JP5819291B2 - 改善された脂質製剤 - Google Patents

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Description

優先権の主張
本出願は、２００９年６月１０日に出願された米国特許出願第６１／１８５，８００号および２００９年９月２２日に出願された米国特許出願第６１／２４４，８３４号に対する優先権を主張し、これらの内容は、その全体が各々参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、脂質粒子を用いた治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、核酸のインビボ送達に有利なカチオン性脂質およびこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を調製する方法、および例えば、様々な病状の治療のために、これらの組成物を用いて、核酸を細胞に導入する方法を提供する。
治療用核酸には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、および免疫刺激性核酸が含まれる。これらの核酸は、種々のメカニズムによって作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡコンストラクトは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体から離れ、結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列に対する相補的配列を有するｍＲＮＡを認識し、それに結合することができる鋳型をＲＩＳＣ内部に生じさせる。相補的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出させる。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする対応するｍＲＮＡの特異的破壊を標的とすることによって、特定のタンパク質の下方調節をもたらすことができる。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡコンストラクトは、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列に関して合成することができるので、ＲＮＡｉの治療的用途は極めて幅広い。これまでに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、インビトロとインビボの両方のモデルで標的タンパク質を特異的に下方調節する能力を示している。さらに、ｓｉＲＮＡコンストラクトは、現在、臨床研究で評価されているところである。
しかしながら、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡコンストラクトが現在直面している２つの問題は、第一に、血漿中でのヌクレアーゼ消化に対して感受性があること、そして第二に、細胞内コンパートメント（遊離のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身投与されたときにＲＩＳＣに結合することができる）に近づく能力が限られていることである。これらの二本鎖コンストラクトは、化学修飾ヌクレオチドリンカー（例えば、ホスホチオアート基）を分子内に取り込ませることによって安定化することができる。しかしながら、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限られた保護しかもたらさず、かつコンストラクトの活性を減少させ得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内送達は、ポリマー、カチオン性リポソームなどの担体系の使用によるか、または例えば、コレステロール分子の共有結合によるコンストラクトの化学修飾によって、促進することができる。しかしながら、送達系の改善には、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力の増加と、化学修飾の必要性の軽減または除外とが求められる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムもまた、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害することができる。アンチセンスコンストラクトの場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に対する相補的配列を有し、ワトソン−クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、および／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮアーゼＨ分解を誘発する。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドには、作用の特異性（すなわち、特定の疾患に関連するタンパク質の下方調節）の途方もない可能性がある。これまでに、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、およびＨＩＶのモデルをはじめとする、いくつかのインビトロおよびインビボモデルで有望ぶりを示している（Ａｇｒａｗａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３７６−３８７（１９９６）に概説されている）。アンチセンスは、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることによって、細胞活性に影響を及ぼすこともできる。いくつかのアンチセンス薬物の先端的なヒト臨床評価が現在進行中である。これらの薬物の標的としては、ｂｃｌ２およびアポリポタンパク質Ｂの遺伝子およびｍＲＮＡ産物が挙げられる。
免疫刺激性核酸には、デオキシリボ核酸とリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、特定の配列またはモチーフは、哺乳動物における免疫刺激を引き起こすことが示されている。これらの配列またはモチーフには、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列およびパリンドローム配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のＣｐＧモチーフは、エンドソームの受容体である、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）によって特異的に認識され、次に、この受容体によって、自然免疫刺激経路と獲得免疫刺激経路の両方が誘発されると考えられている。特定の免疫刺激性リボ核酸配列も報告されている。これらのＲＮＡ配列は、ｔｏｌｌ様受容体６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）に結合することによって免疫活性化を誘発すると考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡは、免疫刺激性であることも報告されており、ＴＬＲ−３に結合することによって活性化すると考えられている。治療用核酸の使用に関してよく知られている問題の１つは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合の安定性と、このリンカーのヌクレアーゼに対する感受性とに関する。血清中にエキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼが存在するために、ホスホジエステルリンカーを有する核酸の消化が速やかに起こり、それゆえに、治療用核酸は、血清の存在下または細胞内で非常に短い半減期を有する可能性がある（Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：３２３−３３８（１９９３）；およびＴｈｉｅｒｒｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｐｌ４７−１６１ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，ＲＰ ａｎｄ Ｉｚａｎｔ，ＪＧ編；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２））。これらのおよび他の既知の問題のために、現在開発されている治療用核酸は、天然の核酸に見られる基本的なホスホジエステル化学を利用していない。
この問題は、血清または細胞内分解を低下させる化学修飾によって一部克服されている。（例えば、ホスホロチオアート、メチルホスホナートまたはホスホルアミダート結合を用いた）ヌクレオチド間ホスホジエステル架橋において、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）において、または糖（例えば、２’−修飾糖）において、修飾が試験されている（Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．Ｘ．，ｐｐ ６４−８１ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９７））。他の者らは、２’−５’糖結合を用いて安定性を改善することを試みている（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号を参照されたい）。他の変化も試みられている。しかしながら、これらの解決法はどれも、完全に満足の行くものではないことが分かり、インビボでの遊離の治療用核酸には、依然として限られた効力しかない。
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上で述べたように、治療用核酸が細胞膜を横断する能力が限られていることに関する問題（Ｖｌａｓｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１９７：９５−１０８２（１９９４）を参照されたい）や、補体媒介性アナフィラキシー、凝固特性の変化、および血球減少症などの全身毒性に関する問題が残る（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．４：２０１−２０６（１９９４））。
効力を向上するために、研究者らは、化学的に修飾されたまたは修飾されていない治療用核酸を送達するための脂質に基づく担体系も利用している。Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｏ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６）において、著者らは、アニオン性（従来の）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、イムノリポソーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体の使用に言及している。同様に、ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソーム中で全身投与されており、これらの核酸−脂質粒子は、非ヒト霊長類をはじめとする哺乳動物における標的タンパク質の下方調節を改善することが報告されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４（２００６））。最近の進展にもかかわらず、一般的な治療的使用に好適な改善された脂質−治療用核酸組成物が当該技術分野において依然として必要とされている。これらの組成物は、高効率に核酸を封入し、高い薬物：脂質比を有し、封入された核酸を血清中での分解やクリアランスから保護し、全身送達に好適であり、かつ封入された核酸の細胞内送達をもたらすことが好ましい。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、核酸の有効用量での患者治療が患者に対する著しい毒性および／またはリスクを伴わない程度に、十分に忍容性でかつ十分な治療指数を提供すべきである。本発明は、このような組成物、この組成物の作製方法、および疾患治療のためを含む、この組成物を用いた細胞への核酸の導入方法を提供する。
米国特許出願第６１／１８５，８００号 米国特許出願第６１／２４４，８３４号
本発明は、新規のカチオン性脂質、およびそれを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子はさらに、活性剤を含み、本発明の関連する方法に従って使用され、かつ活性剤を細胞に送達し得る。
本発明の脂質は、１つ以上の異性体を含み得る。これらの化合物の全てのこのような異性体は、本発明に明示的に含まれる。本発明の化合物は、結合回転を制限することができる結合（例えば、炭素−炭素結合）または置換、例えば、二重結合の存在に起因する制限も含み得る。したがって、シス／トランス異性体およびＥ／Ｚ異性体は全て、本発明に明示的に含まれる。
一態様では、本発明は、式Ｉのカチオン性脂質を含む改善された脂質製剤を提供し、ここで、式Ｉは、
である。
式Ｉは、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＭＣ３またはＭ−Ｃ３と表すこともできる。式Ｉ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＭＣ３およびＭ−Ｃ３は各々、上に直接示したような式を有する。
脂質製剤は、通常、中性脂質、ステロールおよびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質も含み得る。
一態様では、改善された脂質製剤は、ターゲッティング脂質（例えば、ＧａｌＮＡｃおよび／またはフォラート含有脂質）も含む。
一態様では、本発明は、押出法またはインライン混合法によって、改善された脂質製剤を調製する。
一態様では、本発明はさらに、ＲＮＡベースのコンストラクトを含む改善された脂質製剤を動物に投与し、標的遺伝子の発現を評価する方法を提供する。
一態様では、本発明で取り上げられる脂質製剤、例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））と複合体を形成した脂質製剤は、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞における標的遺伝子発現を修飾する（例えば、減少させる）ために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明で取り上げられる脂質製剤は、限定するものではないが、ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６、Ａ３７５、ＭＣＦ７、Ｂ１６Ｆ１０、Ｈｅｐ３ｂ、ＨＵＨ７、ＨｅｐＧ２、Ｓｋｏｖ３、Ｕ８７、およびＰＣ３細胞株をはじめとする、腫瘍細胞株における標的遺伝子発現を修飾するために使用することができる。
別の態様では、本発明は、本発明の脂質を含む脂質粒子を提供する。特定の実施形態では、脂質粒子はさらに、中性脂質および粒子凝集を低下させることができる脂質を含む。一実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質約２０〜６０％：中性脂質５〜２５％：ステロール２５〜５５％：ＰＥＧ−脂質０．５〜１５％というモル比の、（ｉ）少なくとも１種の本発明の脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；ならびに（ｉｖ）ｐｅｇ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になる。一実施形態では、本発明の脂質は、光学的に純粋である。
さらなる関連する実施形態では、本発明は、治療剤をさらに含む本発明の脂質粒子を含む。一実施形態では、治療剤は核酸である。一実施形態では、核酸は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ；二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ；アプタマーまたはリボザイムである。
また別の関連する実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とを含む薬学的組成物を含む。
他の関連する実施形態では、本発明はさらに、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明の脂質粒子または薬学的組成物を細胞に提供することを含む方法を含む。標的遺伝子は、野生型遺伝子であることができる。別の実施形態では、標的遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の突然変異を含む標的遺伝子の発現を特異的に調節することを含む。特定の実施形態では、脂質粒子は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ；二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイムから選択される治療剤を含む。一実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーまたはリボザイムをコードするプラスミドである。
本発明の一態様では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の突然変異、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片の発現を増加させるようなポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。
またさらなる関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の脂質粒子または薬学的組成物を対象に投与することを含み、ここで、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、かつこのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む、方法を含む。
別の関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの低発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ここで、治療剤は、ポリペプチドまたはその機能的変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、本発明の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ここで、治療剤は免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、方法を含む。特定の実施形態では、薬学的組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて患者に提供される。
関連する実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子と疾患または病原体と関連する抗原とを含むワクチンを含む。一実施形態では、脂質粒子は、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。別の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、または寄生虫抗原である。
本発明はさらに、本発明の脂質粒子および薬学的組成物を調製する方法、ならびにこれらの脂質粒子および薬学的組成物の調製において有用なキットを含む。
別の態様では、本発明は、薬剤（例えば、治療剤または診断剤）と本発明の脂質とを含む組成物を評価する方法を提供する。
マウスモデルにおけるＦＶＩＩのサイレンシングに対するＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡを含む脂質製剤の効果を示す棒グラフである。 様々なリポソーム組成物によるラットにおけるＭＣ３の用量応答を示す棒グラフである。 ＭＣ３を含む製剤の効力のＡｐｏＥ依存性を示す棒グラフである。野生型マウスでは、ＦＶＩＩタンパク質レベルにおける用量依存的低下が示されたが、ＡｐｏＥノックアウトマウスでは示されなかった。図２は、ＭＣ３リポソーム製剤のＡｐｏＥ依存性やＭＣ３を用いたＡｐｏＥ ＫＯマウスにおけるサイレンシングの欠如を、ＡｐｏＥとの事前混合により効果的にレスキューすることができることを示すグラフでもある。 リポソーム製剤中のＭＣ３のモルパーセンテージの変化の効果およびさらに、中性脂質の変化の効果（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣ、およびＤＬＰＣによる中性脂質の変化）を示す棒グラフである。 ＰＥＧ遮蔽の増加によって、マウスにおける非ＧａｌＮＡｃ媒介性サイレンシングが減少することをを示す棒グラフである。 ＰＥＧ遮蔽の増加によって、ラットにおける非ＧａｌＮＡｃ媒介性サイレンシングが減少することをを示す棒グラフである。 ＧａｌＮＡｃありとＧａｌＮＡｃなしの、様々なｍｏｌ％のＭＣ３を有するリポソーム製剤の効力を示す棒グラフである。 ＧａｌＮＡｃターゲッティングリポソームの活性が、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）ノックアウトマウスで消失していることを示す棒グラフである。 実施例１７で調製される製剤についての残存ＦＶＩＩ％と用量（ｍｇ／ｋｇ）の用量応答曲線である。 実施例１８で決定されるような式Ｉのカチオン性脂質のｐＫａ滴定曲線である。
例えば、薬剤、例えば、核酸ベースの薬剤（例えば、ＲＮＡベースのコンストラクト）を細胞または対象に送達するものとして使用することができる改善された脂質製剤を本明細書に記載する。また、ＲＮＡベースのコンストラクトを含む改善された脂質製剤を動物に投与し、かついくつかの実施形態では、標的遺伝子の発現を評価する方法を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、改善された脂質製剤は、ターゲッティング脂質（例えば、ＧａｌＮＡｃ含有脂質またはフォラート含有脂質などの本明細書に記載のターゲッティング脂質）を含む。
脂質
本発明は、式Ｉのカチオン性脂質、中性脂質、ステロールおよびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む改善された脂質製剤を提供し、ここで、式Ｉは、
である。
一実施形態では、脂質はラセミ混合物である。
一実施形態では、脂質は１つのジアステレオマーが濃縮されており、例えば、脂質は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％または少なくとも７０％ジアステレオマー過剰である。
一実施形態では、脂質はキラル的に純粋であり、例えば、単一の異性体である。
一実施形態では、脂質は１つの異性体に濃縮されている。
一実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％封入されている。一実施形態では、製剤は、モル基準で約２５％〜約７５％、例えば、モル基準で約３５％〜約６５％、約４５％〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％または約４０％の式Ｉのカチオン性脂質を含む。
一実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約１５％、例えば、モル基準で約３％〜約１２％、約５％〜約１０％または約１５％、約１０％、または約７．５％の中性脂質を含む。
一実施形態では、製剤は、モル基準で約５％〜約５０％（例えば、モル基準で約１５％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、または約３１％）のステロールを含む。一実施形態では、ステロールはコレステロールである。
一実施形態では、製剤は、モル基準で約０．５％〜約２０％（例えば、モル基準で約０．５％〜約１０％、約０．５％〜約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、または約５％）のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で２５〜７５％式Ｉの脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、および０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で３５〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で４５〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約６０％の式Ｉのカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも表す）である。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、２，０００未満（例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００Ｄａ）の平均分子量のＰＥＧ分子を含む。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む、以下の式ＶＩ：
の化合物である。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ、本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１８またはＣ１８−ＰＥＧとも表す）である。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５０％の式Ｉのカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、および約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも表す）である。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ、本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１８またはＣ１８−ＰＥＧとも表す）である。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質はＰＥＧ−ＤＰＧ（ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール）である。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５０％の式Ｉのカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３５％のステロール、約４．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、および約０．５％のターゲッティング脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ、本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１８またはＣ１８−ＰＥＧとも表す）であり、かつターゲッティング脂質はＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧである。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５０％の式Ｉのカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３５％のステロール、約４．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、および約０．５％のターゲッティング脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも表す）である。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約４０％の式Ｉのカチオン性脂質、約１５％の中性脂質、約４０％のステロール、および約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも表す）である。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５０％の式Ｉのカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３５％のステロール、および約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧ．（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも表す）である。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５７．２％の式Ｉのカチオン性脂質、約７．１％の中性脂質、約３４．３％のステロール、および約１．４％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＰＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ｃＤＭＡである（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｈｅｙｅｓら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）でさらに論じられている）。
一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、式ＶＩの化合物またはＰＥＧ−ＤＳＧであり、ここで、ＰＥＧ分子の平均分子量は２，０００Ｄａである。
一実施形態では、本発明の製剤は、モル基準で約５７．５％の式Ｉのカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、および約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。好ましい一実施形態では、カチオン性脂質は式Ｉの化合物であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステロールはコレステロールであり、かつＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧである。
一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡの比は、少なくとも約０．５：１、少なくとも約１：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１１：１、少なくとも約１２：１、少なくとも約１５：１までである。一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡ比は、約１：１％〜約２０：１、約３：１％〜約１５：１、約４：１％〜約１５：１、約５：１％〜約１３：１である。一実施形態では、脂質：ｓｉＲＮＡ比は、約０．５：１％〜約１５：１である。
一態様では、改善された脂質製剤はターゲッティング脂質も含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、ＧａｌＮＡｃ部分（すなわち、Ｎ−ガラクトサミン部分）を含む。例えば、ＧａｌＮＡｃ部分を含むターゲッティング脂質としては、２００８年４月１２日に出願された米国特許出願第１２／３２８，６６９号に開示されているものを挙げることができ、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ターゲッティング脂質としては、例えば、米国特許出願第１２／３２８，６６９号または国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されているような当該技術分野で公知の任意の他の脂質（例えば、ターゲッティング脂質）を挙げることもでき、これらの文献の内容は各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、複数のＧａｌＮＡｃ部分、例えば、２つまたは３つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、複数の、例えば、２つまたは３つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質中の脂質は、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド（すなわち、ＤＳＧ）である。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、ＰＥＧ部分（例えば、少なくとも約５００Ｄａ、例えば、約１０００Ｄａ、１５００Ｄａ、２０００Ｄａまたはそれよりも大きい分子量を有するＰＥＧ部分）を含み、例えば、ターゲッティング部分は、ＰＥＧ部分を介して脂質に接続されている。
いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、葉酸部分を含む。例えば、葉酸部分を含むターゲッティング脂質としては、２００８年４月１２日に出願された米国特許出願第１２／３２８，６６９号に開示されているものを挙げることができ、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、葉酸部分を含むターゲッティング脂質としては、式Ｖの化合物を挙げることができる。
例示的なターゲッティング脂質は、下記の式Ｌ：
（ターゲッティング基）ｎ−Ｌ−脂質
式Ｌ
式中、
ターゲッティング基は、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載の任意のターゲッティング基（例えば、細胞表面受容体）であり、
ｎは１〜５の整数（例えば、３）であり、
Ｌは結合基であり、かつ
脂質は、本明細書に記載の脂質（例えば、ＤＳＧなどの中性脂質）などの脂質である。
いくつかの実施形態では、結合基はＰＥＧ部分を含む。
いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、下記に示すような式２、３、４または５
の化合物である。
いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、モル基準にして約０．００１％〜約５％（例えば、約０．００５％、０．１５％、０．３％、０．５％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、または５％）の量で製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、約０．００５％〜約１．５％の量で製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、本明細書に記載の製剤に含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、抗酸化剤（例えば、ラジカルスカベンジャー）も含む。抗酸化剤は、例えば、約０．０１％〜約５％の量で組成物中に存在することができる。抗酸化剤は、疎水性または親水性である（例えば、脂質に溶けるか、または水に溶ける）ことができる。いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、フェノール化合物、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、レスベラトロール、補酵素Ｑ１０、または他のフラボノイド類、あるいはビタミン、例えば、ビタミンＥもしくはビタミンＣである。他の例示的な抗酸化剤としては、リポ酸、尿酸、β−カロテンまたはレチノール（ビタミンＡ）などのカロテン、グルタチオン、メラトニン、セレン、およびユビキノールが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質（例えば、ＧａｌＮＡｃ含有脂質）の受容体は、アシアロ糖タンパク質受容体（すなわち、ＡＳＧＰＲ）である。
一実施形態では、本発明の製剤は、押出法またはインライン混合法によって産生される。
押出法（事前形成法またはバッチプロセスとも表す）は、まず空のリポソーム（すなわち、核酸なし）を調製し、次いで、核酸を空のリポソームに添加する方法である。リポソーム組成物を小孔性ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜に通して押し出すことにより、比較的明確な径分布が得られる。通常、所望のリポソーム複合体径分布が達成されるまで膜に通して１回以上懸濁を繰り返す。リポソームを連続的により小さくなる膜に通して押し出し、リポソーム径の段階的な減少を達成してもよい。場合によっては、形成される脂質−核酸組成物をサイジングなしで用いることができる。これらの方法は、米国特許第５，００８，０５０号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，７３７，３２３号；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９７９ Ｏｃｔ １９；５５７（１）：９−２３；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８０ Ｏｃｔ ２；６０１（３）：５５９−７；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８６ Ｊｕｎ １３；８５８（１）：１６１−８；およびＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９８５ ８１２，５５−６５に開示されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
インライン混合法は、脂質と核酸の両方を混合チャンバーに同時に添加する方法である。混合チャンバーは、単純なＴ型コネクターまたは当業者に公知の任意の他の混合チャンバーであることができる。
これらの方法は、米国特許第６，５３４，０１８号および米国特許第６，８５５，２７７号；米国特許公開第２００７／００４２０３１号ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３，Ｍａｒ．２００５，ｐ．３６２−３７２に開示されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の製剤を当業者に公知の任意の方法によって調製することができることがさらに理解される。
さらなる実施形態では、式Ｉの化合物を含む代表的な製剤を表１に示す。
一実施形態では、式Ｉの化合物を含む特定の製剤を以下に記載する。
脂質の比率（単位はモルパーセンテージ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比

５０／１０／３８．５／１．５（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ 約 １１

４０／１５／４０／５（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３５／４．５／０．５％（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ（Ｃ１８−ＰＥＧ）：ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３０／９．５／０．５％（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３５／５％（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３８．５／１．５（ＭＣ３：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ 約１１

４０／１５／４０／５（ＭＣ３：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３５／４．５／０．５％（ＭＣ３：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３０／９．５／０．５％（ＭＣ３：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３５／５％（ＭＣ３：ＤＰＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１１

５０／１０／３８．５／１．５（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ 約７

５０／１０／３８．５／１．５（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ 約１０

５０／１０／３８．５／１．５（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ 約１２

５０／１０／３５／５％（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約８

５０／１０／３５／５％（ＭＣ３：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＭＧ）
脂質：ｓｉＲＮＡ比 約１０
一実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％封入されている。
一実施形態では、本発明の製剤は、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で使用される場合、「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質とその変異体および断片、ならびに下記のアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体または断片を指す。
好適なアポリポタンパク質としては、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−ＶおよびＡｐｏＥと、活性のある多型形態、アイソフォーム、変異体および突然変異体ならびにそれらの断片または切断形態が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、アポリポタンパク質はチオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも１つのシステイン残基を含むアポリポタンパク質、変異体、断片またはアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、１つのシステイン残基を含むＡｐｏＡ−Ｉミラノ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−Ｉパリ（ＡｐｏＡ−Ｉｐ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９７：２０６−１３；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ３もチオール含有アポリポタンパク質である。その組換えで産生された形態を含む、単離されたＡｐｏＥおよび／またはその活性断片およびポリペプチド類似体は、米国特許第５，６７２，６８５号；同第５，５２５，４７２号；同第５，４７３，０３９号；同第５，１８２，３６４号；同第５，１７７，１８９号；同第５，１６８，０４５号；同第５，１１６，７３９号に記載されており、これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｕｍａｎ Ｅ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏ−Ｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ”， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１） ２５６：９０７７−９０８３；およびＲａｉｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ”， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８２） ７９：４６９６−４７００に開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ００３９６も参照されたい。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、成熟形態、プレプロアポリポタンパク質形態またはプロアポリポタンパク質形態であることができる。プロＡｐｏＡ−Ｉおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉのホモ二量体およびヘテロ二量体（実現可能な場合）（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：（３）１６７９−８７；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１４）：８６３７−４６；Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１４）：８９９３−９０００）を本発明の範囲内で利用することもできる。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体またはアイソフォームであることができる。「断片」という用語は、天然のアポリポタンパク質のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有し、かつその断片が、脂質結合特性をはじめとする、天然のアポリポタンパク質の活性を保持する任意のアポリポタンパク質を指す。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列の置換または改変を意味し、アミノ酸残基の置換または改変、例えば、付加および欠失は、脂質結合特性をはじめとする、天然のアポリポタンパク質の活性を消失させない。したがって、変異体は、１つ以上のアミノ酸残基が化合的に類似したアミノ酸と保存的に置換されている本明細書で提供される天然のアポリポタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドを含むことができる。保存的置換の例としては、少なくとも１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別の疎水性残基への置換が挙げられる。同様に、本発明は、例えば、少なくとも１つの親水性残基の置換、例えば、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンの間の置換を企図する（米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号および同第６，０４６，１６６号を参照されたい）「アイソフォーム」という用語は、同じか、より大きいかまたは部分的な機能と、同様か、同一かまたは部分的な配列とを有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物で、かつ通常は組織特異的であってもよいし、そうでなくてもよい（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（ｌ）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（１）：８０−８；Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４０（１−３）：１８１−７；Ｗｅｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００（１−３）：４８１−９２；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３３）：２９９１９−２６；Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（２３）：１４８８８−９３および米国特許第６，３７２，８８６号を参照されたい）。
特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築は、虚血再灌流保護特性を含むアポリポタンパク質ドメインと関連する高い脂質結合能を有するアポリポタンパク質ドメインから構成される可能性がある。アポリポタンパク質のキメラ構築は、アポリポタンパク質（すなわち、相同な構築）内部に別々の領域を含む構築であることができるし、またはキメラ構築は、異なるアポリポタンパク質間の別々の領域を含む構築（すなわち、異種の構築）であることができる。キメラ構築を含む組成物は、アポリポタンパク質変異体である部分または特定の特性（例えば、脂質結合、受容体結合、酵素特性、酵素活性化特性、抗酸化特性または還元酸化特性）を有するように設計された部分を含むこともできる（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（ｌ）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３６（ｌ）：８０−８；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１９（９）：２２１４−２５；Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：３２８−３８：Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１１）：６０６２−７０；Ｄｙｅｒ １９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）：１５０００９−１５；Ｈｉｌｌ １９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４７）：３０９７９−８４）。
本発明で利用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成または精製アポリポタンパク質も含まれる。本発明で利用されるアポリポタンパク質またはその等価物を得るための方法は当該技術分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば、密度勾配遠心分離もしくは免疫親和性クロマトグラフィーによって血漿もしくは天然産物から分離することができるし、または合成、半合成で、もしくは当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７９８（１−２）：８３−９０；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８（８）：９１３−２９；Ｐｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７１１：９７−１０９；米国特許第５，０５９，５２８号、同第５，８３４，５９６号、同第５，８７６，９６８号および同第５，７２１，１１４；ならびにＰＣＴ国際公開第８６／０４９２０号および同第８７／０２０６２号を参照されたい）。
本発明で利用されるアポリポタンパク質には、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉミラノ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、ＡｐｏＡ−Ｉパリ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するアポリポタンパク質アゴニスト（例えば、ペプチドおよびペプチド類似体）もさらに含まれる。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、同第６，０４６，１６６号、および同第５，８４０，６８８号に記載されているもののいずれかであることができ、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
アポリポタンパク質アゴニストペプチドまたはペプチド類似体は、例えば、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号および同第６，０４６，１６６号に記載の技術をはじめとする、当該技術分野で公知のペプチド合成の任意の技術を用いて合成または製造することができる。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）によって最初に記載された固相合成技術を用いて調製し得る。他のペプチド合成技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，第２版（１９７６）および当業者に容易に入手可能な他の参考文献に見出し得る。ポリペプチド合成技術の概要は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）に見出すことができる。ペプチドは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，第３版，Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ．ａｌ．，編，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載されているような溶液法でも合成し得る。様々なペプチド合成で使用される適切な保護基は、上述のテキストおよびＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）に記載されている。本発明のペプチドは、例えば、アポリポタンパク質Ａ〜Ｉのより大きい部分からの化学的または酵素的切断によっても調製し得る。
特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であることができる。一実施形態では、アポリポタンパク質は、均質な混合物、すなわち、１種類のアポリポタンパク質であることができる。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の不均質な混合物、すなわち、２種以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であることができる。アポリポタンパク質不均質な混合物の実施形態としては、例えば、動物源由来のアポリポタンパク質と半合成源由来のアポリポタンパク質の混合物を挙げることができる。特定の実施形態では、不均質な混合物としては、例えば、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−Ｉミラノの混合物を挙げることができる。特定の実施形態では、不均質な混合物としては、例えば、ＡｐｏＡ−ＩミラノとＡｐｏＡ−Ｉパリの混合物を挙げることができる。本発明の方法および組成物において使用される好適な混合物は当業者に明白であろう。
アポリポタンパク質を自然源から得る場合、それを植物または動物源から得ることができる。アポリポタンパク質は動物源から得られ、アポリポタンパク質は任意の種由来であることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質を動物源から得ることができる。特定の実施形態では、アポリポタンパク質をヒト源から得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同じ種に由来する。
一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の突然変異、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、標的遺伝子は、肝臓で発現される遺伝子、例えば、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）遺伝子である。標的遺伝子、例えば、ＦＶＩＩの発現の効果は、血清または組織試料などの、生物学的試料におけるＦＶＩＩレベルの測定によって評価される。例えば、例えば、ＦＶＩＩ活性のアッセイによって測定されるような血液中のＦＶＩＩのレベルを決定することができる。一実施形態では、肝臓におけるｍＲＮＡのレベルを評価することができる。別の好ましい実施形態では、少なくとも２種類の評価、例えば、（例えば、血液中の）タンパク質レベルの評価と（例えば、肝臓中の）ｍＲＮＡレベルの測定を両方とも行なう。
一実施形態では、作用剤は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸である。
別の実施形態では、核酸剤は一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。例えば、二本鎖ＤＮＡは、構造遺伝子、制御および終結領域を含む遺伝子、または自己複製系（例えば、ウイルスもしくはプラスミドＤＮＡ）であることができる。二本鎖ＲＮＡは、例えば、ｄｓＲＮＡまたは別のＲＮＡ干渉試薬であることができる。一本鎖核酸は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドであることができる。
さらに別の実施形態では、候補作用剤を投与した後の様々な時点で、流体試料（例えば、血液、血漿、もしくは血清）、または組織試料（例えば、肝臓試料）などの生物学的試料を試験対象から採取して、標的タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルに対する作用剤の効果を試験する。特に好ましい一実施形態では、候補作用剤は、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡであり、生物学的試料を第ＶＩＩ因子タンパク質またはｍＲＮＡのレベルに対する効果について試験する。一実施形態では、例えば、免疫組織化学アッセイまたは発色アッセイを用いて、ＦＶＩＩタンパク質の血漿レベルをアッセイする。別の実施形態では、肝臓におけるＦＶＩＩ ｍＲＮＡのレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ、またはノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲアッセイなどのアッセイで試験する。
一実施形態では、作用剤、例えば、改善された脂質製剤を含む組成物を毒性について試験する。さらに別の実施形態では、モデル対象を、例えば、体重または臨床的挙動の変化により、身体的影響についてモニタリングすることができる。
一実施形態では、本方法は、作用剤、例えば、改善された脂質製剤を含む組成物をさらなる評価にかけることをさらに含む。さらなる評価としては、例えば、（ｉ）上記の評価の繰返し、（ｉｉ）異なる数の動物もしくは異なる用量を用いた上記の評価の繰返し、または（ｉｉｉ）異なる方法、例えば、別の動物モデル（例えば、非ヒト霊長類）における評価によるものを挙げることができる。
別の実施形態では、肝臓タンパク質もしくはｍＲＮＡのレベルに対する候補作用剤の観察された効果に応じて、さらなる研究（例えば、臨床試験）において作用剤と改善された脂質製剤を含めるかどうかに関する決定を行なう。例えば、候補ｄｓＲＮＡがタンパク質またはｍＲＮＡレベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより大きく減少させることが観察される場合、この作用剤には臨床試験が考慮される。
さらに別の実施形態では、肝臓タンパク質、ｍＲＮＡのレベルに対する候補作用剤とアミノ脂質の観察された効果に応じて、薬学的組成物中に作用剤と改善された脂質製剤を含めるかどうかに関する決定を行なう。例えば、候補ｄｓＲＮＡがタンパク質またはｍＲＮＡレベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより大きく減少させることが観察される場合、この作用剤には臨床試験が考慮される。
別の態様では、本発明は、治療剤を細胞に送達するその好適性について改善された脂質製剤を評価する方法を特色とする。いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＮＡべースのコンストラクト、例えば、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを送達するその好適性について改善された脂質製剤を評価する方法を特色とする。本方法は、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡと候補アミノ脂質とを含む組成物を提供すること、この組成物を齧歯類（例えば、マウス）に投与すること、ＦＶＩＩの発現を血液中のＦＶＩＩのレベルまたは肝臓におけるＦＶＩＩ ｍＲＮＡのレベルのうちの少なくとも１つの関数として評価し、それにより候補アミノ脂質を評価することを含む。
脂質含有成分（例えば、リポソーム）を含む組成物、かつこれらは以下でさらに詳細に記載されている。例示的な核酸ベースの作用剤としては、ｄｓＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの作用剤も以下でさらに詳細に記載されている。
「ＬＮＰ」組成物（例えば、ＬＮＰ０１、ＬＮＰ０２など）と表される組成物は、「ＡＦ」組成物（例えば、ＡＦ０１、ＡＦ０２など）としても知られている。
「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含む直鎖または分岐、非環状または環状飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられ、一方、飽和分岐アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環状アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、一方、不飽和環状アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
「アルケニル」は、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含む、上で定義されたようなアルキルを意味する。アルケニルには、シス異性体とトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」は、隣接炭素原子間に少なくとも１つの三重結合をさらに含む、上で定義されたような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」は、結合点の炭素が、以下で定義するようなオキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルがアシル基である。
「アリール」という用語は、任意の環原子が置換され得る、芳香族単環式、二環式、または三環式炭化水素を指す。アリール部分の例としては、限定するものではないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが挙げられる。
「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１または２個のヘテロ原子を含む５〜７員単環式、または７〜１０員二環式の複素環式環を意味し、ここで、この窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、かつこの窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよく、これには、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に融合している二環式環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合し得る。複素環としては、以下で定義するようなヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
「任意に置換されたアルキル」、「任意に置換されたアルケニル」、「任意に置換されたアルキニル」、「任意に置換されたアシル」、および「任意に置換された複素環」 という用語は、置換されるときに、少なくとも１つの水素原子が置換基と置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置き換えられる。そういう意味では、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙを含み、その場合、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは同じものまたは別のもので、かつ独立に水素、アルキルまたは複素環であり、アルキルおよび複素環置換基は各々、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つまたは複数でさらに置換されていてもよい。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合１〜６個のヘテロ原子を、または三環式の場合１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、または１１〜１４員の三環式の環系を指し、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、単環、二環、または三環であるならば、炭素原子と、それぞれ、１〜３個、１〜６個、または１〜９個のＮ、Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、その場合、任意の環原子は置換され得る。本明細書に記載のヘテロアリール基は、共通の炭素−炭素結合を共有する融合環も含み得る。「アルキル複素環」という用語は、環原子の少なくとも１つが、アルキル、アルケニルまたはアルキニルで置換されているヘテロアリールを指す。
「置換された」という用語は、所与の構造中の１つ以上の水素ラジカルと、限定するものではないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリック、および脂肪族をはじめとする特定の置換基のラジカルとの置換を指す。置換基をさらに置換し得ることが理解される。「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
「アルキルアミン」および「ジアルキルアミン」という用語は、それぞれ、−ＮＨ（アルキル）および−Ｎ（アルキル）２ラジカルを指す。
「アルキルホスファート」という用語は、−Ｏ−Ｐ（Ｑ’）（Ｑ”）−Ｏ−Ｒ（式中、Ｑ’およびＱ”は各々独立にＯ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）２、任意に置換されたアルキルまたはアルコキシであり、かつＲは、任意に置換されたアルキル、ω−アミノアルキルまたはω−（置換）アミノアルキルである）を指す。
「アルキルホスホロチオアート」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがＳであるアルキルホスファートを指す。
「アルキルホスホナート」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがアルキルであるアルキルホスファートを指す。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、−Ｏ−アルキルラジカルを意味する。
「アルキル複素環」という用語は、少なくとも１つのメチレンが複素環によって置換されているアルキルを指す。
「ω−アミノアルキル」という用語は、−アルキル−ＮＨ２ラジカルを指す。「ω−（置換）アミノアルキル」という用語は、Ｎ上のＨの少なくとも１つがアルキルで置換されているω−アミノアルキルを指す。
「ω−ホスホアルキル」という用語は、−アルキル−Ｏ−Ｐ（Ｑ’）（Ｑ”）−Ｏ−Ｒ（式中、Ｑ’およびＱ”は各々独立にＯまたはＳであり、かつＲは任意に置換されたアルキルである）を指す。
「ω−チオホスホアルキル」という用語は、Ｑ’またはＱ”の少なくとも１つがＳであるω−ホスホアルキルを指す。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基に関する方法論は当業者に周知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡潔に述べると、本発明との関連における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下または消失させる任意の基である。保護基を官能基に付加して、特定の反応の間のその反応性をマスクし、その後、除去して、もとの官能基を暴露することができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」を使用する。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を減少または消失させる任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を用いて付加および除去することができる。
脂質粒子
本明細書で取り上げられる肝臓スクリーニングモデルで試験するための作用剤および／またはアミノ脂質を脂質粒子中に製剤化することができる。脂質粒子としては、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、リポソームは、水性内部を封入する脂質含有膜を有する構造である。リポソームは１つ以上の脂質膜を有し得る。本発明は、単一膜と呼ばれる単層リポソームと、多重膜と呼ばれる多層リポソームの両方を企図している。核酸と複合体を形成する場合、脂質粒子は、例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているような、ＤＮＡ層とＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスでもあり得る。
脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質および／または他の成分（例えば、コレステロール）をさらに含み得る。脂質酸化の防止またはリガンドのリポソーム表面への付着などの種々の目的のために、他の脂質をリポソーム組成物中に含め得る。両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質を含む、いくつかの脂質のうちのどれが存在してもよい。このような脂質を単独でまたは組み合わせて使用することができる。存在し得る追加の脂質成分の特定の例を以下に記載する。
脂質粒子中に存在し得る追加の成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照されたい）、ペプチド、タンパク質、洗剤、脂質誘導体（例えば、ホスファチジルエタノールアミンと結合したＰＥＧおよびセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ）（米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などの二重層安定化成分が挙げられる。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に記載のターゲッティング脂質などのターゲッティング剤を含む。
脂質粒子は、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および形成時の脂質粒子の凝集を低下させるために選択される脂質のうちの１つまたは複数を含むことができる。この形成は、形成時の電荷誘導性凝集を防ぐ粒子の立体安定性によって生じ得る。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、１つまたは２つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、生理的ｐＨでプロトン化して、カチオン性脂質を形成し得るアミノ頭部基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を含む）とを有する脂質を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、「アミノ脂質」とも表される。
他のカチオン性脂質としては、別の脂肪酸基と他のジアルキルアミノ基（アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）を含む）とを有する脂質が挙げられる。一般に、飽和度の低いアシル鎖を有する脂質（例えば、カチオン性脂質）は、特に、滅菌濾過のために、複合体を約０．３マイクロメートル未満の大きさに揃える場合、より簡単に大きさを揃えられる。Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長の不飽和脂肪酸を含むカチオン性脂質が好ましい。アミノ基（例えば、カチオン性脂質のアミノ基）とカチオン性脂質の脂肪酸または脂肪アルキル部分を分離するために、他のスキャフォールドを使用することもできる。好ましいスキャフォールドは当業者に公知である。
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、脂質が、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）またはそれ未満のｐＨで正の電荷を帯び、かつ好ましくは生理的ｐＨまたはそれを上回る第２のｐＨで中性となるように、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能な基を有する。このような脂質もカチオン性脂質と表される。当然、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡過程であること、および帯電脂質または中性脂質に対する言及は、優勢種の性質を指すのであって、脂質の全てが帯電した形態または中性の形態で存在する必要があるわけではないことが理解されるであろう。２つ以上のプロトン化可能もしくは脱プロトン化可能な基を有するか、または双性イオン性である脂質を本発明での使用から排除するものではない。
特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質（すなわち、カチオン性脂質）は、約４％〜約１１の範囲のｐＫａのプロトン化可能な基を有する。これらの脂質がより低いｐＨ製剤段階でカチオン性となる一方で、粒子は（完全にではないが）ほとんどの場合、ｐＨ７．４付近の生理的ｐＨで表面が中性化するので、約４％〜約７のｐＫａが最も好ましい。このｐＫａの利益の１つは、粒子の外部表面と会合する少なくとも一部の核酸が、生理的ｐＨでその静電相互作用を失い、簡単な透析で除去されること、したがって、粒子のクリアランスに対する感受性が大いに低下することである。
形成中の粒子の凝集を低下させる脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、および例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されているようなポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）がある。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのような、製剤化の間の凝集を防ぐ、電荷のない、親水性の、立体障害部分を有する他の化合物を用いて、本発明の方法および組成物に示すように使用される脂質に結合させることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号および同第５，８８５，６１３号に記載されている。通常、凝集を低下させるために選択される脂質成分の濃度は、（脂質のモルパーセントで）約１〜１５％である。
凝集を低下させ、および／または肝臓スクリーニングモデルで使用可能な核酸剤にコンジュゲートするのに好適である脂質の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、および例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されているようなポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）がある。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのような、製剤化の間の凝集を防ぐ、電荷のない、親水性の、立体障害部分を有する他の化合物を用いて、本発明の方法および組成物に示すように使用される脂質に結合させることができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号および同第５，８８５，６１３号に記載されている。通常、凝集を低下させるために選択される脂質成分の濃度は、（脂質のモルパーセントで）約１〜１５％である。
本発明において有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の具体例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するための種々の「アンカリング」脂質部分を有することができる。好適なＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる同時係属の米国特許出願第０８／４８６，２１４号に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。いくつかの実施形態では、粒子内のＰＥＧ脂質の総ｍｏｌ％は約１．５ｍｏｌ％である。例えば、粒子が、本明細書に記載の複数のＰＥＧ脂質（例えば、上記のＰＥＧ修飾脂質）と、ＰＥＧを含むターゲッティング脂質とを含む場合、ＰＥＧ含有脂質の総量はまとめて約１．５ｍｏｌ％である。
立体的に大きい部分（例えば、ＰＥＧまたはＡＴＴＡ）が脂質アンカーにコンジュゲートしている実施形態では、脂質アンカーの選択は、コンジュゲートが脂質粒子とどのような種類の関連を有することになるかによって決まる。ｍｅＰＥＧ（分子量：２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、粒子が循環から除去されるまで、おそらくは数日間、リポソームと関連し続けることがよく知られている。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他のコンジュゲートには同様の滞留能がある。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に暴露されると、製剤外に速やかに入れ替わり、いくつかのアッセイでは、Ｔ１／２は６０分未満となる。米国特許出願第０８／４８６，２１４号に示されているように、少なくとも３つの特徴、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和、および立体障害頭部基のサイズが交換速度に影響を与える。これらの特色の好適なバリエーションを有する化合物は本発明に有用であり得る。いくつかの治療用途のために、ＰＥＧ修飾脂質がインビボで核酸−脂質粒子から速やかに失われることが好ましい場合があり、それにより、ＰＥＧ修飾脂質が比較的短い脂質アンカーを保有することになる。他の治療用途では、核酸−脂質粒子がより長い血漿循環寿命を示すことが好ましい場合があり、それにより、ＰＥＧ修飾脂質は比較的長い脂質アンカーを保有することになる。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有する脂質アンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２）のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。
凝集を防ぐ化合物が、適切に機能するために、必ずしも脂質コンジュゲーションを必要とするわけではないことに留意すべきである。凝集を防ぐのに、溶液中の遊離ＰＥＧまたは遊離ＡＴＴＡで十分な場合がある。製剤化した後に粒子が安定である場合、対象に投与する前にＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析して除去することができる。
中性脂質は、脂質粒子中に存在する場合、生理的ｐＨで電荷のないまたは中性の両性イオン形態として存在するいくつかの脂質種のいずれかであることができる。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子中で使用される中性脂質の選択は、通常、例えば、リポソームサイズや血流中のリポソームの安定性を考慮して判断される。好ましくは、中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。様々な鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるかまたは周知の技術により単離もしくは合成可能である。一群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲の飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２の範囲の単不飽和脂肪酸または二不飽和脂肪酸を有する脂質を用いる。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を用いることができる。好ましくは、本発明で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連ホスファチジルコリンである。本発明において有用な中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、または他の頭部基（例えば、セリンおよびイノシトール）を有するリン脂質から構成されていてもよい。
脂質混合物のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞または脂質粒子調製の分野で従来使用されているステロールのうちのいずれかであることができる。好ましいステロールはコレステロールである。
上で具体的に記載したものに加えて、生理的ｐＨ付近で正味の正電荷を担持する他のカチオン性脂質もまた本発明の脂質粒子に含まれ得る。このようなカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃ１」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、ならびにリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などの、カチオン性脂質のいくつかの市販の調製物を用いることができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。
本発明の脂質粒子において使用するのに好適なアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
多くの実施形態では、両親媒性脂質が本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」とは、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に向けられている一方で、親水性部分が水性相に向けられている任意の好適な物質を指す。このような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジリノレイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）が挙げられる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸などの、他のリンを欠く化合物を使用することもできる。さらに、このような両親媒性脂質は、トリグリセリド類やステロール類などの他の脂質と容易に混合することができる。
プログラム可能な融合脂質も本発明の脂質粒子中に含めるのに好適である。このような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向がほとんどなく、所与のシグナル事象が起こるまで、その積み荷を送達する。これにより、脂質粒子は、生物または疾患部位に注射された後、より均一に分布し、その後に細胞と融合し始めることが可能になる。このシグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境の変化、または時間であることができる。最後の場合、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲートなどの、融合遅延成分または「クローキング」成分は、時間とともに脂質粒子膜外に単に入れ替わることができる。例示的な脂質アンカーとしては、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有する脂質アンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２）のサイズは、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンである。
体内に適切に分布するまでに、脂質粒子は、融合するのに十分なクローキング剤を失っている。他のシグナル事象の場合、疾患部位または標的細胞と関連するシグナル（例えば、炎症部位での温度上昇）を選択することが望ましい。
核酸剤にコンジュゲートした脂質粒子は、ターゲッティング部分、例えば、細胞型または組織に特異的なターゲッティング部分を含むこともできる。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン類（例えば、リボフラビン）およびモノクローナル抗体などの、種々のターゲッティング部分を用いた脂質粒子のターゲッティングがこれまでに記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照されたい）。例示的なターゲッティング部分としては、本明細書に記載のターゲッティング脂質などのターゲッティング脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質は、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃ３−ＤＳＧやＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧなどのＧａｌＮＡｃ含有ターゲッティング脂質である。ターゲッティング部分は、タンパク質全体またはその断片を含むことができる。ターゲッティング機構は、通常、ターゲッティング部分が標的（例えば、細胞表面受容体）との相互作用に利用可能となるような形で、ターゲッティング剤が脂質粒子の表面に位置付けられることを必要とする。例えば、Ｓａｐｒａ，Ｐ．ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，ＴＭ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９−６２（２００３）およびＡｂｒａ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１−３（２００２）に記載されているものをはじめとする、種々の異なるターゲッティング剤およびターゲッティング方法が当該技術分野で知られており、かつ利用可能である。
ターゲッティングのために、親水性ポリマー鎖（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖）の表面コーティングを有する脂質粒子、すなわち、リポソームを使用することが提案されている（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７：９９−１０８（１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８：６１０１−６１０４（１９９６）；Ｂｌｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９：１８０−１８４（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ 第９章（Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ編） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ（１９９５）。１つのアプローチでは、脂質粒子を標的とするリガンド（例えば、抗体）を、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合する。別のアプローチでは、ターゲッティングリガンドを、親水性ポリマーコーティングを形成するＰＥＧ鎖の遠位末端に結合させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：３２１−３３４（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８：１１５−１１８（１９９６））。
標的薬剤を結合させるための標準的な方法を用いることができる。例えば、標的薬剤の結合のために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、または誘導体化された親油性化合物（例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）を用いることができる。例えば、プロテインＡを組み込んだリポソームを用いて、抗体をターゲッティングするリポソームを構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８−２４５１（１９９０）を参照されたい）。抗体コンジュゲーションの他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、この文献の教示は参照により本明細書に組み込まれる。ターゲッティング部分の例としては、新生物または腫瘍と関連する抗原を含む、細胞成分に特異的な他のタンパク質を挙げることもできる。ターゲッティング部分として用いられるタンパク質は、共有結合によってリポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい）。他のターゲッティング方法としては、ビオチン−アビジンシステムが挙げられる。
例示的な一実施形態では、脂質粒子は、本発明のカチオン性脂質、（カチオン性脂質以外の）中性脂質、ステロール（例えば、コレステロール）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）の混合物を含む。特定の実施形態では、脂質混合物は、本発明のカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質からなるかまたはこれらから本質的になる。さらに好ましい実施形態では、脂質粒子は、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ約２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％というモル比の上記の脂質混合物からなるかまたはこれらから本質的になる。
特定の実施形態では、脂質粒子は、例えば、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ 約２０〜６０％：ＤＳＰＣ ５〜２５％：Ｃｈｏｌ ２５〜５５％：ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ ０．５〜１５％というモル比のＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、およびＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡからなるか、またはこれらから本質的になる。特定の実施形態では、モル脂質比は、約４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）または５２／１３／３０／５（ｍｏｌ％ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。
別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質であるＤＳＰＣは、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換えられる。
治療剤−脂質粒子組成物および製剤化
本発明は、本発明の脂質粒子と活性剤とを含む組成物を含み、その場合、この活性剤は、脂質粒子と関連している。特定の実施形態では、活性剤は治療剤である。特定の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の水性内部に封入されている。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層の内部に存在する。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の外部または内部脂質表面に結合している。
本明細書で使用される「完全に封入された」とは、粒子中の核酸が、血清への暴露または遊離のＤＮＡを相当に分解するヌクレアーゼアッセイの後にそれほど分解されないことを示す。完全に封入された系では、通常は遊離の核酸の１００％を分解する処理において、好ましくは粒子核酸の２５％未満が分解され、より好ましくは１０％未満、および最も好ましくは粒子核酸の５％未満が分解される。あるいは、完全な封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）。
完全に封入されたとは、粒子が血清安定である、すなわち、インビボ投与によって、粒子がすぐにはその構成部分に分解されないことも示唆する。
本明細書で使用される活性剤としては、細胞、組織、器官、または対象に所望の効果を及ぼすことが可能な任意の分子または化合物が挙げられる。このような効果は、例えば、生物学的、生理学的、または美容的であり得る。活性剤は、例えば、核酸、ペプチドならびにポリペプチド（例えば、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および霊長類化（Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）抗体、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンを含む）ならびに小分子（小さい有機分子または化合物を含む）をはじめとする、任意のタイプの分子または化合物であり得る。
一実施形態では、活性剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体に治療活性があってもよく、またはさらに修飾されたときに活性を持つようになるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、未修飾の薬剤と比較したときに、治療活性の一部または全てを保持しているが、別の実施形態では、治療剤誘導体は治療活性を欠いている。
様々な実施形態では、治療剤としては、例えば、抗炎症性化合物、抗鬱薬、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、受胎調節剤、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬（例えば、抗不整脈剤、血管収縮薬）、ホルモンおよびステロイドが挙げられる。
特定の実施形態では、治療剤は抗癌薬であり、これは、抗腫瘍剤、抗癌剤、腫瘍薬、抗新生物剤などとも呼ばれる。本発明に従って使用可能な抗癌薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、ブスルファン静注、ブスルファン経口、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ゲムツズマブ−オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、リトレチノイン、メガストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用可能な抗腫瘍薬の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤ならびにカンプトテシンである。
核酸−脂質粒子
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸と関連して、核酸−脂質粒子を生じさせる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全に封入されている。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことが意図されている。最大５０個のヌクレオチドを含む断片を通常オリゴヌクレオチドと呼び、それよりも長い断片をポリヌクレオチドと呼ぶ。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは２０〜５０ヌクレオチド長である。
本発明との関連において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、またはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーも含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの強化やヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの特性のために、天然の形態よりも好ましいことが多い。
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドと分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’炭素と３’炭素においてリン酸と共有結合して、交互の非分岐状ポリマーを形成するデオキシリボースと呼ばれる５炭糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである同様の反復構造からなる。
本発明による脂質−核酸粒子中に存在する核酸には、既知の核酸の任意の形態が含まれる。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、ならびに自己複製系（例えば、ウイルスまたはプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明の核酸は、通常、核酸の特定の形態に依存して様々な長さであり得る。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜１００，０００ヌクレオチド残基長であり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０〜１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。様々な関連実施形態では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のオリゴヌクレオチドの長さの範囲は、約１０〜約５０ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、約１５〜約３０ヌクレオチド長、約２０〜約３０ヌクレオチド長であり得る。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイスするかまたは標的ポリヌクレオチドに相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間で安定かつ特異的な結合が起こる程度の十分な相補度を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的に結合することで、標的分子の正常な機能が妨げられて、それからの有用性または発現が失われ、かつ特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合は、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合は、アッセイが行なわれる条件下で、オリゴヌクレオチドが非標的配列に結合するのを妨げるほどの十分な相補度があるときに特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的としているまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較したとき、１、２、または３つの塩基置換を含む。
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と関連している。ＲＮＡｉ分子を用いたＲＮＡ干渉法を用いて、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を妨害し得る。この５年の間に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、基本的には、開発中の次世代のターゲッティングオリゴヌクレオチド薬物としてアンチセンスＯＤＮやリボザイムに取って代わった。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる細胞質の多タンパク質複合体と会合することができる通常２１〜３０ヌクレオチド長のＲＮＡ二重鎖である。ｓｉＲＮＡを搭載したＲＩＳＣは、相同なｍＲＮＡ転写産物の分解を仲介し、それゆえ、高い特異性をもってタンパク質発現をノックダウンするよう、ｓｉＲＮＡを設計することができる。他のアンチセンス技術とは異なり、自然な機構によるｓｉＲＮＡ機能は、非コードＲＮＡを介して遺伝子発現を制御するよう進化した。これは、その活性が、アンチセンスＯＤＮまたはリボザイムよりもインビトロおよびインビボで強力である理由であると一般に考えられている。臨床的に意義のある標的を標的とするｓｉＲＮＡをはじめとする種々のＲＮＡｉ試薬は現在、例えば、ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：４４３−４５３（２００７）に記載されているように、医薬品として開発されているところである。
最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖とＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、現在、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを仲介することができることが証明されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ａ．Ｔ．，（２００３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１１１−１１９）。したがって、本発明は、これらの異なるタイプの二本鎖分子のいずれかを含むＲＮＡｉ分子の使用を含む。さらに、ＲＮＡｉ分子を種々の形態で用いて、細胞に導入し得ることが理解される。したがって、本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子は、限定するものではないが、２つの別々の鎖、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、二本鎖領域を形成する相補配列のヘアピンループを含むポリヌクレオチド、例えば、ｓｈＲＮＡｉ分子と、単独でまたは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターとを含む、細胞内でＲＮＡｉ応答を誘導することができる任意のおよび全ての分子を包含する。
本明細書で使用される「一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、単一分子から構成されるｓｉＲＮＡ化合物である。これは、鎖内対形成によって形成された二重鎖領域を含んでもよく、例えば、ヘアピン構造もしくはパン・ハンドル構造であってもよいし、またはこのような構造を含んでもよい。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、標的分子に関してアンチセンスであってもよい。
一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、ＲＩＳＣに入り、ＲＩＳＣ媒介性の標的ｍＲＮＡの切断に関与することができるくらい十分に長くてもよい。一本鎖ｉＲＮＡ化合物の長さは、少なくとも１４ヌクレオチド、および他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の長さは、２００、１００、または６０ヌクレオチド未満である。
ヘアピンｓｉＲＮＡ化合物は、１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下である。特定の実施形態では、二重鎖領域の範囲の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。ヘアピンは、一本鎖突出または末端不対領域を有していてもよい。特定の実施形態では、突出の長さは、２〜３ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、突出は、ヘアピンのセンス側に、いくつかの実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側にある。
本明細書で使用される「二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」とは、鎖間ハイブリダイゼーションによって二重鎖構造の領域が形成され得る、２つ以上の、場合によっては２つの、鎖を含むｓｉＲＮＡ化合物である。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドであってもよい。本明細書で使用される場合、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば、標的ＲＮＡに十分に相補的なｓｉＲＮＡ化合物の鎖を意味する。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対に等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対であってもよい。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下であってもよい。範囲の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対であってもよい。
多くの実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）切断されて、より小さいｓｉＲＮＡ化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）を産生することができるくらいに十分大きい。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、突出、例えば、１つもしくは２つの５’突出もしくは３’突出、または１〜３ヌクレオチドの３’突出を含むように対合した、センス鎖とアンチセンス鎖を含み得る。突出は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの２つの鎖がジグザグ状なっていることの結果として生じ得る。いくつかの実施形態は、少なくとも１つの３’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の両方の末端が３’突出を有する。いくつかの実施形態では、突出は２ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で議論されたｓｓｉＲＮＡ化合物の範囲において、１５〜３０ヌクレオチド長、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｓｉＲＮＡ化合物は、天然のＤｉｃｅｒによって長いｄｓｉＲＮＡからプロセッシングされた産物と長さや構造が類似していることもある。ｓｓｉＲＮＡ化合物の２つの鎖が結合（例えば、共有結合）している実施形態も含まれる。ヘアピン、または必要とされる二本鎖領域、および３’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物および一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を含む、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写産物）のサイレンシングを仲介することができる。便宜上、このようなｍＲＮＡを、本明細書では、サイレンシングされるｍＲＮＡとも表す。このような遺伝子を標的遺伝子とも表す。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを標的することもできる。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論に束縛されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスとガイドＲＮＡ（例えば、２１〜２３ヌクレオチドのｓｓｉＲＮＡ化合物）とが使用されると考えられている。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、ｓｉＲＮＡ化合物が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡ化合物は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン−クリック型塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含むことができる。さらに、特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別することができる。この場合、ｓｉＲＮＡ化合物は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある（例えば、７ヌクレオチド以内の）領域に見られる場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、標的ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害し得る。二本鎖ＲＮＡを介する遺伝子および核酸発現の抑制は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞または生物に導入することにより、本発明に従って達成し得る。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方、例えば、１つのＲＮＡ鎖と１つのＤＮＡ鎖を含むハイブリッド分子であり得る。ｓｉＲＮＡを細胞に直接導入することにより、哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを誘発することができることが証明されている（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１））。さらに、哺乳動物細胞内での抑制はＲＮＡレベルで起こり、標的とされた遺伝子に特異的で、ＲＮＡとタンパク質抑制の間に強い相関があった（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４６−９７４７（２００１））。さらに、ＨｅＬａ Ｓ３、ＣＯＳ７、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ−２９、ＣＨＯ−Ｋ１およびＭＣＦ−７細胞をはじめとする、多種多様な細胞株は、ある程度ｓｉＲＮＡサイレンシングに感受性があることが示された（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ ９（１）：１−７、ｗｗｗ．ｄｏｔ．ａｍｂｉｏｎ．ｄｏｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ（９／１／０２）のワールドワイドウェブ上で入手可能）。
特定のポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡｉ分子は、当該技術分野で公知の手順に従って容易に調製することができる。効果的なｓｉＲＮＡ分子の構造的特徴が同定されている。Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８およびＥｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１），ＥＭＢＯ ２０：６８７７−６８８８。したがって、当業者であれば、多種多様な異なるｓｉＲＮＡ分子を用いて、特異的な遺伝子または転写産物を標的し得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、本発明によるｓｉＲＮＡ分子は二本鎖であり、１６〜３０または１８〜２５ヌクレオチド長（その間にある各々の整数を含む）である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長さである。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、０〜７ヌクレオチドの３’突出または０〜４ヌクレオチドの５’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、２ヌクレオチドの３’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長であり、２ヌクレオチドの３’突出を有する（すなわち、ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖の間に１９ヌクレオチドの相補領域を含む）。特定の実施形態では、突出はＵＵまたはｄＴｄＴの３’突出である。
１塩基対のミスマッチですらサイレンシングを低下させることが示されているので、通常、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ分子の一方の鎖に完全に相補的である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’−デオキシ−または２’−Ｏ−メチル修飾などの修飾された骨格組成を有し得る。しかしながら、好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡの鎖全体は、２’デオキシまたは２’−Ｏ−修飾塩基のいずれかを含んで作製されない。
別の実施形態では、本発明は、細胞内で遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡのうちの１つの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された調節配列を含む。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ標的部位は、標的ｍＲＮＡ転写産物配列をＡＡジヌクレオチド配列の存在についてスキャンすることによって選択される。３’隣接の約１９ヌクレオチドと組み合わされた各々のＡＡジヌクレオチド配列は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位である。一実施形態では、調節領域に結合するタンパク質がｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得るので、ｓｉＲＮＡ標的部位は、選択的に、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内または開始コドン付近の領域内（約７５塩基以内）には位置しない（Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｅｌｓｈａｂｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−６８８８（２００１））。さらに、潜在的標的部位を、適当なゲノムデータベース（例えば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ）上で入手可能な、ＢＬＡＳＴＮ ２．０．５）、および除外された他のコード配列とかなりの相同性を有する潜在的標的配列と比較し得る。
特定の実施形態では、短いヘアピンＲＮＡは、本発明の核酸−脂質粒子の核酸成分を構成している。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、配列特異的に標的遺伝子の発現を低下させることができるヘアピンＲＮＡの形態である。短いヘアピンＲＮＡは、通常、細胞環境においてより安定でかつ分解されにくいので、遺伝子発現を抑制するときにｓｉＲＮＡに優る利点を提供し得る。このような短いヘアピンＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングは、種々の正常細胞株および癌細胞株において、ならびにマウス細胞およびヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞において機能することが立証されている。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８（２００２）。さらに、改変されたｓｈＲＮＡをコードする染色体遺伝子を担持するトランスジェニック細胞株が作製されている。これらの細胞は、ｓｈＲＮＡを構成的に合成し、それにより、子孫細胞に受け継がれ得る長時間持続型のまたは構成的な遺伝子サイレンシングを促進することができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３−１４４８（２００２）。
ｓｈＲＮＡはステムループ構造を含む。特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、変えられるステムの長さ、通常、１９〜２９ヌクレオチド、またはその間の任意の数の長さを含み得る。特定の実施形態では、ヘアピンは、１９〜２１ヌクレオチドステムを含むが、他の実施形態では、ヘアピンは、２７〜２９ヌクレオチドステムを含む。特定の実施形態では、ループサイズは４〜２３ヌクレオチドの長さであるが、ループサイズは、サイレンシング活性にそれほど影響を及ぼすことなく、２３ヌクレオチドより大きいことがあり得る。ｓｈＲＮＡ分子は、効力を低下させることなく、ミスマッチ、例えば、ｓｈＲＮＡステムの２つの鎖の間のＧ−Ｕミスマッチを含み得る。実際、特定の実施形態では、例えば、細菌中で増殖させる間、ヘアピンを安定化するために、ヘアピンステム中に１個または数個のＧ−Ｕ対を含むようにｓｈＲＮＡを設計する。しかしながら、通常、標的ｍＲＮＡに結合するステムの部分（アンチセンス鎖）とｍＲＮＡの相補性が必要とされるので、この領域中の１塩基対ミスマッチでさえもサイレンシングを無効にする可能性がある。５’および３’突出は、ｓｈＲＮＡ機能に重要であるようには見えないので、必要とはされないが、これらが存在していてもよい（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６（８）：９４８−５８）。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない高度に保存された小ＲＮＡ分子群である。プロセッシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれるようになる約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖ＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化の重要な調節因子として同定されている。これらは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に役割を果たしていると考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物切断、またはその両方によって、遺伝子発現の下方調節を仲介する。ＲＩＳＣは、広範囲にわたる真核生物の核内での転写サイレンシングにも関与する。
これまでに同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多く、かつ増加しており、その実例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に、また、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｄｏｔ．ｓａｎｇｅｒ．ｄｏｔ．ａｃ．ｄｏｔ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／におけるワールド・ワイド・ウェブ上でも見られる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、ターゲッティングポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選ばれた配列に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合、相補的なＲＮＡ鎖に結合することによって、その翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡは、特異的で、相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的するために用いることができる。結合が起こる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを酵素のＲＮアーゼＨで分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子と正確には相補的ではない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスで見られる場合に、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途で最も好ましい場合に利用することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的でかつ標的を定めた阻害剤であることが示されており、それゆえに、これを用いて、標的とされた遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質合成を阻害する効力は、よく確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼおよびムスカリンおよびムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体およびヒトＥＧＦについて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号および米国特許第号５，６１０，２８８）。さらに、種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害し、かつこれらを治療するために使用可能なアンチセンスコンストラクトもまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７号および米国特許第５，７８３，６８３号）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製する方法は、当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために容易に適応することができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の解析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギーおよび相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ダイマー、ヘアピン、または宿主細胞における標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少させるかもしくは妨げる他の二次構造を相対的に形成することができないことに基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンにおける領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造解析および標的部位の選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて行なうことができる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼからの保護ならびに薬理学的特性（例えば、組織および細胞への取込みの増強）のための様々な修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオアート骨格、および例えば、３’−末端のコレステロール部分によって、普通のＲＮＡとは異なる。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒと内在性ｍｉＲＮＡとを含む二重鎖を形成することによって内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングし、それによってｍｉＲＮＡ誘導性の遺伝子サイレンシングを妨害するために使用し得る。アンタゴｍｉｒ媒介性のｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９（これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されている、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。アンタゴｍｉｒ ＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いて合成し得る。米国特許出願第１１／５０２，１５８号および同第１１／６５７，３４１号を参照されたい（これらの内容の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
アンタゴｍｉｒは、リガンドにコンジュゲートしたモノマーサブユニットやオリゴヌクレオチド合成用のモノマーを含むことができる。例示的なモノマーは、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１８５号に記載されている。アンタゴｍｉｒは、２００４年３月８日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されているような、ＺＸＹ構造を有することができる。アンタゴｍｉｒは、両親媒性部分と複合体化させることができる。オリゴヌクレオチド剤とともに使用される例示的な両親媒性部分は、２００４年３月８日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
アプタマー
アプタマーは、対象となる特定の分子に高い親和性および特異性で結合する核酸またはペプチド分子である（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８（１９９０））。大きいタンパク質から小さい有機分子まで多くの異なる実体に結合するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーの産生に成功している。Ｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−１６（１９９７）、Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：３２４−９（１９９９）、およびＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５（２０００）を参照されたい。アプタマーは、ＲＮＡベースでも、ＤＮＡベースでもよく、かつリボスイッチを含んでいてもよい。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、かつ標的へのその結合が遺伝子の活性に影響を及ぼす、ｍＲＮＡ分子の一部である。したがって、リボスイッチを含むｍＲＮＡは、その標的分子の有無によって、それ自体の活性の調節に直接関与する。通常、アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸などの様々な分子標的、さらには細胞、組織および生物に結合するように、インビトロ選択を何回も繰り返すことによって、または同等にＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によって人工的に作製される。アプタマーは、合成法、組換え法、および精製法をはじめとする、任意の既知の方法によって調製されてもよく、単独でまたは同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用してもよい。さらに、本明細書でより十分に記載したように、「アプタマー」という用語には、特に、２つ以上の既知のアプタマーと所与の標的との比較から得られるコンセンサス配列を含む「２次アプタマー」が含まれる。
リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと会合する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、しばしばオリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つだけを切断する高度の特異性によって、リン酸エステル転移反応を加速させる（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、基質が化学反応前に特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部のガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることに起因している。
天然に存在する酵素的ＲＮＡの少なくとも６つの基本的な種類が現在知られている。各々は、生理的条件下においてトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持されている酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡを認識し、次に、相補的な塩基対形成によってそれに結合し、一旦正確な部位に結合したら、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされるタンパク質の合成を指示する能力を破壊する。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、そのＲＮＡから放出されて、別の標的を捜し、そして、新しい標的への結合とその切断を繰り返すことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合した状態）またはアカパンカビＶＳ ＲＮＡモチーフとして形成され得る。ハンマーヘッド型モチーフの具体的な例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第ＥＰ０３６０２５７号）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されており、ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載されており、アカパンカビＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており、グループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、それらが、標的遺伝子のＤＮＡ領域またはＲＮＡ領域の１または複数に相補的である特異的な基質結合部位を有すること、およびその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を基質結合部位内または基質結合部位周辺に有することである。したがって、リボザイムコンストラクトは、本明細書中で述べられる特定のモチーフに限定される必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムを作製する方法は、当該技術分野で公知である。リボザイムは、各々参照により本明細書に明確に組み込まれる、国際公開第９３／２３５６９号および国際公開第９４／０２５９５号に記載されているように設計され、かつ合成されて、それらに記載されているようにインビトロおよびインビボで試験され得る。
リボザイム活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更すること、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ修飾を有するリボザイムを化学的に合成すること（例えば、国際公開第９２／０７０６５号；国際公開第９３／１５１８７号；国際公開第９１／０３１６２号；欧州特許出願公開９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際公開第９４／１３６８８を参照されたい。これらの文献は、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分になされ得る様々な化学修飾を記載している）、細胞内でのそれらの効力を高める修飾、およびＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的必要性を低下させるステムＩＩ塩基の除去によって、最適化することができる。
本発明の組成物および方法において使用するのに好適なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の追加の特定の核酸配列は、米国特許出願第６０／３７９，３４３号、米国特許出願第０９／６４９，５２７号、国際公開第０２／０６９３６９号、国際公開第０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号およびＲａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用されるＯＤＮは、ＣｐＧモチーフ内にホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオアート（「ＰＳ」）骨格および／または少なくとも１つのメチル化されたシトシン残基を有する。
核酸修飾
１９９０年代、ＤＮＡベースのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）およびリボザイム（ＲＮＡ）が、薬物のデザインおよび開発に対して興奮させる新しいパラダイムをもたらしたが、それらのインビボでの適用は、エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼ活性ならびに首尾よい細胞内送達の欠如によって妨げられた。この分解の問題は、オリゴヌクレオチド（オリゴ）薬物がヌクレアーゼ酵素によって認識されるのを妨げるが、それらの作用機構を阻害しない化学修飾に対する大規模な研究の後、効果的に克服された。この研究は非常に成功したので、現在開発過程のアンチセンスＯＤＮ薬物は、未修飾分子の場合の数分間と比較して、インビボで数日間インタクトな状態である（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．２００３．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０：１６２８−４４）。しかしながら、細胞内送達および作用機序の問題は、これまで、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムが臨床的な製品になることを制限している。
ＲＮＡ二重鎖は、本質的に、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡよりもヌクレアーゼに対して安定であり、かつアンチセンスＯＤＮとは異なり、未修飾ｓｉＲＮＡは、一旦細胞質に到達すると良好な活性を示す。そうであっても、アンチセンスＯＤＮやリボザイムを安定化させるために開発された化学修飾もまた、どれくらいの化学修飾が許容され得るか、薬物動態学的および薬力学的な活性を高めることができるかどうかを明らかにするために、ｓｉＲＮＡに体系的に適用されている。ｓｉＲＮＡ二重鎖によるＲＮＡ干渉には、異なる機能を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖が必要である。両方とも、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの侵入を可能にするために必要であるが、一旦装填されると、２本の鎖は分離し、センス鎖は分解されるのに対し、アンチセンス鎖は残留して、ＲＩＳＣを標的ｍＲＮＡに導く。ＲＩＳＣへの侵入は、標的ｍＲＮＡの認識および切断よりも構造的に厳格性の低いプロセスである。結果として、センス鎖の多くの異なる化学修飾が可能であるが、限られた変化しかアンチセンス鎖によって許容されない（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
当該技術分野で公知の通り、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、その糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合して、線状のポリマー化合物を形成する。次に、この線状のポリマー構造のそれぞれの末端がさらに結合されて、環状構造を形成することができる。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。
本発明による脂質−核酸粒子において使用される核酸は、公知である任意の形態の核酸を含む。したがって、この核酸は、ヌクレアーゼ耐性および血清安定性を高めるために以前に使用されたタイプの修飾された核酸であり得る。しかしながら、驚くべきことに、許容可能な治療的な生成物は、天然の核酸ポリマーのホスホジエステル結合に対する修飾を有さない核酸から脂質−核酸粒子を製剤化する本発明の方法を用いても調製することができ、未修飾のホスホジエステル核酸（すなわち、全ての結合がホスホジエステル結合である核酸）を使用することが、本発明の好ましい実施形態である。
骨格修飾
本発明において有用なアンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他のオリゴヌクレオチドとしては、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドと骨格内にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドが含まれる。ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含む）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホロセレナート、メチルホスホナートまたはＯ−アルキルホスホトリエステル結合、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスファート、これらの２’−５’結合類似体、および反転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接する対では、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とが結合する）が挙げられる。本発明による核酸内に存在し得る特定の修飾の特定の非限定的な例を表２に示す。
様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた含まれる。上記結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合の混合、または１つ以上の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、例えば、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他のものが挙げられる。上記のオリゴヌクレオシドを記載している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホロチオアート骨格修飾（表３、＃１）（ホスホジエステル結合内の非架橋酸素が硫黄で置換されている）は、ヌクレアーゼ分解に対して核酸薬物を安定化させるために配置された最も古く最も一般的な手段の１つである。通常、ＰＳ修飾は、活性に対して大きく影響せずに、両方のｓｉＲＮＡ鎖に対して広範になされ得るようである（Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−４４，２００３）。しかしながら、ＰＳオリゴは、タンパク質と非特異的に貪欲に会合することが知られており、その結果、特にｉ．ｖ．投与の際に毒性が生じる。それゆえに、ＰＳ修飾は、通常、３’および５’末端における１つまたは２つの塩基に制限される。ボラノホスファートリンカー（表３、＃２）は、ＰＳよりも明らかに安定であり、ｓｉＲＮＡ活性を高め、そして低毒性を有する、最近の修飾である（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：５９９１−６０００，２００４）。
他の有用な核酸誘導体としては、架橋酸素原子（リン酸エステル結合を形成するもの）が−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２−などで置換されている核酸分子が挙げられる。特定の実施形態では、使用されるアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたは他の核酸に対する改変は、核酸と会合する負電荷に完全には影響を及ぼさないであろう。したがって、本発明は、結合の部分が、例えば、中性のメチルホスホナートまたはホスホルアミダート結合で置換されている、アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび他の核酸の使用を企図する。中性の結合が使用されるとき、ある特定の実施形態において、８０％未満の核酸結合が、そのように置換されるか、または５０％未満の結合がそのように置換される。
塩基修飾
塩基修飾は、骨格および糖に対する修飾よりも一般的ではない。０．３−６に示す修飾の全てが、ヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡを安定化させ、活性に対してほとんど効果がないようである（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６：８９３−９００）。
したがって、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオ塩基（当該技術分野では単に「塩基」と表されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「未修飾の」または「天然の」ヌクレオ塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオ塩基としては、他の合成および天然のヌクレオ塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃまたはｍ５ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。
特定のヌクレオ塩基は、本発明のオリゴマー化合物（５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）を含む）の結合親和性を増加させるのに特に有用である。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ｐａｇｅｓ ２７６−２７８）。これらは、特定の実施形態では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせ得る。これらの修飾されたヌクレオ塩基ならびに他の修飾されたヌクレオ塩基の特定のものの調製を教示する米国特許としては、上で述べた米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１，５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号が挙げられるが、これらに限定されない。
糖修飾
糖基におけるほとんどの修飾は、好都合に化学的に反応性の部位を提供する、ＲＮＡ糖環の２’−ＯＨにおいて生じる。（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．２００４．ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ８：５７０−９；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．，Ｄｕ，Ｑ．，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．２００６．ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ６：８９３−９００）。２’−Ｆおよび２’−ＯＭＥ（０．７および８）が、一般的であり、その両方が、安定性を高め、２’−ＯＭＥ修飾は、１本の鎖あたり４ヌクレオチド未満に制限される限り、活性を低下させない（Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．，Ｂａｂａｉｅ，Ｅ．，Ｐｒｙｄｚ，Ｈ．２００３．Ｓｉｍｉｌａｒ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅｙ ａｃｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡｉ ｐａｔｈｗａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２４０１−７）。修飾塩基がその分子の中央領域に限定されるとき、２’−Ｏ−ＭＯＥ（０．９）は、ｓｉＲＮＡにおいて最も有効である（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ａｌｌｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｄａｎｄｅ，Ｐ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．，Ｓｉｏｕｆｉ，Ｎ．，Ｊａｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｂａｋｅｒ，Ｂ．Ｆ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｂｈａｔ，Ｂ．２００５．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８：４２４７−５３）。活性を失わせることなくｓｉＲＮＡを安定化させることが見出されている他の修飾を、０．１０−１４に示す。
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換された糖部分も含み得る。例えば、本発明は、以下のうちの１つを２’位に含むオリゴヌクレオチドを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル、またはＯ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のもののうちの１つを２’位に含む：Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基。１つの修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）が挙げられる。
修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物も有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号：同第５，１１８，８００号：同第５，３１９，０８０号：同第５，３５９，０４４号：同第５，３９３，８７８号：同第５，４４６，１３７号：同第５，４６６，７８６号：同第５，５１４，７８５号：同第５，５１９，１３４号：同第５，５６７，８１１号：同第５，５７６，４２７号：同第５，５９１，７２２号：同第５，５９７，９０９号：同第５，６１０，３００号：同第５，６２７，０５３号：同第５，６３９，８７３号：同第５，６４６，２６５号：同第５，６５８，８７３号：同第５，６７０，６３３号：および同第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されない。
他のオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方（すなわち、骨格）は、新規の基で置換されるが、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。ヌクレオ塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の生成を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００）に見られる。
本発明の特定の実施形態は、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチドならびにヘテロ原子骨格、特に、上で参照された米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格と称される）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表現される）および上で参照された米国特許第５，６０２，２４０号アミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。上で参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含むこともできる。したがって、オリゴヌクレオチドは、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含むことができる。モノマーは、糖の１’位にα結合（例えば、α−ヌクレオシド）を有することができる。オリゴヌクレオチドは、Ｃ−１’にヌクレオ塩基を欠く「無塩基」糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、１つ以上の構成成分の糖原子にさらに修飾を含むこともできる。オリゴヌクレオチドは、Ｌ型である１つ以上の糖（例えば、Ｌ−ヌクレオシド）を含むこともできる。
キメラオリゴヌクレオチド
所与の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、上述の修飾のうちの２つ以上が、１つの化合物、またはオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドにさえ組み込まれ得る。本発明の特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、本発明との関連において、各々が少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている２つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、通常、１つ以上の有利な特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、細胞への高い取り込み、ＲＮＡ標的に対する高い結合親和性）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮａｓｅＨ切断に対する基質である領域を含む。
一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増加させるために修飾された少なくとも１つの領域を含む。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍ（オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度であり；解離は、分光光度的に検出される）を測定することによって通例の通りに決定される。Ｔｍが高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が高い。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドに通例の通りに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。このような高い親和性の効果は、標的遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害を大いに高めることになる。
別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨに対する基質として作用する領域を含む。当然、オリゴヌクレオチドが、本明細書に記載の様々な修飾の任意の組合せを含み得ることが理解される。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取込みを高める、１つ以上の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。このようなコンジュゲートおよびそれを調製する方法は、当該技術分野で公知である。
治療効力などのインビボでの有用性について、合理的な経験則は、チオ化されたバージョンの配列が遊離形態で働く場合、任意の化学成分の、同じ配列の封入された粒子も有効であるということを当業者は理解するだろう。封入された粒子は、アンチセンス治療に別段応答性であることが知られていない状態およびモデルにおいて有効性を示す、より広範囲のインビボ有用性も有し得る。本発明を適用することにより、現在アンチセンス治療に応答する古いモデルを見出し得ることを当業者は知っている。さらに、当業者は、本発明を使用することにより、見捨てられたアンチセンス配列または化学成分を再考し、効力を見出し得る。
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成技術によって、好都合にかつ通例の通りに、作製され得る。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかのベンダーによって販売されている。このような合成のための任意の他の手段も使用され得る。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に、業務従事者の能力の範囲内である。ホスホロチオアートおよびアルキル化された誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも周知である。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子と会合する核酸は、免疫刺激性であってもよく、これには、対象（哺乳動物であっても、または他の患者であってもよい）に投与されたときに、免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）が含まれる。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造を生じさせる特定のパリンドロム（Ｙａｍａｍｏｔｏ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６参照）、またはＣｐＧモチーフ、および他の既知のＩＳＳ特徴（例えば、多重Ｇドメイン、国際公開第９６／１１２６６号参照）が含まれる。
免疫応答は、先天性免疫応答または適応免疫応答であり得る。免疫系は、より先天性の免疫系と、脊椎動物の後天性の適応免疫系に分けられ、後者は、液性の細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態では、免疫応答は、粘膜によるものであってもよい。
特定の実施形態では、免疫刺激性核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与された場合にのみ免疫刺激性であり、その「遊離形態」で投与された場合には、免疫刺激性ではない。本発明によれば、このようなオリゴヌクレオチドが免疫刺激性であると考えられる。
免疫刺激性核酸は、免疫応答を誘発するために標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、その発現を低下させる必要がない場合には、配列非特異的であるとみなされる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それでも配列非特異的な免疫刺激性核酸とみなされる場合がある。
一実施形態では、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、メチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、その場合、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されている。特定の実施形態では、核酸は、５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ ３’という配列を含む。代わりの実施形態では、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、その場合、このＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施形態では、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各々のシトシンはメチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、その場合、ＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、メチル化シトシンを含む。
特定の一実施形態では、核酸は、５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ ３’という配列を含む。別の特定の実施形態では、核酸配列は、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ ３’という配列を含み、その場合、太字で示した２つのシトシンはメチル化されている。特定の実施形態では、ＯＤＮは、以下に示すような、ＯＤＮ ＃１、ＯＤＮ ＃２、ＯＤＮ ＃３、ＯＤＮ ＃４、ＯＤＮ ＃５、ＯＤＮ ＃６、ＯＤＮ ＃７、ＯＤＮ ＃８、およびＯＤＮ ＃９からなるＯＤＮの群から選択される。
「Ｚ」はメチル化シトシン残基を表す。ＯＤＮ １４は１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ＯＤＮ １は、ＯＤＮ １を１６ｍｅｒにするチミジンが５’末端に付加された同じオリゴヌクレオチドである。ＯＤＮ １４とＯＤＮ １の間に生物学的活性の差は検出されておらず、両者ともよく似た免疫刺激活性を示す（Ｍｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
本発明の組成物および方法での使用に好適なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のさらなる特定の核酸配列は、Ｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２９８：１１８５−１１９２（２００１）に記載されている。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるＯＤＮは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオアート（「ＰＳ」）骨格、および／またはＣｐＧモチーフ中の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡがない場合でも、それらの比較的短い結合配列を認識することができるので、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を持つ短いオリゴヌクレオチドを、生きた細胞における遺伝子発現を操作するための道具として使用することができる。この戦略では、このような「デコイオリゴヌクレオチド」が細胞内に送達され、その後、標的因子によって認識および結合されることが必要になる。デコイによって転写因子のＤＮＡ結合部位が占められると、転写因子が後に標的遺伝子のプロモーター領域に結合することができなくなる。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を阻害するために、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方調節するために、治療剤として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの利用例は、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出すことができ、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
スーパーｍｉｒ（Ｓｕｐｅｒｍｉｒ）
スーパーｍｉｒは、ｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、かつその標的に対してアンチセンスとなる、ヌクレオチド配列を有する、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくは両方またはそれらの修飾物の一本鎖、二本鎖または部分的二本鎖オリゴマーまたはポリマーを指す。この用語には、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有結合的ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるものであって、同様に機能する少なくとも１つの天然には存在しない部分を含む、オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの望ましい特性のために、このような修飾または置換オリゴヌクレオチドが天然の形態よりも好ましい。好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒはセンス鎖を含まず、別の好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、それほど大きく自己ハイブリダイズしない。本発明で取り上げられるスーパーｍｉｒは二次構造を有することができるが、生理的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖のスーパーｍｉｒは、スーパーｍｉｒの約５０％未満（例えば、約４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満）がそれ自体と二重鎖を形成する程度に一本鎖である。スーパーｍｉｒはヘアピン部分を含むことができ、例えば、好ましくは３’末端の配列が自己ハイブリダイズし、二重鎖領域、例えば、少なくとも１、２、３、または４および好ましくは８、７、６、またはｎヌクレオチド未満（例えば、５ヌクレオチド）の二重鎖領域を形成することができる。二重鎖を形成した領域は、リンカー、例えば、ヌクレオチドリンカー（例えば、３、４、５、または６つのｄＴ、例えば、修飾ｄＴ）によって接続することができる。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、例えば、スーパーｍｉｒの３’末端と５’末端のうちの一方もしくは両方において、またはスーパーｍｉｒの一方の末端と非末端もしくは中央において、例えば、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長のより短いオリゴと二重鎖を形成する。
ｍｉＲＮＡ模倣体
ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣するために使用することができる一群の分子を表す。したがって、「マイクロＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に侵入し、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの源からの精製によって得られない）。ｍｉＲＮＡ模倣体は、成熟分子（例えば、一本鎖）または模倣体前駆体（例えば、プリ−もしくはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、限定するものではないが、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックされた核酸、もしくは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、または上記の任意の組合せ（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸（修飾または修飾核酸）から構成され得る。さらに、ｍｉＲＮＡ模倣体は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、官能性、鎖の用法、および／または効力に影響を及ぼし得るコンジュゲートを含むことができる。ある設計では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、（例えば、約１６〜約３１ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する）二本鎖分子であり、かつ所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との同一性を有する１つ以上の配列を含む。修飾は、分子の一方または両方の鎖上の２’修飾（２’−Ｏメチル修飾および２’Ｆ修飾を含む）ならびに核酸の安定性および／または特異性を高めるヌクレオチド間修飾（例えば、オスホロチオアート修飾）を含むことができる。さらに、ｍｉＲＮＡ模倣体は突出を含むことができる。突出は、どちらかの鎖の３’末端または５’末端のどちらかにある１〜６個のヌクレオチドからなることができ、かつ安定性または官能性を高めるように修飾することができる。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、１６〜３１ヌクレオチドの二重鎖領域と、以下の化学的修飾パターンのうちの１つまたは複数を含む。すなわち、センス鎖は、（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２と、ＣおよびＵの全ての、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、アンチセンス鎖修飾は、ＣおよびＵの全ての２’Ｆ修飾と、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化と、３’突出の２ヌクレオチドと関連する安定化したヌクレオチド間結合とを含むことができる。
アンチｍｉｒ（Ａｎｔｉｍｉｒ）またはｍｉＲＮＡ阻害因子
「アンチｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害因子」、「ｍｉＲ阻害因子」、または「阻害因子」という用語は同義的であり、特定のｍｉＲＮＡの能力に干渉するオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを指す。一般に、阻害因子は、本質的に核酸または修飾核酸であり、これには、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、または上記の任意の組合せを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾には、送達、安定性、特異性、細胞内区画化、または効力に影響を及ぼし得る２’修飾（２’−Ｏアルキル修飾および２’Ｆ修飾を含む）ならびにヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオアート修飾）が含まれる。さらに、ｍｉＲＮＡ阻害因子は、送達、細胞内区画化、安定性、および／または効力に影響を及ぼし得るコンジュゲートを含むことができる。阻害因子は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖）、およびヘアピン設計をはじめとする種々の形状を取ることができ、一般に、マイクロＲＮＡ阻害因子は、標的とされるｍｉＲＮＡの成熟鎖（または複数の鎖）と相補的または部分的に相補的な１つ以上の配列または配列の部分を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害因子は、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列の５’および３’にある追加の配列も含み得る。追加の配列は、成熟ｍｉＲＮＡが由来するプリ−ｍｉＲＮＡ中の成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列の逆相補体であってもよく、または追加の配列は、（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵの混合物を有する）任意の配列であってもよい。いくつかの実施形態では、追加の配列の一方または両方は、ヘアピンを形成することができる任意の配列である。したがって、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列は、５’側と３’側にヘアピン構造が隣接している。マイクロＲＮＡ阻害因子は、二本鎖を形成したときに、反対鎖のヌクレオチドとの間にミスマッチを含み得る。さらに、マイクロＲＮＡ阻害因子を、阻害因子の細胞への取込みを促進するために、コンジュゲート部分に結合させてもよい。例えば、マイクロＲＮＡ阻害因子を、マイクロＲＮＡ阻害因子の細胞への受動的な取込みを可能にするコレステリル５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ヒドロキシペンチルカルバマート）に結合させてもよい。ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害因子をはじめとするマイクロＲＮＡ阻害因子は、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”， ＲＮＡ １３：７２３−７３０（２００７）ならびに国際公開第２００７／０９５３８７号および国際公開第２００８／０３６８２５号に詳細に記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、所望のｍｉＲＮＡのデータベースから配列を選択し、本明細書に開示されている方法に有用な阻害因子を設計することができる。
Ｕ１アダプター
Ｕ１アダプターはポリＡ部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソン中の部位に相補的な標的ドメインとＵ１ ｓｎＲＮＰの核内低分子ＲＮＡ構成要素Ｕ１に結合する「Ｕ１ドメイン」とを有する二官能性オリゴヌクレオチドである（Ｇｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、プレ−ｍＲＮＡエキソン−イントロン境界への結合によってスプライソソーム形成の初期段階を指示するように主に機能するリボヌクレオタンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４９：７７−９５）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡ塩基対の５’末端のヌクレオチド２〜１１は、プレｍＲＮＡの５’ｓｓと結合する。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはＵ１アダプターである。一実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つの他のｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与することができる。
オリゴヌクレオチド修飾
未修飾のオリゴヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドをより安定にすることができる。
オリゴヌクレオチドはサブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く（例えば、塩基、糖、リン酸部分、またはリン酸部分の非架橋酸素の修飾）は、オリゴヌクレオチド内で繰り返される位置で生じる。所与のオリゴヌクレオチド中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、前述の修飾の２つ以上が単一のオリゴヌクレオチド、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。
修飾がオリゴヌクレオチド中の対象位置の全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そして実際のところ、そうではない。例として、修飾は、３’末端位置または５’末端位置でのみで生じてもよく、内部領域でのみ生じてもよく、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたはオリゴヌクレオチドの最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じてもよい。
修飾は、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域でのみ生じてもよいし、または二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖領域でのみ生じてもよい。例えば、非架橋酸素位置でのホスホロチオアート修飾は、一方もしくは両方の末端で生じてもよいし、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でもしくは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じてもよいし、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じてもよい。５’末端をリン酸化することができる。
本明細書に記載の修飾は、唯一の修飾、もしくは多数のヌクレオチド上に含まれる唯一のタイプの修飾であってもよく、または修飾を本明細書に記載の１つ以上の他の修飾と組み合わせることができる。本明細書に記載の修飾をオリゴヌクレオチド上に組み合わせることもでき、例えば、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドは、本明細書に記載の異なる修飾を有する。
いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高めるために、突出に特定のヌクレオ塩基を含めるか、または一本鎖突出（例えば、５’突出もしくは３’突出、もしくはその両方）に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。いくつかの実施形態では、３’突出または５’突出中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載の修飾を用いて、修飾する。修飾としては、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基での修飾（例えば、ホスホロチオアート修飾）を挙げることができる。突出が標的配列と相同である必要はない。
具体的な修飾を以下に詳細に議論する。
リン酸基
リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、２つの非架橋酸素原子に均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の１つを異なる置換基で置換することによって修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、非荷電リンカーかまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、水素ホスホナート、ホスホロアミダート、アルキルホスホナートまたはアリールホスホナートおよびホスホトリエステルが挙げられる。特定の実施形態では、リン酸骨格部分における非架橋リン酸酸素原子の１つは、以下のいずれか：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、またはＯＲ（Ｒは、アルキルもしくはアリールである）に置き換えることができる。未修飾のリン酸基におけるリン原子はアキラルである。しかしながら、非架橋酸素の１つを上記の原子または原子団の１つと置き換えることにより、リン原子はキラルになる。すなわち、このように修飾されたリン酸基におけるリン原子は立体中心となる。ステレオジェニックなリン原子は、「Ｒ」形状（本明細書ではＲｐ）かまたは「Ｓ」形状（本明細書ではＳｐ）かのいずれかを有することができる。
ホスホロジチオアートは、両方の非架橋酸素が硫黄に置換されている。ホスホロジチオアートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。したがって、理論に束縛されることを望まないが、不斉中心を消失させる両方の非架橋酸素に対する修飾（例えば、ホスホロジチオアート形成）は、ジアステレオマー混合物を生じることができないという点で望ましい場合がある。したがって、非架橋酸素は、独立に、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒは、アルキルもしくはアリールである）のいずれか１つであることができる。
リン酸リンカーは、架橋酸素（すなわち、ホスファートをヌクレオシドに結合させる酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオアート）、および炭素（架橋メチレンホスホナート）と置換することによって修飾することもできる。置換は、どちらかの結合酸素または両方の結合酸素で生じることができる。架橋酸素が、ヌクレオシドの３’酸素である場合、炭素と置換することが好ましい。架橋酸素が、ヌクレオシドの５ ’酸素である場合、窒素と置換することが好ましい。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部に置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣体で置換することは、ヌクレアーゼ安定性を増強するはずであると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。
リン酸基を置換することができる部分の例としては、メチルホスホナート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好ましい置換としては、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
ホスファートに結合している酸素の少なくとも１つが置換されているかまたはリン酸基がリン以外の基に置換されている修飾されたホスファート結合は、「非ホスホジエステル骨格結合」とも表される。
リボリン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物に置換されているオリゴヌクレオチド模倣スキャフォールドを構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電した骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）というヌクレオシド代用物が挙げられる。好ましい代用物はＰＮＡ代用物である。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端にあることができる。これらの修飾は、末端リン酸の全体またはリン酸基の原子の１つもしくは複数の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素もしくはエステルをベースにしたもの）にコンジュゲートすることができる。機能的分子実体は、リン酸基および／またはリンカーを介して糖に付着させることができる。リンカーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ基、Ｎ基、Ｓ基もしくはＣ基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。
リンカー／リン酸−機能的分子実体−リンカー／リン酸アレイがｄｓＲＮＡの２つの鎖の間に挿入されている場合、このアレイは、ヘアピン型ＲＮＡ剤におけるヘアピンＲＮＡループの代わりになることができる。
活性を調節するために有用な末端修飾としては、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾が挙げられる。例えば、好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾としては、ＲＩＳＣ媒介性の遺伝子サイレンシングと適合可能なものが挙げられる。好適な修飾としては、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオアート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホロアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホナート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホナート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が挙げられる。
末端修飾は、分布をモニタニングするためにも有用であり得るが、このような場合、付加される好ましい基としては、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８）が挙げられる。末端修飾は、取込みを増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾としてはコレステロールが挙げられる。末端修飾は、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾としてはマイトマイシンＣが挙げられる。
ヌクレオ塩基
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルはＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然のヌクレオ塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、もしくはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基、例えば、本明細書に記載の「異常塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」および「汎用塩基」のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、限定するものではないが、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンまたはピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９ページ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，編．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているものが挙げられる。
カチオン性基
オリゴヌクレオチドに対する修飾としては、糖、塩基、および／またはホスファートもしくは修飾リン酸骨格部分のリン原子への１つ以上のカチオン性基の付着を挙げることもできる。カチオン性基を天然の、異常なまたは普遍的な塩基上の置換可能な任意の原子に付着させることができる。好まし位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない位置、すなわち、塩基対形成に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。カチオン性基を、例えば、糖のＣ２’位または環式もしくは非環式糖代用物における類似の位置を介して付着させることができる。カチオン性基としては、例えば、プロトン化アミノ基、例えば、Ｏ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン（例えば、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、もしくはアミノ酸）；またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ）に由来するものを挙げることができる。
オリゴヌクレオチド内部での配置
いくつかの修飾が、特定の場所で、例えば、鎖の内部位置で、またはオリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端で、オリゴヌクレオチド上に含まれ得ることが好ましい。オリゴヌクレオチド上の修飾の好ましい場所は薬剤に好ましい特性を付与し得る。例えば、特定の修飾の好ましい場所は、最適な遺伝子サイレンシング特性、またはエンドヌクレアーゼ活性もしくはエキソヌクレアーゼ活性に対する増加した耐性を付与し得る。
オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは２’−５’結合を有し得る。オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、反転した結合、例えば、３’−３’結合、５’−５’結合、２’−２’結合または２’−３’結合を有し得る。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）を含み得る。これらの修飾を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ活性に対して特に安定化される。
一般的な参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いて合成されてもよく、例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（特に、第１章のＭｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２章のＯｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３章の２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第４章のＰｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第５章のＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、第６章のＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓおよび第７章のＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはそれらの中で参照されている参考文献に記載されている。国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／７５１６４号、または国際公開第０２／４４３２１号に記載の修飾を本明細書で使用することができる。本明細書に列挙されている全ての刊行物、特許、および公開されている特許出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
リン酸基に関する参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号に記載されている。アルキルホスホン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されている。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されている。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号および米国特許第５，１７７，１９８号に記載されている。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミダートリボオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されている。３’−デオキシ３’−メチレンホスホン酸オリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載されている。
糖基に関する参考文献
２’修飾に対する修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９−１３４およびその中の全ての参考文献に見出すことができる。リボースに対する特異的修飾は、以下の参考文献に見出すことができる：２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１）、２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０−１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１−３１０）。
リン酸基の置換に関する参考文献
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、ならびに例えば、ＭＭＩとＰＯ結合またはＰＳ結合を交互に有する混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、ならびに公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開第９２／２０８２２号および国際公開第９２／２０８２３号として公開されている）に記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載されている。カルボナート置換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１，１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載されている。カルバマート置換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載されている。
リン酸−リボース骨格の置換に関する参考文献
シクロブチル糖代用物の化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号に記載されているように調製することができる。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，２３５，０３３号、ならびに他の関連する特許の開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体公知であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３で参照されている様々な手順のいずれかに従って調製することができる。これらはまた、米国特許第５，５３９，０８３号に従って調製してもよい。
末端修飾に関する参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）およびその中の参考文献に記載されている。
ヌクレオ塩基に関する参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号に記載されているように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号に記載されているように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号に記載されているように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号に記載されているように調製することができる。
リンカー
「リンカー」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーとしては、典型的には、直接的な結合、または原子（例えば、酸素もしくは窒素）、単位（例えば、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ）または原子鎖（例えば、置換アルキルもしくは未置換アルキル、置換アルケニルもしくは未置換アルケニル、置換アルキニルもしくは未置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ここで、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な結合基、置換アリールもしくは未置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは未置換ヘテロアリール、置換複素環もしくは未置換複素環によって中断もしくは終結されることがあり；Ｒ１は、水素、アシル、脂肪族もしくは置換脂肪族である））が挙げられる。
一実施形態では、リンカーは、−［（Ｐ−Ｑ−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ’−Ｑ’−Ｒ’）ｑ’］ｑ”−Ｔ−であり、
式中、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ’、Ｒ’およびＴは、各出現について各々独立に、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−、ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
またはヘテロシクリルであり、
ＱおよびＱ’は、各出現について各々独立に、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１）（Ｒ２）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり、
Ｘは存在しないかまたは切断可能な結合基であり、
ＲａはＨまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ１およびＲ２は、各出現について各々独立に、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨまたはＮ（ＲＮ）２であり、
ＲＮは、各出現について独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルであり、
ｑ、ｑ’およびｑ”は、各出現について各々独立に、０〜２０であり、ここで、繰返し単位は同じものまたは異なるものであることができ、
ｎは、各出現について独立に、０〜２０であり、かつ
ｍは、各出現について独立に、０〜５０である。
一実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合基を含む。
特定の実施形態では、リンカーは分岐状リンカーである。分岐状リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってよいが、四価、五価もしくは六価の原子、またはそのような多数の原子価を示す基であってもよい。特定の実施形態では、分岐点は、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、または−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃである（式中、Ｑは各出現について独立にＨまたは任意で置換されたアルキルである）。他の実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。
切断可能な結合基
切断可能な結合基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に入ると切断され、リンカーが結び付けている２つの部分を放出する基のことである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象の血液中、または第２の参照条件（例えば、血液中もしくは血清中に見られる条件を模倣するかもしくはそのような条件に相当するように選択することができる）下よりも少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍以上速く、標的細胞内または第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣かもしくはそのような条件に相当するように選択することができる）下で分解される。
切断可能な結合基は、切断作用因子（例えば、ｐＨ、レドックス電位または分解分子の存在）の影響を受けやすい。通常、切断作用因子は、血清中または血液中よりも細胞内により広まっているかまたはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解作用因子の例としては、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性がないレドックス剤、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤（例えば、細胞内に存在する、レドックス切断可能な結合基を還元によって分解することができるメルカプタン）；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる薬剤（例えば、５以下のｐＨを生じさせる薬剤）；一般酸として作用することによって、酸性の切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的である可能性がある）、およびホスファターゼが挙げられる。
切断可能な結合基（例えば、ジスルフィド結合）は、ｐＨによる影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均の細胞内ｐＨは、わずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームのｐＨは、より酸性で、５．５〜６．０の範囲であり、リソソームのｐＨは、さらにより酸性で、５．０前後である。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それにより、カチオン性脂質をリガンドから細胞内に、または所望の細胞区画中に放出する切断可能な結合基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって切断される切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的とされる細胞によって決まる可能性がある。例えば、肝臓ターゲッティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合させることができる。肝臓細胞はエステラーゼが豊富であり、それゆえに、リンカーはエステラーゼが豊富でない細胞型でよりも効率的に肝臓細胞で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、ペプチダーゼが豊富な細胞型（例えば、肝臓細胞および滑膜細胞）を標的とする場合に使用することができる。
一般に、候補となる切断可能な結合基の好適性は、候補となる結合基を切断する分解作用因子（または条件）の能力を試験することによって評価することができる。候補となる切断可能な結合基を、血液中でのまたは他の標的以外の組織と接触させた場合の切断に抵抗する能力について同様に試験することも望ましいしたがって、第１の条件と第２の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、その場合、第１の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第２の条件は他の組織または生体液（例えば、血液もしくは血清）中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官もしくは組織培養で、または動物全体で行なうことができる。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行ない、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用である場合がある。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較したとき、少なくとも２倍、４倍、１０倍、または１００倍速く細胞内で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）切断される。
レドックス切断可能な結合基
切断可能な結合基の１つの部類は、還元または酸化によって切断されるレドックス切断可能な結合基である。還元切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。候補となる切断可能な結合基が、好適で「還元切断可能な結合基」であるかどうか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲッティング剤とともに使用するのに好適であるかどうかを明らかにするために、本明細書に記載の方法に目を向けることができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または細胞（例えば、標的細胞）で観察される切断の速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を用いる他の還元剤とともにインキュベートすることによって評価することができる。候補は、血液条件または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で多くても１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較したとき、少なくとも２倍、４倍、１０倍または１００倍速く、細胞内で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）分解される。候補化合物の切断の速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で、標準的な酵素動力学アッセイを用いて測定し、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。
リン酸ベースの切断可能な結合基
リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
酸切断可能な結合基
酸切断可能な結合基とは、酸性条件下で切断される結合基のことである。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、もしくはそれ未満）の酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素などの薬剤によって切断される。細胞において、特定の低ｐＨのオルガネラ（例えば、エンドソームおよびリソソーム）は、酸切断可能な結合基に対する切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、または三級アルキル基（例えば、ジメチル、ペンチルもしくはｔ−ブチル）である場合である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
エステルベースの結合基
エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、アルキレン基、アルケニルレン基およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
ペプチドベースの結合基
ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基とは、アミノ酸とアミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じさせるペプチド結合のことである。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成させることができる。ペプチド結合は、アミノ酸とアミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、通常、アミノ酸とアミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−（式中、ＲＡとＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である）を有する。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。
リガンド
多種多様な実体を本発明のオリゴヌクレオチドおよび脂質に結合させることができる。好ましい部分は、介在テザーを介して直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、好ましくは共有結合によって結合されるリガンドである。
好ましい実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる分子の分布、ターゲッティングまたは寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドがない種と比較したときに、選択された標的（例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画（例えば、細胞区画もしくは器官区画）、組織、器官、または身体領域）に対する親和性を増強する。選択された標的に対する親和性を増強するリガンドは、ターゲッティングリガンドとも呼ばれる。本発明の脂質にコンジュゲートするための好ましいリガンドはターゲッティングリガンドである。
いくつかのリガンドは、エンドソーム溶解特性を有することができる。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存的な膜活性および融合性を示すポリアニオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームｐＨでその活性型立体構造をとる。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。特定の実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、線状であってもまたは分岐状であってもよい。ペプチドベースのエンドソーム溶解リガンドの例示的な一次配列を表５に示す。
ｎ、ノルロイシン
参考文献
１．Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２．
２．Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６．
３．Ｔｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｏｌａｔｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５９，５６−６８．
４．Ｐｌａｎｋ，Ｃ．Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ，Ｂ．Ｍｅｃｈｔｌｅｒ，Ｋ．Ｋｏｃｈ，Ｃ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．（１９９４）．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９ １２９１８−１２９２４．
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好ましいリガンドは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性特性を改善することができ、かつ結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載のモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善することもあり得る。
リガンドとしては、一般に、例えば、取込みを増強するための、治療的修飾物質；例えば、分布をモニタリングするための、診断的化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を挙げることができる。一般例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物が挙げられる。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メトアクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、ターゲッティング基、例えば、細胞ターゲッティング剤または組織ターゲッティング剤（例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質（例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体））を挙げることもできる。ターゲッティング基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホナート、ポリグルタマート、ポリアスパルタート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォラート、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＳＧペプチド、ＲＳＧペプチド模倣体、またはアプタマーであることができる。表６に、ターゲッティングリガンドとその関連受容体のいくつかの例を示す。
リガンドの他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスファート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、またはペプチド（例えば、共リガンドに対する特異的な親和性を有する分子）、または抗体（例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体）であることができる。リガンドには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。リガンドには、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーなどの非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であることができる。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば、細胞の微小管、微小フィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって）、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取込みを増大させる物質（例えば、薬物）であることができる。薬物は、例えば、タクソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであることができる。
リガンドは、例えば、炎症応答を活性化することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取込みを増大させることができる。このような効果を有する例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが標的組織（例えば、身体の腎臓以外の標的組織）に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であることができる。ＨＳＡに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜へのターゲッティングまたは輸送を増大させることができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節するために、例えば、制御することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓にターゲッティングされる可能性が低く、それゆえ、身体から排出される可能性が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓にターゲッティングすることができる。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。コンジュゲートが好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で、脂質ベースのリガンドがＨＳＡに結合することが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合を取り消すことができないほど強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布するように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分を、脂質ベースのリガンドの代わりにまたは脂質ベースのリガンドに加えて、使用することもできる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞（例えば、増殖細胞）によって取り込まれる部分（例えば、ビタミン）である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型（例えば、癌細胞）の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ（例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール）または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。薬剤は両親媒性であることが好ましい。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、これには、ペプチジル模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用が含まれる。ヘリックス剤は、好ましくは親油性相と疎油性相とを有するアルファヘリックス剤であることが好ましい。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であることができる。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の明確な３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約５〜５０アミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸であることができる（例えば、表７参照）。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐもしくはＰｈｅからなる）疎水性ペプチドであることができる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであることができる。別の代替において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）もターゲッティング部分であることができる。ペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）由来の配列は、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、ペプチドまたはペプチド模倣体は、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされることができる（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。組み込まれたモノマー単位を介してｓｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの細胞ターゲッティングペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造的修飾を有することができる。下記の構造的修飾のいずれかを利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分を用いて、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とすることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓をはじめとする、種々の他の組織の腫瘍へのｓｉＲＮＡ剤のターゲッティングを促進することができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。ＲＧＤペプチドは、ｓｉＲＮＡ剤の腎臓へのターゲッティングを促進することが好ましい。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であることができ、かつ修飾する（例えば、特定の組織へのターゲッティングを促進するためにグリコシル化またはメチル化する）ことができる。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
増殖細胞に濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、αｖβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。通常、このようなリガンドを用いて、増殖細胞および血管新生を制御することができる。この種のリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載の癌遺伝子を標的とするリガンドである。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞（例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞）、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、またはわずか１種もしくは２種の主なアミノ酸を含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であることができる。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとに由来する２つの部分からなる両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧ）であることができる（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤および／または担体オリゴマーに連結されたターゲッティングペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであることができる。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）のペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘリックス安定性の完全性を維持するために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、ヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を最大数利用し、ヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、または環状モノマー単位）を最小数利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基であり、および／またはＣ末端アミド化を用いて、ヘリックスを安定化するための余分なＨ結合を提供することができる）。ｉ±３位、またはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定化をもたらすことができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基のグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成することができる。
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドもしくは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバマート結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド（すなわち、ペプチド）結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
ターゲッティングリガンドは、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであることができる。例としては、フォラート、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖のクラスター（例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター）、またはアプタマーがある。クラスターは２つ以上の糖単位の組合せである。ターゲッティングリガンドとしては、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンドおよびＨＤＬリガンドも挙げられる。リガンドは、核酸をベースにしたもの、例えば、アプタマーであることもできる。アプタマーは、未修飾であることができ、または本明細書で開示される修飾の任意の組合せを有することができる。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリイミダゾールもしくはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシラート、ポリカチオン、マスキングされたオリゴカチオンもしくはマスキングされたポリカチオンまたはマスキングされたオリゴアニオンもしくはマスキングされたポリアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスキングされているかもしくはマスキングされていないカチオン性電荷もしくはアニオン性電荷を有するポリマー、マスキングされているかもしくはマスキングされていないカチオン性電荷もしくはアニオン性電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫ調節物質とは、薬物動態調節物質を意味する。ＰＫ調節物質としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節物質としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのホスホロチオアート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、このため、骨格に多数のホスホロチオアート結合を含む短いオリゴヌクレオチド（例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチド）も、リガンド（例えば、ＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。
さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適している。
本発明に適している他のリガンドは、同時係属出願の米国特許出願：第１０／９１６，１８５号（２００４年８月１０日出願）；米国特許出願：第１０／９４６，８７３号（２００４年９月２１日出願）；米国特許出願：第１０／８３３，９３４号（２００７年８月３日出願）；米国特許出願：第１１／１１５，９８９号（２００５年４月２７日出願）および米国特許出願：第１１／９４４，２２７号（２００７年１１月２１日出願）に記載されており、これらは、全ての目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全てが同じ特性を有することも、全てが異なる特性を有することも、またはあるリガンドが同じ特性を有すると同時に、他のリガンドが異なる特性を有することもある。例えば、リガンドは、ターゲッティング特性を有することも、エンドソーム溶解活性を有することも、またはＰＫ調節特性を有することもある。好ましい実施形態では、リガンドが全て、異なる特性を有する。
リガンドを、様々な場所で、例えば、３’末端、５’末端、および／または内部位置でオリゴヌクレオチドに結合させることができる。好ましい実施形態では、リガンドを介在テザーを介してオリゴヌクレオチドに付着させる。リガンドまたはテザーリガンドは、モノマーが成長鎖に組み込まれるときにモノマー上に存在し得る。いくつかの実施形態では、「前駆体」モノマーが成長鎖に組み込まれた後に、リガンドを「前駆体」モノマーへの結合を介して組み込み得る。例として、例えば、アミノ末端テザーを有する（すなわち、会合リガンドを有さない）モノマー（例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２）を成長するセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込み得る。その後の操作において、すなわち、前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後に、求電子基を有するリガンド（例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を、リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求核基と結合させることによって、後で前駆体モノマーに付着させることができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドを一方または両方の鎖に付着させることができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含む。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含む。
いくつかの実施形態では、リガンドを核酸分子のヌクレオ塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリンヌクレオ塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む、任意の位置で生じ得る。いくつかの実施形態では、プリンヌクレオ塩基の２位、６位、７位、または８位をコンジュゲート部分に付着させる。ピリミジンヌクレオ塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションも任意の位置で生じ得る。いくつかの実施形態では、ピリミジンヌクレオ塩基の２位、５位、および６位をコンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは任意の炭素原子で生じ得る。コンジュゲート部分に付着させることができる糖部分の炭素原子の例としては、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。例えば、無塩基残基中の、１’位をコンジュゲート部分に付着させることもできる。ヌクレオシド間結合もコンジュゲート部分を担持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミダートなど）の場合、コンジュゲート部分をリン原子に直接、またはリン原子に結合したＯ原子、Ｎ原子、もしくはＳ原子に付着させることができる。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分をアミンもしくはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に付着させることができる。
オリゴマー化合物のコンジュゲートを調製するための方法は数多くある。通常、オリゴマー化合物上の反応基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）をコンジュゲート部分上の反応基と接触させることによって、オリゴマー化合物をコンジュゲート部分に付着させる。いくつかの実施形態では、一方の反応基は求電子性であり、もう一方の反応基は求核性である。
例えば、求電子基はカルボニル含有官能基であることができ、求核基はアミンまたはチオールであることができる。結合基を含むおよび含まない核酸および関連オリゴマー化合物のコンジュゲーションの方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，第１７章などの文献に十分に記載されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定するものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，１４９，７８２号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，６８８，９４１号；同第５，７１４，１６６号；同第６，１５３，７３７号；同第６，１７２，２０８号；同第６，３００，３１９号；同第６，３３５，４３４号；同第６，３３５，４３７号；同第６，３９５，４３７号；同第６，４４４，８０６号；同第６，４８６，３０８号；同第６，５２５，０３１号；同第６，５２８，６３１号；同第６，５５９，２７９号が挙げられ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および付随する特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味が、以下に提供される。本明細書の他の部分におけるある用語の用法と本節で示されるその定義との間に明白な矛盾がある場合には、本節の定義が優先されるものとする。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、通常、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分を指すこともできるということが理解されるであろう。当業者にはよく知られていることであるが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させないで、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分に置換することが可能である。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドに置換し得る。このような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。
本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」とは、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、当技術分野で、ＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固因子ＶＩＩ前駆体、凝固因子ＶＩＩ、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進因子、ＦＶＩＩ凝固タンパク質、およびエプタコグαとしても知られている。
本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。
本明細書で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって説明される、ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、および別途示されない限り、ヌクレオチド対との関連で使用される場合の「相補的」という用語は、古典的なワトソン−クリック対、すなわち、ＧＣ、ＡＴ、またはＡＵを意味する。この用語は、ヌクレオチドの一方または両方が、例えば、リボース修飾またはリン酸骨格修飾によって、本明細書に記載されるように修飾されている古典的なワトソン−クリック対形成にまでも及ぶ。この用語は、イノシンまたは塩基対形成特性を実質的に変化させない他の実体との対形成を含むこともできる。
本明細書で使用される場合、および別途示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するのに使用される場合の「相補的」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、特定の条件下で二重鎖構造を形成する能力を指す。相補性は、生理的条件下での、すなわち、生物内で直面し得るような生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする完全な相補性、実質的な相補性、および十分な相補性を含むことができる。完全な相補性とは、個々の対について上で定義されるような、第１の配列と第２の配列の対の全てにおける相補性を指す。ある配列が、本明細書中の第２の配列に対して「実質的に相補的」である場合、この２つの配列は、完全に相補的であることができるか、またはこれらの配列は、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の、しかし通常は、多くて４つ、３つ、もしくは２つのミスマッチの塩基対を形成しながらも、その最終的な適用に最も関連がある条件下でハイブリダイズする能力を保持し得る。実質的な相補性は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとして定義することもでき、この場合、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件の組を決定することができるであろう。
しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するように設計される場合、このような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、一方の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、もう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的のために、やはり「完全に相補的」と呼ばれ得る。
本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドや修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、またはこれらの塩基対から完全に形成されてもよい。
生理的条件下での、例えば、生物内で直面し得るような生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする「相補的」、「完全に相補的」、「実質的に相補的」、および十分な相補性という用語は、これらを使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基ミスマッチに関して本明細書で使用され得る。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に相補的な、例えば、実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、目的の（例えば、第ＶＩＩ因子をコードする）ｍＲＮＡの連続した部分に相補的な、例えば、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、かつ上で定義されたような、実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、またはリボ核酸分子の複合体を指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２つの鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きい分子の部分であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間の中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、この接続構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは、「小さい阻害性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する不対ヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡのことである。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、「相補領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、かつ存在する場合は、通常、末端領域に、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
「同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって決定される、このような配列間の関係性のことである。同一性はまた、一連のポリヌクレオチド配列間の一致によって決定される、このような配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。本明細書で使用される「実質的に同一」とは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応する部分との間に非常に高い相同性（好ましくは１００％の配列同一性）があることを意味する。しかしながら、９０％超、または９５％の配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明で使用してもよく、したがって、遺伝子突然変異、系統多形、または進化的分岐のために見込まれ得る配列のバリエーションも許容することができる。１００％同一性が好ましいが、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡと標的遺伝子の間に単一または多数の塩基対のランダムなミスマッチを含有してもよい。
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、人の手を借りない拡散プロセスまたは能動的な細胞プロセスを通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によってなされ得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されるものではない。ｄｓＲＮＡは、生きた生物の一部である「細胞に導入される」場合もある。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含むことになる。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入することができるし、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
「サイレンシングする」および「発現を阻害する」という用語は、これらの用語が第ＶＩＩ因子遺伝子を指すものである限り、本明細書では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を指し、この抑制は、第ＶＩＩ因子遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群であって、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現が阻害されるように処理された細胞または細胞群から単離し得る、第ＶＩＩ因子遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、第１の細胞または細胞群のように処理されていない細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、低下していることによって明らかにされるようなものである。阻害の程度は、通常
で表される。
あるいは、阻害の程度は、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写に関数関係があるパラメータ（例えば、細胞によって分泌される、第ＶＩＩ因子遺伝子にコードされたタンパク質の量、または特定の表現型（例えば、アポトーシス）を示す細胞の数）の減少という観点から与えられる場合もある。原則として、第ＶＩＩ因子遺伝子のサイレンシングは、構成的にかまたはゲノム工学によるかのいずれかで、標的を発現している任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって測定し得る。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡが第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を一定の度合いで阻害するかどうか、したがって、このｓｉＲＮＡが本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、以下の実施例に提供されるアッセイが、このような参照としての役割を果たすものとする。
例えば、ある例では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％、４０％、または５０％抑制される。一実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。より好ましい実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
「治療する」、「治療」などの用語は、疾患または障害の緩和または軽減を指す。本発明との関連において、以下に本明細書で記載される他の状態（例えば、血栓疾患以外の第ＶＩＩ因子が仲介する状態）のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」などの用語は、このような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはこのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。
「治療的に有意義な」組成物は、適切な用量で投与されたときに、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を緩和または軽減することができる。
本明細書で使用される場合、「第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患」という用語ならびに関連用語および関連語句は、不適切な（例えば、正常よりも大きい）第ＶＩＩ因子の活性を特徴とする状態または障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性は、通常は第ＶＩＩ因子を発現しない細胞での第ＶＩＩ因子の発現、または（例えば、ウイルス性出血熱の症状、もしくは血栓を引き起こす）第ＶＩＩ因子発現の増大の結果として生じ得る。第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性によって完全にまたは部分的に仲介され得る。しかしながら、第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、第ＶＩＩ因子の調節によって、根本的な状態または障害にいくらかの影響を及ぼせるものである（例えば、第ＶＩＩ因子の阻害剤によって、少なくとも一部の患者では健康がいくらか改善される）。
「出血熱」には、ウイルス感染によって引き起こされる病気の組合せが含まれる。典型的には、発熱と消化管症状に続いて、毛細血管の出血が起こる。
「凝固障害」とは、対象の血液凝固機構の任意の欠陥のことである。
本明細書で使用される場合、「血栓障害」とは、好ましくは望ましくないＦＶＩＩ発現に起因する任意の障害のことであり、望ましくない血液凝固を特徴とする任意の障害を含む。
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」および「予防的有効量」という語句は、ウイルス性出血熱、またはこのような障害の明らかな症状（例えば、出血、発熱、衰弱、筋肉痛、頭痛、炎症、もしくは循環性ショック）の治療、予防、もしくは管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、当技術分野で公知の要因、例えば、血栓障害のタイプ、患者の病歴および年齢、疾患の段階、ならびに他の薬剤の投与などによって変わり得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」には、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体とが含まれる。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」とは、意図される薬理学的結果、治療的結果、または予防的結果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下したときに、所与の臨床治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するための薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下をもたらすのに必要な量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤を投与するための担体を指す。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、細胞培養培地を特に除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤、および防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得、一方、潤滑剤は、存在する場合には、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。所望の場合には、消化管内での吸収を遅らせるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングし得る。
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞のことである。
核酸−脂質粒子の特徴
特定の実施形態では、本発明は、脂質に封入された核酸粒子を生成するための方法および組成物に関し、この粒子中で、核酸は脂質層内に封入される。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込んでいるこのような核酸−脂質粒子は：（１）薬物対脂質比；（２）封入効率；および（３）粒径をはじめとする種々の生物物理学的パラメータを用いて特徴付けられる。高い薬物対脂質比、高い封入効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに調節可能な粒径（通常、直径２００ｎｍ未満）が望ましい。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与するための核酸の修飾が、治療薬のコストに加えられるが、多くの場合、限られた耐性しか提供しないので、核酸ポリマーの性質が重要である。特に記述されない限り、これらの基準は、本明細書中で以下の通りに計算される。
核酸対脂質比は、規定容量の調製物中の核酸の量を、同じ容量中の脂質の量で割ったものである。これは、モル当たりのモル基準または重量当たりの重量基準またはモル当たりの重量基準に基づくものであり得る。最終的な投与の準備のできた製剤の場合、透析、クロマトグラフィーおよび／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化を用いて、可能な限り多くの外部核酸を除去した後に、核酸：脂質比を計算する。
封入効率とは、出発混合物の薬物対脂質比を、最終的な投与に適格な製剤の薬物対脂質比で割ったものを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度については、最終的に投与に適格な製剤になる出発混合物に添加された核酸の総量を計算することもできる。製剤化プロセスの間に失われる脂質の量も計算し得る。効率は、組成物の損失量と費用の尺度である
サイズは、形成される粒子のサイズ（直径）を示す。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ Ｍｏｄｅｌ３７０サブマイクロメートル粒子寸法測定器において準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて測定され得る。２００ｎｍ未満の粒子が、新生物や炎症部位などの新生血管形成された（漏出性）組織への分布のために好ましい。
脂質粒子の調製方法
本発明の方法および組成物は、特定のカチオン性脂質を利用し、その脂質の合成、調製および特徴づけは、以下および添付の実施例において説明される。さらに、本発明は、治療剤（例えば、核酸）と会合した脂質粒子をはじめとする脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書で記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子内に封入された核酸を含む中間体混合物を生成し、その場合、この封入された核酸は、約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５〜１５重量％という核酸／脂質比で存在する。この中間体混合物は、脂質に封入された核酸粒子を得るために、場合によって大きさが揃えられてもよく、その場合、この脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層小胞である。次に、ｐＨを上げて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それにより、少なくとも部分的に表面が中和された、脂質に封入された核酸組成物が提供される。
上記のように、これらのカチオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫａ未満のｐＨにおいて帯電しており、ｐＫａより高いｐＨにおいて実質的に中性である、アミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２工程プロセスを用いて本発明の製剤において使用することができる。第１に、核酸の存在下において、滴定可能なカチオン性脂質と他の小胞成分を用いて、低ｐＨにおいて脂質小胞を形成することができる。この方法で、小胞が核酸を封入し、捕捉する。第２に、媒体のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａより高いレベルに、すなわち、生理学的ｐＨまたはそれよりも高く上昇させることによって、新しく形成された小胞の表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有利な態様は、表面に吸着された任意の核酸の容易な除去と、中性の表面を有する結果として生じる核酸送達ビヒクルの両方を含む。中性の表面を有するリポソームまたは脂質粒子は、循環からの速やかなクリアランスを回避し、かつカチオン性リポソーム調製物と関連する特定の毒性を回避すると予想される。核酸−脂質粒子の組成物におけるこのような滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号に提供されている。
この方法で形成された小胞は、高含有量の核酸を含む均一な小胞サイズの製剤を提供することにさらに留意する。さらに、これらの小胞は、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍのサイズ範囲を有する。
任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、核酸封入の非常に高い効率は、低ｐＨにおける静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）において、小胞表面は帯電しており、静電相互作用を介して核酸の一部に結合する。外部の酸性緩衝液が、より中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）に交換されると、脂質粒子またはリポソームの表面は中和され、任意の外部の核酸を除去することが可能になる。製剤化プロセスに関するより詳細な情報は、様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）に提供されている。
上記のことを考慮して、本発明は、脂質／核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書で記載される方法において、脂質の混合物は、核酸の緩衝水溶液と組み合わされて、脂質粒子内に封入された核酸を含む中間体混合物を生成し、例えば、その場合、この封入された核酸は、約１０重量％〜約２０重量％という核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は、脂質に封入された核酸粒子を得るために、場合によって、大きさを揃えてもよく、その場合、この脂質部分は、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層小胞である。次に、ｐＨを上げて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それにより、少なくとも部分的に表面が中和された脂質で封入された核酸組成物を提供する。
特定の実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質成分、すなわち、脂質が、ｐＫａよりも低いｐＨにおいてカチオン性であり、ｐＫａより高いｐＨにおいて中性であるようなｐＫａを有する脂質から選択される本発明の第１アミノ脂質成分と、脂質−核酸粒子形成中の粒子凝集を防止する脂質の中から選択される第２脂質成分とを含む。特定の実施形態では、アミノ脂質は、本発明の新規のカチオン性脂質である。
本発明の核酸−脂質粒子を調製する際、脂質の混合物は、通常、有機溶媒中の脂質の溶液である。次に、この脂質の混合物を乾燥させて、薄膜を形成させることができるか、または凍結乾燥させて、粉末を形成させ、その後、水性緩衝液で水和して、リポソームを形成させることができる。あるいは、好ましい方法において、脂質混合物をエタノールなどの水混和性アルコール中に可溶化し、このエタノール性溶液を水性緩衝液に添加して、自発的にリポソームを形成させる。ほとんどの実施形態では、アルコールを市販されている形態で使用する。例えば、エタノールを、無水エタノール（１００％）として、または９５％エタノール（残りの部分は水である）として使用することができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号でより詳細に記載されている。
例示的な一実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒中のカチオン性脂質、（カチオン性脂質以外の）中性脂質、ステロール（例えば、コレステロール）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）の混合物である。好ましい実施形態では、脂質混合物は、アルコール、より好ましくはエタノール中のカチオン性脂質、中性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ修飾脂質から本質的になる。さらに好ましい実施形態では、第１の溶液は、カチオン性脂質約２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％というモル比の上記脂質混合物からなる。またさらに好ましい実施形態では、第１の溶液は、より好ましくはカチオン性脂質約２０〜６０％：ＤＳＰＣ ５〜２５％：Ｃｈｏｌ ２５〜５５％：ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ ０．５〜１５％というモル比の表１から選択される脂質、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になる。特定の実施形態では、モル脂質比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧもしくはＰＥＧ−ＤＰＧ）、５７．２／７．１／３４．３／１．４（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、４０／１５／４０／５（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／４．５／０．５（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧもしくはＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）または５２／１３／３０／５（ｍｏｌ％カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。別の群の好ましい実施形態では、これらの組成物中の中性脂質をＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。本発明によって、脂質混合物を、核酸を含み得る緩衝水溶液と組み合わせる。この緩衝水溶液は、通常、緩衝液が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する溶液である。好適な緩衝液の例としては、クエン酸、リン酸、酢酸およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝液はクエン酸緩衝液である。好ましい緩衝液は、封入される核酸の化学成分に応じて１〜１０００ｍＭのアニオンの範囲であり、緩衝液濃度の最適化は、高い充填レベルを達成するために重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照されたい）。あるいは、塩化物、硫酸塩などでｐＨ５〜６に酸性化された純水が有用であり得る。この場合、５％グルコース、または粒子が、エタノールを除去するため、ｐＨを上げるために透析されるか、もしくは通常の食塩水などの薬学的に許容される担体と混合されたときに、粒子膜を超えて浸透ポテンシャルを釣り合わせる別の非イオン性溶質を添加することが好適である場合がある。緩衝液中の核酸の量は、変動し得るが、通常、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
脂質の混合物と治療用核酸の緩衝水溶液とを組み合わせて中間体混合物を得る。中間体混合物は、通常、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに、中間体混合物は、負に帯電した核酸のイオン引力および脂質粒子表面上の正に帯電した脂質（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１脂質成分を構成している他の脂質は、その脂質上のプロトン化可能な基のｐＫａ未満のｐＨを有する緩衝液中で正に帯電している）のために、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に付着したいくらかの核酸も含み得る。一群の好ましい実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、その溶液の各々の容量は、組み合わせたときに、得られるアルコール含有量が約２０容量％〜約４５容量％になるように調整される。混合物を組み合わせる方法は、多くの場合、生成される製剤の規模に応じて、種々のプロセスのいずれかを含むことができる。例えば、総容量が約１０〜２０ｍＬ以下であるとき、溶液を試験管内で組み合わせて、ボルテックスミキサーを用いて一緒に撹拌することができる。大規模プロセスを好適な生産規模のガラス製品中で実施することができる。
場合により、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水溶液とを組み合わせることによって生成される、脂質に封入された治療剤（例えば、核酸）の複合体は、所望のサイズの範囲および比較的狭い分布の脂質粒径を達成するために、大きさを揃えることができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物は、約７０〜約２００ｎｍ、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均直径の大きさに揃えられる。所望のサイズにリポソームの大きさを揃えるために、いくつかの技術が利用可能である。大きさを揃える１つの方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。バスまたはプローブ超音波処理によってリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、サイズが約０．０５マイクロメートル未満の小型の単層小胞（ＳＵＶ）まで段階的にサイズが縮小される。均質化は、大きなリポソームをより小さなリポソームに断片化する剪断エネルギーに依存する別の方法である。通常の均質化手順では、選択されたリポソームサイズ（通常、約０．１〜０．５マイクロメートル）が観察されるまで、多層小胞を標準的なエマルジョンホモジナイザーに通して再循環させる。両方の方法において、粒径分布は、従来のレーザービーム粒径測定によってモニタリングすることができる。本明細書中の特定の方法の場合、均一な小胞サイズを得るために、押出しを用いることができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介するリポソーム組成物の押出しによって、比較的明確に規定されたサイズ分布がもたらされる。通常、所望のリポソーム複合体のサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を膜に通して１回以上循環させる。リポソームを連続的により小孔の膜に通して押し出し、リポソームのサイズを徐々に小さくすることを達成し得る。いくつかの例では、形成される脂質−核酸組成物を、サイズを揃えることなく使用してもよい。
特定の実施形態では、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくとも一部を中和する工程をさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することにより、封入されていない核酸が脂質粒子表面から解放され、従来の技術を用いて組成物から除去され得る。好ましくは、封入されていない核酸や表面に吸着した核酸は、緩衝溶液を交換することにより、得られる組成物から除去される。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物を形成するために使用される）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ ｐＨ約７．５）溶液で置換することにより、リポソーム表面の中和と、表面からの核酸の放出とがもたらされる。次に、放出された核酸を、標準的な方法を用いるクロマトグラフィーによって除去した後、使用される脂質のｐＫａよりも高いｐＨを有する緩衝液に切り換えることができる。
場合により、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を水性緩衝液中での水和によって形成し、核酸を添加する前に、上記の方法のいずれかを用いて大きさを揃えることができる。上記のように、水性緩衝液は、アミノ脂質のｐＫａよりも低いｐＨであるべきである。次に、核酸の溶液を、これらの大きさが揃えられ、予め形成された小胞に添加することができる。このような「予め形成された」小胞内への核酸の封入を可能するために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含むべきである。エタノールの場合、それは、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在するべきである。さらに、脂質小胞の組成および核酸の性質に応じて、水性緩衝液−エタノール混合物中の予め形成された小胞と核酸の混合物を約２５℃〜約５０℃の温度に温める必要があることがある。脂質小胞中の核酸の所望のレベルを達成するための封入プロセスの最適化には、エタノール濃度や温度などの変数の操作が必要であることが当業者に明白であろう。核酸の封入のための好適な条件の例を実施例に提供する。一旦核酸が予め形成された小胞内に封入されたら、外部のｐＨを上げて、少なくとも部分的に表面電荷を中和することができる。次に、封入されていない核酸や表面に吸着した核酸を上記のように除去することができる。
使用方法
本発明の脂質粒子は、インビトロまたはインビボで治療剤を細胞に送達するために使用され得る。特定の実施形態では、治療剤は、本発明の核酸−脂質粒子を用いて細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子および関連する薬学的組成物を使用する様々な方法の以下の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明によって例証されるが、これらの方法および組成物が、そのような治療の恩恵を受ける任意の疾患または障害を治療するための任意の治療剤を送達するために容易に適応され得ることが理解される。
特定の実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞に導入するための好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が生じるのに十分な時間にわたって、本発明の粒子または組成物を細胞と接触させることによって行われ得る。
本発明の組成物をほとんど全ての細胞型、例えば、限定するものではないが、ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６、Ａ３７５、ＭＣＦ７、Ｂ１６Ｆ１０、Ｈｅｐ３ｂ、ＨＵＨ７、ＨｅｐＧ２、Ｓｋｏｖ３、Ｕ８７、およびＰＣ３細胞株をはじめとする腫瘍細胞株に吸着させることができる。核酸−脂質粒子は、一旦吸着すると、細胞の一部によってエンドサイトーシスによって取り込まれるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合することができる。この複合体の核酸部分の移入または取込みは、これらの経路のうちのいずれか１つを介して起こることができる。本発明の範囲に関して限定することを意図するものではないが、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる粒子の場合、この粒子は、次に、エンドソーム膜と相互作用し、おそらく非二重層の相の形成によってエンドソーム膜の不安定化をもたらし、封入された核酸が細胞質に導入されると考えられる。同様に、粒子と細胞の原形質膜との直接的な融合の場合、融合が起こるとき、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの内容物が細胞内の液体と組み合わされる。インビトロで行われるとき、細胞と脂質−核酸組成物との接触は、生物学的に適合性の媒体中で起こる。組成物の濃度は、特定の用途に応じて広く変動し得るが、通常、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。特定の実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の処置は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、好ましくは、約２〜８時間行われる。インビトロでの適用では、核酸の送達は、起源が植物であるか動物であるか、脊椎動物あるか無脊椎動物であるか、およびどの組織またはタイプであるかに関係なく、培養で増殖している任意の細胞に対するものであることができる。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％コンフルエントでプレーティングされた細胞に添加する。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
通常の適用は、周知の手順を用いて、ｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらし、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングすることを含む。あるいは、適用は、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。この方法で、欠損しているかまたは存在しない遺伝子産物を供給することによって、遺伝性疾患に対する治療が提供される（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィーの場合は、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）を参照されたく、嚢胞性線維症の場合は、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３（１９８９）を参照されたい）。本発明の組成物に対する他の用途は、細胞内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含む（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３（１９９２）を参照されたい）。
あるいは、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を用いて、インビボで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を送達するための本発明の適用に関して、参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）には、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達が記載されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｙｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）には、リポソームを用いた、マウスの気道の上皮および肺の中の肺胞への嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達が記載されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）には、細胞内の酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウスの肺のインビボトランスフェクションが記載されている。したがって、本発明の組成物は、感染症の治療で使用することができる。
それゆえ、別の態様では、本発明の製剤を用いて、限定するものではないが、ＦＶＩＩ、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３ファミリーメンバーＤＮ−ｐ６３、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子、ｍＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子、αｖ−インテグリン遺伝子、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要とされる遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス複製に必要とされる遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要とされる遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペス・サイトメガロウイルス複製に必要とされる遺伝子、ヘルペス・エプスタイン・バーウイルス遺伝子、ヘルペス・エプスタイン・バーウイルス複製に必要とされる遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要とされる遺伝子、ＪＣウイルス遺伝子、ＪＣウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要とされる遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要とされる遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要とされる遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルス複製に必要とされる遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要とされる遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、デングウイルス遺伝子、デングウイルス遺伝子複製に必要とされる遺伝子、サルウイルス４０遺伝子、サルウイルス４０複製に必要とされる遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス複製に必要とされる遺伝子、モロニーマウス白血病ウイルス遺伝子、モロニーマウス白血病ウイルス複製に必要とされる遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要とされる遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、麻疹ウイルス複製に必要とされる遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス複製に必要とされる遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要とされる遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要とされる遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要とされる遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要とされる遺伝子、マラリア原虫遺伝子、マラリア原虫遺伝子複製に必要とされる遺伝子、ミコバクテリウム・ウルケランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）遺伝子、ミコバクテリウム・ウルケランス複製に必要とされる遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子、結核菌複製に必要とされる遺伝子、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）遺伝子、ハンセン菌複製に必要とされる遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）遺伝子、黄色ブドウ球菌複製に必要とされる遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌複製に必要とされる遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、化膿連鎖球菌複製に必要とされる遺伝子、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、クラミジア肺炎菌複製に必要とされる遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌複製に必要とされる遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、プロ血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−Ｉ遺伝子、１−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素に対する遺伝子、神経伝達物質受容体に対する遺伝子、神経伝達物質リガンドに対する遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＬＯＨ細胞に見られるアレル遺伝子、または多型遺伝子の１つのアレル遺伝子などの標的遺伝子をサイレンシングまたは調節することができる。
インビボ投与の場合、薬学的組成物は、好ましくは、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される。１つの例として、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号を参照のこと。細胞内核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）にも論じられている。脂質ベースの治療薬を投与するまた他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ，米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号に記載されている。
他の方法では、薬学的調製物は、調製物を組織に直接適用することによって標的組織と接触させ得る。適用は、局所的な「開放系」または「閉鎖系」手順によって行ない得る。「局所的」とは、環境（例えば、皮膚、中咽頭、外耳道など）に露出される組織への薬学的調製物の直接的な適用のことを意味する。「開放系」手順は、患者の皮膚を切開することと、その下にある、薬学的調製物が適用される組織を直接可視化することとを含む手順である。これは、一般に、外科的手順（例えば、肺に到達する開胸術、腹部の内臓に到達する開腹術、または標的組織に対する他の直接的な外科的アプローチ）によって達成される。「閉鎖系」手順は、内部の標的組織を直接可視化しないが、皮膚の小さい創傷から器具を挿入することによって到達する、侵襲的な手順である。例えば、調製物は、洗浄針によって腹膜に投与され得る。同様に、脊髄麻酔または脊髄のメトリザマイドイメージングのために通常行われるような、腰椎穿刺中の注入後に患者を適切な位置にすることによって、薬学的調製物が髄膜または脊髄に投与され得る。あるいは、調製物は、内視鏡デバイスを介して投与され得る。
脂質−核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルとして（Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）を参照のこと）または疾患部位における直接的な注射によって（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））も投与することもできる。
本発明の方法は、種々の宿主において実施し得る。好ましい宿主としては、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物種が挙げられる。
本発明の脂質−治療剤粒子に対する投薬量は、治療剤と脂質の比と、患者の年齢、体重および状態に基づく投与医師の見解とによって決まる。
一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している本発明の脂質粒子と細胞を接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「調節する」という用語、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を変化させることを指す。様々な実施形態では、調節するとは、増加させることもしくは増強することを意味することができるし、または減少させることもしくは低下させることを意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルを測定する方法は、当該技術分野において公知であり、利用可能であり、これらの方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用する方法や免疫組織化学的手法が挙げられる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現のレベルは、適当な対照値と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％超、増加しているか、または低下している。
例えば、ポリペプチドの発現の増加が望ましい場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり得る。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下が望ましい場合、核酸は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、それにより標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を妨げるポリヌクレオチド配列を含む、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡであり得る。あるいは、核酸は、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであり得る。
特定の一実施形態では、本発明は、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、式Ｉのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧもしくはＰＥＧ修飾脂質からなるかもしくはこれらから本質的になる脂質粒子を、例えば、約２０〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、３〜２５％の中性脂質、１５〜５５％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質というモル比で、細胞に提供することを含み、ここで、この脂質粒子は、ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している、方法を提供する。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５、５７．５／７．５／３１．５／３．５、５７．２／７．１／３４．３／１．４、５２／１３／３０／５、５０／１０／３８．５／１．５、５０／１０／３５／５、４０／１０／４０／１０、４０／１５／４０／５、または３５／１５／４０／１０（ｍｏｌ％ 式Ｉのカチオン性脂質／ＤＳＰＣまたはＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に記載のターゲッティング脂質などのターゲッティング部分も含む（例えば、脂質粒子は、式Ｉのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質およびターゲッティング部分からなる）。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質をＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をＰＥＧ−ＤＳＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧと置き換える。
特定の実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、その場合、このｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドの発現を低下させるような、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む。
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片の発現を増加させるような、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。
関連する実施形態では、本発明は、培養されている細胞のトランスフェクションに有用な試薬を提供する。例えば、本明細書に記載の脂質製剤を用いて、核酸を培養細胞（例えば、付着細胞、懸濁細胞など）に送達することができる。
関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、かつこのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補物を含む、方法を提供する。
一実施形態では、薬学的組成物は、式Ｉのカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡからなるかまたはこれらから本質的になる脂質粒子を、例えば、約２０〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、３〜２５％の中性脂質、１５〜５５％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）というモル比で含み、ここで、この脂質粒子は、治療用核酸と会合している。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５、５７．５／７．５／３１．５／３．５、５７．２／７．１／３４．３／１．４、５２／１３／３０／５、５０／１０／３８．５／１．５、５０／１０／３５／５、４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０または４０／１５／４０／５（ｍｏｌ％ 式Ｉのカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に記載のターゲッティング脂質も含む（例えば、脂質粒子は式Ｉのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質およびターゲッティング部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）から本質的になる）。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質がＰＥＧ部分を含み、かつ既存のリポソーム製剤に添加される場合、ＰＥＧ修飾脂質（すなわち、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、およびＰＥＧ含有ターゲッティング脂質）の総量を一定のｍｏｌパーセンテージ（例えば、０．３％、１．５ｍｏｌ％、または３．５ｍｏｌ％）に保つように、ＰＥＧ修飾脂質の量を低下させる。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧと置き換える。別の関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、ポリペプチドまたはその機能的な変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法を含む。
本発明は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明の薬学的組成物を提供することを含み、ここで、この治療剤は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、方法をさらに提供する。特定の実施形態では、免疫応答は、例えば、約２０〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、３〜２５％の中性脂質、１５〜５５％のステロール、および０．５〜１５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質（ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧもしくはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）というモル比の、式Ｉのカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡからなるかまたはこれらから本質的になる液性免疫応答または粘膜免疫応答であり、ここで、この脂質粒子は、治療用核酸と会合している。特定の実施形態では、モル脂質比は、約６０／７．５／３１／１．５、５７．５／７．５／３１．５／３．５、５７．２／７．１／３４．３／１．４、５２／１３／３０／５、５０／１０／３８．５／１．５、５０／１０／３５／５、４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０または４０／１５／４０／５ （ｍｏｌ％ 式Ｉのカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に記載のターゲッティング脂質も含む（例えば、脂質粒子は、式Ｉのカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質およびターゲッティング部分から本質的になる）。いくつかの実施形態では、ターゲッティング脂質がＰＥＧ部分を含み、かつ既存のリポソーム製剤に添加される場合、ＰＥＧ修飾脂質（すなわち、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ）、およびＰＥＧ含有ターゲッティング脂質）の総量を一定のｍｏｌパーセンテージ（例えば、０．３％、１．５ｍｏｌ％、または３．５ｍｏｌ％）に保つように、ＰＥＧ修飾脂質の量を低下させる。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質を、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭと置き換える。別の群の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧと置き換える。さらなる実施形態では、薬学的組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて対象に提供される。したがって、本発明自体が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、かつ免疫応答が望まれる抗原と会合している、本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供する。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であるか、または例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生虫などの感染体と関連している。
種々の腫瘍抗原、感染体抗原、および他の疾患に関連する抗原が、当該技術分野で周知であり、これらの例は、本明細書に引用される参考文献に記載されている。本発明における使用に好適な抗原の例としては、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の特定の例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、痘瘡、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核および風疹の抗原である。一実施形態では、抗原は、Ｂ型肝炎組換え抗原である。別の態様では、抗原はＡ型肝炎組換え抗原である。別の態様では、抗原は腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原およびバーキットリンパ腫に関連する抗原である。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組換え抗原である。当業者は、本発明における使用に好適な他の抗原を知っているであろう。
本発明における使用に好適な腫瘍関連抗原は、単一の腫瘍タイプを示し、いくつかのタイプの腫瘍間で共有され、および／または正常細胞と比較して腫瘍細胞においてもっぱら発現されるかもしくは過剰発現される可能性がある、突然変異した分子と突然変異していない分子の両方を含む。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質およびムチンの発現の腫瘍特異的パターンも報告されている。本癌ワクチンにおいて使用するための例示的な腫瘍関連抗原としては、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および腫瘍細胞に特有の突然変異または再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚性遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的な（しかし、腫瘍特異的でない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、ならびにいくつかの他の自己タンパク質が挙げられる。
腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、例えば、突然変異した抗原（例えば、Ｒａｓ ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８およびβカテニン）；過剰発現される抗原（例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡ）、癌胎児性抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））；自己抗原（例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原（例えば、Ｍａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２））；前立腺関連抗原（例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１およびＰＳＭ−Ｐ２）；再活性化された胚性遺伝子産物（例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥおよび他の癌精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１））；ムチン（例えば、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２）；ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２およびＧＤ３）、中性糖脂質および糖タンパク質（例えば、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびグロボ−Ｈ）；ならびに糖タンパク質（例えば、Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）およびｓＴｎ）が挙げられる。全細胞および腫瘍細胞ライセートならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用されるＢリンパ球のモノクローナル増殖時に発現される免疫グロブリンイディオタイプもまた、本明細書における腫瘍関連抗原として含められる。
病原体としては、感染体、例えば、哺乳動物（より特には、ヒト）に感染するウイルスが挙げられるが、これに限定されない。感染性ウイルスの例としては：レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）またはＨＩＶ−ＩＩＩ）；および他の分離株（例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクスウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス、ブニアウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝染性；クラス２＝非経口伝染性（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
また、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、脊椎動物において抗原として働く。このようなグラム陽性細菌としては、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が挙げられるが、これらに限定されない。感染性の細菌の特定の例としては：ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ）（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アウィウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属の種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、腸球菌属の種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属の種（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属の種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、フゾバクテリウム・ヌクレアートゥム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）およびアクチノミセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）が挙げられるがこれらに限定されない。
病原体のさらなる例としては、哺乳動物（より特には、ヒト）に感染する感染性真菌が挙げられるが、これに限定されない。感染性真菌の例としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラートゥム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コッキディオイデス・イムミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミケス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミディア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例としては、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば、プラスモディウム・ファルキパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・オウァレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）およびプラスモディウム・ウィウァクス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）が挙げられる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）としては、トキソプラスマ・ゴンディイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられる。
薬学的組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の肝臓スクリーニングモデルで同定された核酸剤を含む薬学的組成物を提供する。組成物は、作用剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）と薬学的に許容される担体とを含む。薬学的組成物は、遺伝子の発現または活性と関連する疾患または障害を治療するのに有用である。このような薬学的組成物は、送達の様式に基づいて製剤化される。１つの例は、非経口送達を介する全身投与用に製剤化される組成物である。
同定された薬剤を含む薬学的組成物を、標的遺伝子（例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子）の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与する。通常、ｄｓＲＮＡ剤の好適な用量は、１日にレシピエントの体重１キログラム当たり０．０１〜５．０ミリグラムの範囲、通常、１日に体重１キログラム当たり１マイクログラム〜１ｍｇの範囲である。薬学的組成物を１日１回投与してもよく、またはｄｓＲＮＡを１日を通して適切な間隔で２回、３回、もしくはよりより多くのサブ用量として、または徐放製剤による連続的な注入もしくは送達すら用いて投与してもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総１日投薬量に到達するために相応により少量でなければならない。投薬単位は、例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続的放出をもたらす従来の持続放出製剤を用いて、数日間かけて送達されるように調合することもできる。持続放出製剤は当該技術分野で周知であり、かつ本発明の薬剤とともに使用し得るような薬剤の膣送達に特に有用である。この実施形態では、投薬単位は、対応する複数の１日用量を含む。
当業者であれば、限定するものではないが、対象の疾患もしくは障害の重症度、過去の治療、全般的な健康および／または年齢、ならびに他の存在する疾患をはじめとする、特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投薬量およびタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の組成物による対象の治療は、１回の治療または一連の治療を含むことができる。本発明によって企図される個々のｄｓＲＮＡについての有効投薬量やインビボ半減期を、従来の方法を用いて、または本明細書の別の場所に記載されているような、適当な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて、推定することができる。
特定の実施形態では、本発明の脂質−核酸粒子を含む薬学的組成物は標準的な技術に従って調製され、かつこれは薬学的に許容される担体をさらに含む。通常、食塩水が薬学的に許容される担体として利用される。他の好適な担体としては、例えば、安定性を増強するために糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含む、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。食塩水または他の塩含有担体を含む組成物では、担体が、以下の脂質粒子製剤に添加されることが好ましい。したがって、脂質−核酸組成物を生成した後、これらの組成物を薬学的に許容される担体（例えば、食塩水）中に希釈することができる。
得られた薬学的調製物を従来的な周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。その後、水性溶液を、無菌条件下で、使用のために包装するかまたは濾過し、凍結乾燥させ、凍結乾燥させた調製物を、投与の前に滅菌水性溶液と組み合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤およびｐＨ緩衝剤、張性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含んでもよい。さらに、脂質懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化による傷害に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。親油性のフリーラジカルクエンチャー（例えば、α−トコフェロール）および水溶性の鉄特異的キレート剤（例えば、フェリオキサミン）が好適である。
薬学的製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、様々に（すなわち、約０．０１重量％未満、通常は、約０．０５〜５重量％または少なくとも約０．０５〜５重量％から１０〜３０重量％までにも）異なる可能性があり、主に、選択される特定の投与様式に従う液量、粘性などによって選択される。例えば、治療に伴う流体負荷を下げるために、この濃度を増加させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症に関連する鬱血性心不全または重症高血圧を有する患者で特に望ましい可能性がある。あるいは、投与部位での炎症を緩和するために、刺激性の脂質から構成された複合体を低濃度に希釈してもよい。一群の実施形態では、核酸は、標識が付着しており、（相補的核酸の存在を示すことによって）診断に使用される。この例では、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断されている病状、および臨床医の判断によって決定されるが、通常、（例えば、核酸剤の）約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態では、投与される複合体は、体重１キログラム当たり約０．００４〜約５０ｍｇの核酸剤（例えば、約０．００６ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ）を含む。
上記のように、本発明の脂質−治療剤（例えば、核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、もしくはガングリオシドＧＭ１修飾脂質、または凝集を防ぐかまたは制限するのに有効な他の脂質を含んでもよい。このような成分の添加は、単に複合体凝集を防ぐだけではない。それどころか、これは、循環寿命を増大させ、標的組織への脂質−核酸組成物の送達を増大させる手段も提供する可能性がある。
本発明は、キット形態の脂質−治療剤組成物も提供する。キットは、通常、キットの様々な要素を入れるために区画化された容器から構成されている。キットは、好ましくは脱水または濃縮された形態の、本発明の粒子または薬学的組成物を、それらを再水和または希釈および投与するための指示書とともに含む。特定の実施形態では、粒子は活性剤を含むが、他の実施形態では、含まない。
肝臓スクリーニングモデルによって同定された薬剤を含む薬学的組成物を、局所的処置が望ましいかまたは全身的処置が望ましいかによって、および治療されるべき面積によって、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所的、肺（例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹入）；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口的または非経口的であってもよい。投与はまた、局所送達を通じて、例えば、関節への直接的な関節内注射によって、消化管および腸への直接的な送達のための直腸投与によって、子宮頸部および膣への送達のための膣内投与によって、眼への送達のための硝子体内投与によって、特定の組織への優先的な局在化をもたらすように設計されてもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、関節内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射もしくは注入；または頭蓋内（例えば、髄腔内もしくは脳室内）投与が挙げられる。
局所的投与のための薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、座薬、スプレー、液剤および粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性、粉末もしくは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、グローブなども有用であり得る。好ましい局所製剤としては、本発明のｄｓＲＮＡが、局所的送達成分（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤または界面活性剤）と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、すなわちＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明のｄｓＲＮＡはリポソーム内に封入され得るし、またはｄｓＲＮＡは、リポソームへと（特に、カチオン性リポソームへと）複合体を形成し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡを脂質へと（特に、カチオン性脂質へと）複合体化し得る。好ましい脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられるが、これらに限られない。局所製剤は１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５，２９８号に詳細に記載されており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
経口的投与のための組成物および製剤としては、粉末剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水中もしくは非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ、錠剤またはミニ錠が挙げられる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。好ましい経口製剤は、本発明のｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透増進剤界面活性剤およびキレート化剤と組み合わせて投与されるものである。好ましい界面活性剤として、脂肪酸および／またはそれらのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはそれらのモノグリセリド、ジグリセリドもしくは薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。浸透増進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩も好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩とカプリン酸とＵＤＣＡである。さらなる浸透増進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のｄｓＲＮＡを噴霧乾燥した粒子を含む顆粒形態として経口的に送達するか、またはそれを複合体化させてマイクロ粒子もしくはナノ粒子を形成させてもよい。ｄｓＲＮＡ複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリラート；ポリアルキルアクリラート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリラート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリラート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリラート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロースおよびデンプンが含まれる。特に好ましい複合体化剤にはキトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリラート）、ポリ（エチルシアノアクリラート）、ポリ（ブチルシアノアクリレトー）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）および同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に記載されており、これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、髄腔内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤（例えば、限定するものではないが、浸透増進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤）も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
薬学的組成物としては、溶液、エマルジョョンおよびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物を、事前形成された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれるが、これらに限定されない種々の成分から生成させ得る。
好都合に単位投薬形態で提示し得る本発明の薬学的製剤は、薬学的産業において周知の従来の方法に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉砕された固体担体または両方と均一かつ緊密に関連させ、次に、必要ならば、生成物を成形することにより調製される。
本発明の組成物を製剤化し、多くの可能な投薬形態、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、座薬、および浣腸のいずれかにしてもよい。また、本発明の組成物を、水性、非水性または混合媒体中の懸濁剤として製剤化してもよい。水性懸濁剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を高める物質をさらに含んでいてもよい。懸濁剤はまた、安定剤を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態では、薬学的組成物を泡剤として製剤化し、使用してもよい。薬学的泡剤としては、限定するものではないが、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの製剤が挙げられる。これらの製剤は性質において基本的に類似しているが、成分および最終的生成物の稠度の点で異なる。このような組成物および製剤の調製は、一般に、製薬および医薬の技術分野における専門家に知られており、かつ本発明の組成物の製剤に適用され得る。
本発明は、その適用が以下の説明に示される成分の構築および配置の詳細には制限されない。本発明は、他の実施形態であり得、様々な方法で実施または実行され得る。また、本明細書で用いられる表現および技術用語は、説明目的のものであって、制限とみなされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、および本明細書におけるそれらのバリエーションの使用は、以後列挙される項目およびその等価物ならびにさらなる項目を包含することが意図される。
以下の実施例は、特許請求された発明を例証するために提供されるのであって、これを限定するために提供されるのではない。
本明細書に示す実施例で使用される場合、「ＡｐｏＥ」という用語は、別途特定されない限り、ＡｐｏＥ３を指す。
実施例１：ＬｕｃおよびＦＶＩＩのターゲッティングのためのｓｉＲＮＡ二重鎖
下記の表８は、ＬｕｃおよびＦＶＩＩのターゲッティングのための例示的な配列を示す。
Ｌ８は、
であり、小文字は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、＊はホスホロチオアート骨格結合であり、ｆＮは２’−フルオロヌクレオチドであり、ｄＮは２’−デオキシヌクレオチドであることに留意されたい。
実施例２：カチオン性脂質由来のリポソームを用いたＦＶＩＩのインビボ評価
インビボでの齧歯類第ＶＩＩ因子およびＡｐｏＢのサイレンシング実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）とＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，ＭＡ）に、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの容量で、食塩水または所望の製剤中のｓｉＲＮＡのいずれかを投与した。投与後の様々な時点で、動物にイソフルオラン吸入で麻酔をかけ、血液を後眼窩採血によって血清分離チューブ中に回収した。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、製造元のプロトコルに従って発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ，ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ，ＯＨまたはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＯＨ）を用いて試料中で決定した。食塩水処理した動物から回収した血清を用いて標準曲線を作成した。投与後の様々な時点で、肝臓ｍＲＮＡレベルを評価する実験において、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結した。凍結した肝臓組織をすり潰して粉末にした。組織ライセートを調製し、第ＶＩＩ因子およびａｐｏＢの肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）を用いて決定した。
実施例３．ＦＶＩＩターゲッティングのためのリポソーム製剤
凝固カスケードの著名なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）で合成され、血漿中に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、簡単なプレートに基づく比色アッセイで決定することができる。したがって、ＦＶＩＩは、ｓｉＲＮＡ媒介性の肝細胞由来タンパク質の下方調節の決定、ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡの血漿濃度および組織分布のモニタリングのための好都合なモデルである。
マウスにおける第ＶＩＩ因子ノックダウン
Ｃ５７ＢＬ／６マウスで静脈内（ボーラス）注射した２４時間後、ＦＶＩＩ活性をＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ処理動物で評価した。マイクロプレートスケールで、製造元の指示に従って、血清または組織中のタンパク質レベルを決定するための市販キットを用いてＦＶＩＩを測定した。ＦＶＩＩの低下を未処理の対照マウスに対して決定し、結果を残存ＦＶＩＩ％として表した。４つの用量レベル（２、５、１２．５、２５ｍｇ／ｋｇ ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を各々の新規リポソーム組成物の初期スクリーンで用い、初期スクリーンで得られた結果を基にして、この用量を後の研究で拡大した。
認容性の決定
体重変化、臨床観察、臨床化学検査および、場合によって、血液検査をモニタリングすることにより、各々の新規リポソームｓｉＲＮＡ製剤の認容性を評価した。処理前および処理２４時間後に、動物の体重を記録した。データを体重変化％として記録した。体重測定に加えて、肝機能マーカーを含む、完全な臨床化学検査パネルを、ＦＶＩＩ解析用に採取された血清のアリコートを用いて、注射２４時間後に、各用量レベル（２、５、１２．５および２５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ）で得た。解析のために、試料をＣｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎｓ（Ｌａｎｇｌｅｙ，ＢＣ）に送付した。場合によっては、血液検査解析用の全血の採取が行えるように、治療群に追加のマウスを含めた。
治療指数の決定
治療指数（ＴＩ）は、毒性と活性の測定値を比較して生成される任意のパラメータである。これらの研究のために、ＴＩを
ＴＩ＝ＭＴＤ（最大忍容用量）／ＥＤ５０（５０％のＦＶＩＩノックダウンが得られる用量）
として計算する。
これらの研究についてのＭＴＤは、体重の＞７％減少および齧歯類の肝臓の損傷に対する良好な特異性を有する臨床的化学マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の＞２００倍の増加を引き起こす最低の用量として設定された。ＥＤ５０は、ＦＶＩＩ用量−活性曲線から求められた。
実施例１に示したようなＡＤ１６６１ ｓｉＲＮＡを、以下のモル比、すなわち、６０：７．５：３１：１．５、５０：１０：３８．５：１．５および４０：２０：３８．５：１．５のＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（これらは、実施例２に記載したような方法で調製および試験された）を含む製剤中で投与した。これらのインビボ実験の結果は、試験した製剤のサイレンシング能力を示す図１に示されている
実施例４．１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−ＤＭＧ）の調製
ＩＶａの調製
１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリドＩａ（３０ｇ、６１．８０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ、２３．７６ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ、５００ｍＬ）中に入れ、氷水混合物上で撹拌した。この撹拌溶液中にトリエチルアミン（ＴＥＡ、２５．３０ｍＬ、３当量）を添加し、その後、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌させておいた。反応の進行をＴＬＣでモニタリングした。反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（５００ｍＬ）水溶液で洗浄した後、標準的な後処理をした。得られた残渣を高真空下にて周囲温度で一晩乾燥させた。乾燥後、このようにして得られた粗カルボナートＩＩａをジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（ＩＩＩ、１０３．００ｇ、４７．２０ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）および無水ピリジン（Ｐｙ、８０ｍＬ、過剰）をアルゴン下で添加した。次に、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌させておいた。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルカラムに充填した。カラムを最初に酢酸エチル、その後ジクロロメタン中の５〜１０％メタノール勾配で溶出させると、所望のＰＥＧ−脂質ＩＶａが白色の固体（１０５．３０ｇ、８３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．２０−５．１２（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８０−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．１０−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，４８Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２６６０−２８３６。
ＩＶｂの調製
１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリドＩｂ（１．００ｇ、１．８４８ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（０．７１０ｇ、１．５当量）を一緒にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に入れ、氷水混合物中で０℃に冷却した。トリエチルアミン（１．００ｍＬ、３当量）を添加し、反応液を一晩撹拌した。反応後、ＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、得られたＩＩｂの残渣を高真空下で一晩維持した。この化合物をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ ＩＩＩ（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）およびＩＩｂ（０．７０２ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応液を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、反応液を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニタリングした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、次いで勾配溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製すると、所要の化合物ＩＶｂが白色の固体（１．４６ｇ、７６％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．１７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．４５（ｍ，６Ｈ），１．３５−１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２７１６−２８９２。
ＩＶｃの調製
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリドＩｃ（４．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（２．５８ｇ、１．５当量）を一緒にジクロロメタン（６０ｍＬ）中に入れ、氷水混合物中で０℃に冷却した。トリエチルアミン（２．７５ｍＬ、３当量）を添加し、反応液を一晩撹拌した。反応後、ＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩維持した。この化合物をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。ＭＰＥＧ２０００ＮＨ２ ＩＩＩ（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）およびＩＩｃ（０．７６０ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応液を０℃に冷却した。ピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、反応液を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニタリングした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで勾配溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製すると、所望の化合物ＩＶｃが白色の固体（０．９２ｇ、４８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．２２−５．１５（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，６４Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２７７４−２９４８。
実施例５：ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）の調製
（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を室温で一晩撹拌した。この溶液を希塩酸、次いで希釈重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーター（ロトバップ）で除去した。残渣を、１〜５％メタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いて、シリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製物を含む画分を組合せ、溶媒を除去すると、無色のオイル（０．５４ｇ）が得られた。
本発明の化合物を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の論文に記載の手順に従って合成することができる。
１．Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｕｒｓ；Ｌｕ，Ｊｕｎ；Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｂｅｒｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｔｏ Ｈｅａｖｉｌｙ Ｌｉｐｉｄａｔｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００３），５（３），２５５−２５７．
２．Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｆ．；Ａｌｌｂｕｔｔ，Ａ．Ｄ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９７０，４８，１７５４−１７６９
３．Ｍａｃｈ，Ｍａｔｅｕｓｚ；Ｓｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｕｒｓ；Ｍａｔｈｅｗ，Ｆｅｌｉｘ；Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｂｅｒｔ；Ｈａｚｅｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｃ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｎ−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｎ−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ａｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｄｏｎｏｒｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００２），５８（３６），７３４５−７３５４．
実施例６：ラットにおける様々なリポソーム組成物を有するＭＣ３リポソームの効力
ラットにおけるＭＣ３含有リポソーム製剤の用量応答を調べるために、以下のリポソーム製剤を本質的に実施例２に記載した通りに調製した。下記の表に示すように、含まれる成分を次の通りに示す：ＭＣ３−ＤＳＰＣ−コレステロール−ＰＥＧ−Ｃ１４。下記の表９に、試験した例示的な製剤を示す。
図２に示すように、５０ｍｏｌ％のＭＣ３を有するリポソーム製剤は、４０ｍｏｌ％のＭＣ３を有するリポソーム製剤のｓｉＲＮＡ濃度よりもわずかに低いｓｉＲＮＡ濃度で効力を有する用量応答曲線を示した。
実施例７：ＭＣ３リポソームの効力はマウスにおいてＡｐｏＥ依存性を示す。
様々なリポソーム製剤の効力におけるＡｐｏＥの役割をさらに調べるために、野生型マウスおよびＡｐｏＥノックアウトマウスに、０．１、０．０３、および０．０１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−１６６１ ｓｉＲＮＡ組成物を含むＭＣ３リポソームを本質的に実施例２に記載した通りに投与した。ＡｐｏＥを外から添加することで、マウスにおけるタンパク質の欠如を克服することができるかどうかを明らかにするために、リポソーム製剤の半分を組換えＡｐｏＥタンパク質と事前混合した。下記の表１０に、試験した例示的な製剤を示す。
図３は、ＭＣ３製剤化リポソームを投与したときの、ＡｐｏＥ欠損ノックアウトマウス（左の棒）ではなく、野生型（右の棒）におけるＦＶＩＩタンパク質レベルの用量依存的減衰を示し、細胞取込みおよび／または肝臓への送達におけるＡｐｏＥの役割を示唆している。１６６１ ｓｉＲＮＡとともに上記のように製剤化されたＭＣ３リポソームを、０．１、０．０３、および０．０１ｍｇ／ｋｇの濃度で単独でまたはＡｐｏＥリポタンパク質と事前混合して投与した。しかしながら、はるかに高い用量（例えば、約１．０ｍｇ／ｋｇまたはそれを超える）では、ＭＣ３製剤化製剤は、ＦＶＩＩのｍＲＮＡおよびタンパク質のサイレンシングをもたらすことが分かった（図示せず）。図３に示すように、試験したＭＣ３製剤化リポソーム製剤は、組換えＡｐｏＥと事前混合しない限り、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいてＦＶＩＩのサイレンシングをもたらすことができない。したがって、ＭＣ３（ＭＣ３含有リポソーム）をＡｐｏＥと事前混合することによって、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて活性をレスキューすることができる。
実施例８：モルパーセンテージおよびホスホコリンのテールの長さが異なるＭＣ３含有リポソーム製剤の効力
モルパーセンテージおよびホスホコリンのテールの長さの変化が様々なリポソーム製剤の効力に及ぼす効果を調べるために、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣおよびＤＬＰＣを含む様々な製剤を０．０１または０．０３ｍｇ／ｋｇでＦＶＩＩサイレンシングの効力について試験した。
下記の表１１に、試験した例示的な製剤を示す。
図４は、例えば、５０モルパーセントと４０モルパーセント、また、ＤＭＰＣ含有製剤については、５０モルパーセントと４０モルパーセントと３０モルパーセントを比較した、ＭＣ３のモルパーセンテージの変化の効果を示している。図４は、中性脂質の変化の効果も示し、これは、ＤＳＰＣ、ＤＭＰＣ、およびＤＬＰＣを含むＭＣ３リポソーム製剤についての異なる結果を示している。
実施例９：リポソーム製剤中へのＧａｌＮＡｃ脂質の組込み
潜在的な代替送達機構を探索するために、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）コンジュゲート脂質を含むリポソーム製剤を用いてインビボ実験を行なった。ＧａｌＮＡｃをターゲッティングリガンド候補として選んだが、それは、ＧａｌＮＡｃ受容体が肝臓で高度に発現されると考えられることが知られているからである。それゆえ、マウスおよびラットで研究を行ない、式ＩＩＩのＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ脂質をさらに含むＭＣ３含有リポソーム製剤の効力を本質的に実施例２に記載した通りに試験した。全ての実験において、ＰＥＧコンジュゲート脂質の総量を一定に保った（例えば、０．５％ｍｏｌのＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を０．５％ｍｏｌだけ減らした）。実験では遺伝子型ごとの９つの群の各々について４匹の動物を用いた。
下記の表１２に、製剤をＣ５７ＢＬ６マウスで試験した場合の、５％のＰＥＧ脂質濃度を有するＭＣ３含有リポソームを含む方法についての実験詳細を示す。以下の相対モル量、すなわち、５０／１０／３５／５のＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧを含むを含むリポソーム。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を４．５％に低下させる。
下記の表１３に、製剤をＣ５７ＢＬ６マウスで試験した場合の、１０ｍｏｌ％濃度のＰＥＧ−ＤＳＧ脂質を有するＭＣ３含有リポソームを含む方法についての実験詳細を示す。リポソームは、以下の相対モル量、すなわち、５０／１０／３０／１０のＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧを含んでいた。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を９．５％に低下させる。
図５は、ＰＥＧ遮蔽の増大によって、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける非ＧａｌＮＡｃ媒介性サイレンシングが減少する場合の効果を示している。これは、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいて５％と１０％の両方のＰＥＧ濃度で証明されている。Ｃ１８−ＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ−ＤＳＧ）を１０ｍｏｌ％で含むことにより、サイレンシングが効果的に阻害され、このサイレンシングは、０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を等モル量のＧａｌＮＡｃ−脂質（すなわち、式ＩＩＩのＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ）と置き換えることによって打破することができる。それゆえ、（例えば、５ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％への）ＰＥＧ遮蔽の増大は、非ＧａｌＮＡｃ媒介性サイレンシングだけでなく、全体的な効力も減少させるようである。
ラットにおいても同様の実験を行ない、その場合、５モル％と１０モル％の両方でＰＥＧ脂質（ＰＥＧ−ＤＳＧも）をリポソームに含めた。下記の表１４に、製剤をラットで試験した場合の、５％のＰＥＧ脂質濃度を有するＭＣ３含有リポソームを含む方法についての実験詳細を示す。以下の相対モル量、すなわち、５０／１０／３５／５のＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧを含むリポソーム。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を４．５％に低下させる。
下記の表１５に、製剤をラットで試験した場合の、１０％のＰＥＧ脂質濃度を有するＭＣ３含有リポソームを含む方法についての実験詳細を示す。以下の相対モル量、すなわち、５０／１０／３０／１０のＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧを含むリポソーム。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を９．５％に低下させる。
図６は、示された投薬量でラットに投与された５ｍｏｌ％および１０ｍｏｌ％のＣ１８ ＰＥＧを含有するＭＣ３製剤の結果を示している。１０ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＳＧを含有する製剤は、ラットにおいて、試験した濃度（０．６２５〜５ｍｇ／ｋｇ）でサイレンシングがほとんどないことを示している。しかしながら、０．５ｍｏｌ％の式ＩＩＩのＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧを含ませると（すなわち、０．５ｍｏｌ％のＣ１８−ＰＥＧを取り替えると）、ＦＶＩＩのノックダウンが回復する。それゆえ、マウスと比較したとき、ラットでは、５ｍｏｌ％濃度のＰＥＧと１０ｍｏｌ％濃度のＰＥＧとの差に示されるように、より高度に遮蔽された製剤によって、一般により良好に効力が保持される。
実施例１０：０．５ｍｏｌ％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧを含むおよび含まないＭＣ３含有リポソーム製剤中の成分のｍｏｌ％の変化の評価
ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧを含むおよび含まない、様々なモルパーセンテージの成分を有するＭＣ３含有リポソームの効力を明らかにするために、以下のリポソーム製剤を、実質的に上記の実施例２に記載した通りに調製し、Ｃ５７ＢＬ６マウスで試験した。表に記載された成分は、次のような順で示されている：ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧ。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、下記の表１６に示すように、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を４．５％に低下させる。
図７に示すように、ＧａｌＮＡｃをリポソーム製剤に添加すると、各製剤において、すなわち、ＭＣ３が５０、４０、および３０ｍｏｌ％で存在する場合に、ＦＶＩＩのサイレンシングが改善される。
実施例１１：ＷＴマウスおよびＡＳＧＰＲ ＫＯマウスにおけるＭＣ３含有リポソームおよびＧａｌＮＡｃ含有リポソームの効力
様々なリポソーム製剤の効力におけるＡＳＧＰＲの役割を調べるために、野生型マウスおよびＡＳＧＰＲノックアウトマウスに、実施例１に記載したような３、１、および０．３ｍｇ／ｋｇのＡＤ−１６６１ ｓｉＲＮＡ組成物を含有するＭＣ３リポソームを投与した。表に記載された成分は、次のような順で示されている：ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＧ。０．５％のＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧを添加する場合、下記の表１７に示すように、対応するＰＥＧ−ＤＳＧの量を９．５％に低下させる。
図８は、これらの実験の結果を示し、これにより、ＧａｌＮＡｃターゲッティング部分の予想される受容体であるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を欠損するマウス系統に投与されたときに、ＧａｌＮＡｃ３−ＰＥＧ−ＤＳＧ脂質を含めることによる、Ｃ１８ ＰＥＧを含有する製剤におけるＦＶＩＩノックダウンの回復が無効になることが証明される。
実施例１２：オリゴヌクレオチド合成
合成
オリゴヌクレオチドは全て、ＡＫＴＡオリゴパイロット合成装置で合成する。市販の多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Ａ、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホルアミダイトである、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブトリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホルアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴヌクレオチド合成に用いた。２’−Ｆホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトは（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。
ホスホルアミダイトは全て、１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍ濃度で用いるグアノシンを除いて、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で用いる。１６分のカップリング／リサイクリング時間を用いる。活性化剤は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。ＰＯ酸化の場合は、ヨウ素／水／ピリジンを用い、ＰＳ酸化の場合は、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を用いる。
対応するリガンドを含有する固体支持体を用いて、３’−リガンドコンジュゲート鎖を合成する。例えば、配列中のコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホルアミダイトから行なわれる。コレステロールを６−アミノヘキサノアート結合を介してｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリノールに連結させると、ヒドロキシプロリノール−コレステロール部分が得られる。５’末端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識ｓｉＲＮＡは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入される対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホルアミダイトから合成される。５’末端または内部位置へのリガンドのコンジュゲーションは、適切に保護されたリガンド−ホスホルアミダイトビルディングブロックを用いて達成される。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化剤の存在下で０．１Ｍホスホルアミダイトの無水ＣＨ３ＣＮ溶液のカップリングを１５分間延長して固体支持体結合オリゴヌクレオチドを得る。ヌクレオチド間ホスファイトのホスファートへの酸化は、（１）で報告したような標準的なヨウ素−水を用いることによるか、または酸化待ち時間１０分でコンジュゲートオリゴヌクレオチドをｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）で処理することによって実施される。ホスホロチオアートは、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳおよび／またはボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬などの硫黄転移試薬を用いて、ホスファイトをホスホロチオアートに酸化することによって導入される。コレステロールホスホルアミダイトは自家合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で用いる。コレステロールホスホルアミダイトのカップリング時間は１６分である。
脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成が終了した後、支持体を１００ｍＬガラスボトル（ＶＷＲ）に移す。オリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、塩基とリン酸基を８０ｍＬのエタノールアンモニア混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］を用いて５５℃で６．５時間同時に脱保護する。ボトルを氷上で短時間冷却した後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０−ｍＬボトルに入れる。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部のエタノール／水（１：１ ｖ／ｖ）で洗浄する。次に、混合物の容量をロータリーエバポレーター（ロトバップ）で約３０ｍＬにまで減らす。次に、混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックにて真空下で乾燥させる。
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳの除去）
乾燥残渣を、トリエチルアミンとトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦとＤＭＳＯ（３：４：６）２６ｍＬに再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次に、反応液を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、そのｐＨを６．５に調整する。オリゴヌクレオチドを精製するまでフリーザーで保存する。
分析
オリゴヌクレオチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析された後に精製され、緩衝液およびカラムの選択は、配列および／またはコンジュゲートされたリガンドの性質によって決まる。
ＨＰＬＣ精製
リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを逆相分取ＨＰＬＣで精製する。コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチドを自前で詰めたＴＳＫゲルカラム上での陰イオン交換ＨＰＬＣで精製する。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ａ）中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）および１０％ＣＨ３ＣＮ、１Ｍ ＮａＢｒ（緩衝液Ｂ）中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）である。全長オリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させる。ＯＤ約０．１５の脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μＬになるまで水に希釈した後、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の特別なバイアルにピペッティングで入れる。次に、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥで分析する。
ｓｉＲＮＡ調製
ｓｉＲＮＡを調製するために、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を、１×ＰＢＳ中、９５℃で５分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷却させる。二重鎖の完全性をＨＰＬＣ分析で確認する。
小文字は２’ＯＭｅ修飾であり、Ｎｆは２’Ｆ修飾ヌクレオ塩基であり、ｄＴはデオキシチミジンであり、ｓはホスホチオアートである。
実施例１３：ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリドの合成
ＰＥＧ−脂質（例えば、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド）を以下の手順を用いて合成した。
化合物４ａ（ＰＥＧ−ＤＭＧ）の調製：１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド１ａ（３０ｇ、６１．８０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−スクシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ、２３．７６ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ、５００ｍＬ）中に入れ、氷水混合物上で撹拌した。撹拌溶液にトリエチルアミン（２５．３０ｍＬ、３当量）を添加し、その後、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌させておいた。反応の進行をＴＬＣでモニタリングした。反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した後、後処理した。得られた残渣を高真空下にて周囲温度で一晩乾燥させた。乾燥後、このようにして得られた粗カルボナート２ａをジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（３、１０３．００ｇ、４７．２０ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）および無水ピリジン（８０ｍＬ、過剰）をアルゴン下で添加した。いくつかの実施形態では、このメトキシ−（ＰＥＧ）ｘ−アミンは、ｘ＝４５〜４９、好ましくは４７〜４９、およびより好ましくは４９を有する。次に、この反応混合物を周囲温度で一晩撹拌させておいた。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルカラムに充填した。このカラムを最初に酢酸エチル、その後、ジクロロメタン中の５〜１０％のメタノール勾配で溶出させると、所望のＰＥＧ−脂質４ａが白色の固体（１０５．３０ｇ、８３％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．２０−５．１２（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８０−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．１０−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，４８Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２６６０−２８３６。
４ｂの調製：１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド１ｂ（１．００ｇ、１．８４８ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（０．７１０ｇ、１．５当量）を一緒にジクロロメタン（２０ｍＬ）中に入れ、氷水混合物中で０℃に冷却した。それにトリエチルアミン（１．００ｍＬ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。反応後にＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で、および残渣２ｂを高真空下で一晩除去した。この化合物をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ ３（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）および前の工程２ｂからの化合物（０．７０２ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応液を０℃に冷却した。それにピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニタリングした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、その後、勾配溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製すると、所要の化合物４ｂが白色の固体（１．４６ｇ、７６％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．１７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．４５（ｍ，６Ｈ），１．３５−１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２７１６−２８９２。
４ｃの調製：１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド１ｃ（４．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（２．５８ｇ、１．５当量）を一緒にジクロロメタン（６０ｍＬ）中に入れ、氷水混合物中で０℃に冷却した。それにトリエチルアミン（２．７５ｍＬ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。反応後にＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で、および残渣を高真空下で一晩除去した。この化合物をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ ３（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）および前の工程２ｃからの化合物（０．７６０ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応液を０℃に冷却した。それにピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニタリングした。溶媒および揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（最初に酢酸エチル、その後、勾配溶出としての５〜１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製すると、所要の化合物４ｃが白色の固体（０．９２ｇ、４８％）として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．２２−５．１５（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，６４Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲実測値：２７７４−２９４８。
実施例１４：押出法の一般的プロトコル
脂質（式Ｉのカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ）を可溶化し、所望のモル比に従ってエタノール中で混合する。混合した脂質をｐＨ５．２の酢酸ナトリウム緩衝液に添加するエタノール注入法によって、リポソームを形成させる。これにより、３５％エタノール中でリポソームが自然に形成される。リポソームを０．０８μｍポリカーボネート膜に少なくとも２回通して押し出す。ストックｓｉＲＮＡ溶液を酢酸ナトリウムおよび３５％エタノール中に調製し、リポソームに添加して、充填（ｌｏａｄ）した。ｓｉＲＮＡ−リポソーム溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、希釈した。エタノールを除去し、透析または接線流濾過でＰＢＳ緩衝液に交換した。
実施例１５：インライン混合法の一般的プロトコル
一方は脂質を含み、もう一方はｓｉＲＮＡを含む、個々別々のストックを調製する。式Ｉのカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ脂質を含む脂質ストックを９０％エタノールに可溶化して調製する。残りの１０％は低ｐＨクエン酸緩衝液である。脂質ストックの濃度は４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸緩衝液のｐＨの範囲は、利用される融合性脂質の種類によって、ｐＨ３〜５であることができる。ｓｉＲＮＡを４ｍｇ／ｍＬの濃度でクエン酸緩衝液にも可溶化する。小規模用に、５ｍＬの各ストック溶液を調製する。
ｓｉＲＮＡと組み合わせる前に、ストック溶液は完全に透明であり、かつ脂質は完全に可溶化されなければならない。それゆえに、ストック溶液を加熱して、脂質を完全に可溶化してもよい。このプロセスで使用されるｓｉＲＮＡは、未修飾オリゴヌクレオチドであっても、修飾オリゴヌクレオチドであってもよく、コレステロールなどの親油性部分とコンジュゲートされていてもよい。
各溶液をＴ字路に汲み上げて、個々のストックを組み合わせる。デュアルヘッド型のＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプを用いて、２つのストリームの開始と停止を同時に制御する。線流速を増加させるために、１．６ｍｍのポリプロピレンチューブをさらに小さくして、０．８ｍｍのチューブにする。このポリプロピレンライン（ＩＤ＝０．８ｍｍ）をＴ字路のどちらかの側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、４．１ｍｍ３の容積が結果として得られるように、１．６ｍｍの直線状の先端を有する。ポリプロピレンラインの大きい末端（１．６ｍｍ）の各々は、可溶化された脂質ストックかまたは可溶化されたｓｉＲＮＡのいずれかを含む試験管の中に入れられる。Ｔ字路の後ろに、組み合わされたストリームが流れるチューブを１本置く。次に、チューブを伸ばして、２×容量のＰＢＳが入った容器中に入れる。ＰＢＳを素早く撹拌する。ポンプの流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分のセッティングとする。エタノールを除去し、透析でＰＢＳに交換する。次に、脂質製剤を、遠心分離または透析濾過を用いて、適当なワーキング濃度まで濃縮する。
実施例１６：［６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノアート］（式Ｉのカチオン性脂質またはＭＣ３）の合成
アルコール２の調製
アルゴン注入口とサーモウェルとが取り付けられたきれいな乾燥した２００Ｌのガラス反応器に６０ＬのＴＨＦと５．７３Ｋｇ（２０．４ｍｏｌ）のリノール酸とを充填した。反応器の内容物をアセトン−ドライアイス浴を用いて０℃未満に冷却した。この冷たい溶液に、トルエン中の１３．８Ｌのビトライド（６０％重量／体積）をゆっくりと添加し、反応混合物の内部温度を０℃未満に維持した（注：最初のビトライドの添加は発熱性であり、発泡が観察された。添加してから１５分後に発泡は止まった）。ビトライドの添加には３時間４５分かかった。添加し終わった後、反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。アリコートを取り、飽和Ｎａ２ＳＯ４でクエンチし、このようにして得られた粗生成物を出発酸の存在についてＴＬＣで分析した。ＴＬＣは反応の完了を示しており、この反応混合物を約４５分間で再び０℃未満に冷却した。この混合物に（１．１Ｋｇの硫酸ナトリウムを１．５Ｌの水に溶解させて調製した）飽和硫酸ナトリウム溶液を４５分間かけてゆっくりと添加した。添加し終わった後、２５Ｌの酢酸エチルを撹拌しながら３０分間かけて添加した。得られた反応混合物を４５分間かけてセライトパッドに通して濾過し、セライト床をさらに１７Ｌの酢酸エチルで洗浄して、この残渣から全ての生成物を取り除いた。組み合わせた有機物を減圧下で濃縮した。残渣を１５Ｌの酢酸エチルに溶解させ、有機層を水（２×７Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム（１．１Ｋｇ）上で乾燥させた。濾過後、有機層を減圧下で濃縮し、高真空下で乾燥させると、生成物のリノレイルアルコールがオイルとして得られた。粗収量＝５．５Ｋｇ（理論収量＝５．４３Ｋｇ）。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
リノレイルメシラート３を調製するためのプロセス
アルゴン注入口とサーモウェルとが取り付けられたきれいな乾燥した２００Ｌの全ガラス反応器に、４５ＬのＤＣＭと５．５Ｋｇの工程１からの粗生成物とを充填した。この溶液に、１１．５Ｌのトリエチルアミン、次いで０．２５２Ｋｇ（２．０ｍｏｌ）のＤＭＡＰを添加した。この溶液をドライアイス−アセトン混合物を用いて−１０℃に冷却し、この冷えた反応塊に、塩化メシル（３．２Ｌ、４１．３ｍｏｌ）のＤＣＭ（１０Ｌ）溶液を、０℃未満の温度に保持しながら、３時間かけて少しずつ添加した。添加し終わった後、反応混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、反応混合物のＴＬＣ（ＤＣＭ中５％ＥｔＯＡｃ；ＰＭＡ染色）により、出発アルコールの完全な消失が示された。この反応混合物に、１７Ｌの氷冷水を添加し、層を分離した。一番上の水性層を１０ＬのＤＣＭで再び洗浄し、この層を分離した。合わせた有機層を（２Ｌの濃ＨＣｌを１８ＬのＲＯ水と混合して調製した）２×１０Ｌの希塩酸、２×７．５Ｌの水および（１１ＫｇのＮａＣｌを１０ＬのＲＯ水に溶解させて調製した）１０Ｌのブラインで洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４（２．７５Ｋｇ）上で乾燥させ、濾過した。有機層を減圧下で蒸発させ、真空乾燥させると、粗メシラートが淡黄色オイルとして得られた。粗収量＝７．１Ｋｇ（理論収量＝７．１Ｋｇ）。この材料をさらに精製することなく次の工程で用いた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．４２−５．２１（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｔ，２Ｈ），２．１９−２．００（ｍ，４Ｈ），１．９０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．０６−１．１８（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） δ＝１３０．７６，１３０．５４，１２８．６，１２８．４，７０．６７，３７．９，３２．０５，３０．１２，２９．８７，２９．８５，２９．６８，２９．６５，２９．５３，２７．７２，２７．７１，２６．１５，２５．９４，２３．０９，１４．６０。ＭＳ。Ｃ１９Ｈ３６Ｏ３Ｓについて計算された分子量、計算値３４４．５３、実測値３４３．５２（Ｍ−Ｈ−）。
臭化リノレイル４の調製
アルゴン注入口とサーモウェルとが取り付けられたきれいな乾燥した２００Ｌの全ガラス反応器に、２５ＬのＤＭＦと７．１Ｋｇの工程２からの粗生成物を充填した。この混合物をアセトン−ドライアイス混合物を用いて−１０℃に冷却した。この撹拌混合物に、臭化リチウム（２．７Ｋｇ、３１．０ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液２５Ｌを、０℃未満の反応温度を保持しながら、１．５時間かけて添加した。添加し終わった後、アリコートのＴＬＣ（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃ、ＰＭＡ染色）により、出発メシラートの完全な消失が示されるまで、反応混合物を４５℃で１８〜２０時間撹拌した。反応混合物を７０Ｌの水で希釈し、５７Ｌのヘキサンで抽出した。水性層を２×１０Ｌのヘキサンでさらに抽出し、合わせた有機層（約１２０Ｌ）を２×１０Ｌの水および（１４Ｋｇの塩化ナトリウムを１０Ｌの水に溶解させて調製した）１×１０Ｌのブラインで再び洗浄した。得られた有機層（１２０Ｌ）を硫酸ナトリウム（４Ｋｇ）上で乾燥させ、減圧下で濃縮すると、粗生成物（６．５Ｋｇ）が得られた。この粗生成物を、ヘキサンを溶離液として用いて、６０〜１２０メッシュのシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物の濃縮により、５．５Ｋｇ（８１％、３工程）の臭化物４が無色の液体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ＝５．４１−５．２９（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｄ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−２．０２（ｍ，４Ｈ），１．８８−１．００（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２７（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３） δ＝１３０．４１，１３０．２５，１２８．２６，１２８．１２，３４．１７，３３．０５，３１．７５，２９．８２，２９．５７，２９．５４，２９．３９，２８．９５，２８．３８，２７．４２，２７．４０，２５．８４，２２．７９，１４．２８。
ジリノレイルメタノール６の調製
アルゴン注入口と還流冷却器とサーモウェルとが取り付けられたきれいな乾燥した２００Ｌの全ガラス反応器を脱気し、アルゴンでパージした。反応器に２７７ｇ（１１．３ｍｏｌ）の活性マグネシウム、次いで１．５Ｌの無水エーテルを充填した。反応器を再び３回脱気し、アルゴンでパージした。臭化物４（２．５Ｋｇ、７．６ｍｏｌ）をアルゴン下で５Ｌの無水エーテルに溶解させ、この溶液１Ｌを反応器に添加し、次いで２５ｍＬ（０．３５ｍｏｌ）のジブロモメタンを添加した。反応器の内容物を、水浴を用いて４０℃に加熱した（泡立ちが観察された後で還流し、グリニャール試薬生成の開始が示された）。反応開始後、加熱装置を反応器から取り外し、残りの４Ｌの臭化物を、混合物の穏やかな還流を維持しながら、２時間３０分かけてゆっくりと添加した。添加し終わった後、反応混合物を再び１時間加熱還流し（浴温度４５℃）、その後、反応混合物のアリコートを水でクエンチして、ＴＬＣ（ヘキサン、ＰＭＡ染色）で分析した。これにより、出発臭化物の完全な消失が示された。反応混合物を氷浴を用いて１０℃未満に冷却し、ギ酸エチルのエーテル溶液（４Ｌのエーテル中２７５ｍＬ）を２時間３０分かけて添加し、添加し終わった後、反応混合物を室温に温めて、１時間撹拌した。反応混合物を冷却して１０℃に戻し、この混合物にアセトン（１．１５Ｌ）をゆっくりと添加し、次いで、７Ｌの氷冷水と（３．４Ｌの硫酸を３４Ｌの氷冷水で希釈して調製した）１０％硫酸溶液とを添加した。生成物を３×１０Ｌのエーテルで抽出し、合わせた有機層を１０Ｌのブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム（２Ｋｇ）上で乾燥させた。減圧下での有機層の濃縮により、粗生成物（２Ｋｇ）が、微量のＯ−ホルミル化生成物とともに、所要のジリノレイルアルコールの混合物として得られた。この粗生成物をＴＨＦ（４Ｌ）に再溶解させ、２０Ｌのガラス反応器に充填した。これにＮａＯＨ溶液（０．９３４Ｋｇを８Ｌの氷冷水に溶解させたもの）を添加し、内容物を６５℃で１８時間加熱した後、ＴＬＣ（ヘキサン中１０％エーテル）により、Ｏ−ホルミル化生成物が所要のジリノレイルメタノールに完全に変換されたことが示された。 反応混合物を冷却し、エーテル（３×４Ｌ）で抽出し、合わせた有機層を５Ｌのブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム（４Ｋｇ）上で乾燥させた。濾過後、有機層を濃縮すると、粗生成物が得られた。このようにして得られた粗生成物を、ヘキサン中の４％エーテルを用いて、６０〜１２０メッシュのシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分の濃縮により、純粋な６（１．４５Ｋｇ、８０％）が無色の液体として得られた。ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ５．４７−５．２４（ｍ，８Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝６．８，４．２，ＩＨ），２．８５−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．１２−１．９１（ｍ，９Ｈ），１．５０−１．１７（ｍ，４６Ｈ），０．９８−０．７６（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ１３０．４１，１３０．３７，１２８．１８，１２８．１５，７７．５４，７７．２２，７６．９１，７２．２５，３７．７３，３１．７５，２９．９４，２９．８９，２９．８３，２９．７３，２９．５８，２９．５３，２７．４６，２７．４３，２５．８９，２５．８６，２２．８０，１４．３０。
［６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノアート］ＭＣ３（８）の調製：
ジリノレイルメタノール６（１４４ｇ、２７２ｍｍｏｌ）を１Ｌのジクロロメタンに溶解させ、それにジメチルアミノ酪酸７（５５ｇ、３２８ｍｍｏｌ）の塩酸塩を添加し、次いでジイソプロピルエチルアミン（７０ｍＬ）とＤＭＡＰ（４ｇ）とを添加した。周囲温度で５分間撹拌した後、ＥＤＣＩ（８０ｇ、４１７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した後、ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）分析により、出発アルコールの完全な消失が示された。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（４００ｍＬ）、水（４００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。このようにして得られた粗生成物（１８０ｇ）をフラッシュカラムクロマトグラフィー［以下の溶離液を用いた、２．５Ｋｇシリカゲル、すなわち、ｉ）０．１％ＮＥｔ３を含むＤＣＭ ６Ｌを詰めたカラム；充填後、ｉｉ）０．１％ＮＥｔ３を含むＤＣＭ ４Ｌ；ｉｉｉ）２％のＭｅＯＨと９８％の０．１％ＮＥｔ３を含むＤＣＭ １６Ｌ；ｉｖ）２．５％のＭｅＯＨと９７．５％の０．１％ＮＥｔ３を含むＤＣＭ ４Ｌ；ｖ）３％のＭｅＯＨと９７％の０．１％ＮＥｔ３を含むＤＣＭ １２Ｌ］で精製すると、純粋な生成物８（ＭＣ３、１５９ｇ、９１％）が無色のオイルとして単離された。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．４６−５．２３（ｍ，８Ｈ），４．９３−４．７７（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．３７−２．２２（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，６Ｈ），２．１０−１．９６（ｍ，９Ｈ），１．８５−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝５．４，４Ｈ），１．３９−１．１５（ｍ，３９Ｈ），０．９５−０．７５（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７３．５６，１３０．３８，１３０．３３，１２８．１７，１２８．１４，７７．５４，７７．２２，７６．９０，７４．４４，５９．１７，４５．６４，３４．３６，３２．６９，３１．７３，２９．８７，２９．７６，２９．７４，２９．７０，２９．５６，２９．５０，２７．４４，２７．４１，２５．８４，２５．５５，２３．３８，２２．７８，１４．２７。ＥＩ−ＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４３Ｈ７９ＮＯ２のＭＷ計算値（Ｍ＋Ｈ）＋：６４２．６、実測値：６４２．６。
実施例１７．事前形成小胞を用いたｓｉＲＮＡ製剤
事前形成小胞の方法を用いてカチオン性脂質含有粒子を作製した。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を、それぞれ、４０／１０／４０／１０というモル比でエタノールに可溶化した。この脂質混合物を水性緩衝液（５ＯｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、それぞれ、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）および６．１ｍｇ／ｍＬという最終的なエタノールおよび脂質の濃度になるように混合して、押出しの前に室温で２時間平衡化させておいた。Ｎｉｃｏｍｐ分析で測定したときに７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いて２２℃で２つの積層された８０ｎｍ孔径フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して、水和した脂質を押し出した。これには通常、１〜３回の通過を要した。小さい小胞を形成しないいくつかのカチオン性脂質混合物の場合、脂質混合物をより低いｐＨの緩衝液（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）で水和してＤＳＰＣ頭部基上のリン酸基をプロトン化することにより、安定な７０〜９０ｎｍの小胞の形成が促進された。
ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含む５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液に可溶化したもの）を、事前に３５℃に平衡化した小胞に、混合しながら約５ｍＬ／分の割合で添加した。０．０６（重量／重量）という最終的な標的ｓｉＲＮＡ／脂質比に到達した後、小胞を再組織化させ、ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡを封入するために、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートした。次に、エタノールを除去し、透析かまたは接線流透析濾過のいずれかによって、外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と交換した。サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを用いて封入されていないｓｉＲＮＡを除去した後に、最終的な封入ｓｉＲＮＡと脂質の比を決定した。用量（ｍｇ／ｋｇ）に対する残存ＦＶＩＩ％を示す用量応答曲線を図９に示す。
実施例１８．式Ｉのカチオン性脂質のｐＫａ測定
式Ｉのカチオン性脂質のｐＫａを、水中では非蛍光性であるが、膜に結合したときに感知できるほどに蛍光性になる蛍光プローブである２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を用いて、本質的に記載されている通りに決定した（Ｅａｓｔｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：４２６２−４２６８）。カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／ＣＨ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０モル比）から構成された小胞を、２〜１１の範囲の様々なｐＨの緩衝液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４、１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に希釈して０．１ｍＭにした。この希釈した小胞にＴＮＳ水溶液（最終１μＭ）のアリコートを添加し、３０秒間の平衡化期間の後、ＴＮＳ含有溶液の蛍光を、それぞれ、３２１ｎｍおよび４４５ｎｍの励起波長および放出波長で測定した。測定された蛍光を溶液のｐＨに対してプロットし、データを市販のグラフ作成プログラムＩｇｏｒＰｒｏを用いてシグモイド曲線に対してフィッティングすることによって、カチオン性脂質含有小胞のｐＫａを決定した。式Ｉのカチオン性脂質のｐＫａ滴定曲線を図１０に示す。

Claims (18)

  1. 式Ｉのカチオン性脂質：
    または薬学的に許容されるその塩。
  2. 請求項１に記載のカチオン性脂質を含む脂質製剤。
  3. ４５〜６５％の式Ｉのカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、および０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２に記載の脂質製剤。
  4. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選択される、請求項３に記載の脂質製剤。
  5. 前記ステロールがコレステロールである、請求項３に記載の脂質製剤。
  6. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−Ｃ１４からＰＥＧ−Ｃ２２、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ １４ 、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ ２０、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥである、請求項３に記載の脂質製剤。
  7. 核酸を含む治療剤をさらに含む、請求項２に記載の脂質製剤。
  8. 前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、アンチマイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ阻害因子、マイクロＲＮＡ活性化因子、免疫抑制性核酸またはＵ１アダプターからなる群から選択される、請求項７に記載の脂質製剤。
  9. 核酸が、ｓｉＲＮＡであり、脂質：ｓｉＲＮＡの比が３〜１５である、請求項８に記載の脂質製剤。
  10. 少なくとも１種のアポリポタンパク質をさらに含む、請求項２に記載の脂質製剤。
  11. ターゲッティング脂質をさらに含む、請求項２に記載の脂質製剤。
  12. 前記ターゲッティング脂質がＮ−アセチルガラクトサミンを含む、請求項１１に記載の脂質製剤。
  13. 前記ターゲッティング脂質が、０．００１％〜５％のモル量で前記製剤中に存在する、請求項１１に記載の脂質製剤。
  14. 前記ターゲッティング脂質が、式ＩＩおよび式ＩＩＩ：
    からなる群から選択される化合物である、請求項１１に記載の脂質製剤。
  15. ５０％の式Ｉのカチオン性脂質、１０％の前記中性脂質、３８．５％の前記ステロール、および１．５％の前記ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項２に記載の脂質製剤。
  16. 請求項７に記載の脂質製剤を含む、治療剤を細胞に送達するための組成物。
  17. 前記治療剤がｄｓＲＮＡである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記治療剤が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムである、請求項１７に記載の組成物。
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