JP2024521735A - 化合物、リポソーム及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、化合物、リポソーム、リポソームの調製方法、薬物担体、薬物組成物及び薬物組成物の、高脂血症及びその関連疾患における治療または予防の使用を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明はバイオ医薬の分野に属し、具体的に、化合物、リポソーム、薬物担体及びそれらの使用、リポソームの調製方法、薬物組成物及び使用に関する。

ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸系分子は、非常に潜在力のある薬物分子であり、細胞内に入って作用する必要がある。しかしながら、核酸系分子自体は高分子量、高負電性、分解しやすい化合物であり、自体が細胞に入ることができない。したがって、それを持って細胞、または体内組織にトランスフェクションする適切な送達担体を必要とする。

リポソームは、すでに有効な核酸担体であることが証明され、リポソームに包まれたｓｉＲＮＡ薬物Ｏｎｐａｔｔｒｏが発売されている。核酸系薬物、特にｓｉＲＮＡ薬物、ｍＲＮＡ薬物などの研究の進展に伴い、核酸薬物担体に対する継続的な研究需要があり、異なる細胞タイプと組織タイプを標的とするリポソーム、酵素による核酸の分解からよりよく保護し、または細胞内でより良く放出するリポソーム、より毒性が低く、生分解しやすいリポソームなどを研究する。

したがって、安定性が高く、毒性が低く、生分解しやすいリポソームを研究開発する必要がある。

本発明は、関連技術における技術的問題の一つを少なくとも一定の程度解決する。

このため、本発明の第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）に示す化合物または式（Ｉ）に示す化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、薬学的に許容する塩である化合物を提案し、
ただし、Ｘ、Ｙ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は本発明で述べるような定義を有する。

本発明の実施例によれば、各ＸとＹはそれぞれ独立して－ＣＨ_２－または－ＣＯ－から選ばれ、ＸとＹは同時に－ＣＨ_２－または－ＣＯ－ではなく、ただし、各Ｘは同じまたは異なり、各Ｙは同じまたは異なり、Ｒ_２はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、Ｒ_３はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれ、Ｒ_１は
または
から選ばれ、ただし、ｎは０－１０から選ばれた整数であり、Ｚは
または
から選ばれ、Ｒ_４は任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれる。

本発明の実施例によれば、Ｒ_２はＨ、ＣＨ_３－、またはＲ_１から選ばれ、Ｒ_３はＨ、またはＲ_１から選ばれ、Ｒ_１は
または
から選ばれ、ただしｎは１－５から選ばれた整数であり、Ｚは
または
から選ばれ、Ｒ_４はＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基またはＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基は１－３個の二重結合を含み、前記Ｃ４－Ｃ２０アルキニル基は１－３個の三重結合を含む。

本発明の実施例によれば、Ｒ_４はＣ_５－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む。

本発明の実施例によれば、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は同じであり、Ｒ_４はＣ_１０－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む。

本発明の実施例によれば、前記化合物は、
の中の１つの構造を有する。

本発明の実施例によれば、化合物骨格は４つのアミノ基の骨格主鎖構造と複数の分岐鎖アルキル基または置換アルキル基構造を含む。骨格主鎖において、各アミノ基はアルキル基またはアシル基で接続されており、その中に少なくとも２つのアシル基があり、これにより、化合物の塩基性が低下し、アルキルアミン基の塩基性は分岐鎖に含まれるエステル基の化学的安定性に及ぼす影響が低下し、且つ化合物の正電性が低下し、リポソームが持つ正電性を低下させるのに有利であると同時に、アミド結合が体内での代謝性を高め、体内での化合物の蓄積を避ける。

本発明の第２の態様では、本発明は、リポソームの調製における上記化合物の使用を提案する。本発明の実施例によれば、上記化合物はアミン含有脂質化合物であり、イオン化可能な性質を有し、リポソームを調製するために使用できる。

本発明の実施例によれば、上記化合物はポリマー形態でリポソームを調製することができ、上記化合物は他の物質と共有結合を形成してリポソームを調製することができ、他の物質と化学反応を起こしてリポソームを調製することができる。本発明の実施例によれば、上記化合物からリポソームを調製する具体的な方式は限定されないが、上記化合物を使用してリポソームを調製し、リポソームに上記化合物の構造の全部または一部を含むと、本発明の使用とする。

本発明の第３の態様では、本発明はリポソームを提案する。本発明の実施例によるリポソームは、本発明の第１の態様に記載の化合物から調製され、リポソームは脂質二分子層の流動作用により添加された被担持物質を包み込むことができ、封入効果が良好であるため、担持物質を効果的に細胞に侵入して内包体から細胞質に逃げ出すことができる。

本発明の実施例によれば、上記化合物は疎水性脂質及び／又は両親媒性脂質と自己組織化によりリポソームを形成することができる。

本発明の実施例によれば、リポソームは、疎水性脂質、両親媒性脂質、緩衝試薬及び／又は有機溶媒をさらに含み、前記両親媒性脂質は中性脂質とＰＥＧ－脂質から選ばれる少なくとも１つを含み、前記疎水性脂質はステロールを含む。

本発明の実施例によれば、前記中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウリルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、ジミリスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及び卵黄レシチン（ＥＰＣ）から選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記ＰＥＧ－脂質は、ビスパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ）、ビスステアリルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、ジミリスチルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）及びジメタクリレート（ＤＭＡ－ＰＥＧ）から選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記ステロールはコレステロールである。

本発明の実施例によれば、前記緩衝試薬は酸性緩衝試薬である。

本発明の実施例によれば、前記緩衝試はクエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、トリメチロールアミノメタン－塩酸、リン酸二水素カリウム－水酸化ナトリウム、ホウ酸－ホウ砂、グリシン－塩酸、フタル酸－塩酸、フタル酸水素カリウム及びリン酸二水素ナトリウム－クエン酸から選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トルエンシクロヘキサノン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、プロピレンオキサイド、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ピリジン、フェノール、スチレン、パークロロエチレン、トリクロロエチレン、エチレングリコールエーテル及びトリエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０～８０％ｍｏｌ／ｍｏｌである。

本発明の実施例によれば、前記化合物、中性脂質、ステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比は（２０～８０）：（５～５０）：（１０～６０）：（０．２～２０）である。

本発明の実施例によれば、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は５０～９０％ｖ／ｖである。

本発明の実施例によれば、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は７５％ｖ／ｖである。

本発明の実施例によれば、上記の配合比のリポソームを採用すると、トランスフェクション効率が高く、封入効果がよく、薬物提示能力が強い。

本発明の第４の態様では、本発明は上記リポソームの調製方法を提案する。本発明の実施例によれば、所定の量の本発明の第１の態様に記載の化合物と有機溶媒を混合し、前記リポソームを取得するステップを含む。本発明の実施例によれば、前記化合物を有機溶媒に溶解することはリポソームの形成に有利である。

本発明の実施例によれば、前記方法は、所定の量の脂質を上記有機溶液に溶解してから緩衝試薬と混合し、前記リポソームを取得するステップをさらに含む。本発明の実施例によれば、前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０～８０％ｍｏｌ／ｍｏｌであり、前記化合物、中性脂質、ステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比は（２０～８０）：（５～５０）：（１０～６０）：（０．２～２０）であり、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は７５％ｖ／ｖである。

本発明の第５の態様では、本発明は薬物担体を提案し、本発明の第１の態様に記載の化合物または本発明の第３の態様に記載のリポソームを含む。本発明の実施例によれば、前記化合物はイオン化可能なアミン含有脂質であり、前記薬物担体はイオン化可能な担体であり、負に帯電する薬物を担持することができ、薬物を細胞内に送達して内包体から効果的に細胞質に逃げ出し、担持された薬物の薬効の発揮に有利である。

本発明の第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載の化合物、本発明の第３の態様に記載のリポソームまたは本発明の第５の態様に記載の薬物担体の、薬物の調製における使用を提案する。

本発明の第７の態様では、本発明は、薬物組成物を提案し、前記薬物組成物は担体と薬物活性成分を含み、ここで、前記担体は本発明の第５の態様に記載の薬物担体を含む。本発明の実施例によれば、前記薬物担体はイオン化可能な担体であり、負に帯電する薬物活性成分を担持することができ、薬物活性成分を細胞内に送達して内包体から効果的に細胞質に逃げ出し、担持された薬物活性成分の発揮に有利である。

本発明の実施例によれば、前記薬物活性成分は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質及び小分子薬物から選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の実施例によれば、前記薬物活性成分は負に帯電する。本発明の実施例によれば、前記薬物担体にイオン化可能なアミン含有脂質が含まれ、特定のｐＨで正に帯電し、負に帯電する薬物活性成分と結合することができ、なお、脂質二分子層の流動作用により、薬物活性成分を包み込んで、細胞に送達することができる。

本発明の実施例によれば、前記薬物活性成分は核酸を含む。本発明の実施例によれば、前記薬物活性成分はＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸－タンパク質複合体、核酸－脂質複合体、核酸－核種複合体等を含み、前記核酸のタイプは制限されない。

本発明の実施例によれば、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（５～４０）：１である。

本発明の実施例によれば、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（８～２０）：１である。

本発明の実施例によれば、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は１５：１である。

本発明の第８の態様では、本発明は、上記化合物または上記リポソームを含むことを特徴とするトランスフェクション複合体を提案する。

本発明の実施例によれば、前記トランスフェクション複合体は少なくとも一種の生理活性剤を含む。

本発明の実施例によれば、前記生理活性剤は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質及び薬物から選ばれる少なくとも１つを含む。

本発明の付加的な態様と利点を以下の説明では部分的に示し、部分的に以下の説明から明らかになり、または本発明の実践を通じて了解することができる。

本発明の上記および／または付加的な態様と利点は、以下の図面を組み合わせた実施例の説明から明らかになり、理解しやすい。
本発明の実施例によるゲルブロック実験結果である。 本発明の実施例によるｓｉＡ４－１３の製剤の４℃での安定性の結果である。 本発明の実施例によるＣｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３のＣ５７ＢＬ／６マウス体内の分布の定量データである。 動物による本発明の実施例の異なる濃度のｓｉＡ４－１３製剤の投与後または異なる時点でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の変化及びＣＨＯ、ＴＧ、ＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃレベルの変化であり、ここで、図ａは動物による１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ ｓｉＡ４－１３製剤の投与後の異なる時点でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の変化及びＣＨＯ、ＴＧ、ＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃレベルの変化であり、図ｂは動物による投与量の０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇまでのｓｉＡ４－１３製剤の投与後の４８時間のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現の変化及びＣＨＯ、ＴＧ、ＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃレベルの変化である。 本発明の実施例による血清生化学指標の変化である。 本発明の実施例によるｓｉＡＮＡ４－１３のｄｂ／ｄｂマウス体内での脂質低下効果とＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現抑制能力である。 本発明の実施例による異なる治療群の動物肝臓の脂質沈着状況である。 本発明の実施例によるｓｉＡｐｏＣＡ４－１３の治療及び薬物中止から４週間以内の脂質低下効果と血中脂質変化である。 本発明の実施例による異なる処方のリポソームで媒介したルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞上での発現結果である。 本発明の実施例によるリポソームで媒介したルシフェラーゼｍＲＮＡのマウス体内での発現結果である。 本発明の実施例による脂質Ｅの化学構造である。 本発明の実施例による脂質Ａ４と脂質Ｅの４０℃での安定性の試験結果である。 本発明の実施例によるＬｉｐｏとＡ４－１３のＣ５７マウス体内での薬効比較である。

以下、本発明の実施例を詳しく説明し、前記実施例の例は図面に示されている。以下、図面を参照しながら説明する実施例は例示的なものであり、本発明を制限するためのものではなく、本発明を解釈することを目的とする。

「第１の」、「第２の」といった用語は目的を説明するためのものにすぎず、相対的に重要性を示す若しくは暗に示す、または技術的特徴を明示する数を暗に示すとみなすことはできない。したがって、「第１の」、「第２の」と限定している特徴は少なくとも１つの該特徴を含むことを明示するまたは暗に示すことができる。本発明の説明において、特に明確かつ具体的に限定している場合を除き、「複数」の概念は少なくとも２つ、例えば２つまたは３つである。

現在、本発明の幾つかの実施形態を詳細に説明し、その例は添付の構造式と化学式によって説明される。本発明は、全ての代替、修正及び同等の技術的解決手段を網羅することを意図しており、それらは、請求項によって定義された本発明の範囲内に含まれる。当業者は、本発明と同様または同等の多くの方法及び材料は本発明を実践するために使用できることを認識すべきである。本発明は本発明に記載の方法と材料に限定されない。組み合わせた文献、特許及び同様の材料の１つまたは複数が本願と異なるか、または矛盾する場合（定義される用語、用語の適用、説明される技術などを含むが、これらに限定されない）で、本願を基準とする。

さらに、本発明の幾つかの特徴は、明確にするために、複数の独立した実施形態で説明されたが、単一の実施例で組み合わせて提供されてもよいことが認識されるべきである。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態で説明されるが、単独でまたは任意の適切なサブ組合せで提供されてもよい。

特に指摘されない限り、本発明に使用される技術的及び科学的用語は、本発明の当業者の通常理解と同じ意味を有し、特に指摘されない限り、本発明の全内容の開示に援用される全ての特許公開出版物は、参照方式によって全体が本開示に組み込まれている。

本発明は、他の態様で示されない限り、以下の定義を適用する。本発明の目的によると、化学元素は週期律表、ＣＡＳバージョン及び化学薬品ハンドブック、７５，ｔｈＥｄ，１９９４によって定義される。また、有機化学の一般的な原理は、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｓａｕｓａｌｉｔｏ： １９９９， ａｎｄ 「Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」， ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ． Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ２００７を参照するため、本発明のすべての内容は参考文献を融合している。

本明細書において、「リポソーム」または「脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）」は、生体適合性脂質材料を担体として、薬物やその他の生体活性物質を脂質核に溶解または包んだり、またはナノ粒子の表面に吸着、付着させたりする薬物担持系を指す。

本発明は同位体標識の本発明化合物をさらに含み、１つまたは複数の原子は原子質量または質量数が天然の一般的な原子の質量または質量数と異なる原子で代替するという事実を除いて、本発明に記載の化合物と同じである。本発明の化合物に導入することができる例示的な同位体は水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体、例えば２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１６Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３６Ｓ、１８Ｆ及び３７Ｃｌを含む。

前述同位体及び／又は他の原子の他の同位体の本発明の化合物及び前記化合物の薬学的に許容する塩はいずれも本発明の範囲内に含まれる。同位体標識された本発明の化合物、例えば放射性同位体、例えば３Ｈと１４Ｃが本発明の化合物に組み込まれて薬物及び／又は基質組織分布分析に用いられることができる。調製及び検出が容易であるため、トリチウム置換、即ち、３Ｈ、及び炭素－１４、即ち１４Ｃ、同位体が特に好ましい。なお、重水素などの重同位体、即ち２Ｈで置換することによって、例えば体内半減期の増加または投与量の需要の減少など、代謝安定性の向上に由来するいくつかの治療上の利点を提供することができる。このため、場合によって好ましいかもしれない。

本発明で使用される立体化学の定義と慣例は、一般的に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ、Ｅｄ．、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ａｎｄ Ｅｌｉｅｌ、Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ、Ｓ．、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４に従う。本発明の化合物は不斉中心またはキラル中心を含んでよいため、異なる立体異性体形態で存在する。本発明の化合物の全ての立体異性体形態は、ジアステレオマー、エナンチオマー及びトランスオリソマー（ａｔｒｏｐｉｓｏｍｅｒ）、及びラセミ混合物などのそれらの混合物を含むが、これらに制限されないことが期待されるが、本発明の範囲内にも含まれる。多くの有機化合物は光学活性の形で存在し、即ち平面偏光の平面を回転させる能力を持つ。光学活性を有する化合物を記述する場合、接頭辞ＤとＬまたはＲとＳを用いて分子中のキラル中心（または複数のキラル中心）に対する分子の絶対配置を示す。接頭辞ｄとｌまたは（＋）と（-）は、化合物による平面偏光の回転を指定するための記号であり、ただし（-）またはｌは化合物が左旋性であるのを示す。接頭辞が（＋）またはｄである化合物は右旋性である。所定の化学構造に対して、これらの立体異性体は、互いの鏡像であることを除いて、同様である。具体的な立体異性体はエナンチオマーと呼ばれることもでき、且つ前記異性体の混合物は、通常、エナンチオマーの混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれ、化学反応または方法に立体選択性または立体特異性がない場合、前記ラセミ混合物またはラセミ体が現れることができる。

原料と方法の選択に応じて、本開示の化合物は、可能な異性体の１つとして、またはそれらの混合物のとして、例えば純粋な光学異性体、または異性体混合物、例えばラセミ体及びジアステレオマー混合物として存在し、これは、不斉炭素原子の数によって決められる。光学活性な（Ｒ）－または（Ｓ）－異性体は、キラルシントンまたはキラル製剤を使用して調製するか、または従来の技術を使用して分割することができる。この化合物に１つの二重結合を含むと、置換基はＥまたはＺ配置である可能性があり、この化合物に二置換シクロアルキルが含まれる場合、シクロアルキルの置換基はシスまたはトランス（ｃｉｓ－またはｔｒａｎｓ－）配置である可能性がある。

本発明の化合物は不斉中心またはキラル中心を含んでよいため、異なる立体異性体形態で存在する。本発明の化合物の全ての立体異性体形態は、ジアステレオマー、エナンチオマー、トランスオリソマー（ａｔｒｏｐｉｓｏｍｅｒ）、及び幾何（または配座）異性体、及びラセミ混合物などのそれらの混合物を含むが、これらに制限されないことが期待されるが、本発明の範囲内にも含まれる。

別途に指摘しない限り、本発明に記載の構造はこの構造を含むすべての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、トランスオリソマー（ａｔｒｏｐｉｓｏｍｅｒ）及び幾何（または配座））形態、例えば、各不斉中心のＲとＳ配置、（Ｚ）と（Ｅ）二重結合異性体、及び（Ｚ）と（Ｅ）配座異性体を示す。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学異性体及びエナンチオマー混合物、ジアステレオマー混合物及び幾何異性体（または配座異性体）混合物はいずれも本発明の範囲内である。

「互変異性体」または「互変異性形態」という用語は、異なるエネルギーを持つ低エネルギー障壁（ｌｏｗ ｅｎｅｒｇｙ ｂａｒｒｉｅｒ）によって互いに変換できる構造異性体を指す。互変異性が可能であれば（例えば溶液中で）、互変異性体の化学平衡を達成することができる。例えば、プロトン互変異性体（ｐｒｏｔｏｎｔａｕｔｏｍｅｒ）（プロトン移動互変異性体（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ ｔａｕｔｏｍｅｒ）とも呼ばれる）は、ケトン－エノール異性化やイミエナミン異性化などのプロトン移動による相互変換が含む。価電子結合互変異性体（ｖａｌｅｎｃｅ ｔａｕｔｏｍｅｒ）は幾つかの結合形成電子の再結合による相互変換を含む。ケトン－エノール互変異性の具体例はペンタン－２，４－ジオンと４－ヒドロキシペンチル－３－エン－２－オン互変異性体の互変である。互変異性の他の例はフェノール－ケトン互変異性である。フェノール－ケトン互変異性の１つの具体例は、ピリジン－４－オールとピリジン－４（１Ｈ）－ケトン互変異性体の互変である。別途に指摘しない限り、本発明の化合物の全ての互変異性体形態はいずれも本発明の範囲内である。

本発明で使用される「窒素酸化物」とは、化合物がアミン官能基を幾つか含む場合、１個以上の窒素原子を酸化してＮ－酸化物を形成できることを意味する。Ｎ－酸化物の特別な例は３級アミンのＮ－酸化物または含窒素複素環窒素原子のＮ－酸化物である。過酸化水素または過酸（例えばペルオキシカルボン酸））などの酸化剤で対応するアミンを処理してＮ－酸化物を形成する（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， 第４版， Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ， ｐａｇｅｓ参照）。特に、Ｎ－酸化物はＬ．Ｗ．Ｄｅａｄｙの方法によって調製することができる（Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍ．１９７７， ７， ５０９－５１４）、ここで、塩化メチレンなどの不活性溶媒中で、アミン化合物とｍ－クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）を反応させる。

本発明の「溶媒和物」とは、１つまたは複数の溶媒分子と本発明の化合物で形成される会合体を指す。溶媒和物を形成する溶媒は、水、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸、アミノエタノールを含むが、これらに制限されない。「水和物」という用語は、溶媒分子が水によって形成される会合体であることを意味する。

本発明で使用される「薬学的に許容する塩」とは、本発明の化合物の有機塩と無機塩を指す。薬学的に許容する塩は当該分野において知られており、例えば文献：Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， ｄｅｓｃｒｉｂｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ ｉｎ Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９７７， ６６： １－１９．に記載のものである。薬学的に許容できる無毒の酸からなる塩は、アミノ基と反応して形成される塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩などの無機酸塩と、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩などの有機酸を含むが、これらに制限されなく、または書籍文献に記載されている他の方法、例えばイオン交換法によってこれらの塩を得る。他の薬学的に許容する塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、硼酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンチルプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸、ギ酸塩、トランスブタケート、グルコヘプタン酸塩、リン酸グリセリル塩、グルコン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エチルスルホン酸塩、ラクトースアルデヒド酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、メチレンビスヒドロキシナフタレン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、テバレート、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、チオシアン酸塩、ｐ?トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含むが、これらに制限されない。適切な塩基によって得られる塩はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ＋（Ｃ１－４アルキル基）４の塩を含む。本発明もＮの基を含む化合物からなる任意の四級アンモニウム塩を考案した。水溶性または油溶性または分散物は四級アンモニウム化作用によって得ることができる。アルカリ金属、アルカリ土類金属塩はナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。薬学的に許容する塩は、適切で無毒なアンモニウム、及びハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸化物、硫酸化物、リン酸化物、硝酸化物、Ｃ１－８スルホン酸化物及び芳香スルホン酸化物などの四級アンモニウム塩と抗平衡イオンからなるアミンカチオンをさらに含む。

本発明の化合物の任意の不斉原子（例えば、炭素等）は、（Ｒ）－、（Ｓ）－または（Ｒ，Ｓ）－配置形態などのラセミまたはエナンチオマー濃縮の形態で存在してもよい。幾つかの実施形態において、各不斉原子は、（Ｒ）－または（Ｓ）－配置において、少なくとも５０％エナンチオマー過剰、少なくとも６０％エナンチオマー過剰、少なくとも７０％エナンチオマー過剰、少なくとも８０％エナンチオマー過剰、少なくとも９０％エナンチオマー過剰、少なくとも９５％エナンチオマー過剰、または少なくとも９９％エナンチオマー過剰を有する。可能であれば、不飽和二重結合を有する原子上の置換基は、シス－（Ｚ）－またはトランス－（Ｅ）－の形で存在してもよい。

したがって、本発明に記載されるように、本発明の化合物は、可能な異性体、スピン異性体、ヒンドランス異性体、互変異性体の中の１つの形態またはその混合物の形態で存在することができ、例えばほぼ純粋な幾何（シスまたはトランス）異性体、ジアステレオマー、光学異性体（エナンチオマー）、ラセミ体またはその混合物の形態で存在することができる。

成分の物理化学的差異に応じて、得られた異性体の混合物は、クロマトグラフィーおよび／または段階的な結晶化などによって、純粋またはほぼ純粋な幾何または光学異性体、ジアステレオマー、ラセミ体に分離できる。

既知の方法によって、得られた最終生成物または中間体のラセミ体は、例えば得られたそのジアステレオメアの塩を分離することにより、当業者によく知られている方法で光学エナンチオマーに分割することができる。ラセミの生成物は、キラル吸着剤を用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのキラルクロマトグラフィーにより分離することもできる。特に、エナンチオマーはは非対称合成により調製することができる（例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ， Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ （Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （２ｎｄ Ｅｄ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ． Ｇａｗｌｅｙ， Ｊｅｆｆｒｅｙ Ａｕｂe， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ， ２０１２）； Ｅｌｉｅｌ， Ｅ．Ｌ． Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， ＮＹ， １９６２）； ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ， Ｓ．Ｈ． Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ． ２６８ （Ｅ．Ｌ． Ｅｌｉｅｌ， Ｅｄ．， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ， ＩＮ １９７２）。

本発明に記載されているように、本発明の化合物は、上記の一般式化合物、または実施例のような特別な例、サブクラス、および本発明に含まれる化合物のような１つまたは複数の置換基によって任意に置換されてもよい。「任意に置換」という用語は、「置換または非置換」という用語と交換して使用することができる。「任意に」、「任意の」または「任意」という用語は、後述するイベントまたは状況が発生してもよいが、必ずしも発生していないことを意味し、且つこの叙述は、このイベントまたは状況が発生した場合、及びこのイベントまたは状況が発生していない場合とが含まれる。一般的に、「任意に」という用語は、「置換」という用語の前に位置するかどうかにもかかわらず、所定の構造の中の１つまたは複数の水素原子が具体的な置換基に置換されることを示す。別途に示しない限り、１つの任意の置換基は基のそれぞれの置換可能な位置で置換することができる。所定の構造式の中の複数の位置が具体的な基から選ばれる１つまたは複数の置換基で置換できる場合、置換基は同じであっても異なっていてもそれぞれの位置で置換されてもよい。ここで、前記置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｎ３、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、オキソ（＝Ｏ）等であってもよいが、。

「Ｎ_３」という用語は、１つのアジド構造を示す。このような基は、他の基と接続してもよく、例えば、１つのメチル基と連結してアジド系メタン（ＭｅＮ_３）を形成してもよいし、または１つのフェニル基と連結してアジド系ベンゼン（ＰｈＮ_３）を形成してもよい。

また、なお、他の方式で明示されていない限り、本発明で用いられる記述方式「それぞれ…独立して」、「…それぞれ独立して」及び「…独立して」は互いに交換可能であり、広義に理解されるべきであり、異なる基において、同じ記号同士で示される具体的な選択肢同士が互いに影響を与えないことを意味してもよいし、同じ基において、同じ記号同士で示される具体的な選択肢同士が互いに影響を与えないことを意味してもよい。

本明細書の各部において、本発明で開示される化合物の置換基は、基の種類または範囲に応じて開示される。特に、本発明はこれらの基の種類または範囲の各メンバーのそれぞれの独立したサブ組合わせであることを指摘する。例えば、「Ｃ_１－６アルキル基」という用語は、特に独立して開示するメチル基、エチル基、Ｃ_３アルキル基、Ｃ_４アルキル基、Ｃ_５アルキル基及びＣ_６アルキル基を指す。

本発明の各部分において、接続置換基を説明する。該構造は明らかに連結基を必要とする場合、該基について挙げたクッシュ変数は連結基と理解すべきである。例えば、該構造は連結基を必要とし、該変数のクッシュ基定義に対して「アルキル基」または「アリール基」が挙げられている場合、該「アルキル基」または「アリール基」はそれぞれ接続したアルキレン基またはアリーレン基を代表する。

本発明で使用する用語「アルキル」または「アルキル基」とは、１－２０個の炭素原子の飽和直鎖または分岐鎖を含む一価炭化水素原子団を示す。別途に詳細に説明しない限り、アルキル基は１－２０個の炭素原子を含み、その中の幾つかの実施例において、アルキル基は１－１０個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１－９個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１－８個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１－６個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１－４つの炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１－３個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１０－２０個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１０－１８個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１０－１６個の炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１０－１４つの炭素原子を含み、他の幾つかの実施例において、アルキル基は１０－１３個の炭素原子を含む。

アルキル基の例は、メチル（Ｍｅ、－ＣＨ_３）、エチル（Ｅｔ、－ＣＨ_２ＣＨ_３）、ｎ－プロピル（ｎ－Ｐｒ、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、イソプロピル（ｉ－Ｐｒ、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、ｎ－ブチル（ｎ－Ｂｕ、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、イソブチル（ｉ－Ｂｕ、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、ｓｅｃ－ブチル（ｓ－Ｂｕ、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ、－Ｃ（ＣＨ_３）_３）、ｎ－ペンチル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ペンチル （－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ３）_２）、２－メチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ３）_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ （ＣＨ３）_２）、３－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、ｎ－ヘキシル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３））、２－メチル－２－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、４－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３－メチル－３－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ２ＣＨ_３）_２）、２－メチル－３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２，３－ジメチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ_３）２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３，３－ジメチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（ＣＨ_３）_３）、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどを含むが、これらに制限されなく、ここで、前記アルキル基は、独立して置換されていなくてもよく、または１つまたは複数の本発明に記載の置換基で置換されていてもよい。

本発明で使用される用語「アルキル基」及びその接頭辞「アルキル」はいずれも直鎖と分岐鎖の飽和炭素鎖を含む。

「アルケニル基」という用語は、２－２０個の炭素原子、または２－１８個の炭素原子、または２－１６個の炭素原子、または２－１２個の炭素原子、または２－８個の炭素原子、または２－６個の炭素原子、または２－４つの炭素原子の直鎖または分岐鎖の一価炭化水素基を示し、ここで、少なくとも１つの位置Ｃ－Ｃはｓｐ２二重結合不飽和状態であり、ここで、アルケニル基は、独立して置換されていなくてもよく、または１つまたは複数の本発明に記載の置換基で置換されていてもよく、「シス」、「トランス」または「Ｚ」及び「Ｅ」の位置を有する基を含み、ここで、具体な例は、ビニル（－ＣＨ＝ＣＨ_２）、アリル（－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）などを含むが、これらに限定されない。

「アルキニル基」という用語は、２－２０個の炭素原子、または２－１８個の炭素原子、または２－１６個の炭素原子、または２－１２個の炭素原子、または２－８個の炭素原子、または２－６個の炭素原子、または２－４つの炭素原子の直鎖または分岐鎖の一価炭化水素基を示し、ここで、少なくとも１つの位置Ｃ－Ｃはｓｐ三重結合不飽和状態であり、ここで、アルキニル基は、独立して置換されていなくてもよく、または１つまたは複数の本発明に記載の置換基で置換されていてもよく、具体な例は、エチニル（－Ｃ≡ＣＨ）、プロパルギル（－ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ）、１－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ_３）などを含むが、これらに限定されない。

「含有する」または「含む」は非限定的表現であり、即ち本発明が示す内容を含むが、他の態様の内容を排除するものではない。

本発明に記載されるように、「薬学的に許容できる担体」という用語は、任意の溶媒、分散媒、コーティング材、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、分散剤、潤滑剤、甘味剤、調味剤、着色剤、またはこれらの組み合わせを含み、これらの担体は当業者にはよく知られている（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０， ｐｐ． １２８９－１３２９に記載）。任意の通常の担体が活性成分と相溶しない場合を除いて、治療または薬物組成物における使用を含む。

化合物
本発明の第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）に示す化合物または式（Ｉ）に示す化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、薬学的に許容する塩である化合物を提案し、
ただし、Ｘ、Ｙ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３は本発明で述べるような定義を有する。

いくつかの実施形態では、各ＸとＹはそれぞれ独立して－ＣＨ_２－または－ＣＯ－から選ばれ、ＸとＹは同時に－ＣＨ_２－または－ＣＯ－ではなく、ただし、各Ｘは同じまたは異なり、各Ｙは同じまたは異なり、Ｒ_２はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、Ｒ_３はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれ、Ｒ_１は
または
から選ばれ、ただしｎは０－１０から選ばれる整数であり、Ｚは
または
から選ばれ、Ｒ_４は任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれる。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２はＨ、ＣＨ_３－、またはＲ_１から選ばれ、Ｒ_３はＨ、またはＲ_１から選ばれ、Ｒ_１は
または
から選ばれ、ただしｎは１－５から選ばれる整数であり、Ｚは
または
から選ばれ、Ｒ_４はＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基またはＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基は１－３個の二重結合を含み、前記Ｃ_４－Ｃ_２０アルキニル基は１－３個の三重結合を含む。

いくつかの実施形態では、Ｒ_４はＣ_５－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む。

いくつかの実施形態では、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は同じであり、Ｒ_４はＣ_１０－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む。

さらに、前記化合物は、
の中の１つの構造を有する。

本発明に記載の化合物とは、一つの大きな分子鎖に親水頭部と疎水尾部を有することを意味する。ただし、親水頭部はＮ１、Ｎ４－ビス（３－アミノプロピル）ブタンジアミド（Ｎ１，Ｎ４－ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｅ）または３，３’－（ブタン－１，４－ジイルビス（メチルアザンジイル）ジプロパンアミド（３，３’－（ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｙｌｂｉｓ （ｍｅｔｈｙｌａｚａｎｅｄｉｙｌ）） ｄｉｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）または３，３’－（ブタン－１，４－ジイルビス（（２－ヒドロキシプロピル）アザンジイル）ジプロパンアミド（３，３’－（ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｙｌｂｉｓ（（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ａｚａｎｅｄｉｙｌ））ｄｉｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）であってもよい。疎水尾部は、二重結合及び／又はエステル結合を有する直炭素鎖であってもよく、総鎖長は１２、１４、１６、１８個の原子であってもよい。本発明の化合物は親水頭部の中の一種と疎水尾部の中の一種または多種であってもよく、１：１または１：２または１：３等の複数の割合で形成される。

いくつかの実施形態では、疎水尾部は、
の化学構造の少なくとも１つを有し、
ただし、式１中の二重結合とエステル結合の位置は便利な原料入手の容易性に応じて変化すればよく、総鎖長を１６個の原子または１８個の原子とし、式２中のエステル結合の位置は便利な原料入手の容易性に応じて変化すればよく、総鎖長を１４、１６個または１８個の原子とし、式３中の鎖さが変化可能であり、１２，１４，１６，１８（１２，１４個の原子がより好ましい）であってもよい。

いくつかの実施形態では、前記塩は、薬学的に許容する塩を指す。「薬学的に許容できる」という用語とは、物質または組成物が製剤を含む他の成分及び／又はそれを用いて治療される哺乳動物と化学的及び／又は毒理学的に適合しなければならないことを意味する。

本発明の化合物は、このような化合物の他の塩をさらに含み、この他の塩は必ずしも薬学的に許容する塩ではなく、本発明の化合物の調製及び／又は精製及び／又は本発明の化合物のエナンチオマーの分離のための中間体として使用することができる。

薬用可能な酸付加塩は、無機酸及び有機酸と形成することができ、例えば酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭素酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、樟脳スルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロロテオフィリン塩、クエン酸塩、エチレンジスルフォン塩、フマル酸塩、グルコヘプチル糖酸塩、グルコン酸塩、グルコアルデヒド酸酸塩、馬尿酸塩、ウ化水素酸塩／ヨウ化物、ヒドロキシエチルスルホン酸塩、乳酸塩、ラクトースアルデヒド酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ナフタレン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデシル酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、メチレンビスヒドロキシナフタレン酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクトース酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トルエンスルホン酸塩及びトリフルオロ酢酸塩である。

それから誘導して得られることができる塩の無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。

それから誘導して得られることができる塩の有機酸は、酢酸、プロピオン酸、ヒドロキシ酢酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、スルホサリチル酸等を含む。

薬用可能な塩基加成塩は無機塩基及び有機塩基と形成することができる。

それから誘導して得られることができる塩の無機塩基は、アンモニウム塩と週期表的Ｉ族からＸＩＩ族までの金属を含む。幾つかの実施形態において、該塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、及び銅から誘導され、特に適切な塩はアンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウム塩を含む。

それから誘導して得られることができる塩の有機塩基は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンを含み、置換アミンは天然に存在する置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂等を含む。幾つかの有機アミンは、例えば、イソプロピルアミン、ベンジルスターペニシリン（ｂｅｎｚａｔｈｉｎｅ）、コリン塩（ｃｈｏｌｉｎａｔｅ）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リジン、グルタミン（ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ）、ピペラジン及びアミノブタントリオールを含む。

本発明の薬用可能な塩は、通常の化学的方法で母体化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸の形と化学量論的に適切な塩基（例えばＮａ、Ｃａ、ＭｇまたはＫ水酸化物、炭素酸塩、重炭酸塩等）を反応させるか、またはこれらの化合物の遊離塩基の形と化学量論的に適切な酸を反応させることによって調製することができる。このような反応は、通常、水または有機溶媒または両方の混合物で行う。一般的に、適切な場合で、ジエチルエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロピルアルコールまたはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用する必要がある。例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、（１９８５）；及び「薬用塩ハンドブック：性質、選択と応用（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｕｓｅ）」、Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）から他の幾つかの適切な塩のリスクを検索することができる。

そして、本発明の化合物、その塩を含む化合物はまたその水和物の形で取得してもよく、またはその結晶化のための他の溶媒を含む。本発明の化合物は固有にまたは設計することにより薬用可能な溶媒（水を含む）を有する溶媒和物を形成することができ、このため、本発明は、溶媒和形態と非溶媒和の形態を含むことを意図する。

本発明で与えられた任意の構造式は、これらの化合物が標識されていない形態及び同位体標識されている形態を示すことを意図する。同位体標識された化合物は、１つまたは複数の原子が選択された原子量または質量数を有する原子で置き換えられる場合を除いて、本発明で与えられた一般式で表される構造を有する。本発明の化合物に導入されることができる例示的な同位体は水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位体、例えば２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３６Ｓ、３７Ｃｌまたは１２５Ｉを含む。

他の態様では、本発明に記載の化合物は各種の同位体で標識された本発明で定義された化合物、例えば、３Ｈ、１４Ｃ及び１８Ｆなどの放射性同位体が存在する化合物、または２Ｈと１３Ｃなどの非放射性同位体が存在する化合物を含む。このような同位体で標識された化合物は、代謝研究（１４Ｃを使用）、反応動力学研究（例えば２Ｈまたは３Ｈを使用）、検出またはイメージング技術、例えば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）または薬物または基質組織分布測定を含む単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に使用できるか、または患者の放射線療法に使用できる。１８Ｆで標識された化合物はＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究に対して特に理想的である。以前使用された非標識試薬の代わりに、同位体で標識された式（Ｉ）化合物は当業者で知られている通常の技術または本発明における実施例と調製過程に記載されるように適切な同位体標識試薬を用いて調製することができる。

なお、より重い同位体、特に重水素（即ち、２ＨまたはＤ）の置換は、体内半減期の増加または投与量の需要の低下または治療指数の改善など、代謝安定性がより高いことによるいくつかの治療上の利点を提供することができる。この文脈では、重水素は式（Ｉ）化合物の置換基とみなされると理解すべきである。同位体濃縮係数でこのような重い同位体特に重水素の濃度を定義することができる。本発明で使用される「同位体濃縮係数」という用語とは、指定された同位体の同位体存在度と天然存在度との間の比率を意味する。本発明の化合物の置換基が重水素に指定する場合、該化合物は指定された各重水素原子に対して少なくとも３５００（各指定された重水素原子に５２．５％の重水素を配合）、少なくとも４０００（６０％の重水素配合）、少なくとも４５００（６７．５％の重水素配合）、少なくとも５０００（７５％の重水素配合）、少なくとも５５００（８２．５％の重水素配合）、少なくとも６０００（９０％の重水素配合）、少なくとも６３３３．３（９５％の重水素配合）、少なくとも６４６６．７（９７％の重水素配合）、少なくとも６６００（９９％の重水素配合）または少なくとも６６３３．３（９９．５％の重水素配合）の同位体濃縮係数を有する。本発明の薬用可能な溶媒和物は、結晶性溶媒が同位体置換可能なＤ２Ｏ、アセトン－ｄ６、またはＤＭＳＯ－ｄ６などの溶媒和物が含む。

リポソーム及び調製方法

本発明の他の態様では、本発明は、リポソームを提案する。本発明の実施例によるリポソームは本発明の第１の態様に記載の化合物により調製され、リポソームは脂質二分子層の流動作用により添加された被担持物質を包み込むことができ、封入効果が良好であるため、担持物質を効果的に細胞に侵入して内包体から細胞質に逃げ出すことができる。

上記化合物は疎水性脂質と自己組織化によりリポソームを形成することができる。

いくつかの実施形態では、リポソームは、疎水性脂質、両親媒性脂質、緩衝試薬及び／又は有機溶媒をさらに含み、前記両親媒性脂質は中性脂質とＰＥＧ－脂質から選ばれる少なくとも１つを含み、前記疎水性脂質はステロールを含む。

いくつかの実施形態では、前記中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウリルホスファチジルコリン、ピロ炭酸ジエチル、ジミリスチルホスファチジルコリン及び卵黄レシチンから選ばれる少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、前記ＰＥＧ－脂質は、ビスパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ、ビスステアリルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ、ジミリスチルグリセロール及びジメタクリレートから選ばれる少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、前記ステロールはコレステロールである。

いくつかの実施形態では、前記緩衝試薬は酸性緩衝試薬である。

いくつかの実施形態では、前記緩衝試薬は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、トリメチロールアミノメタン－塩酸、リン酸二水素カリウム－水酸化ナトリウム、ホウ酸－ホウ砂、グリシン－塩酸、フタル酸－塩酸、フタル酸水素カリウム及びリン酸二水素ナトリウム－クエン酸から選ばれる少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トルエンシクロヘキサノン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、プロピレンオキサイド、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ピリジン、フェノール、スチレン、パークロロエチレン、トリクロロエチレン、エチレングリコールエーテル及びトリエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０～８０％ｍｏｌ／ｍｏｌであり、さらに、前記化合物の量は２０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、８０％ｍｏｌ／ｍｏｌである。

いくつかの実施形態では、前記化合物、中性脂質、ステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比は（２０～８０）：（５～５０）：（１０～６０）：（０．２～２０）である。

いくつかの実施形態では、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は５０～９０％ｖ／ｖである。さらに、前記緩衝試薬の体積は５０％ｖ／ｖ、５１％ｖ／ｖ、５２％ｖ／ｖ、５３％ｖ／ｖ、５４％ｖ／ｖ、５５％ｖ／ｖ、５６％ｖ／ｖ、５７％ｖ／ｖ、５８％ｖ／ｖ、５９％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、６１％ｖ／ｖ、６２％ｖ／ｖ、６３％ｖ／ｖ、６４％ｖ／ｖ、６５％ｖ／ｖ、６６％ｖ／ｖ、６７％ｖ／ｖ、６８％ｖ／ｖ、６９％ｖ／ｖ、７０％ｖ／ｖ、７１％ｖ／ｖ、７２％ｖ／ｖ、７３％ｖ／ｖ、７４％ｖ／ｖ、７５％ｖ／ｖ、７６％ｖ／ｖ、７７％ｖ／ｖ、７８％ｖ／ｖ、７９％ｖ／ｖ、８０％ｖ／ｖ、８１％ｖ／ｖ、８２％ｖ／ｖ、８３％ｖ／ｖ、８４％ｖ／ｖ、８５％ｖ／ｖ、８６％ｖ／ｖ、８７％ｖ／ｖ、８８％ｖ／ｖ、８９％ｖ／ｖ、９０％ｖ／ｖである。

いくつかの実施形態では、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は７５％ｖ／ｖである。

いくつかの実施形態では、上記化合物はリン脂質誘導体とともにリポソームを形成することもでき、リン脂質誘導体は、ジステアロイルホスファチジルコリン、ビスステアリルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含むが、これらに制限されない。

一具体的な実施形態において、リポソームは上記化合物を含み、さらに、リポソームは中性脂質とリポソーム粒子の凝集を低減できる脂質も含む。

一具体的な実施形態において、リポソームは主に、（ｉ）少なくとも一種の本発明の脂質、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＬＰＣ、ＤＥＰＣ、ＤＭＰＣ、及びＥＰＣ等から選ばれる中性脂質、（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール、（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質、例えばＤＰＰＥ－ＰＥＧ，ＤＳＰＥ－ＰＥＧ，ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡは約２０－８０％のアミン含有脂質_：５－５０％中性脂質_：１０－６０％ステロール_：０．２－２０％ＰＥＧ－脂質のモル比で配合してなるものからなる。

本発明の別の態様では、本発明は上記リポソームの調製方法を提案する。本発明の実施例によれば、所定の量の本発明の第１の態様に記載の化合物と有機溶媒を混合して、前記リポソームを取得するステップを含む。

いくつかの実施形態では、上記化合物の有機溶液中の濃度は１０－３０ｍｇ／ｍＬであり、さらに、上記化合物の有機溶液中の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、前記方法は、所定の量の疎水性脂質、両親媒性脂質を上記有機溶液に溶解してから緩衝試薬と混合し、前記リポソームを取得するステップをさらに含む。本発明の実施例によれば、前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０～８０％ｍｏｌ／ｍｏｌであり、前記化合物、中性脂質、ステロール及びＰＥＧ－脂質の質量比は（２０～８０）：（５～５０）：（１０～６０）：（０．２～２０）であり、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は７５％ｖ／ｖである。

いくつかの実施形態では、前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、２９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、３９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、４９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、５９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、６９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７０％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７１％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７２％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７３％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７４％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７５％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７６％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７７％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７８％ｍｏｌ／ｍｏｌ、７９％ｍｏｌ／ｍｏｌ、８０％ｍｏｌ／ｍｏｌである。

薬物担体、薬物組成物、トランスフェクション複合体

本発明の他の態様では、本発明は、上記化合物またはリポソームを含む薬物担体を提案する。本発明の実施例によれば、前記化合物はイオン化可能なアミン含有脂質であり、前記薬物担体はイオン化可能な担体であり、負に帯電する薬物を担持することができ、薬物を細胞内に送達して内包体から効果的に細胞質に逃げ出し、担持された薬物の薬効の発揮に有利である。

本発明のさらなる態様では、本発明は、担体と薬物活性成分を含む薬物組成物を提案し、ここで、前記担体は本発明の第５の態様に記載の薬物担体を含む。本発明の実施例によれば、前記薬物担体はイオン化可能な担体であり、負に帯電する薬物活性成分を担持することができ、薬物活性成分を細胞内に送達して内包体から効果的に細胞質に逃げ出し、担持された薬物活性成分の薬効の発揮に有利である。

いくつかの実施形態では、前記薬物活性成分は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質及び疎水性薬物から選ばれる少なくとも１つを含む。本発明の実施例によれば、前記薬物担体は、疎水性小分子薬物などの疎水性物質を担持できる長い炭素鎖を含む。

さらに、本発明の薬物担体は、タンパク質、ポリペプチド系物質を担持することもでき、前記タンパク質、ポリペプチド系の複製は特に限定されず、ペプチド鎖、タンパク質そのものであってもよいし、上記物質の誘導体または他の物質の複合体、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはその一部のドメインペプチドセグメント、核種をした担持タンパク質、抗体などの物質であってもよい。

さらに、本発明の薬物担体は核酸系物質、例えば、アンチセンス核酸等を担持することもできる。

いくつかの実施形態では、前記薬物活性成分は負に帯電する。本発明の実施例によれば、前記薬物担体にイオン化可能なアミン含有脂質が含まれ、特定のｐＨで正に帯電し、負に帯電する薬物活性成分と結合することができ、なお、脂質二分子層の流動作用により、薬物活性成分を包み込んで、細胞に送達することができる。

いくつかの実施形態では、前記薬物活性成分は核酸を含む。本発明の実施例によれば、前記薬物活性成分はＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸－タンパク質複合体、核酸－脂質複合体、核酸－核種複合体等を含み、前記核酸のタイプは制限されない。該核酸の具体例として、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオシド酸、プラスミドＤＮＡ、ペプチド核酸、三本鎖形成型オリゴヌクレオシド酸（Ｔｒｉｐｌｅｘ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＴＦＯ）、遺伝子などが挙げられる。ここで、本発明の担体は、ｓｉＲＮＡを細胞内に輸送する上で特に有効である。本発明の担体に適用する核酸は、ヒト、動物、植物、細菌、ウイルスなどに由来する核酸であってもよく、また、化学的合成により調製される核酸であってもよい。さらに、上記核酸は一本鎖、二本鎖、三本鎖のいずれかであってもよく、またその分子量も特に限定されない。また、本発明において、核酸は、化学、酵素またはペプチドで修飾された核酸であってもよい。本発明において、核酸は１種を単独で使用してもよいし、２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。好ましい実施形態において、本発明の核酸輸送用担体組成物は、低干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）またはその類似物を輸送することが好ましい。

いくつかの実施形態では、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（５～４０）：１である。

いくつかの実施形態では、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（８～２０）：１である。

いくつかの実施形態では、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１である。

いくつかの実施形態では、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は１５：１である。

本発明のさらなる態様では、本発明は、トランスフェクション複合体を提案する。本発明の実施例によれば、前記トランスフェクション複合体は上記化合物または上記リポソームを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるトランスフェクション複合体の調製と形成に適した補助脂質は、コレステロール、コレステロール誘導体または外因性生体活性分子の細胞または組織内部への導入を実現または促進する中性または陽イオン脂質のいずれかであってもよいが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載のトランスフェクション複合体の調製に１種以上の補助脂質を使用することができる。

いくつかの実施形態では、前記トランスフェクション複合体は少なくとも一種の生理活性剤を含む。本発明の実施例によるトランスフェクション複合体は、体外または体内細胞、組織または器官に１種または複数種の生理活性剤を送達するのに適用する。

いくつかの実施形態では、前記トランスフェクション複合体は、細胞に送達するか、または体外または体内の標的組織に送達する１種または複数種の生理活性剤を含む。適切な生理活性剤は、本明細書に記載のトランスフェクション試薬とトランスフェクション複合体を形成でき、且つ１つまたは複数の細胞内部に送達されるか、または体内または体外組織に送達される場合に生体応答を起こすような任意の分子を含むことができる。本明細書に記載の実施形態に使用される生理活性剤は、カチオン性、中性またはアニオン性の試薬であってもよい。

いくつかの実施形態では、前記生理活性剤は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質及び薬物から選ばれる少なくとも１つを含む。本発明の実施例によれば、トランスフェクション複合体の調製に適する例示的な生理活性剤は、核酸（一本鎖または二本鎖直鎖または環状ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ分子を含む）、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子、低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、オリゴキシリル酸、アンチセンスオリゴキシリル酸、センスオリゴキシリル酸を含むが、これらに限定されない）、マルチプルスキン、抗体、オリゴスキン、治療的ペプチドまたはタンパク質分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、カチオン性、アニオン性または中性の有機分子または薬物、及びそれらの薬学的に許容する塩を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスフェクション複合体は、任意に１種または複数種の融合皮膚または細胞貫通皮膚を含むことができる。融合皮膚または細胞貫通皮膚は、脂質含有複合体と細胞膜（原形質膜または細胞体内膜）の融合を促進する任意のペプチド高分子である。複数種の融合ペプチドまたは細胞貫通ペプチドは、当該分野で知られ、且つ当業者の技能レベル内で、融合ペプチドまたは細胞貫通ペプチド及び本発明におけるその使用条件を過度な実験なしで識別することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスフェクション複合体は、任意に１種または複数種のトランスフェクション補助剤または標的部分を含むことができる。標的部分は皮膚、修飾された皮膚、抗体、修飾された抗体、受容体分子、修飾された受容体分子、一本鎖または二本鎖核酸分子、修飾された一本鎖または二本鎖核酸分子、ペプチドまたは核酸アプタマー、修飾されたペプチドまたは核酸アプタマー、有機分子、多糖、またはそれらの任意の他の分子であってもよく、前記分子はトランスフェクション複合体を特定の組織または細胞タイプに標的化してそれに生理活性剤を標的的に送達することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスフェクション複合体は、最大１年間安定でき、且つトランスフェクション対象の細胞または組織と接触できるか、または形成直後またはしばらく動物またはヒトに投与されるか、または任意に細胞または組織と接触しまたは動物またはヒトに投与する前に一定の時間保存することができる。前記トランスフェクション複合体は安定し、且つ室温または氷点以上からほぼ室温までの温度で、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４つの月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月または少なくとも１年間保存することができる。本明細書に記載の製剤は、生物学的と薬学的分野の熟練した従業員が容易に理解するように、生体活性製剤の長期的な安定と貯蔵を補助する１種または複数種の安定剤、防腐剤、緩衝剤等を含むことができ、過度な実験を必要せずに実現することができると理解すべきである。さらに、貯蔵期は、３１分間～１時間、または１時間～２４時間など、これらの期間のいずれかであってもよいと理解すべきである。

以下、具体的な実施例を参照し、本発明を説明し、なお、これらの実施例は、説明的なものに過ぎず、いかなる方式で本発明を限定するものではない。

検出と計算方法：
１、アンモニウム含有脂質の構造を決定するための核磁気共鳴分光計検出
用いられる核磁気共鳴分光計はＢｒｕｋｅｒ ４００Ｍ核磁気共鳴分光計である。具体的な計算方法は文献、Ｂｏｕｌｍｅｄａｉｓ Ｆ．、Ｆｒｉｓｃｈ Ｂ．、Ｅｔｉｅｎｎｅ Ｏ．、Ｌａｖａｌｌｅ Ｐｈ．、Ｐｉｃａｒｔ Ｃ．、Ｏｇｉｅｒ Ｊ．、Ｖｏｅｇｅｌ Ｊ－Ｃ．、Ｓｃｈａａｆ Ｐ．、Ｅｇｌｅｓ Ｃ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｆｉｌｍｓ ｗｉｔｈ ｐｅｇｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、２５、２００３－２０１１を参考する。

２、製剤中の核酸の担持を証明するためのゲルブロック実験
抗アポリポタンパク質Ｂ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｐｏＢ）をＤＥＰＣ処理水に溶解し、異なる質量比（ｗ／ｗ）のＬＮＰと新鮮に組み立てる。その後、６×ローディングバッファ液（宝日医生体技術（北京）有限公司）と混合して、同量のｓｉＲＮＡを含む製剤を０．０１％ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（ｗ／ｗ）（北京全式金生体）を含む１％（ｗ／ｗ）アガロースゲルに添加する。１×ＴＡＥ電気泳動バッファ液中で、９０ｖの電圧で３０ｍｉｎ電気泳動する。ゲルイメージングシステム（上海日能科技有限公司）で紫外光波長３２０ｎｍで結果を記録する。ｓｉＡｐｏＢ配列を表１に示す。

３、粒子径及び表面電位の測定、脂質処方が使用可能であるかどうかを初歩的に判定する
ＬＮＰはｓｉＲＮＡを包んだ後に得られた製剤は、粒子径と表面電位を測定する前に１０倍の希釈を行う。粒子径と表面電位の測定に用いられる計器は、米国Ｍａｌｖｅｎ会社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳ型レーザ粒度計であり、測定温度は２５℃で、角度は９０°で、入射光波長は６７７ｎｍである。

４、製剤内ｓｉＲＮＡ濃度の測定
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ法でｓｉＲＮＡ濃度を測定する。被験製剤を２０倍希釈した後に１００μＬを９６ウェルプレート内に添加し、製剤外部ｓｉＲＮＡ蛍光量を検出するために使用される。１５μＬの希釈後の被験製剤を別途に取り、５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００（ｗ／ｗ）の混合液で脂質構造を破壊して内部のｓｉＲＮＡを完全に放出し、ウェルに３５μＬの１×ＴＥバッファ液を添加して体積を補完し、製剤の全部のｓｉＲＮＡ蛍光量を検出するために使用される。なお、ｓｉＲＮＡ標準試料、１×ＴＥ、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を使用して検量線を作成し、被験サンプル中のｓｉＲＮＡの濃度を計算するために使用される。すべての被験サンプルをロードした後に、室温で３０分間インキュベートする。次に、遮光でＲｉｂｏＧｒｅｅｎ作動液を１００μＬ／ウェルで添加して直ちに酵素マーカーで蛍光検出を行う。検出条件を表２に示す。

５、製剤の粒子形態を検出するための透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）実験
用いられる透過型電子顕微鏡はオランダＪＥＭ－１００ＣＸ ＩＩ型透過型電子顕微鏡である。まず、銅網を被験サンプル溶液に浸漬し、次に、０．１重量％のリンタングステン酸溶液で染色し、約３分後、余分な液体を濾紙でろ過し、室温で乾かす。次に、透過型電子顕微鏡で観察し、システム内の粒子の形態を撮影する。

６、体外トランスフェクション実験
候補製剤のｓｉＲＮＡ送達効率の検出に対して、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地で１２ウェルプレートに接種し、接種密度は１×１０^５細胞／ウェルであり、ウェルあたり１ｍＬ培地で、３７℃で一夜培養した。

翌日、１２ウェルプレート中の細胞培養液を吸い取って廃棄し、すべてのトランスフェクション対象のウェルに１ウェルあたり１ｍＬの新鮮な１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地を添加する。Ｍｏｃｋ群をさらに処理しない。被験サンプルウェルに対応する製剤を添加し、サンプルロード体積は、先にＲｉｂｏＧｒｅｅｎ法によるＬＮＰ内ｓｉＲＮＡ濃度に応じて計算されることにより、ｓｉＡｐｏＢの最終濃度を５０ｎＭにする。細胞を３７℃で４時間培養し、ウェルあたりに１ｍＬの１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ完全培地を添加し、続いて、３７℃で一夜培養する。

その後、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ （Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いて、被験サンプル中のＡｐｏＢ ｍＲＮＡの相対発現を検出する。具体的なステップは、トランスフェクションした細胞を２４時間培養した後、ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｏｒ （南京諾唯贊生体科技有限公司、貨物番号Ｒ４０１－０１－ＡＡ）、クロロホルム、イソプロピルアルコールで細胞中の総ＲＮＡを抽出し、それぞれ１μｇの総ＲＮＡを取って逆転写キット（北京全式金生体技術有限公司、貨物番号ＡＴ３１１－０３）の使用方法に従って逆転写してｃＤＮＡを取得する。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ ｍｉｘ（上海翊聖生体科技有限公司、貨物番号１１２０１ＥＳ０８）を使用して、ｃＤＮＡをテンプレートとして明細書のステップに従って目的遺伝子ＡｐｏＢ及び内部参照遺伝子グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を検出し、ここで、ＡｐｏＢの発現には、ＧＡＰＤＨを参照する必要がある。ＡｐｏＢと内部参照遺伝子としてのＧＡＰＤＨを増幅するためのＰＣＲプライマーを表３に示す。

７、細胞毒性検出
ＭＴＴ法（テトラゾール塩比色法）を利用してポリマーの細胞毒性を検出し、具体的な方法は以下の通りである。
（１）９６ウェルプレートに１．２５×１０^４個のＨｅｐＧ２細胞／ウェルを接種し、ウェル当たりの培地体積は１００μＬであり、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で一夜インキュベートする。
（２）２４時間後、ウェル中のｓｉＲＮＡの含有量を１ｎＭから２００ｎＭとなるように、各ウェルに防虫ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ｓｉＦｉｒｅｆｌｙ）を包むｓｉＦＬＡ４－１３を適量に添加する。同時に、対照ウェル（細胞、製剤を含む液体体積と同様で、ｐＨ値が７．４のＰＢＳ、培養液、ＭＴＴ、ジメチルスルホキシド）を設定し、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で４８時間インキュベートする。
（３）各ウェルに２０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いて５％ＣＯ_２、３７℃条件下で４時間インキュベートする。
（４）ウェル内の上澄み培養液を慎重に廃棄し、各ウェルに１５０μＬのジメチルスルホキシドを添加し、低速発振器に置いて１０分間振とうし、結晶物を十分に溶解する。連続分光マルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００）で５４０ｎｍで各ウェルの吸光値を測定する。
（５）以下の式によって各サンプルウェル細胞の相対活力を計算し、
ｓｉＦｉｒｅｆｌｙ配列を表４に示す。

８、核酸が細胞に入ったかどうかを判断するために使用されるサブ細胞局在化
試験の前日に、２×１０^５ＨｅｐＧ２細胞を３５ｍｍシャーレに接種し、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で一夜培養する。翌日、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７ ３’端にＣｙ５基を接続したＬＮＰ Ｃｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包んで対応するシャーレに添加して４時間培養し続き、細胞がトランスフェクション試薬を飲み込むようにする。所定の時間に達したら、トランスフェクション試薬を含む培地をすべて廃棄して１×ＰＢＳでシャーレ上の細胞を三回洗浄する。その後、シャーレに１ｍＬの染色作動液（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ用の１×ＰＢＳ １：３０００（ｖ／ｖ）を添加して希釈し、また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ０．１ ｍｇ／ｍｌを含み、３７℃下で１５分間遮光染色する。染色を完了した後、レーザー共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００，Ｚｅｉｓｓ）で蛍光信号の細胞内での分布状況を観察する。

９、細胞への核酸侵入の効率を判断するための細胞取り込み
ＨｅｐＧ２細胞は、検出前日に１２ウェルプレートに接種され、濃度は２×１０^５細胞／ｍＬであり、体積は１ｍＬ／ウェルである。２４時間後、ウェルにＣｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３を添加し、最終濃度を５０ｎＭにし、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で４時間培養する。その後、トランスフェクション試薬を含む培地をすべて廃棄し、トリプシンで細胞を消化し、完全培地で消化を中止し、液体を遠心管内に収集する。８００回転／分で５分間遠心した後、１×ＰＢＳで再懸濁し、細胞を三回繰り返して潤洗する。その後、フローサイトメータ（ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ，ＢＤ）でＨｅｐＧ２細胞による製剤の飲み込み効率を検出する。ＦｌｏｗＪｏ ７．６を利用してデータを分析する。

１０、薬物の体内での代謝及び分布特徴を判断するための体内分布実験
実験は、６－８週のＣ５７ＢＬ／６マウスを実験対象とし、２グループに分けた後にそれぞれ尾静脈を通じて１×ＰＢＳまたはＣｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３を投与し、ここで、Ｃｙ５－ｓｉＦｉｒｅｆｌｙの量は２ｍｇ／ｋｇである。投薬後の異なる時点で小動物生体撮像システムＦＸ Ｐｒｏ（Ｋｏｄａｋ）によってマウス体内のＣｙ５信号分布状況を検出する。なお、投薬０．５時間、４時間及び２４時間後、生体イメージングが完了した後に、各グループの１－２匹の動物が安楽死させられ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃、腸、顎下腺及び胸腺を臓器イメージングのために分離する。結果の分析はＣａｒｅｓｔｒｅａｍソフトウェアによって完了され、折れ線グラフはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８によって生成される。

他の実験では、実験対象は６－８週のＣ５７ＢＬ／６マウスであり、それぞれ尾静脈で１×ＰＢＳまたはｍＬｕＡ４－１２製剤を投与し、ｍＲＮＡの量は２０μｇ／匹の動物である。投薬６、９時間後、動物が安楽死させられ、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃、腸、顎下腺及び胸腺を臓器イメージングのために分離した。結果の分析はＣａｒｅｓｔｒｅａｍソフトウェアによって完了する。

１１、投与量依存性実験
３２匹の６－８週のＣ５７ＢＬ／６マウスが８グループに分けた後、それぞれ１×ＰＢＳまたは０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇのｓｉＡ４－１３を受けた。４２時間後、動物は６時間絶食されて、安楽死させられた。血清と肝組織サンプルを血清中のトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＣＨＯ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－ｃ）及び肝組織内ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの発現変化を分析するために収集する。マウスＡｐｏＢと内部参照遺伝子としてのＧＡＰＤＨを増幅するためのＰＣＲプライマーを表５に示す。

１２、作用時間実験
９６匹の６－８週のＣ５７ＢＬ／６マウスは３グループに分けられ、それぞれ１×ＰＢＳまたは１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのｓｉＡ４－１３を受けた。投薬後、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９日後、それぞれ各グループの４匹の動物は６時間絶食されて、安楽死させられ、血清と肝組織サンプルを血清中のＴＧ、ＣＨＯ、ＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃ及び肝組織内ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの発現変化を分析するために収集する。作用時間曲線はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８から生成される。

１３、薬効試験
実験は２つの部分に分けられる。第１の部分では、レプチン受容体ノックアウトｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／ＪＧｐｔ－ Ｌｅｐｒｅｍ２Ｃｄ／Ｇｐｔ）を実験対象として、同じ遺伝的背景の無遺伝子ノックアウトマウス（ｍ／ｍ）を対照とした。この部分の実験は、抗アンギオゲニン様タンパク質３ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＮＧＰＴＬ３）を包んだ製剤ｓｉＡＮＡ４－１３の脂質低下効果と標的遺伝子の発現変化を検出することを目的とする。第２の部分では、ヒト化アポリポタンパク質Ｃ３（ＡｐｏＣ３）トランスジェニックマウス（ｈＡｐｏＣ３、Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ）を実験対象とし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対照とする。この部分の実験は、ｓｉＡｐｏＣ３製剤を包んだｓｉＡｐｏＣＡ４－１３の脂質低下効果及び薬物中止後の動物の血中脂質回復状況を検出することを目的とする。

第１の部分では、ｄｂ／ｄｂマウスにそれぞれ尾静脈で１×ＰＢＳまたは０．５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＦＬＡ４－１３または０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡＮＡ４－１３または０．２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡＮＡ４－１３を注射する。テストは週に１回、合計５回の投薬を行う。投薬後の３日目に、用いられる動物は、６時間絶食されて眼窩から血液をＴＧ、ＣＨＯの変化を分析するために収集する。最後の投薬後の２日目に、すべての動物は、６時間絶食された後に犠牲にされ、血液と肝組織サンプルを収集し、血中脂質変化と肝組織中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現をさらに測定する。グループごとに１匹の動物から肝臓を収集してオイルレッドＯ染色に用いて、肝臓中の脂質沈着の変化を観察するために使用される。

第２の部分では、ｈＡｐｏＣ３マウスにそれぞれ尾静脈で１×ＰＢＳまたは０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＦＬＡ４－１３または０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏＣＡ４－１３または０．２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡｐｏＣＡ４－１３を注射する。実験は同様に５回の投薬を行い、毎回１週間隔で行い、その間に血中脂質変化を検出すると予定する。最後の投薬後、すべての動物は週に１回の血中脂質検出を受けて、合計４回である。その後、動物が安楽死させられ、血液を収集して血中脂質を検出する。実験に関するｓｉＡＮＧＰＴＬ３とｓｉＡｐｏＣ３の配列、及びマウスＡＮＧＰＴＬ３とヒトＡｐｏＣ３を増幅するためのＰＣＲプライマーをそれぞれ表６と表７に示す。

１４、体外ｍＲＮＡ発現テスト
ＨｅｐＧ２細胞を検出の前日に１２ウェルプレートに接種し、濃度は２×１０^５細胞／ｍＬであり、体積は１ｍＬ／ウェルである。２４時間後、ウェルにルシフェラーゼｍＲＮＡを包んだｍＬｕＡ４－１２を添加し、各ウェルに添加されたｍＲＮＡの量は４００ｎｇになり、５％ＣＯ_２、３７℃条件下で６時間培養する。所定時間に達すると、受動的開裂液で細胞を開裂して細胞開裂液を収集する。その後、９６ウェルプレートに細胞開裂液１０μＬ／サンプルを添加し、各ウェルに５０μＬのルシフェラーゼ基質を添加する。完了後に直ちに酵素マーカーでサンプルからの蛍光量を検出する。

１５、ｓｉＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの遺伝子抑制比較テスト
トランスフェクションの２４時間前に、ＨｅｐＧ２－ｌｕｃ細胞を６ウェルプレートに接種し、濃度は２×１０^５細胞／ｍＬであり、体積は１ｍＬ／ウェルである。翌日、ＬＮＰにそれぞれ抗ｐｏｌｏ様キナーゼ遺伝子１を包んだｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＫ１）とＣａｓタンパク質とＰＬＫ１ ｓｇＲＮＡを同時に発現したプラスミド（ｐＣＰＬＫ１）のｓｉＰＬＫＡ４－１３とｐＣＰＡ４－１２を対応するウェル内に添加し、ｓｉＲＮＡとプラスミドの量は１６００ｎｇとなる。Ｍｏｃｋ群をさらに処理しない。細胞は５％ＣＯ_２、３７℃条件下で４時間培養する。その後、各ウェルに新鮮な培地１ｍＬを添加し、さらに、２０時間培養し続ける。所定時間に達すると、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を利用して被験サンプルにおけるＰＬＫ１ ｍＲＮＡの相対発現を検出する。ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡの核酸及びプライマー配列をそれぞれ表８と表９に示す。

調製例１ アミン含有脂質化合物Ａ４の合成

化合物Ａ２の合成
反応は、三ネックフラスコ中で行い、ここで、ｔｅｒｔ－ブチル（３－アミノプロピル）カルバメート（１．０１ｇ，５．７ｍｍｏｌ）、１，２－エポキシドデカン（２．３３ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）及び１２．００ｍＬのエタノールを含み、５０℃で窒素還流する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて反応を監視し、反応終了後に停止した。粗品を減圧濃縮した後、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１（ｖ／ｖ）を展開剤とし、シリカゲルカラムで分離精製した。生成物Ａ２ （１．６１ｇ，収率７８．１％）を取得する。 １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ １３．６８ Ｈｚ， ６ Ｈ）， １．２６－１．４４ （ｍ， ４５ Ｈ）， １．６７ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．３８－２．７０ （ｍ， ６ Ｈ）， ３．１８ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．７０ （ｍ， ２ Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） １５６．２２， ７９．３９， ６９．５８， ６２．９０， ５２．７０， ３８．５８， ３８．５３， ３５．１３， ３４．９８， ３１．９２， ２９．６２， ２９．３５， ２８．４４， ２５．６５， ２２．７０， １４．１３；高分解能質量分析（ＥＩ＋モード）で化合物Ａ２（分子量５４３．５０２３）を走査し、走査結果は５４３．５１０８である。

化合物Ａ３の合成
化合物Ａ２（１．０４ｇ，１．８ｍｍｏｌ）と２０．００ｍＬのジクロロメタンを含む三ネックフラスコに、撹拌しながら塩酸をゆっくりと添加する。室温で１６時間反応し、反応が終了後に停止し、ＴＬＣ板で検出する。１ＭのＮａＯＨ水溶液で反応混合液のｐＨを７－８に調整し、水と酢酸エチルで３回抽出する。減圧の状況下で濃縮して生成物Ａ３（３９８．０ｍｇ，収率４９．９％）を取得する。 １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ １３．０８ Ｈｚ， ６ Ｈ）， １．２６ （ｍ， ３２ Ｈ）， １．４３ （ｍ， ４ Ｈ）， １．９６ （ｍ， Ｊ ＝ １４．５ Ｈｚ， ２ Ｈ）， ２．６０ （ｍ， Ｊ＝２０．９ Ｈｚ， ４ Ｈ）， ３．０１ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．２５ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．８０ （ｍ， ２ Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ７０．４１， ６３．２１， ５８．２９， ４０．７９， ３６．１５， ３１．９４， ２９．９１， ２９．６９， ２９．３９， ２３．９０， ２２．７０， １４．１１；高分解能質量分析（ＥＩ＋モード）で化合物Ａ３（分子量４４３．４４９８）を走査し、走査結果は４４３．４５７６である。

化合物Ａ４の合成
Ａ３（２．２ｇ，４．９ｍｍｏｌ）とコハク酸（２６３．３ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）を２０．００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、三ネックフラスコに入れる。次に、催化剤として１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（７５３．３ｍｇ，５．６ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩（１．１３ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を添加する。窒素ガスの保護下、１２時間反応した。薄層クロマトグラフィーによる検出後、反応を停止した。粗生成物を２回水洗い、飽和塩で２回水洗い、有機相で２回洗浄する。生成物Ａ４（０．１ｇ，収率３．３％）を取得する。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） ０．８８ （ｔ， Ｊ ＝ １３．２４ Ｈｚ， １２ Ｈ）， １．２６－１．４７ （ｍ， ７２ Ｈ）， １．９３ （ｍ， ４ Ｈ）， ２．５６－３．４１．７４ （ｍ， ２０ Ｈ）， ３．８９ （ｍ， ４ Ｈ）， ５．０３ （ｍ， ４ Ｈ）， ８．０４（ｍ， ２ Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （１００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） δ （ｐｐｍ） １７３．２６， ６７．１４， ５９．６９， ５１．６９， ３５．７０， ３４．４７， ３４．２１， ３３．２１， ３０．９５， ３０．５２， ２９．３０， ２８．７２， ２８．４２， ２１．７０， １３．１１；高分解能質量分析（ＥＩ＋モード）で化合物（分子量９６７．９０５１）を走査し、走査結果は９６７．９１３７である。

実施例１
調製例１で得られた脂質Ａ４とＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（艾偉拓（上海）医薬科技有限公司から購入）を無水エタノールに溶解し、濃度は２０ｍｇ／ｍｌである。Ａ４は常温条件下で完全に溶解でき、淡黄色透明液体である。ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧを５０℃で完全に溶解するまで数分間水浴し、いずれも無色透明液体である。上記材料の準備の完了後、Ａ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６６．８：１０．９：２０．０：２．２の質量比で４種の原料を混合してすべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。なお、有機相混合液の３倍体積のｐＨ＝４．０、濃度が１０ｎＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を別途に準備し、同様に、すべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。その後、それぞれ有機相混合液とバッファ液を入れたインスリン注射器を同一の遠心管に置いて全ての液体を迅速に放出し、遠心管を軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１を調製した。

テスト例１
このテスト例は、ゲルブロック実験によって実施例１で得られた脂質ナノ粒子がｓｉＲＮＡを包む能力を検出するとともに、脂質ナノ粒子とｓｉＲＮＡの最適な質量比を探索することを目的とし、テスト結果を図１に示す。結果から、ＬＮＰとｓｉＲＮＡの質量比が５：１より低いと、ｓｉＲＮＡは大量に漏れ、低い質量比はｓｉＲＮＡの送達に適さないことを説明することを示す。質量比は５：１以上であると、ｓｉＲＮＡがＬＮＰで効率よく包まれ、質量比は１５：１であると、ｓｉＲＮＡはほとんど完全に包まれる。ＬＮＰとｓｉＲＮＡの質量比は５：１－３０：１である場合、ＬＮＰとｓｉＲＮＡの適切な質量比範囲であり、質量比が１５：１以上であると、ｓｉＲＮＡの効率よい送達を実現することができる。このため、後続の調製例では、この質量比でＬＮＰｓを調製する。

実施例２
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５８．５：１４．３：２３．４：３．８の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－２を調製した。

実施例３
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５０．２：１６．４：２５．１：８．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－３を調製した。

実施例４
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４２．８：１７．５：２５．７：１４．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－４を調製した。

実施例５
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６１．８：８．６：２１．０：８．６の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－５を調製した。

実施例６
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５７．４：１２．０：１４．６：１６．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－６を調製した。

実施例７
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５５．０：１５．３：２８．１：１．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－７を調製した。

実施例８
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５４．７：１９．０：２３．３：３．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－８を調製した。

実施例９
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５７．７：７．０：２１．３：１４．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－９を調製した。

実施例１０
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５７．２：１０．４：２５．４：７．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１０を調製した。

実施例１１
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６６．１：１６．０：１４．７：３．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１１を調製した。

実施例１２
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６１．６：１８．６：１８．２：１．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１２を調製した。

実施例１３
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６４．８：６．９：２５．５：２．８の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１３を調製した。

実施例１４
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６６．２：１０．６：２１．７：１．４の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１４を調製した。

実施例１５
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５９．１：１２．７：１５．５：１２．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１５を調製した。

実施例１６
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６３．６：１７．１：２１．５：６．８の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振って脂質ナノ粒子Ａ４－１６を調製した。

上記実施例において、Ａ４、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧはそれぞれ４つのレベルに設定され、表８に示す。

実施例１－１６の配合比は直交設計ソフトウェア（直交設計アシスタントｉｉ Ｖ３．１）を用いて設計しており、１６つの配合比の異なるＬＮＰのモル比と質量比を表９に示す。

実施例１７－３２
ｓｉＡｐｏＢの濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール含有量が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＡｐｏＢ溶液を調製した。

実施例１－１６で得られた１６つの異なる配合比の脂質ナノ粒子とｓｉＡｐｏＢ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡｐｏＢはできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、１６個の脂質ナノ粒子／ｓｉＡｐｏＢ複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

テスト例２
このテスト例は、実施例１－１６で得られた１６つのｓｉＡｐｏＢを包まなかった脂質ナノ粒子の粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）を検出することを目的とし、結果を表１０に示し、ほとんどの製剤は、優れた送達担体としての前提を満たす。

テスト例３
このテスト例は、実施例１７－３２で得られた１６つのｓｉＡｐｏＢを包んだ製剤の粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）、包被率（Ｅ．Ｅ．）及び粒子内ｓｉＲＮＡ濃度（ｃｏｎｃ）を検出することを目的とし、結果を表１１に示し、すべての処方はｓｉＲＮＡを効率よく包むことができる。

テスト例４
実施例１７－３２で得られた１６つの製剤に体外トランスフェクション実験を行い、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ結果を表１２に示し、すべての処方はいずれも包まれたｓｉＲＮＡを細胞内に送達し、遺伝子の抑制を実現し、ここで、ｓｉＡ４－１３性能は最適である。

テスト例５
実施例１７－３２で得られた１６つの製剤について動物レベルで活性検証を行う。試験はＣ５７ＢＬ／６を対象とし、６８匹の雌性マウスは１７グループに分けられ、それぞれ尾静脈で１×ＰＢＳまたは投与量が０．５ｍｇ／ｋｇの１６個の製剤を注射する。投薬４２時間後、動物は６時間絶食され、安楽死させられる。肝組織サンプルをＡｐｏＢ ｍＲＮＡの１×ＰＢＳを受けた動物に対する発現変化を分析するために収集する。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ発現はリアルタイム蛍光定量ＰＣＲによって検出される。活性テストの分析結果はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８によって生成して表１３に示し、すべての製剤はいずれも動物レベルの遺伝子抑制を実現することができ、その中で、ｓｉＡ４－１３の性能が最適である。

実施例３３
ｓｉＦｉｒｅｆｌｙをＤＥＰＣ処理水で濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール濃度が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＦｉｒｅｆｌｙ溶液を調製する。

実施例１３で得られた番号がＡ４－１３の脂質ナノ粒子とｓｉＦｉｒｅｆｌｙ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＦｉｒｅｆｌｙはできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析したｓｉＦＬＡ４－１３を取得する。

テスト例６
このテスト例は、実施例３３で得られた番号のｓｉＦＬＡ４－１３をテストすることを目的とする。製剤の細胞毒性、テスト結果を表１４に示す。

テスト例７
このテスト例は、実施例２９で得られた番号のｓｉＡ４－１３の製剤が４℃での安定性をテストすることを目的とする。具体的に、製剤の調製が完了した後にレーザ粒度計を利用して製剤の粒子径を検出する。操作を完了した後に４℃に置いて保存する。その後、３、７、２１日目にそれぞれ再度製剤の粒子径を検出し、検出結果を図２に示し、該製剤が４℃で少なくとも３週安定できることを証明する。

実施例３４
Ｃｙ５－ｓｉＦｉｒｅｆｌｙをＤＥＰＣ処理水で濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール濃度が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＦｉｒｅｆｌｙ溶液を調製する。

実施例１３で得られた番号Ａ４－１３の脂質ナノ粒子とＣｙ５－ｓｉＦｉｒｅｆｌｙ溶液を質量比１５：１（つまり体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、Ｃｙ５－ｓｉＦｉｒｅｆｌｙはできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析して、Ｃｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３を取得し、上記の過程は、全過程で遮光しなければならない。

テスト例８
このテスト例は、実施例３４で得られたＣｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３がＣ５７ＢＬ／６マウス体内での代謝特徴を検出することを目的とする。

テスト例９
このテスト例は、実施例２９で得られた番号ｓｉＡ４－１３の製剤が、Ｃ５７ＢＬ／６マウス体内での投与量依存性行為をテストすることを目的とする。ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの発現変化及び総コレステロール（ＣＨＯ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－ｃ）レベル変化状況をそれぞれ表１６と表１７に示し、計算により、該製剤の有効投与量の半数は約０．１８ｍｇ／ｋｇである。

テスト例１０
このテスト例は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実施例２９で得られたｓｉＡ４－１３製剤の単回注射を受けた後に異なる時点におけるＡｐｏＢ ｍＲＮ発現の変化及びＣＨＯ、ＴＧ、ＬＤＬ－ｃ、ＨＤＬ－ｃレベルの変化をテストすることを目的とする。結果を図４に示し、４週投薬した後、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡ、ＴＧ及びＬＤＬ－ｃのレベルは依然として対照群より低く、４週に１回投薬することをサポートする。

実施例３５
実施例３３で得られた製剤を孔径が１００Ｋｄの限外ろ過管で濃縮し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ法でｓｉＲＮＡ濃度を測定した後、製剤中のｓｉＲＮＡの濃度をそれぞれ３００ｎｇ／μＬ（対応投薬濃度３ｍｇ／ｋｇ）と１００ｎｇ／μＬ（対応投薬濃度１ｍｇ／ｋｇ）に調整する。

テスト例１１
このテスト例は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが実施例３４で得られた製剤を受けた後の主要血清生化学的指標の変化をテストし、これによって、製剤の安全性を判定することを目的とし、結果を図５に示し、テスト実験から、製剤の毒性が要求を満たすことを示す。

実施例３６
ｓｉＡＮＧＰＴＬ３の濃度をＤＥＰＣ処理水で１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール濃度が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＡＮＧＰＴＬ３溶液を調製した。

実施例１３で得られた番号Ａ４－１３の脂質ナノ粒子とｓｉＡＮＧＰＴＬ３溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡＮＧＰＴＬ３はできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析してｓｉＡＮＡ４－１３を取得する。

テスト例１２
このテスト例は、実施例３５で得られたｓｉＡＮＡ４－１３のｄｂ／ｄｂマウス体内での脂質低下効果とＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現抑制能力をテストすることを目的とする。治療を受けた後のマウスのＴＧとＣＨＯ変化状況を図６に示し、該実験から、モデル動物が治療を受けた後にその血中脂質が有意に正常動物のレベルに減少できることが証明される。

０．５ｍｇ／ｋｇと０．２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＡＮＧＰＴ３治療を受けたマウスと０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＮＣ治療を受けたマウスの標的遺伝子発現比較を表１８に示し、図６の血中脂質の低下は、標的遺伝子の抑制によるものである。

異なる治療群動物肝臓の脂質沈着状況を図７に示し、結果から、製剤は肝臓での脂質沈着を逆転させる能力を有することを示す。

実施例３７
ｓｉＡｐｏＣ３の濃度をＤＥＰＣ処理水で１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール濃度が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＡＮＧＰＴＬ３溶液を調製した。

実施例１３で得られた番号Ａ４－１３の脂質ナノ粒子とｓｉＡｐｏＣ３溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡｐｏＣ３はできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析してｓｉＡｐｏＣＡ４－１３を取得する。

テスト例１３
このテスト例は、実施例３４で得られたｓｉＡｐｏＣＡ４－１３治療を受けたｈＡｐｏＣ３マウス及び薬物中止４週間以内の脂質低下効果と血中脂質の変化をテストすることを目的とする。治療を受けた後のマウスのＴＧとＣＨＯ変化状況を図８に示し、該試験から、モデル動物が治療を受けた後の血中脂質が有意に減少し、薬物中止後、血中脂質は一定の時間後に治療前のレベルに回復することが証明される。

調製例２ アミン含有脂質化合物Ａ１０の合成

化合物Ａ７の合成
Ａｒガス保護下で２０ｍｌの無水ジクロロメタンを添加し、撹拌しながら２ｇのトランス-2-トリデセン-1-オールと１．７１ｇの３－ブロモプロピオニルクロリドを添加し、室温で撹拌して２ｈ反応させる。ＴＬＣで反応の完了を検出した後、減圧濃縮によりジクロロメタンを除去した後、シリカゲルカラムで精製して淡黄色油状物（２．７ｇ、収率８９％）を取得する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：５．７５－５．８６（１、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、５．５２－５．６５（１、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、４．５６－４．６１（２Ｈ、ｄ ＯＣＨ２）、３．５６－３．６２（２Ｈ、ｔ ＣＨ２）、２．８９－２．９７（２Ｈ、ｔ ＣＨ２）、２．１６－２．９７（２Ｈ、ｍ ＣＨ２）、１．２２－１．４５（１６Ｈ、ｍ）、０．９０（３Ｈ、ｔ、ＣＨ３）ｐｐｍ

化合物Ａ８の合成
Ａｒガス保護下で、反応フラスコ内に１０ｍｌの無水ＤＭＦを添加し、撹拌しながら２８０ｍｇのＮ－Ｂｏｃ－１，３－ジアミノプロパン塩酸塩と７２１．４ｍｇのＤＩＰＥＡを添加し、室温で２ｈ撹拌した後に１ｇの化合物Ａ７を滴下し、室温で一夜撹拌する。反応終了後、加圧濃縮によりＤＭＦを除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより１６３ｍｇの淡黄色油状物である化合物Ａ８を取得する。収率１８％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：５．７６－５．８３（２Ｈ、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、５．５４－５．６２（２、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、４．５３－４．５７（４Ｈ、ｄ ＯＣＨ２）、２．７１－２．７８（４Ｈ、ｔ ＣＨ２）、２．４３－２．５２（６Ｈ、ｍ ＣＨ２）、２．０４－２．１８（４Ｈ、ｍ ＣＨ２）、１．６０－１．６８（２Ｈ、 ｍ），１．４３－１．５０（１２Ｈ、ｍ）、１．２２－１．３６（３２Ｈ、ｍ）、０．８４－０．９０（６Ｈ、ｍ、ＣＨ３）ｐｐｍ

化合物Ａ９の合成
室温で１６３ｍｇの化合物Ａ８を５ｍｌの４ＭのＨＣｌ酢酸エチル溶液に添加し、室温で撹拌反応する。１ｈ後ＴＬＣで反応を検出する。原料がないまで、反応が完了することを示す。減圧濃縮により溶媒を除去し、真空ポンプで５ｍｉｎ濃縮して次のステップの反応に直接用いられる。

化合物Ａ１０の合成
Ａｒガス保護下で、前ステップの生成物を２ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、４５ｍｇのトリエチルアミンを添加し、室温で３０ｍｉｎ撹拌した後に１４ｍｇのコハク酸クロリドを滴下する。室温で１ｈ撹拌反応し、ＴＬＣで反応を検出する。反応液に１０ｍｌのジクロロメタンを添加し、希釈には１Ｍの塩酸で洗浄し、有機相を収集し、減圧濃縮してシリカゲルカラムを通過する。ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝６０：１である流動相に５‰アンモニア水を添加して（アンモニア水を添加しないと、生成物をカラムにかける）、生成物Ａ１０である淡黄色油状物５６ｍｇを取得する。２ステップの収率は３７％である。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：６．８５（２Ｈ、ｓ、ＮＨ），５．７７－５．８３（４Ｈ、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、５．５２－５．６１（４、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、４．５１－４．５５（８Ｈ、ｄ ＯＣＨ２）、３．２０－３．２６（４Ｈ、ｍ）、２．７１－２．７７（８Ｈ、ｔ ＣＨ２）、２．５６（４Ｈ、ｓ）、２．４５－２．５１（１２Ｈ、ｍ ＣＨ２）、２．０７－２．１５（８Ｈ、ｍ ＣＨ２）、１．６１－１．６８（４Ｈ ｍ，），１．２１－１．３３（６４Ｈ、ｍ）、０．８５－０．９１（１２Ｈ、ｍ、ＣＨ３）ｐｐｍ
ＭＡＳＳ理論値１２３９．８８、実測Ｍ＋１＝１２３９．９。

実施例３８
調製例１で得られた脂質Ａ１０とＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（艾偉拓（上海）医薬科技有限公司から購入）を無水エタノールに溶解し、濃度は２０ｍｇ／ｍｌである。Ａ１０は常温条件下で完全に溶解でき、淡いピンク色の透明液体である。ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧを５０℃で完全に溶解するまで数分間水浴し、いずれも無色透明液体である。上記材料の準備の完了後、Ａ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７２．２：８．１：１４．９：４．９の質量比で４種の原料を混合してすべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。なお、有機相混合液の３倍体積のｐＨ＝４．０、濃度が１０ｎＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を別途に準備し、同様に、すべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。その後、それぞれ有機相混合液とバッファ液を入れたインスリン注射器を同一の遠心管に置いて全ての液体を迅速に放出し、遠心管を軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－１を調製する。

実施例３９
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６１．８：１２．１：１９．１：７．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－２を調製した。

実施例４０
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５２．１：１４．６：２１．５：１１．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－３を調製した。

実施例４１
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６５．９：５．９：１６．３：１１．９の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－４を調製した。

実施例４２
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６４．９：１０．２：２１．４：３．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－５を調製した。

実施例４３
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６９．３：１５．６：１１．４：３．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－６を調製した。

実施例４４
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７０．２：５．３：１９．３：５．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－７を調製した。

実施例４５
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７０．５：９．２：９．７：１０．６の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－８を調製した。

実施例４６
上記溶解した４種の原料をＡ１０：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６９．５：１３．０：１４．３：３．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ａ１０－９を調製した。

上記実施例において、Ａ１０、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧはそれぞれ３つのレベルに設定され、表１９に示す。

実施例３８－４６の配合比は直交設計ソフトウェア（直交設計アシスタントｉｉ Ｖ３．１）を用いて設計しており、９つの配合比の異なるＬＮＰのモル比と質量比を表２０に示す。

実施例４７－５５
実施例３８－４６で得られた９つの異なる配合比のＬＮＰとｓｉＡｐｏＢ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡｐｏＢはできるだけＬＮＰによって包まれる。その後、９つのＬＮＰ／ｓｉＡｐｏＢ複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

テスト例１４
このテスト例は、実施例３８－４６で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包まなかったＬＮＰの粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）を検出することを目的とし、結果を表２１に示し、全ての製剤は、優れた送達担体になる前提がある。

テスト例１５
このテスト例は、実施例４７－５５で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包んだ製剤の粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）、包被率（Ｅ．Ｅ．）及び粒子内ｓｉＲＮＡ濃度（ｃｏｎｃ）を検出することを目的とし、結果を表２２に示し、全ての製剤は、優れた送達担体になる前提がある。

テスト例１６
実施例４７－５５で得られた９つの製剤に体外トランスフェクション実験を行い、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ結果を表２３に示し、全ての製剤は、遺伝子の抑制を実現することができる。

調製例３ アミン含有脂質化合物Ｂ８の合成

化合物Ｂ３の合成
１．０ｇの化合物Ｂ１（１．０ｅｑ）を１５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴で０．９７ｇ（１．０１ｅｑ）のトリエチルアミンを添加し、その後、０．８７ｇ（１．０１ｅｑ）の化合物Ｂ２をシステムに滴下し、アルゴンガス保護で反応し、２時間後、ＴＬＣで原料の反応が完了したことを監視し、得られた化合物Ｂ３の粗品は、未処理のまま次のステップに投入した。

化合物Ｂ４の合成
１．９２ｇ（２．１ｅｑ）のトリエチルアミンを前のステップの反応系に注射し、その後、４．９２ｇのミリスチン酸クロライドをシステムに注射し、氷浴のアルゴンガス保護下で反応を続け、２時間後、ＴＬＣで原料の反応が完了したことを監視し、１Ｍの希塩酸を添加して三回洗浄し、Ｈ_２Ｏで一回洗浄し、有機相を収集し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮により溶媒を除去し、シリカゲルカラム（ＤＣＭ／ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５００：１）で精製し、３．０ｇの白色固体である化合物Ｂ４を取得する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：６．５８－５．６３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、６．３２－５．４２（１Ｈ、ｄ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、５．６８－５．７３（１、ｄ、ＣＨ ＝ ＣＨ）、４．１８－４．３０（４Ｈ、ｄｔ ＮＣＨ２）、３．６４－３．７４（４Ｈ、ｔ ＣＨ２）、２．３０－２．３８（４Ｈ、ｔ ＣＨ２）、１．５８－１．６８（４Ｈ、 ｍ），１．２９－１．２９（４２Ｈ、ｍ）、０．８５－０．９０（６Ｈ、ｍ、ＣＨ３）ｐｐｍ

化合物Ｂ５の合成
１．０ｇ（１．０ｅｑ）のブタンジアミンを３０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴で５．２ｇの（２．１ｅｑ）Ｂｏｃ酸無水物をシステムに滴下し、撹拌して６ｈ反応させ、ＴＬＣで原料の反応が完了したことを監視し、順次に１Ｍの希塩酸、飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して洗浄し、有機相を収集し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮により溶媒を除去し、２．２ｇの白色固体粉末である化合物Ｂ５を取得する。

化合物Ｂ６の合成
１．０ｇ（１．０ｅｑ）の化合物Ｂ５を２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、氷浴で０．５５ｇ（３．０ｅｑ）の質量分数が６０％のＮａＨをシステムにゆっくりと添加し、撹拌して１５ｍｉｎ反応させた後、定圧滴下漏斗で１．０ｇの（２．０ｅｑ）ＣＨ_３Ｉをシステムにゆっくりと滴下し、低温で１時間反応した後、室温に移り、一夜反応させ、翌日に、原料が完了したことを監視し、１Ｍの希塩酸を添加してクエンチャー反応を行い、減圧濃縮によりＤＭＦを除去し、その後、ＤＣＭを添加して溶解し、ＤＣＭ／Ｈ_２Ｏで抽出して洗浄し、有機相を収集し、減圧濃縮により溶媒を除去し、シリカゲルカラム（ＰＥ；ＥＡ＝１０：１）で精製し、３．０ｇの白色固体である化合物Ｂ６を取得する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：３，２４（４Ｈ、ｍ）、２．８３（６Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、１．４６－１．５１（４Ｈ、ｍ）、１．３８－１．４８（１８Ｈ、 ｍ）ｐｐｍ

化合物Ｂ７の合成
２．５ｇ（１．０ｅｑ）の化合物Ｂ６を３０ｍｌのＨＣｌのＥＡ溶液（４Ｍ）に溶解し、室温で撹拌して３時間反応させ、減圧濃縮により溶媒を除去し、０．８ｇの白色固体粉末である化合物Ｂ７を取得する。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：２．９７（４Ｈ、ｓ）、２．５７（６Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、１．５６－１．６１（４Ｈ、ｍ） ｐｐｍ

化合物Ｂ８の合成
１３０ｍｇ（１．０ｅｑ）化合物Ｂ７を１５ｍｌのイソプロピルアルコールに溶解し、１４２．６ｍｇ（２．０５ｅｑ）のトリエチルアミンを添加し、室温で撹拌して３０ｍｉｎ反応させた後、８１７．１ｍｇ（２．０５ｅｑ）の化合物Ｂ４を添加し、９０℃で撹拌して２４ｈ反応させ、ＴＬＣから、少量の原料が残ることを示すと、反応を停止し、減圧濃縮により溶媒を除去し、ＤＣＭを添加して溶解し、その後、１Ｍの希塩酸を添加して三回洗浄し、Ｈ_２Ｏで一回洗浄し、有機相を収集し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮により溶媒を除去し、シリカゲルカラムで精製し、１３６ｍｇの化合物Ｂ８を取得し、収率が１６％である。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：４．１９－２．２４（８Ｈ、ｍ）、３．５８－３．６８（８Ｈ、ｍ）、２．６７－２．７６（４Ｈ、ｍ）、２．５４－２．６２（４Ｈ、ｍ）、２．２５－２．３４（８Ｈ、ｍ）、２．２４－２．２５（６Ｈ、ｍ）、１．６１－１．７０（８Ｈ、ｍ）、１．４３－１．５０（４Ｈ、ｍ）、１．２３－１．３２（８０Ｈ、ｍ）、０．７６－０．８９（１２Ｈ、ｔ、ＣＨ３）ｐｐｍ。ＭＡＳＳ理論値＝１２７５．９９、実測値Ｍ＋１＝１２７６．０。

実施例５６
調製例２で得られた脂質Ｂ８とＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（艾偉拓（上海）医薬科技有限公司から購入）を無水エタノールに溶解し、濃度は２０ｍｇ／ｍｌである。Ｂ８は、３０℃条件下で５分間インキュベートしなければ、完全に溶解できなく、無色透明液体である。ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧを５０℃で完全に溶解するまで数分間水浴し、いずれも無色透明液体である。上記材料の準備の完了後、Ｂ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７０．１：８．７：１５．９：５．２の質量比で４種の原料を混合してすべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。なお、有機相混合液の３倍体積のｐＨ＝４．０、濃度が１０ｎＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を別途に準備し、同様に、すべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。その後、それぞれ有機相混合液とバッファ液を入れたインスリン注射器を同一の遠心管に置いて全ての液体を迅速に放出し、遠心管を軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－１を調製した。

実施例５７
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５９．５：１２．９：２０．３：７．４の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－２を調製した。

実施例５８
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４９．７：１５．４：２２．６：１２．４の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－３を調製した。

実施例５９
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６３．７：６．３：１７．４：１２．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－４を調製した。

実施例６０
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６２．６：１０．９：２２．８：３．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－５を調製した。

実施例６１
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６７．１：１６．６：１２．２：４．０の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－６を調製した。

実施例６２
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６８．１：５．６：２０．６：５．６の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－７を調製した。

実施例６３
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６８．４：９．９：１０．４：１１．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－８を調製した。

実施例６４
上記溶解した４種の原料をＢ８：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６７．４：１３．９：１５．３：３．４の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｂ８－９を調製した。

上記実施例において、Ｂ８、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧはそれぞれ３つのレベルに設定され、表２４に示す。

実施例５６－６４の配合比は直交設計ソフトウェア（直交設計アシスタントｉｉ Ｖ３．１）を用いて設計しており、９つの配合比の異なるＬＮＰのモル比と質量比を表２５に示す。

実施例６５－７３
実施例５６－６４で得られた９つの異なる配合比のＬＮＰとｓｉＡｐｏＢ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後、５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡｐｏＢはできるだけＬＮＰによって包まれる。その後、９つのＬＮＰ／ｓｉＡｐｏＢ複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

テスト例１７
このテスト例は、実施例５６－６４で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包まなかったＬＮＰの粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）を検出することを目的とし、結果を表２６に示し、全ての製剤は良好な理化学的性質を有し、優れた送達担体になる潜在力を持っている。

テスト例１８
このテスト例は、実施例６５－７３で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包んだ製剤の粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）、包被率（Ｅ．Ｅ．）及び粒子内ｓｉＲＮＡ濃度（ｃｏｎｃ）を検出することを目的とし、結果を表２７に示し、全ての製剤は良好な理化学的性質を有し、優れた送達担体になる潜在力を持っている。

テスト例１９
実施例６５－７３で得られた９つの製剤に体外トランスフェクション実験を行い、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ結果を表２８に示し、全ての製剤は、遺伝子の抑制を実現することができる。

調製例４ アミン含有脂質化合物Ｃ３の合成

化合物Ｃ２の合成
２００ｍｇ（２．２７ｍｍｏｌ）の１，４－ブタンジアミンを１０ｍｌのイソプロピルアルコールに溶解し、１．１ｇ（４．７６ｍｍｏｌ）の化合物Ｃ１を添加し、システムが無色透明状態であり、７０℃まで加熱して撹拌し、３ｈ後、白色固体が析出し、加熱し続けて５ｈ撹拌した後、ＴＬＣで原料Ｃ１が完全に反応したことを検出すると、反応を停止する。減圧でイソプロピルアルコールを除去した後に、２０ｍｌのノルマルヘキサンを添加し、室温で１ｈ撹拌し、吸引濾過して化合物Ｃ２（５４０ｍｇ、収率４７％）を取得する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：３．６１（２Ｈ、ｓ）、２．５８－２．６５（６Ｈ、ｍ）、２．４４－２．５２（２Ｈ、ｍ）、１．４７－１．５９（８Ｈ、ｍ）、１．２３－１．３４（４０Ｈ、ｍ）、０．７３－０．８８（６Ｈ、ｔ、ＣＨ３）ｐｐｍ

化合物Ｃ３の合成
１３０ｍｇ（０．２２４ｍｍｏｌ）の化合物Ｂ４を５ｍｌのイソプロピルアルコールに溶解し、５７．４９ｍｇ（０．１１２ｍｍｏｌ）の化合物Ｃ２を添加し、９０℃で１０ｈ反応した後、ＴＬＣで原料Ｂ４とＣ２の両方が完全に反応したことを検出すると、反応を停止する。後処理しないまま直接シリカゲルカラムで精製して最終生成物Ｃ３（５４ｍｇ、収率２９％）を取得する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ ：４．２５（８Ｈ、ｍ）、３．５６－３．６７（１０Ｈ、ｍ）、２．２４－２．９５（２４Ｈ、ｍ）、１．４４－１．６２（１２Ｈ、ｍ）、１．１７－１．３９（１２４Ｈ、ｍ）、０．７６－０．９１（１８Ｈ、ｔ、ＣＨ３）ｐｐｍ。Ｍａｓｓ理論値＝１６７２．６８、実測Ｍ＋１＝１６７３．６。

実施例７４
調製例３で得られた脂質Ｃ３とＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（艾偉拓（上海）医薬科技有限公司から購入）を無水エタノールに溶解し、濃度は２０ｍｇ／ｍｌである。Ｃ３の完全溶解には、５０℃条件で５分間超音波をかける必要があり、無色透明液体である。ＤＳＰＣ、コレステロールとＤＭＧ－ＰＥＧを５０℃で完全に溶解するまで数分間水浴し、いずれも無色透明液体である。上記材料の準備の完了後、Ｃ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７５．５：７．１：１３．１：４．３の質量比で４種の原料を混合してすべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。なお、有機相混合液の３倍体積のｐＨ＝４．０、濃度が１０ｎＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を別途に準備し、同様に、すべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。その後、それぞれ有機相混合液とバッファ液を入れたインスリン注射器を同一の遠心管に置いて全ての液体を迅速に放出し、遠心管を軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－１を調製した。

実施例７５
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６５．８：１０．９：１７．１：６．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－２を調製した。

実施例７６
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５６．４：１３．３：１９．６：１０．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－３を調製した。

実施例７７
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６９．７：５．３：１４．５：１０．６の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－４を調製した。

実施例７８
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝６８．７：９．１：１９．１：３．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－５を調製した。

実施例７９
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７２．８：１３．８：１０．１：３．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－６を調製した。

実施例８０
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７３．７：４．６：１７．０：４．７の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－７を調製した。

実施例８１
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７４．０：８．２：８．５：９．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－８を調製した。

実施例８２
上記溶解した４種の原料をＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝７３．１：１１．５：１２．７：２．８の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ Ｃ３－９を調製した。

上記実施例において、Ｃ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧはそれぞれ３つのレベルに設定され、表２９に示す。

実施例７４－８２の配合比は直交設計ソフトウェア（直交設計アシスタントｉｉ Ｖ３．１）を用いて設計しており、９つの配合比の異なるＬＮＰのモル比と質量比を表３０に示す。

実施例８３－９１
実施例７４－８２で得られた９つの異なる配合比のＬＮＰとｓｉＡｐｏＢ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＡｐｏＢはできるだけＬＮＰによって包まれる。その後、９つのＬＮＰ／ｓｉＡｐｏＢ複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

テスト例２０
このテスト例は、実施例７４－８２で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包まなかったＬＮＰの粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）を検出することを目的とし、結果を表３１に示し、全ての製剤は良好な理化学的性質を有し、優れた送達担体になる潜在力を持っている。

テスト例２１
このテスト例は、実施例８３－９１で得られた９つのｓｉＡｐｏＢを包んだ製剤の粒子径（ｓｉｚｅ）、多分散係数（ＰＤＩ）、表面電位（ｚｅｔａ）、包被率（Ｅ．Ｅ．）及び粒子内ｓｉＲＮＡ濃度（ｃｏｎｃ）を検出することを目的とし、結果を表３２に示し、全ての製剤は良好な理化学的性質を有し、優れた送達担体になる潜在力を持っている。

テスト例２２
実施例８３－９１で得られた９つの製剤に体外トランスフェクション実験を行い、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ結果を表３３に示し、全ての製剤は、遺伝子の抑制を実現することができる。

実施例９２
調製例１で得られた脂質Ａ４とＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（艾偉拓（上海）医薬科技有限公司から購入）を無水エタノールに溶解し、濃度は２０ｍｇ／ｍｌである。Ａ４は常温条件下で完全に溶解でき、淡黄色透明液体である。ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧを５０℃で完全に溶解するまで数分間水浴し、いずれも無色透明液体である。上記材料の準備の完了後、Ａ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４５．０：２３．１：３０：２．０の質量比で４種の原料を混合してすべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。なお、有機相混合液の３倍体積のｐＨ＝４．０、濃度が１０ｎＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を別途に準備し、同様に、すべてインスリン注射器に吸入して準備に使用される。その後、それぞれ有機相混合液とバッファ液を入れたインスリン注射器を同一の遠心管に置いて全ての液体を迅速に放出し、遠心管を軽く振って脂質ナノ粒子ｍＡ４－１を調製する。

実施例９３
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝３６．９：２８．４：３１．５：３．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－２を調製した。

実施例９４
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝３１．３：３２．１：３２．５：４．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－３を調製した。

実施例９５
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝２７．３：３５．１：３２．８：４．８の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－４を調製した。

実施例９６
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４７．１：１８．１：３０．１：４．６の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－５を調製した。

実施例９７
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４５．３：２６．１：２２．６：５．９の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－６を調製した。

実施例９８
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝３７．１：２８．５：３３．３：１．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－７を調製した。

実施例９９
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝３５．６：３４．３：２７．８：２．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－８を調製した。

実施例１００
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４９．１：１５．１：３０．６：５．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－９を調製した。

実施例１０１
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４４．２：２０．４：３１．８：３．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１０を調製した。

実施例１０２
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４８．４：２９．８：１９．３：２．５の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１１を調製した。

実施例１０３
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４３．３：３３．３：２２．２：１．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１２を調製した。

実施例１０４
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５２．６：１３．５：３１．６：２．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１３を調製した。

実施例１０５
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝５１．９：２０．０：２７．０：１．１の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１４を調製した。

実施例１０６
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４９．３：２５．３：２１．０：４．３の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１５を調製した。

実施例１０７
上記溶解した４種の原料をＡ４：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ－ＰＥＧ＝４９．０：３１．４：１６．３：３．２の質量比で混合してインスリン注射器に吸い込む。また、３倍体積のクエン酸／クエン酸ナトリウムバッファ液を準備してインスリン注射器に吸い込んで有機相と混合し、軽く振ってＬＮＰ ｍＡ４－１６を調製した。

上記実施例において、Ａ４、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧはそれぞれ４つのレベルに設定され、表３４に示す。

実施例９２－１０７の配合比は直交設計ソフトウェア（直交設計アシスタントｉｉ Ｖ３．１）を用いて設計しており、１６個の配合比の異なるＬＮＰのモル比と質量比を表３５に示す。

実施例１０８－１２３
ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ｍＬｕｃ）の濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール含有量が２５％の５００ｎｇ／μＬのｍＬｕｃ溶液を調製した。

実施例９２－１０７で得られた１６つの異なる配合比の脂質ナノ粒子とｍＬｕｃ溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｍＬｕｃはできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれる。その後、１６個のＬＮＰ／ｍＬｕｃ複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

テスト例２３
このテスト例は、実施例１０８－１２３で得られた１６つの製剤の体外ｍＲＮＡの発現効率を検出することを目的とし、テスト結果を図９に示す。結果から、１６個の製剤はいずれもｍＲＮＡの細胞内での効率よい発現を媒介することができ、その中で、ｍＬｕＡ４－１２が好ましい。

テスト例２４
このテスト例は、実施例１１９で得られたｍＬｕＡ４－１２のＣ５７ＢＬ／６マウス体内での代謝特徴を検出することを目的とし、尾静脈でｍＬｕＡ４－１２を注射し、６時間後に、各主な臓器のルシフェラーゼの発現量を図１０に示し、ｍＡ４－１２はｍＲＮＡの細胞内での効率よい発現を媒介することができる。

実施例１２４
ＰＬＫ１ ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を同時に発現するプラスミドｐＣＰＬＫ１の濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール含有量が２５％の５００ｎｇ／μＬのｐＣＰＬＫ１溶液を調製した。実施例９２で得られたｍＡ４－１２とｐＣＰＬＫ１溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｐＣＰＬＫ１はできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれて、ｐＣＰＡ４－１２を取得する。その後、ｓｇＰＬＫＡ１－１２複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。

実施例１２５
ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡの濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール含有量が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｉＰＬＫ１溶液を調製した。Ａ４－１３とｓｉＰＬＫ１溶液を質量比１５：１（即ち体積比１．５：１）で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｉＰＬＫ１はできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれて、ｓｉＰＬＫＡ４－１３を取得する。その後、ｓｉＰＬＫＡ４－１３複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内に移し（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）、１×ＰＢＳで３時間透析した。

実施例１２６
ＰＬＫ１を標的とするｓｇＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に溶解し、濃度を１０００ｎｇ／μＬに調整し、等体積の５０％エタノール溶液と混合し、エタノール含有量が２５％の５００ｎｇ／μＬのｓｇＰＬＫ１溶液を調製した。Ｃａｓ９タンパク質はＤＥＰＣ処理水で溶解し、ＢＣＡ法で濃度を測定し、等量のｓｇＰＬＫ１と混合した。そして、Ａ４－１３と上記溶液を質量比３０：１で混合し、軽く振った後５０℃で２０分間インキュベートし、ｓｇＰＬＫ１及びＣａｓ９タンパク質はできるだけ脂質ナノ粒子によって包まれて、ＣａｓＰＬＫＡ４－１３を取得する。その後、ＣａｓＰＬＫＡ４－１３複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。
ＨｅｐＧ２細胞を被験対象とし、プレートを敷いてから２４時間後に細胞にＣａｓＰＬＫＡ４－１３を加えてトランスフェクションを行い、ｓｉＰＬＫＡ４－１３を陽性対照とした。２４時間後に細胞を受け取り、ｑＰＣＲはＰＬＫ１の相対的な発現を検出する。

実施例１２７
塩酸アジスロマイシンをＰＢＳに溶解して完全に溶解させ、濃度を測定する。Ａ４－１３と上記溶液を質量比１５：１で混合し、軽く振った後室温で２０分間インキュベートし、複合体ＤＯＸＡ４－１３を形成する。その後、ＤＯＸＡ４－１３複合体をカットオフ分子量が１０００００ドルトンの透析チューブ内（ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇ２３５０３５）に移し、１×ＰＢＳで３時間透析した。
ＨｅｐＧ２細胞を被験対象とし、プレートを敷いてから２４時間後に細胞にＤＯＸＡ４－１３を加えてトランスフェクションを行い、遊離のＤＯＸを対照とする。２４時間後に細胞を受け取り、ＭＴＴ法で異なるサンプル処理後の細胞の相対活性を検出する。

テスト例２５
このテスト例は、実施例１２４で得られたｐＣＰＡ４－１２が細胞レベルの標的遺伝子の編集効率をテストし、実施例１２５で得られたｓｉＰＬＫＡ４－１３と遺伝子抑制の効率を比較することを目的とし、結果を表３４に示す。結果から、細胞がｐＣＰＡ４－１２処理を受けた後の標的遺伝子ＰＬＫ１の発現はｓｉＰＬＫＡ４－１３より明らかに高いが、ＰＢＳ対照群と比較して、極めて顕著な差異があり、ｍＡ４－１２は良好な遺伝子編集応用の見通しがあることを示す。

比較例１
この比較例は、調製例１で得られた脂質Ａ４と対照物脂質Ｅの安定性を比較することを目的とする。ここで、脂質Ｅの化学構造式を図１１に示す。

脂質Ａ４と脂質Ｅをそれぞれ９０％無水エタノールと１０％濃度が０．０５Ｍ、ｐＨが４．０のクエン酸塩（Ｗ／Ｗ）の溶媒に溶解する。直ちに１００μＬのサンプルをインキュベート前のサンプルとして吸い取り、直ちに－８０℃で保存してサンプルの分解を防止する。当日は実験の０日目である。その後、それぞれＡ４とＥ被験サンプルを４０℃でインキュベートし続け、それぞれ実験の１日目、３日目、５日目及び７日目に１００μＬのサンプルを吸い取って－８０℃で保存する。全てのサンプルを取得した後、ＨＰＬＣでサンプルの安定性をテストし、テスト条件は以下の通りである。

比較例２
Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｅ ２０００（Ｌｉｐｏ）は市販の商用トランスフェクション試薬であり、細胞レベルで効率よい核酸送達を媒介することができるが、動物レベルで有効送達をほとんど実現できない。本実験は、Ａ４－１３のＣ５７マウス体内での薬効（投与量は０．５ｍｇ／ｋｇ）を比較することを目的とし、Ｌｉｐｏ／ｓｉＡｐｏＢの相対発現は０．８５であり、Ａ４－１３／ｓｉＡｐｏＢの相対発現は０．２７である。結果を図１２に示す。実験結果から、Ｌｉｐｏが体内での送達効率は低く、Ａ４－１３は効率よいｓｉＲＮＡ送達を実現することができることが証明される。

比較例３
このテスト例は、実施例３４で得られたＣｙ－ｓｉＦＬＡ４－１３の細胞取り込み効率を検出することを目的とする。テスト分析結果を表３５に示し、該製剤の細胞レベルでの送達効率は商用トランスフェクション試薬に相当し、Ｌｉｐｏは動物レベルでの核酸の効率よい送達を実現することができないことを考慮すると、Ａ４－１３の核酸送達分野での応用潜在力の優位性は明らかである。

比較例４
この比較例は、ＬｉｐｏでｍＲＮＡを包んだ後で得られた複合体と実施例１１９で得られたｍＬｕＡ４－１２は細胞レベルで媒介した飲み込み効率を比較することを目的とし、テスト結果を表３６に示し、ＬｉｐｏとｍＬｕＡ４－１２によって全ての細胞がルシフェラーゼｍＲＮＡを飲み込むことに成功したことを示し、Ｌｉｐｏはより高い平均蛍光信号強度を実現し、即ち単一の細胞はより多くのルシフェラーゼｍＲＮＡを飲み込む。しかしながら、Ｌｉｐｏは動物レベルでの核酸の効率よい送達を実現することができないことを考慮すると、ｍＡ４－１２はまたより広い応用範囲を有する。

比較例５
この比較例は、脂質Ｅを核心脂質として得られたリポソームＥと、さらにｓｉＡｐｏＢとインキュベートすることで得られたｓｉＥと、実施例２９で得られたｓｉＡ４－１３との細胞レベルで媒介した送達効率を比較することを目的とする。結果を表３７に示し、ｓｉＡ４－１３は効率よい細胞レベルでの標的遺伝子の抑制を実現することができるが、ｓｉＥは細胞レベルで標的遺伝子の抑制をほとんど実現できないことを示す。

本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、または「いくつかの例」という参考用語などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点は本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語例示的な叙述は必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明する具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例では適切な方式で結合することができる。なお、互いに衝突しない場合、当業者は本明細書に説明される異なる実施例または例以及び異なる実施例または例の特徴を結合と組み合わせることができる。

本発明の実施例を提示し記述したが、上記実施例は例示的なものであり、本発明を制限するためのものとして理解することができなく、当業者であれば、本発明の範囲で上記実施例について様々な変化、修正、置換および変形が可能であることが理解できる。

Claims (21)

1. 式（Ｉ）に示す化合物または式（Ｉ）に示す化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、薬学的に許容する塩である化合物であって、
   ただし、
   各ＸとＹはそれぞれ独立して－ＣＨ_２－または－ＣＯ－から選ばれ、ＸとＹは同時に－ＣＨ_２－または－ＣＯ－ではなく、ただし、各Ｘは同じまたは異なり、各Ｙは同じまたは異なり、
   Ｒ_２はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、Ｒ_３はＨ、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれ、
   Ｒ_１は
   または
   から選ばれ、ただし、ｎは０－１０から選ばれた整数であり、Ｚは
   または
   から選ばれ、
   Ｒ_４は任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルケニル基または任意に置換されたＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、置換基はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＮＯ_２から選ばれる、化合物。
2. Ｒ_２はＨ、ＣＨ_３－、またはＲ_１から選ばれ、Ｒ_３はＨ、またはＲ_１から選ばれ、
   Ｒ_１は
   または
   から選ばれ、ただし、ｎは１－５から選ばれた整数であり、Ｚは
   または
   から選ばれ、
   Ｒ_４はＣ_４－Ｃ_２０アルキル基、Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基またはＣ_４－Ｃ_２０アルキニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_４－Ｃ_２０アルケニル基は１－３個の二重結合を含み、前記Ｃ_４－Ｃ_２０アルキニル基は１－３個の三重結合を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
3. Ｒ_４はＣ_５－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_５－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の化合物。
4. Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は同じであり、
   Ｒ_４はＣ_１０－Ｃ_１５アルキル基、Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基から選ばれ、ただし、前記Ｃ_１０－Ｃ_１５アルケニル基は１－３個の二重結合を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の化合物。
5. の中の１つの構造を含む、ことを特徴とする請求項４に記載の化合物。
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物のリポソームにおける調製の使用。
7. 請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物からなる、ことを特徴とするリポソーム。
8. 疎水性脂質、両親媒性脂質、緩衝試薬及び有機溶媒から選ばれる少なくとも１つをさらに含み、ここで、前記両親媒性脂質は、中性脂質とＰＥＧ－脂質から選ばれる少なくとも１つを含み、前記疎水性脂質はステロールから選ばれ、
   任意選択に、前記中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウリルホスファチジルコリン、ピロ炭酸ジエチル、ジミリスチルホスファチジルコリン及び卵黄レシチンから選ばれる少なくとも１つを含み、
   任意選択に、前記ＰＥＧ－脂質は、ビスパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ、ビスステアリルホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ、ジミリスチルグリセロール及びジメタクリレートから選ばれる少なくとも１つを含み、
   任意選択に、前記ステロールはコレステロールであり、
   任意選択に、前記緩衝試薬は酸性緩衝試薬であり、
   任意選択に、前記緩衝試薬はクエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、トリメチロールアミノメタン－塩酸、リン酸二水素カリウム－水酸化ナトリウム、ホウ酸－ホウ砂、グリシン－塩酸、フタル酸－塩酸、フタル酸水素カリウム及びリン酸二水素ナトリウム－クエン酸から選ばれる少なくとも１つを含み、
   任意選択に、前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサン、オクタン、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トルエンシクロヘキサノン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、プロピレンオキサイド、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、ピリジン、フェノール、スチレン、パークロロエチレン、トリクロロエチレン、エチレングリコールエーテル及びトリエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項７に記載のリポソーム。
9. 前記リポソームに基づいて、前記化合物の量は２０～８０％ｍｏｌ／ｍｏｌであり、
   任意選択に、前記化合物、中性脂質、ステロール及びＰＥＧ－脂質のモル比は（２０～８０）：（５～５０）：（１０～６０）：（０．０１～２０）であり、
   任意選択に、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は５０～９０％ｖ／ｖであり、
   好ましくは、前記リポソームに基づいて、前記緩衝試薬の体積は７５％ｖ／ｖである、ことを特徴とする請求項８に記載のリポソーム。
10. 所定の量の請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物と有機溶媒を混合し、前記リポソームを取得するステップを含む、ことを特徴とする請求項７～９のいずれか１項に記載のリポソームの調製方法。
11. 所定の量の疎水性脂質、両親媒性脂質及び／又は緩衝試薬と請求項１０で得られた溶液を混合し、前記リポソームを取得するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１～２のいずれか１項に記載の化合物または請求項３～９のいずれか１項に記載のリポソームを含む、薬物担体。
13. 請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、請求項７～９のいずれか１項に記載のリポソームまたは請求項１２に記載の薬物担体の薬物調製における使用。
14. 担体と薬物活性成分を含み、前記担体は請求項１２に記載の薬物担体を含む、薬物組成物。
15. 前記薬物活性成分は、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ポリペプチド及び小分子薬物から選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の薬物組成物。
16. 前記薬物活性成分に負に帯電する、ことを特徴とする請求項１４に記載の薬物組成物。
17. 前記薬物活性成分は核酸を含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の薬物組成物。
18. 前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（５～４０）：１であり、
    好ましくは、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は（８～２０）：１であり、
    好ましくは、前記担体と前記薬物活性成分の質量比は１５：１である、ことを特徴とする請求項１４に記載の薬物組成物。
19. 請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物または請求項７～９に記載のリポソームを含む、ことを特徴とするトランスフェクション複合体。
20. 前記トランスフェクション複合体は少なくとも一種の生理活性剤を含む、ことを特徴とする請求項１９に記載のトランスフェクション複合体。
21. 前記生理活性剤は、
    ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質及び薬物から選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項２０に記載のトランスフェクション複合体。