물:


    .
  58. 제41항에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  59. 제41항에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 약 10% 내지 약 50%의 몰 백분율로 포함하는 조성물.
  60. 제41항에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅡA, ⅡB, ⅡC, ⅡD 또는 ⅡE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 5:1 내지 약 100:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
  61. 제41항에 있어서, 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포로의 전달과 비교하여 약제학적 작용제를 폐 또는 폐세포로 우선적으로 전달하기 위한 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 또는 폐세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 조절하도록 구성되는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
  64. 제61항에 있어서, 약제학적 작용제가 폐 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
  65. 제41항에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 폐가 아닌 기관 또는 폐세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 약제학적 작용제를 이를 필요로 하는 대상체의 폐 또는 폐세포에 우선적으로 전달하는 방법.
  66. 제41항에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 약제학적 작용제를 이를 필요로 하는 대상체의 폐 또는 폐세포에 우선적으로 전달하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성되는 것과 비교하여 대상체의 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 더 많은 양 또는 활성을 조절하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 대상체의 폐 또는 폐세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하는 방법.
  69. 제1항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에서,
    Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4가 각각 독립적으로 H 또는 이고;
    Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 하나가 인 조성물.
  70. 제69항에 있어서, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4 중 적어도 2개가 독립적으로 인 조성물.
  71. 제69항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE를 갖는 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물:
    [화학식 ⅢA]

    [화학식 ⅢB]

    [화학식 ⅢC]

    [화학식 ⅢD]
    , 또는
    [화학식 ⅢE]

    여기서:
    m5, m6, m7 및 m8은 각각 독립적으로 1, 2 또는 3이고;
    q5, q6, q7 및 q8은 각각 독립적으로 1, 2, 3 또는 4이고;
    Rc5, Rc6, Rc7 및 Rc8은 존재하는 경우 각각 독립적으로 C4-C20 알킬 또는 C4-C20 알케닐이다.
  72. 제71항에 있어서, 화학식 Ⅰ의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 화학식 ⅢE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 조성물.
  73. 제71항에 있어서, Rc5가 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  74. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc6이 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  75. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 Rc7이 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  76. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢE에서 Rc8이 C4-C16 알킬 또는 C4-C16 알케닐인 조성물.
  77. 제71항에 있어서, m5가 1 또는 2인 조성물.
  78. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 m6이 1 또는 2인 조성물.
  79. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 m7이 1 또는 2인 조성물.
  80. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢE에서 m8이 1 또는 2인 조성물.
  81. 제71항에 있어서, q5가 1, 2 또는 3인 조성물.
  82. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢB, ⅢD 또는 ⅢE에서 q6이 1, 2 또는 3인 조성물.
  83. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE에서 q7이 1, 2 또는 3인 조성물.
  84. 제71항에 있어서, 화학식 ⅢE에서 q8이 1, 2 또는 3인 조성물.
  85. 제69항에 있어서, 리피도이드가 하기 및 이 중 임의의 것의 임의의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 조성물:

  86. 제69항에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약 20% 내지 약 50%의 몰 백분율로 지질 조성물에 존재하는 조성물.
  87. 제69항에 있어서, 지질 조성물이 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 약 10% 내지 약 50%의 몰 백분율로 포함하는 조성물.
  88. 제69항에 있어서, 화학식 Ⅰ, ⅢA, ⅢB, ⅢC, ⅢD 또는 ⅢE의 리피도이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 약제학적 작용제에 대해 약 5:1 내지 약 100:1의 질량비 또는 중량비로 조성물에 존재하는 조성물.
  89. 제69항에 있어서, 상기 조성물은 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포로의 전달과 비교하여 약제학적 작용제를 간 또는 간세포로 우선적으로 전달하기 위한 조성물.
  90. 제89항에 있어서, 약제학적 작용제가 간 또는 간세포에 특이적이거나 주로 그 안에서 발견되는 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물을 암호화하거나 조절하도록 구성되는 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 약제학적 작용제가 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하도록 구성되는 조성물.
  92. 제89항에 있어서, 약제학적 작용제가 간 질환 또는 장애와 관련이 있는 조성물.
  93. 제69항에 따른 조성물을 투여함으로써 대상체의 간이 아닌 기관 또는 간세포가 아닌 세포에서 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에서 약제학적 작용제의 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 약제학적 작용제를 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 우선적으로 전달하는 방법.
  94. 제69항에 따른 조성물을 투여함으로써 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성된 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에 약제학적 작용제의 더 많은 양, 발현 또는 활성을 제공하는 것을 포함하는, 약제학적 작용제를 이를 필요로 하는 대상체의 간 또는 간세포에 우선적으로 전달하는 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상응하는 기준 리피도이드를 포함하는 상응하는 기준 지질 조성물로 달성되는 것과 비교하여 대상체의 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 더 많은 양 또는 활성을 조절하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 대상체의 간 또는 간세포에서 표적 유전자 또는 이의 유전자 산물의 변형된 발현 프로파일을 제공하는 방법.
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