CN117209536A - 甘油磷酰乙醇胺系列化合物及包括其的脂质纳米药物载体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸药物递送领域，主要涉及一种甘油磷酰乙醇胺骨架化合物及包括其的脂质纳米药物载体。甘油磷酰乙醇胺骨架化合物，具有如式(I)所示的结构：本发明将二硫戊环结构修饰在甘油磷酰乙醇胺脂质的磷酸亲水端，使二硫戊环结构更充分的暴漏在LNP的表面，使制备的LNP表面会暴漏更多的二硫戊环，能够进一步促进黏膜细胞对LNP的内吞。甘油磷酰乙醇胺骨架化合物在LNP处方中具有较宽的调节范围，可以提高LNP中二硫戊环的含量。本发明的核酸脂质纳米颗粒组合物以及药物制剂可以用于核酸药物的眼部递送、肺部吸入递送以及鼻腔喷雾，为核酸药物的肝外递送提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于核酸药物递送领域，主要涉及一种甘油磷酰乙醇胺骨架化合物及包括其的脂质纳米药物载体。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前用于核酸药物递送的脂质纳米颗粒(LNP)主要由四种组分组成，包括阳离子/可电离脂质、中性辅助磷脂、胆固醇以及PEG化脂质。这四种成分可以通过微流控设备包裹核酸药物而得到脂质纳米颗粒。目前已经有三款基于LNP的核酸药物上市销售，2018年首款基于LNP技术的核酸药物Patisiran成功上市，该药物是用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性多发性神经病的首款siRNA药物。另外两款为新冠疫情期间附条件上市的mRNA疫苗。近年来有数十亿剂基于LNP技术的mRNA药物被广泛的接种并且阻止了新冠病毒对健康人群的伤害，证明了LNP技术在mRNA药物递送中具有良好的安全性和优异的免疫效果。
LNP对核酸药物具有较高的包封率，通常在80％以上，并且能够保护核酸免受体内各种酶的降解。但是基于LNP的核酸药物多集中在肝病和疫苗领域，目前虽然有大量的核酸药物处于不同的临床实验阶段，但是尚未有靶向其他器官的核酸药物进入临床研究。
现有专利CN116212031A公开了由硫辛酸、聚乙二醇和磷酰乙醇胺磷脂三个部分和链接这三个部分的化学键组成的黏膜黏附性脂质材料(DSPE-PEG-LA)，该材料虽然可以构建为LNP并进一步制备为具有黏膜黏附作用的核酸药物，但是PEG链段具有较强的柔性，在LNP的组装过程中疏水的硫辛酸容易被裹在LNP的内部疏水内核中，导致二硫戊环难以暴漏在LNP表面，进而影响其促进细胞内吞的功能。另外，DSPE-PEG-LA在LNP的处方的优选用量一般在1％-5％，这极大限制了二硫戊环在LNP中的含量范围。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种甘油磷酰乙醇胺骨架化合物及包括其的脂质纳米药物载体。本发明设计了一种新型化合物用于核酸药物的递送，该化合物中存在二硫戊环结构，可以与细胞表面的巯基发生化学反应，从而促进LNP的内吞，提高核酸药物进入细胞的能力。本发明将二硫戊环结构修饰在甘油磷酰乙醇胺脂质的磷酸亲水端，相比于DSPE-PEG-LA，本发明设计的带有二硫戊环结构的甘油磷酰乙醇胺脂质材料可以使二硫戊环结构更充分的暴漏在LNP的表面，使用本发明的脂质材料制备的LNP表面会暴漏更多的二硫戊环，能够进一步促进黏膜细胞对LNP的内吞。本发明的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物在LNP处方中具有较宽的调节范围，可以提高LNP中二硫戊环的含量。本发明的核酸脂质纳米颗粒组合物以及药物制剂可以用于核酸药物的眼部递送、肺部吸入递送以及鼻腔喷雾，为核酸药物的肝外递送提供了新的选择。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种甘油磷酰乙醇胺骨架化合物，具有如式(I)所示的结构：
其中，R1和R2各自独立地为C1-24烷基或者C1-24烯基中的一种，A1为亚甲基、1,2-乙二基、1,3-丙二基、1-甲基-1,2-乙二基、1,2-异丙基、1-甲基-1,3-丙二基、2-甲基-1,3-丙二基、1,4-丁二基、1,5-戊二基、1-甲基-1,4-丁二基、2-甲基-1,4-丁二基、3-甲基-1,4-丁二基、2，2-二甲基-1,3-丁二基、1,6-己二基、1-甲基-1,5-戊二基、2-甲基-1,5-戊二基、3-甲基-1,5-戊二基、1-乙基-1,4-丁二基或2-乙基-1,4-丁二基。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物的制备方法，包括以下步骤：
将如式(II)所示的化合物搅拌溶解于氯仿中，加入羰基二咪唑后遮光搅拌，再加入如式(III)所示的化合物，避光反应，反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到所述甘油磷酰乙醇胺骨架化合物；
优选地，式(II)所示的化合物、羰基二咪唑和如式(III)所示的化合物的摩尔比为1:0.75～0.85:1.05～1.15。
优选地，避光反应温度为29～31℃，时间为22～26h。
第三方面，本发明提供了一种脂质纳米药物载体，包括第一脂质化合物和第二脂质化合物，所述第一脂质化合物包括如第一方面所述的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物中的一种或多种，所述第二脂质化合物包括阳离子或可电离脂质、甾醇和两亲性脂质。
优选地，所述阳离子或可电离脂质包括DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、C12-200、SM-102和ALC-0315中的一种或多种；
所述两亲性脂质包括PEG-DSPE、PEG-PE、PEG-DMG、PEG-C14、PEG-c-DMA、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的一种或多种。
优选地，所述第一脂质化合物、所述阳离子或者可电离脂质、所述甾醇和所述两亲性脂质的摩尔比为2～20:10～65:20～55:0.2～20。
优选地，所述第一脂质化合物、所述阳离子或者可电离脂质、所述甾醇和所述两亲性脂质的摩尔比为5～10:30～50:35～55:0.5～10。
第四方面，本发明提供了一种核酸脂质纳米粒组合物，其粒径为30-300nm，包括如第三方面所述的脂质纳米药物载体和核酸药物，所述脂质纳米药物载体与所述核酸药物的质量比为1:1～20。
优选地，所述核酸药物包括DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的一种或多种。
第五方面，本发明提供了一种药物制剂，包括如第四方面所述的核酸脂质纳米粒组合物、药学上可接受的缓冲盐、渗透压调节剂和助悬剂。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
本发明的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物中二硫戊环位于亲水的磷酸端，在LNP的组装过程中，二硫戊环在LNP的表面的暴漏量较大，更容易与细胞表面的巯基发生作用。
本发明的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物在LNP处方中的调节范围较广，可以在较大的范围内调节LNP中二硫戊环的含量，促进黏膜细胞对LNP的内吞。
使用eGFP质粒作为模型核酸药物，基于甘油磷酰乙醇胺骨架化合物的核酸脂质纳米颗粒组合物具有优异的转染效果。基于上述组合物的药物制剂在核酸的肺部吸入给药、眼部给药、鼻腔给药中具有广阔的应用前景。
本发明所提供的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物合成路线简单，提纯过程方便，具有优异的市场前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例14包载siPLK1小干扰RNA的核酸脂质纳米颗粒组合物的粒径分布图；
图2为实施例16包载siPLK1小干扰RNA的核酸脂质纳米颗粒制剂的粒径分布图；
图3为实施例18中Cy3标记的脂质纳米颗粒在A549细胞中的分布情况，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色是Cy3标记的LNP，绿色是Lysotracker green标记的溶酶体；左图为含有化合物7的脂质纳米颗粒，右图为不含二硫戊环结构的LNP脂质纳米颗粒；
图4为实施例19中包载eGFP质粒的核酸脂质纳米颗粒组合物对A549细胞转染后的荧光显微镜图片；
图5为实施例20包载siPLK1小干扰RNA的核酸脂质纳米颗粒药物制剂的粒径分布图
图6为实施例21中脂质纳米颗粒1的透射电镜图；
图7为实施例21中脂质纳米颗粒2的透射电镜图。
具体实施方式
除非另有说明，下列术语的含义如下：
术语“药学上可接受的盐”是指对人体基本上无毒性的化合物的盐。药学上可接受的盐通常包括(但不限于)本发明的化合物与药学上可接受的无机/有机酸或无机/有机碱反应而形成的盐，此类盐又被称为酸加成盐或碱加成盐。常见的无机酸包括(但不限于)盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等，常见的有机酸包括(但不限于)三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、乙酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等，常见的无机碱包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡等，常见的有机碱包括(但不限于)二乙胺、三乙胺、乙胺丁醇等。
术语“立体异构体”(或称“旋光异构体”)是指由于具有至少一个手性因素(包括手性中心、手性轴、手性面等)而导致具有垂直的不对称平面，从而能够使平面偏振光旋转的稳定异构体。由于本发明化合物中存在可能导致立体异构的不对称中心以及其它化学结构，因此本发明也包括这些立体异构体及其混合物。由于本发明的化合物及其盐包括不对称碳原子，因而能够以单一立体异构体形式、外消旋物、对映异构体和非对映异构体的混合物形式存在。通常，这些化合物能够以外消旋混合物的形式制备。然而，如果需要的话，可以将这类化合物制备或分离后得到纯的立体异构体，即单一对映异构体或非对映异构体，或者单一立体异构体富集化(纯度≥98％、≥95％、≥93％、≥90％、≥88％、≥85％或≥80％)的混合物。化合物的单一立体异构体是由含有所需手性中心的旋光起始原料合成制备得到的，或者是通过制备得到对映异构体产物的混合物之后再分离或拆分制备得到的，例如转化为非对映异构体的混合物之后再进行分离或重结晶、色谱处理、使用手性拆分试剂，或者在手性色谱柱上将对映异构体进行直接分离。具有特定立体化学的起始化合物既可以商购得到，也可以按照下文中描述的方法制备再通过本领域熟知的方法拆分得到。
术语“互变异构体”(或称“互变异构形式”)是指具有不同能量的可通过低能垒互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(或称质子转移互变异构体)包括(但不限于)通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化、亚胺-烯胺异构化、酰胺-亚胺醇异构化等。除非另外指出，本发明的化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。
术语“溶剂化物”是指由本发明的化合物或其药学上可接受的盐与至少一种溶剂分子通过非共价分子间作用力结合而形成的物质。常见的溶剂化物包括(但不限于)水合物、乙醇合物、丙酮合物等。
术语“螯合物”是具有环状结构的配合物，是通过两个或多个配位体与同一金属离子形成螯合环的螯合作用而得到。
术语“非共价复合物”是通过化合物与另一分子的相互作用而形成的，其中该化合物与该分子之间不形成共价键。例如，可以通过范德华相互作用、氢键键合和静电相互作用(也称作离子键合)来发生复合。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基R1和取代基R2各自独立地为十二烷-1-基、十八烷-1-基、二十四烷-1-基，例如当取代基R1为十二烷-1-基时，取代基R2既可以为十二烷-1-基、十八烷-1-基、二十四烷-1-基，；同理，当取代基R2为十二烷-1-基时，取代基R1也可以为十二烷-1-基、十八烷-1-基、二十四烷-1-基。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
术语“包含”和“包括”以其开放、非限制性意义使用。
术语“烷基”是指一价的直链或支链的烷烃基团，其仅由碳原子和氢原子组成，不含有不饱和度，并且通过一个单键与其它片段连接，包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基等。例如，“C1-24烷基”指包含1至24个碳原子的饱和的一价直链或支链烃基。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中，“当量(eq)”比指的是溶剂或药品的摩尔比。
本发明中，“适量的”指的是所加入溶剂量或药品量可调范围较大，且对合成结果影响较小，可以不作具体限定。
在下述的实施例中，所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯；溶剂在使用前均经过重新蒸馏；无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。
实施例1：化合物1的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-庚酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物1：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.90(t，6H)，1.27-1.30(d，14H)，1.51-1.66(m，8H)，1.73(s，1H)，1.97(s，1H)，2.01-2.36(m，8H)，2.59(s，1H)，3.46(t，2H)，4.17-4.38(m，6H)，5.27(m，1H)，6.26(s，1H)。
实施例2：化合物2的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-辛酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物2：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.83-0.92(t，6H)，1.25-1.31(d，18H)，1.46-1.62(m，8H)，1.70(s，1H)，1.93(s，1H)，2.05-2.32(m，8H)，2.66(s，1H)，3.36(t，2H)，4.15-4.31(m，6H)，5.37(m，1H)，6.86(s，1H)。
实施例3：化合物3的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-壬酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物3：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.82-0.96(t，6H)，1.22-1.36(d，22H)，1.45-1.58(m，8H)，1.67(s，1H)，1.83(s，1H)，2.12-2.37(m，8H)，2.62(s，1H)，3.41(t，2H)，4.21-4.37(m，6H)，5.27(m，1H)，5.86(s，1H)。
实施例4：化合物4的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-十二酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物4：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.85-0.96(t，6H)，1.22-1.36(d，34H)，1.45-1.58(m，8H)，1.67(s，1H)，1.83(s，1H)，2.12-2.37(m，8H)，2.62(s，1H)，3.41(t，2H)，4.21-4.37(m，6H)，5.27(m，1H)，5.86(s，1H)。
实施例5：化合物5的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物5：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.87-0.93(t，6H)，1.24-1.32(d，42H)，1.40-1.52(m，8H)，1.63(s，1H)，1.73(s，1H)，2.16-2.31(m，8H)，2.52(s，1H)，3.46(t，2H)，4.26-4.32(m，6H)，5.24(m，1H)，5.66(s，1H)。
实施例6：化合物6的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物6：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.82-0.87(t，6H)，1.27-1.36(d，50H)，1.46-1.57(m，8H)，1.66(s，1H)，1.75(s，1H)，2.23-2.37(m，8H)，2.58(s，1H)，3.44(t，2H)，4.23-4.37(m，6H)，5.26(m，1H)，5.54(s，1H)。
实施例7：化合物7的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物7：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.83-0.87(t，6H)，1.21-1.36(d，48H)，1.43-1.58(m，8H)，1.66(s，1H)，1.78(s，1H)，2.19-2.40(m，8H)，2.56(s，1H)，3.49(t，2H)，4.23-4.30(m，6H)，5.24(m，1H)，5.45(m，2H)，5.67(s，1H)。
实施例8：化合物8的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物8：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.89(t，6H)，1.22-1.36(d，48H)，1.40-1.52(m，8H)，1.63(s，1H)，1.73(s，1H)，2.16-2.31(m，8H)，2.52(s，1H)，3.46(t，2H)，4.26-4.32(m，6H)，5.29(m，1H)，5.65(m，4H)，5.86(s，1H)。
实施例9：化合物9的合成
将硫辛酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1-硬脂酰-2-亚油酸-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物9：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.83-0.87(t，6H)，1.24-1.32(d，50H)，1.44-1.56(m，8H)，1.67(s，1H)，1.72(s，1H)，2.14-2.36(m，8H)，2.53(s，1H)，3.42(t，2H)，4.24-4.36(m，6H)，5.16(m，1H)，5.62(m，2H)，5.72(s，1H)。
实施例10：化合物10的合成
将2-(1,2-二硫烷-3-基)乙酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1,2-庚酰基磷脂酰乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物10；
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.82-0.88(t，6H)，1.31-1.33(d，24H)，1.54-1.66(m，4H)，1.74(s，1H)，1.96(s，1H)，2.33-2.54(m，5H)，3.46-3.48(s，2H)，4.12-4.36(m，6H)，5.26-5.28(m，1H)，5.62(m，2H)。
实施例11：化合物11的合成
将2-(1,2-二硫烷-3-基)丙酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)1-硬脂酰-2-亚油酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物11：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.82-0.85(t，6H)，1.22-1.30(d，46H)，1.41-1.52(m，8H)，1.66(s，1H)，1.70(s，1H)，2.11-2.32(m，8H)，2.51(s，1H)，3.46(t，2H)，4.27-4.34(m，6H)，5.18(m，1H)，5.62(m，2H)，5.81(s，1H)。
实施例12：化合物12的合成
将2-(1,2-二硫烷-3-基)戊酸(1.0eq)溶解于适量氯仿中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑(1.1eq)室温避光搅拌30分钟后，加入(0.8eq)二油酰磷脂酰-甘油-3-磷酸乙醇胺，避光于30℃下反应24h。反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到化合物12：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.85-0.88(t，6H)，1.21-1.37(d，46H)，1.38-1.53(m，8H)，1.61(s，1H)，1.70(s，1H)，2.15-2.33(m，8H)，2.50(s，1H)，3.41(t，2H)，4.20-4.27(m，6H)，5.25(m，1H)，5.65(m，4H)，5.76(s，1H)。
实施例13：脂质纳米颗粒的制备
分别按照化合物7、8、9、10：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，以PBS为水相，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并透析除去乙醇即得脂质纳米颗粒。
实施例14：核酸脂质纳米颗粒组合物的制备
分别按照化合物7、8、9、10：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为30mg/mL的脂质溶液)，将siPLK1小干扰RNA溶解于pH4.0的10mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并使用透析将缓冲环境置换成pH7.4的PBS，以除去乙醇即得到核酸脂质纳米颗粒组合物。如图1所示，基于化合物7、8、9、10制备的核酸脂质纳米颗粒组合物具有相近的粒径分布。
实施例15：核酸脂质纳米颗粒药物制剂的制备
分别按照化合物7、8、9、10：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，将eGFP质粒溶解于pH4.0的10mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用碰撞混合器将两相快速混合并使用透析将缓冲环境置换成pH7.4的PBS，加入氯化钠调节渗透压、加入乙基纤维素作为助悬剂后即得到核酸脂质纳米颗粒药物制剂。
实施例16：核酸脂质纳米颗粒药物制剂的制备
分别按照化合物7、8、9、10：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，将siPLK1小干扰RNA溶解于pH4.0的10mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并使用透析将缓冲环境置换成pH7.4的PBS，加入甘油调节渗透压、加入羟丙基甲基纤维素作为助悬剂后即得到核酸脂质纳米颗粒药物制剂，粒径分布如图2所示。
实施例17：核酸脂质纳米颗粒药物制剂的制备
分别按照化合物7、8、9、10：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，将eGFP质粒溶解于pH4.0的10mM柠檬酸缓冲盐水溶液中，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微射流将两相快速混合并使用透析将缓冲环境置换成pH7.4的HEPES缓冲溶液，加入葡萄糖调节渗透压、加入聚乙烯醇作为助悬剂后即得到核酸脂质纳米颗粒药物制剂。
实施例18：脂质纳米颗粒激光共聚焦实验
分别按照化合物7：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：Cy3-PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，以PBS为水相，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并透析除去乙醇即得脂质纳米颗粒1。将上述实验中的化合物7替换成DSPC，使用同样的处方与工艺制备得到脂质纳米颗粒2。将两种脂质纳米颗粒分别与A549细胞共同孵育0.5、1、2h后，使用PBS洗去样品，再使用Lystracker-green染溶酶体1h，接着使用4％多聚甲醛对细胞进行固定，最后再使用DAPI对细胞核进行染色。使用激光共聚焦显微镜对细胞明场、细胞核、溶酶体以及样品进行观察。通过共聚焦显微镜可以观察到本发明设计的含有二硫戊环结构的脂质可以促进A549细胞对脂质纳米颗粒的内吞，并且具有溶酶体逃逸效果，激光共聚焦图片见图3。利用Cy3标记脂质纳米颗粒，观察脂质纳米颗粒在A549细胞中的分布情况，同时利用DAPI染色细胞，Lysotracker green标记的溶酶体作为参考。左侧为脂质纳米颗粒1，右侧为脂质纳米颗粒2。如图3所示，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色是Cy3标记的LNP，绿色是Lysotracker green标记的溶酶体，带有二硫戊环的LNP能够显著提高LNP进入细胞的能力，从共聚焦结果来看LNP分布在A549细胞核周围，表现A549细胞可有效内吞LNP，并且具有一定的溶酶体逃逸能力。
实施例19：eGFP脂质纳米颗粒转染实验
分别按照化合物7：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：Cy3-PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，以浓度pH4.0浓度为100mM的柠檬酸为水相其中eGFP的浓度为0.2mg/mL，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并透析除去乙醇即得包载eGFP的脂质纳米颗粒。将包载eGFP的脂质纳米颗粒分别与A549细胞孵育1h后使用PBS清洗除去样品，置于荧光显微镜下观察细胞内的荧光情况，通过荧光显微镜可以看到A549细胞几乎都成功得转入了eGFP质粒，荧光图片见图4。
实施例20：siPLK1脂质纳米颗粒蛋白抑制实验
分别按照化合物7：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：Cy3-PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，以浓度pH4.0浓度为100mM的柠檬酸为水相其中siPLK1的浓度为0.2mg/mL，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并透析除去乙醇即得包载siPLK1的脂质纳米颗粒。将上述实验中的化合物7替换成DSPC，使用同样的处方与工艺制备得到脂质纳米颗粒2。将两种包载siPLK1的脂质纳米颗粒分别与A549细胞孵育1h后使用PBS清洗除去样品，以β-actin蛋白为参照，使用蛋白电泳检测细胞内的PLK1蛋白的情况，从蛋白电泳结果可以看到包载siPLK1的脂质纳米颗粒可以抑制A549细胞内PLK1蛋白的表达，蛋白电泳图片见图5。
实施例21：siPLK1脂质纳米颗粒透射电镜样品的制备
分别按照化合物7：胆固醇：ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))：Cy3-PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰磷酰乙醇胺)以10:38:49:3的摩尔比溶解于乙醇中(以脂质总重量计，得到浓度为20mg/mL的脂质溶液)，以浓度pH4.0浓度为100mM的柠檬酸为水相其中siPLK1的浓度为0.2mg/mL，两种溶液的体积比1:3(其中，乙醇溶液的当量为1，水溶液的当量为3)，使用微流控技术将两相快速混合并透析除去乙醇即得包载siPLK1的脂质纳米颗粒。将上述实验中的化合物7替换成DSPC，使用同样的处方与工艺制备得到脂质纳米颗粒2。分别将制备得到的两种脂质纳米颗粒分别滴在2个电镜铜网上，静置3min后使用滤纸从铜网背面吸取液体，再滴上一滴磷钨酸染液静置3min，使用滤纸从铜网背面吸走液体，最后滴上一滴纯化水，使用滤纸从铜网背面吸走液体清洗铜网。将制备好的透射电镜样品避光保存，送样观察，电镜图片见图4、图5。二硫戊环结构容易络合重金属离子，使用磷钨酸作为透射电镜的染色剂，对本实施例制备的核酸脂质纳米颗粒组合物以及使用DSPE-PEG-LA材料制备的核酸脂质纳米颗粒组合物进行磷钨酸染色后拍摄投射电镜照片。如图6所示，本实施例的LNP由于磷钨酸的络合，拍摄的电镜照片染色清晰。如图7所示，使用DSPE-PEG-LA材料制备的LNP由于二硫戊环在LNP表面暴漏的量较少，因此拍摄的电镜照片较暗。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种甘油磷酰乙醇胺骨架化合物，其特征在于，具有如式(I)所示的结构：
其中，R1和R2各自独立地为C1-24烷基或者C1-24烯基中的一种，A1为亚甲基、1,2-乙二基、1,3-丙二基、1-甲基-1,2-乙二基、1,2-异丙基、1-甲基-1,3-丙二基、2-甲基-1,3-丙二基、1,4-丁二基、1,5-戊二基、1-甲基-1,4-丁二基、2-甲基-1,4-丁二基、3-甲基-1,4-丁二基、2，2-二甲基-1,3-丁二基、1,6-己二基、1-甲基-1,5-戊二基、2-甲基-1,5-戊二基、3-甲基-1,5-戊二基、1-乙基-1,4-丁二基或2-乙基-1,4-丁二基。
2.一种如权利要求1所述的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如式(II)所示的化合物搅拌溶解于氯仿中，加入羰基二咪唑后遮光搅拌，再加入如式(III)所示的化合物，避光反应，反应结束后旋蒸除去氯仿，柱层析得到所述甘油磷酰乙醇胺骨架化合物；
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式(II)所示的化合物、羰基二咪唑和如式(III)所示的化合物的摩尔比为1:0.75～0.85:1.05～1.15。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，避光反应温度为29～31℃，时间为22～26h。
5.一种脂质纳米药物载体，其特征在于，包括第一脂质化合物和第二脂质化合物，所述第一脂质化合物包括如权利要求1所述的甘油磷酰乙醇胺骨架化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物中的一种或多种，所述第二脂质化合物包括阳离子或可电离脂质、甾醇和两亲性脂质。
6.如权利要求5所述的脂质纳米药物载体，其特征在于，所述阳离子或可电离脂质包括DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、C12-200、SM-102和ALC-0315中的一种或多种；
所述两亲性脂质包括PEG-DSPE、PEG-PE、PEG-DMG、PEG-C14、PEG-c-DMA、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的一种或多种。
7.如权利要求5所述的脂质纳米药物载体，其特征在于，所述第一脂质化合物、所述阳离子或者可电离脂质、所述甾醇和所述两亲性脂质的摩尔比为2～20:10～65:20～55:0.2～20；
优选地，所述第一脂质化合物、所述阳离子或者可电离脂质、所述甾醇和所述两亲性脂质的摩尔比为5～10:30～50:35～55:0.5～10。
8.一种核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，其粒径为30-300nm，包括如权利要求5-7任一项所述的脂质纳米药物载体和核酸药物，所述脂质纳米药物载体与所述核酸药物的质量比为1:1～20。
9.如权利要求8所述的核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，所述核酸药物包括DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的一种或多种。
10.一种药物制剂，其特征在于，包括如权利要求8或9所述的核酸脂质纳米粒组合物、药学上可接受的缓冲盐、渗透压调节剂和助悬剂。
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