KR102374518B1 - 향상된 지질 조성물 - Google Patents

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지아오준 킨
윌리엄 캔틀리
무티아 마노하란
칼란토따틸 지. 라지브
키자케다투 자야프라카쉬 나이르
무투사미 자야라만
지안신 첸
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 양이온성 지질, 화학식 I의 양이온성 지질을 포함하는 향상된 지질 제제 및 상응하는 이용 방법을 특징으로 한다. 또한, 표적화 지질, 그리고 이런 표적화 지질을 포함하는 특정한 지질 제제가 개시된다.

Description

향상된 지질 조성물 {IMPROVED LIPID FORMULATION}
우선권 주장
본 출원은 2009년 6월 10일에 제출된 U.S.S.N 61/185,800 및 2009년 9월 22일에 제출된 U.S.S.N. 61/244,834에 우선권을 주장하고, 이들 각각의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
기술분야
본 발명은 지질 입자를 이용한 치료제 전달의 분야에 관계한다. 특히, 본 발명에서는 양이온성 지질 및 이들 지질을 포함하는 지질 입자를 제시하는데, 이들은 핵산의 생체내 전달에 유익하고, 그리고 핵산-지질 입자 조성물은 생체내 치료적 용도에 적합하다. 부가적으로, 본 발명에서는 이들 조성물을 제조하는 방법, 그리고 예로써, 다양한 질환 상태 (disease condition)의 치료를 위하여 이들 조성물을 이용하여 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 제시한다.
관련된 선행 기술에 관한 설명
치료적 핵산에는 예로써, 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 플라스미드, 그리고 면역 자극 핵산이 포함된다. 이들 핵산은 다양한 기전에 의해 작용한다. siRNA 또는 miRNA의 경우에, 이들 핵산은 RNA 간섭 (RNAi)으로 불리는 과정을 통하여 특정 단백질의 세포내 수준을 하향-조절할 수 있다. 세포 세포질 내로 siRNA 또는 miRNA의 도입 이후에, 이들 이중-가닥 RNA 구조체는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체로부터 이탈되고, 결합된 siRNA 또는 miRNA의 서열과 상보성 서열을 갖는 mRNA를 인식하고 여기에 결합할 수 있는 RISC 내에 주형 (template)을 제공한다. 상보성 mRNA에 결합하면, RISC 복합체는 mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 단백질 합성을 인코딩하는 상응하는 mRNA의 특정한 파괴를 표적으로 함으로써, 특정 단백질의 하향-조절 (down-regulation)을 제공할 수 있다.
RNAi의 치료적 적용은 극히 넓은데, 그 이유는 siRNA와 miRNA 구조체가 표적 단백질에 지향되는 임의의 뉴클레오티드 서열로 합성될 수 있다. 현재까지, siRNA 구조체는 시험관내와 생체내 모형 둘 모두에서 표적 단백질을 특이적으로 하향-조절하는 능력을 보였다. 이에 더하여, siRNA 구조체는 임상 연구에서 현재 평가되고 있다.
하지만, siRNA 또는 miRNA 구조체가 현재 직면하고 있는 2가지 문제점은 첫째, 혈장 내에서 뉴클레아제 절단 (nuclease digestion)에 대한 감수성, 그리고 둘째, 그들이 유리 siRNA 또는 miRNA로서 전신 투여될 때, RISC에 결합할 수 있는 세포내 구획에 대한 접근을 획득하는 한정된 능력이다. 이들 이중-가닥 구조체는 분자 내에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 링커 (linker), 예를 들면, 포스포티오에이트 (phosphothioate) 기의 함입 (incorporation)에 의해 안정화될 수 있다. 하지만, 이들 화학적 변형은 뉴클레아제 절단 (nuclease digestion)으로부터 단지 한정된 보호만을 제공하고, 그리고 구조체의 활성을 감소시킬 수도 있다. siRNA 또는 miRNA의 세포내 전달은 담체 시스템, 예를 들면, 중합체, 양이온성 리포좀의 이용에 의해, 또는 구조체의 화학적 변형, 예를 들면, 콜레스테롤 분자의 공유 부착에 의해 조장될 수 있다. 하지만, siRNA와 miRNA 분자의 효능을 증가시키고 화학적 변형에 대한 요구를 감소시키거나 배제하기 위하여 향상된 전달 시스템이 요구된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임 역시 mRNA의 단백질로의 번역을 저해할 수 있다. 안티센스 구조체의 경우에, 이들 단일 가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열과 상보성 서열을 갖고, 그리고 Watson-Crick 염기 대합 (base pairing)에 의해 상기 mRNA에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 예방하고 및/또는 mRNA 전사체의 RNase H 분해를 촉발한다. 결과적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 작용 (즉, 특정 질환-관련된 단백질의 하향-조절)의 특이성에 대한 엄청난 잠재력을 갖는다. 현재까지, 이들 화합물은 염증 질환, 암, 그리고 HIV의 모형을 비롯한 여러 시험관내와 생체내 모형에서 가능성을 보였다 (Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)에서 개관됨). 안티센스 역시 염색체 DNA와 특이적으로 혼성화됨으로써 세포 활성에 영향을 줄 수 있다. 여러 안티센스 약물의 진전된 인간 임상 평가가 현재 진행되고 있다. 이들 약물에 대한 표적에는 bcl2와 아포지단백 (apolipoprotein) B 유전자 및 mRNA 산물이 포함된다.
면역-자극 핵산에는 데옥시리보핵산 및 리보핵산이 포함된다. 데옥시리보핵산의 경우에, 일정한 서열 또는 모티프가 포유동물에서 불량한 면역 자극을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이들 서열 또는 모티프에는 CpG 모티프, 피리미딘-풍부한 서열 및 팰린드롬 서열이 포함된다. 데옥시리보핵산 내에서 CpG 모티프는 엔도솜 수용체, 톨-유사 수용체 9 (TLR-9)에 의해 특이적으로 인식되고, 이는 이후, 선천성 및 후천성 면역 자극 경로 둘 모두를 유발하는 것으로 생각된다. 일정한 면역 자극 리보핵산 서열 역시 보고되었다. 이들 RNA 서열은 톨-유사 수용체 6과 7 (TLR-6 및 TLR-7)에 결합함으로써 면역 활성화를 유발하는 것으로 생각된다. 이에 더하여, 이중-가닥 RNA 역시 면역 자극성인 것으로 보고되고, 그리고 TLR-3에 결합에 의해 활성화되는 것으로 생각된다.
치료적 핵산의 이용에서 한 가지 널리 공지된 문제점은 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연쇄의 안정성 및 뉴클레아제에 대한 이러한 링커의 감수성에 관계한다. 혈청 내에서 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 및 엔도뉴클레아제 (endonuclease)의 존재는 포스포디에스테르 링커 (phosphodiester linker)를 보유하는 핵산의 급속한 절단을 유발하고, 따라서 치료적 핵산은 혈청의 존재에서 또는 세포 내에서 매우 짧은 반감기 (half-life)를 가질 수 있다 (Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); 그리고 Thierry, A.R., et al., ppl47-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)). 현재 개발되고 있는 치료적 핵산은 이와 같은 공지된 문제점으로 인하여, 자연 핵산에서 관찰되는 기본적 포스포디에스테르 화학을 이용하지 않는다.
이러한 문제점은 혈청 또는 세포내 분해를 감소시키는 화학적 변형에 의해 부분적으로 극복되었다. 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 가교 (가령, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 포스포라미데이트 연쇄를 이용)에서, 뉴클레오티드 염기 (가령, 5-프로피닐-피리미딘)에서, 또는 당 (가령, 2'-변형된 당)에서 변형이 시험되고 있다 (Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). 2'-5' 당 연쇄를 이용하여 안정성을 향상시키려는 다른 시도가 있었다 (예로써, US Pat. No. 5,532,130 참조). 다른 변화가 시도되었다. 하지만, 이들 해법 중에서 어느 것도 완전히 만족스러운 것으로 증명되지 않았고, 그리고 생체내 유리 치료적 핵산은 여전히 한정된 효능을 갖는다.
이에 더하여, siRNA와 miRNA에 관련하여 앞서 언급된 바와 같이, 세포 막을 건너가는 치료적 핵산의 한정된 능력으로 인한 문제점 (참조: Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)), 그리고 전신 독성 (systemic toxicity)과 연관된 문제점, 예를 들면, 보체-매개된 아나필락시스 (complement-mediated anaphylaxis), 변경된 응고 성질, 그리고 혈구감소증 (cytopenia) (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994))이 여전하다.
향상된 효능을 꾀하기 위하여, 연구자들은 화학적으로 변형된 또는 변형되지 않은 치료적 핵산을 전달하는데 지질-기초된 담체 시스템 역시 이용하였다. Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996)에서, 저자들은 음이온성 (전통적인) 리포좀, pH 민감성 리포좀, 면역리포좀, 융합성 (fusogenic) 리포좀, 그리고 양이온성 지질/안티센스 집합체의 이용에 대해 언급한다. 유사하게, siRNA는 양이온성 리포좀에 담겨 전신 투여되었고, 그리고 이들 핵산-지질 입자는 비-인간 영장류를 비롯한 포유동물에서 표적 단백질의 향상된 하향-조절을 제공하는 것으로 보고되었다 (Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)).
최근의 진전에도 불구하고, 일반적인 치료적 용도에 적합한 향상된 지질-치료적 핵산 조성물이 당해 분야에서 여전히 요구된다. 바람직하게는, 이들 조성물은 높은 효능을 갖는 핵산을 캡슐화 (encapsulation)시키고, 높은 약물:지질 비율을 갖고, 캡슐화된 핵산을 혈청 내에서 분해와 제거로부터 보호하고, 전신 전달에 적합하고, 그리고 캡슐화된 핵산의 세포내 전달을 제공할 것이다. 이에 더하여, 이들 지질-핵산 입자는 충분히 내약성이고, 그리고 효과량의 핵산에서 환자 치료가 환자에 대한 현저한 독성 및/또는 위험과 연관되지 않도록 적절한 치료적 지수 (therapeutic index)를 제공해야 한다. 본 발명에서는 이런 조성물, 이들 조성물을 만드는 방법, 그리고 질환 치료의 목적으로 핵산을 세포내로 도입하기 위하여 이들 조성물을 이용하는 방법을 제시한다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 신규한 양이온성 지질, 그리고 이들을 포함하는 지질 입자를 제시한다. 이들 지질 입자는 활성제를 더욱 포함하고, 그리고 활성제를 세포에 전달하기 위하여 본 발명의 관련된 방법에 따라서 이용될 수 있다.
본 발명의 지질은 하나 또는 그 이상의 이성질체 형태를 포함할 수 있다. 이들 화합물의 모든 이런 이성질체 형태는 본 발명에 명백하게 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한, 결합 회전 (bond rotation)을 제한할 수 있는 연쇄 (가령, 탄소-탄소 결합) 또는 치환기, 예를 들면, 이중 결합의 존재에 기인한 제한을 보유할 수 있다. 따라서 모든 cis/trans 및 EfZ 이성질체는 본 발명에 명백하게 포함된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 화학식 I의 양이온성 지질을 포함하는 향상된 지질 제제를 제시하고, 여기서 화학식 I은 아래와 같다:
[화학식 I]
Figure 112021005370664-pat00001
화학식 I은 또한, DLin-M-C3-DMA, MC3 또는 M-C3으로 지칭될 수 있다. 화학식 I, DLin-M-C3-DMA, MC3 및 M-C3은 각각, 상기에 제시된 바와 같은 화학식을 갖는다.
지질 제제는 전형적으로, 중성 지질, 스테롤 및 PEG 또는 PEG-변형된 지질 역시 포함한다.
한 측면에서, 향상된 지질 제제는 또한, 표적화 지질 (가령, GalNAc 및/또는 폴산염 함유 지질)을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 사출 성형 (extrusion) 또는 인-라인 혼합 (in-line mixing) 방법에 의한 향상된 지질 제제의 제조를 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 RNA-기초된 구조체를 포함하는 향상된 지질 제제를 동물에 투여하고, 그리고 표적 유전자의 발현을 평가하는 방법을 더욱 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서 특징되는 지질 제제, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 이중 가닥 RNA (dsRNA)와 복합된 지질 제제는 생체내에서 또는 시험관내에서 종양 세포에서 표적 유전자 발현을 변경하는데 (가령, 감소시키는데) 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 특징되는 지질 제제는 HeLa, HCT116, A375, MCF7, B16F10, Hep3b, HUH7, HepG2, Skov3, U87, 그리고 PC3 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 종양 세포주에서 표적 유전자 발현을 변경하는데 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 본 발명의 지질을 포함하는 지질 입자를 제시한다. 일정한 구체예에서, 지질 입자는 중성 지질 및 입자 집합을 감소시킬 수 있는 지질을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 지질 입자는 대략 20-60% 양이온성 지질: 5-25% 중성 지질: 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰 비율로, (i) 본 발명의 적어도 하나의 지질; (ii) DSPC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM에서 선택되는 중성 지질; (iii) 스테롤, 예를 들면, 콜레스테롤; 그리고 (iv) peg-지질, 예를 들면, PEG-DMG 또는 PEG-cDMA로 본질적으로 구성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 지질은 광학적으로 순수하다.
추가의 관련된 구체예에서, 본 발명에서는 치료제를 더욱 포함하는 본 발명의 지질 입자를 제시한다. 한 구체예에서, 치료제는 핵산이다. 한 구체예에서, 핵산은 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안타고머; 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, siRNA; 압타머 또는 리보자임이다.
또 다른 관련된 구체예에서, 본 발명에서는 본 발명의 지질 입자 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다.
게다가, 본 발명에서는 다른 관련된 구체예에서, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 지질 입자 또는 제약학적 조성물을 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 표적 유전자는 야생형 유전자일 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 유전자는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 보유한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 보유하는 표적 유전자의 발현을 특이적으로 조정하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 지질 입자는 면역자극 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안타고머; 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, siRNA, 압타머, 리보자임에서 선택되는 치료제를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 리보자임을 인코딩하는 플라스미드이다.
본 발명의 한 측면에서, 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, SORT1 유전자, XBP1 유전자, 종양 억제자 유전자에서 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 핵산은 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드이고, 따라서 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편의 발현이 증가된다.
또 다른 관련된 구체예에서, 본 발명에서는 개체 내에서 폴리펩티드의 과다발현으로 특징되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 지질 입자 또는 제약학적 조성물을 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 siRNA, microRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 siRNA, microRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드에서 선택되고, 그리고 여기서 상기 siRNA, microRNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함한다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명에서는 개체 내에서 폴리펩티드의 과소발현으로 특징되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드이다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 개체 내에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 상기 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 면역자극 올리고뉴클레오티드이다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 백신 또는 항원과 공동으로 환자에 제공된다.
관련된 구체예에서, 본 발명에서는 본 발명의 지질 입자 및 질환 또는 병원체와 연관된 항원을 포함하는 백신을 제시한다. 한 구체예에서, 지질 입자는 면역자극 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 항원은 종양 항원이다. 다른 구체예에서, 항원은 바이러스 항원, 세균 항원, 또는 기생충 항원이다.
본 발명에서 또한, 본 발명의 지질 입자 및 제약학적 조성물을 제조하는 방법, 그리고 이들 지질 입자 및 제약학적 조성물의 제조에서 유용한 키트를 제시한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 작용제, 예를 들면, 치료제 또는 진단제, 그리고 본 발명의 지질을 포함하는 조성물을 평가하는 방법을 제시한다.
상세한 설명
예로써, 작용제, 예를 들면, 핵산-기초된 작용제, 예를 들면, RNA-기초된 구조체를 세포 또는 개체에 전달하는데 이용될 수 있는 향상된 지질 제제가 본 명세서에서 기술된다. 또한, RNA-기초된 구조체를 포함하는 향상된 지질 제제를 동물에 투여하고, 그리고 일부 구체예에서, 표적 유전자의 발현을 평가하는 방법이 본 명세서에서 기술된다. 일부 구체예에서, 향상된 지질 제제는 표적화 지질 (가령, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질, 예를 들면, GalNAc 또는 폴산염 함유 지질)을 포함한다.
지질
본 발명에서는 화학식 I의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤 및 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함하는 향상된 지질 제제를 제시하고 , 여기서 화학식 I은
Figure 112021005370664-pat00002
이다.
한 구체예에서, 지질은 라세미 혼합물이다.
한 구체예에서, 지질은 한쪽 부분입체이성질체가 풍부하다, 예를 들면, 지질은 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 80% 또는 적어도 70% 부분입체이성질체 과잉 (diastereomeric excess)을 갖는다.
한 구체예에서, 지질은 키랄에서 순수하다, 예를 들면, 단일 이성질체이다.
한 구체예에서, 지질은 한쪽 이성질체가 풍부하다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 포집 (entrapment)된다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 25% 내지 대략 75%, 예를 들면, 몰 기초에서, 대략 35 내지 대략 65%, 대략 45 내지 대략 65%, 대략 60%, 대략 57.5%, 대략 50% 또는 대략 40%의 화학식 I의 양이온성 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 0.5% 내지 대략 15%, 예를 들면, 몰 기초에서, 대략 3 내지 대략 12%, 대략 5 내지 대략 10% 또는 대략 15%, 대략 10%, 또는 대략 7.5%의 중성 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 5% 내지 대략 50%, 예를 들면, 몰 기초에서, 대략 15 내지 대략 45%, 대략 20 내지 대략 40%, 대략 40%, 대략 38.5%, 대략 35%, 또는 대략 31%의 스테롤을 포함한다. 한 구체예에서, 스테롤은 콜레스테롤이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 0.5% 내지 대략 20%, 예를 들면, 몰 기초에서, 대략 0.5 내지 대략 10%, 대략 0.5 내지 대략 5%, 대략 1.5%, 대략 0.5%, 대략 1.5%, 대략 3.5%, 또는 대략 5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 25-75%의 화학식 I의 양이온성 지질, 0.5-15%의 중성 지질, 5-50%의 스테롤, 그리고 0.5-20%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 35-65%의 화학식 I의 양이온성 지질, 3-12%의 중성 지질, 15-45%의 스테롤, 그리고 0.5-10%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 45-65%의 화학식 I의 양이온성 지질, 5-10%의 중성 지질, 25-40%의 스테롤, 그리고 0.5-10%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 60%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 7.5%의 중성 지질, 대략 31%의 스테롤, 그리고 대략 1.5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 그리고 PEG 지질은 PEG-DMG (일명, PEG-C14 또는 C14-PEG)이다. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 2,000 Da의 평균 분자량의 PEG 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 2,000 Da 이하, 예를 들면, 대략 1,500 Da, 대략 1,000 Da, 또는 대략 500 Da의 평균 분자량의 PEG 분자를 포함한다. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 2,000 Da의 평균 분자량의 PEG 분자를 포함하는 아래의 화학식 VI의 화합물이다:
Figure 112021005370664-pat00003
. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 PEG-디스테아로일 글리세롤 (PEG-DSG, 일명 PEG-C18 또는 C18-PEG)이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 50%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 10%의 중성 지질, 대략 38.5%의 스테롤, 그리고 대략 1.5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 그리고 PEG 지질은 PEG-DMG (일명, PEG-C14 또는 C14-PEG)이다. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 PEG-디스티릴 글리세롤 (PEG-DSG, 일명 PEG-C18 또는 C18-PEG)이다. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 PEG-DPG (PEG-디팔미토일글리세롤)이다. 한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 2,000 Da의 평균 분자량의 PEG 분자를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 50%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 10%의 중성 지질, 대략 35%의 스테롤, 대략 4.5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질, 그리고 대략 0.5%의 표적화 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 PEG-디스테아로일 글리세롤 (PEG-DSG, 일명 PEG-C18 또는 C18-PEG)이고, 그리고 표적화 지질은 GalNAc3-PEG-DSG이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 50%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 10%의 중성 지질, 대략 35%의 스테롤, 대략 4.5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질, 그리고 대략 0.5%의 표적화 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 PEG-DMG (일명, PEG-C14 또는 C14-PEG)이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 40%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 15%의 중성 지질, 대략 40%의 스테롤, 그리고 대략 5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 PEG-DMG (일명, PEG-C14 또는 C14-PEG)이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 50%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 10%의 중성 지질, 대략 35%의 스테롤, 그리고 대략 5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 PEG-DMG (일명, PEG-C14 또는 C14-PEG)이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 57.2%의 화학식 I의 양이온성 지질, 대략 7.1%의 중성 지질, 대략 34.3%의 스테롤, 그리고 대략 1.4%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DPPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 PEG-cDMA이다 (PEG-cDMA는 Heyes et al., J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)에서 더욱 상세하게 논의된다).
한 구체예에서, PEG 또는 PEG 변형된 지질은 화학식 VI의 화합물 또는 PEG-DSG이고, 여기서 PEG 분자는 2,000 Da의 평균 분자량을 갖는다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 몰 기초에서, 대략 57.5%의 화학식 (I)의 양이온성 지질, 대략 7.5%의 중성 지질, 대략 31.5%의 스테롤, 그리고 대략 3.5%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의 화합물이고, 중성 지질은 DSPC이고, 스테롤은 콜레스테롤이고, 그리고 PEG 지질은 PEG-DMG이다.
한 구체예에서, 지질:siRNA의 비율은 적어도 대략 0.5:1, 적어도 대략 1:1, 적어도 대략 2:1, 적어도 대략 3:1, 적어도 대략 4:1, 적어도 대략 5:1, 적어도 대략 6:1, 적어도 대략 7:1, 적어도 대략 8:1, 적어도 대략 10:1, 적어도 대략 11:1, 적어도 12:1, 또는 적어도 대략 15:1이다. 한 구체예에서, 지질:siRNA의 비율은 대략 1:1 내지 대략 20:1, 대략 3:1 내지 대략 15:1, 대략 4:1 내지 대략 15:1, 대략 5:1 내지 대략 13:1이다. 한 구체예에서, 지질:siRNA의 비율은 대략 0.5:1 내지 대략 15:1이다.
한 측면에서, 본 발명의 향상된 지질 제제는 또한, 표적화 지질 (targeting lipid)을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 GalNAc 모이어티 (즉, N-갈락토사민 모이어티)를 보유한다. 가령, GalNAc 모이어티를 보유하는 표적화 지질에는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 2008년 12월 4일 제출된 USSN 12/328,669에서 개시된 것들이 포함될 수 있다. 표적화 지질에는 당분야에 공지된 임의의 다른 지질 (가령, 표적화 지질), 예를 들면, USSN 12/328,669 또는 International Publication No. WO 2008/042973에서 기술된 것들 역시 포함될 수 있고, 이들 각각의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 복수의 GalNAc 모이어티, 예를 들면, 2개 또는 3개의 GalNAc 모이어티를 보유한다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 복수의, 예를 들면, 2개 또는 3개의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티를 보유한다. 일부 구체예에서, 표적화 지질 내에서 지질은 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세리드 (즉, DSG)이다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 PEG 모이어티 (가령, 적어도 대략 500 Da, 예를 들면, 대략 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da 또는 그 이상의 분자량을 갖는 PEG 모이어티)를 보유한다, 가령, 표적화 모이어티는 PEG 모이어티에 의해 지질에 연결된다.
일부 구체예에서, 표적화 지질은 폴산염 (folate) 모이어티를 보유한다. 가령, 폴산염 모이어티를 보유하는 표적화 지질에는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 2008년 12월 4일 제출된 USSN 12/328,669에서 개시된 것들이 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴산염 모이어티를 보유하는 표적화 지질에는 화학식 V의 화합물이 포함될 수 있다.
예시적인 표적화 지질은 하기 화학식 L로 표시된다:
[화학식 L]
(표적화 기)n-L-지질, 여기서
표적화 기는 당업자에게 공지된 및/또는 본 명세서에서 기술된 임의의 표적화 기 (가령, 세포 표면 수용체 (cell surface receptor))이고;
n은 1 내지 5의 정수 (가령, 3)이고;
L은 연결 기(linking group)이고; 그리고
지질은 본 명세서에서 기술된 지질 (가령, 중성 지질, 예를 들면, DSG)과 같은 지질이다.
일부 구체예에서, 연결 기는 PEG 모이어티를 보유한다.
일부 구체예에서, 표적화 지질은 하기에 제공된 바와 같은 화합물 2, 3, 4 또는 5의 화합물이다:
[화학식 II]
GalNAc3-DSG
Figure 112021005370664-pat00004
JN-424-24
[화학식 III]
GalNAc3-PEG-DSG
Figure 112021005370664-pat00005
JN-469-36
[화학식 IV]
(GalNAc) 3 -PEG-LCO
Figure 112021005370664-pat00006
[화학식 V]
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴산염(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염)
폴산염-PEG-DSPE
Figure 112021005370664-pat00007
[화학식 VI]
폴산염-PEG2000-DSG
Figure 112021005370664-pat00008
[화학식 VII]
폴산염-PEG3400-DSG
Figure 112021005370664-pat00009
일부 구체예에서, 표적화 지질은 제제 내에서, 몰 기초 (molar basis)에서 대략 0.001% 내지 대략 5% (가령, 대략 0.005%, 0.15%, 0.3%, 0.5%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 또는 5%)의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 제제 내에서, 대략 0.005% 내지 대략 1.5%의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 본 명세서에서 기술된 제제 내에 포함된다.
일부 구체예에서, 지질 제제는 또한, 항산화제 (가령, 라디칼 소거제)를 포함한다. 항산화제는 지질 내에서, 예로써 대략 0.01% 내지 대략 5%의 양으로 존재할 수 있다. 항산화제는 소수성 또는 친수성 (가령, 지질에 용해성, 또는 물에 용해성)일 수 있다. 일부 구체예에서, 항산화제는 페놀성 화합물, 예를 들면, 부틸히드록시톨루엔, 레스베라트롤 (resveratrol), 조효소 Q1O, 또는 기타 플라보노이드 (flavonoid), 또는 비타민, 예를 들면, 비타민 E 또는 비타민 C이다. 다른 예시적인 항산화제에는 리포산 (lipoic acid), 요산 (uric acid), 카로틴 (carotene), 예를 들면, 베타-카로틴 (beta-carotene) 또는 레티놀 (retinol) (비타민 A), 글루타티온 (glutathione), 멜라토닌 (melatonin), 셀레늄 (selenium), 그리고 유비퀴놀 (ubiquinol)이 포함된다.
일부 구체예에서, 표적화 지질 (가령, GalNAc 보유 지질)에 대한 수용체는 아시알로 당단백질 수용체 (즉, ASGPR)이다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 사출 성형 방법 또는 인-라인 혼합 방법에 의해 생산된다.
사출 성형 방법 (또한, 미리 수행된 방법 또는 배치 (batch) 과정으로 지칭됨)은 빈 리포좀 (즉, 핵산 없음)이 먼저 제조되고, 그 이후에 빈 리포좀에 핵산이 추가되는 방법이다. 작은-구멍 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 리포좀 조성물의 사출 성형은 상대적으로 잘 정의된 크기 분포 (size distribution)를 발생시킨다. 전형적으로, 현탁액은 원하는 리포좀 복합체 크기 분포가 달성될 때까지, 1회 또는 그 이상, 막을 통하여 순환된다. 이들 리포좀은 리포좀 크기에서 점진적인 감소를 달성하기 위하여, 연속되는 더욱 작은-구멍 막을 통하여 사출 성형될 수 있다. 일부 경우에, 형성되는 지질-핵산 조성물은 임의의 사이징 (sizing) 없이 이용될 수 있다. 이들 방법은 US 5,008,050; US 4,927,637; US 4,737,323; Biochim Biophys Acta. 1979 Oct 19;557(1):9-23; Biochim Biophys Acta. 1980 Oct 2;601(3):559-7; Biochim Biophys Acta. 1986 Jun 13;858(1):161-8; 그리고 Biochim. Biophys. Acta 1985 812, 55-65에서 개시되고, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
인-라인 혼합 방법은 지질과 핵산 둘 모두 혼합 챔버 (mixing chamber) 내로 병렬로 추가되는 방법이다. 혼합 챔버는 단순한 T-연결관 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 혼합 챔버일 수 있다. 이들 방법은 US patent no. 6,534,018과 US 6,855,277; US publication 2007/0042031, 그리고 Pharmaceuticals Research, Vol. 22, No. 3, Mar. 2005, p. 362-372에서 개시되고, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
게다가, 본 발명의 제제는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로 이해된다.
진전된 구체예에서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 대표적인 제제는 표 1에서 서술된다.
[표 1]
Figure 112021005370664-pat00010
한 구체예에서, 화학식 I의 화합물을 포함하는 특정한 제제는 아래와 같이 기술된다:
지질의 비율 (몰 백분율)
지질:siRNA 비율
50/10/38.5/1.5 (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA ~ 11
40/15/40/5 (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/35/4.5/0.5% (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG (C18-PEG): GalNAc3-PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/30/9.5/0.5% (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG: GalNAc3-PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/35/5% (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/38.5/1.5 (MC3 : DPPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA ~ 11
40/15/40/5 (MC3 : DPPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/35/4.5/0.5% (MC3 : DPPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG: GalNAc3-PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/30/9.5/0.5% (MC3 : DPPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG: GalNAc3-PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/35/5% (MC3 : DPPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG)
지질:siRNA 비율 ~ 11
50/10/38.5/1.5 (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA ~ 7
50/10/38.5/1.5 (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DSG)
지질:siRNA ~ 10
50/10/38.5/1.5 (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA ~ 12
50/10/35/5% (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA 비율 ~ 8
50/10/35/5% (MC3 : DSPC : 콜레스테롤 : PEG-DMG)
지질:siRNA 비율 ~ 10
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 포집 (entrappment)된다.
한 구체예에서, 본 발명의 제제는 아포지단백 (apolipoprotein)을 더욱 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "아포지단백" 또는 "지단백"은 당업자에게 공지된 아포지단백 및 이들의 변이체와 단편, 그리고 하기에 기술된 이들의 아포지단백 작동약 (agonist), 유사체 또는 단편을 지칭한다.
적절한 아포지단백에는 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V 및 ApoE, 그리고 이들의 활성 다형성 형태 (동질이상 형태), 동종형 (isoform), 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 절두된 형태가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일정한 구체예에서, 아포지단백은 티올 보유 아포지단백이다. "티올 보유 아포지단백"은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 보유하는 아포지단백, 변이체, 단편 또는 동종형을 지칭한다. 가장 일반적인 티올 보유 아포지단백은 하나의 시스테인 잔기를 보유하는 ApoA-I Milano (APOA-IM) 및 ApoA-I Paris (ApoA-Ip)이다 (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). ApoA-II, ApoE2 및 ApoE3 역시 티올 보유 아포지단백이다. 분리된 ApoE 및/또는 재조합 방식으로 생산된 형태를 비롯한 이의 활성 단편과 폴리펩티드 유사체는 U.S. Pat. No. 5,672,685; 5,525,472; 5,473,039; 5,182,364; 5,177,189; 5,168,045; 5,116,739에서 기술되고, 이들의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다. ApoE3은 Weisgraber, et al., "Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms," J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; 그리고 Rail, et al., "Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects," Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700에서 개시된다. 또한, GenBank 수탁 번호 K00396을 참조한다.
일정한 구체예에서, 아포지단백은 성숙 형태, 프레프로아포지단백 (preproapolipoprotein) 형태 또는 프로아포지단백 형태일 수 있다. 프로-와 성숙 ApoA-I의 동종-과 이종이합체 (가능한 경우에) (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29), ApoA-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)1679-87; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35), ApoA-I Paris (Daum et al., 1999, J. MoI. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), ApoA-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83), 그리고 ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000) 역시 본 발명의 범위 내에서 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 아포지단백은 아포지단백의 단편, 변이체 또는 동종형일 수 있다. 용어 "단편"은 고유 아포지단백의 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열을 갖는 임의의 아포지단백을 지칭하고, 그리고 이들 단편은 지질 결합 특성을 비롯한 고유 아포지단백의 활성을 유지한다. "변이체"는 아포지단백의 아미노산 서열에서 치환 또는 변경을 의미하고, 이들 치환 또는 변경, 예를 들면, 아미노산 잔기의 부가와 결실은 지질 결합 특성을 비롯한 고유 아포지단백의 활성을 파괴하지 않는다. 따라서 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산으로 보존성 치환되는, 본 명세서에서 제시된 고유 아포지단백에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 보존성 치환의 실례에는 다른 소수성 잔기에 대한 적어도 하나의 소수성 잔기, 예를 들면, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 치환이 포함된다. 유사하게, 본 발명에서는 예로써, 적어도 하나의 친수성 잔기의 치환, 예를 들면, 아르기닌과 리신 사이에 치환, 글루타민과 아스파라긴 사이에 치환, 그리고 글리신과 세린 사이에 치환을 계획한다 (참조: U.S. Pat. No. 6,004,925, 6,037,323과 6,046,166). 용어 "동종형"은 동일한, 더욱 큰 또는 부분적인 기능 및 유사한, 동일한 또는 부분적인 서열을 갖는 단백질을 지칭하고, 그리고 동일한 유전자의 산물이거나 아닐 수 있고 통상적으로 조직 특이적이다 (참조: Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8): 1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9): 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10): 1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4) :2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3):181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23): 14888-93, 그리고 U.S. Pat. No. 6,372,886).
일정한 구체예에서, 본 발명의 방법과 조성물은 아포지단백의 키메라 구조의 이용을 포함한다. 가령, 아포지단백의 키메라 구조는 허혈 재관류 보호 특성을 갖는 아포지단백 도메인과 연관된 높은 지질 결합 능력을 갖는 아포지단백 도메인으로 구성될 수 있다. 아포지단백의 키메라 구조는 아포지단백 내에 별개의 영역을 포함하는 구조 (즉, 상동성 구조)이거나, 또는 키메라 구조는 상이한 아포지단백 사이에 별개의 영역을 포함하는 구조 (즉, 이종기원성 구조)일 수 있다. 키메라 구조를 포함하는 조성물은 아포지단백 변이체인 분절 (segment), 또는 특정한 특성 (가령, 지질 결합, 수용체 결합, 효소, 효소 활성화, 항산화제 또는 환원-산화 특성)을 갖도록 설계된 분절 역시 포함할 수 있다 (참조: Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8): 1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9): 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(9) :2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vase. Biol. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23): 150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84).
본 발명에 이용된 아포지단백에는 재조합, 합성, 반-합성 또는 정제된 아포지단백 역시 포함된다. 본 발명에서 이용되는 아포지단백 또는 이들의 등가물을 획득하는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 가령, 아포지단백은 예로써, 밀도 구배 원심분리 (density gradient centrifugation) 또는 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)에 의해 혈장 또는 자연 산물로부터 분리되거나, 또는 합성적으로, 반-합성적으로 또는 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산될 수 있다 (참조: Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711 :97-109; U.S. Pat. No. 5,059,528, 5,834,596, 5,876,968과 5,721,114; 그리고 PCT Publication WO 86/04920과 WO 87/02062).
본 발명에 이용되는 아포지단백에는 아포지단백 작동약, 예를 들면, ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-IM), ApoA-I Paris (ApoA-IP), ApoA-II, ApoA-IV, 그리고 ApoE의 활성을 모방하는 펩티드와 펩티드 유사체가 더욱 포함된다. 가령, 아포지단백은 U.S. Pat. No. 6,004,925, 6,037,323, 6,046,166, 그리고 5,840,688에서 기술된 것들 중에서 한 가지일 수 있고, 이들의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
아포지단백 작동약 펩티드 또는 펩티드 유사체는 예로써, U.S. Pat. No. 6,004,925, 6,037,323과 6,046,166에서 기술된 기술을 비롯한 당분야에 공지된 펩티드 합성을 위한 임의의 기술을 이용하여 합성되거나 제조될 수 있다. 가령, 이들 펩티드는 Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)에 의해 최초로 보고된 고형-상 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다른 펩티드 합성 기술은 Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) 및 당업자에게 쉽게 가용한 다른 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 폴리펩티드 합성 기술의 요약은 Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, 111., (1984)에서 찾아볼 수 있다. 펩티드는 또한, The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N. Y. (1976)에서 기술된 바와 같은 용액 방법에 의해 합성될 수도 있다. 상이한 펩티드 합성에서 이용을 위한 적합한 보호 기 (protective group)는 앞서 언급된 문서에서뿐만 아니라 McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N. Y. (1973)에서 기술된다. 본 발명의 펩티드는 또한, 예로써 아포지단백 A-I의 더욱 큰 부분으로부터 화학적 또는 효소적 절단에 의해 제조될 수도 있다.
일정한 구체예에서, 아포지단백은 아포지단백의 혼합물일 수 있다. 한 구체예에서, 아포지단백은 아포지단백의 동종성 혼합물, 다시 말하면, 단일 유형의 아포지단백일 수 있다. 다른 구체예에서, 아포지단백은 아포지단백의 이종성 혼합물, 다시 말하면, 2개 또는 그 이상의 상이한 아포지단백의 혼합물일 수 있다. 아포지단백의 이종성 혼합물의 구체예는 예로써, 동물 공급원으로부터 아포지단백 및 반-합성 공급원으로부터 아포지단백의 혼합물을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이종성 혼합물은 예로써, ApoA-I 및 ApoA-I Milano의 혼합물을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이종성 혼합물은 예로써, ApoA-I Milano 및 ApoA-I Paris의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법과 조성물에 이용하기 적합한 혼합물은 당업자에게 명백할 것이다.
아포지단백이 자연 공급원으로부터 획득되면, 이는 식물 또는 동물 공급원으로부터 획득될 수 있다. 아포지단백이 동물 공급원으로부터 획득되면, 아포지단백은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아포지단백은 동물 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, 아포지단백은 인간 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 아포지단백은 이러한 아포지단백이 투여되는 개체와 동일한 종으로부터 유래된다.
한 구체예에서, 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자에서 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 표적 유전자는 간에서 발현되는 유전자, 예를 들면, VII 인자 (FVII) 유전자이다. 표적 유전자, 예를 들면, FVII의 발현의 효과는 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈청 또는 조직 샘플에서 FVII 수준을 측정함으로써 평가된다. 가령, 혈액 내에서 예로써, FVII 활성의 분석평가에 의해 측정된 바와 같은 FVII의 수준이 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 간에서 mRNA의 수준이 평가될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 적어도 2가지 유형의 평가가 수행된다, 가령 단백질 수준의 평가 (가령, 혈액 내에서), 그리고 mRNA 수준의 측정 (가령, 간 내에서) 둘 모두가 수행된다.
한 구체예에서, 작용제는 핵산, 예를 들면, 이중-가닥 RNA (dsRNA)이다.
다른 구체예에서, 핵산 작용제는 단일-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드이다. 가령, 이중-가닥 DNA는 구조 유전자 (structural gene), 제어와 종결 영역을 포함하는 유전자, 또는 자기-복제 시스템, 예를 들면, 바이러스 또는 플라스미드 DNA일 수 있다. 이중-가닥 RNA는 예로써, dsRNA 또는 기타 RNA 간섭 시약 (interference reagent)일 수 있다. 단일-가닥 핵산은 예로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 또는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 후보 작용제의 투여후 다양한 시점에서, 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액, 혈장, 또는 혈청과 같은 유체 샘플, 또는 조직 샘플, 예를 들면, 간 샘플은 검사 개체로부터 채취되고, 그리고 표적 단백질 또는 mRNA 발현 수준에 대한 상기 작용제의 효과에 대하여 조사된다. 특히 바람직한 구체예에서, 후보 작용제는 FVII를 표적으로 하는 dsRNA이고, 그리고 생물학적 샘플은 VII 인자 단백질 또는 mRNA 수준에 대한 효과에 대하여 조사된다. 한 구체예에서, FVII 단백질의 혈장 수준은 예로써, 면역조직화학 (immunohistochemistry) 분석평가 또는 색원체 (chromogenic) 분석평가를 이용함으로써 평가된다. 다른 구체예에서, 간 내에서 FVII mRNA의 수준은 임의의 분석평가, 예를 들면, 가지화 DNA 분석평가, 또는 노던 블롯 (Northern blot) 또는 RT-PCR 분석평가에 의해 조사된다.
한 구체예에서, 작용제, 예를 들면, 향상된 지질 제제를 포함하는 조성물은 독성에 대하여 평가된다. 또 다른 구체예에서, 모형 개체는 예로써, 체중 또는 케이지안 행동 (cageside behavior)에서 변화에 의해 신체 효과에 대하여 모니터링될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 작용제, 예를 들면, 향상된 지질 제제를 포함하는 조성물을 추가의 평가에 종속시키는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 평가에는 예로써, (i) 앞서 기술된 평가의 반복, (ii) 상이한 숫자의 동물 또는 상이한 용량으로 앞서 기술된 평가의 반복, 또는 (iii) 상이한 방법, 예를 들면, 다른 동물 모형, 예를 들면, 비-인간 영장류에서 평가가 포함될 수 있다.
다른 구체예에서, 간 단백질 또는 mRNA 수준에 대한 후보 작용제의 관찰된 효과에 따라서, 추가의 연구, 예를 들면, 임상 연구에 상기 작용제 및 향상된 지질 제제를 포함할 지 안할 지의 여부에 관한 결정이 이루어진다. 가령, 후보 dsRNA가 단백질 또는 mRNA 수준을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 감소시키는 것으로 관찰되면, 상기 작용제는 임상 시험에 고려될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 간 단백질 또는 mRNA 수준에 대한 후보 작용제 및 아미노 지질의 관찰된 효과에 따라서, 제약학적 조성물 내에 상기 작용제 및 향상된 지질 제제를 포함할 지 안할 지의 여부에 관한 결정이 이루어진다. 가령, 후보 dsRNA가 단백질 또는 mRNA 수준을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 감소시키는 것으로 관찰되면, 상기 작용제는 임상 시험에 고려될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료제를 세포에 전달하기 위한 적합성 (suitability)에 대하여 향상된 지질 제제를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 RNA-기초된 구조체, 예를 들면, FVII를 표적으로 하는 dsRNA를 전달하기 위한 적합성 (suitability)에 대하여 향상된 지질 제제를 평가하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 FVII를 표적으로 하는 dsRNA 및 후보 아미노 지질을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물을 설치류, 예를 들면, 생쥐에 투여하고, 혈액 내에서 FVII의 수준 또는 간 내에서 FVII mRNA의 수준 중에서 적어도 하나의 함수 (function)로서 FVII의 발현을 평가하여 후보 아미노 지질을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 표적 유전자의 발현을 미리 선택된 기준 값과 비교하는 단계를 더욱 포함한다.
조성물은 지질 포함 성분, 예를 들면, 리포좀을 포함하고, 그리고 이들은 하기에 더욱 상세하게 기술된다. 예시적인 핵산-기초된 작용제에는 dsRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 또는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 이들 작용제 역시 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
"알킬"은 1개 내지 24개의 탄소 원자를 보유하는 직쇄 또는 분지쇄, 비환형 또는 환형, 포화된 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화된 직쇄 알킬에는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등이 포함된다; 반면, 포화된 분지쇄 알킬에는 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등이 포함된다. 대표적인 포화된 환형 알킬에는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함된다; 반면, 불포화된 환형 알킬에는 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등이 포함된다.
"알케닐"은 인접한 탄소 원자 간에 적어도 하나의 이중 결합을 보유하는, 앞서 정의된 바와 같은 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 (cis)와 트랜스 (trans) 이성질체를 모두 포함한다. 대표적인 직쇄와 분지쇄 알케닐에는 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등이 포함된다.
"알키닐"은 인접한 탄소 간에 적어도 하나의 삼중 결합을 부가적으로 보유하는, 앞서 정의된 바와 같은 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적인 직쇄와 분지쇄 알키닐에는 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등이 포함된다.
"아실"은 부착 지점 (point of attachment)에서 탄소가 하기에 정의된 바와 같은 옥소 (oxo) 기로 치환되는 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 의미한다. 가령, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 그리고 -C(=O)알키닐은 아실 기이다.
용어 "아릴"은 방향족 단일환형, 이중환형, 또는 삼중환형 탄화수소 고리 시스템을 지칭하고, 여기서 임의의 고리 원자가 치환될 수 있다. 아릴 모이어티의 실례에는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 그리고 피레닐이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
"헤테로환"은 포화되거나, 불포화되거나, 또는 방향족이고, 그리고 질소, 산소 및 황에서 독립적으로 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자를 보유하고, 그리고 여기서 질소와 황 헤테로원자는 선택적으로 산화 (oxidation)될 수 있고, 그리고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화 (quaternization)될 수 있는 5- 내지 7-원 단일환형, 또는 7- 내지 10-원 이중환형, 헤테로환형 고리를 의미하고, 상기 헤테로환 중에서 임의의 하나는 벤젠 고리에 융합되는 이중환형 고리를 포함한다. 헤테로환은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에 의해 부착될 수 있다. 헤테로환에는 하기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴이 포함된다. 헤테로환에는 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐 등이 포함된다.
용어 "선택적으로 치환된 알킬", "선택적으로 치환된 알케닐", "선택적으로 치환된 알키닐", "선택적으로 치환된 아실", 그리고 "선택적으로 치환된 헤테로환"은 치환될 때, 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 대체된다는 것을 의미한다. 옥소 치환기 (=0)의 경우에, 2개의 수소 원자가 대체된다. 이와 관련하여, 치환기에는 옥소, 할로겐, 헤테로환, -CN, -ORX, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)RX, -C(=O)ORX, -C(=0)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy이 포함되고, 여기서 n은 0, 1 또는 2이고, Rx와 Ry는 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로환이고, 그리고 상기 알킬 및 헤테로환 치환기 각각은 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORX, 헤테로환, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry -NRxSO2Ry, -C(=O)RX, -C(=O)ORX, -C(=0)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중에서 하나 또는 그 이상으로 더욱 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 방향족 5-8-원 단일환형, 8-12-원 이중환형, 또는 단일환형의 경우에 1-3개 헤테로원자, 이중환형의 경우에 1-6개 헤테로원자, 또는 삼중환형의 경우에 1-9개 헤테로원자를 보유하는 11-14-원 삼중환형 고리 시스템을 지칭하고, 상기 헤테로원자는 O, N, 또는 S에서 선택되고 (가령, 단일환형, 이중환형, 또는 삼중환형의 경우에, 각각 탄소 원자 및 N, O, 또는 S의 1-3개, 1-6개, 또는 1-9개 헤테로원자), 여기서 임의의 고리 원자가 치환될 수 있다. 본 명세서에서 헤테로아릴 기는 또한, 공통의 탄소-탄소 결합을 공유하는 융합된 고리를 보유할 수도 있다. 용어 "알킬헤테로환"은 고리 원자 중에서 적어도 하나가 알킬, 알케닐 또는 알키닐로 치환되는 헤테로아릴을 지칭한다.
용어 "치환된"은 소정의 구조 내에서, 할로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로시클릴, 티올, 알킬티오, 옥소, 티옥시, 아릴티오, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬설포닐, 알킬설포닐알킬, 아릴설포닐알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아르알콕시, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아릴아미노카르보닐, 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 할로알킬, 아미노, 트리플루오르메틸, 시아노, 니트로, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아미노알킬아미노, 히드록시, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노카르보닐알킬, 아실, 아르알콕시카르보닐, 카르복실산, 설폰산, 설포닐, 포스폰산, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로환형, 그리고 지방족이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 특정된 치환기의 라디칼로 하나 또는 그 이상의 수소 라디칼의 대체를 지칭한다. 치환기는 더욱 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
"할로겐"은 플루오르, 클로로, 브로모 및 요오드를 의미한다.
용어 "알킬아민" 및 "디알킬아민"은 각각, -NH(알킬) 및 -N(알킬)2 라디칼을 지칭한다.
용어 "알킬포스페이트"는 -0-P(Q')(Q")-0-R을 지칭하고, 여기서 Q'와 Q"는 각각 독립적으로, 0, S, N(R)2, 선택적으로 치환된 알킬 또는 알콕시이고; 그리고 R은 선택적으로 치환된 알킬, ω-아미노알킬 또는 ω-(치환된)아미노알킬이다.
용어 "알킬포스포로티오에이트"는 Q' 또는 Q" 중에서 적어도 하나가 S인 알킬포스페이트를 지칭한다.
용어 "알킬포스포네이트"는 Q' 또는 Q" 중에서 적어도 하나가 알킬인 알킬포스페이트를 지칭한다.
용어 "히드록시알킬"은 -O-알킬 라디칼을 의미한다.
용어 "알킬헤테로환"은 적어도 하나의 메틸렌이 헤테로환으로 대체되는 알킬을 지칭한다.
용어 "ω-아미노알킬"은 -알킬-NH2 라디칼을 지칭한다. 그리고, 용어 "ω-(치환된)아미노알킬"은 N 상에서 적어도 하나의 H가 알킬로 대체되는 ω-아미노알킬을 지칭한다.
용어 "ω-포스포알킬"은 -알킬-O-P(Q')(Q")-O-R을 지칭하고, 여기서 Q'와 Q"는 각각 독립적으로 O 또는 S이고, 그리고 R은 선택적으로 치환된 알킬이다.
용어 "ω-티오포스포알킬"은 Q' 또는 Q" 중에서 적어도 하나가 S인 ω-포스포알킬을 지칭한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 보호기의 이용을 필요로 할 수도 있다. 보호기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T. W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). 간단히 말하면, 본 발명의 맥락에서 보호기는 기능기의 바람직하지 않은 반응성을 감소시키거나 배제시키는 임의의 기이다. 보호기는 일정한 반응 동안 기능기의 반응성을 감추기 위하여 기능기에 추가되고, 이후 본래 기능기를 노출시키기 위하여 제거될 수 있다. 일부 구체예에서, "알코올 보호기"가 이용된다. "알코올 보호기"는 알코올 기능기의 바람직하지 않은 반응성을 감소시키거나 배제시키는 임의의 기이다. 보호기는 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 추가되고 제거될 수 있다.
지질 입자
본 발명에서 특징되는 간 스크리닝 모형에서 검사를 위한 작용제 및/또는 아미노 지질은 지질 입자로 조제될 수 있다. 지질 입자에는 리포좀이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, 리포좀은 수성 내부를 둘러싸는 지질-함유 막을 보유하는 구조이다. 리포좀은 하나 또는 그 이상의 지질 막을 보유할 수 있다. 본 발명에서는 단일라멜라 (unilamellar)로서 지칭되는 단일-층 리포좀, 그리고 다중라멜라 (multilamellar)로서 지칭되는 다중-층 리포좀 둘 모두를 계획한다. 핵산과 복합될 때, 지질 입자는 또한, 리포플렉스 (lipoplex)일 수 있고, 이들은 예로써, Feigner, Scientific American에서 기술된 바와 같이 DNA 층 사이에 샌드위치 모양으로 끼여 있는 양이온성 지질 이중층으로 구성된다.
지질 입자는 하나 또는 그 이상의 추가 지질 및/또는 기타 성분, 예를 들면, 콜레스테롤을 더욱 포함할 수 있다. 기타 지질은 다양한 목적으로, 예를 들면, 지질 산화를 예방하거나, 또는 리간드를 리포좀 표면에 부착하기 위하여 리포좀 조성물 내에 포함될 수 있다. 친양쪽성, 중성, 양이온성, 그리고 음이온성 지질을 비롯한 다수의 지질이 존재할 수 있다. 이런 지질은 단독으로 또는 공동으로 이용될 수 있다. 존재할 수 있는 추가 지질 성분의 특정 실례는 하기에 기술된다.
지질 입자 내에 존재할 수 있는 추가 성분에는 이중층 안정화 성분, 예를 들면, 폴리아미드 올리고머 (참조: U.S. Patent No. 6,320,017), 펩티드, 단백질, 세정제, 지질-유도체, 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG 및 세라미드에 접합 (conjugation)된 PEG (참조: U.S. Patent No. 5,885,613)가 포함된다. 일부 구체예에서, 지질 입자는 표적화 작용제, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질을 포함한다.
지질 입자는 두 번째 아미노 지질 또는 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, 그리고 형성 동안 지질 입자의 집합 (aggregation)을 감소시키기 위하여 선택된 지질 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있고, 이는 형성 동안 전하-유도된 집합을 예방하는 입자의 입체 안정화 (steric stabilization)에 기인할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "양이온성 지질"은 1개 또는 2개의 지방산 또는 지방 알킬 사슬, 그리고 생리 pH에서 양성자화 (protonattion)되어 양이온성 지질을 형성할 수 있는 아미노 머리 기 (head group) (알킬아미노 또는 디알킬아미노 기 포함)를 보유하는 지질을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구체예에서, 양이온성 지질은 "아미노 지질"로서 지칭된다.
다른 양이온성 지질에는 알킬 치환기가 서로 다른 것들 (가령, N-에틸-N-메틸아미노-, N-프로필-N-에틸아미노- 등)을 비롯하여, 대안적 지방산 기 및 기타 디알킬아미노 기를 보유하는 것들이 포함될 것이다. 일반적으로, 덜 포화된 아실 사슬을 보유하는 지질 (가령, 양이온성 지질)은 특히, 이들 복합체가 필터 멸균 (filter sterilization)의 목적으로 대략 0.3 마이크론 (micron) 미만으로 사이징 (sizing)될 때, 더욱 용이하게 사이징된다. C10 내지 C20의 범위의 탄소 사슬 길이 (carbon chain length)를 갖는 불포화된 지방산을 포함하는 양이온성 지질이 바람직하다. 다른 골격 (scaffold) 역시 양이온성 지질의 아미노 기 (가령, 양이온성 지질의 아미노 기) 및 지방산 또는 지방 알킬 부분을 분리하는데 이용될 수 있다. 적절한 골격은 당업자에게 공지되어 있다.
일정한 구체예에서, 양이온성 지질은 적어도 하나의 양성자화가능 또는 탈양성자화가능 기를 보유하고, 따라서 상기 지질은 첫 pH에서, 생리 pH (가령, pH 7.4) 또는 그 미만에서 양으로 하전되고, 그리고 두 번째 pH에서, 바람직하게는 생리 pH 또는 그 초과에서 중성이다. 이런 지질은 또한, 양이온성 지질로서 지칭된다. 당연히, pH의 함수로서 양성자의 부가 또는 제거는 평형 과정이고, 그리고 하전된 또는 중성 지질에 대한 지시는 우세한 종의 성질을 지칭하고 모든 지질이 반드시 하전된 또는 중성 형태로 존재하는 것은 아니라는 것으로 이해될 것이다. 하나 이상의 양성자화가능 또는 탈양성자화가능 기를 보유하거나, 또는 쌍성이온 (zwiterrionic)인 지질은 본 발명에서 이용으로부터 배제되지 않을 것이다.
일정한 구체예에서, 양성자화가능 지질 (즉, 양이온성 지질)은 대략 4 내지 대략 11의 범위에서 양성자화가능 기의 pKa를 갖는다. 가장 바람직하게는 대략 4 내지 대략 7의 pKa인데, 그 이유는 이들 지질이 더욱 낮은 pH 조제 단계에서 양이온성인 반면, 입자가 대략 pH 7.4의 생리 pH에서 표면이 거의 (비록 전체는 아니지만) 중화될 것이기 때문이다. 이러한 pKa의 이점 중의 하나는 입자의 외부 표면과 결합된 적어도 일부 핵산이 생리 pH에서 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)을 상실하여 간단한 투석에 의해 제거되고, 따라서 제거에 대한 입자의 감수성이 현저하게 감소할 것이라는 점이다.
형성 동안 입자의 집합을 감소시키는 지질의 실례에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 지질, 모노시알로강글리오시드 (monosialoganglioside) Gm1, 그리고 예로써, US Pat. No. 6,320,017에서 기술된 바와 같은 폴리아미드 올리고머 ("PAO")가 포함된다. 조제 동안 집합을 예방하는 하전되지 않은, 친수성, 입체-장벽 모이어티, 예를 들면, PEG, Gm1 또는 ATTA를 보유하는 다른 화합물 역시 본 발명의 방법과 조성물에서와 같은 이용을 위하여 지질에 결합될 수 있다. ATTA-지질은 예로써, U.S. Patent No. 6,320,017에서 기술되고, 그리고 PEG-지질 접합체 (conjugate)는 예로써, U.S. Patent No. 5,820,873, 5,534,499와 5,885,613에서 기술된다. 전형적으로, 집합을 감소시키기 위하여 선택된 지질 성분의 농도는 대략 1 내지 15% (지질의 몰% (mole percent)로)이다.
집합을 감소시키고 및/또는 간 스크리닝 모형에서 이용될 수 있는 핵산 작용제에 접합에 적합한 지질의 실례에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 지질, 모노시알로강글리오시드 (monosialoganglioside) Gm1, 그리고 예로써, US Pat. No. 6,320,017에서 기술된 바와 같은 폴리아미드 올리고머 ("PAO")가 포함된다. 조제 동안 집합을 예방하는 하전되지 않은, 친수성, 입체-장벽 모이어티, 예를 들면, PEG, Gm1 또는 ATTA를 보유하는 다른 화합물 역시 본 발명의 방법과 조성물에서와 같은 이용을 위하여 지질에 결합될 수 있다. ATTA-지질은 예로써, U.S. Patent No. 6,320,017에서 기술되고, 그리고 PEG-지질 접합체 (conjugate)는 예로써, U.S. Patent No. 5,820,873, 5,534,499와 5,885,613에서 기술된다. 전형적으로, 집합을 감소시키기 위하여 선택된 지질 성분의 농도는 대략 1 내지 15% (지질의 몰% (mole percent)로)이다.
본 발명에 유용한 PEG-변형된 지질 (또는 지질-폴리옥시에틸렌 접합체)의 특정 실례는 PEG 부분을 지질 소포의 표면에 확보하기 위한 다양한 "고정화 (anchoring)" 지질 부분을 보유할 수 있다. 적절한 PEG-변형된 지질의 실례에는 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, 본 발명에 참조로서 편입되는 동시-계류 중인 USSN 08/486,214에서 기술되는 PEG-세라미드 접합체 (가령, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 디알킬아민, 그리고 PEG-변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민이 포함된다. PEG-변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤이 특히 바람직하다. 일부 구체예에서, 입자 내에서 PEG 지질의 총 mol%는 대략 1.5 mol%이다. 가령, 입자가 본 명세서에서 기술된 복수의 PEG 지질, 예를 들면, 앞서 기술된 바와 같은 PEG-변형된 지질 및 PEG를 함유하는 표적화 지질을 포함할 때, PEG 함유 지질의 총량은 서로 합쳐, 대략 1.5 mol%이다.
입체적으로 큰 모이어티, 예를 들면, PEG 또는 ATTA가 지질 앵커 (anchor)에 접합되는 구체예에서, 지질 앵커의 선택은 접합체가 지질 입자와 어떤 유형의 결합을 갖는 지에 좌우된다. mePEG (mw2000)-디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE)은 입자가 순환으로부터 제거될 때까지, 아마도 수일 동안 리포좀과 결합된 상태로 남아있는 것으로 널리 알려져 있다. 다른 접합체, 예를 들면, PEG-CerC20은 유사한 머무름 능력 (staying capacity)을 갖는다. 하지만, PEG-CerC14는 일부 분석평가에서 60 min. 이하의 T1/2로, 혈청에 노출 시에 제제의 외부로 빠르게 교환된다. US Pat. Application SN 08/486,214에서 예증된 바와 같이, 적어도 3가지 특성이 교환 속도, 아실 사슬의 길이, 아실 사슬의 포화도 (saturation), 그리고 입체-장벽 머리 기의 크기에 영향을 준다. 이들 특징의 적절한 이형을 갖는 화합물은 본 발명에 유용할 수 있다. 일부 치료적 적용의 경우에, PEG-변형된 지질이 생체내에서 핵산-지질 입자로부터 빠르게 소멸되는 것이 바람직할 수 있고, 따라서 PEG-변형된 지질은 상대적으로 짧은 지질 앵커를 보유할 것이다. 다른 치료적 적용에서, 핵산-지질 입자가 더욱 긴 혈장 순환 수명 (plasma circulation lifetime)을 나타내는 것이 바람직할 수 있고, 따라서 PEG-변형된 지질은 상대적으로 더욱 긴 지질 앵커를 보유할 것이다. 예시적인 지질 앵커에는 대략 C14 내지 대략 C22, 바람직하게는 대략 C14 내지 대략 C16의 길이를 갖는 것들이 포함된다. 일부 구체예에서, PEG 모이어티, 예를 들면, mPEG-NH2는 대략 1000, 2000, 5000, 10,000, 15,000 또는 20,000 달톤의 크기를 갖는다.
집합 예방 화합물이 적절하게 기능하기 위하여 지질 접합이 반드시 요구되는 것은 아니다. 용해 상태에서 유리 PEG 또는 유리 ATTA가 집합을 예방하는데 충분할 수 있다. 입자가 조제 이후에 안정하면, PEG 또는 ATTA는 개체에 투여에 앞서 투석에 의해 제거될 수 있다.
지질 입자 내에 존재할 때 중성 지질은 생리 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 쌍성이온 형태로 존재하는 다수의 지질 종류 중에서 한 가지일 수 있다. 이런 지질에는 예로써, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 디히드로스핑고미엘린, 세팔린, 그리고 세레브로시드가 포함된다. 본 명세서에서 기술된 입자에서 이용을 위한 중성 지질의 선택은 일반적으로, 예로써 리포좀 크기 및 혈류 (bloodstream) 내에서 리포좀의 안정성의 고려에 의해 좌우된다. 바람직하게는, 중성 지질 성분은 2개의 아실 기 (즉, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)를 보유하는 지질이다. 변하는 사슬 길이와 포화도의 다양한 아실 사슬 기를 보유하는 지질은 가용하거나, 또는 널리 공지된 기술에 의해 분리되거나 합성될 수 있다. 일군의 구체예에서, C14 내지 C22의 범위에서 탄소 사슬 길이를 갖는 포화된 지방산을 포함하는 지질이 바람직하다. 다른 일군의 구체예에서, C14 내지 C22 범위에서 탄소 사슬 길이를 갖는 단일 또는 이중불포화된 지방산을 포함하는 지질이 이용된다. 부가적으로, 포화된 및 불포화된 지방산 사슬의 혼합물을 포함하는 지질이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 중성 지질은 DOPE, DSPC, DPPC, POPC, 또는 임의의 관련된 포스파티딜콜린이다. 본 발명에 유용한 중성 지질 역시 스핑고미엘린, 디히드로스핑고미엘린, 또는 다른 머리 기, 예를 들면, 세린 및 이노시톨을 보유하는 인지질로 구성될 수 있다.
지질 혼합물의 스테롤 성분은 존재하면, 리포좀, 지질 소포 또는 지질 입자 제조의 분야에서 전통적으로 이용되는 임의의 스테롤일 수 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다. 앞서 구체적으로 기술된 것들 이외에, 대략 생리 pH에서 알짜 양성 전하 (net positive charge)를 갖는 다른 양이온성 지질 역시 본 발명의 지질 입자 내에 포함될 수 있다. 이런 양이온성 지질에는 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 염화물 ("DODAC"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필-N,N-N-트리에틸암모늄 염화물 ("DOTMA"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브롬화물 ("DDAB"); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 염화물 ("DOTAP"); 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 염화물 염 ("D0TAP.C1"); 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 ("DC-Chol"), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-2-(스페르민카르복사미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세트산염 ("DOSPA"), 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페르민 ("DOGS"), 1,2-디올레일-sn-3-포스포에탄올아민 ("DOPE"), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 ("DODAP"), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민 ("DODMA"), 그리고 N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3 -일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브롬화물 ("DMRIE")이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 부가적으로, 양이온성 지질의 다수의 상업적 제조물, 예를 들면, LIPOFECTIN (DOTMA 및 DOPE를 포함, GIBCO/BRL로부터 구입가능), 그리고 LIPOFECTAMINE (DOSPA 및 DOPE를 포함, GIBCO/BRL로부터 구입가능)이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 양이온성 지질은 아미노 지질이다.
본 발명의 지질 입자에 이용하기 적합한 음이온성 지질에는 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴 포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 그리고 중성 지질에 연결된 다른 음이온성 변형 기 (modifying group)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다수의 구체예에서, 친양쪽성 지질이 본 발명의 지질 입자 내에 포함된다. "친양쪽성 지질"은 지질 물질의 소수성 부분이 소수성 상으로 향하고, 반면 친수성 부분이 수성 상으로 향하는 임의의 적절한 물질을 지칭한다. 이런 화합물에는 인지질, 아미노지질, 그리고 스핑고지질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 대표적인 인지질에는 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC), 또는 디리놀레일포스파티딜콜린 (DLPC)이 포함된다. 다른 인-결핍 화합물, 예를 들면, 스핑고지질, 글리코스핑고지질 집단, 디아실글리세롤, 그리고 β-아실옥시산 역시 이용될 수 있다. 부가적으로, 이런 친양쪽성 지질은 다른 지질, 예를 들면, 트리글리세리드 및 스테롤과 쉽게 혼합될 수 있다.
프로그램가능 융합 지질 (programmable fusion lipid) 역시 본 발명의 지질 입자 내에 포함에 적합하다. 이런 지질 입자는 세포 막과 융합하는 성향이 거의 없고, 그리고 소정의 신호 사건이 발생할 때까지 그들의 수화물 (payload)을 전달한다. 이것은 지질 입자가 세포와의 융합을 시작하기 이전에, 생물체 또는 질환 부위 내로 주사 이후에 더욱 균일하게 분포될 수 있도록 한다. 신호 사건은 예로써, pH, 온도, 이온 환경, 또는 시간에서 변화일 수 있다. 후자 경우에, 융합 지연 또는 "은폐" 성분, 예를 들면, ATTA-지질 접합체 또는 PEG-지질 접합체는 시간의 흐름에서 지질 입자 막의 외부로 간단하게 교환될 수 있다. 예시적인 지질 앵커에는 대략 C14 내지 대략 C22, 바람직하게는 대략 C14 내지 대략 C16의 길이를 갖는 것들이 포함된다. 일부 구체예에서, PEG 모이어티, 예를 들면, mPEG-NH2는 대략 1000, 2000, 5000, 10,000, 15,000 또는 20,000 달톤의 크기를 갖는다.
지질 입자는 체내에 적절하게 분포되는 시점에, 융합성 (fusogenic)이 될 만큼 충분한 은폐제 (cloaking agent)를 상실한다. 다른 신호 사건에서, 질환 부위 또는 표적 세포와 연관되는 신호, 예를 들면, 염증 부위에서 증가된 온도를 선택하는 것이 바람직하다.
핵산 작용제에 접합된 지질 입자는 또한, 표적화 모이어티, 예를 들면, 세포 유형 또는 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 표적화 모이어티, 예를 들면, 리간드, 세포 표면 수용체, 당단백질, 비타민 (가령, 리보플라빈) 및 단일클론 항체를 이용한 지질 입자의 표적화는 이미 보고되었다 (참조: U.S. Patent No. 4,957,773과 4,603,044). 예시적인 표적화 모이어티에는 표적화 지질, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질이 포함된다. 일부 구체예에서, 표적화 지질은 GalNAc 포함 표적화 지질, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 GalNAc3-DSG 및 GalNAc3-PEG-DSG이다. 이들 표적화 모이어티는 전체 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 기전은 일반적으로, 표적화 모이어티가 표적, 예를 들면, 세포 표면 수용체와의 상호작용에 이용될 수 있도록 하는 방식으로, 표적화 작용제가 지질 입자의 표면 상에 배치되어야 한다. 예로써, Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); 그리고 Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002)에서 기술된 것들을 비롯한 다양한 상이한 표적화 작용제 및 방법은 당분야에 공지되어 있고 가용하다.
표적화를 위한, 친수성 중합체 사슬, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬의 표면 코팅을 갖는 지질 입자, 다시 말하면, 리포좀의 이용이 제안되었다 (Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); U.S. Patent No. 5,013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995)). 한 가지 접근법에서, 지질 입자를 표적화시키기 위한 리간드, 예를 들면, 항체는 이러한 지질 입자를 형성하는 지질의 극성 머리 기에 연결된다. 다른 접근법에서, 표적화 리간드는 친수성 중합체 코팅를 형성하는 PEG 사슬의 원위 단부에 부착된다 (Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).
표적 작용제를 결합시키기 위한 표준 방법이 이용될 수 있다. 가령, 표적 작용제의 부착을 위하여 활성화될 수 있는 포스파티딜에탄올아민, 또는 유도체화된 친유성 화합물, 예를 들면, 지질-유도체화된 블레오마이신이 이용될 수 있다. 항체-표적화된 리포좀은 예로써, 단백질 A를 함입 (incorporation)하는 리포좀을 이용하여 구축될 수 있다 (참조: Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990); 그리고 Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990)). 항체 접합의 다른 실례는 U.S. Patent No. 6,027,726에서 개시되고, 이의 교시는 본 발명에 참조로서 편입된다. 표적화 모이어티의 실례에는 또한, 신생물 또는 종양과 연관된 항원을 비롯한 세포 성분에 특이적인 다른 단백질이 포함될 수 있다. 표적화 모이어티로서 이용되는 단백질은 공유 결합에 의해 리포좀에 부착될 수 있다 (참조: Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). 다른 표적화 방법에는 비오틴-아비딘 시스템이 포함된다.
예시적인 구체예에서, 지질 입자는 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질 (양이온성 지질 제외), 스테롤 (가령, 콜레스테롤) 및 PEG-변형된 지질 (가령, PEG-DMG 또는 PEG-cDMA)의 혼합물을 포함한다. 일정한 구체예에서, 지질 혼합물은 본 발명의 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형된 지질로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 지질 입자는 대략 20-70% DLin-M-C3-DMA: 5-45% 중성 지질:20-55% 콜레스테롤:0.5-15% PEG-변형된 지질의 몰 비율로, 상기 지질 혼합물로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다.
특정 구체예에서, 지질입자는 대략 20-60% DLin-M-C3-DMA: 5-25% DSPC:25-55% Chol:0.5-15% PEG-DMG 또는 PEG-cDMA의 몰 비율로, DLin-M-C3-DMA, DSPC, Chol 및 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다. 특정 구체예에서, 몰 지질 비율은 대략 40/10/40/10 (DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%), 35/15/40/10 (DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%) 또는 52/13/30/5 (DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%)이다.
다른 일군의 구체예에서, 이들 조성물 내에서 중성 지질, DSPC는 POPC, DPPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다.
치료제-지질 입자 조성물 및 제제
본 발명은 본 발명의 지질 입자 및 활성제를 포함하는 조성물에 관계하고, 여기서 활성제는 지질 입자와 결합된다. 특정 구체예에서, 활성제는 치료제이다. 특정 구체예에서, 활성제는 지질 입자의 수성 내부에 캡슐화된다. 다른 구체예에서, 활성제는 지질 입자의 하나 또는 그 이상의 지질 층 내에 존재한다. 다른 구체예에서, 활성제는 지질 입자의 외부 또는 내부 지질 표면에 결합된다.
본 명세서에서, "완전히 캡슐화된"은 유리 DNA를 현저하게 분해시키는 혈청 또는 뉴클레아제 분석물에 노출후, 입자 내에 핵산이 현저하게 분해되지 않는다는 것을 지시한다. 완전히 캡슐화된 시스템에서, 정상적으로 100%의 유리 핵산을 분해시키는 처리에서 바람직하게는 25% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하, 그리고 가장 바람직하게는 5% 이하의 입자 핵산이 분해된다. 대안으로, 완전 캡슐화는 Oligreen 분석평가에 의해 결정될 수 있다. Oligreen은 용해 상태에서 올리고뉴클레오티드 및 단일-가닥 DNA을 정량하기 위한 초민감성 형광 핵산 색소 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)이다.
"완전히 캡슐화된"은 또한, 이들 입자가 혈청 안정성임을 암시한다, 다시 말하면, 이들이 생체내 투여 시에 그들의 주요 성분으로 빠르게 분해되지 않는다는 것을 암시한다.
본 명세서에서, 활성제에는 세포, 조직, 장기 또는 개체에 원하는 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물이 포함된다. 이런 효과는 예로써, 생물학적, 생리학적, 또는 미용적 효과일 수 있다. 활성제는 예로써, 항체, 예를 들면, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 재조합 항체, 재조합 인간 항체, 그리고 PrimatizedTM 항체, 사이토킨, 성장 인자, 아폽토시스 인자, 분화-유도 인자, 세포 표면 수용체 및 이들의 리간드를 비롯한 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드; 호르몬; 그리고 소형 유기 분자 또는 화합물을 비롯한 소형 분자가 포함되는 임의의 유형의 분자 또는 화합물일 수 있다.
한 구체예에서, 활성제는 치료제, 또는 이의 염 또는 유도체이다. 치료제 유도체는 그 자체로 치료 활성적이거나, 또는 이들은 추가 변형 시에 활성화되는 프로드러그 (prodrug)일 수 있다. 따라서 한 구체예에서, 치료제 유도체는 변형되지 않은 작용제와 비교하여 치료적 활성의 일부 또는 전부를 유지하고, 반면 다른 구체예에서, 치료제 유도체는 치료적 활성이 없다.
다양한 구체예에서, 치료제에는 임의의 치료 효과적 작용제 또는 약물, 예를 들면, 소염성 화합물, 우울증 치료제, 흥분제, 진통제, 항생제, 피임약, 해열제, 혈관확장제, 항혈관생성제, 세포혈관제 (cytovascular agent), 신호 전달 저해제, 심혈관계 약물, 예를 들면, 항-부정맥제, 혈관수축제, 호르몬, 그리고 스테로이드가 포함된다.
일정한 구체예에서, 치료제는 항-종양 약물, 항-암 약물, 종양 약물, 항신생물제 (antineoplastic agent) 등으로도 지칭되는 종양학 약물이다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 종양학 약물의 실례에는 아드리아마이신 (adriamycin), 알케란 (alkeran), 알로푸리놀 (allopurinol), 알트레타민 (altretamine), 아미포스틴 (amifostine), 아나스트로졸 (anastrozole), araC, 삼산화비소 (arsenic trioxide), 아자티오프린 (azathioprine), 벡사로텐 (bexarotene), biCNU, 블레오마이신 (bleomycin), 정맥내 부설판 (busulfan), 경구 부설판, 카페시타빈 (capecitabine) (Xeloda), 카르보플라틴 (carboplatin), 카르무스틴 (carmustine), CCNU, 셀레콕시브 (celecoxib), 클로람부실 (chlorambucil), 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 시클로스포린 (cyclosporin) A, 시타라빈 (cytarabine), 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside), 다우노루비신 (daunorubicin), 시톡산 (cytoxan), 다우노루비신 (daunorubicin), 덱사메타손 (dexamethasone), 덱스라족산 (dexrazoxane), 도데탁셀 (dodetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), DTIC, 에피리부신 (epirubicin), 에스트라무스틴 (estramustine), 에토포시드 포스페이트 (etoposide phosphate), 에토포시드(etoposide)와 VP-16, 엑세메스탄 (exemestane), FK506, 플루다라빈 (fludarabine), 플루오르우라실 (fluorouracil), 5-FU, 젬시타빈 (gemcitabine) (Gemzar), 젬투주맙 (gemtuzumab)-오조가미신 (ozogamicin), 고세렐린 아세트산염 (goserelin acetate), 히드레아 (hydrea), 히드록시우레아 (hydroxyurea), 이다루비신 (idarubicin), 이포스파미드 (ifosfamide), 이마티닙 메실레이트 (imatinib mesylate), 인터페론 (interferon), 이리노테칸 (irinotecan) (Camptostar, CPT-111), 레트로졸 (letrozole), 류코보린 (leucovorin), 류스타틴 (leustatin), 류프롤리드 (leuprolide), 레바미솔 (levamisole), 리트레티노인 (litretinoin), 메가스트롤 (megastrol), 멜팔란 (melphalan), L-PAM, 메스나 (mesna), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메톡살렌 (methoxsalen), 미트라마이신 (mithramycin), 미토마이신 (mitomycin), 미톡산트론 (mitoxantrone), 질소 겨자 (nitrogen mustard), 파클리탁셀 (paclitaxel), 파미드로네이트 (pamidronate), 페가데마세 (Pegademase), 펜토스타틴 (pentostatin), 포르피머 나트륨 (porfimer sodium), 프레드니손 (prednisone), 리툭산 (rituxan), 스트렙토조신 (streptozocin), STI-571, 타목시펜 (tamoxifen), 탁소테르 (taxotere), 테모졸라미드 (temozolamide), 테니포시드 (teniposide), VM-26, 토포테칸 (topotecan) (Hycamtin), 토레미펜 (toremifene), 트레티노인 (tretinoin), ATRA, 발루비신 (valrubicin), 벨반 (velban), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), VP 16, 그리고 비노렐빈 (vinorelbine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 종양학 약물의 다른 실례는 엘립티신 (ellipticin) 및 엘립티신 유사체 또는 유도체, 에포틸론 (epothilone), 세포내 키나아제 저해제 및 캄포테신 (camptothecin)이다.
핵산-지질 입자
일정한 구체예에서, 본 발명의 지질 입자는 핵산과 결합되어 핵산-지질 입자를 산출한다. 특정 구체예에서, 핵산은 지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다. 본 명세서에서, 용어 "핵산"은 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다. 최대 50개 뉴클레오티드를 포함하는 단편은 일반적으로, 올리고뉴클레오티드로 불리고, 그리고 더욱 긴 단편은 폴리뉴클레오티드로 불린다. 특정 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 20-50개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생하는 염기, 당 및 당간 (intersugar) (중추) 연쇄로 구성되는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단위체의 중합체 또는 올리고머를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"에는 유사하게 기능하는 비-자연적으로 발생하는 단위체, 또는 이들의 일부분을 포함하는 중합체 또는 올리고머 역시 포함된다. 이런 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종, 예로써 증강된 세포 흡수 및 뉴클레아제의 존재에서 증가된 안정성과 같은 특성으로 인하여, 고유 형태보다 선호된다.
올리고뉴클레오티드는 데옥시리보올리고뉴클레오티드 또는 리보올리고뉴클레오티드로 분류된다. 데옥시리보올리고뉴클레오티드는 5'와 3' 탄소에서 인산염에 공유 결합되어 교호의 가지 없는 중합체를 형성하는 데옥시리보오스 (deoxyribose)로 불리는 5-탄소 당으로 구성된다. 리보올리고뉴클레오티드는 5-탄소 당이 리보오스인 유사한 반복 구조로 구성된다.
본 발명에 따른 지질-핵산 입자 내에 존재하는 핵산에는 공지된 임의의 형태의 핵산이 포함된다. 본 발명에서 이용되는 핵산은 단일-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드일 수 있다. 이중-가닥 DNA의 실례에는 구조 유전자 (structural gene), 제어와 종결 영역을 포함하는 유전자, 그리고 자기-복제 시스템, 예를 들면, 바이러스 또는 플라스미드 DNA가 포함된다. 이중-가닥 RNA의 실례에는 siRNA 및 기타 RNA 간섭 시약이 포함된다. 단일-가닥 핵산에는 예로써, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 마이크로RNA, 또는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명의 핵산은 일반적으로, 핵산의 특정 형태에 따라서, 다양한 길이를 가질 수 있다. 가령, 특정 구체예에서, 플라스미드 또는 유전자는 대략 1,000개 내지 100,000개 뉴클레오티드 잔기 길이를 갖는다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 대략 10개 내지 100개 뉴클레오티드의 길이 범위를 갖는다. 다양한 관련된 구체예에서, 단일-가닥, 이중-가닥, 그리고 삼중-가닥의 올리고뉴클레오티드는 대략 10개 내지 대략 50개 뉴클레오티드, 대략 20개 내지 대략 50개 뉴클레오티드, 대략 15개 내지 대략 30개 뉴클레오티드, 대략 20개 내지 대략 30개 뉴클레오티드의 길이 범위를 갖는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 (또는 이의 가닥)는 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되거나, 또는 여기에 상보성이다. "특이적으로 혼성화가능" 및 "상보성"은 DNA 또는 RNA 표적 및 올리고뉴클레오티드 사이에 안정된 특정한 결합이 발생할 만큼 충분한 정도의 상보성 (complementarity)을 지시하는데 이용되는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화되기 위하여 표적 핵산 서열에 100% 상보성일 필요는 없는 것으로 이해된다. 올리고뉴클레오티드는 표적에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 분자의 정상적인 기능을 간섭하여 유용성 또는 이로부터 발현의 상실을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 다시 말하면, 생체내 분석평가 또는 치료적 처리의 경우에 생리 조건 하에, 또는 시험관내 분석평가의 경우에 이들 분석평가가 수행되는 조건 하에 비-표적 서열에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합이 회피될 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, 특이적으로 혼성화가능하다. 따라서 다른 구체예에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 이에 의해 표적화되거나, 또는 특이적으로 혼성화되는 유전자 또는 mRNA 서열의 영역과 비교하여, 1, 2, 또는 3개의 염기 치환을 포함한다.
RNA 간섭 핵산
특정 구체예에서, 본 발명의 핵산-지질 입자는 RNA 간섭 (RNAi) 분자와 결합된다. RNAi 분자를 이용한 RNA 간섭 방법은 목적되는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 중단시키는데 이용될 수 있다. 지난 5년 동안, 소형 간섭 RNA (siRNA)는 개발 중인 차세대 표적화 올리고뉴클레오티드 약물로서 안티센스 ODN 및 리보자임을 본질적으로 대체하였다. siRNA는 RNAi-유도된 침묵 복합체 (RISC)로서 알려져 있는 세포질 멀티-단백질 복합체와 결합할 수 있는 정상적으로 21-30개 뉴클레오티드 길이의 RNA 이중나선이다. siRNA로 적하된 RISC는 상동성 mRNA 전사체의 분해를 매개하고, 따라서 siRNA는 높은 특이성 (specificity)으로 단백질 발현을 녹다운시키도록 설계될 수 있다. 다른 안티센스 기술과 달리, siRNA는 비-코딩 RNA를 통하여 유전자 발현을 제어하도록 진화된 자연 기전을 통하여 기능한다. 이것은 일반적으로, 그들의 활성이 안티센스 ODN 또는 리보자임보다 시험관내에서 및 생체내에서 더욱 강력한 이유인 것으로 간주된다. 임상적으로 관련된 표적을 표적으로 하는 siRNA를 비롯한 다양한 RNAi 시약이 예로써, de Fougerolles, A. et al., Nature Reviews 6:443-453 (2007)에서 기술된 바와 같이, 현재 약제로서 개발 중에 있다.
맨 처음 기술된 RNAi 분자는 RNA 센스 및 RNA 안티센스 가닥을 모두 포함하는 RNA:RNA 하이브리드이었지만, DNA 센스:RNA 안티센스 하이브리드, RNA 센스:DNA 안티센스 하이브리드, 그리고 DNA:DNA 하이브리드 역시 RNAi를 매개할 수 있는 것으로 증명되었다 (Lamberton, J. S. and Christian, A.T., (2003) Molecular Biotechnology 24: 111-119). 따라서 본 발명은 이들 상이한 유형의 이중-가닥 분자 중에서 한 가지를 포함하는 RNAi 분자의 용도를 포함한다. 이에 더하여, RNAi 분자는 다양한 형태로 이용되고 세포에 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서 본 명세서에서, RNAi 분자는 2개의 별개의 가닥, 다시 말하면, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 소형 간섭 RNA (siRNA); 이중-가닥 영역을 형성하는 상보성 서열의 헤어핀 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, shRNAi 분자, 그리고 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오티드와 공동으로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 발현 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 세포에서 RNAi 반응을 유도할 수 있는 모든 분자를 포괄한다.
본 명세서에서, "단일 가닥 siRNA 화합물"은 단일 분자로 구성되는 siRNA 화합물이다. 이것은 가닥내 대합 (intra-strand pairing)에 의해 형성된 이중나선 영역을 포함할 수 있다, 가령 이것은 헤어핀 또는 프라이팬 손잡이 구조이거나, 또는 이러한 구조를 포함할 수 있다. 단일 가닥 siRNA 화합물은 표적 분자에 대하여 안티센스일 수 있다.
단일 가닥 siRNA 화합물은 RISC에 들어가고 표적 mRNA의 RISC 매개된 절단에 참여할 수 있을 만큼 충분히 길 수 있다. 단일 가닥 siRNA 화합물은 적어도 14개, 그리고 다른 구체예에서 적어도 15, 20, 25, 29, 35, 40 또는 50개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일정한 구체예에서, 이것은 200, 100 또는 60개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
헤어핀 siRNA 화합물은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드 쌍, 또는 그 이상의 이중나선 영역을 보유할 것이다. 이중나선 영역은 200, 100 또는 50개 뉴클레오티드 쌍, 또는 그 이하의 길이를 가질 것이다. 일정한 구체예에서, 이중나선 영역에 대한 범위는 15 내지 30개, 17 내지 23개, 19 내지 23개, 그리고 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이이다. 헤어핀은 단일 가닥 오버행 또는 말단 대합되지 않은 영역을 보유할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 오버행은 2-3개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 오버행은 헤어핀의 센스 측면에 위치하고, 그리고 일부 구체예에서, 헤어핀의 안티센스 측면에 위치한다.
본 명세서에서, "이중 가닥 siRNA 화합물"은 1개 이상, 그리고 일부 경우에, 2개의 가닥을 포함하는 siRNA 화합물이고, 여기서 사슬간 혼성화가 이중나선 구조의 영역을 형성할 수 있다.
이중 가닥 siRNA 화합물의 안티센스 가닥은 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 또는 60개 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 이것은 200, 100 또는 50개 뉴클레오티드, 또는 그 이하의 길이를 가질 수 있다. 범위는 17 내지 25개, 19 내지 23개, 그리고 19 내지 21개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "안티센스 가닥"은 표적 분자, 예를 들면, 표적 RNA에 충분히 상보성인 siRNA 화합물의 가닥을 의미한다.
이중 가닥 siRNA 화합물의 센스 가닥은 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40, 또는 60개 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 이것은 200, 100 또는 50개 뉴클레오티드, 또는 그 이하의 길이를 가질 수 있다. 범위는 17 내지 25개, 19 내지 23개, 그리고 19 내지 21개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
이중 가닥 siRNA 화합물의 이중 가닥 부분은 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 또는 60개 뉴클레오티드 쌍, 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 이것은 200, 100 또는 50개 뉴클레오티드 쌍, 또는 그 이하의 길이를 가질 수 있다. 범위는 15 내지 30개, 17 내지 23개, 19 내지 23개, 그리고 19 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다.
많은 구체예에서, siRNA 화합물은 더욱 작은 siRNA 화합물, 예를 들면, siRNA 작용제를 생산하기 위하여 내생성 분자, 예를 들면, Dicer에 의해 절단될 수 있을 만큼 충분히 크다.
이들 센스 및 안티센스 가닥은 이중-가닥 siRNA 화합물이 분자의 한쪽 또는 양쪽 단부에서 단일 가닥 또는 대합되지 않은 영역을 보유하도록 선택될 수 있다. 따라서 이중-가닥 siRNA 화합물은 오버행, 예를 들면, 1개 또는 2개의 5' 또는 3' 오버행, 또는 1-3개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 보유하도록 대합된 센스 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 이들 오버행은 한쪽 가닥이 다른 쪽 가닥보다 길거나, 또는 동일한 길이의 두 가닥이 비트적거림으로써 발생할 수 있다. 일부 구체예는 적어도 하나의 3' 오버행을 보유할 것이다. 한 구체예에서, siRNA 분자의 양쪽 단부가 3' 오버행을 보유할 것이다. 일부 구체예에서, 오버행은 2개 뉴클레오티드이다.
일정한 구체예에서, 이중나선 영역의 길이는 예로써, 앞서 논의된 ssiRNA 화합물 범위에서 15 내지 30개, 또는 18, 19, 20, 21, 22, 그리고 23개 뉴클레오티드이다. ssiRNA 화합물은 길이 및 구조에서, 긴 dsiRNA로부터 자연 Dicer 가공된 산물과 유사할 수 있다. ssiRNA 화합물의 두 가닥이 연결되는, 예를 들면, 공유 연결되는 구체예 역시 포함된다. 헤어핀, 또는 요구되는 이중 가닥 영역을 제공하는 다른 단일 가닥 구조, 그리고 3' 오버행 역시 본 발명의 범위 내에 있다.
이중-가닥 siRNA 화합물 및 단일-가닥 siRNA 화합물을 비롯한 본 명세서에서 기술된 siRNA 화합물은 표적 RNA, 예를 들면, mRNA, 예를 들면, 단백질을 인코딩하는 유전자의 전사체의 침묵을 매개할 수 있다. 편의를 위하여, 이런 mRNA는 본 명세서에서, 침묵되는 mRNA로서 지칭된다. 이런 유전자 역시 표적 유전자로서 지칭된다. 일반적으로, 침묵되는 RNA는 내생성 유전자 또는 병원체 유전자이다. 이에 더하여, mRNA 이외의 RNA, 예를 들면, tRNA, 그리고 바이러스 RNA 역시 표적화될 수 있다.
본 명세서에서, 구(句) "RNAi를 매개한다"는 서열 특이적인 방식으로, 표적 RNA를 침묵시키는 능력을 지칭한다. 이론에 한정됨 없이, 침묵은 RNAi 기구 (machinery) 또는 과정, 그리고 가이드 RNA, 예를 들면, 21 내지 23개 뉴클레오티드의 ssiRNA 화합물을 이용하는 것으로 생각된다.
한 구체예에서, siRNA 화합물은 이러한 siRNA 화합물이 표적 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 생산을 침묵시킬 만큼, 표적 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA에 "충분히 상보성"이다. 다른 구체예에서, siRNA 화합물은 표적 RNA, 예를 들면, 표적 mRNA에 "정확하게 상보성"이고, 그리고 siRNA 화합물은 어닐링 (annealing)되어 예로써, 정확한 상보성의 영역 내에서 오로지 Watson-Crick 염기 쌍으로만 이루어진 하이브리드를 형성한다. "충분히 상보성" 표적 RNA은 표적 RNA에 정확하게 상보성인 내부 영역 (가령, 적어도 10개 뉴클레오티드)을 보유할 수 있다. 게다가, 일정한 구체예에서, siRNA 화합물은 단일-뉴클레오티드 차이를 특이적으로 식별한다. 이러한 경우에, siRNA 화합물은 단일-뉴클레오티드 차이의 영역 (가령, 7개 뉴클레오티드 이내)에서 정확한 상보성이 관찰되는 경우에만 RNAi를 매개한다.
RNA 간섭 (RNAi)은 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 특이적으로 저해하는데 이용될 수 있다. 유전자 및 핵산 발현의 이중-가닥 RNA-매개된 억제는 세포 또는 생물체 내로 dsRNA, siRNA 또는 shRNA를 도입함으로써 본 발명에 따라서 달성될 수 있다. siRNA는 이중-가닥 RNA, 또는 RNA와 DNA 둘 모두, 예를 들면, 하나의 RNA 가닥 및 하나의 DNA 가닥을 포함하는 하이브리드 분자일 수 있다. 세포에 siRNA의 직접적인 도입은 포유동물 세포에서 RNAi를 발생시킬 수 있는 것으로 증명되었다 (Elshabir, S.M., et al. Nature 411 :494-498 (2001)). 게다가, 포유동물 세포에서 억제는 RNA 수준에서 발생하였고, 그리고 RNA 및 단백질 억제 사이에 강한 상관으로, 표적화된 유전자에 특이적이었다 (Caplen, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9746-9747 (2001)). 이에 더하여, HeLa S3, COS7, 293, NIH/3T3, A549, HT-29, CHO-KI 및 MCF-7 세포를 비롯한 매우 다양한 세포주 (cell line)가 다소간 수준의 siRNA 침묵에 민감한 것으로 밝혀졌다 (Brown, D. et al. TechNotes 9(1): 1-7, www.dot.ambion.dot.com/techlib/tn/91/912.html (9/1/02)에서 월드와이드웹 상에서 가용).
특정한 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 RNAi 분자는 당분야에 공지된 절차에 따라서 쉽게 제조될 수 있다. 효과적인 siRNA 분자의 구조 특성은 확인되었다 (Elshabir, S.M. et al. (2001) Nature 411 :494-498; 그리고 Elshabir, S.M. et al. (2001), EMBO 20:6877-6888). 따라서 당업자는 매우 다양한 상이한 siRNA 분자가 특정한 유전자 또는 전사체를 표적으로 하는데 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명에 따른 siRNA 분자는 이중-가닥이고 16-30개 또는 18-25개, 그리고 그 사이에 각 정수의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 한 구체예에서, siRNA는 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일정한 구체예에서, siRNA는 0-7개 뉴클레오티드 3' 오버행 (overhang) 또는 0-4개 뉴클레오티드 5' 오버행을 보유한다. 한 구체예에서, siRNA 분자는 2개 뉴클레오티드 3' 오버행을 보유한다. 한 구체예에서, siRNA는 2개 뉴클레오티드 3' 오버행을 보유하는 21개 뉴클레오티드 (즉, 이들은 센스 및 안티센스 가닥 사이에 19개 뉴클레오티드 상보성 영역을 보유한다) 길이를 갖는다. 일정한 구체예에서, 오버행은 UU 또는 dTdT 3' 오버행이다.
일반적으로, siRNA 분자는 표적 DNA 분자의 한쪽 가닥에 완전히 상보성인데, 그 이유는 심지어 단 하나의 염기쌍 미스매치 (base pair mismatch)가 침묵을 감소시키는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 다른 구체예에서, siRNA는 변형된 중추 조성, 예를 들면, 2'-데옥시- 또는 2'-O-메틸 변형을 보유할 수 있다. 하지만, 바람직한 구체예에서, siRNA의 전체 가닥은 2' 데옥시 또는 2'-O-변형된 염기로 만들어지지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명에서는 세포에서 유전자의 발현을 저해하기 위한 벡터를 포함하는 세포를 제시한다. 벡터는 본 발명의 dsRNA 중에서 한 가지의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.
한 구체예에서, siRNA 표적 부위는 AA 디뉴클레오티드 서열의 발생에 대하여 표적 mRNA 전사체 서열을 스캐닝 (scanning)함으로써 선택된다. 3' 인접한 대략 19개 뉴클레오티드와 공동으로 각 AA 디뉴클레오티드 서열은 잠재적인 siRNA 표적 부위이다. 한 구체예에서, siRNA 표적 부위는 바람직하게는, 5'와 3' 비번역 영역 (UTR) 또는 시작 코돈 인근의 영역 내에 (대략 75개 염기 내에) 위치하지 않는데, 그 이유는 조절 영역에 결합하는 단백질이 siRNP 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 간섭할 수 있기 때문이다 (Elshabir, S. et al. Nature 411 :494-498 (2001); Elshabir, S. et al. EMBO J. 20:6877-6888 (2001)). 이에 더하여, 잠재적 표적 부위는 www.ncbi.nlm에서 NCBI 서브 상에서 가용한 적절한 게놈 데이터베이스, 예를 들면, BLASTN 2.0.5에 비교되고, 그리고 다른 코딩 서열에 현저한 상동성을 갖는 잠재적 표적 서열은 배제된다.
특정 구체예에서, 짧은 헤어핀 RNA는 본 발명의 핵산-지질 입자의 핵산 성분을 구성한다. 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 표적 유전자의 발현을 서열-특이적으로 감소시킬 수 있는 헤어핀 RNA의 한 형태이다. 짧은 헤어핀 RNA는 유전자 발현의 억제에서 siRNA에 비하여 이점을 제공할 수 있는데, 그 이유는 이들이 일반적으로, 세포 환경에서 더욱 안정되고 분해에 덜 민감하기 때문이다. 이런 짧은 헤어핀 RNA-매개된 유전자 침묵은 다양한 정상 및 암 세포주에서, 그리고 생쥐와 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포에서 효과를 발휘하는 것으로 확립되었다 (Paddison, P. et al., Genes Dev. 16(8):948-58 (2002)). 게다가, 조작된 shRNA를 코딩하는 염색체 유전자를 보유하는 유전자도입 세포주가 산출되었다. 이들 세포는 shRNA를 구조적으로 합성할 수 있고, 따라서 자손 세포에게 대물림되는 장기적 또는 구조성 유전자 침묵을 조장한다 (Paddison, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3): 1443-1448 (2002)).
shRNA는 스템 루프 (stem loop) 구조를 보유한다. 일정한 구체예에서, 이들은 가변적인 스템 길이, 전형적으로 19개 내지 29개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 사이에 임의의 숫자를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 헤어핀은 19개 내지 21개 뉴클레오티드 스템을 보유하고, 반면 다른 구체예에서, 헤어핀은 27개 내지 29개 뉴클레오티드 스템을 보유한다. 일정한 구체예에서, 루프 크기는 4개 내지 23개 뉴클레오티드 길이이지만, 루프 크기는 침묵 활성에 별다른 영향을 주지 않으면서 23개 뉴클레오티드보다 클 수도 있다. shRNA 분자는 효능을 감소시키지 않으면서 shRNA 스템의 2개 가닥 사이에 미스매치, 예를 들면, G-U 미스매치를 보유할 수 있다. 실제로, 일정한 구체예에서, shRNA는 예로써, 세균에서 증식 동안 헤어핀을 안정화시키기 위하여 헤어핀 스템에서 1개 또는 여러 개의 G-U 대합을 포함하도록 설계된다. 하지만, 표적 mRNA (안티센스 가닥)에 결합하는 스템의 부분 및 상기 mRNA 사이에 상보성이 전형적으로 요구되고, 그리고 이러한 영역 내에서 단 하나의 염기쌍 미스매치도 침묵을 소멸시킬 수 있다. 5'와 3' 오버행은 필요하지 않은데, 그 이유는 이들이 비록 존재하더라도 shRNA 기능에 결정적인 것으로 보이지 않기 때문이다 (Paddison et al. (2002) Genes & Dev. 16(8):948-58).
마이크로RNA
마이크로RNA (miRNA)는 식물과 동물의 게놈에서 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 고도로 보존된 부류의 소형 RNA 분자이다. 처리된 miRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 합입되고, 그리고 발달 (development), 세포 증식 (cell proliferation), 아폽토시스 (apoptosis) 및 분화 (differentiation)의 핵심 조절인자로서 확인된 단일 가닥 ~17-25개 뉴클레오티드 (nt) RNA 분자이다. 이들은 특정한 mRNA의 3'-비번역 영역에 결합에 의해, 유전자 발현의 조절에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. RISC는 번역 저해, 전사체 절단, 또는 둘 모두를 통하여 유전자 발현의 하향-조절을 매개한다. RISC는 또한, 넓은 범위의 진핵생물의 핵에서 전사 침묵에 관여한다.
현재까지 확인된 miRNA 서열의 숫자는 크고 증가하고 있으며, 이의 예시적인 실례는 예로써, "miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature" Griffiths- Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144; "The microRNA Registry" Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D 109-DlIl; 그리고 microrna.dot.sanger.dot. ac.dot.uk/sequences/에서 월드와이드웹 상에서 찾아볼 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
한 구체예에서, 핵산은 표적 폴리뉴클레오티드에 지향되는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 간단하게 "안티센스"는 표적화된 폴리뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 선택된 서열에 상보성인 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA의 경우에, 이들은 이에 결합함으로써 상보성 RNA 가닥의 번역을 예방한다. 안티센스 DNA는 특정한 상보성 (코딩 또는 비-코딩) RNA를 표적으로 하는데 이용될 수 있다. 결합이 발생하면, 이러한 DNA/RNA 하이브리드는 효소 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대략 10개 내지 대략 50개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 대략 15개 대략 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 또한, 원하는 표적 유전자에 정확하게 상보성이 아닐 수도 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포괄한다. 따라서 본 발명은 안티센스와의 비-표적 특이적-활성이 관찰되는 경우에, 또는 표적 서열과 하나 또는 그 이상의 미스매치를 보유하는 안티센스 서열이 특정 용도를 위하여 가장 바람직한 경우에 이용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 단백질 합성의 효과적인 표적화된 저해제인 것으로 증명되었고 그리고 결과적으로, 표적화된 유전자에 의한 단백질 합성을 특이적으로 저해하는데 이용될 수 있다. 단백질 합성을 저해하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능은 충분히 확립된다. 가령, 폴리갈락투로나아제 (polygalactauronase) 및 무스카린 (muscarine) 2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 그들의 개별 mRNA 서열로 지향되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 저해된다 (U.S. Patent 5,739,119 및 U.S. Patent 5,759,829). 게다가, 안티센스 저해의 실례는 핵 단백질 시클린 (cyclin), 다제 내성 유전자 (MDG1), ICAM-I, E-셀렉틴, STK-I, 선조체 (striatal) GABAA 수용체 및 인간 EGF로 증명되었다 (Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10;240(4858): 1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989;l(4):225-32; Peris et al., Brain Res MoI Brain Res. 1998 Jun 15;57(2):310-20; U.S. Patent 5,801,154; U.S. Patent 5,789,573; U.S. Patent 5,718,709; 그리고 U.S. Patent 5,610,288). 게다가, 다양한 비정상적인 세포 증식, 예를 들면, 암을 저해하고 이를 치료하는데 이용될 수 있는 안티센스 구조체 역시 보고되었다 (U.S. Patent 5,747,470; U.S. Patent 5,591,317 및 U.S. Patent 5,783,683).
안티센스 올리고뉴클레오티드를 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위하여 쉽게 적합될 수 있다. 소정의 표적 서열에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열의 선별은 선택된 표적 서열의 분석, 그리고 이차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대적 안정성의 결정에 좌우된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이합체, 헤어핀, 또는 호스트 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적인 결합을 감소시키거나 차단하는 다른 이차 구조를 형성하는 그들의 상대적 무능력에 기초하여 선택될 수 있다. mRNA의 매우 바람직한 표적 영역에는 AUG 번역 개시 코돈에서 또는 여기에 인접하는 영역 및 상기 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보성인 서열이 포함된다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선별 고려는 예로써, OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 v.4 (Molecular Biology Insights) 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402)를 이용하여 실행될 수 있다.
안타고머 (antagomir)
안타고머는 RNAse 보호 및 약리학적 성질, 예를 들면, 증강된 조직과 세포 흡수를 위한 다양한 변형을 보유하는 RNA-유사 올리고뉴클레오티드이다. 이들은 예로써, 당, 포스포로티오에이트 중추, 그리고 예로써, 3'-단부에서 콜레스테롤-모이어티의 완전한 2'-O-메틸화에 의해 정상적인 RNA와 상이하다. 안타고머는 안타고머 및 내생성 miRNA를 포함하는 이중나선을 형성하고, 따라서 miRNA-유도된 유전자 침묵을 예방함으로써 내생성 miRNA를 효과적으로 침묵시키는데 이용될 수 있다. 안타고머-매개된 miRNA 침묵의 실례는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Krutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689에서 기술된 miR-122의 침묵이다. 안타고머 RNA는 표준 고형 상 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜을 이용하여 합성될 수 있다. US Patent Application Ser. Nos. 11/502,158 및 11/657,341 (이들 각각의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다)을 참조한다.
안타고머는 리간드-접합된 단위체 아단위 및 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 단위체를 포함할 수 있다. 예시적인 단위체는 2004년 8월 10일에 제출된 U.S. Application No. 10/916,185에서 기술된다. 안타고머는 2004년 3월 8일에 제출된 PCT Application No. PCT/US2004/07070에서 기술된 바와 같은 ZXY 구조를 갖는다. 안타고머는 친양쪽성 모이어티와 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 작용제와 함께 이용을 위한 예시적인 친양쪽성 모이어티는 2004년 3월 8일에 제출된 PCT Application No. PCT/US2004/07070에서 기술된다.
압타머 (aptamer)
압타머는 높은 친화성 및 특이성으로 목적되는 특정 분자에 결합하는 핵산 또는 펩티드 분자이다 (Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990)). 큰 단백질에서부터 작은 유기 분자까지 많은 상이한 실체 (entity)에 결합하는 DNA 또는 RNA 압타머가 성공적으로 생산되었다 (참조: Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999), 그리고 Hermann and Patel, Science 287:820-5 (2000). 압타머는 RNA 또는 DNA 기초될 수 있고, 그리고 리보스위치 (riboswitch)를 보유할 수 있다. 리보스위치는 작은 표적 분자에 직접적으로 결합할 수 있고, 그리고 표적에 결합하면 유전자의 활성에 영향을 주는 mRNA 분자의 일부이다. 따라서 리보스위치를 보유하는 mRNA는 표적 분자의 존재 또는 부재에 따라서, 그 자신의 활성을 조절하는데 직접적으로 관여한다. 일반적으로, 압타머는 다양한 분자 표적, 예를 들면, 작은 분자, 단백질, 핵산, 그리고 심지어 세포, 조직 및 생물체에 결합하기 위하여 시험관내 선별의 반복된 라운드, 또는 동등하게, SELEX (지수적 증폭 (exponential enrichment)에 의한 리간드의 체계적 발전)를 통하여 조작된다. 압타머는 합성, 재조합, 그리고 정제 방법을 비롯한 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 그리고 단독으로 또는 동일한 표적에 대하여 특이적인 다른 압타머와 공동으로 이용될 수 있다. 게다가, 본 명세서에서 더욱 충분하게 기술된 바와 같이, 용어 "압타머"에는 소정의 표적에 2개 또는 그 이상의 공지된 압타머를 비교함으로써 유래된 공통 서열 (consensus sequence)을 포함하는 "이차 압타머"가 특이적으로 포함된다.
리보자임
본 발명의 다른 구체예에 따라서, 핵산-지질 입자는 리보자임과 결합된다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 특정한 촉매 도메인을 보유하는 RNA-단백질 복합체이다 (Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20). 가령, 대다수의 리보자임은 높은 특이성으로 포스포에스테르 전이 반응을 가속화시키고, 종종 올리고뉴클레오티드 기질 내에서 여러 포스포에스테르 중에서 단지 하나만을 절단한다 (Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96; Michel and Westhof, J MoI Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374): 173-6). 이러한 특이성은 상기 기질이 화학적 반응에 앞서, 특이적인 염기-대합 상호작용에 의해 리보자임의 내부 가이드 서열 (internal guide sequence, "IGS")에 결합해야 하는 요구에 기인하였다.
자연-발생 효소적 RNA의 적어도 6개의 염기 변화가 현재 알려져 있다. 각각은 생리 조건 하에 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 in trans 촉진할 수 있다(따라서 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다). 일반적으로, 효소적 핵산은 먼저, 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이런 결합은 표적 RNA를 절단하는 기능을 하는 분자의 효소적 부분에 가깝게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 발생한다. 따라서 효소적 핵산은 먼저, 표적 RNA를 인식하고, 이후 상보성 염기-대합을 통하여 여기에 결합하고, 그리고 일단 정확한 부위에 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이런 표적 RNA의 전략적 절단은 인코딩된 단백질의 합성을 주동하는 능력을 파괴할 것이다. 효소적 핵산이 RNA 표적에 결합하고 이를 절단한 이후에, 상기 핵산은 다른 표적을 찾기 위하여 상기 RNA로부터 방출되고, 그리고 새로운 표적에 반복적으로 결합하고 이들을 절단할 수 있다.
효소적 핵산 분자는 예로써, 해머헤드 (hammerhead), 헤어핀, 간염 δ바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNaseP RNA (RNA 가이드 서열과 함께) 또는 Neurospora VS RNA 모티프에서 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 특정한 실례는 Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11;20(17):4559-65에서 기술된다. 헤어핀 모티프의 실례는 Hampel et al. (Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257), Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):299-304; 그리고 U. S. Patent 5,631,359에서 기술된다. 간염 δ 바이러스 모티프의 실례는 Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1 ;31 (47): 11843-52에서 기술된다; RNaseP 모티프의 실례는 Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57에서 기술된다; Neurospora VS RNA 리보자임 모티프는 Collins (Saville and Collins, Cell. 1990 May 18;61(4):685-96; Saville and Collins, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct l;88(19):8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23;32(11):2795-9)에 의해 기술된다; 그리고 그룹 I 인트론의 실례는 U.S. Patent 4,987,071에서 기술된다. 본 발명에 따라서 이용되는 효소적 핵산 분자의 중요한 특성은 이들이 표적 유전자 DNA 또는 RNA 영역 중에서 하나 또는 그 이상에 상보성인 특정한 기질 결합 부위를 보유하고, 그리고 이들이 상기 분자에 RNA 절단 활성을 제공하는, 상기 기질 결합 부위 내에 또는 주위에 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 점이다. 따라서 리보자임 구조체는 본 명세서에 언급된 특정 모티프에 한정될 필요가 없다.
임의의 폴리뉴클레오티드 서열에 표적화된 리보자임을 생산하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 리보자임은 각각 본 발명에 참조로서 편입되는 Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569 및 Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595에서 기술된 바와 같이 설계되고, 그리고 합성되어 본 명세서에서 기술된 바와 같이 시험관내에서 및 생체내에서 검사될 수 있다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 팔의 길이를 변경함으로써, 또는 혈청 리보뉴클레아제에 의한 그들의 분해를 예방하는 변형 (참조: Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 92/07065; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/15187; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 91/03162; Eur. Pat. Appl. Publ. No. 92110298.4; U.S. Patent 5,334,711; 그리고 Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/13688, 이들은 효소적 RNA 분자의 당 모이어티에 만들어질 수 있는 다양한 화학적 변형을 기술한다), 세포 내에서 그들의 효능을 증강시키는 변형, 그리고 RNA 합성 시간을 단축하고 화학적 요구를 감소시키기 위한 스템 II 염기의 제거로 리보자임을 화학적으로 합성함으로써 최적화될 수 있다.
본 발명의 조성물과 방법에 이용하기 적합한 올리고뉴클레오티드 (ODN)의 추가적인 특정한 핵산 서열은 U.S. Patent Appln. 60/379,343, U.S. patent application Ser. No. 09/649,527, Int. Publ. WO 02/069369, Int. Publ. No. WO 01/15726, U.S. Pat. No. 6,406,705, 그리고 Raney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192 (2001)에서 기술된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법에 이용되는 ODN은 포스포디에스테르 ("PO") 중추 또는 포스포로티오에이트 ("PS") 중추, 및/또는 CpG 모티프 내에서 적어도 하나의 메틸화된 시토신 잔기를 보유한다.
핵산 변형
1990년대에, DNA-기초된 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 및 리보자임 (RNA)은 약물 설계와 개발을 위한 흥미롭고 새로운 범례이었지만, 그들의 생체내 적용은 성공적인 세포내 전달의 결여뿐만 아니라 엔도-와 엑소-뉴클레아제 활성에 의해 방해되었다. 분해 문제는 올리고뉴클레오티드 (올리고) 약물이 뉴클레아제 효소에 의해 인식되는 것을 예방하지만 그들의 작용 기전을 저해하지 않는 화학적 변형에 관한 집중적인 연구 이후에 효과적으로 극복되었다.
이러한 연구는 매우 성공적이었는데, 현재 개발 중인 안티센스 ODN 약물은 변형되지 않은 분자에서 수분에 비하여 수일 동안 생체내에서 본래 대로 존속하였다 (Kurreck, J. 2003. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biochem 270:1628-44). 하지만, 세포내 전달 및 작용 기전 문제로 인하여, 안티센스 ODN 및 리보자임은 여전히, 임상적 산물로서 이용이 제한되고 있다.
RNA 이중나선은 본질적으로, 단일 가닥 DNA 또는 RNA보다 뉴클레아제에 대하여 더욱 안정하고, 그리고 안티센스 ODN과 달리, 변형되지 않은 siRNA는 일단 그들이 세포질에 들어가면 우수한 활성을 보인다. 비록 그렇다 하더라도, 안티센스 ODN 및 리보자임을 안정화시키기 위하여 개발된 화학적 변형은 얼마나 많은 화학적 변형이 관용될 수 있는 지, 그리고 약동학적 및 약역학적 활성이 증강될 수 있는 지를 결정하기 위하여 siRNA에도 체계적으로 적용되었다. siRNA 이중나선에 의한 RNA 간섭은 상이한 기능을 갖는 안티센스 및 센스 가닥을 필요로 한다. 양쪽은 siRNA가 RISC에 들어갈 수 있도록 하는데 필요하지만, 일단 적하되면, 이들 2개의 가닥은 분리되고, 그리고 센스 가닥은 분해되는 반면, 안티센스 가닥은 RISC를 표적 mRNA로 안내하기 위하여 존속한다. RISC 내로 진입은 표적 mRNA의 인식과 절단보다 구조적으로 덜 엄격한 과정이다. 결과적으로, 센스 가닥의 많은 상이한 화학적 변형이 가능하지만, 단지 한정된 변화만 안티센스 가닥에 의해 관용된다 (Zhang et al., 2006).
당분야에서 공지된 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 연결된 인산염 기를 더욱 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 (pentofuranosyl) 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우에, 인산염 기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 형성할 때, 이들 인산염 기는 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유 연결하여 선형 중합체 화합물을 형성한다. 차례로, 이러한 선형 중합체 구조의 개별 단부는 더욱 연결되어 환형 구조를 형성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 이들 인산염 기는 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 중추를 형성하는 것으로 지칭된다. RNA와 DNA의 전형적인 연쇄 또는 중추는 3'→5' 포스포디에스테르 연쇄이다.
본 발명에 따른 지질-핵산 입자에 이용되는 핵산에는 공지된 임의의 핵산 형태가 포함된다. 따라서 핵산은 뉴클레아제 내성 및 혈청 안정성을 증강시키기 위하여 기존에 이용된 유형의 변형된 핵산일 수 있다. 하지만, 놀랍게도, 기준에 맞는 치료적 산물 역시 자연 핵산 중합체의 포스포디에스테르 연쇄가 변형되지 않은 핵산으로부터 지질-핵산 입자를 조제하는 본 발명의 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 그리고 변형되지 않은 포스포디에스테르 핵산 (즉, 모든 연쇄가 포스포디에스테르 연쇄인 핵산)의 이용은 본 발명의 바람직한 구체예이다.
중추 변형
본 발명에 유용한 안티센스, siRNA 및 기타 올리고뉴클레오티드에는 변형된 중추 또는 비-자연 뉴클레오시드간 연쇄를 보유하는 올리고뉴클레오티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 변형된 중추를 보유하는 올리고뉴클레오티드에는 중추 내에 인 원자를 보유하는 것들 및 중추 내에 인 원자를 보유하지 않는 것들이 포함된다. 뉴클레오시드간 중추 내에 인 원자를 보유하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 역시 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드 중추에는 예로써, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 (phosphorodithioate), 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트와 키랄 포스포네이트를 비롯한 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트와 아미노알킬포스포라미데이트를 비롯한 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 포스포로셀레네이트 (phosphoroselenate), 메틸포스포네이트, 또는 O-알킬 포스포트리에스테르 연쇄, 그리고 통상의 3'-5' 연쇄를 갖는 보라노인산염, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 그리고 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'으로, 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전 극성 (inverted polarity)을 갖는 것들이 포함된다. 본 발명에 따른 핵산 내에 존재할 수 있는 특정 변형의 무제한적 실례는 표 2에 도시된다.
다양한 염, 혼성 염 및 유리 산 형태 역시 포함된다. 이들 연쇄의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 U.S. Patent No. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 그리고 5,625,050이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
일정한 구체예에서, 그 내부에 인 원자를 보유하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 중추는 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 혼성 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 또는 하나 또는 그 이상의 짧은 사슬 헤테로원자형 또는 헤테로환형 뉴클레오시드간 연쇄에 의해 형성되는 중추를 갖는다. 이들에는 예로써, 모르폴리노 연쇄 (부분적으로, 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨)를 보유하는 것들; 실록산 중추; 설피드, 설폭시드 및 설폰 중추; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 중추; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 중추; 알켄 포함 중추; 설파메이트 중추; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 중추; 설포네이트 및 설폰아미드 중추; 아미드 중추; 그리고 혼성 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 보유하는 다른 것들이 포함된다. 이들 올리고뉴클레오시드를 기술하는 대표적인 미국 특허에는 U.S. Pat. No. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 그리고 5,677,439가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소가 황에 의해 대체되는 포스포로티오에이트 중추 변형 (표 3, #1)은 뉴클레아제 분해로부터 핵산 약물을 안정화시키기 위하여 이용되는 가장 오래되고 가장 보편적인 수단 중의 하나이다. 일반적으로, PS 변형은 활성에 대한 별다른 영향 없이 양쪽 siRNA 가닥에 광범위하게 만들어질 수 있는 것으로 생각된다 (Kurreck, J., Eur. J. Biochem. 270:1628-44, 2003). 하지만, PS 올리고는 단백질과 비-특이적으로 강하게 결합하여 특히, i.v. 투여 시에 독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이런 이유로, PS 변형은 통상적으로, 3'와 5' 단부에서 1개 또는 2개 염기로 한정된다. 보라노인산염 링커 (표 3, #2)는 명백하게 PS보다 더욱 안정되고, siRNA 활성을 증강시키고, 그리고 낮은 독성을 갖는 최신의 변형이다 (Hall et al., Nucleic Acids Res. 32:5991-6000, 2004).
[표 3]
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Figure 112021005370664-pat00012
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다른 유용한 핵산 유도체에는 가교 산소 원자 (포스포에스테르 연쇄를 형성하는 것들)가 -S-, -NH-, -CH2- 등으로 대체된 핵산 분자가 포함된다. 일정한 구체예에서, 이용되는 안티센스, siRNA, 또는 기타 핵산에 변경은 이들 핵산과 연관된 음전하 (negative charge)에 완전하게 영향을 주지는 않을 것이다. 따라서 본 발명에서는 안티센스, siRNA, 그리고 연쇄의 일부분이 예로써, 중성 메틸 포스포네이트 또는 포스포라미데이트 연쇄로 대체되는 기타 핵산의 이용을 계획한다. 중성 연쇄가 이용될 때, 일정한 구체예에서, 80% 이하의 핵산 연쇄가 이렇게 치환되거나, 또는 50% 이하의 연쇄가 이렇게 치환된다.
염기 변형
염기 변형은 중추 및 당에 대한 변형보다 덜 일반적이다. 0.3-6에서 나타나는 변형 모두 뉴클레아제로부터 siRNA를 안정화시키고 활성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 보인다 (Zhang, H.Y., Du, Q., Wahlestedt, C, Liang, Z. 2006. RNA Interference with chemically modified siRNA. Curr Top Med Chem 6:893-900).
따라서 올리고뉴클레오티드는 핵염기 (종종, 간단하게 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환 역시 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 핵염기에는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 핵염기에는 다른 합성 및 자연 핵염기, 예를 들면, 5-메틸시토신 (5-me-C 또는 m5c), 5-히드록시메틸 시토신, 산틴, 히폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 기타 5-치환된 우라실과 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다.
2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯하여, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6과 0-6 치환된 퓨린과 같은 일정한 핵염기는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성 (binding affinity)을 증가시키는데 특히 유용하다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-278). 이들은 특정 구체예에서, 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 합쳐질 수 있다. 이들 변형된 핵염기 및 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 미국 특허에는 앞서 언급된 U.S. Pat. No. 3,687,808뿐만 아니라 U.S. Pat. No. 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 그리고 5,681,941이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
당 변형
당 기에서 대부분의 변형은 편의한 화학적 반응 부위를 제공하는, RNA 당 고리의 2'-OH에서 발생한다 (Manoharan, M. 2004. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs. Curr Opin Chem Biol 8:570-9; Zhang, H.Y., Du, Q., Wahlestedt, C, Liang, Z. 2006. RNA Interference with chemically modified siRNA. Curr Top Med Chem 6:893-900). 2'-F와 T-OME (0.7과 8)가 일반적이고, 그리고 둘 모두 안정성을 증가시키고, 2'-OME 변형은 가닥마다 4개 이하의 뉴클레오티드로 한정되면 활성을 감소시키지 않는다 (Holen, T., Amarzguioui, M., Babaie, E., Prydz, H. 2003. Similar behaviour of single-strand and double-strand siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway. Nucleic Acids Res 31 :2401-7). 2'-0-MOE (0.9)는 변형된 염기가 상기 분자의 중간 영역으로 한정될 때, siRNA에서 가장 효과적이다 (Prakash, T.P., Allerson, C. R., Dande, P., Vickers, T.A., Sioufi, N., Jarres, R., Baker, B.F., Swayze, E.E., Griffey, R.H., Bhat, B. 2005. Positional effect of chemical modifications on short interference RNA activity in mammalian cells. J Med Chem 48:4247-53). 활성의 상실 없이 siRNA를 안정화시키는 것으로 밝혀진 다른 변형은 0.10-14에서 나타난다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 치환된 당 모이어티 역시 보유할 수 있다. 가령, 본 발명은 2' 위치에서 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬, O-알킬-0-알킬, O-, S-, 또는 N-알케닐, 또는 O-, S- 또는 N-알키닐 중에서 한 가지를 보유하는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐과 알키닐일 수 있다. O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)2ON(CH3)2, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 그리고 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2가 특히 바람직하고, 여기서 n과 m은 1 내지 대략 10이다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 제거 기 (cleaving group), 리포터 기 (reporter group), 인터칼레이터 (intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 향상시키기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 향상시키기 위한 기, 그리고 유사한 성질을 갖는 다른 치환기 중에서 한 가지를 포함한다. 다른 변형에는 2'-메톡시에톡시 (2'-0--CH2CH2OCH3, 일명 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) (Martin et al., HeIv. Chim. Acta 1995, 78, 486-504), 다시 말하면, 알콕시알콕시 기가 포함된다. 다른 변형에는 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 다시 말하면, 2'-DMAOE로 알려져 있는 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-DMAEOE)가 포함된다.
추가 변형에는 2'-메톡시 (2'-0--CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)가 포함된다. 유사한 변형은 또한, 올리고뉴클레오티드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한, 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 보유할 수 있다. 이런 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 U.S. Pat. No. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 그리고 5,700,920이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
다른 올리고뉴클레오티드 모방체에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연쇄 둘 모두, 다시 말하면, 중추는 비록 이들 염기 단위가 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위하여 유지되긴 하지만, 신규한 기로 대체된다. 뛰어난 혼성화 성질을 갖는 것으로 밝혀진 이와 같은 올리고머 화합물, 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-중추는 아미드 포함 중추, 특히 아미노에틸글리신 중추로 대체된다. 이들 핵염기는 유지되고 중추의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 U.S. Pat. No. 5,539,082; 5,714,331; 그리고 5,719,262가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. PNA 화합물에 관한 추가의 교시는 Nielsen et al. (Science, 1991, 254, 1497-1500)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 포스포로티오에이트 중추를 보유하는 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 중추, 그리고 특히, 앞서 인용된 U.S. Pat. No. 5,489,677의 --CH2--NH--O--CH2--, --CH2--N(CH3)--0--CH2--(메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 중추로 지칭됨)--CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --0--N(CH3)--CH2--CH2-- (여기서 고유 포스포디에스테르 중추는 --0--P--O-CH2--로 표시됨), 그리고 앞서 인용된 U.S. Pat. No. 5,602,240의 아미드 중추를 보유하는 올리고뉴클레오시드이다. 앞서 인용된 U.S. Pat. No. 5,034,506의 모르폴리노 중추 구조를 보유하는 올리고뉴클레오티드 역시 바람직하다.
당 기는 또한, 리보오스 내에서 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학적 배열을 갖는 하나 또는 그 이상의 탄소를 보유할 수 있다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 예로써, 아라비노오스를 당으로서 보유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 단위체는 당에서 1' 위치에서 알파 연쇄, 예를 들면, 알파-뉴클레오시드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한, C-1'에서 핵염기가 결핍되는 "무염기" 당을 보유할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한, 하나 또는 그 이상의 구성 당 원자에서 변형을 더욱 보유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한, L 형태인 하나 또는 그 이상의 당, 예를 들면, L-뉴클레오시드를 보유할 수 있다.
키메라 올리고뉴클레오티드
소정의 화합물 내에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 그리고 실제로, 앞서 언급된 변형 중에서 한 가지 이상이 단일 화합물 내에서, 또는 심지어, 올리고뉴클레오티드 내에 단일 뉴클레오시드에서 함입될 수 있다. 본 발명의 일정한 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 맥락에서 "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 2개 또는 그 이상의 화학적으로 별개의 영역을 보유하고, 이들 각 영역이 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 유익한 성질 (가령, 증가된 뉴클레아제 내성, 세포 내로 증가된 흡수, RNA 표적에 대한 증가된 결합 친화성)을 공여하는 변형된 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역, 그리고 RNase H 절단을 위한 기질인 영역을 보유한다.
한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화성을 증가시키기 위하여 변형된 적어도 하나의 영역을 포함한다. 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성은 올리고뉴클레오티드와 표적이 해리되는 온도인, 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일과적으로 결정된다; 해리 (dissociation)는 분광광도법으로 검출된다. Tm이 더욱 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성이 더욱 크다. 한 구체예에서, 표적 mRNA 결합 친화성을 증가시키기 위하여 변형되는 올리고뉴클레오티드의 영역은 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 이런 변형은 올리고뉴클레오티드 내로 일과적으로 함입되고, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 소정의 표적에 대하여 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 더욱 높은 Tm (즉, 더욱 높은 표적 결합 친화성)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이런 증가된 친화성의 효과는 표적 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 저해를 크게 증가시키는 것이다.
다른 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 RNAse H에 대한 기질로서 기능하는 영역을 포함한다. 당연히, 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술된 다양한 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 이러한 올리고뉴클레오티드에, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증강시키는 하나 또는 그 이상의 모이어티 또는 접합체를 화학적으로 연결하는 것을 수반한다. 이런 접합체 및 이들을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 생체내 유용성, 예를 들면, 치료적 효능을 위하여, 합리적인 경험 법칙 (rule of thumb)은 서열의 티오에이트 이형이 유리 형태로 작용하면, 임의의 화학작용의 동일한 서열의 캡슐화된 입자 역시 유효할 것이라는 것이다. 캡슐화된 입자는 또한, 더욱 넓은 범위의 생체내 유용성을 갖고, 따라서 그렇지 않으면 안티센스 요법에 반응하는 것으로 알려져 있지 않은 조건 및 모형에서 효능을 나타낸다. 당업자는 본 발명을 적용하면, 안티센스 요법에 지금 반응하는 과거 모형이 발견될 수도 있다는 것을 인지한다. 더 나아가, 당업자는 본 발명을 이용함으로써, 폐기된 안티센스 서열 또는 화학 작용을 재고하고 효능을 찾아낼 수도 있다.
본 발명에 따라서 이용되는 올리고뉴클레오티드는 고형 상 합성의 널리 공지된 기술을 통하여 편의하게 및 일과적으로 만들어질 수 있다. 이런 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems를 비롯한 여러 업체에 의해 판매된다. 이런 합성을 위한 임의의 다른 수단 역시 이용될 수 있다; 이들 올리고뉴클레오티드의 실제 합성은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 유사한 기술을 이용하여 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하는 것 역시 널리 공지되어 있다.
면역자극 올리고뉴클레오티드
개체, 예를 들면, 포유동물 또는 다른 환자에 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 면역자극 올리고뉴클레오티드 (ISS; 단일- 또는 이중-가닥)를 비롯한, 본 발명의 지질 입자와 결합된 핵산은 면역자극성일 수 있다. ISS에는 예로써, 헤어핀 이차 구조를 유발하는 일정한 팰린드롬 (palindrome) (참조: Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076), 또는 CpG 모티프, 그리고 기타 공지된 ISS 특징 (가령, 다중-G 도메인, WO 96/11266 참조)이 포함된다.
면역 반응은 선천성 또는 후천성 면역 반응일 수 있다. 면역 시스템은 척추동물의 더욱 선천성 면역 시스템, 그리고 획득된 후천성 면역 시스템으로 분류되고, 후자는 체세포 성분으로 더욱 분류된다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 점막성일 수 있다.
특정 구체예에서, 면역자극 핵산은 지질 입자와 공동으로 투여될 때에만 면역자극성이고, 그리고 "자유 형태"로 투여될 때에는 면역자극성이 아니다. 본 발명에 따라서, 이런 올리고뉴클레오티드는 면역자극성인 것으로 간주된다.
면역자극 핵산은 면역 반응을 유발하기 위하여 이들이 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고 이의 발현을 감소시키는 것이 요구되지 않을 때, 비-서열 특이적인 것으로 간주된다. 따라서 일정한 면역자극 핵산은 자연 발생 유전자 또는 mRNA의 영역에 상응하는 서열을 포함할 수도 있지만, 이들은 여전히 비-서열 특이적 면역자극 핵산인 것으로 간주된다.
한 구체예에서, 면역자극 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 또는 CpG 디뉴클레오티드는 비메틸화되거나, 또는 메틸화될 수 있다. 다른 구체예에서, 면역자극 핵산은 메틸화되고 시토신을 보유하는 적어도 하나의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 단일 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 CpG 디뉴클레오티드 내에서 시토신은 메틸화된다. 특정한 구체예에서, 상기 핵산은 서열 5' TAACGTTGAGGGGCAT 3'을 포함한다. 대안적 구체예에서, 상기 핵산은 적어도 2개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 CpG 디뉴클레오티드 내에서 적어도 하나의 시토신은 메틸화된다. 다른 구체예에서, 서열 내에 존재하는 CpG 디뉴클레오티드 내에서 각 시토신은 메틸화된다. 다른 구체예에서, 상기 핵산은 복수의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 CpG 디뉴클레오티드 중에서 적어도 하나는 메틸화된 시토신을 포함한다.
특정한 구체예에서, 상기 핵산은 서열 5' TTCCATGACGTTCCTGACGT 3'을 포함한다. 다른 특정한 구체예에서, 핵산 서열은 서열 5' TCCATGACGTTCCTGACGT 3'을 포함하고, 여기서 굵게 표시된 2개의 시토신은 메틸화된다. 특정 구체예에서, ODN은 하기에 도시된 바와 같이, ODN #1, ODN #2, ODN #3, ODN #4, ODN #5, ODN #6, ODN #7, ODN #8, 그리고 ODN #9로 구성된 일군의 ODN에서 선택된다.
[표 4]
Figure 112021005370664-pat00014
"Z"는 메틸화된 시토신 잔기를 표시한다. ODN 14는 15-mer 올리고뉴클레오티드이고, 그리고 ODN 1은 5' 단부에 티미딘이 추가된 동일한 올리고뉴클레오티드이고, 따라서 ODN 1은 16-mer이다. ODN 14와 ODN 1 사이에 생물학적 활성에서 차이는 검출되지 않았고, 그리고 양쪽은 유사한 면역자극 활성을 나타낸다 (Mui et al., 2001).
본 발명의 조성물과 방법에 이용하기 적합한 올리고뉴클레오티드 (ODN)의 추가의 특정한 핵산 서열은 Raney et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192 (2001)에서 기술된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법에 이용되는 ODN은 포스포디에스테르 ("PO") 중추 또는 포스포로티오에이트 ("PS") 중추, 및/또는 CpG 모티프 내에 적어도 하나의 메틸화된 시토신 잔기를 보유한다.
미끼 올리고뉴클레오티드
전사 인자가 그들의 상대적으로 짧은 결합 서열을 인식하기 때문에, 주위의 게놈 DNA의 부재에서도, 특정한 전사 인자의 공통 결합 서열을 보유하는 짧은 올리고뉴클레오티드는 살아있는 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 도구로서 이용될 수 있다. 이러한 전략은 이런 "미끼 올리고뉴클레오티드"의 세포내 전달을 수반하고, 이들은 이후, 표적 인자에 의해 인식되고 결합된다. 미끼에 의한 전사 인자의 DNA-결합 부위의 점유는 전사 인자가 차후에, 표적 유전자의 프로모터 영역에 결합할 수 없도록 만든다. 미끼는 전사 인자에 의해 활성화되는 유전자의 발현을 저해하거나, 또는 전사 인자의 결합에 의해 억제되는 유전자를 상향 조절하기 위한 치료제로서 이용될 수 있다. 미끼 올리고뉴클레오티드의 이용의 실례는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075에서 찾아볼 수 있다.
슈퍼머 (supermir)
슈퍼머는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 둘 모두의 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥 소중합체 또는 중합체, 또는 이의 변형을 지칭하고, 이는 miRNA에 실질적으로 동일하고 표적에 대하여 안티센스인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 상기 용어는 자연-발생 핵염기, 당 및 공유 뉴클레오시드간 (중추) 연쇄로 구성되는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 유사하게 기능하는 적어도 하나의 비-자연-발생 부분을 포함한다. 이런 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 바람직한 성질, 예를 들면, 증강된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증강된 친화성, 그리고 뉴클레아제의 존재에서 증가된 안전성으로 인하여, 고유 형태보다 선호된다. 바람직한 구체예에서, 슈퍼머는 센스 가닥을 포함하지 않고, 그리고 다른 바람직한 구체예에서, 슈퍼머는 유의미한 정도로 자기-혼성화되지 않는다. 본 발명에서 특징되는 슈퍼머는 이차 구조를 보유할 수 있지만, 이는 생리학적 조건 하에 실질적으로 단일-가닥이다. 실질적으로 단일-가닥인 슈퍼머는 이러한 슈퍼머의 대략 50% 이하 (가령, 대략 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 이하)가 그 자신과 이중나선을 형성하는 정도로 단일-가닥이다. 슈퍼머는 바람직하게는 3' 단부에서 헤어핀 분절, 예를 들면, 서열을 보유할 수 있고, 그리고 자기 혼성화되어 이중나선 영역, 예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개, 그리고 바람직하게는 8, 7, 6, 또는 n개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들면, 5개 뉴클레오티드의 이중나선 영역을 형성할 수 있다. 이러한 이중나선 영역은 링커, 예를 들면, 뉴클레오티드 링커, 예를 들면, 3, 4, 5, 또는 6개 dT, 예를 들면, 변형된 dT에 의해 연결될 수 있다. 다른 구체예에서, 슈퍼머는 예로써, 슈퍼머의 3'과 5' 단부의 한쪽 또는 양쪽에서, 또는 한쪽 단부에서 및 비-말단 또는 중간에서 예로써, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드 길이의 더욱 짧은 올리고와 이중나선을 형성한다.
miRNA 모방체 (mimic)
miRNA 모방체는 하나 또는 그 이상의 miRNA의 유전자 침묵 능력을 모방하는데 이용될 수 있는 일 부류의 분자를 나타낸다. 따라서 용어 "마이크로RNA 모방체"는 RNAi 경로에 들어가고 유전자 발현을 조절할 수 있는 합성 비-코딩 RNA를 지칭한다 (즉, 이러한 miRNA는 내생성 miRNA의 공급원으로부터 정제에 의해 획득되지 않는다). miRNA 모방체는 성숙 분자 (가령, 단일 가닥) 또는 모방체 전구물질 (가령, 프리(pri)- 또는 프레(pre)-miRNA)로서 설계될 수 있다. miRNA 모방체는 제한 없이, RNA, 변형된 RNA, DNA, 변형된 DNA, 잠금된 핵산, 또는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산 (ENA), 또는 이들의 임의의 조합 (DNA-RNA 하이브리드 포함)을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 핵산 (변형된 또는 변형된 핵산)으로 구성될 수 있다. 이에 더하여, miRNA 모방체는 전달, 세포내 구획화 (compartmentalization), 안전성, 특이성, 기능성, 가닥 사용빈도 (strand usage), 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있는 접합체를 포함할 수 있다. 한 가지 설계에서, miRNA 모방체는 이중 가닥 분자 (가령, 대략 16개 내지 대략 31개 뉴클레오티드 길이의 이중나선 영역 보유)이고, 그리고 소정의 miRNA의 성숙 가닥과 동일성을 갖는 하나 또는 그 이상의 서열을 포함한다. 변형에는 분자의 한쪽 또는 양쪽 가닥에서 2' 변형 (2'-0 메틸 변형 및 2' F 변형 포함), 그리고 핵산 안전성 및/또는 특이성을 증강시키는 뉴클레오티드간 변형 (가령, 포스포르티오에이트 변형)이 포함될 수 있다. 이에 더하여, miRNA 모방체는 오버행을 보유할 수 있다. 이들 오버행은 어느 한쪽 가닥의 3' 또는 5' 단부에서 1-6개 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 그리고 안전성 또는 기능성을 증강시키기 위하여 변형될 수 있다. 한 구체예에서, miRNA 모방체는 16개 내지 31개 뉴클레오티드 사이의 이중나선 영역 및 아래의 화학적 변형 패턴 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다: 센스 가닥은 뉴클레오티드 1과 2 (센스 올리고뉴클레오티드의 5' 단부로부터 계산됨), 그리고 모든 C와 U의 2'-O-메틸 변형을 보유한다; 안티센스 가닥 변형은 모든 C와 U의 2' F 변형, 올리고뉴클레오티드의 5' 단부의 인산화, 그리고 2개 뉴클레오티드 3' 오버행과 연관된 안정화된 뉴클레오티드간 연쇄를 포함할 수 있다.
안티머 (antimir) 또는 miRNA 저해제.
용어 "안티머", "마이크로RNA 저해제", "miR 저해제", 또는 "저해제"는 특정한 miRNA의 능력을 간섭하는 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 올리고뉴클레오티드를 지칭하는 동의어이다. 일반적으로, 이들 저해제는 RNA, 변형된 RNA, DNA, 변형된 DNA, 잠금된 핵산 (LNA), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 비롯한 성격상 핵산 또는 변형된 핵산이다. 변형에는 2' 변형 (2'-0 알킬 변형 및 2' F 변형 포함), 그리고 전달, 안전성, 특이성, 세포내 구획화, 또는 효능에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드간 변형 (가령, 포스포로티오에이트 변형)이 포함된다. 이에 더하여, miRNA 저해제는 전달, 세포내 구획화, 안전성, 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있는 접합체를 포함할 수 있다. 저해제는 단일 가닥, 이중 가닥 (RNA/RNA 또는 RNA/DNA 이중나선), 그리고 헤어핀 설계를 비롯한 다양한 배치 (configuration)를 채택할 수 있고, 일반적으로, 마이크로RNA 저해제는 표적화되는 miRNA의 성숙 가닥 (또는 가닥들)과 상보성 또는 부분적으로 상보성인 하나 또는 그 이상의 서열 또는 서열의 일부분을 포함하고, 이에 더하여, miRNA 저해제는 성숙 miRNA의 역보체 (reverse complement)인 서열의 5'와 3'에 위치하는 추가의 서열 역시 포함할 수 있다. 추가의 서열은 성숙 miRNA가 유래되는 프리(pri)-miRNA 내에서, 성숙 miRNA에 인접하는 서열의 역보체이거나, 또는 추가의 서열은 임의의 서열 (A, G, C, 또는 U의 혼합)일 수 있다. 일부 구체예에서, 추가의 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽은 헤어핀을 형성할 수 있는 임의 서열이다. 따라서 일부 구체예에서, miRNA의 역보체인 서열은 5' 측면 및 3' 측면에서 헤어핀 구조와 접한다. 이중 가닥일 때 마이크로-RNA 저해제는 마주보는 가닥 상에서 뉴클레오티드 간에 미스매치 (mismatch)를 보유할 수 있다. 게다가, 마이크로-RNA 저해제는 세포 내로 저해제의 흡수를 조장하기 위하여 접합체 모이어티에 연결될 수 있다. 가령, 마이크로-RNA 저해제는 마이크로-RNA 저해제의 세포 내로의 수동 흡수를 가능하게 하는 콜레스테릴 5-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-3 히드록시펜틸카르바메이트)에 연결될 수 있다. 헤어핀 miRNA 저해제를 비롯한 마이크로-RNA 저해제는 Vermeulen et al., "Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function," RNA 13: 723-730 (2007), 그리고 WO2007/095387 및 WO 2008/036825에서 상세하게 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 당업자는 데이터베이스로부터 원하는 miRNA에 대한 서열을 선택하고, 그리고 본 명세서에서 기술된 방법에 유용한 저해제를 설계할 수 있다.
U1 어댑터 (adaptor)
U1 어댑터는 polyA 부위를 저해하고, 그리고 표적 유전자의 말단 엑손 내에서 부위에 상보성인 표적 도메인 및 U1 snRNP의 U1 더욱 작은 핵 RNA 성분에 결합하는 'U1 도메인'을 보유하는 이중기능성 올리고뉴클레오티드이다 (Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). U1 snRNP는 프레(pre)-mRNA 엑손-인트론 경계에 결합함으로써, 스플라이시오솜 (spliceosome) 형성에서 초기 단계를 주동하는데 첫째로 기능하는 리보핵단백질 복합체이다 (Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 49:77-95). U1 snRNA 염기 쌍의 5' 단부의 뉴클레오티드 2-11은 프레(pre) mRNA의 5' ss와 결합한다. 한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 U1 어댑터이다. 한 구체예에서, U1 어댑터는 적어도 하나의 다른 iRNA 작용제와 공동으로 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 변형
변형되지 않은 올리고뉴클레오티드는 일부 적용에서 최적 이하일 수 있다, 가령, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드는 예로써, 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽다. 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 하지만, 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형은 향상된 성질을 공여할 수 있고, 그리고 예로써, 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제에 대해 더욱 안정하도록 만들 수 있다.
올리고뉴클레오티드가 아단위 또는 단위체의 중합체이기 때문에, 하기에 기술된 많은 변형, 예를 들면, 염기, 당, 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-가교 산소의 변형은 올리고뉴클레오티드 내에서 반복되는 위치에서 일어날 수 있다. 소정의 올리고뉴클레오티드 내에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 그리고 실제로, 앞서 언급된 변형 중에서 한 가지 이상이 단일 올리고뉴클레오티드 내에, 또는 심지어, 올리고뉴클레오티드 내에서 단일 뉴클레오시드에 함입 (incorporation)될 수 있다.
일부 경우에, 변형은 올리고뉴클레오티드 내에서 모든 개별 위치에서 일어나지만, 많은 경우에, 그리고 실제로 대부분의 경우에, 그렇지 않을 것이다. 실례로써, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어나거나, 내부 영역 내에서만 일어나거나, 말단 영역 내에서, 예를 들면, 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 올리고뉴클레오티드의 최종 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드 내에서 위치에서만 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다.
변형은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 이중 가닥 영역에서만 일어나거나, 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 가령, 비-가교 산소 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 일어나거나, 말단 영역 내에서, 예를 들면, 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 가닥의 최종 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드 내에서 위치에서만 일어나거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역 내에서, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5' 단부(들)는 인산화될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 변형은 단독 변형, 또는 복수 뉴클레오티드 상에 포함된 단독 유형의 변형이거나, 또는 변형은 본 명세서에서 기술된 하나 또는 그 이상의 다른 변형과 합동될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 변형은 또한, 올리고뉴클레오티드 상에 함입될 수 있다, 가령, 올리고뉴클레오티드의 서로 다른 뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술된 상이한 변형을 갖는다.
일부 구체예에서, 예로써, 안전성을 증강시키기 위하여, 오버행 내에 특정 핵염기를 포함하거나, 또는 단일 가닥 오버행 내에, 예를 들면, 5' 또는 3' 오버행 내에, 또는 둘 모두에 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대용물을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 가령, 오버행 내에 퓨린 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 3' 또는 5' 오버행 내에 모든 또는 일부 염기는 예로써, 본 명세서에서 기술된 변형으로 변형될 것이다. 변형에는 예로써, 리보오스 당의 2' OH 기에서 변형의 이용, 예를 들면, 리보뉴클레오티드 대신에 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들면, 데옥시티미딘의 이용, 그리고 포스페이트 기에서 변형, 예를 들면, 포스포티오에이트 변형이 포함될 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성 (homologous)일 필요가 없다.
특정한 변형은 하기에 더욱 상세하게 논의된다.
포스페이트 기
포스페이트 기는 음으로 하전된 핵종 (negatively charged species)이다. 전하 (charge)는 2개의 비-가교 산소 원자 위에 균등하게 분배된다. 하지만, 포스페이트 기는 산소 중의 하나를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. RNA 포스페이트 중추에 대한 이러한 변형의 한 가지 결과는 핵분해 붕괴 (nucleolytic breakdown)에 대한 올리고리보뉴클레오티드의 증가된 내성일 수 있다. 따라서 이론에 한정됨 없이, 일부 구체예에서, 하전되지 않은 링커, 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 유발하는 변경을 도입하는데 바람직할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 실례에는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르가 포함된다. 일정한 구체예에서, 포스페이트 중추 모이어티 내에서 비-가교 포스페이트 산소 원자 중의 하나는 아래 중에서 하나에 의해 대체될 수 있다: S, Se, BR3 (R은 수소, 알킬, 아릴), C (즉, 알킬 기, 아릴 기 등), H, NR2 (R은 수소, 알킬, 아릴), 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴). 변형되지 않은 포스페이트 기 내에서 인 원자는 비키랄성이다. 하지만, 상기 원자 또는 원자 그룹 중에서 하나로 비-가교 산소 중에서 하나의 대체는 인 원자를 키랄성으로 만든다; 다시 말하면, 이러한 방식으로 변형된 포스페이트 기 내에서 인 원자는 입체 중심 (stereogenic center)이다. 입체 인 원자는 "R" 배열 (본 명세서에서, Rp) 또는 "S" 배열 (본 명세서에서, Sp)을 보유할 수 있다.
포스포로디티오에이트는 양쪽 비-가교 산소가 황으로 대체된다. 포스포로디티오에이트 내에서 인 중심은 올리고리보뉴클레오티드 부분입체이성질체의 형성을 배제시키는 비키랄성이다. 따라서 이론에 한정됨 없이, 키랄 중심 (chiral center)을 제거하는 양쪽 비-가교 산소에 대한 변형, 예를 들면, 포스포로디티오에이트 형성은 그들이 부분입체이성질체 혼합물을 생산할 수 없다는 점에서, 바람직할 수 있다. 따라서 이들 비-가교 산소는 독립적으로, S, Se, B, C, H, N, 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴) 중에서 한 가지일 수 있다.
포스페이트 링커는 또한, 질소 (가교된 포스포로아미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌포스포네이트)로 가교 산소 (즉, 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결시키는 산소)의 대체에 의해 변형될 수 있다. 이러한 대체는 어느 한쪽 연결 산소, 또는 양쪽 연결 산소에서 일어날 수 있다.
가교 산소가 뉴클레오시드의 3 '-산소일 때, 탄소로 대체가 바람직하다. 가교 산소가 뉴클레오시드의 5'-산소일 때, 질소로 대체가 바람직하다.
포스페이트 기의 대체
포스페이트 기는 비-인 보유 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 하전된 포스포디에스테르 기가 핵분해 감성 (nucleolytic degradation)에서 반응 중심이기 때문에, 중성 구조 모방체로 이의 대체는 증강된 뉴클레아제 안전성을 부여할 것으로 생각된다. 다시 한 번, 이론에 한정됨 없이, 일부 구체예에서, 하전된 포스페이트 기가 중성 모이어티에 의해 대체되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 실례에는 메틸 포스포네이트, 히드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥시드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노가 포함된다. 바람직한 대체에는 메틸렌카르보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노 기가 포함된다.
포스페이트에 연결된 산소 중에서 적어도 하나가 대체되거나, 또는 포스페이트 기가 비-인 기에 의해 대체되는 변형된 포스페이트 연쇄는 또한, "비-포스포디에스테르 중추 연쇄"로서 지칭된다.
리보포스페이트 중추의 대체
올리고뉴클레오티드- 모방 골격 역시 작제될 수 있는데, 여기서 포스페이트 링커 및 리보오스 당은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대용물에 의해 대체된다. 이론에 한정됨 없이, 반복적으로 하전된 중추의 부재는 다가 음이온을 인식하는 단백질 (가령, 뉴클레아제)에 대한 결합을 감소시키는 것으로 생각된다. 다시 한 번, 이론에 한정됨 없이, 일부 구체예에서, 염기가 중성 대용물 중추에 의해 속박되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 실례에는 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대용물이 포함된다. 바람직한 대용물은 PNA 대용물이다.
말단 변형
올리고뉴클레오티드의 3'와 5' 단부가 변형될 수 있다. 이런 변형은 분자의 3' 단부, 5' 단부 또는 양쪽 단부에 존재할 수 있다. 이들은 전체 말단 포스페이트, 또는 포스페이트 기의 원자 중에서 하나 또는 그 이상의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 가령, 올리고뉴클레오티드의 3'와 5' 단부는 다른 기능적 분자 실체, 예를 들면, 표지화 모이어티, 예를 들면, 형광단 (가령, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기 (예로써, 황, 실리콘, 붕소 또는 에스테르에 기초된)에 접합될 수 있다. 기능적 분자 실체는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통하여 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트 기의 연결 원자, 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기에 연결되거나 이를 대체할 수 있다. 대안으로, 링커는 뉴클레오티드 대용물 (가령, PNA)의 말단 원자에 연결되거나, 또는 이를 대체할 수 있다.
링커/포스페이트-기능성 분자 실체-링커/포스페이트 어레이가 dsRNA의 두 가닥 사이에 끼워 넣어질 때, 이러한 어레이는 헤어핀-유형 RNA 작용제에서 헤어핀 RNA 루프를 대체할 수 있다.
활성을 조절하는데 유용한 말단 변형에는 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로 5' 단부의 변형이 포함된다. 가령, 바람직한 구체예에서 dsRNA의 안티센스 가닥은 5' 인산화되거나, 또는 5' 최말단에서 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형에는 RISC 매개된 유전자 침묵과 양립하는 것들이 포함된다. 적절한 변형에는 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화되거나 비-메틸화됨) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡 (Appp), 그리고 임의의 변형된 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드 캡 구조 (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (H0)(HS)(S)P-0-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가의 조합 (가령, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트 (R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들면, RP(0H)(0)-0-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트 (R=알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들면, RP(0H)(0)-0-5'-)가 포함된다.
말단 변형은 또한, 분포를 모니터링하는데 유용할 수 있고, 그리고 이런 경우에, 추가되는 바람직한 기에는 형광단, 예를 들면, 플루오레세인 또는 Alexa 염료, 예를 들면, Alexa 488이 포함된다. 말단 변형은 또한, 흡수를 증강시키는데 유용할 수 있고, 이를 위하여 유용한 변형에는 콜레스테롤이 포함된다. 말단 변형은 또한, RNA 작용제를 다른 모이어티에 가교-연결하는데 유용할 수 있다; 이를 위하여 유용한 변형에는 마이토마이신 C가 포함된다.
핵염기
아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실은 RNA에서 가장 일반적으로 관찰되는 염기이다. 이들 염기는 향상된 성질을 갖는 RNA를 제공하기 위하여 변형되거나 대체될 수 있다. 가령, 뉴클레아제 내성 올리고리보뉴클레오티드는 이들 염기 또는 합성 및 자연 핵염기 (가령, 이노신, 티민, 산틴, 히폭산틴, 누불라린 (nubularine), 이소구아니신 (isoguanisine), 또는 투베르시딘 (tubercidine)), 그리고 상기 변형 중에서 임의의 한 가지로 제조될 수 있다. 대안으로, 상기 염기, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 "보기 드문 염기", "변형된 염기", "비-자연 염기" 및 "보편적 염기" 중에서 한 가지의 치환된 또는 변형된 유사체가 이용될 수 있다. 실례에는 제한 없이, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-트리플루오르메틸 및 기타 5-치환된 우라실과 시토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6과 0-6 치환된 퓨린, 예를 들면, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신, 디히드로우라실, 3-데아자-5-아자시토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 시토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-디메틸아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트리아졸, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3카르복시프로필)우라실, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N4-아세틸 시토신, 2-티오시토신, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, N-메틸구아닌, 또는 O-알킬화된 염기가 포함된다. 추가의 퓨린 및 피리미딘에는 U.S. Pat. No. 3,687,808에서 개시된 것들, Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에서 개시된 것들, 그리고 Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에서 개시된 것들이 포함된다.
양이온성 기
올리고뉴클레오티드에 대한 변형에는 또한, 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 중추 모이어티의 당, 염기, 및/또는 인 원자에 하나 또는 그 이상의 양이온성 기의 부착이 포함될 수 있다. 양이온성 기는 자연, 보기 드문 또는 보편적 염기 상에서 치환될 수 있는 임의의 원자에 부착될 수 있다. 바람직한 위치는 혼성화를 간섭하지 않는, 다시 말하면, 염기 대합에 요구되는 수소 결합 상호작용을 간섭하지 않는 위치이다. 양이온성 기는 예로써, 환형 또는 비환형 당 대용물에서 당 또는 유사한 위치의 C2' 위치를 통하여 부착될 수 있다. 양이온성 기에는 예로써, 0-아민 (아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노알콕시, 예를 들면, 0(CH2)n아민 (가령, 아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노 (가령, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 또는 NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민 (아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노)로부터 유래되는 양성자화된 아미노 기가 포함될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 내에 배치
일부 변형은 바람직하게는, 특정 위치에서, 예를 들면, 가닥의 내부 위치에서, 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 단부에서 올리고뉴클레오티드 상에 포함될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 상에서 변형의 바람직한 위치는 작용제에 바람직한 성질을 공여할 수 있다. 가령, 특정 변형의 바람직한 위치는 최적 유전자 침묵 성질, 또는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성에 대한 증가된 내성을 공여할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 2'-5' 연쇄를 보유할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 반전 연쇄 (inverted linkage), 예를 들면, 3'-3', 5'-5', 2'-2' 또는 2'-3' 연쇄를 보유할 수도 있다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 5'-우리딘-아데닌-3' (5'-UA-3') 디뉴클레오티드, 여기서 우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-우리딘-구아닌-3' (5'-UG-3') 디뉴클레오티드, 여기서 5'-우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-시티딘-아데닌-3' (5'-CA-3') 디뉴클레오티드, 여기서 5'-시티딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-우리딘-우리딘-3' (5'-UU-3') 디뉴클레오티드, 여기서 5'-우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-시티딘-시티딘-3' (5'-CC-3') 디뉴클레오티드, 여기서 5'-시티딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-시티딘-우리딘-3' (5'-CU-3') 디뉴클레오티드, 여기서 5'-시티딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이고, 또는 말단 5'-우리딘-시티딘-3' (5'-UC-3') 디뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 5'-우리딘은 2'-변형된 뉴클레오티드이다. 이들 변형을 보유하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제 활성에 대하여 특히 안정화된다.
일반적인 참고문헌
본 발명에 따라서 이용되는 올리고리보뉴클레오티드 및 올리고리보뉴클레오시드는 고형 상 합성 (solid phase synthesis)에 의해 합성될 수 있다 (참조: Oligonucleotide synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (특히, Chapter 1, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, Chapter 2, Oligoribonucleotide synthesis, Chapter 3,2'-O-Methyloligoribonucleotide-s: synthesis and applications, Chapter 4, Phosphorothioate oligonucleotides, Chapter 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, Chapter 6, Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside methylphosphonates, 그리고. Chapter 7, Oligodeoxynucleotides containing modified bases). 다른 특히 유용한 합성 절차, 시약, 차단 기 및 반응 조건은 Martin, P., HeIv. CMm. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 및 Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, 또는 이들에서 인용된 참고문헌에서 기술된다. WO 00/44895, WO01/75164, 또는 WO02/44321에서 기술된 변형이 본 발명에서 이용될 수 있다. 본 명세서에 열거된 모든 간행물, 특허, 그리고 공개된 특허 출원의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.
포스페이트 기 참고문헌
포스피네이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 5,508,270에서 기술된다. 알킬 포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 4,469,863에서 기술된다. 포스포르아미디트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 5,256,775 또는 U.S. Pat. No. 5,366,878에서 기술된다. 포스포트리에스테르 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 5,023,243에서 기술된다. 보라노 포스페이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 5,130,302 및 5,177,198에서 기술된다. 3'-데옥시-3'-아미노 포스포르아미데이트 올리고리보뉴클레오티드의 제조는 U.S. Pat. No. 5,476,925에서 기술된다. 3'-데옥시-3'-메틸렌포스포네이트 올리고리보뉴클레오티드는 An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801에서 기술된다. 황 가교된 뉴클레오티드의 제조는 Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651 및 Crosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693에서 기술된다.
당 기 참고문헌
2' 변형에 대한 변형은 Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 및 여기에 인용된 모든 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 리보오스에 대한 특정한 변형은 아래의 참고문헌: 2'-플루오르 (Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841), 2'-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA" (Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310)에서 찾아볼 수 있다.
포스페이트 기의 대체 참고문헌
본 명세서에서 MMI 연결된 올리고리보뉴클레오시드로서 확인되는 메틸렌메틸이미노 연결된 올리고리보뉴클레오시드, 본 명세서에서 MDH 연결된 올리고리보뉴클레오시드로서 확인되는 메틸렌디메틸히드라조 연결된 올리고리보뉴클레오시드, 그리고 본 명세서에서 아미드-3 연결된 올리고리보뉴클레오시드로서 확인되는 메틸렌카르보닐아미노 연결된 올리고뉴클레오시드, 그리고 본 명세서에서 아미드-4 연결된 올리고리보뉴클레오시드로서 확인되는 메틸렌아미노카르보닐 연결된 올리고뉴클레오시드, 그리고 예로써, 교대되는 MMI 및 PO 또는 PS 연쇄를 보유하는 혼성 중추 화합물은 U.S. Pat. No. 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 그리고 공개된 PCT application PCT/US92/04294 및 PCT/US92/04305 (각각, WO 92/20822 및 WO 92/20823로서 공개됨)에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결된 올리고리보뉴클레오시드는 U.S. Pat. No. 5,264,562 및 5,264,564에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 에틸렌 옥시드 연결된 올리고리보뉴클레오시드는 U.S. Pat. No. 5,223,618에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 실록산 대체는 CormierJ.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583에서 기술된다. 카보네이트 대체는 Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933에서 기술된다. 카르복시메틸 대체는 Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991에서 기술된다. 카르바메이트 대체는 Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129에서 기술된다.
포스페이트-리보오스 중추의 대체 참고문헌
시클로부틸 당 대용물 화합물은 U.S. Pat. No. 5,359,044에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 피롤리딘 당 대용물은 U.S. Pat. No. 5,519,134에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 모르폴리노 당 대용은 U.S. Pat. No. 5,142,047 및 5,235,033, 그리고 다른 관련된 특허 공보에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 펩티드 핵산 (PNA)은 그 자체로 공지되어 있고 Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23에서 언급된 임의의 다양한 절차에 따라서 제조될 수 있다. 이들은 또한, U.S. Pat. No. 5,539,083에 따라서 제조될 수 있다.
말단 변형 참고문헌
말단 변형은 Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002) 및 여기에 언급된 참고문헌에서 기술된다.
핵염기 참고문헌
N-2 치환된 퓨린 뉴클레오시드 아미디트는 U.S. Pat. No. 5,459,255에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 3-데아자 퓨린 뉴클레오시드 아미디트는 U.S. Pat. No. 5,457,191에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 5,6-치환된 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트는 U.S. Pat. No. 5,614,617에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 5-프로피닐 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트는 U.S. Pat. No. 5,484,908에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
링커
용어 "링커"는 화합물의 두 부분을 연결하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로, 직접 결합, 또는 원자, 예를 들면, 산소 또는 황, 단위, 예를 들면, NR1, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자의 사슬, 예를 들면, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 치환된 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환된 또는 치환되지 않은 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시클릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤테로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알키닐헤테로시클릴알케닐, 알키닐헤테로시클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R1)2, C(O), 절단가능 연결 기, 치환된 또는 치환되지 않은 아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 치환된 또는 치환되지 않은 헤테로환형이 중간에 끼어들거나, 또는 이들에 의해 종결되고; 여기서 R1은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다.
한 구체예에서, 링커는 -[(P-Q-R)q-X-(P'-Q'-R')q' ]q''-T-이고, 여기서: P, R, T, P', R' 및 T는 각 경우에, 각각 독립적으로 부재하거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, CH2O; NHCH(Ra)C(0), -C(0)-CH(Ra)-, NH-, CH=N-O,
Figure 112021005370664-pat00015
,
Figure 112021005370664-pat00016
,
Figure 112021005370664-pat00017
,
Figure 112021005370664-pat00018
Figure 112021005370664-pat00019
, 또는 헤테로시클릴이고;
Q와 Q'는 각 경우에, 각각 독립적으로 부재하거나, -(CH2)n-, -C(R1)(R2)(CH2)n-, -(CH2)nC(R1)(R2)-, -(CH2CH2O)mCH2CH2-, 또는 -(CH2CH2O)mCH2CH2NH-이고;
X는 부재하거나, 또는 절단가능 연결 기이고;
Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이고;
R1과 R2는 각 경우에, 각각 독립적으로 H, CH3, OH, SH 또는 N(RN)2이고;
RN은 각 경우에 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 또는 벤질이고;
q, q'와 q"는 각 경우에, 각각 독립적으로 0-20이고, 그리고 여기서 반복 단위 (repeating unit)는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 각 경우에 독립적으로 1-20이고; 그리고
m은 각 경우에 독립적으로 0-50이다.
한 구체예에서, 링커는 적어도 하나의 절단가능 연결 기를 포함한다.
일정한 구체예에서, 링커는 분지된 링커이다. 분지된 링커의 분기점 (branchpoint)은 적어도 3가 (trivalent)이지만, 4가 (tetravalent), 5가 (pentavalent) 또는 6가 (hexavalent) 원자, 또는 이런 복수 결합가 (multiple valency)를 나타내는 기일 수 있다. 일정한 구체예에서, 분기점은 -N, -N(Q)-C, -O-C, -S-C, -SS-C, -C(O)N(Q)-C, -OC(O)N(Q)-C, -N(Q)C(O)-C, 또는 -N(Q)C(O)O-C이고; 여기서 Q는 각 경우에 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 다른 구체예에서, 분기점은 글리세롤 또는 글리세롤 유도체이다.
절단가능 연결 기
절단가능 연결 기는 세포 외부에서 충분히 안정하지만, 표적 세포 내로 진입 시에 절단되어 링커에 의해 서로 묶여 있는 두 부분을 방출한다. 바람직한 구체예에서, 절단가능 연결 기는 개체의 혈액 내에서 또는 두 번째 기준 조건 (second reference condition) (이는 예로써, 혈액 또는 혈청 내에서 관찰되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있다) 하에서보다 표적 세포 내에서 또는 첫 번째 기준 조건 (first reference condition) (이는 예로써, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있다) 하에서 적어도 10배 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 100 배 빨리 절단된다.
절단가능 연결 기는 절단 작용제, 예를 들면, pH, 산화환원 전위 (redox potential), 또는 감성 분자 (degradative molecule)의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단 작용제는 혈청 또는 혈액 내에서보다 세포 내에서 더욱 우세하거나, 또는 더욱 높은 수준 또는 활성으로 관찰된다. 이런 감성 작용제의 실례에는 특정 기질에 대하여 선택되거나, 또는 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원 작용제, 예를 들면, 산화 또는 환원 효소 또는 환원 작용제, 예를 들면, 환원에 의해 산화환원 절단가능 연결 기를 붕괴시킬 수 있는, 세포 내에 존재하는 메르캅탄 (mercaptan); 에스테라아제; 엔도솜 (endosome), 또는 산성 환경을 유발할 수 있는 작용제, 예를 들면, 5 또는 그 이하의 pH를 발생시키는 것들; 일반 산 (general acid)으로 기능함으로써 산 절단가능 연결 기를 파괴하거나 붕괴시킬 수 있는 효소, 펩티다아제 (이는 기질 특이적일 수 있다); 그리고 포스파타아제가 포함된다.
절단가능 연쇄 기, 예를 들면, 이황화 결합은 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면, 평균 세포내 pH는 이보다 약간 낮은 대략 7.1-7.3 범위이다. 엔도솜은 5.5-6.0 범위의 더욱 강한 산성 pH를 갖고, 그리고 리소좀은 대략 5.0의 훨씬 강한 산성 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되고, 따라서 세포 내부에서 리간드로부터, 또는 세포의 원하는 구획 내로 양이온성 지질을 방출하는 절단가능 연결 기를 보유할 것이다.
링커는 특정 효소에 의해 절단가능한 절단가능 연결 기를 보유할 수 있다. 링커 내로 함입되는 절단가능 연결 기의 유형은 표적화되는 세포에 좌우될 수 있다. 가령, 간 표적화 리간드는 에스테르 기를 보유하는 링커를 통하여 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라아제가 풍부하고, 이런 이유로 링커는 에스테라아제-풍부하지 않은 세포 유형에서보다 간 세포에서 더욱 효과적으로 절단될 수 있다. 에스테라아제가 풍부한 다른 세포-유형에는 폐, 신 피질 (renal cortex), 그리고 고환의 세포가 포함된다.
펩티드 결합을 보유하는 링커는 펩티다아제가 풍부한 세포 유형, 예를 들면, 간 세포 및 윤활막세포 (synoviocyte)를 표적으로 할 때, 이용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단가능 연결 기의 적합성은 후보 연결 기를 절단하는 감성 작용제 (또는 조건)의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 또한, 혈액 내에서 또는 다른 비-표적 조직과 접촉될 때, 절단에 저항하는 능력에 대하여 후보 절단가능 연결 기를 조사하는 것이 바람직할 것이다. 따라서 첫 번째 및 두 번째 조건 사이에 절단에 대한 상대적 감수성을 결정할 수 있는데, 여기서 첫 번째 조건은 표적 세포 내에서 절단을 나타내도록 선택되고, 그리고 두 번째 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들면, 혈액 또는 혈청 내에서 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 세포 없는 시스템에서, 세포에서, 세포 배양액에서, 장기 또는 조직 배양액에서, 또는 완전 동물에서 실행될 수 있다. 세포-없는 또는 배양 조건에서 평가를 수행하고 완전 동물에서 추가 평가로 확증하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건)에서와 비교하여 세포 내에서 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에) 적어도 2, 4, 10 또는 100배 빨리 절단된다.
산화환원 절단가능 연결 기
한 부류의 절단가능 연결 기는 환원 또는 산화 시에 절단되는 산화환원 절단가능 연결 기이다. 환원적으로 절단가능 연결 기의 실례는 디설피드 연결 기 (-S-S-)이다.
후보 절단가능 연결 기가 적합한 "환원적으로 절단가능 연결 기"인 지, 또는 예로써, 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화 작용제와 함께 이용하기 적합한 지를 결정하기 위하여, 본 명세서에서 기술된 방법을 주목할 수 있다. 가령, 후보는 세포, 예를 들면, 표적 세포 내에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당분야에 공지된 시약을 이용하여 디티오트레이톨 (DTT), 또는 다른 환원제 (reducing agent)와 함께 배양함으로써 평가될 수 있다. 후보는 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택되는 조건 하에 평가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 후보 화합물은 혈액 내에서 많아야 10% 절단된다. 바람직한 구체예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건)에서와 비교하여 세포 내에서 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에) 적어도 2, 4, 10 또는 100배 빨리 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 매체를 모방하도록 선택된 조건 하에 표준 효소 동역학 분석평가를 이용하여 결정되고 세포외 매체를 모방하도록 선택된 조건과 비교될 수 있다.
포스페이트-기초된 절단가능 연결 기
포스페이트-기초된 절단가능 연결 기는 포스페이트 기를 붕괴시키거나 가수분해하는 작용제에 의해 절단된다. 세포 내에서 포스페이트 기를 절단하는 작용제의 실례는 세포 내에서 효소, 예를 들면, 포스파타아제이다. 포스페이트-기초된 연결 기의 실례는 -0-P(O)(ORk)-O-, -0-P(S)(ORk)-O-, -0-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -0-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -0-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -0-P(O)(Rk)-O-, -0-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 바람직한 구체예는 -0-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -0-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -0-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -0-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -0-P(O)(H)-O-, -0-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -0-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 구체예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보는 앞서 기술된 것들과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
산 절단가능 연결 기
산 절단가능 연결 기는 산성 조건 하에 절단되는 연결 기이다. 바람직한 구체예에서, 산 절단가능 연결 기는 대략 6.5 또는 그 이하 (가령, 대략 6.0, 5.5, 5.0, 또는 그 이하)의 pH로, 또는 일반 산으로서 기능할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 산성 환경에서 절단된다. 세포 내에서, 특정한 낮은 pH 세포소기관, 예를 들면, 엔도솜 및 리소좀은 산 절단가능 연결 기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단가능 연결 기의 실례에는 히드라존, 에스테르, 그리고 아미노산의 에스테르가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 산 절단가능 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 구체예는 탄소가 에스테르의 산소 (알콕시 기)에 부착될 때, 아릴 기, 치환된 알킬 기, 또는 삼차 알킬 기, 예를 들면, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸이다. 이들 후보는 앞서 기술된 것들과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
에스테르-기초된 연결 기
에스테르-기초된 절단가능 연결 기는 세포 내에서 효소, 예를 들면, 에스테라아제 및 아미다아제에 의해 절단된다. 에스테르-기초된 절단가능 연결 기의 실례에는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 에스테르 절단가능 연결 기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보는 앞서 기술된 것들과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
펩티드-기초된 절단 기
펩티드-기초된 절단가능 연결 기는 세포 내에서 효소, 예를 들면, 펩티다아제 및 프로테아제에 의해 절단된다. 펩티드-기초된 절단가능 연결 기는 아미노산 간에 형성되어 올리고펩티드 (가령, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 산출하는 펩티드 결합이다. 펩티드-기초된 절단가능 기에는 아미드 기 (-C(O)NH-)가 포함되지 않는다. 아미드 기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 아미노산 간에 형성되어 펩티드 및 단백질을 산출하는 특수한 유형의 아미드 결합이다. 펩티드 기초된 절단 기는 일반적으로, 펩티드 및 단백질을 산출하는 아미노산 간에 형성된 펩티드 결합 (즉, 아미드 결합)에 한정되고 전체 아미드 기능기가 포함되지는 않는다. 펩티드-기초된 절단가능 연결 기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서 RA와 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 기이다. 이들 후보는 앞서 기술된 것들과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
리간드
매우 다양한 실체가 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 지질에 결합될 수 있다. 바람직한 모이어티는 리간드인데, 이들은 바람직하게는, 직접적으로 또는 개재성 속박 사슬 (intervening tether)에 의해 간접적으로 공유 결합된다.
바람직한 구체예에서, 리간드는 자신이 함입되는 분자의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 바람직한 구체예에서, 리간드는 예로써, 이런 리간드가 부재하는 종류와 비교하여, 선별된 표적, 예를 들면, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들면, 세포 또는 장기 구획, 조직, 장기 또는 신체 영역에 대한 증강된 친화성을 제공한다. 선별된 표적에 대한 증강된 친화성을 제공하는 리간드는 또한, 표적화 리간드로 불린다. 본 발명의 지질에 접합을 위한 바람직한 리간드는 표적화 리간드이다.
일부 리간드는 엔도솜붕괴 (endosomolytic) 성질을 가질 수 있다. 엔도솜붕괴 리간드는 엔도솜의 용해 (lysis) 및/또는 엔도솜에서 세포의 세포질로 본 발명의 조성물, 또는 이의 성분의 수송을 촉진한다. 엔도솜붕괴 리간드는 pH-의존성 막 활성 및 융합성 (fusogenicity)을 나타내는 다가 음이온성 펩티드 또는 펩티드모방체 (peptidomimetic)일 수 있다. 일정한 구체예에서, 엔도솜붕괴 리간드는 엔도솜 pH에서 활성 형태를 취한다. "활성" 형태는 엔도솜붕괴 리간드가 엔도솜의 용해 (lysis) 및/또는 엔도솜에서 세포의 세포질로 본 발명의 조성물, 또는 이의 성분의 수송을 촉진하는 형태이다. 예시적인 엔도솜붕괴 리간드에는 GALA 펩티드 (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA 펩티드 (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586), 그리고 이들의 유도체 (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68)가 포함된다. 일정한 구체예에서, 엔도솜붕괴 성분은 pH에서 변화에 응하여 전하 또는 양성자화에서 변화를 겪는 화학 기 (가령, 아미노산)를 보유할 수 있다. 엔도솜붕괴 성분은 선형 또는 분지형일 수 있다. 펩티드 기초된 엔도솜붕괴 리간드의 예시적인 일차 서열은 표 5에 제시된다.
[표 5]
Figure 112021005370664-pat00020
참고문헌
1 Subbarao et al, Biochemistry, 1987, 26 2964-2972.
2 Vogel et al, J Am Chem Soc, 1996, 118 1581-1586.
3 Turk, M J, Reddy, J A et al (2002) Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs Biochim Biophys Acta 1559, 56-68.
4 Plank, C Oberhauser, B Mechtler, K Koch, C Wagner, E (1994) The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems, J Biol Chem 269 1291812924.
5 Mastrobattista, E, Koning, G A et al (2002) Functional characterization of an endosome-disruptive peptide and its application in cytosolic delivery of immunoliposome-entrapped proteins. J. Biol. Chem 277, 27135-43.
6 Oberhauser, B, Plank, C et al (1995) Enhancing endosomal exit of nucleic acids using pH-sensitive viral fusion peptides Deliv. Strategies Antisense Oligonucleotide Ther. 247-66
바람직한 리간드는 수송, 혼성화, 그리고 특이성 성질을 향상시킬 수 있고, 또한 결과의 자연 또는 변형된 올리고리보뉴클레오티드, 또는 본 명세서에서 기술된 단위체 및/또는 자연 또는 변형된 리보뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함하는 중합성 분자의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수도 있다.
리간드에는 일반적으로, 예로써, 흡수를 증강시키기 위한 치료적 변경자; 예로써, 분포를 모니터링하기 위한 진단 화합물 또는 리포터 기; 가교-연결제 (cross-linking agent); 그리고 뉴클레아제-내성 공여 모이어티가 포함될 수 있다. 일반적인 실례에는 지질, 스테로이드, 비타민, 당, 단백질, 펩티드, 폴리아민, 그리고 펩티드 모방체가 포함된다.
리간드에는 자연 발생 물질, 예를 들면, 단백질 (가령, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지단백질 (LDL), 고밀도 지단백질 (HDL), 또는 글로불린); 탄수화물 (가령, 덱스트란, 풀룰란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질이 포함될 수 있다. 리간드는 또한, 재조합 또는 합성 분자, 예를 들면, 합성 중합체, 예를 들면, 합성 폴리아미노산, 올리고뉴클레오티드 (가령, 압타머)일 수도 있다. 폴리아미노산의 실례에는 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루타민산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴릴비닐 알코올 (PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진이 포함된다. 폴리아민의 실례에는 폴리에틸렌이민, 폴리 리신 (PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드모방체 폴리아민, 덴드리머 (dendrimer) 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 사차 염 (quaternary salt), 또는 알파 나선 펩티드가 포함된다.
리간드에는 또한, 표적화 기, 예를 들면, 세포 또는 조직 표적화 작용제, 예를 들면, 레시틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들면, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체가 포함될 수 있다. 표적화 기는 갑상선 자극 호르몬 (thyrotropin), 멜라노트로핀 (melanotropin), 레시틴, 당단백질, 계면활성 단백질 A, 점액소 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 당화된 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴산염, 비타민 B12, 비오틴, RGD 펩티드, RGD 펩티드 모방체 또는 압타머일 수 있다. 표 6에서는 표적화 리간드 및 그들의 연관된 수용체의 일부 실례를 제시한다.
[표 6]
표적화 리간드 및 그들의 연관된 수용체
Figure 112021005370664-pat00021
리간드의 다른 실례에는 염료, 삽입성 물질 (intercalating agent) (가령, 아크리딘), 가교-링커 (가령, 프소랄렌, 마이토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다중환형 방향족 탄화수소 (가령, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 (가령, EDTA), 친유성 분자, 예를 들면, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 (geranyloxyhexyl) 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜란산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체 (가령, 안테나페디아 (antennapedia) 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG (가령, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지된 마커, 효소, 합텐 (가령, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (가령, 아스파린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제 (가령, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클 (tetraazamacrocycle)의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP가 포함된다.
리간드는 단백질, 예를 들면, 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들면, 보조-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들면, 특수한 세포 유형, 예를 들면, 암 세포, 내피 세포, 또는 골 세포에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드에는 또한, 호르몬 및 호르몬 수용체가 포함될 수도 있다. 이들에는 또한, 비-펩티드 종류, 예를 들면, 지질, 레시틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 또는 압타머가 포함될 수 있다. 리간드는 예로써, 리포다당류, p38 MAP 키나아제의 활성제, 또는 NF-κB의 활성제일 수 있다.
리간드는 예로써, 세포의 세포뼈대 (cytoskeleton)를 파괴함으로써, 예를 들면, 세포의 미세소관 (microtubule), 미세섬유 (microfilament), 및/또는 중간 섬유 (intermediate filament)를 파괴함으로써 iRNA 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 임의의 물질, 예를 들면, 약제일 수 있다. 상기 약제는 예로써, 탁솔 (taxol), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시토칼라신, 노코다졸, 자스플라키노라이드 (jasplakinolide), 라트룬쿨린 (latrunculin) A, 팔로이딘 (phalloidin), 스윈홀리드 (swinholide) A, 인다노신 (indanocine), 또는 미오세르빈 (myoservin)일 수 있다.
리간드는 예로써, 염증 반응을 활성화시킴으로써 iRNA 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이런 효과를 가지는 예시적인 리간드에는 종양 괴사 인자 알파 (TNF알파), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론이 포함된다.
한 측면에서, 리간드는 지질 또는 지질-기초된 분자이다. 이런 지질 또는 지질-기초된 분자는 바람직하게는, 혈청 단백질, 예를 들면, 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들면, 신체의 비-신장 표적 조직에 접합체의 분포를 가능하게 한다. 가령, 표적 조직은 간의 실질 세포 (parenchymal cell)를 비롯한 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자 역시 리간드로서 이용될 수 있다. 가령, 네프록신 또는 아스피린이 이용될 수 있다. 지질 또는 지질-기초된 리간드는 (a) 접합체의 붕괴에 대한 내성을 증가시키고, (b) 표적화, 또는 표적 세포 또는 세포 막 내로 수송을 증가시키고, 및/또는 (c) 혈청 단백질, 예를 들면, HSA에 결합을 조정하는데 이용될 수 있다.
지질 기초된 리간드는 표적 조직에 접합체의 결합을 조정, 예를 들면, 제어하는데 이용될 수 있다. 가령, HSA에 더욱 강하게 결합하는 지질 또는 지질-기초된 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 더욱 낮고, 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 더욱 낮을 것이다. HSA에 더욱 약하게 결합하는 지질 또는 지질-기초된 리간드는 접합체를 신장으로 표적화시키는데 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 지질 기초된 리간드는 HSA에 결합한다. 바람직하게는, 이것은 접합체가 가급적, 비-신장 조직으로 분포될 만큼 충분한 친화성으로 HSA에 결합한다. 하지만, 친화성은 HSA-리간드 결합이 반전될 수 없을 만큼 강하지 않도록 하는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 구체예에서, 지질 기초된 리간드는 접합체가 가급적, 신장으로 분포되도록 HSA에 약하게 결합하거나 결합하지 않는다. 신장 세포를 표적으로 하는 다른 모이어티 역시 지질 기초된 리간드 대신에, 또는 지질 기초된 리간드에 더하여 이용될 수 있다.
다른 측면에서, 리간드는 모이어티, 예를 들면, 표적 세포, 예를 들면, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 예로써, 악성 또는 비-악성 유형, 예를 들면, 암 세포의 원치 않는 세포 증식으로 특징되는 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 예시적인 비타민에는 비타민 A, E, 그리고 K가 포함된다. 다른 예시적인 비타민에는 B 비타민, 예를 들면, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살, 또는 암 세포에 의해 흡수되는 기타 비타민 또는 영양소가 포함된다. 또한, HAS, 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)이 포함된다.
다른 측면에서, 리간드는 세포-침투제 (cell-permeation agent), 바람직하게는 나선 세포-침투제이다. 바람직하게는, 상기 작용제는 친양쪽성이다. 예시적인 작용제는 펩티드, 예를 들면, tat 또는 안테나페디아이다. 작용제가 펩티드이면, 이는 펩티드모방체, 반전체 (invertomer), 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 연쇄, 그리고 D-아미노산의 이용을 비롯하여 변형될 수 있다. 이러한 나선 작용제는 바람직하게는, 알파-나선 작용제이고, 이는 바람직하게는, 친유성 (lipophilic) 및 소유성 (lipophobic) 상을 보유한다.
리간드는 펩티드 또는 펩티드모방체일 수 있다. 펩티드모방체 (본 명세서에서, 올리고펩티드모방체)는 자연 펩티드와 유사한 규정된 3-차원 구조로 접힘될 수 있는 분자이다. 펩티드 또는 펩티드모방체 모이어티는 대략 5-50개 아미노산 길이, 예를 들면, 대략 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이를 가질 수 있다 (예로써, 표 7 참조).
[표 7]
Figure 112021005370664-pat00022
펩티드 또는 펩티드모방체는 예로써, 세포 침투 펩티드, 양이온성 펩티드, 친양쪽성 펩티드, 또는 소수성 펩티드 (가령, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 속박된 펩티드 또는 가교 연결된 펩티드일 수 있다. 다른 대안에서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전위 서열 (MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-포함 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체 (가령, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP) 역시 표적화 모이어티일 수 있다. 펩티드 모이어티는 세포 막을 가로질러 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 그리고 단백질을 비롯한 큰 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 가령, HIV Tat 단백질 (GRKKRRQRRRPPQ) 및 드라소필라 안테나페디아 (Drosophila Antennapedia) 단백질 (RQIKIWFQNRRMKWKK)로부터 서열은 전달 펩티드로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩티드 또는 펩티드모방체, 예를 들면, 파지-전시 라이브러리 (phage-display library)로부터 확인된 펩티드, 또는 일-비드-일-화합물 (one-bead-one-compound, OBOC) 조합 라이브러리 (combinatorial library)는 무작위 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있다 (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). 바람직하게는, 함입된 단위체 단위에 의해 iRNA 작용제에 속박된 펩티드 또는 펩티드모방체는 세포 표적화 펩티드, 예를 들면, 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)-펩티드, 또는 RGD 모방체이다. 펩티드 모이어티는 대략 5개 아미노산 내지 대략 40개 아미노산 범위의 길이를 가질 수 있다. 펩티드 모이어티는 예로써, 안전성을 증가시키거나, 또는 형태적 성질을 관리하기 위하여 구조 변형을 보유할 수 있다. 하기에 기술된 임의의 구조 변형이 이용될 수 있다.
RGD 펩티드 모이어티는 종양 세포, 예를 들면, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적으로 하는데 이용될 수 있다 (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD 펩티드는 폐, 신장, 비장, 또는 간을 비롯한 다양한 다른 조직의 종양으로 iRNA 작용제의 표적화를 촉진할 수 있다 (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). 바람직하게는, RGD 펩티드는 신장으로 iRNA 작용제의 표적화를 촉진할 것이다. RGD 펩티드는 선형 또는 환형일 수 있고, 그리고 특정한 조직으로 표적화를 촉진하기 위하여 변형, 예를 들면, 당화 또는 메틸화될 수 있다. 가령, 당화된 RGD 펩티드는 率B3을 발현하는 종양 세포로 iRNA 작용제를 전달할 수 있다 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
증식 세포가 농축된 마커를 표적으로 하는 펩티드가 이용될 수 있다. 가령, RGD 포함 펩티드 및 펩티드모방체는 암 세포, 특히 αvβ3 인테그린을 나타내는 세포를 표적으로 할 수 있다. 따라서 RGD 펩티드, RGD를 포함하는 환형 펩티드, D-아미노산을 보유하는 RGD 펩티드, 그리고 합성 RGD 모방체가 이용될 수 있다. RGD 이외에, αvβ3 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 모이어티가 이용될 수 있다. 일반적으로, 이런 리간드는 증식 세포 및 혈관신생 (angiogeneis)을 제어하는데 이용될 수 있다. 이러한 유형의 리간드의 바람직한 접합체는 PECAM-1, VEGF, 또는 기타 암 유전자, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 암 유전자를 표적으로 한다.
"세포 침투 펩티드"는 세포, 예를 들면, 미생물 세포, 예를 들면, 세균 또는 진균류 세포, 또는 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포를 침투할 수 있다. 미생물 세포-침투 펩티드는 예로써, α-나선 선형 펩티드 (가령, LL-37 또는 Ceropin P1), 이황화 결합-보유 펩티드 (가령, α-디펜신 (defensin), β-디펜신 또는 박테네신 (bactenecin)), 또는 단지 1개 또는 2개의 지배적 아미노산을 보유하는 펩티드 (가령, PR-39 또는 인돌리시딘 (indolicidin))일 수 있다. 세포 침투 펩티드는 또한, 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS)를 보유할 수 있다. 가령, 세포 침투 펩티드는 2부분 (bipartite) 친양쪽성 펩티드, 예를 들면, HIV-1 gp41 및 SV40 큰 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래되는 MPG일 수 있다 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
한 구체예에서, iRNA 작용제 및/또는 담체 소중합체에 속박되는 표적화 펩티드는 친양쪽성 α-나선 펩티드일 수 있다. 예시적인 친양쪽성 α-나선 펩티드에는 세크로핀 (cecropin), 리코톡신 (lycotoxin), 파라닥신 (paradaxin), 부포린 (buforin), CPF, 봄비닌 (bombinin)-유사 펩티드 (BLP), 카텔리시딘 (cathelicidin), 세라토톡신 (ceratotoxin), 미더덕 (S. clava) 펩티드, 먹장어 장내 항균 펩티드 (HFIAP), 마가이닌 (magainin), 브레비닌 (brevinin)-2, 더마셉틴 (dermaseptin), 멜리틴 (melittin), 플레우로시딘 (pleurocidin), H2A 펩티드, 개구리 (Xenopus) 펩티드, 에스쿨렌틴 (esculentin)-1, 그리고 카에린 (caerin)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 바람직하게는, 나선 안전성의 완전성 (integrity)을 유지시키기 위하여 다수의 인자가 고려될 것이다. 가령, 최대 숫자의 나선 안정화 잔기 (가령, leu, ala, 또는 lys)가 이용되고, 그리고 최소 숫자의 나선 불안정화 잔기 (가령, 프롤린, 또는 환형 단위체 단위)가 이용될 것이다. 캡핑 잔기 (capping residue)가 고려된다 (가령, Gly는 예시적인 N-캡핑 잔기이고 및/또는 C-말단 아미드화는 나선을 안정화시키는 여분의 H-결합을 제공하는데 이용될 수 있다). i±3, 또는 i±4 위치로 분리되는, 반대 전하를 갖는 잔기 간에 염 가교 (salt bridge)의 형성은 안전성을 제공할 수 있다. 가령, 양이온성 잔기, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 호모-아르기닌, 오르니틴 또는 히스티딘은 음이온성 잔기 글루타메이트 또는 아스파르테이트와 염 가교를 형성할 수 있다.
펩티드 및 펩티드모방체 리간드에는 자연 발생 또는 변형된 펩티드, 예를 들면, D 또는 L 펩티드; α, β 또는 γ펩티드; N-메틸 펩티드; 아자펩티드; 하나 또는 그 이상의 아미드를 보유하는 펩티드, 다시 말하면, 연쇄가 하나 또는 그 이상의 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 또는 설포닐 우레아 연쇄로 대체되는 펩티드; 또는 환형 펩티드를 보유하는 것들이 포함된다.
표적화 리간드는 특정한 수용체를 표적으로 할 수 있는 임의의 리간드일 수 있다. 실례는 아래와 같다: 폴산염, GalNAc, 갈락토오스, 만노오스, 만노오스-6P, 당 클러스터, 예를 들면, GalNAc 클러스터, 만노오스 클러스터, 갈락토오스 클러스터, 또는 압타머. 클러스터는 2개 또는 그 이상의 당 단위의 조합이다. 표적화 리간드에는 또한, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 및 HDL 리간드가 포함된다. 이들 리간드는 또한, 핵산, 예를 들면, 압타머에 기초될 수 있다. 압타머는 변형되지 않거나, 또는 본 명세서에서 기술된 변형의 임의의 조합을 보유할 수 있다.
엔도솜 방출제 (endosome release agent)에는 이미다졸, 폴리 또는 올리고이미다졸, PEI, 펩티드, 융합성 펩티드, 폴리카르복실레이트 (polycaboxylate), 다가 양이온, 차폐된 올리고 또는 다가 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 차폐된 또는 차폐되지 않은 양이온성 또는 음이온성 전하를 갖는 중합체, 차폐된 또는 차폐되지 않은 양이온성 또는 음이온성 전하를 갖는 덴드리머가 포함된다.
PK 조절자 (modulator)는 약동학적 조절자를 의미한다. PK 조절자에는 친유성체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등이 포함된다. 예시적인 PK 조절자에는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 연쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드 역시 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있고, 따라서 중추 내에 복수의 포스포로티오에이트 연쇄를 포함하는 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 대략 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오티드 역시 리간드 (가령, PK 조정 리간드)로서 본 발명에 포함된다.
이에 더하여, 혈청 성분 (가령, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머 역시 PK 조정 리간드로서 본 발명에 포함된다.
본 발명에 포함되는 리간드는 동시 계류 중인 출원: 2004년 8월 10일 제출된 USSN: 10/916,185; 2004년 9월 21일 제출된 10/946,873; 2007년 8월 3일 제출된 USSN: 10/833,934; 2005년 4월 27일 제출된 USSN: 11/115,989, 그리고 2007년 11월 21일 제출된 USSN: 11/944,227에서 기술되고, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
2개 또는 그 이상의 리간드가 존재할 때, 이들 리간드는 모두 동일한 성질을 갖거나, 모두 상이한 성질을 갖거나, 또는 일부 리간드는 동일한 성질을 갖고 다른 리간드는 상이한 성질을 갖는다. 가령, 리간드는 표적화 성질을 갖거나, 엔도솜붕괴 활성을 갖거나, 또는 PK 조정 성질을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 모든 리간드가 상이한 성질을 갖는다.
리간드는 다양한 위치, 예를 들면, 3'-단부, 5'-단부, 및/또는 내부 위치에서 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 리간드는 개재성 속박 사슬 (intervening tether)에 의해 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 리간드 또는 속박된 리간드는 단위체가 성장 가닥 내로 함입될 때, 상기 단위체 상에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드는 "전구물질" 단위체가 성장 가닥 내로 함입된 이후에, 상기 "전구물질" 단위체에 결합에 의해 함입될 수 있다. 가령, 예로써, 아미노-종결된 속박 사슬을 보유하는 (즉, 연관된 리간드를 보유하지 않는) 단위체, 예를 들면, TAP-(CH2)nNH2가 성장하는 센스 또는 안티센스 가닥 내로 함입될 수 있다. 차후 작업에서, 다시 말하면, 가닥 내로 전구물질 단위체의 함입후, 친전자성 기, 예를 들면, 펜타플루오르페닐 에스테르 또는 알데히드 기를 보유하는 리간드는 차후에, 리간드의 친전자성 기를 전구물질 단위체의 속박 사슬의 말단 친핵성 기와 결합시킴으로써 전구물질 단위체에 부착될 수 있다.
이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 경우에, 리간드는 한쪽 또는 양쪽 가닥에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 이중-가닥 iRNA 작용제는 센스 가닥에 접합된 리간드를 보유한다. 다른 구체예에서, 이중-가닥 iRNA 작용제는 안티센스 가닥에 접합된 리간드를 보유한다.
일부 구체예에서, 리간드는 핵산 분자의 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오시드간 (internucleosidic) 연쇄에 접합될 수 있다. 퓨린 핵염기 또는 이들의 유도체에 접합은 내향환형 (endocyclic) 및 외향환형 (exocyclic) 원자를 비롯한 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 퓨린 핵염기의 2-, 6-, 7-, 또는 8-위치가 접합체 모이어티에 부착된다. 피리미딘 핵염기 또는 이들의 유도체에 접합 역시 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 피리미딘 핵염기의 2-, 5-, 그리고 6-위치는 접합체 모이어티로 치환될 수 있다. 뉴클레오시드의 당 모이어티에 접합은 임의의 탄소 원자에서 일어날 수 있다. 접합체 모이어티에 부착될 수 있는 당 모이어티의 모범 탄소 원자에는 2', 3', 그리고 5' 탄소 원자가 포함된다. 1' 위치 역시 무염기 잔기에서와 같이, 접합체 모이어티에 부착될 수 있다. 뉴클레오시드간 연쇄는 또한, 접합체 모이어티를 보유할 수 있다. 인-보유 연쇄 (가령, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오테이트, 포스포로아미데이트 등)의 경우에, 접합체 모이어티는 인 원자에 직접적으로, 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 부착될 수 있다. 아민- 또는 아미드-보유 뉴클레오시드간 연쇄 (가령, PNA)의 경우에, 접합체 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자에, 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
소중합성 화합물의 접합체를 제조하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 일반적으로, 소중합성 화합물은 소중합성 화합물 상에서 반응성 기 (가령, OH, SH, 아민, 카르복실, 알데히드 등)를 접합체 모이어티 상에서 반응성 기와 접촉시킴으로써 접합체 모이어티에 부착된다. 일부 구체예에서, 한쪽 반응성 기는 친전자성이고, 다른 반응성 기는 친핵성이다.
가령, 친전자성 기는 카르보닐-보유 기능기일 수 있고, 그리고 친핵성 기는 아민 또는 티올일 수 있다. 연결 기로, 그리고 연결 기 없이 핵산 및 관련된 소중합성 화합물의 접합 방법은 기존 문헌, 예를 들면, Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, FIa., 1993, Chapter 17에서 충분히 기술되고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허에는 U.S. Pat. No. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,149,782; 5,214,136; 5,245,022; 5,254, 469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; 5,672,662; 5,688,941; 5,714,166; 6,153,737; 6,172,208; 6,300,319; 6,335,434; 6,335,437; 6,395,437; 6,444,806; 6,486,308; 6,525,031; 6,528,631; 6,559,279가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 본 발명에 참조로서 편입된다.
정의
편의를 위하여, 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 일정한 용어와 구(句)의 의미가 하기에 제공된다.
본 명세서의 다른 부분에서 용어의 용법 및 본 섹션에서 제공된 이의 정의 사이에 명백한 불일치가 존재하면, 본 섹션에서 정의가 우선할 것이다.
"G," "C," "A" 및 "U"는 각각, 일반적으로 구아닌, 시토신, 아데닌, 그리고 우라실을 염기로서 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다. 하지만, 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 또한, 하기 더욱 상술된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티 (surrogate replacement moiety)를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 그리고 우라실이 이런 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 비롯하여, 올리고뉴클레오티드의 염기 대합 성질을 실질적으로 변경시키지 않으면서 다른 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 충분히 인지한다. 가령, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 내에서, 예로써 이노신을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 이런 대체 모이어티를 보유하는 서열은 본 발명의 구체예이다.
본 명세서에서, "VII 인자"는 VII 인자 mRNA, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "VII 인자"는 또한, 당분야에서 AI132620, Cf7, VII 응고 인자 전구물질, VII 응고 인자, FVII, 혈청 프로트롬빈 전환 가속제 (serum prothrombin conversion accelerator), FVII 응고 단백질, 그리고 엡타코그 알파 (eptacog alfa)로서 알려져 있다.
본 명세서에서, "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA를 비롯하여, 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 이용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본 명세서에서, 그리고 달리 지시되지 않으면, 뉴클레오티드 쌍의 맥락에서 이용될 때 용어 "상보성"은 고전적인 Watson-Crick 쌍, 다시 말하면, GC, AT, 또는 AU를 의미한다. 이것은 뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽이 예로써, 리보오스 변형 또는 인산염 중추 변형에 의해 본 명세서에서 기술된 바와 같이 변형되는 고전적인 Watson-Crick 대합에도 확장된다. 이것은 또한, 이노신 또는 염기 대합 성질을 실질적으로 변경시키지 않는 다른 존재 (entity)와의 대합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 그리고 달리 지시되지 않으면, 두 번째 뉴클레오티드 서열에 관련하여 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 기술하기 위하여 이용될 때 용어 "상보성"은 당업자가 이해하는 바와 같이, 일정한 조건 하에서 두 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되고 이중나선 구조를 형성하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 상보성은 완전 상보성, 실질적 상보성, 그리고 생리 조건 하에, 예를 들면, 생물체 내에서 직면되는 생리학적으로 적절한 조건 하에 혼성화될 만큼 충분한 상보성을 포함할 수 있다. 완전 상보성은 첫 번째와 두 번째 서열의 전체 쌍에서, 개별 쌍에 대하여 앞서 정의된 바와 같은 상보성을 지칭한다. 서열이 본 명세서에서 두 번째 서열에 대하여 "실질적으로 상보성"일 때, 이들 두 서열은 완전 상보성이거나, 또는 이들은 궁극적 적용에 가장 적합한 조건 하에 혼성화되는 능력을 유지하면서 혼성화 시에 하나 또는 그 이상, 하지만 일반적으로 4개, 3개 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍을 형성할 수 있다. 실질적 상보성은 또한, 엄격한 조건 하에 혼성화로서 정의될 수 있고, 여기서 엄격한 조건은 12-16시간 동안 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 5O℃ 또는 7O℃, 그 이후에 세척을 포함한다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적 적용에 따라서 두 서열의 상보성 검사를 위하여 가장 적합한 일단의 조건을 결정할 수 있을 것이다.
하지만, 두 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에, 하나 또는 그 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우에, 이런 오버행은 상보성의 결정과 관련하여 미스매치로서 간주되지 않는다. 가령, 21개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 및 23개 뉴클레오티드 길이의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA (여기서 더욱 긴 올리고뉴클레오티드는 더욱 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보성인 21개 뉴클레오티드의 서열을 포함한다)는 그럼에도 불구하고, 본 발명을 위하여 "완전 상보성"으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서, "상보성" 서열은 또한, 혼성화 능력에 관한 상기 필요 조건이 충족되기만 하면, 비-Watson-Crick 염기쌍 및/또는 비-자연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 포함하거나, 또는 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다.
용어 "상보성", "완전 상보성", "실질적으로 상보성" 및 생리 조건 하에, 예를 들면, 생물체 내에서 직면되는 생리학적으로 적절한 조건 하에 혼성화될 만큼 충분한 상보성은 본 명세서에서, 그들의 이용의 맥락으로부터 이해되는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이에, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이에 염기 정합 (base matching)과 관련하여 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 메신저 RNA (mRNA)의 "적어도 일부에 상보성, 예를 들면, 실질적으로 상보성"인 폴리뉴클레오티드는 목적되는 mRNA (가령, VII 인자를 인코딩)의 연속 부분에 상보성, 예를 들면, 실질적으로 상보성인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 가령, 폴리뉴클레오티드는 서열이 VII 인자를 인코딩하는 mRNA의 비-중단된 부분에 실질적으로 상보성이면, VII 인자 mRNA의 적어도 일부에 상보성이다.
본 명세서에서, 용어 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 2개의 역-평행이고 앞서 정의된 바와 같이 실질적으로 상보성인 핵산 가닥을 보유하는 이중나선 구조를 갖는 리보핵산 분자, 또는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이중나선 구조를 형성하는 이들 두 가닥은 하나의 큰 RNA 분자의 상이한 일부분이거나, 또는 이들은 별개의 RNA 분자일 수 있다. 이들 두 가닥이 하나의 큰 분자의 일부분이고, 따라서 이중나선 구조를 형성하는 한쪽 가닥의 3 '-단부 및 다른 쪽 가닥의 5' 단부 사이에 뉴클레오티드의 연속된 사슬에 의해 연결되는 경우에, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 이들 두 가닥이 이중나선 구조를 형성하는 한쪽 가닥의 3 '-단부 및 다른 쪽 가닥의 5' 단부 사이에 뉴클레오티드의 연속된 사슬 이외의 수단에 의해 공유 연결되는 경우에, 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일한 또는 상이한 숫자의 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 염기쌍의 최대 숫자는 dsRNA의 가장 짧은 가닥에서 뉴클레오티드의 숫자이다. 이중나선 구조에 더하여, dsRNA는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, dsRNA는 또한, "소형 저해 RNA", "siRNA", "siRNA 작용제", "iRNA 작용제" 또는 "RNAi 작용제"로 지칭된다.
본 명세서에서, "뉴클레오티드 오버행"은 대합되지 않은 뉴클레오티드, 또는 dsRNA의 한쪽 가닥의 3 '-단부가 다른 가닥의 5'-단부를 넘어서 확장되거나, 또는 그 반대일 때, dsRNA의 이중나선 구조로부터 돌출되는 뉴클레오티드를 지칭한다. "평활" 또는 "평활 말단"은 dsRNA의 단부에서 대합되지 않은 뉴클레오티드 없음, 다시 말하면, 뉴클레오티드 오버행 없음을 의미한다. "평활 말단" dsRNA는 전체 길이에서 이중-가닥인, 다시 말하면, 분자의 어느 한쪽 단부에도 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다.
용어 "안티센스 가닥"은 표적 서열에 실질적으로 상보성인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "상보성 영역"은 서열, 예를 들면, 표적 서열에 본 명세서에서 정의된 바와 같이 실질적으로 상보성인 안티센스 가닥 상에서 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전한 상보성이 아닌 경우에, 미스매치는 말단 영역에서 가장 관용되고, 그리고 존재하면, 일반적으로 말단 영역 또는 영역들, 예를 들면, 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2개 뉴클레오티드 내에 존재한다.
본 명세서에서, 용어 "센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보성인 영역을 보유하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다.
용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 상관관계이다. 동일성은 또한, 폴리뉴클레오티드 서열의 일련 (string) 사이의 정합에 의해 결정되는, 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 서열 관련성 정도를 의미한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하긴 하지만, 상기 용어는 당업자에게 충분히 공지되어 있다 (참조: Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); 그리고 Sequence Analysis Primer, Gribskov., M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)). 본 명세서에서, "실질적으로 동일한"은 dsRNA의 센스 가닥 및 표적 유전자의 상응하는 부분 사이에 매우 높은 정도의 상동성 (바람직하게는, 100% 서열 동일성)이 존재함을 의미한다. 하지만, 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 dsRNA가 본 발명에 이용될 수 있고, 따라서 유전자 돌연변이 (genetic mutation), 계통 다형성 (strain polymorphism), 또는 진화적 발산 (evolutionary divergence)으로 인하여 발생할 지도 모르는 서열 변화가 관용될 수 있다. 비록 100% 동일성이 바람직하긴 하지만, dsRNA는 RNA 및 표적 유전자 사이에 단일 또는 복수 염기쌍 무작위 미스매치를 보유할 수도 있다.
dsRNA와 관련하여, "세포 내로 도입"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 세포 내로 흡수를 촉진하는 것을 의미한다. dsRNA의 흡수는 독력의 확산성 또는 활성 세포 과정을 통하여, 또는 보조 작용제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. 상기 용어의 의미는 시험관내에서 세포에 한정되지 않는다; dsRNA는 세포가 생존 생물체의 일부인 경우에도 "세포 내로 도입"될 수 있다. 이런 경우에, 세포 내로 도입은 생물체에 전달을 포함할 것이다. 가령, 생체내 전달의 경우에, dsRNA는 조직 부위 내로 주사되거나, 또는 전신 투여될 수 있다. 세포 내로 시험관내 도입은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 전기천공 (electroporation) 및 리포펙션 (lipofection)을 포함한다.
VII 인자 유전자와 관련하여, 용어 "침묵" 및 "발현의 저해"는 본 명세서에서, VII 인자 유전자가 전사되고, 그리고 상기 VII 인자 유전자의 발현이 저해되도록 처리된 첫 번째 세포 또는 일군의 세포로부터 분리될 수 있는 VII 인자 유전자로부터 mRNA의 양이 상기 첫 번째 세포 일군의 세포와 실질적으로 동일하지만 이렇게 처리되지 않은 두 번째 세포 또는 일군의 세포 (대조 세포)와 비교하여 감소함으로써 명백하게 확인되는, VII 인자 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제를 지칭한다. 저해 정도는 일반적으로,
Figure 112021005370664-pat00023
로 표시된다.
대안으로, 저해 정도는 VII 인자 유전자 전사에 기능적으로 연계된 파라미터, 예를 들면, 세포에 의해 분비되는 VII 인자 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 양, 또는 일정한 표현형, 예를 들면, 아폽토시스 (apoptosis)를 나타내는 세포의 숫자의 감소의 관점에서 제공된다. 원칙적으로, VII 인자 유전자 침묵은 구조성으로 또는 게놈 조작 (genomic engineering)에 의해 표적을 발현하는 임의의 세포에서, 그리고 임의의 적절한 분석평가에 의해 결정될 수 있다. 하지만, 소정의 siRNA가 VII 인자 유전자의 발현을 일정한 정도로 저해하고, 따라서 본 발명에 포함되는 지를 결정하기 위하여 기준 (reference)이 필요할 때, 하기 실시예에서 제공된 분석평가는 이런 기준으로서 기능할 것이다.
가령, 일정한 경우에, VII 인자 유전자의 발현은 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 대략 20%, 25%, 35%, 40% 또는 50% 억제된다. 한 구체예에서, VII 인자 유전자는 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 대략 60%, 70%, 또는 80% 억제된다. 더욱 바람직한 구체예에서, VII 인자 유전자는 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의해 적어도 대략 85%, 90%, 또는 95% 억제된다.
용어 "치료한다", "치료" 등은 질환 또는 장애의 경감 또는 완화를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 하기에 언급된 임의의 다른 장애 (가령, 혈전 질환 이외의 VII 인자-매개된 장애)와 관련하여, 용어 "치료한다", "치료" 등은 이런 장애와 연관된 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 또는 이런 장애의 진행을 지연시키거나 반전시키는 것을 의미한다.
"치료적으로 적절한" 조성물은 적절한 용량으로 투여될 때, 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애의 증상을 완화시킬 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "VII 인자-매개된 장애 또는 질환" 및 관련된 용어와 구(句)는 부적절한, 예를 들면, 정상 이상의 VII 인자 활성으로 특징되는 질환 또는 장애를 지칭한다. 부적절한 VII 인자 기능적 활성은 VII 인자를 정상적으로 발현하지 않는 세포에서 VII 인자 발현, 또는 증가된 VII 인자 발현 (예로써, 바이러스 출혈열, 또는 혈전의 증상을 유발)의 결과로써 발생할 수도 있다. VII 인자-매개된 장애 또는 질환은 부적절한 VII 인자 기능적 활성에 의해 완전히 또는 부분적으로 매개될 수 있다. 하지만, VII 인자-매개된 장애 또는 질환은 VII 인자의 조정이 근원적 질환 또는 장애에 대한 일정한 영향을 유발하는 장애 또는 질환이다 (가령, VII 인자 저해제는 적어도 일부 환자에서 환자 복지에서 일정한 향상을 유발한다).
"출혈열"은 바이러스 감염에 의해 유발되는 병의 조합을 포함한다. 열병 및 위장 증상은 전형적으로, 모세관 출혈이 뒤따른다.
"응고병증"은 개체의 혈액 응고 기전에서 임의의 결함이다.
본 명세서에서, "혈전 질환"은 바람직하지 않은 혈액 응고로 특징되는 임의의 질환을 비롯하여, 주로 바람직하지 않은 FVII 발현으로부터 발생하는 임의의 질환이다.
본 명세서에서, 구(句) "치료 효과량" 및 "예방 효과량"은 바이러스 출혈열, 또는 이런 질환의 명백한 증상, 예를 들면, 출혈, 열병, 쇠약, 근육통, 두통, 염증, 또는 순환 쇼크 (circulatory shock)의 치료, 예방 또는 관리에서 치료적 이익을 제공하는 양을 지칭한다. 치료적으로 효과적인 특정한 양은 보통의 의학 전문가에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 그리고 당분야에 공지된 인자, 예를 들면, 혈전 질환의 유형, 환자의 병력과 연령, 질환의 단계, 그리고 다른 작용제의 투여에 따라 변한다.
본 명세서에서, "제약학적 조성물"은 약리학적 효과량의 dsRNA 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에서, "약리학적 효과량," "치료 효과량" 또는 간단하게 "효과량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 산출하는데 효과적인 RNA의 양을 지칭한다. 가령, 소정의 임상적 치료가 질환 또는 장애와 연관된 측정가능한 파라미터에서 적어도 25% 감소가 나타날 때 효과적인 것으로 간주되면, 상기 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료 효과량은 상기 파라미터에서 적어도 25% 감소를 달성하는데 필요한 양이다.
용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 치료제의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이런 담체에는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 그리고 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상기 용어는 세포 배양 배지를 명확하게 배제한다. 경구 투여되는 약물의 경우에, 제약학적으로 허용되는 담체에는 제약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 비활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미료, 풍미제, 착색제 및 보존제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 비활성 희석제에는 나트륨과 칼슘 탄산염, 나트륨과 칼슘 인산염, 그리고 락토오스가 포함되고, 반면 옥수수 전분 및 알긴산은 적절한 붕해제이다. 결합제에는 전분 및 젤라틴이 포함되고, 반면, 윤활제는 존재하면, 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원하는 경우에, 정제는 위장관 내에서 흡수를 지연시키기 위하여 글리세릴 모노스테아레이트 (glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트 (glyceryl distearate)와 같은 물질로 코팅될 수 있다.
본 명세서에서, "형질전환된 세포"는 dsRNA 분자가 발현될 수 있는 벡터가 도입된 세포이다.
핵산-지질 입자의 특징
일정한 구체예에서, 본 발명은 핵산이 지질 층 내에 캡슐화되는 지질-캡슐화된 핵산 입자를 생산하기 위한 방법과 조성물에 관계한다. siRNA 올리고뉴클레오티드를 함입하는 이런 핵산-지질 입자는 (1) 약물 대(對) 지질 비율; (2) 캡슐화 효율; 그리고 (3) 입자 크기를 비롯한 다양한 생물물리학적 파라미터를 이용하여 특징된다. 높은 약물 대(對) 지질 비율, 높은 캡슐화 효율, 우수한 뉴클레아제 내성 및 혈청 안정성, 그리고 제거가능 입자 크기, 일반적으로 200 nm 이하 직경의 입자 크기가 바람직하다. 이에 더하여, 핵산 중합체의 성질이 중요한데, 그 이유는 뉴클레아제 내성을 부여하기 위한 핵산의 변형이 많은 경우에, 단지 한정된 내성만을 제공하면서 치료 비용을 가중시키기 때문이다. 달리 명시되지 않으면, 이들 기준은 본 명세서에서 아래와 같이 계산된다:
핵산 대(對) 지질 비율은 정의된 부피의 제조물에서 핵산의 양이 동일한 부피에서 지질의 양으로 나눗셈된 것이다. 이것은 몰/몰 기초 (mole per mole basis) 또는 중량/중량 기초 (weight per weight basis), 또는 중량/몰 기초 (weight per mole basis)한다. 최종의 투여-적격 제제의 경우에, 핵산:지질 비율은 가능한 많은 외부 핵산을 제거하기 위하여 투석, 크로마토그래피 및/또는 효소 (가령, 뉴클레아제) 절단이 수행된 이후에 계산된다;
캡슐화 효율은 최종의 투여 적격 제제의 약물 대(對) 지질 비율에 의해 나눗셈된, 출발 혼합물의 약물 대(對) 지질 비율을 지칭한다. 이것은 상대적 효율의 척도이다. 절대 효율의 측정을 위하여, 투여 적격 제제 내에 남아있는 출발 혼합물에 첨가된 핵산의 총량 역시 계산될 수 있다. 조제 과정 동안 상실된 지질의 양 역시 계산될 수 있다. 효율은 조제의 소모량과 소요 비용의 척도이다; 그리고 크기는 형성된 입자의 크기 (직경)를 지시한다. 크기 분포는 Nicomp Model 370 마이크론 이하 (sub-micron) 입자 분석기에서 준탄성 광 산란 (quasi-elastic light scattering, QELS)을 이용하여 결정될 수 있다. 200 nm 미만의 입자가 혈관신생된 (유출) 조직, 예를 들면, 신생물 및 염증 부위에 분포를 위하여 바람직하다.
지질 입자를 제조하는 방법
본 발명의 방법과 조성물은 하기에서 및 첨부된 실시예에서 기술되는 일정한 양이온성 지질, 합성, 제조 및 특징화를 이용한다. 이에 더하여, 본 발명에서는 치료제, 예를 들면, 핵산과 결합된 것들을 비롯한 지질 입자를 제조하는 방법을 제시한다. 본 명세서에서 기술된 이들 방법에서, 지질의 혼합물은 지질 입자 내에 캡슐화된 핵산을 포함하는 중간 혼합물을 생산하기 위하여 핵산의 완충된 수성 용액과 합쳐지고, 여기서 이들 캡슐화된 핵산은 대략 3 wt% 내지 대략 25 wt%, 바람직하게는 5 내지 15 wt%의 핵산/지질 비율로 존재한다. 중간 혼합물은 지질-캡슐화된 핵산 입자를 획득하기 위하여 선택적으로 사이징 (sizing)될 수 있고, 여기서 이들 지질 부분은 바람직하게는 30 내지 150 nm의 직경, 더욱 바람직하게는 대략 40 내지 90 nm의 직경을 갖는 단일라멜라 소포이다. pH는 이후, 지질-핵산 입자 상에서 표면 전하의 적어도 일부를 중화시키기 위하여 상승되고, 따라서 적어도 부분적으로 표면-중화된 지질-캡슐화된 핵산 조성물이 생산된다.
앞서 기술된 바와 같이, 이들 각각의 양이온성 지질은 아미노 기의 pKa 미만의 pH에서 하전되고, 그리고 pKa 초과의 pH에서 실질적으로 중성인 아미노 지질이다. 이들 양이온성 지질은 적정가능 양이온성 지질로 불리고 2-단계 과정을 이용하여 본 발명의 제제에 이용될 수 있다. 먼저, 지질 소포는 더욱 낮은 pH에서, 핵산의 존재에서 적정가능 양이온성 지질 및 기타 소포 성분으로 형성될 수 있다. 이러한 방식으로, 이들 소포는 핵산을 캡슐화시키고 포집할 것이다. 둘째, 새로 형성된 소포의 표면 전하는 존재하는 적정가능 양이온성 지질의 pKa를 초과하는 수준, 다시 말하면, 생리 pH 또는 그 이상으로 매체의 pH를 증가시킴으로써 중화될 수 있다. 이러한 과정의 특히 유익한 측면에는 임의의 표면 흡수된 핵산 및 중성 표면을 보유하는 결과의 핵산 전달 운반제 둘 모두의 용이한 제거가 포함된다. 중성 표면을 보유하는 리포좀 또는 지질 입자는 순환으로부터 급속한 제거를 회피하고, 그리고 양이온성 리포좀 제조물과 연관되는 일정한 독성을 회피할 것으로 예상된다. 핵산-지질 입자의 제제에서 이런 적정가능 양이온성 지질의 이용과 관련된 추가 상세는 본 발명에 참조로서 편입되는 US Patent 6,287,591 및 US Patent 6,858,225에서 제공된다.
게다가, 이러한 방식으로 형성된 소포는 높은 함량의 핵산을 포함하는, 균일한 소포 크기의 제제를 제공한다. 부가적으로, 이들 소포는 대략 30 내지 대략 150 nm, 더욱 바람직하게는 대략 30 내지 대략 90 nm의 크기 범위를 갖는다.
특정 이론에 한정됨 없이, 핵산 캡슐화의 매우 높은 효율은 낮은 pH에서 정전기적 상호작용의 결과인 것으로 생각된다. 산성 pH (가령, pH 4.0)에서, 소포 표면은 하전되고, 그리고 정전기적 상호작용을 통하여 핵산의 일부에 결합한다. 외부 산성 완충액 (external acidic buffer)이 더욱 중성 완충액 (가령, pH 7.5)으로 교체될 때, 지질 입자 또는 리포좀의 표면이 중화되고 임의의 외부 핵산이 제거되게 된다. 조제 과정에 대한 더욱 상세한 정보는 다양한 간행물 (가령, US Patent 6,287,591 및 US Patent 6,858,225)에서 제공된다.
상기에 비추어, 본 발명에서는 지질/핵산 제제를 제조하는 방법을 제시한다. 본 명세서에서 기술된 방법에서, 지질의 혼합물은 지질 입자 내에 캡슐화된 핵산을 포함하는 중간 혼합물을 생산하기 위하여 핵산의 완충된 수성 용액과 합쳐지고, 여기서 이들 캡슐화된 핵산은 대략 10 내지 대략 20 wt%의 핵산/지질 비율로 존재한다. 중간 혼합물은 지질-캡슐화된 핵산 입자를 획득하기 위하여 선택적으로 사이징 (sizing)될 수 있고, 여기서 이들 지질 부분은 바람직하게는 30 내지 150 nm의 직경, 더욱 바람직하게는 대략 40 내지 90 nm의 직경을 갖는 단일라멜라 소포이다. pH는 이후, 지질-핵산 입자 상에서 표면 전하의 적어도 일부를 중화시키기 위하여 상승되고, 따라서 적어도 부분적으로 표면-중화된 지질-캡슐화된 핵산 조성물이 생산된다.
일정한 구체예에서, 지질의 혼합물은 적어도 2가지 지질 성분을 포함한다: 지질이 pKa 미만의 pH에서 양이온성이고 pKa 초과의 pH에서 중성이 되도록 하는 pKa를 갖는 지질 중에서 선택되는 본 발명의 첫 번째 아미노 지질 성분, 그리고 지질-핵산 입자 형성 동안 입자 집합을 예방하는 지질 중에서 선택되는 두 번째 지질 성분. 특정 구체예에서, 아미노 지질은 본 발명의 신규한 양이온성 지질이다.
본 발명의 핵산-지질 입자를 제조할 때, 지질의 혼합물은 전형적으로, 유기 용매에서 지질의 용액이다. 지질의 이러한 혼합물은 이후, 얇은 필름을 형성하기 위하여 건조되거나, 또는 수성 완충액으로 수화되어 리포좀을 형성하기 이전에 분말을 형성하기 위하여 냉동 건조될 수 있다. 대안으로, 바람직한 방법에서, 지질 혼합물은 물 혼화성 알코올, 예를 들면, 에탄올에 용해될 수 있고, 그리고 이러한 에탄올성 용액은 수성 완충액에 첨가되어 리포좀이 자발적으로 형성된다. 대부분의 구체예에서, 알코올은 상업적으로 가용한 형태로 이용된다. 가령, 에탄올은 절대 에탄올 (100%)로서, 또는 95% 에탄올 (나머지는 물이다)로서 이용될 수 있다. 이러한 방법은 US Patent 5,976,567에서 더욱 상세하게 기술된다.
예시적인 구체예에서, 지질 혼합물은 알코올 용매에서 양이온성 지질, 중성 지질 (양이온성 지질 제외), 스테롤 (가령, 콜레스테롤) 및 PEG-변형된 지질 (가령, PEG-DMG 또는 PEG-cDMA)의 혼합물이다. 바람직한 구체예에서, 지질 혼합물은 알코올, 더욱 바람직하게는 에탄올에서 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형된 지질로 본질적으로 구성된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 첫 번째 용액은 대략 20-70% 양이온성 지질: 5-45% 중성 지질:20-55% 콜레스테롤:0.5-15% PEG-변형된 지질의 몰 비율로, 상기 지질 혼합물로 구성된다. 이보다 더욱 바람직한 구체예에서, 첫 번째 용액은 더욱 바람직하게는, 대략 20-60% 양이온성 지질: 5-25% DSPC:25-55% Chol:0.5-15% PEG-DMG 또는 cPEG-DMA의 몰 비율로, 표 1에서 선택된 지질, DSPC, Chol 및 PEG-DMG 또는 PEG-cDMA로 본질적으로 구성된다. 특정 구체예에서, 몰 지질 비율은 대략 50/10/38.5/1.5 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG, PEG-DSG 또는 PEG-DPG mol%), 57.2/7.1/34.3/1.4 (양이온성 지질/DPPC/Chol/PEG-cDMA mol%), 40/15/40/5 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG mol%), 50/10/35/4.5/0.5 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DSG 또는 GalNAc3-PEG-DSG mol%), 50/10/35/5 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG mol%), 40/10/40/10 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%), 35/15/40/10 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%) 또는 52/13/30/5 (양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%)이다. 다른 일군의 바람직한 구체예에서, 이들 조성물 내에서 중성 지질은 POPC, DPPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다.
본 발명에 따라서, 지질 혼합물은 핵산을 포함하는 완충된 수성 용액과 합쳐진다. 완충된 수성 용액은 전형적으로, 완충액이 지질 혼합물 내에 양성자화가능 지질의 pKa 이하의 pH를 갖는 용액이다. 적절한 완충액의 실례에는 구연산염, 인산염, 아세트산염, 그리고 MES가 포함된다. 특히 바람직한 완충액은 구연산염 완충액이다. 바람직한 완충액은 캡슐화되는 핵산의 화학적 성질에 따라 상기 음이온의 1-1000 mM 범위 내에 있고, 그리고 완충액 농도의 최적화는 높은 적하 수준을 달성하는데 중요할 수 있다 (참조: US Patent 6,287,591 및 US Patent 6,858,225). 대안으로, 염화물, 황산염 등으로 pH 5-6로 산성화된 순수한 물이 유용할 수 있다. 이러한 경우에, 에탄올을 제거하기 위하여 입자가 투석될 때 입자 막을 교차하여 삼투능 (osmotic potential)의 균형을 잡거나, pH를 증가시키거나, 또는 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 통상의 염수와 혼합되는 5% 글루코오스, 또는 다른 비-이온성 용질을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 완충액 내에서 핵산의 양은 달라질 수 있지만 전형적으로, 대략 0.01 ㎎/㎖ 내지 대략 200 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 대략 0.5 ㎎/㎖ 내지 대략 50 ㎎/㎖일 것이다.
지질의 혼합물 및 치료적 핵산의 완충된 수성 용액은 합쳐지고 중간 혼합물이 제공된다. 중간 혼합물은 전형적으로, 캡슐화된 핵산을 포함하는 지질 입자의 혼합물이다. 부가적으로, 중간 혼합물은 또한, 지질 입자 표면 상에서 음으로 하전된 핵산 및 양으로 하전된 지질 (양성자화가능 일차 지질 성분을 구성하는 아미노 지질 또는 기타 지질은 지질 상에서 양성자화가능 기의 pKa 이하의 pH를 갖는 완충액에서 양으로 하전된다)의 이온성 끌림 (ionic attraction)으로 인하여, 지질 입자 (리포좀 또는 지질 소포)의 표면에 부착되는 핵산 중에서 일부를 포함할 수도 있다. 일군의 바람직한 구체예에서, 지질의 혼합물은 지질의 알코올 용액이고, 그리고 각 용액의 부피는 조합 시에, 결과의 알코올 함량이 부피로 대략 20% 내지 부피로 대략 45%가 되도록 조정된다. 이들 혼합물을 합치는 방법은 종종, 생산되는 제제의 규모에 따라 임의의 다양한 공정을 포함할 수 있다. 가령, 총 부피가 대략 10-20 ㎖ 또는 그 이하일 때, 이들 용액은 검사 튜브에서 합쳐지고 와동 믹서 (vortex mixer)를 이용하여 함께 교반될 수 있다. 대규모 공정은 적절한 생산 규모 글라스웨어에서 실행될 수 있다.
선택적으로, 지질 혼합물 및 치료제 (핵산)의 완충된 수성 용액을 합침으로써 생산되는 지질-캡슐화된 치료제 (가령, 핵산) 복합체는 원하는 크기 범위 및 지질 입자 크기의 상대적으로 좁은 분포를 달성하기 위하여 사이징 (sizing)될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에서 제시된 조성물은 대략 70 내지 대략 200 nm, 더욱 바람직하게는 대략 90 내지 대략 130 nm의 평균 직경으로 사이징 (sizing)될 것이다. 리포좀을 원하는 크기로 사이징하기 위하여 여러 기술이 가용하다. 한 가지 사이징 방법은 본 발명에 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 4,737,323에서 기술된다. 배스 초음파 (bath sonication) 또는 프로브 초음파 (probe sonication)로 리포좀 현탁액을 초음파처리하면, 크기가 대략 0.05 마이크론 이하 크기의 소형 단일라멜라 소포 (SUV)까지 점진적으로 감소한다. 균질화 (homogenization)는 큰 리포좀을 더욱 작은 리포좀으로 단편화시키기 위하여 전단 에너지 (shearing energy)에 의존하는 다른 방법이다. 전형적인 균질화 절차에서, 다중라멜라 소포는 선택된 리포좀 크기, 전형적으로 대략 0.1 내지 0.5 마이크론이 관찰될 때까지, 표준 에멀젼 균질화기를 통하여 재순환된다. 양쪽 방법에서, 입자 크기 분포는 전통적인 레이저-빔 입자 크기 결정에 의해 모니터링될 수 있다. 본 명세서에서 일정한 방법의 경우에, 사출 성형 (extrusion)은 균일한 소포 크기를 획득하기 위하여 이용된다.
작은-구멍 폴리카보네이트 막 또는 비대칭 세라믹 막을 통한 리포좀 조성물의 사출 성형은 상대적으로 충분히 정의된 크기 분포를 유발한다. 전형적으로, 현탁액은 원하는 리포좀 복합체 크기 분포가 달성될 때까지 1회 또는 그 이상 막을 통하여 순환된다. 리포좀은 리포좀 크기에서 점진적인 감소를 달성하기 위하여 연속하여 더욱 작은 구멍 막을 통하여 사출 성형될 수 있다. 일부 경우에, 형성되는 지질-핵산 조성물은 임의의 사이징 없이 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 지질-핵산 조성물의 지질 부분 상에서 표면 전하 중의 적어도 일부를 중화시키는 단계를 더욱 포함한다. 표면 전하를 적어도 부분적으로 중화시킴으로써, 캡슐화되지 않은 핵산은 지질 입자 표면으로부터 해방되고 전통적인 기술을 이용하여 조성물로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화되지 않고 표면 흡착된 핵산은 완충액 용액의 교체를 통하여 결과의 조성물로부터 제거될 수 있다. 가령, HEPES-완충된 염수 (HBS pH 대략 7.5) 용액으로 구연산염 완충액 (pH 대략 4.0, 조성물을 형성하는데 이용됨)의 대체는 리포좀 표면의 중화 및 표면으로부터 핵산 방출을 유발한다. 방출된 핵산은 이후, 표준 방법을 이용한 크로마토그래피에 의해 제거되고, 그 이후에 이용된 지질의 pKa 초과의 pH를 갖는 완충액 내로 이전될 수 있다.
선택적으로, 지질 소포 (즉, 지질 입자)는 수성 완충액에서 수화 (hydration)에 의해 형성되고, 그리고 핵산의 첨가에 앞서, 앞서 기술된 임의의 방법을 이용하여 사이징될 수 있다. 앞서 기술된 바와 같이, 수성 완충액은 아미노 지질의 pKa 미만의 pH이어야 한다. 핵산의 용액은 이후, 이들 사이징되고 미리 형성된 소포에 첨가될 수 있다. 핵산의 이런 "미리 형성된" 소포로의 캡슐화가 가능하도록 하기 위하여, 혼합물은 알코올, 예를 들면, 에탄올을 포함해야 한다. 에탄올의 경우에, 이는 대략 20% (w/w) 내지 대략 45% (w/w)의 농도로 존재해야 한다. 이에 더하여, 지질 소포의 조성물 및 핵산의 성질에 따라, 수성 완충액-에탄올 혼합물에서 미리 형성된 소포 및 핵산의 혼합물을 대략 25℃ 내지 대략 50℃의 온도로 가온하는 것이 필요할 수도 있다. 지질 소포 내에서 원하는 수준의 핵산을 달성하기 위한 캡슐화 과정의 최적화가 변수, 예를 들면, 에탄올 농도 및 온도의 조작을 필요로 할 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 핵산 캡슐화를 위한 적절한 조건의 실례는 실시예에서 제공된다. 일단 핵산이 미리 형성된 소포 내에 캡슐화되면, 외부 pH는 표면 전하를 적어도 부분적으로 중화시키기 위하여 증가될 수 있다. 캡슐화되지 않고 표면 흡착된 핵산은 이후, 앞서 기술된 바와 같이 제거될 수 있다.
이용 방법
본 발명의 지질 입자는 치료제를 시험관내에서 또는 생체내에서 세포에 전달하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제는 핵산이고, 이는 본 발명의 핵산-지질 입자를 이용하여 세포에 전달된다. 지질 입자를 이용하는 다양한 방법 및 관련된 본 발명의 제약학적 조성물에 관한 하기 설명이 핵산-지질 입자에 관련된 설명에 의해 예시되긴 하지만, 이들 방법과 조성물은 이런 치료로부터 이익을 얻는 임의의 질환 또는 장애의 치료를 위하여 임의의 치료제의 전달에 쉽게 적합될 수 있는 것으로 이해된다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서는 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 제시한다. 세포 내로 도입을 위한 바람직한 핵산은 siRNA, 면역-자극 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 및 리보자임이다. 이들 방법은 세포내 전달이 일어날 만큼 충분한 기간 동안 본 발명의 입자 또는 조성물을 세포와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 거의 모든 세포 유형, 예를 들면, HeLa, HCT116, A375, MCF7, B16F10, Hep3b, HUH7, HepG2, Skov3, U87, 그리고 PC3 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 종양 세포주에 흡착될 수 있다. 일단 흡착되면, 핵산-지질 입자는 세포의 일부분에 의해 세포내이입되거나, 세포 막과 지질을 교환하거나, 또는 이들 세포와 융합할 수 있다. 복합체의 핵산 부분의 이전 또는 함입은 이들 경로 중에서 한 가지 경로에 의해 발생할 수 있다. 본 발명의 범위와 관련하여 한정됨 없이, 세포내이입 (endocytosis)에 의해 세포 내로 흡수된 입자의 경우에, 이들 입자는 이후, 엔도솜 막과 상호작용하여, 아마도 비-이중층 상의 형성에 의해 엔도솜 막의 불안정화를 유발하고 캡슐화된 핵산의 세포 세포질 내로의 도입을 유발하는 것으로 생각된다. 유사하게, 입자의 세포 혈장 막과의 직접적인 융합의 경우에, 융합이 발생할 때, 리포좀 막은 세포 막 내로 통합되고, 그리고 리포좀의 내용물은 세포내 유체와 합쳐진다. 세포 및 지질-핵산 조성물 사이에 접촉이 시험관내에서 수행될 때, 이는 생물학적으로 적합한 매체에서 발생할 것이다. 조성물의 농도는 특정 적용에 따라 폭넓게 변할 수 있긴 하지만 일반적으로, 대략 1 μmol 내지 대략 10 mmol이다. 일정한 구체예에서, 지질-핵산 조성물로 세포의 치료는 일반적으로, 대략 1 내지 24시간, 바람직하게는 대략 2 내지 8시간의 기간 동안 생리 온도 (대략 37℃)에서 실행될 것이다. 시험관내 적용을 위하여, 핵산은 식물 또는 동물 기원, 척추동물 또는 무척추동물, 그리고 임의의 조직 또는 유형인 지에 상관없이, 배양 동안 성장된 임의의 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 그리고 가장 바람직하게는 인간 세포일 것이다.
일군의 구체예에서, 지질-핵산 입자 현탁액은 대략 103 내지 대략 105개 세포/㎖, 더욱 바람직하게는 대략 2 x 104개 세포/㎖의 세포 밀도 (cell density)를 갖는 60-80% 합류성 도말된 세포에 첨가된다. 세포에 첨가된 현탁액의 농도는 바람직하게는 대략 0.01 내지 20 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 대략 1 ㎍/㎖이다.
전형적인 적용에는 특정한 세포 표적을 녹다운시키거나 침묵시키는 siRNA의 세포내 전달을 제공하는 널리 공지된 절차를 이용하는 것을 포함한다. 대안으로, 적용은 치료적으로 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 서열의 전달을 포함한다. 이러한 방식으로, 결함성 또는 결여된 유전자 산물을 제공하는 유전 질환 (즉, 듀시엔형 근이영양증 (Duchenne's dystrophy); 참조: Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989), 그리고 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis) (참조: Goodfellow, Nature 341 : 102-103 (1989))에 대한 요법이 제공된다. 본 발명의 조성물에 대한 다른 용도에는 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입이 포함된다 (참조: Bennett, et al., MoI. Pharm. 41 :1023-1033 (1992)).
대안으로, 본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 생체내에서 핵산의 세포로의 전달에도 이용될 수 있다. DNA 또는 mRNA 서열의 전달을 위한 본 발명의 적용과 관련하여, 본 발명에 참조로서 편입된 Zhu, et al., Science 261 :209-211 (1993)에서는 DOTMA-DOPE 복합체를 이용한 사이토메갈로바이러스 (CMV)-클로람페니콜 아세틸전이효소 (CAT) 발현 플라스미드의 정맥내 전달을 기술한다. 본 발명에 참조로서 편입되는 Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993)에서는 리포좀을 이용하여, 생쥐의 기도 상피 및 폐에서 꽈리로 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자 (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR) 유전자의 전달을 기술한다. 본 발명에 참조로서 편입되는 Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989)에서는 세포내 효소, 클로람페니콜 아세틸전이효소 (CAT)를 인코딩하는 기능성 원핵생물 유전자로 생쥐의 폐의 생체내 형질감염 (transfection)을 기술한다. 따라서 본 발명의 조성물은 전염성 질환의 치료에 이용될 수 있다.
이런 이유로, 다른 측면에서, 본 발명의 제제는 FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPMlD 유전자, RAS 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자, p53 종양 억제자 유전자, p53 집단 구성원 DN-p63, pRb 종양 억제자 유전자, APCl 종양 억제자 유전자, BRCA1 종양 억제자 유전자, PTEN 종양 억제자 유전자, mLL 융합 유전자, BCR/ABL 융합 유전자, TEL/AML1 융합 유전자, EWS/FLI1 융합 유전자, TLS/FUS1 융합 유전자, PAX3/FKHR 융합 유전자, AML1/ET0 융합 유전자, 알파 v-인테그린 유전자, FIt-1 수용체 유전자, 튜불린 유전자, 인간 유두종 바이러스 유전자, 인간 유두종 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 복제에 요구되는 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, C형 간염 바이러스 유전자, C형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, D형 간염 바이러스 유전자, D형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, E형 간염 바이러스 유전자, E형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, F형 간염 바이러스 유전자, F형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, G형 간염 바이러스 유전자, G형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, H형 간염 바이러스 유전자, H형 간염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 단순 포진 바이러스 유전자, 단순 포진 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 복제에 요구되는 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 카포시 육종-연관된 헤르페스 바이러스 유전자, 카포시 육종-연관된 헤르페스 바이러스 복제에 요구되는 유전자, JC 바이러스 유전자, JC 바이러스 복제에 요구되는 인간 유전자, 믹소바이러스 유전자, 믹소바이러스 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 리노바이러스 유전자, 리노바이러스 복제에 요구되는 유전자, 코로나바이러스 유전자, 코로나바이러스 복제에 요구되는 유전자, 웨스트 나일 바이러스 유전자, 웨스트 나일 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 세인트루이스 뇌염 유전자, 세인트루이스 뇌염 복제에 요구되는 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 머레이 계곡 뇌염 바이러스 유전자, 머레이 계곡 뇌염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 뎅기 바이러스 유전자, 뎅기 바이러스 유전자 복제에 요구되는 유전자, 원숭이 바이러스 40 유전자, 원숭이 바이러스 40 복제에 요구되는 유전자, 인간 T 세포 림프친화 바이러스 유전자, 인간 T 세포 림프친화 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 뇌심근염 바이러스 유전자, 뇌심근염 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 바리셀라-조스터 바이러스 유전자, 바리셀라-조스터 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 아데노바이러스 유전자, 아데노바이러스 복제에 요구되는 유전자, 황열 바이러스 유전자, 황열 바이러스 복제에 요구되는 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 폴리오바이러스 복제에 요구되는 유전자, 수두바이러스 유전자, 수두바이러스 복제에 요구되는 유전자, 말라리아 병원충 유전자, 말라리아 병원충 유전자 복제에 요구되는 유전자, 미코박테리움 울서란스 (Mycobacterium ulcerans) 유전자, 미코박테리움 울서란스 (Mycobacterium ulcerans) 복제에 요구되는 유전자, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 유전자, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 복제에 요구되는 유전자, 나균 (Mycobacterium leprae) 유전자, 나균 (Mycobacterium leprae) 복제에 요구되는 유전자, 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 유전자, 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 복제에 요구되는 유전자, 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae) 유전자, 폐렴연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae) 복제에 요구되는 유전자, 스트렙토코커스 파이오진스 (Streptococcus pyogenes) 유전자, 스트렙토코커스 파이오진스 (Streptococcus pyogenes) 복제에 요구되는 유전자, 클라미디어 뉴모니아 (Chlamydia Pneumoniae) 유전자, 클라미디어 뉴모니아 (Chlamydia Pneumoniae) 복제에 요구되는 유전자, 마이코플라즈마 폐렴 (Mycoplasma Pneumoniae) 유전자, 마이코플라즈마 폐렴 (Mycoplasma Pneumoniae) 복제에 요구되는 유전자, 인테그린 유전자, 셀렉틴 유전자, 보체계 (complement system) 유전자, 케모카인 유전자, 케모카인 수용체 유전자, GCSF 유전자, Gro1 유전자, Gro2 유전자, Gro3 유전자, PF4 유전자, MIG 유전자, 프로-혈소판 기초 단백질 (Pro-Platelet Basic Protein) 유전자, MIP-II 유전자, MIP-IJ 유전자, RANTES 유전자, MCP-1 유전자, MCP-2 유전자, MCP-3 유전자, CMBKR1 유전자, CMBKR2 유전자, CMBKR3 유전자, CMBKR5v, AIF-1 유전자, I-309 유전자, 이온 채널의 성분에 대한 유전자, 신경전달물질 수용체에 대한 유전자, 신경전달물질 리간드에 대한 유전자, 아밀로이드-집단 유전자, 프레세닐린 유전자, HD 유전자, DRPLA 유전자, SCA1 유전자, SCA2 유전자, MJD1 유전자, CACNL1A4 유전자, SCA7 유전자, SCA8 유전자, LOH 세포에서 발견되는 대립형질 유전자, 또는 다형성 유전자 (polymorphic gene)의 대립형질 유전자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 표적 유전자를 침묵시키거나 조정하는데 이용될 수 있다.
생체내 투여의 경우에, 제약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 다시 말하면, 관절내, 정맥내, 복막내, 피하, 또는 근육내 투여된다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 일시 주사 (bolus injection)에 의해 정맥내 또는 복막내 투여된다. 한 가지 실례로써, 본 발명에 참조로서 편입되는 Stadler, et al., U.S. Patent No. 5,286,634를 참조한다. 세포내 핵산 전달은 또한, Straubringer, et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, New York. 101 :512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), 그리고 Behr, Ace. Chem. Res. 26:274-278 (1993)에서 논의되었다. 지질-기초된 치료제를 투여하는 또 다른 방법은 예로써, Rahman et al., U.S. Patent No. 3,993,754; Sears, U.S. Patent No. 4,145,410; Papahadjopoulos et al., U.S. Patent No. 4,235,871; Schneider, U.S. Patent No. 4,224,179; Lenk et al., U.S. Patent No. 4,522,803; 그리고 Fountain et al., U.S. Patent No. 4,588,578에서 기술된다.
다른 방법에서, 제약학적 제조물은 조직에 상기 제조물의 직접적인 적용에 의해 표적 조직과 접촉될 수 있다. 이러한 적용은 국소, "개방" 또는 "폐쇄" 절차에 의해 달성될 수 있다. "국소"는 주변 환경에 노출된 조직, 예를 들면, 피부, 입인두, 외부 오관 (external auditory canal) 등에 제약학적 제조물의 직접적인 적용을 의미한다. "개방" 절차는 환자의 피부를 절개하고 제약학적 제조물이 적용되는 기초 조직을 직접적으로 명시화하는 것을 포함하는 절차이다. 이것은 일반적으로, 외과적 절차, 예를 들면, 폐에 접근하는 개흉술 (thoracotomy), 복부 내장 (abdominal viscera)에 접근하는 복부 개복술 (abdominal laparotomy), 또는 표적 조직에 대한 다른 직접적인 외과적 접근법에 의해 달성된다. "폐쇄" 절차는 내부 표적 조직이 직접적으로 명시화되지 않지만 피부 내에 작은 상처를 통하여 기구를 삽입함으로써 접근되는 침해성 절차이다. 가령, 이들 제조물은 바늘 세척 (needle lavage)에 의해 복막 (peritoneum)에 투여될 수 있다. 유사하게, 제약학적 제조물은 요추 천자 (lumbar puncture) 동안 주입, 그 이후에 척추 마취 (spinal anesthesia) 또는 척수의 메트리자미드 화상진찰 (metrizamide imaging)을 위하여 통상적으로 실시되는 환자의 적절한 위치 결정 (positioning)에 의해 뇌막 (meninges) 또는 척추 (spinal cord)에 투여될 수 있다. 대안으로, 이들 제조물은 내시경 장치 (endoscopic device)를 통하여 투여될 수도 있다.
지질-핵산 조성물은 또한, 폐로 흡입된 에어로졸에 담겨 (참조: Brigham, et al., Am. J. ScL 298(4):278-281 (1989)), 또는 병든 부위에 직접적인 주사에 의해 (Culver, Human Gene Therapy, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, pp.70-71 (1994)) 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 호스트에서 실시될 수 있다. 바람직한 호스트에는 포유동물 종, 예를 들면, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 양 등이 포함된다.
본 발명의 지질-치료제 입자에 대한 용량은 치료제 대(對) 지질의 비율, 그리고 환자의 연령, 체중 및 상태에 기초된 담당 의사의 소견에 좌우될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명에서는 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조정하는 방법을 제시한다. 이들 방법은 일반적으로, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조정할 수 있는 핵산과 결합되는 본 발명의 지질 입자와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "조정"은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 변화시키는 것을 지칭한다. 상이한 구체예에서, 조정은 증가 또는 증강을 의미할 수 있고, 또는 조정은 축소 또는 감소를 의미할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현의 수준을 측정하는 방법은 당분야에 공지되어 있고 가용하며, 여기에는 예로써, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 이용하는 방법 및 면역조직화학적 기술이 포함된다. 특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 수준은 적절한 대조 값 (control value)과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 50% 이상 증가되거나 감소된다. 가령, 폴리펩티드의 증가된 발현이 요망되면, 핵산은 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 다른 한편, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 감소된 발현이 요망되면, 핵산은 예로써, 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 따라서 상기 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 중단시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 또는 마이크로RNA일 수 있다. 대안으로, 핵산은 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 또는 마이크로RNA를 발현하는 플라스미드일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명에서는 세포에 의한 폴리펩티드의 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 예로써, 대략 20-65%의 화학식 I의 양이온성 지질, 3-25%의 중성 지질, 15-55%의 스테롤, 그리고 0.5-15%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질의 몰 비율로, 화학식 I의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, PEG 또는 PEG-변형된 지질로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 지질 입자를 세포에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 지질 입자는 상기 폴리펩티드의 발현을 조정할 수 있는 핵산과 결합된다. 특정 구체예에서, 몰 지질 비율은 대략 60/7.5/31/1.5, 57.5/7.5/31.5/3.5, 57.2/7.1/34.3/1.4, 52/13/30/5, 50/10/38.5/1.5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 40/15/40/5, 또는 35/15/40/10 (화학식 I의 양이온성 지질/DSPC 또는 DPPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%)이다. 일부 구체예에서, 지질 입자는 또한, 표적화 모이어티, 예를 들면, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질을 포함한다 (가령, 지질 입자는 화학식 I의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, PEG 또는 PEG-변형된 지질 및 표적화 모이어티로 본질적으로 구성된다). 다른 일군의 구체예에서, 이들 조성물에서 중성 지질은 DPPC, POPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다. 다른 일군의 구체예에서, PEG 또는 PEG-변형된 지질은 PEG-DSG, PEG-DMG, 또는 PEG-DPG로 대체된다..
특정 구체예에서, 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드에서 선택되고, 그리고 여기서 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드의 발현이 감소하도록 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함한다.
다른 구체예에서, 핵산은 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편의 발현이 증가하도록 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드이다
관련된 구체예에서, 본 발명에서는 배양 중인 세포의 형질감염에 유용한 시약을 제시한다. 가령, 본 명세서에서 기술된 지질 제제는 핵산을 배양된 세포 (가령, 부착 세포, 현탁 세포 등)에 전달하는데 이용될 수 있다.
관련된 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 폴리펩티드의 과다발현으로 특징되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 상기 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드에서 선택되고, 그리고 여기서 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드의 발현이 감소하도록 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함한다.
한 구체예에서, 제약학적 조성물은 예로써, 대략 20-65%의 화학식 I의 양이온성 지질, 3-25%의 중성 지질, 15-55%의 스테롤, 그리고 0.5-15%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질 PEG-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEG-cDMA의 몰 비율로, 화학식 I의 양이온성 지질, DSPC, Chol 및 PEG-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEG-cDMA으로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 지질 입자를 포함하고, 여기서 지질 입자는 치료적 핵산과 결합된다. 특정 구체예에서, 몰 지질 비율은 대략 60/7.5/31/1.5, 57.5/7.5/31.5/3.5, 57.2/7.1/34.3/1.4, 52/13/30/5, 50/10/38.5/1.5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 35/15/40/10 또는 40/15/40/5 (화학식 I의 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%)이다. 일부 구체예에서, 지질 입자는 또한, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질을 포함한다 (가령, 지질 입자는 화학식 I의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, PEG 또는 PEG-변형된 지질 및 표적화 모이어티 (가령, GalNAc3-PEG-DSG)로 본질적으로 구성된다). 일부 구체예에서, 표적화 지질이 PEG 모이어티를 포함하고 현존하는 리포좀 제제에 첨가될 때, PEG-변형된 지질 (즉, PEG-변형된 지질, 예를 들면, PEG-DMG, 그리고 PEG-함유 표적화 지질)의 총량이 일정한 mol 백분율 (가령, 0.3%, 1.5 mol%, 또는 3.5 mol%)로 유지되도록 PEG-변형된 지질의 양이 감소된다. 다른 일군의 구체예에서, 이들 조성물에서 중성 지질은 DPPC, POPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다. 다른 일군의 구체예에서, PEG 또는 PEG-변형된 지질은 PEG-DSG 또는 PEG-DPG로 대체된다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 폴리펩티드의 과소발현으로 특징되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드이다.
본 발명에서는 또한, 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 상기 개체에 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 치료제는 면역자극 올리고뉴클레오티드이다. 일정한 구체예에서, 면역 반응은 체액 또는 점막 면역 반응이고, 그리고 제약학적 조성물은 예로써, 대략 20-65%의 화학식 I의 양이온성 지질, 3-25%의 중성 지질, 15-55%의 스테롤, 그리고 0.5-15%의 PEG 또는 PEG-변형된 지질 PEG-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEG-cDMA의 몰 비율로, 화학식 I의 양이온성 지질, DSPC, Chol 및 PEG-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEG-cDMA으로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 지질 입자를 포함하고, 여기서 지질 입자는 치료적 핵산과 결합된다. 특정 구체예에서, 몰 지질 비율은 대략 60/7.5/31/1.5, 57.5/7.5/31.5/3.5, 57.2/7.1/34.3/1.4, 52/13/30/5, 50/10/38.5/1.5, 50/10/35/5, 40/10/40/10, 35/15/40/10 또는 40/15/40/5 (화학식 I의 양이온성 지질/DSPC/Chol/PEG-DMG 또는 PEG-cDMA mol%)이다. 일부 구체예에서, 지질 입자는 또한, 본 명세서에서 기술된 표적화 지질을 포함한다 (가령, 지질 입자는 화학식 I의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤, PEG 또는 PEG-변형된 지질 및 표적화 모이어티로 본질적으로 구성된다). 일부 구체예에서, 표적화 지질이 PEG 모이어티를 포함하고 현존하는 리포좀 제제에 첨가될 때, PEG-변형된 지질 (즉, PEG-변형된 지질, 예를 들면, PEG-DMG, 그리고 PEG-함유 표적화 지질)의 총량이 일정한 mol 백분율 (가령, 0.3%, 1.5 mol%, 또는 3.5 mol%)로 유지되도록 PEG-변형된 지질의 양이 감소된다. 다른 일군의 구체예에서, 이들 조성물에서 중성 지질은 DPPC, POPC, DOPE 또는 SM으로 대체된다. 다른 일군의 구체예에서, PEG 또는 PEG-변형된 지질은 PEG-DSG 또는 PEG-DPG로 대체된다.
다른 구체예에서, 제약학적 조성물은 백신 또는 항원과 공동으로 개체에 제공된다. 따라서 본 발명은 그 자체로, 본 발명의 지질 입자를 포함하는 백신을 제시하고, 이는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 면역 반응이 요망되는 항원과 결합된다. 특정 구체예에서, 항원은 종양 항원이거나, 또는 전염성 병원체, 예를 들면, 바이러스, 세균 또는 기생충과 연관된다.
다양한 종양 항원, 전염성 병원체 항원, 그리고 다른 질환과 연관된 항원은 당분야에 충분히 공지되어 있고, 그리고 이들의 실례는 본 명세서에서 인용된 참고문헌에서 기술된다. 본 발명에 이용하기 적합한 항원의 실례에는 폴리펩티드 항원 및 DNA 항원이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항원의 특정한 실례는 A형 간염, B형 간염, 천연두, 폴리오, 비탈저, 인플루엔자, 발진티푸스, 파상풍, 홍역, 로타바이러스, 디프테리아, 백일해, 결핵, 그리고 풍진 항원이다. 한 구체예에서, 항원은 B형 간염 재조합 항원이다. 다른 측면에서, 항원은 A형 간염 재조합 항원이다. 다른 측면에서, 항원은 종양 항원이다. 이런 종양-연관된 항원의 실례는 MUC-I, EBV 항원 및 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma)과 연관된 항원이다. 또 다른 측면에서, 항원은 티로시나아제 (tyrosinase)-관련된 단백질 종양 항원 재조합 항원이다. 당업자는 본 발명에 이용하기 적합한 다른 항원을 인지할 것이다.
본 발명에 이용하기 적합한 종양-연관된 항원에는 단일 종양 유형을 지시하고, 여러 유형의 종양 간에 공유되고 및/또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 배타적으로 발현되거나 과다발현될 수 있는 돌연변이된 분자 및 비-돌연변이된 분자가 모두 포함된다. 단백질 및 당단백질 이외에, 탄수화물, 갱글리오사이드, 당지질 및 무친의 발현의 종양-특이적 패턴 역시 상세히 기록되었다. 본 발명의 암 백신에 이용되는 예시적인 종양-연관된 항원에는 암유전자의 단백질 산물, 종양 억제자 유전자 및 종양 세포에 대한 독특한 돌연변이 또는 재배열 (rearrangement)을 갖는 기타 유전자, 재활성화된 태아 유전자 산물, 암태아성 항원, 조직-특이적 (하지만 종양-특이적이지 않음) 분화 항원, 성장 인자 수용체, 세포 표면 탄수화물 잔기, 외래 바이러스 단백질, 그리고 다수의 다른 자기 단백질이 포함된다.
종양-연관된 항원의 특정 구체예에는 예로써, 돌연변이된 항원, 예를 들면, Ras p21 원형암유전자, 종양 억제자 p53 및 BCR-abl 암유전자의 단백질 산물, 그리고 CDK4, MUM1, 카스파제 8, 그리고 베타 카테닌; 과다발현된 항원, 예를 들면, 갈렉틴 (galectin) 4, 갈렉틴 9, 탄산무수효소 (carbonic anhydrase), 알돌라아제 (Aldolase) A, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 및 KSA, 암태아성 항원, 예를 들면, 알파 태아단백질 (AFP), 인간 융모성 생식샘자극호르몬 (human chorionic gonadotropin, hCG); 자기 항원, 예를 들면, 암배 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 멜라닌세포 (melanocyte) 분화 항원, 예를 들면, Mart 1/Melan A, gp1OO, gp75, 티로시나아제 (Tyrosinase), TRP1 및 TRP2; 전립선 연관된 항원, 예를 들면, PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 및 PSM-P2; 재활성화된 태아 유전자 산물, 예를 들면, MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE, 그리고 다른 암 고환 항원 (cancer testis antigen), 예를 들면, NY-ESO1, SSX2 및 SCP1; 무친, 예를 들면, Muc-1 및 Muc-2; 갱글리오사이드, 예를 들면, GM2, GD2 및 GD3, 중성 당지질, 그리고 당단백질, 예를 들면, Lewis (y) 및 globo-H; 그리고 당단백질, 예를 들면, Tn, Thomson-Friedenreich 항원 (TF) 및 sTn이 포함된다. 전체 세포 및 종양 세포 용해질, 이들의 면역원성 부분, 그리고 B 세포 림프종에 반하는 이용을 위한 B 림프구의 단일클론 증식물에서 발현되는 면역글로불린 유전자형 (idiotype) 역시 본 발명에서 종양-연관된 항원으로서 포함된다.
병원체에는 포유동물, 더욱 구체적으로 인간을 감염시키는 전염성 병원체, 예를 들면, 바이러스가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전염성 바이러스의 실례에는 레트로바이러스과 (Retroviridae) (가령, 인간 면역결핍 바이러스, 예를 들면, HIV-I (일명, HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III; 그리고 다른 분리물, 예를 들면, HIV-LP)); 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) (가령, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내 바이러스 (enterovirus), 인간 콕사키 바이러스 (human Coxsackie virus), 리노바이러스 (rhinovirus), 에코바이러스 (echovirus)); 칼시바이러스과 (Calciviridae) (가령, 위장염 (gastroenteritis)을 유발하는 계통); 토가바이러스과 (Togaviridae) (가령, 마 뇌염 바이러스 (equine encephalitis virus), 풍진 바이러스 (rubella virus)); 플래비바이러스과 (Flaviridae) (가령, 뎅기열 바이러스 (dengue virus), 뇌염 바이러스 (encephalitis virus), 황열 바이러스 (yellow fever virus)); 코로나바이러스과 (Coronaviridae) (가령, 코로나바이러스 (coronavirus)); 랍도바이러스 (Rhabdoviridae) (가령, 소수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스 (rabies virus)); 코로나바이러스과 (Coronaviridae) (가령, 코로나바이러스 (coronavirus); 랍도바이러스 (Rhabdoviridae) (가령, 소수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스 (rabies virus)); 필로바이러스과 (Filoviridae) (가령, 에볼라 바이러스 (ebola virus)); 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae) (가령, 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 이하선염 바이러스 (mumps virus), 홍역 바이러스 (measles virus), 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus)); 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae) (가령, 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)); 분야바이러스과 (Bungaviridae) (가령, 한탄 바이러스 (Hantaan virus), 분야 바이러스 (bunya virus), 플레보바이러스 (phlebovirus) 및 나이로 바이러스 (Nairo virus)); 아레나 바이러스과 (Arena viridae) (출혈열 바이러스 (hemorrhagic fever virus)); 레오바이러스과 (Reoviridae) (가령, 레오바이러스 (reovirus), 오르비바이러스 (orbivirus) 및 로타바이러스 (rotavirus)); 버나바이러스과 (Birnaviridae); 간염바이러스과 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보바이러스과 (Parvovirida) (파르보바이러스 (parvovirus)); 파포바바이러스과 (Papovaviridae) (유두종 바이러스 (papilloma virus), 폴리오마 바이러스 (polyoma virus)); 아데노바이러스과 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스 (adenovirus)); 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus, HSV) 1과 2, 수두대상포진 바이러스 (varicella zoster virus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus, CMV), 헤르페스 바이러스 (herpes virus)); 폭스바이러스과 (Poxviridae) (두창 바이러스 (variola virus), 우두 바이러스 (vaccinia virus), 폭스 바이러스 (pox virus)); 이리도바이러스과 (Iridoviridae) (가령, 아프리카 돼지 열 바이러스 (African swine fever virus)); 미분류 바이러스 (unclassified virus) (가령, 해면상 뇌증 (Spongiform encephalopathy)의 병원체, 델타 간염 (B형 간염 바이러스의 결함성 종자 (defective satellite)인 것으로 생각됨)의 병원체, 비-A형, 비-B형 간염 (클래스 1=체내에서 전염됨; 클래스 2=비경구 전염된 (즉, C형 간염)의 병원체; 노워크 (Norwalk) 및 관련된 바이러스, 그리고 아스트로 바이러스 (astro virus))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
또한, 그람 음성 및 그람 양성 세균이 척추동물에서 항원으로서 기능한다. 이런 그람 양성 세균에는 파스튜렐라성 종 (Pasteurella species), 스타필로코커스 종 (Staphylococci species), 그리고 스트렙토코커스 종 (Streptococcus species)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 그람 음성 박테리아에는 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 종 (Pseudomonas species), 그리고 살모넬라 종 (Salmonella species)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전염성 세균의 특정 실례에는 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella Pneumophila), 마이코박테리아 (Mycobacteria) 종 (가령, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (M. tuberculosis), 마이코박테리움 아비움 (M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰레어 (M. intracelle), 마이코박테리움 칸사이 (M. kansaii), 마이코박테리움 고르도나 (M. gordonae)), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 임균 (Neisseria gonorrhoeae), 수막염균 (Neisseria meningitidis), 리스테리아균 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 파이오진스 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티에 (Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 비리단스 (Streptococcus viridans) 그룹, 스트렙토코커스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (Streptococcus) (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 장구균 (Enterococcus) 종, 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 바실루스 안트라시스 (Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아 (corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 (corynebacterium) 종, 에리시펠로트릭스 루시오페이취 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringers), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스 (Enterobacter aerogenes), 폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 (Bacteroides) 종, 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모닐리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움 (Treponema pallidium), 트레포네마 퍼테뉴 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케차 (Rickettsia), 그리고 악티노미세스 이스라엘리 (Actinomyces israelii)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
병원체의 추가 실례에는 포유동물, 더욱 구체적으로 인간을 감염시키는 전염성 진균류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전염성 진균류의 실례에는 크립토코커스 네오포만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슬라툼 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이시즈 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전염성 기생충의 실례에는 말라리아 병원충 (Plasmodium), 예를 들면, 열대열 원충 (Plasmodium falciparum), 사일열 원충 (Plasmodium malariae), 난형열 원충 (Plasmodium ovale), 그리고 삼일열 원충 (Plasmodium vivax)이 포함된다. 기타 전염성 생물체 (즉, 원생생물 (protist))에는 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii)가 포함된다.
제약학적 조성물
한 구체예에서, 본 발명에서는 본 명세서에서 기술된 간 스크리닝 모형에 의해 확인된 핵산 작용제를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 이러한 조성물은 작용제, 예를 들면, dsRNA, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 제약학적 조성물은 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 이들 제약학적 조성물은 전달 양식에 기초하여 조제된다. 한 가지 실례는 비경구 전달에 의한 전신 투여용으로 조제되는 조성물이다.
확인된 작용제를 포함하는 제약학적 조성물은 표적 유전자, 예를 들면, VII 인자 유전자의 발현을 저해하는데 충분한 용량으로 투여된다. 일반적으로, dsRNA 작용제의 적절한 용량은 일일 수용자 체중 ㎏당 0.01 내지 5.0 ㎎의 범위, 일반적으로 일일 수용자 체중 ㎏당 1 ㎍ 내지 1 ㎎의 범위에 있을 것이다. 제약학적 조성물은 일일 1회 투여되거나, 또는 dsRNA는 하루 동안 적절한 간격에서, 또는 심지어 서방 제제를 통한 연속 주입 또는 전달을 이용하여 2회, 3회, 또는 그 이상의 하위 복용량 (dose)으로 투여될 수 있다. 상기 경우에, 각 하위 복용량에 포함되는 dsRNA는 일일 총량 (total daily dosage)을 달성하기 위하여 상대적으로 더욱 적어야 한다. 이러한 투약 단위 (dosage unit)는 또한, 예로써, 수일에 걸쳐 dsRNA의 지속 방출을 제공하는 전통적인 지속 방출 제제를 이용하여, 수일 동안 전달을 위하여 조제될 수 있다. 지속 방출 제제는 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 작용제의 질내 전단에 특히 유용하고 예로써, 본 발명의 작용제와 함께 이용될 수 있다. 상기 구체예에서, 이러한 투약 단위는 일일 복용량 (daily dose)의 상응하는 배량을 포함한다.
당업자는 질환 또는 장애의 심각도, 이전 치료, 개체의 전반적인 건강 및/또는 연령, 그리고 존재하는 다른 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 일정한 인자가 개체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 용량 및 시간 조정 (timing)에 영향을 줄 수 있다는 것을 인지할 것이다. 게다가, 치료 효과량의 조성물로 개체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개별 dsRNA에 대한 효과적인 용량 및 생체내 반감기의 평가는 본 명세서의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 전통적인 방법을 이용하여, 또는 적절한 동물 모형을 이용한 생체내 검사에 기초하여 달성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 지질-핵산 입자를 포함하는 제약학적 조성물은 표준 기술에 따라 제조되고, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 포함한다. 일반적으로, 통상의 염수가 제약학적으로 허용되는 담체로서 이용될 것이다. 다른 적절한 담체에는 예로써, 증강된 안정성을 위한 당단백질, 예를 들면, 알부민, 지단백, 글로불린 등을 비롯하여, 물, 완충된 물, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 포함된다. 염수 또는 기타 염 함유 담체를 포함하는 조성물에서, 담체는 바람직하게는 지질 입자 형성 이후에 첨가된다. 따라서 지질-핵산 조성물이 형성된 이후에, 이들 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 통상의 염수 내로 희석될 수 있다.
결과의 제약학적 제조물은 널리 공지된 전통적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수성 용액은 이후, 이용을 위하여 포장되거나, 또는 무균 조건 하에 여과되고 동결 건조되며, 동결 건조된 제조물은 투여에 앞서 무균 수성 용액과 합쳐진다. 이들 조성물은 생리 조건을 근사하기 위하여 요구되는 제약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, pH 조정제 및 완충제, 삼투압 조절제 (tonicity adjusting agent) 등, 예를 들면, 나트륨 아세트산염, 나트륨 젖산염, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 포함할 수 있다. 부가적으로, 지질성 현탁액은 보관 동안 유리-라디칼 및 지질-과산화성 손상으로부터 지질을 보호하는 지질-보호제를 포함할 수 있다. 친유성 유리-라디칼 소거제 (quencher), 예를 들면, α-토코페롤 및 물-용해성 철-특이적 킬레이터 (chelator), 예를 들면, 페리옥사민 (ferrioxamine)이 적합하다.
제약학적 제제 내에서 지질 입자 또는 지질-핵산 입자의 농도는 중량으로 대략 0.01% 이하, 일반적으로 적어도 대략 0.05-5%에서 10 내지 30%까지 폭넓게 변할 수 있고, 그리고 선택된 특정 투여 방식에 따라서, 일차적으로 유체 부피, 점성 등에 의해 선택될 것이다. 가령, 농도는 치료와 연관된 유체 하중 (fluid load)을 낮추기 위하여 증가될 수 있다. 이것은 특히, 동맥경화증-연관된 울혈성 심부전 또는 심각한 고혈압을 앓는 환자에서 바람직할 수 있다. 대안으로, 자극성 지질로 구성되는 복합체는 투여 부위에서 염증을 감소시키기 위하여 낮은 농도로 희석될 수 있다. 일군의 구체예에서, 핵산은 부착된 라벨을 보유하고 진단 (상보성 핵산의 존재를 지시함으로써)에 이용될 것이다. 이러한 경우에, 투여되는 복합체의 양은 이용된 특정 라벨, 진단되는 질환 상태 및 의사의 판단에 좌우되지만 일반적으로, 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 대략 50 ㎎ (가령, 핵산 작용제), 바람직하게는 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 대략 5 ㎎일 것이다. 일부 구체예에서, 투여된 복합제는 체중 ㎏당 대략 0.004 내지 대략 50 ㎎의 핵산 작용제 (가령, 대략 0.006 ㎎/㎏ 내지 대략 0.2 ㎎/㎏)를 포함한다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 지질-치료제 (가령, 핵산) 입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 인지질, PEG-세라미드, 또는 갱글리오사이드 GM1-변형된 지질, 또는 집합 (aggregation)을 예방하거나 제한하는데 효과적인 다른 지질을 포함할 수 있다. 이런 성분의 첨가는 단지 복합체 집합만을 예방하는 것은 아니다. 오히려, 이것은 순환 수명 (circulation lifetime)을 증가시키고 표적 조직에 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키기 위한 수단 역시 제공할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 키트 형태로 지질-치료제 조성물을 제시한다. 키트는 전형적으로, 상기 키트의 다양한 원소를 유지하기 위하여 구획화되는 용기로 구성될 것이다. 키트는 재수화 또는 희석 및 투여를 위한 사용설명서와 함께, 바람직하게는 탈수된 또는 농축된 형태로, 본 발명의 입자 또는 제약학적 조성물을 포함할 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 입자는 활성제를 포함하지만 다른 구체예에서, 활성제를 포함하지 않는다.
간 스크리닝 모형에 의해 확인된 작용제를 포함하는 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요망되는 지의 여부 및 치료되는 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소, 폐, 예를 들면, 분무기에 의한 분말 또는 에어로졸의 흡입에 의해; 기관내, 비내, 표피 및 경피), 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여는 또한, 예로써 관절 내로 직접적인 관절내 주사에 의해, 장과 내장에 직접적인 전달을 위한 직장 투여에 의해, 자궁경부와 질에 전달을 위한 질내 투여에 의해, 눈에 전달을 위한 유리체강내 (intravitreal) 투여에 의한 국소 전달을 통하여 특정 조직에 우선적인 국지화를 유발하도록 설계될 수 있다. 비경구 투여에는 정맥내, 동맥내, 관절내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들면, 수막공간내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
국소 투여를 위한 제약학적 조성물 및 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점안약, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 전통적인 제약학적 담체, 수성 분말 또는 유성 염기, 농후제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 바람직한 국소 제제에는 본 발명의 dsRNA가 국소 전달 성분, 예를 들면, 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 또는 계면활성제와 혼합되는 것들이 포함된다. 바람직한 지질 및 리포좀에는 중성 (가령, 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 디미리스토일포스파티딜 콜린 (DMPC), 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성 (가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤, 또는 DMPG) 및 양이온성 (가령, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다. 본 발명의 dsRNA는 리포좀 내에 캡슐화되거나, 또는 이들 리포좀, 특히 양이온성 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, dsRNA는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합될 수 있다. 바람직한 지방산 및 에스테르에는 아라키돈산 (arachidonic acid), 올레산 (oleic acid), 에이코사노산 (eicosanoic acid), 라우르산 (lauric acid), 카프릴산 (caprylic acid), 카프르산 (capric acid), 미리스트산 (myristic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 디카프레이트 (dicaprate), 트리카프레이트 (tricaprate), 모노올레인 (monoolein), 딜라우린 (dilaurin), 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴 (acylcarnitine), 아실콜린 (acylcholine), 또는 C1-10 알킬 에스테르 (가령, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 국소 제제는 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 1999년 5월 20일 제출된 U.S. patent application Ser. No. 09/315,298에서 상세하게 기술된다.
경구 투여를 위한 조성물과 제제에는 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비-수성 매체에서 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제가 포함된다. 농후제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 접합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 dsRNA가 하나 또는 그 이상의 침투 증강제, 계면활성제 및 킬레이터와 공동으로 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제에는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이들의 염이 포함된다. 바람직한 담즙산/염에는 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid, CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산 (ursodeoxychenodeoxycholic acid, UDCA), 콜산 (cholic acid), 데히드로콜산 (dehydrocholic acid), 데옥시콜산 (deoxycholic acid), 글루콜산 (glucholic acid), 글리콜산 (glycholic acid), 글리코데옥시콜산 (glycodeoxycholic acid), 타우로콜산 (taurocholic acid), 타우로데옥시콜산 (taurodeoxycholic acid), 나트륨 타우로-24,25-디히드로-후시데이트 및 나트륨 글리코데옥시후시데이트 (sodium glycodeoxyfusidate)가 포함된다. 바람직한 지방산에는 아라키돈산 (arachidonic acid), 운데카노산 (undecanoic acid), 올레산 (oleic acid), 라우르산 (lauric acid), 카프릴산 (caprylic acid), 카프르산 (capric acid), 미리스트산 (myristic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid), 리놀레산 (linoleic acid), 리놀렌산 (linolenic acid), 디카프레이트 (dicaprate), 트리카프레이트 (tricaprate), 모노올레인 (monoolein), 딜라우린 (dilaurin), 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴 (acylcarnitine), 아실콜린 (acylcholine), 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 (가령, 나트륨)이 포함된다. 또한, 침투 증강제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과 공동으로 지방산/염이 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 다른 침투 증강제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 발명의 dsRNA는 분무되고 건조된 입자를 포함하는 과립상 형태로 경구 전달되거나, 또는 마이크로 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. dsRNA 복합화제 (complexining agent)에는 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴 (cationized gelatin), 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화된 폴리이민, 폴룰란 (pollulan), 셀룰로오스 및 전분이 포함된다. 특히 바람직한 복합화제에는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌 (가령, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락트-코-글리콜산 (PLGA), 알기네이트, 그리고 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이 포함된다. dsRNA에 대한 경구 제제 및 이들의 제조는 U.S. application. Ser. No. 08/886,829 (1997년 7월 1일 제출됨), Ser. No. 09/108,673 (1998년 7월 1일 제출됨), Ser. No. 09/256,515 (1999년 2월 23일 제출됨), Ser. No. 09/082,624 (1998년 5월 21일 제출됨) 및 Ser. No. 09/315,298 (1999년 5월 20일 제출됨)에서 상세하게 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
비경구, 수막공간내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 완충액, 희석제, 그리고 침투 증강제, 담체 화합물 및 기타 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 적절한 첨가제를 또한 함유하는 무균 수성 용액을 포함할 수 있다.
제약학적 조성물에는 용액, 에멀젼, 그리고 리포좀-함유 제제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자기-유화 고체 및 자기-유화 반고체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 성분으로부터 산출될 수 있다.
단위 약형 (unit dosage form)으로 편의하게 제공될 수 있는 제약학적 제제는 제약 업계에서 널리 공지된 전통적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이런 기술은 활성 성분을 제약학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 갈라진 고형 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시키고, 이후 필요한 경우에, 산물의 형체를 이룸으로써 제조된다.
이들 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연성 겔, 좌약, 그리고 관장제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 많은 다양한 약형 (dosage form)으로 조제될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 수성, 비-수성 또는 혼성 매체에서 현탁액으로서 조제될 수 있다. 수성 현탁액은 예로써, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 비롯하여, 현탁액의 점성을 증가시키는 일정한 물질을 더욱 포함할 수 있다. 현탁액은 또한, 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 제약학적 조성물은 조제되고 거품으로서 이용될 수 있다. 제약학적 거품에는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리 및 리포좀이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 제제가 포함된다. 성질 면에서 기본적으로 유사하긴 하지만, 이들 제제는 최종 산물의 성분 및 경도 (consistency)에서 변한다. 이런 조성물 및 제제의 제조는 일반적으로, 제약 및 조제 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 그리고 본 발명의 조성물의 제제에 적용될 수 있다.
본 발명은 아래의 설명에서 열거된 성분의 구조 상세 및 정렬에 무제한적으로 적용된다. 본 발명은 다른 구체예가 가능하고, 그리고 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 이용된 어법 및 용어는 설명을 목적으로 하고 한정하는 것으로 간주되지 않는다. 본 명세서에서, "보유하는", "포함하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", 그리고 이들의 변형의 이용은 하기에 열거된 항목, 이들의 등가물, 그리고 추가 항목을 포괄하는 것으로 의도된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 생쥐 모형에서 FVII의 침묵에 대한, DLin-M-C3-DMA를 포함하는 지질 제제의 효과를 보여주는 막대그래프이다.
도 2는 다양한 리포좀 조성물로 쥐에서 MC3의 용량 반응을 보여주는 막대그래프이다.
도 3은 MC3을 포함하는 제제의 효능의 ApoE 의존을 보여주는 막대그래프이다. 야생형 생쥐는 FVII 단백질 수준에서 용량-의존성 감소를 보이는 반면, ApoE 녹아웃 생쥐는 그렇지 않았다. 도 2는 또한, MC3 리포좀 제제의 ApoE 의존 및 MC3을 이용한 ApoE KO 생쥐에서 침묵의 결핍이 ApoE와 미리 혼합함으로써 효과적으로 구제될 수 있다는 것을 증명하는 그래프를 도시한다.
도 4는 리포좀 제제 내에서 MC3의 몰 백분율에서 편차의 효과 및 중성 지질에서 변화 (가령, DSPC, DMPC, 그리고 DLPC로 중성 지질의 변화)의 효과를 보여주는 막대그래프이다.
도 5는 생쥐에서 증가하는 PEG-차폐 (shielding)가 비-GalNAc-매개된 침묵을 감소시킨다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 6은 쥐에서 증가하는 PEG-차폐 (shielding)가 비-GalNAc-매개된 침묵을 감소시킨다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 7은 GalNAc과 함께 및 GalNAc 없이, 상이한 mol%의 MC3을 포함하는 리포좀 제제의 효능을 보여주는 막대그래프이다.
도 8은 GalNAc-표적화된 리포좀의 활성이 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 녹아웃 생쥐에서 소멸된다는 것을 보여주는 막대그래프이다.
도 9는 실시예 17에서 제조된 제제에 대한 잔여 FVII % 및 용량 (㎎/㎏)의 용량 반응 곡선이다.
도 10은 실시예 18에서 결정된 바와 같은, 화학식 I의 양이온성 지질의 pKa 적정 곡선이다.
실시예
아래의 실시예는 예시를 위하여 제공되지만 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
본 명세서에서 제공된 실시예에서, 용어 "ApoE"는 달리 명시되지 않으면, ApoE3을 지칭한다.
실시예 1: Luc 및 FVII 표적화를 위한 siRNA 이중나선.
하기 표 8에서는 Luc 및 FVII의 표적화를 위한 예시적인 서열을 제공한다.
[표 8]
Figure 112021005370664-pat00024
주의: L8은
Figure 112021005370664-pat00025
이고, 소문자는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이고, *는 포스포로티오에이트 중추 연쇄이고, fN은 2'-플루오르 뉴클레오티드이고, dN은 2'-데옥시 뉴클레오티드이다.
실시예 2: 양이온성 지질 유래된 리포좀을 이용한 FVII 생체내에서 평가
생체내 설치류 VII 인자 및 ApoB 인자 침묵 실험. C57BL/6 생쥐 (Charles River Labs, MA) 및 Sprague-Dawley 쥐 (Charles River Labs, MA)는 0.01 ㎖/g의 부피에서 꼬리 정맥 주사에 의해 염수, 또는 원하는 제제에 담긴 siRNA가 투여되었다. 투여후 다양한 시점에서, 동물은 이소플루란 흡입에 의해 마취되고, 그리고 혈액은 후안구 혈액 (retroorbital bleed)에 의해 혈청 분리기 튜브 내로 수집되었다. VII 인자 단백질의 혈청 수준은 제조업자의 프로토콜에 따른 색원체 분석평가 (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH, 또는 Biophen FVII, Aniara Corporation, OH)를 이용하여 샘플에서 결정되었다. 표준 곡선은 염수 치료된 동물로부터 수집된 혈청을 이용하여 산출되었다. 간 mRNA 수준이 투여후 다양한 시점에서 평가되는 실험에서, 동물은 희생되고, 그리고 간은 수확되고 액체 질소에서 스냅 동결되었다. 동결된 간 조직은 분말로 으깨어졌다. 조직 용해질이 제조되고, 그리고 VII 인자 및 apoB의 간 mRNA 수준은 가지화 DNA 분석평가 (QuantiGene Assay, Panomics, CA)를 이용하여 결정되었다.
실시예 3: VII 인자 표적화를 위한 리포좀 제제.
응고 캐스케이드 (coagulation cascade)에서 주도적 단백질인 VII 인자 (FVII)는 간세포 (hepatocyte)에서 합성되고 혈장 내로 분비된다. 혈장 내에서 FVII 수준은 간단한, 평판-기초된 비색 분석평가에 의해 결정될 수 있다. 따라서 FVII는 간세포-유래된 단백질의 siRNA-매개된 하향 조절을 결정하고, 그리고 핵산 지질 입자 및 siRNA의 혈장 농도 및 조직 분포를 모니터링하기 위한 편의한 모형을 대표한다.
생쥐에서 VII 인자 녹다운
FVII 활성은 C57BL/6 생쥐에서 정맥내 (일시) 주사후 24시간 시점에 FVII siRNA-치료된 동물에서 평가되었다. FVII는 마이크로평판 규모에서 제조업체의 지시에 따라서, 혈청 또는 조직 내에 단백질 수준을 결정하기 위한 상업적으로 가용한 키트를 이용하여 측정되었다. FVII 감소는 치료되지 않은 대조 생쥐와 비교하여 결정되고, 그리고 그 결과는 잔여 FVII %로서 표시되었다. 4가지 용량 수준 (2, 5, 12.5, 25 ㎎/㎏ FVII siRNA)이 각 신규한 리포좀 조성물의 최초 스크린에 이용되었고, 그리고 이러한 투약은 최초 스크린에서 획득된 결과에 기초하여 차후 연구에서 확대되었다.
관용성 (tolerability)의 결정
각 신규한 리포좀성 siRNA 제제의 관용성은 체중 변화, 케이지안 관찰, 임상 화학 (clinical chemistry) 및 일부 경우에, 혈액학 (hematology)을 모니터링함으로써 평가되었다. 동물 체중은 치료 직전 및 치료후 24시간 시점에 기록되었다. 데이터는 체중 변화 %로 기록되었다. 체중 측정에 더하여, 간 기능 마커를 비롯한 정규 임상 화학 패널이 FVII 분석을 위하여 수집된 혈청의 분취량 (aliquot)을 이용한 주사후 24시간 시점에, 각 용량 수준 (2, 5, 12.5 및 25 ㎎/㎏ siRNA)에서 획득되었다. 샘플은 분석을 위하여 Central Laboratory for Veterinarians (Langley, BC)로 보내졌다. 일부 경우에, 혈액학 분석을 위한 전혈 (whole blood)의 수집을 가능하게 하기 위하여 추가의 생쥐가 치료 군에 포함되었다.
치료적 지수의 결정
치료적 지수 (therapeutic index, TI)는 독성 및 활성의 척도를 비교함으로써 산출된 임의의 파라미터이다. 이들 연구를 위하여, TI는 아래와 같이 결정되었다:
TI = MTD (최대 관용량) / ED50 (50% FVII 녹다운을 위한 용량)
이들 연구를 위한 MTD는 체중에서 >7% 감소, 그리고 설치류에서 간 손상에 대한 우수한 특이성을 갖는 임상 화학 마커인 알라닌 아미노전이효소 (ALT)에서 >200-배 감소를 유발하는 최소량으로서 설정되었다. ED50은 FVII 용량-활성 곡선으로부터 결정되었다.
실시예 1에서 제공된 바와 같은 AD 1661 siRNA는 아래의 몰 비율의 DLin-M-C3-DMA:DSPC:Chol:PEG-DMG를 포함하는 제제가 투여되었는데, 이들은 실시예 2에서 기술된 바와 같은 방법으로 제조되고 검사되었다: 60:7.5:31:1.5; 50:10:38:.5:1.5; 그리고 40:20:38.5:1.5. 이들 생체내 실험의 결과는 도 1에서 제공되고, 조사된 제제의 침묵 능력을 증명한다.
실시예 4. 1,2-디-O-알킬- sn 3-카르바모일글리세리드 (PEG-DMG)의 제조
Figure 112021005370664-pat00026
IVa의 제조
1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세리드 Ia (30 g, 61.80 mmol) 및 N,N'-숙시니미딜카보네이트 (DSC, 23.76 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (DCM, 500 ㎖)에 넣어지고, 그리고 얼음물 혼합물에서 교반되었다. 트리에틸아민 (TEA, 25.30 ㎖, 3 eq)이 교반 용액에 첨가되고, 그리고 차후에, 반응 혼합물은 주위 온도에서 하룻밤동안 교반되었다. 반응의 진행은 TLC에 의해 모니터링되었다. 반응 혼합물은 DCM (400 ㎖)으로 희석되고, 그리고 유기 층은 물 (2X500 ㎖), 수성 NaHCO3 용액 (500 ㎖)으로 세척되고, 그 이후에 표준 작업 (standard work-up)이 수행되었다. 획득된 잔류물은 주위 온도에서 높은 진공 하에 하룻밤동안 건조되었다. 건조 이후에, 이렇게 획득된 가공되지 않은 카보네이트 IIa는 디클로메탄 (500 ㎖)에 용해되고 얼음 중탕 (ice bath)에서 교반되었다. 교반 용액에, mPEG20OO-NH2 (III, 103.00 g, 47.20 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 무수성 피리딘 (Py, 80 ㎖, 과량)이 아르곤 하에 첨가되었다. 반응 혼합물은 이후, 주위 온도에서 하룻밤동안 교반되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 DCM (200 ㎖)에 용해되고 에틸 아세트산염에서 패킹 (packing)된 실리카 겔의 칼럼에 채워졌다. 상기 칼럼은 먼저, 에틸 아세트산염으로 용리되고, 그 이후에 디클로메탄에서 5-10% 메탄올의 농도차 (gradient)로 용리되어 원하는 PEG-지질 IVa가 백색 고체 (105.30g, 83%)로서 제공되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.20-5.12(m, 1H), 4.18-4.01(m, 2H), 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H), 1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2660-2836.
IVb의 제조
1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세리드 Ib (1.00 g, 1.848 mmol) 및 DSC (0.710 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (20 ㎖)에 함께 넣어지고 얼음물 혼합물에서 0℃로 냉각되었다. 트리에틸아민 (1.00 ㎖, 3eq)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 TLC에 의해 추적되고, DCM으로 희석되고, 물 (2회), NaHCO3 용액으로 세척되고, 그리고 황산나트륨에서 건조되었다. 용매는 감압 하에 제거되고, 그리고 화합물 IIb의 생성된 잔류물은 높은 진공 하에 하룻밤동안 유지되었다. 이 화합물은 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 이용되었다. MPEG2000-NH2 III (1.50g, 0.687 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 IIb (0.702g, 1.5eq)는 아르곤 하에 디클로메탄 (20 ㎖)에 용해되었다. 반응물은 0℃로 냉각되었다. 피리딘 (1 ㎖, 과량)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응은 TLC에 의해 모니터링되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 크로마토그래피 (농도차 용리로서 먼저, 에틸 아세트산염, 그 이후에 5-10% MeOH/DCM)에 의해 정제되어 원하는 화합물 IVb가 백색 고체 (1.46 g, 76%)로서 획득되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.17(t, J= 5.5Hz, 1H), 4.13(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.05(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.82-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.05-1.90(m, 2H), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.61-1.45(m, 6H), 1.35-1.17(m, 56H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2716-2892.
IVc의 제조
1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세리드 Ic (4.00 g, 6.70 mmol) 및 DSC (2.58 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (60 ㎖)에 함께 넣어지고 얼음물 혼합물에서 0℃로 냉각되었다. 트리에틸아민 (2.75 ㎖, 3eq)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 TLC에 의해 추적되고, DCM으로 희석되고, 물 (2회), NaHCO3 용액으로 세척되고, 그리고 황산나트륨에서 건조되었다. 용매는 감압 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 높은 진공 하에 하룻밤동안 유지되었다. 이 화합물은 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 이용되었다. MPEG2000-NH2 III (1.50g, 0.687 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 IIc (0.760g, 1.5eq)는 아르곤 하에 디클로메탄 (20 ㎖)에 용해되었다. 반응물은 0℃로 냉각되었다. 피리딘 (1 ㎖, 과량)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응은 TLC에 의해 모니터링되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 크로마토그래피 (농도차 용리로서 먼저, 에틸 아세트산염, 그 이후에 5-10% MeOH/DCM)에 의해 정제되어 원하는 화합물 IVc가 백색 고체 (0.92 g, 48%)로서 획득되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.22-5.15(m, 1H), 4.16(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.06(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.81-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.60-1.48(m, 4H), 1.31-1.15(m, 64H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2774-2948.
실시예 5: DLin-M-C3-DMA (즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조
디클로메탄 (5 ㎖)에서 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올 (0.53 g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 염산염 (0.51 g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘 (0.61g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 (0.53 g)의 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반되었다. 생성된 용액은 희석된 염산염, 그 이후에 희석된 수성 중탄산나트륨으로 세척되었다. 유기 분획물은 무수성 황산마그네슘에서 건조되고, 여과되고, 그리고 회전증발기 (rotovap)에서 용매가 제거되었다. 잔류물은 1-5% 메탄올/디클로메탄 농도차 용리를 이용하여 실리카 겔 칼럼 (20 g)에서 걸러진다. 정제된 산물을 포함하는 분획물은 합쳐지고, 그리고 용매가 제거되어 무색 오일 (0.54 g)이 산출되었다.
본 발명의 화합물은 본 발명에 참조로서 편입되는 하기 논문에서 기술된 절차에 의해 합성될 수 있다:
1. Schlueter, Urs; Lu, Jun; Fraser-Reid, Bert. Synthetic Approaches To Heavily Lipidated Phosphoglyceroinositides. Organic Letters (2003), 5(3), 255-257.
2. King, J. F.; Allbutt, A. D. Can. J. Chem. 1970, 48, 1754-1769
3. Mach, Mateusz; Schlueter, Urs; Mathew, Felix; Fraser-Reid, Bert; Hazen, Kevin C. Comparing n-pentenyl orthoesters and n-pentenyl glycosides as alternative glycosyl donors. Tetrahedron (2002), 58(36), 7345-7354.
실시예 6: 쥐에서 다양한 리포좀 조성을 갖는 MC3 리포좀의 효능
쥐에서 MC3 함유 리포좀 제제의 용량 반응을 조사하기 위하여, 아래의 리포좀 제제가 본질적으로 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조되었다. 하기 표에 제시된 바와 같이, 포함되는 성분은 아래와 같이 지시된다: MC3-DSPC-콜레스테롤.-PEG-C14. 하기 표 9에서는 조사된 예시적인 제제를 제시한다.
[표 9]
Figure 112021005370664-pat00027
도 2에서 확인되는 바와 같이, 50 mol% MC3을 포함하는 리포좀 제제는 40 mol% MC3을 포함하는 리포좀 제제의 용량 반응 곡선보다 약간 낮은 siRNA 농도에서 유효한 용량 반응 곡선을 보였다.
실시예 7: MC3 리포좀의 효능은 생쥐에서 ApoE 의존을 나타낸다.
다양한 리포좀 제제의 효능에서 ApoE의 역할을 더욱 조사하기 위하여, 야생형 및 ApoE 녹아웃 생쥐는 본질적으로 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 0.1, 0.03, 그리고 0.01 ㎎/㎏으로, AD-1661 siRNA 조성물을 포함하는 MC3 리포좀이 투여되었다. 이들 리포좀 제제 중에서 절반은 ApoE의 외부적 첨가가 생쥐에서 상기 단백질의 부재를 극복할 수 있는 지를 결정하기 위하여 재조합 ApoE 단백질과 미리 혼합되었다. 하기 표 10에서는 조사된 예시적인 제제를 제시한다.
[표 10]
Figure 112021005370664-pat00028
도 3에서는 MC3-조제된 리포좀이 투여될 때, 야생형 (오른쪽 막대)에서 FVII 단백질 수준이 용량 의존성으로 약화되지만 ApoE 결함성 녹아웃 생쥐 (왼쪽 막대)에서는 그렇지 않다는 것을 보여주고, 이는 세포 흡수 및/또는 간으로 전달에서 ApoE의 역할을 암시한다. 1661 siRNA로 앞서 기술된 바와 같이 조제된 MC3 리포좀은 단독으로, 또는 ApoE 지단백질과 미리 혼합되어, 0.1, 0.03, 그리고 0.01 ㎎/㎏의 농도로 투여되었다. 하지만, 훨씬 높은 용량 (가령, ~ 1.0 ㎎/㎏ 또는 그 이상)에서, MC3-조제된 제제는 FVII mRNA 및 단백질의 침묵을 매개하는 것으로 밝혀졌다 (결과 제시되지 않음). 도 3에서 확인되는 바와 같이, 조사된 MC3 조제된 리포좀 제제는 재조합 ApoE와 미리 혼합되지 않으면, ApoE 녹아웃 생쥐에서 FVII의 침묵을 매개할 수 없다. 따라서 활성은 MC3 (MC3-함유 리포좀)을 ApoE와 미리 혼합함으로써 ApoE 녹아웃 생쥐에서 복원될 수 있다.
실시예 8: 포스포콜린의 몰 백분율 및 꼬리 길이에서 변하는 MC3 함유 리포좀 제제의 효능.
다양한 리포좀 제제의 효능에 대한 포스포콜린의 몰 백분율 및 꼬리 길이에서 변화의 효과를 조사하기 위하여, DSPC, DMPC 및 DLPC를 포함하는 다양한 제제가 0.01 또는 0.03 ㎎/㎏에서 FVII 침묵의 효능에 대하여 조사되었다. 하기 표 11에서는 조사된 예시적인 제제를 제시한다:
[표 11]
Figure 112021005370664-pat00029
도 4에서는 MC3의 몰 백분율에서 변화의 효과를 보여주고, 예로써, 50 및 40 몰%, 그리고 DMPC 함유 제제의 경우에, 50, 40 및 30 몰%을 비교한다, 도 4에서는 또한, 중성 지질에서 변화의 효과를 보여주고, DSPC, DMPC, 그리고 DLPC를 포함하는 MC3 리포좀 제제에 대한 차별되는 결과를 도시한다.
실시예 9: 리포좀 제제 내로 GalNAc 지질의 함입.
잠재적인 대안적 전달 기전을 모색하기 위하여, N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 접합된 지질을 포함하는 리포좀 제제를 이용하여 생체내 실험이 실행되었다. GalNAc는 GalNAc 수용체가 간에서 고도로 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에, 가능한 표적화 리간드로서 선택되었다. 이런 이유로, 화학식 III의 GalNAc3-PEG-DSG 지질을 더욱 포함하는 MC3 함유 리포좀 제제의 효능을 조사하기 위하여 본질적으로 실시예 2에서 기술된 바와 같이 생쥐 및 쥐에서 연구가 실행되었다. 모든 실험에서, PEG-접합된 지질의 총량은 일정하게 유지되었다 (가령, 0.5% mol의 GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 0.5% mol 감소하였다). 상기 실험에서 유전형 (genotype)당 각 9개 군에 대하여 4마리 동물이 이용되었다.
하기 표 12에서는 5% PEG 지질 농도를 갖는 MC3 함유 리포좀을 비롯한, 이들 방법에 대한 실험적 상세를 제시하고, 여기서 이들 제제는 C57BL6 생쥐에서 조사되었다. 이들 리포좀은 아래의 상대적인 몰 양을 포함하였다: 50/10/35/5의 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 4.5%로 감소된다.
[표 12]
Figure 112021005370664-pat00030
하기 표 13에서는 10 mol% 농도의 PEG-DSG 지질을 보유하는 MC3 함유 리포좀을 비롯한, 이들 방법에 대한 실험적 상세를 제시하고, 여기서 이들 제제는 C57BL6 생쥐에서 조사되었다. 이들 리포좀은 아래의 상대적인 몰 양을 포함하였다: 50/10/30/10의 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 9.5%로 감소된다.
[표 13]
Figure 112021005370664-pat00031
도 5에서는 증가하는 PEG-실딩 (shielding)이 C57BL6 생쥐에서 비-GalNAc 매개된 침묵을 감소시키는 효과를 보여준다. 이것은 C57BL6 생쥐에서 5%와 10%의 PEG 농도로 증명된다. 10 mol%에서 C18-PEG (즉, PEG-DSG)의 포함은 침묵을 효과적으로 저해하고, 이는 0.5 mol%의 PEG 지질을 동몰 양 GalNAc-지질 (즉, 화학식 III의 GalNAc3-PEG-DSG)로 치환함으로써 극복될 수 있다. 이런 이유로, 증가하는 PEG-실딩 (가령, 5 mol%에서 10 mol%로)은 비-GalNAc-매개된 침묵뿐만 아니라 전체 효능을 감소시키는 것으로 보인다.
쥐에서 유사한 실험이 실행되었는데, 여기서 PEG 지질 (역시 PEG-DSG)이 5와 10 mol%로 리포좀에 포함되었다. 하기 표 14에서는 5% PEG 지질 농도를 갖는 MC3 함유 리포좀을 비롯한, 이들 방법에 대한 실험적 상세를 제시하고, 여기서 이들 제제는 쥐에서 조사되었다. 이들 리포좀은 아래의 상대적인 몰 양을 포함하였다: 50/10/35/5의 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 4.5%로 감소된다.
[표 14]
Figure 112021005370664-pat00032
하기 표 15에서는 10% PEG 지질 농도를 갖는 MC3 함유 리포좀을 비롯한, 이들 방법에 대한 실험적 상세를 제시하고, 여기서 이들 제제는 쥐에서 조사되었다. 이들 리포좀은 아래의 상대적인 몰 양을 포함하였다: 50/10/30/10의 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 9.5%로 감소된다.
[표 15]
Figure 112021005370664-pat00033
도 6에서는 지정된 용량으로 쥐에 투여된 5 mol%와 10 mol%에서 C18 PEG를 포함하는 MC3 제제의 결과를 도시한다. 10 mol%의 PEG-DSG를 포함하는 제제는 쥐에서 조사된 농도 (0.625 - 5 ㎎/㎏)에서 침묵을 거의 나타내지 않는다. 하지만, 화학식 III의 0.5 mol% GalNAc3-PEG-DSG의 포함 (즉, 0.5 mol%의 C18-PEG를 대체)은 FVII의 녹다운을 복원한다. 이런 이유로, 5 mol%과 10 mol% PEG의 농도 간에 차이에서 확인되는 바와 같이, 생쥐와 비교하여 쥐에서 더욱 고도로 실딩 (shielding)된 제제가 일반적으로, 효능을 더욱 좋게 유지한다.
실시예 10: 0.5 mol% GalNAc3-PEG-DSG가 포함된 및 포함되지 않는 MC3 함유 리포좀 제제에서 성분의 mol% 변화의 평가
GalNAc3-PEG-DSG와 함께 및 GalNAc3-PEG-DSG 없이, 상이한 몰 백분율의 성분을 포함하는 MC3 함유 리포좀의 효능을 결정하기 위하여, 아래의 리포좀 제제가 실질적으로 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조되고 C57BL6 생쥐에서 조사되었다. 이들 성분은 표에서 제시된 바와 같이, 아래와 같은 순서로 제공된다: MC3/DSPC/Chol./PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 하기 표 16에서 제시된 바와 같이, 4.5%로 감소된다.
[표 16]
Figure 112021005370664-pat00034
도 7에서 확인되는 바와 같이, 이들 리포좀 제제에 GIaNAc의 첨가는 MC3이 50, 40, 그리고 30 mol%로 존재하는 각 제제에서 FVII의 침묵을 향상시킨다.
실시예 11: WT 및 ASGPR KO 생쥐에서 MC3 및 GalNAc 함유 리포좀의 효능.
다양한 리포좀 제제의 효능에서 ASGPR의 역할을 조사하기 위하여, 야생형 및 ASGPR 녹아웃 생쥐는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 3, 1, 그리고 0.3 ㎎/㎏에서 AD-1661 siRNA 조성물을 포함하는 MC3 리포좀이 투여되었다. 이들 성분은 표에서 제시된 바와 같이, 아래와 같은 순서로 제공된다: MC3/DSPC/Chol./PEG-DSG. 0.5% GalNAc3-PEG가 첨가되는 경우에, PEG-DSG의 상응하는 양은 하기 표 17에서 제시된 바와 같이, 9.5%로 감소된다.
[표 17]
Figure 112021005370664-pat00035
도 8에서는 이들 실험의 결과를 도시하고, GalNAc3-PEG-DSG 지질의 포함에 의해 C18 PEG를 포함하는 제제가 GalNAc 표적화 모이어티에 대한 예상 수용체인 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)가 결함된 생쥐 종족에서 투여될 때, FVII 녹다운의 복원이 소멸된다는 것을 증명한다.
실시예 12: 올리고뉴클레오티드 합성
합성
모든 올리고뉴클레오티드는 AKTAoligopilot 합성기에서 합성된다. 상업적으로 가용한 다공성 유리 고형 서포트 (controlled pore glass solid support) (dT-CPG, 500Å Prime Synthesis) 및 표준 보호기를 갖는 RNA 포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸 N6-벤조일-2'-t-부틸디메틸실릴-아데노신-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-t-부틸디메틸실릴-시티딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-N2-이소부티릴-2'-t-부틸디메틸실릴-구아노신-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포르아미디트, 그리고 5'-O-디메톡시트리틸-2'-t-부틸디메틸실릴-우리딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포르아미디트 (Pierce Nucleic Acids Technologies)가 올리고뉴클레오티드 합성에 이용되었다. 2'-F 포스포르아미디트, 5'-O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-플루오르-시티딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포르아미디트 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-플루오르-우리딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포르아미디트는 Promega로부터 구입된다. 모든 포스포르아미디트는 10% THF/ANC (v/v)에서 0.2M 농도로 이용되는 구아노신을 제외하고, 아세토니트릴 (CH3CN)에서 0.2M의 농도로 이용된다. 16분의 커플링 (coupling)/재순환 (recycling) 시간이 이용된다. 활성자는 5-에틸 티오테트라졸 (0.75M, American International Chemicals)이다; PO-산화의 경우에, 요오드/물/피리딘이 이용되고, 그리고 PS-산화의 경우에, 2,6-루티딘/ACN (1:1 v/v)에서 PADS (2%)가 이용된다.
3'-리간드 접합된 가닥은 상응하는 리간드를 포함하는 고형 서포트를 이용하여 합성된다. 가령, 서열에서 콜레스테롤 단위의 도입은 히드록시프롤리놀-콜레스테롤 포스포르아미디트로부터 실행된다. 콜레스테롤은 6-아미노헥사노에이트 연쇄에 의해 trans-4-히드록시프롤리놀에 속박되어 히드록시프롤리놀-콜레스테롤 모이어티가 획득된다. 5'-단부 Cy-3 및 Cy-5.5 (형광단) 표지된 siRNA는 Biosearch Technologies로부터 구입된 상응하는 Quasar-570 (Cy-3) 포스포르아미디트로부터 합성된다. 5'-단부 및/또는 내부 위치에 리간드의 접합은 적절하게 보호된 리간드-포스포르아미디트 빌딩 블록 (building block)을 이용함으로써 달성된다. 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 활성자의 존재에서 무수성 CH3CN에서 포스포르아미디트의 0.1 M 용액의 고형-서포트-결합된 올리고뉴클레오티드에 대한 연장된 15분 커플링. 뉴클레오티드간 포스파이트의 포스페이트로의 산화는 기존 문헌 (1)에서 보고된 바와 같이 표준 요오드-물을 이용하여, 또는 10분 산화 대기 시간 접합된 올리고뉴클레오티드와 함께 tert-부틸 히드로퍼옥시드/아세토니트릴/물 (10: 87: 3)로 처리에 의해 수행된다. 포스포로티오에이트는 황 이전 시약 (sulfur transfer reagent), 예를 들면, DDTT (AM Chemicals로부터 구입됨), PADS 및/또는 Beaucage 시약을 이용함으로써, 포스파이트의 포스포로티오에이트로의 산화에 의해 도입된다. 콜레스테롤 포스포르아미디트는 사내에서 합성되고 디클로메탄에서 0.1 M의 농도로 이용된다. 콜레스테롤 포스포르아미디트에 대한 커플링 시간 (coupling time)은 16분이다.
탈보호 I (핵염기 탈보호)
합성의 완결후, 서포트는 100 ㎖ 유리병 (VWR)으로 옮겨진다. 올리고뉴클레오티드는 55℃에서 6.5시간 동안 에탄올성 암모니아 [암모니아: 에탄올 (3: 1)]의 혼합물 80 ㎖로 염기 및 포스페이트 기의 동시 탈보호에 의해 서포트로부터 격리된다. 상기 병은 얼음 위에서 짧게 냉동되고, 이후 에탄올성 암모니아 혼합물은 새로운 250-㎖ 병으로 여과된다. CPG는 2 x 40 ㎖ 분량의 에탄올/물 (1:1 v/v)로 세척된다. 혼합물의 부피는 이후, 회전-증발기에 의해 ~30 ㎖로 감소된다. 혼합물은 이후, 드라이아이스에서 냉동되고 진공 농축기 (speed vac)에서 진공 하에 건조된다.
탈보호 II (2'-TBDMS 기의 제거)
건조된 잔류물은 26 ㎖의 트리에틸아민, 트리에틸아민 트리히드로플루오르화물 (TEAㆍ3HF) 또는 피리딘-HF 및 DMSO (3:4:6)에서 재현탁되고, 그리고 2' 위치에서 tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기를 제거하기 위하여 60℃에서 90분 동안 가열된다. 반응물은 이후, 50 ㎖의 20 mM 아세트산나트륨으로 진정되고, 그리고 pH가 6.5로 조정된다. 올리고뉴클레오티드는 정제 때까지 냉동 장치에 보관된다.
분석
올리고뉴클레오티드는 정제에 앞서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석되고, 그리고 완충액 및 칼럼의 선택은 서열 및/또는 접합된 리간드의 성격에 좌우된다.
HPLC 정제
리간드-접합된 올리고뉴클레오티드는 역상 예비 HPLC에 의해 정제된다. 접합되지 않은 올리고뉴클레오티드는 사내에서 패킹 (packing)된 TSK 겔 칼럼에서 음이온-교환 HPLC에 의해 정제된다. 완충액은 10% CH3CN에서 20 mM 인산나트륨 (pH 8.5) (완충액 A) 및 10% CH3CN, 1M NaBr에서 20 mM 인산나트륨 (pH 8.5) (완충액 B)이다. 전장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분획물은 모아지고, 탈염되고, 그리고 냉동 건조된다. 대략 0.15 OD의 탈염된 올리고뉴클레오티드는 물에서 150 ㎕로 희석되고, 이후 CGE 및 LC/MS 분석을 위하여 여러 바이알로 피펫팅 (pipetting)된다. 화합물은 이후, LC-ESMS 및 CGE에 의해 분석된다.
siRNA 제조
siRNA의 제조를 위하여, 동몰 양의 센스 및 안티센스 가닥은 1xPBS에서 95℃에서 5분 동안 가열되고 실온으로 천천히 냉각된다. 이중나선의 완전성은 HPLC 분석에 의해 확증된다.
[표 18]
Figure 112021005370664-pat00036
소문자는 2'0Me 변형이고, Nf는 2'F 변형된 핵염기이고, dT는 데옥시 티미딘이고, 그리고 s는 포스포티오에이트이다.
실시예 13: mPEG2000-1,2-디-0-알킬- sn 3-카르바모일글리세리드의 합성
PEG-지질, 예를 들면, mPEG2000-1,2-디-0-알킬-sn3-카르바모일글리세리드는 아래의 절차를 이용하여 합성되었다:
Figure 112021005370664-pat00037
mPEG2000-1,2-디-0-알킬-sn3-카르바모일글리세리드
화합물 4a (PEG-DMG)의 제조: 1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세리드 1a (30 g, 61.80 mmol) 및 N,N'-숙시니미딜카보네이트 (DSC, 23.76 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (DCM, 500 ㎖)에 넣어지고, 그리고 얼음물 혼합물에서 교반되었다. 트리에틸아민 (TEA, 25.30 ㎖, 3 eq)이 교반 용액에 첨가되고, 그리고 차후에, 반응 혼합물은 주위 온도에서 하룻밤동안 교반되었다. 반응의 진행은 TLC에 의해 모니터링되었다. 반응 혼합물은 DCM (400 ㎖)으로 희석되고, 그리고 유기 층은 물 (2X500 ㎖), 수성 NaHCO3 용액 (500 ㎖)으로 세척되고, 그 이후에 표준 작업 (standard work-up)이 수행되었다. 획득된 잔류물은 주위 온도에서 높은 진공 하에 하룻밤동안 건조되었다. 건조 이후에, 이렇게 획득된 가공되지 않은 카보네이트 2a는 디클로메탄 (500 ㎖)에 용해되고 얼음 중탕 (ice bath)에서 교반되었다. 교반 용액에, mPEG20OO-NH2 (3, 103.00 g, 47.20 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 무수성 피리딘 (Py, 80 ㎖, 과량)이 아르곤 하에 첨가되었다. 일부 구체예에서, 메톡시-(PEG)x-아민은 x= 45-49, 바람직하게는 47-49, 그리고 더욱 바람직하게는 49를 갖는다. 반응 혼합물은 이후, 주위 온도에서 하룻밤동안 교반되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 DCM (200 ㎖)에 용해되고 에틸 아세트산염에서 패킹 (packing)된 실리카 겔의 칼럼에 채워졌다. 상기 칼럼은 먼저, 에틸 아세트산염으로 용리되고, 그 이후에 디클로메탄에서 5-10% 메탄올의 농도차 (gradient)로 용리되어 원하는 PEG-지질 4a가 백색 고체 (105.30g, 83%)로서 제공되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.20-5.12(m, 1H), 4.18-4.01(m, 2H), 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H), 1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2660-2836.
4b의 제조: 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세리드 1b (1.00 g, 1.848 mmol) 및 DSC (0.710 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (20 ㎖)에 함께 넣어지고 얼음물 혼합물에서 0℃로 냉각되었다. 트리에틸아민 (1.00 ㎖, 3eq)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 TLC에 의해 추적되고, DCM으로 희석되고, 물 (2회), NaHCO3 용액으로 세척되고, 그리고 황산나트륨에서 건조되었다. 용매는 감압 하에 제거되고, 그리고 잔류물 2b는 높은 진공 하에 하룻밤동안 유지되었다. 이 화합물은 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 이용되었다. MPEG2000-NH2 3 (1.50g, 0.687 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 이전 단계로부터 화합물 2b (0.702g, 1.5eq)는 아르곤 하에 디클로메탄 (20 ㎖)에 용해되었다. 반응물은 0℃로 냉각되었다. 피리딘 (1 ㎖, 과량)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응은 TLC에 의해 모니터링되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 크로마토그래피 (농도차 용리로서 먼저, 에틸 아세트산염, 그 이후에 5-10% MeOH/DCM)에 의해 정제되어 원하는 화합물 4b가 백색 고체 (1.46 g, 76%)로서 획득되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.17(t, J= 5.5Hz, 1H), 4.13(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.05(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.82-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 2.05-1.90(m, 2H), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.61-1.45(m, 6H), 1.35-1.17(m, 56H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2716-2892.
4c의 제조: 1,2-디-O-옥타데실-sn-글리세리드 1c (4.00 g, 6.70 mmol) 및 DSC (2.58 g, 1.5eq)는 디클로메탄 (60 ㎖)에 함께 넣어지고 얼음물 혼합물에서 0℃로 냉각되었다. 트리에틸아민 (2.75 ㎖, 3eq)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 TLC에 의해 추적되고, DCM으로 희석되고, 물 (2회), NaHCO3 용액으로 세척되고, 그리고 황산나트륨에서 건조되었다. 용매는 감압 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 높은 진공 하에 하룻밤동안 유지되었다. 이 화합물은 추가 정제 없이 다음 반응에 직접 이용되었다. MPEG2000-NH2 3 (1.50g, 0.687 mmol, NOF Corporation (Japan)으로부터 구입됨) 및 이전 단계로부터 화합물 2c (0.760g, 1.5eq)는 아르곤 하에 디클로메탄 (20 ㎖)에 용해되었다. 반응물은 0℃로 냉각되었다. 피리딘 (1 ㎖, 과량)이 첨가되고, 그리고 반응물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응은 TLC에 의해 모니터링되었다. 용매 및 휘발성물질은 진공 하에 제거되고, 그리고 잔류물은 크로마토그래피 (농도차 용리로서 먼저, 에틸 아세트산염, 그 이후에 5-10% MeOH/DCM)에 의해 정제되어 원하는 화합물 4c가 백색 고체 (0.92 g, 48%)로서 획득되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.22-5.15(m, 1H), 4.16(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.06(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.81-3.75(m, 2H), 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-O-, PEG-CH2), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.60-1.48(m, 4H), 1.31-1.15(m, 64H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H). 관찰된 MS 범위: 2774-2948.
실시예 14: 사출 성형 방법에 대한 일반적인 프로토콜
지질 (화학식 I의 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤, DMG-PEG)은 용해되고 원하는 몰 비율에 따라 에탄올에서 혼합되었다. 리포좀은 에탄올 주입 방법에 의해 형성되고, 여기서 혼성 지질은 pH 5.2에서 나트륨 아세트산염 완충액에 첨가된다. 이것은 35% 에탄올에서 리포좀의 자발적 형성을 유발한다. 리포좀은 0.08 ㎛ 폴리카보네이트 막을 통하여 적어도 2회 사출 성형된다. 스톡 (stock) siRNA 용액은 나트륨 아세트산염 및 35% 에탄올에서 제조되고, 그리고 적하 (loading)를 위하여 리포좀에 첨가되었다. siRNA-리포좀 용액은 37℃에서 30분 동안 항온처리되고, 이후 희석되었다. 에탄올이 제거되고, 그리고 투석 또는 접선류 여과 (tangential flow filtration)에 의해 PBS 완충액으로 교체되었다.
실시예 15: 인-라인 혼합 방법에 대한 일반적인 프로토콜
별개의 독립된 스톡 용액 (stock solution)이 제조된다 - 한 스톡 용액은 지질을 포함하고, 다른 스톡 용액은 siRNA를 포함한다. 화학식 I의 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 포함하는 지질 스톡은 90% 에탄올에 용해됨으로써 제조된다. 나머지 10%는 낮은 pH 구연산염 완충액이다. 지질 스톡의 농도는 4 ㎎/㎖이다. 이러한 구연산염 완충액의 pH는 이용되는 융합생성 (fusogenic) 지질의 유형에 따라 pH3-5의 범위에서 변할 수 있다. siRNA 역시 4 ㎎/㎖의 농도에서 구연산염 완충액에 용해된다. 소규모의 경우에, 5 ㎖의 각 스톡 용액이 제조된다.
스톡 용액은 완전히 투명하고, 그리고 지질은 siRNA과 합쳐지기 이전에 완전히 용해되어야 한다. 이런 이유로, 스톡 용액은 지질을 완전히 용해시키기 위하여 가열될 수 있다. 이러한 과정 동안 이용되는 siRNA는 변형되지 않은 또는 변형된 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 그리고 친유성 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤과 접합 (conjugation)될 수 있다.
이들 별개의 스톡은 각 용액을 T-교차점 (junction)으로 펌핑 (pumping)함으로써 합쳐진다. 2가지 흐름의 출발과 멈춤을 동시에 제어하기 위하여 이중-헤드 Watson-Marlow 펌프가 이용된다. 1.6 mm 폴리프로필렌 관류 (tubing)는 선형 유속 (linear flow rate)을 증가시키기 위하여 0.8 mm 관류로 더욱 축소된다. 폴리프로필렌 라인 (ID = 0.8 mm)은 T-교차점의 어느 한쪽에 부착된다. 폴리프로필렌 T는 4.1 ㎣의 합성 부피 (resultant volume)에 대한 1.6 mm의 선형 모서리 (linear edge)를 갖는다. 폴리프로필렌 라인의 큰 단부 (1.6 mm) 각각은 용해된 지질 스톡 또는 용해된 siRNA를 포함하는 검사 튜브 내로 배치된다. T-교차점 뒤에, 단일 관류가 배치되고, 여기서 합쳐진 흐름이 방출될 것이다. 상기 관류는 이후, 2x 부피의 PBS를 포함하는 용기 내로 연장된다. PBS는 빠르게 교반된다. 펌프 유속은 300 rpm 또는 110 ㎖/min으로 설정된다. 에탄올이 제거되고, 그리고 투석에 의해 PBS로 교체된다. 이들 지질 제제는 이후, 원심분리 (centrifugation) 또는 정용여과 (diafiltration)를 이용하여 적절한 작업 농도로 농축된다.
실시예 16: [6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4- (디메틸아미노) 부타노에이트] (화학식 I의 양이온성 지질 또는 MC3)의 합성
Figure 112021005370664-pat00038
i) Vtride/THF; ii) MsCl, Et3N, DMAP/DCM; iii) LiBr/DMF; iv) Mg, HCOOEt; v) NaOH, THF, 물; vi) EDCI, DMAP, DIPEA.
알코올 2의 제조
아르곤 입력 및 온도계 보호관 (thermowell)이 구비된 깨끗하고 건조된 200l 유리 반응기는 60l의 THF 및 5.73 ㎏ (20.4 mol)의 리놀레산으로 채워졌다. 반응기의 내용물은 아세톤-드라이아이스 중탕을 이용하여 0℃ 미만으로 냉각되었다. 생성된 차가운 용액에, 반응 혼합물의 내부 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 톨루엔에서 13.8l의 Vitride (60% wt/vol)가 천천히 첨가되었다 (주의: vitride의 최초 첨가는 발열성이고, 그리고 거품 발생 (frothing)이 관찰되었다. 이러한 거품 발생은 첨가후 15분 시점에 중지되었다). vitride의 첨가는 3시간 45분이 소요되었다. 첨가의 완결후, 반응 혼합물은 주위 온도에서 2시간 동안 교반되었다. 분취량 (aliquot)이 채취되고 sat. Na2SO4로 진정되고, 그리고 이렇게 획득된 가공되지 않은 산물은 출발 산의 존재에 대하여 TLC에 의해 분석되었다. TLC는 반응의 완결을 보였고, 그리고 반응 혼합물은 다시 한 번 대략 45분 동안 0℃ 미만으로 냉각되었다. 황산나트륨의 포화된 용액 (1.5l의 물에 1.1 ㎏의 황산나트륨을 용해시킴으로써 제조됨)이 45분에 걸쳐 반응 혼합물에 천천히 첨가되었다. 첨가의 완결후, 25l의 에틸 아세트산염이 교반과 함께 30분의 기간 동안 첨가되었다. 획득된 반응 혼합물은 45분의 기간 동안 셀리트 베드 (celite bed)를 통하여 여과되고, 그리고 상기 셀리트 베드는 잔류물로부터 모든 산물을 제거하기 위하여 추가의 17l의 에틸 아세트산염으로 세척되었다. 합쳐진 유기물은 감압 하에 농축되었다. 잔류물은 15l의 에틸 아세트산염에 용해되고, 그리고 유기 층은 물 (2 X 7 l)로 세척되고 황산나트륨 (1.1 ㎏)에서 건조되었다. 여과후, 유기 층은 감압 하에 농축되고 높은 진공 하에 건조되어 리놀레일 알코올 산물이 오일로서 획득되었다. 가공되지 않은 수율 = 5.5 ㎏ (이론적 수율 = 5.43 ㎏). 상기 산물은 추가 정제 없이 다음 단계에 이용되었다.
리놀레일 메실레이트 3을 제조하는 공정
아르곤 입력 및 온도계 보호관 (thermowell)이 구비된 깨끗하고 건조된 200l 유리 반응기는 45 l의 DCM 및 단계 1로부터 5.5 ㎏의 가공되지 않은 산물로 채워졌다. 생성된 용액에, 11.5 l 트리에틸아민이 첨가되고, 그 이후에 0.252 ㎏ (2.0 mol)의 DMAP가 첨가되었다. 생성된 용액은 드라이아이스 아세톤 혼합물을 이용하여 -10℃로 냉각되고, 그리고 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 DCM (10 l)에서 메실 염화물 (3.2 l, 41.3 mol)의 용액이 3시간의 기간 동안 상기 차가운 반응물에 방울방울 첨가되었다. 첨가의 완결후, 반응 혼합물은 0℃에서 1시간 동안 교반되고, 이후 반응 혼합물의 TLC (DCM에서 5% EtOAc; PMA 착색)가 출발 알코올의 완전한 소멸을 보였다. 반응 혼합물에, 17 l의 얼음같이 차가운 물이 첨가되고, 그리고 층이 분리되었다. 최상위 수성 층은 다시 한 번 10 ℓ의 DCM으로 세척되고, 그리고 층이 분리되었다. 합쳐진 유기 층은 2 X 10 l의 희석된 염산염 (2 l의 Con. HCl을 18 l의 RO 물과 혼합함으로써 제조됨), 2 X 7.5 l의 물 및 10 l의 염수 (10 l의 RO 물에 11 ㎏의 NaCl을 용해시킴으로써 제조됨)로 세척되었다. 유기 층은 분리되고, Na2SO4 (2.75 ㎏)에서 건조되고, 여과되었다. 유기 층은 감압 하에 증발되고 진공 건조되어 가공되지 않은 메실레이트가 밝은 황색 오일로서 획득되었다. 가공되지 않은 수율 = 7.1 ㎏ (이론적 수율 = 7.1 ㎏). 상기 물질은 추가 정제 없이 다음 단계에 이용되었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.42-5.21 (m, 4H), 4.20 (t, 2H), 3.06 (s, 3H), 2.79 (t, 2H), 2.19-2.00 (m, 4H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.06-1.18 (m, 18H), 0.88 (t, 3H). 13C NMR (CDCl3) δ= 130.76, 130.54, 128.6, 128.4, 70.67, 37.9, 32.05, 30.12, 29.87, 29.85, 29.68, 29.65, 29.53, 27.72, 27.71, 26.15, 25.94, 23.09, 14.60. MS. C19H36O3S에 대하여 계산된 분자량, CaI. 344.53, 관찰됨 343.52 (M-H-).
리놀레일 브롬화물 4의 제조
아르곤 입력 및 온도계 보호관 (thermowell)이 구비된 깨끗하고 건조된 200l 유리 반응기는 25 l의 DMF 및 7.1 ㎏의 단계 2로부터 가공되지 않은 산물로 채워졌다. 생성된 혼합물은 아세톤-드라이아이스 혼합물로 -10℃로 냉각되었다. 이러한 교반된 혼합물에, 반응 온도를 0℃ 미만으로 유지하면서 25l의 DMF에서 리튬 브롬화물 (2.7 ㎏, 31.0 mol)의 용액이 1.5시간의 기간 동안 첨가되었다. 첨가의 완결후, 반응 혼합물은 분취량의 TLC (헥산에서 10% EtOAc, PMA 착색)가 출발 메실레이트의 완전한 소멸을 보일 때까지 18 - 20시간 동안 45℃에서 교반되었다. 반응 혼합물은 70 l의 물로 희석되고 57 l의 헥산으로 추출되었다. 수성 층은 2 X 10 l의 헥산으로 더욱 추출되고, 그리고 합쳐진 유기 층 (대략 120 l)은 2 X 10 l의 물 및 1 X 10 l의 염수 (10 l의 물에 14 ㎏의 염화나트륨을 용해시킴으로써 제조됨)로 다시 한 번 세척되었다. 획득된 유기 층 (120 l)은 황산나트륨 (4 ㎏)에서 건조되고 감압 하에 농축되어 가공되지 않은 산물 (6.5 ㎏)이 획득되었다. 가공되지 않은 산물은 헥산을 용리제 (eluent)로서 이용한 60-120 그물눈 (mesh) 실리카 겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 순수한 산물의 농축은 5.5 ㎏ (81%, 3 단계)의 브롬화물 4를 무색 액체로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.41-5.29 (m, 4H), 4.20 (d, 2H), 3.40 (t, J = 7 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.09-2.02 (m, 4H), 1.88-1.00 (m, 2H), 1.46-1.27 (m, 18H), 0.88 (t, J = 3.9 Hz, 3H). 13C NMR (CDCl3) δ= 130.41, 130.25, 128.26, 128.12, 34.17, 33.05, 31.75, 29.82, 29.57, 29.54, 29.39, 28.95, 28.38, 27.42, 27.40, 25.84, 22.79, 14.28.
디리놀레일메탄올 6의 제조
아르곤 입력, 환류 응축기 및 온도계 보호관 (thermowell)이 구비된 깨끗하고 건조된 200l 유리 반응기는 탈기되고 아르곤으로 정화되었다. 상기 반응기는 277 g (11.3 mol)의 활성화된 마그네슘, 그 이후에 1.5 l의 무수성 에테르로 채워졌다. 상기 반응기는 다시 한 번 3회 탈기되고 아르곤으로 정화되었다. 브롬화물 4 (2.5 ㎏, 7.6 mol)는 아르곤 하에 5 l의 무수성 에테르에 용해되고, 그리고 1l의 생성된 용액이 반응기에 첨가되고, 그 이후에 25 ㎖ (0.35 mol)의 디브로모메탄이 첨가되었다. 상기 반응기의 내용물은 물 중탕을 이용하여 40℃로 가열되었다 (비등 (effervescence)이 관찰되고, 그 이후에 Grignard 시약 형성의 개시를 지시하는 환류가 관찰되었다). 반응의 개시후, 가열 장치는 반응기로부터 제거되고, 그리고 남아있는 4l의 브롬화물은 혼합물의 부드러운 환류를 유지하면서 2시간 30분의 기간 동안 천천히 첨가되었다. 첨가의 완결후, 반응 혼합물은 다시 한 번 1시간 동안 환류 (중탕 온도 45℃)로 가열되고, 그 이후 반응 혼합물의 분취량이 물로 진정되고 TLC (헥산, PMA 착색)에 의해 분석되었는데, 이는 출발 브롬화물의 완전한 소모를 보였다. 반응 혼합물은 얼음 중탕을 이용하여 10℃ 미만으로 냉각되고, 그리고 에테르에서 에틸 포름산염 (4 l의 에테르에서 275 ㎖)의 용액이 2시간 30분의 기간 동안 첨가되고, 그리고 첨가의 완결후, 반응 혼합물은 실온으로 가온되고 1시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 10℃로 다시 냉각되고, 그리고 아세톤 (1.15 l)이 상기 혼합물에 천천히 첨가되고, 그 이후에 7 l의 얼음같이 차가운 물 및 10% 황산 용액 (34 l의 얼음같이 차가운 물로 3.4 l의 황산을 희석함으로써 제조됨)이 첨가되었다. 산물은 3 X 10 l의 에테르로 추출되고, 그리고 합쳐진 유기 층은 10 l의 염수로 세척되고 황산나트륨 (2 ㎏)에서 건조되었다. 감압 하에 유기 층의 농축은 가공되지 않은 산물 (2 ㎏)을 미량의 O-포르밀화된 산물과 함께, 요망되는 디리놀레일 알코올의 혼합물로서 제공하였다. 이러한 가공되지 않은 산물은 THF (4l)에서 재용해되고 2Ol 유리 반응기 내로 채워졌다. 여기에 NaOH 용액 (8 l의 얼음같이 차가운 물에 용해된 0.934 ㎏)이 첨가되고, 그리고 내용물은 65℃에서 18시간 동안 가열되고, 그 이후 TLC (헥산에서 10% 에테르)가 0-포르밀화된 산물의 요망되는 디리놀레일메탄올로의 완전한 변환을 보였다. 반응 혼합물은 냉각되고 에테르 (3 X 4 l)로 추출되고, 그리고 합쳐진 유기 층은 5 l의 염수로 세척되고 황산나트륨 (4 ㎏)에서 건조되었다. 여과, 그 이후에 유기 층의 농축은 가공되지 않은 산물을 제공하였다. 이렇게 획득된 가공되지 않은 산물은 헥산에서 4% 에테르를 이용한 60-120 그물눈 실리카 겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 순수한 산물 분획물의 농축은 순수한 산물 6 (1.45 ㎏, 80%)을 무색 액체로서 제공하였다. NMR (400 MHz5CDCl3) δ 5.47-5.24 (m, 8H), 3.56 (dd, J = 6.8, 4.2, 1H), 2.85-2.66 (m, 4H), 2.12-1.91 (m, 9H), 1.50-1.17 (m, 46H), 0.98-0.76 (m, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 130.41, 130.37, 128.18, 128.15, 77.54, 77.22, 76.91, 72.25, 37.73, 31.75, 29.94, 29.89, 29.83, 29.73, 29.58, 29.53, 27.46, 27.43, 25.89, 25.86, 22.80, 14.30.
[6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트] MC3 (8)의 제조:
디리놀레일 메탄올 6 (144 g, 272 mmol)은 1 l의 디클로메탄에 용해되고, 그리고 여기에 디메틸아미노부티르산 7 (55 g, 328 mmol)의 염산염이 첨가되고, 그 이후에 디이소프로필에틸아민 (70 ㎖) 및 DMAP (4 g)가 첨가되었다. 주위 온도에서 5분 동안 교반후, EDCI (80 g, 417 mmol)가 첨가되고, 그리고 반응 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반되고, 그 이후 TLC (실리카 겔, CH2Cl2에서 5% MeOH) 분석은 출발 알코올의 완전한 소멸을 보였다. 반응 혼합물은 CH2Cl2 (500 ㎖)로 희석되고 포화된 NaHCO3 (400 ㎖), 물 (400 ㎖) 및 염수 (500 ㎖)로 세척되었다. 합쳐진 유기 층은 무수성 Na2SO4에서 건조되고 용매가 진공에서 제거되었다. 이렇게 획득된 가공되지 않은 산물 (180 g)은 플래시 칼럼 크로마토그래피 [2.5 ㎏ 실리카 겔, 아래의 용리제 i) DCM에서 6l의 0.1% NEt3으로 패킹된 칼럼; 적하 (loading)후 ii) DCM에서 4 l의 0.1% NEt3; iii) DCM에서 16l의 2% MeOH - 98%의 0.1% NEt3; iv) DCM에서 4l의 2.5% MeOH - 97.5%의 0.1% NEt3; v) DCM에서 12l의 3% MeOH - 97%의 0.1% NEt3 이용]에 의해 정제되어 순수한 산물 8 (MC3, 159 g, 91%)이 무색 오일로서 분리되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.46-5.23 (m, 8H), 4.93-4.77 (m, 1H), 2.83-2.66 (m, 4H), 2.37-2.22 (m, 4H), 2.20 (s, 6H), 2.10-1.96 (m, 9H), 1.85-1.69 (m, 2H), 1.49 (d, J = 5.4, 4H), 1.39-1.15 (m, 39H), 0.95-0.75 (m, 6H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.56, 130.38, 130.33, 128.17, 128.14, 77.54, 77.22, 76.90, 74.44, 59.17, 45.64, 34.36, 32.69, 31.73, 29.87, 29.76, 29.74, 29.70, 29.56, 29.50, 27.44, 27.41, 25.84, 25.55, 23.38, 22.78, 14.27. EI-MS (+ve): C43H79NO2 (M+ H)+에 대하여 계산된 MW: 642.6, 관찰됨: 642.6.
실시예 17. 미리 형성된 소포를 이용한 siRNA 제제
양이온성 지질 포함 입자는 미리 형성된 소포 방법을 이용하여 만들어졌다. 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질은 각각, 40/10/40/10의 몰 비율로 에탄올에 용해되었다. 지질 혼합물은 각각, 30% (vol/vol) 및 6.1 mg/㎖의 최종 에탄올 및 지질 농도로, 혼합과 함께 수성 완충액 (5OmM 구연산염, pH 4)에 첨가되고 사출 성형에 앞서 2분 동안 실온에서 평형화되었다. 이들 수화된 지질은 Nicomp 분석에 의한 결정에서 70-90 nm의 소포 직경 (vesicle diameter)이 획득될 때까지, 22℃에서 Lipex Extruder (Northern Lipids, Vancouver, BC)를 이용하여 2개의 겹쳐 쌓인 80 nm 구멍-크기 필터 (Nuclepore)를 통하여 사출 성형되었다. 이것은 일반적으로, 1-3회 통과를 요구하였다. 작은 소포를 형성하지 못한 일부 양이온성 지질 혼합물의 경우에, DSPC 머리기 (headgroup)에서 포스페이트 기를 양성자화 (protonation)시키는 더욱 낮은 pH 완충액 (5OmM 구연산염, pH 3)으로 지질 혼합물의 수화는 안정된 70-90 nm 소포를 형성하는데 도움을 주었다.
FVII siRNA (30% 에탄올을 포함하는 5OmM 구연산염, pH 4 수성 용액에서 용해됨)은 이들 소포에 첨가되고, 혼합과 함께 ~5㎖/min의 비율로 35℃에서 미리 평형화되었다. 0.06 (wt/wt)의 최종 표적 siRNA/지질 비율이 달성된 이후에, 혼합물은 FVII siRNA의 소포 재편 (reorganization) 및 캡슐화 (encapsulation)가 가능해지도록 35℃에서 추가로 30분 동안 항온처리되었다. 에탄올은 이후, 제거되고, 그리고 외부 완충액은 투석 (dialysis) 또는 횡류 정용여과 (tangential flow diafiltration)에 의해 PBS (155mM NaCl, 3mM Na2HPO4, 1mM KH2PO4, pH 7.5)로 대체되었다. 최종 캡슐화된 siRNA-대(對)-지질 비율은 크기-배제 스핀 칼럼 또는 이온 교환 스핀 칼럼을 이용한, 캡슐화되지 않은 siRNA의 제거 이후에 결정되었다. 용량 (㎎/㎏)에 대하여 잔여 FVII %를 설명하는 용량 반응 곡선은 도 9에 도시된다.
실시예 18. 화학식 I의 양이온성 지질의 pKa 결정
화학식 I의 양이온성 지질의 pKa는 물에서 비-형광성이지만 막에 결합될 때 인식가능하게 형광을 발하는 형광 프로브 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌설폰산 (TNS)을 이용하여 본질적으로 Eastman et al 1992 Biochemistry 31:4262-4268에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 양이온성 지질/DSPC/CH/PEG-c-DOMG (40:10:40:10 mole 비율)로 구성되는 소포는 2 내지 11 범위의 다양한 pH의 완충액 (13OmM NaCl, 1OmM CH3COONH4, 1OmM MES, 1OmM HEPES)에서 0.1mM로 희석되었다. TNS 수성 용액의 분취량 (1 μM 최종)이 희석된 소포에 첨가되고, 그리고 30초 평형화 시간후, TNS-함유 용액의 형광이 각각, 321nm 및 445nm의 여기 (excitation) 및 방출 (emission) 파장에서 측정되었다. 양이온성 지질-함유 소포의 pKa는 측정된 형광을 용액의 pH에 대하여 플롯팅 (plotting)하고 획득된 데이터를 상업적 도식화 프로그램 IgorPro으로 S자 형태의 곡선 (sigmoidal curve)으로 핏팅 (fitting)함으로써 결정되었다. 화학식 I의 양이온성 지질에 대한 pKa 적정 곡선은 도 10에 도시된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHEN, JIANXIN ANSELL, STEVEN AKINC, AKIN DORKIN, JOSEPH ROBERT QIN, XIAOJUN CANTLEY, WILLIAM MANOHARAN, MUTHIAH RAJEEV, KALLANTHOTTATHIL G. NARAYANANNAIR, JAYAPRAKASH K. JAYARAMAN, MUTHUSAMY <120> LIPID FORMULATION <130> A2038-718210 <140> 12/813,448 <141> 2010-06-10 <150> 61/244,834 <151> 2009-09-22 <150> 61/185,800 <151> 2009-06-10 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> 2'-O-Methyl nucleotide <220> <221> modified_base <222> 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 6 guaagacuug agaugaucct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(9) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(16) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 7 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (6)..(8) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(18) <223> 2'-Fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 8 guaagacuug agaugaucct t 21 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 taacgttgag gggcat 16 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ttccatgacg ttcctgacgt 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> methylated-cytosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> methylated-cytosine <400> 11 tccatgacgt tcctgacgt 19 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> methylated-cytosine <400> 12 taacgttgag gggcat 16 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> methylated-cytosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> methylated-cytosine <400> 14 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 tgcatccccc aggccaccat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 gcccaagctg gcatccgtca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 gcccaagctg gcatccgtca 20 <210> 24 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ggtgctcact gcggc 15 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 aaccgttgag gggcat 16 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 tatgctgtgc cggggtcttc gggc 24 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gtgccggggt cttcgggc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ggaccctcct ccggagcc 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 tcctccggag ccagactt 18 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 aacgttgagg ggcat 15 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ccgtggtcat gctcc 15 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 cagcctggct caccgccttg g 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cagccatggt tccccccaac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gtgctccatt gatgc 15 <210> 37 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 gaguucugau gaggccgaaa ggccgaaagu cug 33 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 aacgttgagg ggcat 15 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 caacgttatg gggaga 16 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Glu Ala Leu Ala 1 <210> 41 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala 1 5 10 15 Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys 20 25 <210> 42 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys 20 25 30 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala 1 5 10 15 <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 44 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Trp Asp Tyr Gly 20 <210> 45 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 45 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 20 <210> 46 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 46 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Cys 20 <210> 47 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 47 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Cys 20 <210> 48 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu 1 5 10 15 His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ser Cys 35 <210> 49 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Cys <210> 50 <211> 21 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Norleucine <400> 50 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Xaa Ile Asp Gly Lys 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Norleucine <400> 51 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Xaa Ile Asp Gly 20 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 52 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 53 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 54 <211> 27 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 54 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 56 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35 <210> 61 <211> 31 <212> PRT <213> Ascaris suum <400> 61 Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys 1 5 10 15 Arg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro Arg 20 25 30 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys 20 25 30 <210> 63 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala 1 5 10 15 Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala 20 25 30 Lys Cys Cys Lys 35 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown bactenecin peptide <400> 64 Arg Lys Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg 1 5 10 <210> 65 <211> 42 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <223> C-term amidated <400> 65 Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro 1 5 10 15 Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro Gly Lys Arg 35 40 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown indolicidin peptide <220> <223> C-term amidated <400> 66 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 69 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 70 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 72 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 73 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 74 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 75 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 76 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 guaagacuug agaugaucct t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(10) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(17) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 78 ggaucaucuc aagucuuact t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(9) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> modified_base <222> (17)..(19) <223> 2'-fluoro nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> Phosphorothioate linkage <400> 79 guaagacuug agaugaucct t 21

Claims (30)

  1. 화학식 I의 양이온성 지질 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염을 포함하는 지질 입자:
    [화학식 I]
    Figure 112021097015717-pat00054
  2. 제1항에 있어서, 상기 지질 입자는 중성 지질 및 입자 집합을 감소시킬 수 있는 지질을 더 포함하는 것인, 지질 입자.
  3. 제1항에 있어서, 치료적 제제를 더 포함하는 것인, 지질 입자.
  4. 제2항에 있어서, 치료적 제제를 더 포함하는 것인, 지질 입자.
  5. 제3항에 있어서, 상기 치료적 제제는 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 리보자임으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 것인, 지질 입자.
  6. 제4항에 있어서, 상기 치료적 제제는 플라스미드, 면역자극 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 리보자임으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 것인, 지질 입자.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 siRNA이거나, 또는
    상기 치료적 제제는 치료적으로 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열인 것인, 지질 입자.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 siRNA이거나, 또는
    상기 치료적 제제는 치료적으로 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열인 것인, 지질 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 지질 입자 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 제형.
  10. 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시험관내 (in vitro) 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 지질 입자를 세포에 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시험관내 (in vitro) 방법으로서,
    상기 방법은 제9항에 따른 제약학적 제형을 세포에 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 생체내 (in vivo) 방법에서 사용하기 위한 것인, 지질 입자.
  13. 제9항에 있어서, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 생체내 (in vivo) 방법에서 사용하기 위한 것인, 제약학적 제형.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자 내 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자 내 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자 내 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 지질 입자.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 VII 인자, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, Cyclin D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, Cyclin A 유전자, Cyclin E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 수르비빈 유전자, Her2/Neu 유전자, 국소이성화효소 I 유전자, 국소이성화효소 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, 카베올린 I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제자 유전자 내 돌연변이, p53 종양 억제자 유전자, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 제약학적 제형.
  18. 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체에서 폴리펩티드의 과다발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 치료적 제제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드 중에서 선택되고,
    상기 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함하는 것인, 지질 입자.
  19. 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체에서 폴리펩티드의 과소발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 치료적 제제는 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드인 것인, 지질 입자.
  20. 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 치료적 제제는 면역자극 올리고뉴클레오티드인 것인, 지질 입자.
  21. 제9항에 있어서, 대상체에서 폴리펩티드의 과다발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 제약학적 제형이 치료적 제제를 포함하는 경우, 상기 치료적 제제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드 중에서 선택되고,
    상기 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 보체를 포함하는 것인, 제약학적 제형.
  22. 제9항에 있어서, 대상체에서 폴리펩티드의 과소발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 제약학적 제형이 치료적 제제를 포함하는 경우, 상기 치료적 제제는 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 인코딩하는 플라스미드인 것인, 제약학적 제형.
  23. 제9항에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 것이고,
    상기 제약학적 제형이 치료적 제제를 포함하는 경우, 상기 치료적 제제는 면역자극 올리고뉴클레오티드인 것인, 제약학적 제형.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 지질 입자 및 질환 또는 병원체와 연관된 항원을 포함하는 백신.
  25. (i) 지질의 혼합물을 핵산의 완충된 수성 용액과 혼합하여 지질 입자 내에 캡슐화된 핵산을 함유하는 중간 혼합물을 생산하는 단계로서, 상기 캡슐화된 핵산은 3 wt% 내지 25 wt%의 핵산/지질 비율로 존재하는 것인 단계; 및
    (ii) pH를 상승시켜 지질-핵산 입자 상에서 표면 전하의 적어도 일부를 중화시키는 단계
    를 포함하는, 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 지질 입자를 제조하는 방법.
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