JP2021020928A - 標的化脂質 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸のインビボ送達に有利な標的化脂質およびこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。【解決手段】構造Ｌ１００−リンカー−Ｌ１０１（式中、Ｌ１００は、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｌ１０１は、リガンドまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−リガンドであり、ｐは、１〜１０００であり、かつｑは、１〜２０である。）の標的化脂質を提供する。さらに、本発明は、治療剤を細胞に送達するための組成物および方法を提供する。特に、これらは、核酸を効率的に封入し、封入された核酸をインビボで細胞に効率的に送達する新規の脂質および核酸−脂質粒子を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／９９２，３０９号（２００７年１２月４日出願）；米国仮特許出願第６１／０１３，５９７号（２００７年１２月１３日出願）；米国仮特許出願第６１／１２７，７５１号（２００８年５月１４日出願）；米国仮特許出願第６１／０９１，０９３号（２００８年８月２２日出願）；および米国仮特許出願第６１／０９７，２６１号（２００８年９月１６日出願）に対する優先権の利益を主張する。これらの先行出願の全ての内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
政府援助に関する記載
本明細書に記載される研究は、少なくとも一部は、国立アレルギー感染病研究所／国立衛生研究所／保健社会福祉省（ＮＩＡＩＤ／ＮＩＨ／ＤＨＨＳ）から与えられた契約番号ＨＨＳＮ２６６２００６０００１２Ｃ、ならびに国防総省および防衛威嚇緩和機関（ＤＯＤ／ＤＴＲＡ）から与えられた契約番号ＨＤＴＲＡ−１−０７−Ｃ−００８２の下での米国政府資金を用いてなされたものである。したがって、政府は本発明における一定の権利を有し得る。
本発明は、脂質粒子を用いた治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、核酸のインビボ送達に有利な標的化脂質およびこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を作製する方法、および例えば、さまざまな疾患状態の治療のために、これらの組成物を用いて核酸を細胞に導入する方法を提供する。
オリゴヌクレオチド化合物は、医学において重要な治療用途を有する。特定の疾患の原因となる遺伝子をサイレンシングするためにオリゴヌクレオチドを用いることができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳を阻害することによってタンパク質の生成を妨げる。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾患と関連するタンパク質の機能を阻害する従来型の小有機化合物に取って代わるものとして有望視されている。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の生成を妨げるオリゴヌクレオチドである。
ＲＮＡ干渉、すなわち「ＲＮＡｉ」は、線虫に導入されたときに、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を阻止することができるという観察を説明するために、Ｆｉｒｅおよび同僚らが最初に作り出した用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む、多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導くものであり、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを壊す配列特異的な多成分ヌクレアーゼである、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって仲介される。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を含有することが知られているが、この活性のタンパク質成分はまだ分かっていない。
ｓｉＲＮＡ化合物は、種々の診断目的および治療目的に有望な薬剤である。ｓｉＲＮＡ化合物は、遺伝子の機能を同定するために用いることができる。さらに、ｓｉＲＮＡ化合物は、疾患を引き起こす遺伝子をサイレンシングすることによって作用する新しいタイプの医薬品として大きな可能性を提供する。中枢神経系疾患、炎症性疾患、代謝障害、腫瘍、感染性疾患、および眼疾患を含む多くの疾患を治療するための干渉ＲＮＡ治療剤を開発する研究が現在進行中である。
ｓｉＲＮＡは、潜在的な抗ウイルス治療薬として極めて有効であることが示されており、最近多くの例が公表されている。ウイルスゲノム中の標的に対して向けられるｓｉＲＮＡ分子は、インフルエンザ（非特許文献２〜４）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（非特許文献５）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（非特許文献６）、Ｃ型肝炎ウイルス（非特許文献７〜８）、およびＳＡＲＳコロナウイルス（非特許文献９）の動物モデルにおいて、ウイルス力価を数桁、飛躍的に低下させる。
アンチセンス法とは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのような細胞内核酸の正常な必須機能（例えば、タンパク質合成）が妨げられるような、比較的短いオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡまたはＤＮＡへの相補的なハイブリダイゼーションのことである。ハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリック塩基対を介したＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドの配列特異的な水素結合である。このような塩基対を互いに相補的であると言う。
Ｃｏｈｅｎ（非特許文献１０）によって論じられている、標的配列の発現レベルを変化させる天然に存在する事象には、２つの種類があると考えられる。第一の、ハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が、標的核酸に結合し、その結果、単なる立体障害によって、必須タンパク質（ほとんどの場合、リボソーム）の核酸への結合が妨げられる終結事象を説明するものである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列の発現レベルを変化させるもう１つの手段は、標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションと、それに続く細胞内ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの酵素的切断によるものである。２'−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的ＲＮＡとハイブリダイズし、この二重鎖がＲＮアーゼＨ酵素を活性化して、ＲＮＡ鎖を切断し、それによって、このＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この種のアンチセンス終結事象によって作用するアンチセンス薬剤の最も著明な例である。
これらのおよび他の核酸をベースにした治療を使用する機会は大いに有望であり、現在の伝統的な医学では対処できない医学的問題の解決策を提供する。増々多くの疾患関連遺伝子の場所と配列が同定されつつあり、種々の疾患についての核酸をベースにした治療法の臨床試験が、現在進行中である。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の治療薬としての適用の進歩にも関わらず、改善された薬理学的特性を有するオリゴヌクレオチドが必要とされている。核酸およびオリゴヌクレオチドの膜貫通送達の改善に向けた努力において、タンパク質担体、抗体担体、リポソーム性送達系、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、ウイルスベクター、およびリン酸カルシウムを介する形質転換が利用されている。しかしながら、これらの技術の多くは、膜貫通輸送が可能な細胞の種類と、このような輸送を達成するのに必要な条件とによって限定される。
効果の改善を試みようとして、研究者らは、化学修飾された治療的核酸または未修飾の治療的核酸を送達するために、脂質をベースにした担体系も利用している。非特許文献１１において、著者らは、アニオン性（従来型）のリポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポソーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体の使用に言及している。同様に、ｓｉＲＮＡは、カチオン性リポソーム中で全身投与されており、これらの核酸−脂質粒子がヒト以外の霊長類を含む哺乳類における標的タンパク質の下方調節を改善することが報告されている（非特許文献１２）。
こうした進歩にもかかわらず、一般的な治療的使用に好適な改善された脂質−治療的核酸組成物が当技術分野で依然として必要とされている。これらの組成物は、高効率で核酸を封入し、高い薬物：脂質比を有し、封入された核酸を血清中の分解とクリアランスから保護し、全身送達に好適であり、封入された核酸の細胞内送達を提供することが好ましいであろう。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、核酸の有効用量での患者治療が重大な毒性および／または患者へのリスクを伴わないように、良好な忍容性があり、かつ十分な治療指数を提供するべきである。本発明は、このような組成物、これらの組成物を作製する方法、および疾患の治療の目的を含めて、これらの組成物を用いて核酸を細胞に導入する方法を提供する。
Ｆｉｒｅら（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１ ２〜Ｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：８６７６−８６８１（２００４） Ｔｏｍｐｋｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：８６８２−８６８６（２００４） Ｔｈｏｍａｓら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４９５−５０５（２００５） Ｂｉｔｋｏら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５（２００５） Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−１００７（２００５） Ｋａｐａｄｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２０１４−２０１８（２００３） Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２７８３−２７８８（２００３） Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：９４４−９５１（２００５） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ． Ｚｅｌｐｈａｔｉ，ＯおよびＳｚｏｋａ，Ｆ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．４１：９９−１１９（１９９６） Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４（２００６）
本発明は、核酸のインビボ送達に有利な標的化脂質およびこれらの脂質を含む脂質粒子、ならびにインビボでの治療的使用に好適な核酸−脂質粒子組成物を提供する。
本発明は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する標的化脂質を提供する：
Figure 2021020928
 式中、
ＬＡは、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、ペプチドから選択されるリガンドであるか、または下記式ＩＩ〜Ｖ：
Figure 2021020928
 に示す構造を有し；
ｑ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；
Ｐ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、およびＴ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ＣＨ２Ｓ、尿素、ヘテロ環、ヘテロアリール、
Figure 2021020928
 であり；
Ｑ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、およびＱ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ’’）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
ＬＢは、親油性物質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、セラミドからなる群から選択されるリガンドであるか、または下記式（ＶＩ）：
Figure 2021020928
 の構造を有し；
Ｒ、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６、Ｒ６Ａ、およびＲ６Ｂは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、またはペプチドであり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＲ１０Ｒ２０、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであるか；あるいは、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立にハロゲンであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｒ１０およびＲ２０は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂは、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に１つ以上の置換基で置換されており；
ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０であり；
ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、１〜２０であり；かつ
ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０である。
ｑ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃのいずれかが１よりも大きいとき、繰り返し単位は、互いに同じであることも、または異なることもあり、例えば、ｑが３であるとき、単位−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］ｑ−は、−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−に拡大され、この−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−単位の全てが、同じであることも、互いに全く異なることも、またはこれらの混合であることもある。
本発明はさらに、脂質粒子および薬学的組成物を調製する方法、ならびにこれらの脂質粒子および薬学的組成物を調製する際に有用なキットを含む。本方法は、薬剤、例えば、選択された標的遺伝子（例えば、肝臓で発現する遺伝子）を標的とするオリゴヌクレオチドをベースにしたコンストラクトと標的化脂質とを含む組成物を提供する工程；および組成物を被検対象（例えば、動物）に投与する工程；それによって、標的遺伝子の発現を評価することにより、薬剤と標的化脂質を評価する工程を含む。
標的化リガンドを用いた標的送達の概略図。 コンジュゲートされた治療剤とともに標的化リガンドを用いる標的送達の概略図。 テザーで隔てられた１つ以上の標的化部分Ｒを用いるポリマー薬物送達系の模式図。ＸとＹは、スキャフォールド／テザーとテザー／リガンド間の化学的結合を示す。Ｒ’および／またはＲ’’は、標的化基、融合基、エンドソーム放出基、疎水性／親水性バランサー（例えば、さまざまな長さの飽和アルキルもしくは不飽和アルキル）、またはさまざまな長さのＰＥＧ、またはＰＥＧのような循環促進剤、ＰＫ調節因子のいずれかである。 テザーと結合Ｚ（生体切断可能であるかまたは安定である）を介してポリマー骨格にコンジュゲートされた治療剤コンジュゲートを用いるポリマー薬物送達系の概略図。 標的化部分を有するｐＨ感受性脂質。 カチオン性脂質−葉酸コンジュゲート。 脂質−葉酸コンジュゲート。 標的送達のための葉酸コンジュゲート脂質、ＰＥＧ−脂質、および送達系。 標的送達のための葉酸コンジュゲート脂質、ＰＥＧ−脂質、および送達系。 葉酸コンジュゲートの合成。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。 本発明のＰＥＧ−脂質の模式図。
一態様では、本発明は、下記式（ＣＩ）に示す構造を有する標的化脂質モノマーを提供する。
Figure 2021020928
 式中、
Ｌ１００は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ１０１は、それぞれ存在ごとに独立して、リガンドまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−リガンドであり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
一実施形態では、標的化脂質モノマーは、下記式（ＣＩＩ）に示す構造を有する。
Figure 2021020928
 式中、
Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ３、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ−Ｓ、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−Ｓ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ−、
Figure 2021020928
 ヘテロ環、またはヘテロアリールであり；
Ｌ１００は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ１０１は、それぞれ存在ごとに独立して、リガンドまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−リガンドであり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
一実施形態では、標的化脂質モノマーは、下記式（ＣＩＩＩ）に示す構造を有する。
Figure 2021020928
 式中、
Ｌ１００は、Ｌ１１２、
Figure 2021020928
 であり；
Ｒ１００は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−Ｓ−、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ヘテロアリール、ヘテロ環、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ１１１は、Ｌ１１３、Ｌ１１４、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ１１２は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ１１３は、それぞれ存在ごとに独立して、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−Ｌ１１４であり；
Ｌ１１４は、それぞれ存在ごとに独立して、リガンド、−Ｃ（Ｏ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−リガンド、−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−リガンド、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−リガンド、−Ｓ−Ｓ−リガンド、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−リガンド、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−リガンド、−Ｃ＝Ｎ−Ｏ−リガンド、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｈ）−リガンド、ヘテロ環−リガンド、ヘテロアリール−リガンド、
Figure 2021020928
 であり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
一実施形態では、Ｌ１１０は、
Figure 2021020928
 からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｌ１１１は、
Figure 2021020928
 からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｌ１１２は、アルキル、例えば、Ｃ５−Ｃ３１アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１８アルキルである。
一実施形態では、Ｌ１１２は、アルケニル、例えば、Ｃ５−Ｃ３１アルケニル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルケニル、例えば、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルケニルである。一実施形態では、Ｌ１１２は、少なくとも１つの二重結合を含む。
一実施形態では、Ｌ１１２は、アルキニル、例えば、Ｃ５−Ｃ３１アルキニル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキニル、例えば、Ｃ１４アルキニル、Ｃ１５アルキニル、Ｃ１６アルキニル、Ｃ１７アルキニル、Ｃ１８アルキニルである。一実施形態では、Ｌ１１２は、少なくとも１つの三重結合を含む。一実施形態では、Ｌ１１２は、少なくとも１つの二重結合と少なくとも１つの三重結合とを含む。
一実施形態では、Ｌ１１２は、少なくとも１つの二重結合、例えば、Ｅ配置またはＺ配置の二重結合を含む。
一実施形態では、Ｌ１１２は、２つの二重結合を含む。一実施形態では、少なくとも１つの二重結合がＺ配置を有する。一実施形態では、両方の二重結合がＺ配置を有する。一実施形態では、少なくとも１つの二重結合がＥ配置を有する。一実施形態では、両方の二重結合がＥ配置を有する。
一実施形態では、Ｌ１１２は、３つの二重結合を含む。一実施形態では、少なくとも１つの二重結合がＺ配置を有する。一実施形態では、２つの二重結合がＺ配置を有する。一実施形態では、３つ全ての二重結合がＺ配置を有する。一実施形態では、少なくとも１つの二重結合がＥ配置を有する。一実施形態では、２つの二重結合がＥ配置を有する。一実施形態では、３つ全ての二重結合がＥ配置を有する。
一実施形態では、Ｌ１１２は、コレステロールである。
一実施形態では、Ｌ１１２は、
Figure 2021020928
 である。
一実施形態では、Ｌ１１４は、標的化リガンド、例えば、葉酸、糖質である。
一実施形態では、Ｌ１１４は、式（ＩＩ）〜（Ｖ）に示す構造を有する。
一実施形態では、Ｌ１１４は、図８に示す群から選択される。
一実施形態では、Ｌ１１４は、
Figure 2021020928
 からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｌ１１０が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１０はラセミ混合物である。
一実施形態では、Ｌ１１０が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１０は、Ｒ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、Ｌ１１０は、エナンチオマー的に純粋な「Ｒ」異性体である。
一実施形態では、Ｌ１１０が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１０は、Ｓ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、Ｌ１１０は、エナンチオマー的に純粋な「Ｓ」異性体である。
一実施形態では、Ｌ１１１が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１１はラセミ混合物である。
一実施形態では、Ｌ１１１が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１１は、Ｒ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、Ｌ１１１は、エナンチオマー的に純粋な「Ｒ」異性体である。
一実施形態では、Ｌ１１１が、
Figure 2021020928
 からなる群から選択されるとき、Ｌ１１１は、Ｓ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、Ｌ１１１は、エナンチオマー的に純粋な「Ｓ」異性体である。
一態様では、本発明は、下記式（ＣＩＶ）で示す構造を有する脂質モノマーである
Figure 2021020928
 式中、
Ｌ２１０は、Ｌ２１２、
Figure 2021020928
 であり；
Ｒ２００は、それぞれ存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−Ｓ−、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ヘテロアリール、ヘテロ環、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ２１１は、Ｌ２１３、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ２１２は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ２１３は、それぞれ存在ごとに独立して、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−Ｌ２１４であり；
Ｌ２１４は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、−ＳＨ、−ＳＣＨ３、−Ｎ３、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、または
Figure 2021020928
 であり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
一実施形態では、Ｌ２１０は、
Figure 2021020928
 からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｌ２１１は、
Figure 2021020928
 からなる群から選択される。
一態様では、本発明は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する標的化脂質を提供する：
Figure 2021020928
 式中、
ＬＡは、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、ペプチドから選択されるリガンドであるか、または下記式ＩＩ〜Ｖ：
Figure 2021020928
 に示す構造を有し；
ｑ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；
Ｐ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、およびＴ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ＣＨ２Ｓ、尿素、ヘテロ環、ヘテロアリール、
Figure 2021020928
 であり；
Ｑ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、およびＱ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ’’）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
ＬＢは、親油性物質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、セラミドからなる群から選択されるリガンドであるか、または下記式（ＶＩ）：
Figure 2021020928
 の構造を有し；
Ｒ、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６、Ｒ６Ａ、およびＲ６Ｂは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、またはペプチドであり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＲ１０Ｒ２０、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｒ１０およびＲ２０は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂは、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に１つ以上の置換基で置換されており；
ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０であり；
ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、１〜２０であり；かつ
ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０である。
ｑ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃのいずれかが１よりも大きいとき、反復単位は、互いに同じであることも、または異なることもあり、例えば、ｑが３であるとき、単位−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］ｑ−は、−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−に拡大され、この−［Ｐ−Ｑ−Ｒ］−単位の全てが、同じであることも、互いに全く異なることも、またはこれらの混合であることもある。
親油性部分は、例えば、脂質、コレステロール、オレイル残基、リノレオイル基、ラウロイル残基、ドコシニル残基、ステアロイル残基、レチニル残基、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、または胆汁酸からなる群から選択することができる。好ましい親油性部分はコレステロールである。
一実施形態では、ＬＡは、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンであるか、または式Ｖに示す構造を有する。好ましい実施形態では、ＬＡは、マンノースである。一実施形態では、ＬＡは、式Ｖに示す構造を有する。
一実施形態では、ＬＡは、
Figure 2021020928
 である。
一実施形態では、ＬＡは、
Figure 2021020928
 である。
一実施形態では、Ｌ２ＡとＬ２Ｂは両方とも同じである。
一実施形態では、Ｌ２ＡとＬ２Ｂは両方とも異なっている。
一実施形態では、Ｌ３ＡとＬ３Ｂは両方とも同じである。
一実施形態では、Ｌ３ＡとＬ３Ｂは両方とも異なっている。
一実施形態では、Ｌ４ＡとＬ４Ｂは両方とも同じである。
一実施形態では、Ｌ４ＡとＬ４Ｂは両方とも異なっている。
一実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５ＢとＬ５Ｃは全て同じである。
一実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５ＢとＬ５Ｃのうちの２つが同じである。
一実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５Ｂが同じで、Ｌ５Ｃが異なっている。
一実施形態では、Ｌ５ＡとＬ５Ｃが同じで、Ｌ５Ｂが異なっている。
一実施形態では、Ｌ５ＢとＬ５Ｃが同じで、Ｌ５Ａが異なっている。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方とも同じである。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方とも異なっている。
一実施形態では、Ｒ６ＡとＲ６Ｂは各々、Ｏ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、またはＮＲ’である。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、独立して、アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキルである。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方とも、アルキル、例えば、同じ長さを有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ６−Ｃ２８アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ１８アルキル、例えば、Ｃ１４アルキルまたはＣ１６アルキルである。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方ともＣ１４アルキルである。
一実施形態では、式ＶＩは、ラセミ混合物を表す。
一実施形態では、式ＶＩの化合物は、Ｒ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、式ＶＩは、エナンチオマー的に純粋な「Ｒ」異性体を表す。
一実施形態では、式ＶＩの化合物は、Ｓ異性体のエナンチオマー過剰（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）である。一実施形態では、式ＶＩは、エナンチオマー的に純粋な「Ｓ」異性体を表す。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、独立して、アルケニルであり、例えば、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、独立して、Ｃ６−Ｃ３０アルケニルであるか、またはＬ６ＡとＬ６Ｂは各々、同じアルケニル部分である。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、１つの二重結合、例えば、Ｅ配置またはＺ配置の二重結合を含む。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、２つの二重結合部分を含む。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも１つがＺ配置を有する。一実施形態では、これらの二重結合が両方ともＺ配置を有する。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂのうちの少なくとも１つは、下記式（ＶＩＩ）で示される。
Figure 2021020928
 式中、
ｘは１〜８の整数であり；かつ
ｙは１〜１０の整数である。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方とも、式（ＶＩＩ）のものである。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも１つがＥ配置を有し、例えば、これらの二重結合が両方ともＥ配置を有する。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂのうちの少なくとも１つは、下記式（ＶＩＩＩ）で示される。
Figure 2021020928
 式中、
ｘは１〜８の整数であり；かつ
ｙは１〜１０の整数である。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは各々、３つの二重結合部分を含む。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも１つがＺ配置を有する。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも２つがＺ配置を有する。一実施形態では、これらの二重結合が全て、Ｚ配置を有する。一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂのうちの少なくとも１つは、下記式（ＩＸ）で示される。
Figure 2021020928
 式中、
ｘは１〜８の整数であり；かつ
ｙは１〜１０の整数である。
一実施形態では、Ｌ６ＡとＬ６Ｂは両方とも、式（ＩＸ）で示されるものである。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも１つはＥ配置を有する。一実施形態では、これらの二重結合のうちの少なくとも２つはＥ配置を有する。一実施形態では、これらの二重結合は全てＥ配置を有する。一実施形態ではＬ６ＡとＬ６Ｂのうちの少なくとも１つは、下記式（Ｘ）で示される。
Figure 2021020928
 式中、
ｘは１〜８の整数であり；かつ
ｙは１〜１０の整数である。
一実施形態では、ＬＢは、
Figure 2021020928
 である。
一実施形態では、ＬＢは、ジアシルグリセロール、ジステアリルグリセロール、ジパルミトイルグリセロール、ジミリストイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、または他のジアシル／ステリル疎水性基からなる群から選択される。
一実施形態では、ＬＢは、
Figure 2021020928
 である。
好ましい一実施形態では、ＬＢは、
Figure 2021020928
 である。
別の好ましい実施形態では、ＬＢは、
Figure 2021020928
 である。
好ましい一実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
別の好ましい実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
好ましい一実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
別の好ましい実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
好ましい一実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
別の好ましい実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
好ましい一実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
別の好ましい実施形態では、式Ｉは、構造
Figure 2021020928
 を有する。
一態様では、本発明は、下記式（ＶＩＩ）で示す構造を有する標的化脂質モノマーを特色とする。
Figure 2021020928
 式中、Ｒ３００はリガンドである。
一態様では、本発明は、下記式（ＶＩＩＩ）〜（ＸＶ）の標的化脂質を特色とする。
Figure 2021020928
Figure 2021020928
 式中、Ｒ３００はリガンドであり；ｎは０〜２０であり；かつ
ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、カルバメート結合、ウレタン結合、生体切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド、エステル、アミド）、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、アセタール／ケタール、オルトエステル、ＣＤＭ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７，１０４（３２），１２９８２−１２９８７）参照）ペプチダーゼ感受性ペプチド、ホスフェート、アジドおよびアルキン由来のトリアゾール結合、ならびに／またはこれらの組合せである。
一実施形態では、Ｒは、式（ＩＩ）〜（Ｖ）に示す構造を有する。
一実施形態では、Ｒは、図８に示す群から選択される。
一実施形態では、Ｒは、
Figure 2021020928
 式中、ｘは、エーテル結合、チオエーテル結合、カルバメート結合、ウレタン結合、生体切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド、エステル、アミド）、ｐＨ感受性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、アセタール／ケタール、オルトエステル、ＣＤＭ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７，１０４（３２），１２９８２−１２９８７）参照）、ペプチダーゼ感受性ペプチド、ホスフェート、アジドおよびアルキン由来のトリアゾール結合、ならびに／またはこれらの組合せである。）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、表１の化合物を提供する。
Figure 2021020928
一態様では、本発明は、標的化リガンドとコンジュゲートした薬物送達系を提供する。
薬物送達系（本明細書では「薬物送達スキャフォールド」とも呼ばれる）は、ポリマー性のスキャフォールドをベースにすることができる。ポリマー性の送達系は、エンドソーム放出剤を含むかまたはこれを含まない、水溶性、生体適合性、生物分解性、ｐＨ感受性、カチオン性、アニオン性、中性、親水性、疎水性で、線状または分岐状のポリマー、デンドリマーを含む。ポリマーは、ポリアニオン性もしくはポリカチオン性のポリマーのｐＨ感受性マスキング、ペプチド、多糖、単糖、ポリグリシドールも含む。ポリマーと標的化部分の間のテザーおよび結合は、本明細書に記載される脂質−リガンドコンジュゲートのテザーおよび結合と同一または同様である。
一実施形態では、薬物送達系は、この送達系のＰＫ特性を調節することができる部分とコンジュゲートまたは会合している。
一実施形態では、薬物送達系は、エンドソーム放出剤とコンジュゲートまたは会合している。
一実施形態では、薬物送達系は、エンドソーム放出剤およびこの送達系のＰＫ特性を調節することができる部分とコンジュゲートまたは会合している。
一実施形態では、薬物送達系を標的化部分に結合するテザー／リンカーは、エンドソーム放出剤とコンジュゲートまたは会合している。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリイミダゾールもしくはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスキングされたオリゴカチオンもしくはマスキングされたポリカチオン、もしくはマスキングされたオリゴアニオンもしくはマスキングされたポリアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、および／またはオルトエステルが挙げられる。
一態様では、薬物送達系は、リポソーム製剤、サーファクタント製剤、ミセル製剤、膜性製剤、ナノ粒子、エマルジョン、ナノエマルジョンおよびマイクロエマルジョン、イントラリピッド、大豆をベースにした製剤、大豆脂肪油、脂肪油をベースにしたもの、魚油（オメガ−３）、抗体、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、ならびに乾燥粉末製剤に基づく。
好ましい実施形態では、リポソームは、カチオン性、アニオン性、または中性である。
好ましい実施形態では、サーファクタントは、カチオン性、アニオン性、または中性である。
腎臓は、近位尿細管細胞に集中した高親和性の葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）を含有する（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８０．２３７−２８４，１９９８））。それゆえに、核酸治療剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンタゴｍｉｒ）を、本発明の標的送達アプローチを用いた核酸治療薬の標的送達によって、腎臓に標的することができる。
本発明における薬物は、核酸治療薬またはｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、プラスミド、デコイＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、アンチセンスマイクロＲＮＡ、スプライス調節オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ活性化オリゴヌクレオチドなど）である。薬物は、送達系とコンジュゲートしているかまたは送達系ととともに製剤化されているかのどちらかである。いくつかの実施形態では、薬物は、標的化部分を送達系に結合させるテザー／リンカーとコンジュゲートしている。
さらなる態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、本明細書で記載される薬物送達系とともに製剤化されているかまたは本明細書で記載される薬物送達系とコンジュゲートしている、本明細書で定義される薬物を投与する工程を含む。
一態様では、本発明は、本明細書に記載される薬物送達系とともに製剤化されているかまたは本明細書に記載される薬物送達系とコンジュゲートしている核酸および薬学的に許容される担体を有する薬学的組成物を特色とする。
さらなる関連実施形態では、本発明は、１つ以上の上記の本発明の脂質を含む脂質粒子を含む。ある実施形態では、粒子は、本明細書で記載される標的化脂質、カチオン性脂質、中性脂質、および粒子の凝集を低下させることができる脂質をさらに含む。特定の一実施形態では、脂質粒子は、標的化脂質約０．５〜５０％：カチオン性脂質２０〜６０％：中性脂質５〜２５％：コレステロール２５〜５５％：ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ ０．５〜１５％というモル比の（ｉ）標的化脂質、（ｉｉ）アミノ脂質、（ｉｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｖ）コレステロール；ならびに（ｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡから本質的になる。
葉酸
本明細書で使用される場合、「葉酸」という用語は、葉酸、ならびにプテロイン酸誘導体およびプテロイン酸類似体を含む、葉酸誘導体を指すことを意味する。本発明で使用するのに好適な葉酸の類似体および誘導体としては、葉酸拮抗薬、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、テトラヒドロプテリン、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、１−デザ（ｄｅｚａ）葉酸、３−デアザ葉酸、５−デアザ葉酸、８−デアザ葉酸、１０−デアザ葉酸、１，５−デアザ葉酸、５，１０−ジデアザ葉酸、８，１０−ジデアザ葉酸、および５，８−ジデアザ葉酸、葉酸拮抗薬、ならびにプテロイン酸誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる葉酸類似体は、公開されている米国公開ＵＳ第２００４／０，２４２，５８２号（２００４年１２月２日公開）に記載されている。
脂質／親油性物質
「脂質」および「親油性物質」という用語は、任意の脂溶性分子（例えば、脂肪、油、ワックス、テルペン、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、Ａ、Ｄ、Ｅ、およびＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、脂肪酸、ホパノイド、およびリン脂質）を指す。例示的な親油性分子としては、コレステロール、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ノルエチンドフロン（ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｆｒｏｎｅ）、コルチゾン、コール酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、コレン酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、ラウリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アルキドン酸（ａｒｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ロイコトリエンＡ、ミルセン、ゲラニオール、カルボン、菊酸、ネペタラクトン、メントフラン、α−ピネン、カンファー、ファルネソール、フムレン、ナギオン（ｎａｇｉｏｎｅ）、カリオフィレン、アビエチン酸、ラノステロール、およびスクワレン、カンペステロール、シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、ブラッシンステロール（ｂｒａｓｓｉｎｓｔｅｒｏｌ）、ジステアリル−リトコールアミド、ボルネオール、メントール、ヘプタデシル基、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、ならびに胆汁酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、遊離酸（例えば、遊離脂肪酸、例えば、パルミチン酸）などの親油性部分を説明する用語は、ラジカルを表す用語（例えば、パルミトイル）と互換的に使用される。
糖質
本明細書で使用される場合、「糖質」とは、少なくとも６個の炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（線状、分岐状、もしくは環状であり得る）から構成され、各々の炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合しているそれ自体が糖質である化合物か、または各々が少なくとも６個の炭素原子を有する１つ以上の単糖単位（線状、分岐状、もしくは環状であり得る）から構成され、各々の炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合している糖質部分をその一部として有する化合物のいずれかを指す。代表的な糖質には、糖類（単糖、二糖、三糖、および約４〜９個の単糖単位を含有するオリゴ糖）、ならびに多糖類（例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖ゴム）が含まれる。具体的な単糖には、Ｃ５以上（好ましくはＣ５〜Ｃ８）の糖；二糖および三糖には、２つまたは３つの単糖単位（好ましくはＣ５〜Ｃ８）を有する糖が含まれる。
「単糖」という用語は、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノス−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロースの基を含む。単糖は、Ｄ体またはＬ体であることができる。単糖はさらに、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環状形態の環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子の水素を炭素で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などであってもよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換することができるということが理解される。
「二糖」、「三糖」、および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどの基を含む。さらに、「二糖」、「三糖」、および「多糖」などは、さらに置換することができるということが理解される。二糖には、アミノ糖およびその誘導体、特に、Ｃ−４'位で誘導体化されたミカミノースまたはＣ−６'位で誘導体化された４デオキシ−３−アミノグルコースも含まれる。
リガンド
多種多様な実体を、本発明によるコンジュゲーションのためのリガンドとして使用することができる。好ましい部分は、介在テザーを介して直接的にかまたは間接的にかのいずれかで、好ましくは共有結合的に連結されるリガンドである。
好ましい実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる分子の分布、標的化、または寿命を改変する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドがない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞、もしくは細胞型、区画（例えば、細胞区画もしくは器官区画）、組織、器官、または身体領域）に対する親和性を増強する。選択された標的に対する親和性を増強するリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
いくつかのリガンドは、エンドソーム溶解特性を有することができる。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存的な膜活性および融合性を示すポリアニオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ある実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームｐＨで活性のある立体構造をとる。「活性のある」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドには、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が含まれる。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化することになる化学基（例えば、アミノ酸）を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状であってもまたは分岐状であってもよい。ペプチドをベースにしたエンドソーム溶解リガンドの例示的な一次配列を表２に示す。
Figure 2021020928
リガンドは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性特性を改善することができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善することもある。
一般的に、リガンドは、例えば、取込みを増強するための、治療的修飾物質；例えば、分布をモニターするための、診断的化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含むことができる。一般例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物が挙げられる。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メトアクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤（例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質（例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体））を挙げることもできる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化されたポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＳＧペプチド、ＲＳＧペプチド模倣体、またはアプタマーであることができる。表３に、標的化リガンドとその関連受容体のいくつかの例を示す。
Figure 2021020928
リガンドの他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、またはペプチド（例えば、共リガンドに対する特異的な親和性を有する分子）、または抗体（例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体）であることができる。リガンドには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。リガンドには、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーなどの非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーター、またはＮＦ−κＢのアクチベーターであることができる。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって（例えば、細胞の微小管、微小フィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって）、コンジュゲートの細胞内への取込みを増大させる物質、例えば、薬物であることができる。薬物は、例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであることができる。
リガンドは、例えば、炎症性応答を活性化することによって、コンジュゲートの細胞内への取込みを増大させることができる。このような効果を有すると考えられる例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質または脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが標的組織（例えば、身体の腎臓以外の標的組織）に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であることができる。ＨＳＡに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
脂質をベースにしたリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節（例えば、制御）するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質をベースにしたリガンドは、腎臓に標的される可能性が低く、したがって、身体から排出される可能性が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質をベースにしたリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的するために使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡに結合する。コンジュゲートが好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で、脂質をベースにしたリガンドがＨＳＡに結合することが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合を取り消すことができないほど強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布するように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分を、脂質をベースにしたリガンドの代わりにまたは脂質をベースにしたリガンドに加えて、使用することもできる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞（例えば、増殖細胞）によって取り込まれる部分（例えば、ビタミン）である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型（例えば、癌細胞）の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンＢ（例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール）、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。この薬剤は両親媒性であることが好ましい。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。この薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、ペプチジル模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチド結合または偽ペプチド結合が含まれ、Ｄ−アミノ酸を使用することもできる。ヘリックス剤は、好ましくは親油性相と疎油性相とを有するアルファヘリックス剤であることが好ましい。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であることができる。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の明確な３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約５〜５０アミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸であることができる（例えば、表４参照）。
Figure 2021020928
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅからなる）疎水性ペプチドであることができる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであることができる。別の代替において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。ＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）を含有する疎水性ＭＴＳも標的化部分であることができる。ペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであることができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）に由来する配列は、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされることができる（Ｌａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣物などの細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を増大させるための、構造的修飾を有することができる。下記の任意の構造的修飾を利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、種々の他の組織の腫瘍へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓への標的化を促進することが好ましい。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であることができ、かつ修飾する（例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化する）ことができる。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡを送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒら，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
増殖細胞に濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、ＩｖＪ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。このように、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、Ｉｖ−Ｊ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子（例えば、本明細書に記載される癌遺伝子）を標的とするリガンドであるこの種のリガンドの好ましいコンジュゲート。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞（例えば、細菌細胞または真菌細胞）、または哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−ヘリックス線状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、またはわずか１種または２種のアミノ酸を主に含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であることができる。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２つの部分からなる両親媒性ペプチドであることができる（Ｓｉｍｅｏｎｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３））。
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであることができる。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）のペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘリックスの安定性を完全に維持するために、多くの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、ヘリックス安定化残基を最大数利用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、ヘリックス不安定化残基を最小数利用する（例えばプロリン、または環状モノマー単位）。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基であり、かつ／またはヘリックスを安定化するための余分なＨ結合を与えるために、Ｃ末端アミド化を用いることができる）。ｉ±３位、またはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定化をもたらすこともできる。例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基である、グルタミン酸またはアスパラギン酸と、塩架橋を形成することができる。
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドには、天然ペプチドもしくは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバメート結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド（すなわち、ペプチド）結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが含まれる。
標的化リガンドは、特異的な受容体を標的とすることができる任意のリガンドであることができる。例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖のクラスター（例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター）、またはアプタマーがある。クラスターは、２つ以上の糖単位の組合せである。標的化リガンドには、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドも含まれる。リガンドは、核酸をベースにしたもの、例えば、アプタマーであることもできる。アプタマーは、未修飾であることができ、または本明細書で開示される修飾の任意の組合せを有することができる。
エンドソーム放出剤には、イミダゾール、ポリイミダゾールもしくはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスキングされたオリゴカチオンもしくはマスキングされたポリカチオン、またはマスキングされたオリゴアニオンもしくはマスキングされたポリアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスキングされているかもしくはマスキングされていないカチオン性電荷もしくはアニオン性電荷を有するポリマー、マスキングされているかもしくはマスキングされていないカチオン性電荷もしくはアニオン性電荷を有するデンドリマーが含まれる。
ＰＫ調節物質とは、薬物動態調節物質を意味する。ＰＫ調節物質には、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例示的なＰＫ調節物質としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、このため、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含む短いオリゴヌクレオチド（例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチド）も、リガンド（例えば、ＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。
さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適している。
本発明に適している他のリガンドは、同時係属出願である米国特許出願第１０／９１６，１８５号（２００４年８月１０日出願）；同第１０／９４６，８７３号（２００４年９月２１日出願）；同第１０／８３３，９３４号（２００７年８月３日出願）；同第１１／１１５，９８９号（２００５年４月２７日出願）および；同第１１／９４４，２２７号（２００７年１１月２１日出願）の各明細書に記載されており、これらは、全ての目的のために、その全体が参照により組み入れられる。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全てが同じ特性を有することも、全てが異なる特性を有することも、またはあるリガンドが同じ特性を有すると同時に、他のリガンドが異なる特性を有することもある。例えば、リガンドは、標的化特性を有することも、エンドソーム溶解活性を有することも、またはＰＫ調節特性を有することもある。好ましい実施形態では、リガンドが全て、異なる特性を有する。
リンカー／テザー
「リンカー」および「テザー」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分である。リンカーは、典型的には、直接的な結合、または原子、例えば、酸素もしくは窒素、単位、例えば、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、または原子鎖、例えば、置換アルキルもしくは非置換アルキル、置換アルケニルもしくは非置換アルケニル、置換アルキニルもしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールを含み、この場合、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な結合基、置換アリールまたは非置換アリール、置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロアリール、置換複素環または非置換複素環によって中断または終結され得る（式中、Ｒ１は、水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である）。
一実施形態では、リンカー／テザー（下線）には、−（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−；−ＮＲ’’’’（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）−；−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−；−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−（ＣＨ ２ ） ｎ −；−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ（Ｒ’’’）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）−ＳＳ−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ（Ｒ’’’）ＮＨ−；−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＳＳ−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＣＨ（Ｒ’’’）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ（Ｒ’’’）ＮＨ−；−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）−ＳＳ−（ＣＨ ２ ） ｎ −が含まれる（式中、各ｎは、独立して、１〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、イソＰｒ、Ｂｕ、Ｂｎ）またはＮ（ジアルキル＝Ｍｅ２、Ｅｔ２、Ｂｎ２）であり；Ｒ’’’は、Ｈ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＮＭｅ２、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＯＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＳＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨＭｅ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＨ、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＮＨ２、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＣＨ３、ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＣＯＯＨ、またはＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｊＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＳＨであり；かつＲ’’’’は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ｊおよびｋは、それぞれ独立して、０〜２０である）。好ましくは、ｎは、２、５、６、または１１である。他の実施形態では、窒素は、末端オキシアミノ基（例えば、−ＯＮＨ２）、またはヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）の一部を形成し得る。リンカー／テザーは、随意的に、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、パーハロアルキルで置換されていてもよく、かつ／または随意的に、１つ以上の追加のヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、もしくはＳが挿入されていてもよい。
ある実施形態では、リンカーは、分岐状リンカーである。分岐状リンカーの分岐点は、少なくとも三価であり得るが、四価、五価、もしくは六価の原子、またはこのような複数の原子価を示す基であってもよい。ある実施形態では、分岐点は、−Ｃ、−ＣＨ、−Ｃ（ＣＨ２−）（ＣＨ２−）ＣＨ２−、−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ２−）ＣＨ２−、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、または−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃである（式中、Ｑはそれぞれ存在ごとに独立して、Ｈまたは随意的に置換アルキルである）。他の実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。
脂質粒子
本発明は、上記の１つ以上の標的化脂質を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子には、リポソームが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用される場合、リポソームとは、水性内部を包む脂質含有膜を有する構造体のことである。リポソームは、１つ以上の脂質膜を有し得る。本発明は、一層のリポソーム（単層と呼ぶ）と重層化されたリポソーム（多層と呼ぶ）の両方を企図する。核酸と複合体を形成した場合、脂質粒子は、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているような、ＤＮＡ層の間に挟まったカチオン性脂質二重層から構成される、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）となり得る。
本発明の脂質粒子は、１つ以上の追加の脂質および／または他の成分（例えば、コレステロール）をさらに含んでもよい。他の脂質は、種々の目的のために、例えば、脂質の酸化を防ぐために、またはリガンドをリポソーム表面に付着させるために、本発明のリポソーム組成物に含めてもよい。本発明のリポソームの中に、両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質を含む、多くの脂質のうちのどれが存在してもよい。このような脂質は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。存在し得る追加の脂質成分の具体的な例は、以下に記載されている。
本発明の脂質粒子中に存在し得る追加の成分には、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書参照）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、例えば、ホスファチジルエタノールアミンに共役したＰＥＧおよびセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号明細書参照）などの、二重層安定化成分が含まれる。
特定の実施形態では、脂質粒子には、アミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および生成中の脂質粒子の凝集を低下させるために選択される脂質のうち１つ以上が含まれる。生成中の脂質粒子の凝集の低下は、生成中の電荷誘導による凝集を防ぐ、粒子の立体安定化によって生じ得る。
生成中に粒子が凝集するのを低下させる脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、およびポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されているもの）が挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍ１、またはＡＴＴＡのような、生成中に凝集するのを防ぐ、荷電していない親水性の立体障害部分を有する他の化合物を、本発明の方法および組成物などで使用するために、脂質に共役させることもできる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号の各明細書に記載されている。典型的には、凝集を低下させるために選択される脂質成分の濃度は、（脂質のモルパーセントで）約１〜１５％である。
本発明で有用なＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレンコンジュゲート）の特定の例は、ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するための種々の「アンカリング」脂質部分を有することがある。好適なＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、参照により本明細書に組み入れられる同時係属の米国特許出願第０８／４８６，２１４号明細書に記載されているＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ならびにＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。特に好ましいのは、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールである。
ＰＥＧまたはＡＴＴＡなどの立体的に大きい部分を脂質アンカーにコンジュゲートする実施形態では、脂質アンカーの選択は、コンジュゲートが脂質粒子とどのように会合することになるかということによって決まる。ｍｅＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、この粒子が循環から排除されるまで、おそらく数日間は、リポソームと会合したままであるということがよく知られている。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他のコンジュゲートは、同様の滞留能を有する。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に曝されると、速やかに製剤から放出され、いくつかのアッセイでは、Ｔ１／２が６０分未満である。米国特許出願第０８／４８６，２１４号明細書で例説されているように、少なくとも３つの特性、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和状態、および立体障害頭部基の大きさが、放出速度に影響を与える。これらの特色について好適なバリエーションがある化合物が、本発明に有用であり得る。いくつかの治療用途については、ＰＥＧ修飾脂質が、インビボで核酸−脂質粒子から速やかに失われることが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧ修飾脂質が比較的短い脂質アンカーを有することになる。他の治療用途では、核酸−脂質粒子がより長い血漿循環寿命を示すことが好ましい場合があり、したがって、ＰＥＧ修飾脂質が比較的長い脂質アンカーを有することになる。
他の例示的なＰＥＧ−脂質には、例えば、国際公開第０５／０２６３７２号に記載されているようなジアルキルオキシプロピルに共役したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）、例えば、米国特許公開第２００３００７７８２９号および同第２００５００８６８９号に記載されているようなジアシルグリセロールに共役したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に共役したＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、もしくはセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるわけではない（米国特許第５，８８５，６１３号参照）。
凝集防止化合物が適切に機能するために、脂質コンジュゲーションが必ずしも必要というわけではないということに留意すべきである。溶液中の遊離のＰＥＧまたは遊離のＡＴＴＡが、凝集を防ぐのに十分であることがある。生成後に粒子が安定である場合は、対象に投与する前に、ＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析で取り除くことができる。
脂質粒子中に存在する場合、中性脂質は、生理的ｐＨで非荷電または中性のいずれかの両性イオン形態で存在する多くの脂質種のうちのどれであってもよい。このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが含まれる。本明細書に記載される粒子中で使用される中性脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの安定性を考慮することで判断される。中性脂質成分は、２つのアシル基（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）を有する脂質であることが好ましい。さまざまな鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であるか、または周知の技術で単離もしくは合成され得る。一群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の単不飽和脂肪酸または二不飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。本発明で使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、または任意の関連ホスファチジルコリンであることが好ましい。本発明で使用される中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、または他の頭部基（例えば、セリンおよびイノシトール）を有するリン脂質から構成されていてもよい。
存在する場合、脂質混合物のステロール成分は、リポソーム、脂質小胞、または脂質粒子の調製の分野で従来から使用されているステロールのうちのどれであってもよい。好ましいステロールは、コレステロールである。
本発明の脂質粒子中で使用するのに好適なカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロ酢酸（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）、ならびにＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）などの、カチオン性脂質の多くの市販調製品を使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質はアミノ脂質である。
本発明に適した他のカチオン性脂質は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号（２００７年１０月３日出願）に開示されている。
本発明の脂質粒子中で使用するのに好適なアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
多くの実施形態では、両親媒性脂質が本発明の脂質粒子中に含められる。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相の方向に向いている一方で、親水性部分が水性相の方向に向いている、任意の好適な材料を指す。このような化合物としては、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸などの、リンを欠く他の化合物も使用することができる。さらに、このような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなどの、他の脂質と容易に混合することができる。
プログラム可能な融合脂質も、本発明の脂質粒子中に含めるのに好適である。このような脂質粒子は、細胞膜と融合する傾向がほとんどなく、所与のシグナル事象が生じるまで積載物を送達する。これによって、脂質粒子は、生物に注射された後でより均一に分布すること、または細胞と融合し始める前に疾患部位に分布することが可能となる。シグナル事象は、例えば、ｐＨ、温度、イオン環境、または時間の変化であり得る。時間の変化の場合、融合遅延成分または融合「遮蔽（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分（例えば、ＡＴＴＡ−脂質コンジュゲートまたはＰＥＧ−脂質コンジュゲート）は、単に時間をかけて脂質粒子膜から放出することができる。脂質粒子は、体内で好適に分布する時までに、融合性であるのに十分な遮蔽剤を失っている。他のシグナル事象に関しては、炎症部位での温度上昇などの、疾患部位または標的細胞と関連するシグナルを選択することが望ましい。
例示的な一実施形態では、脂質粒子は、本発明の標的化脂質、カチオン性脂質、中性脂質（アミノ脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物を含む。ある実施形態では、脂質混合物は、本発明の標的化脂質、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質からなるか、または本発明の標的化脂質、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質から本質的になる。さらに好ましい実施形態では、脂質粒子は、標的化脂質約２０〜５０％：カチオン性脂質２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％というモル比の上記の脂質混合物からなるかまたは標的化脂質約２０〜５０％：カチオン性脂質２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％というモル比の上記の脂質混合物から本質的になる。
好ましい実施形態では、脂質粒子の全ての成分は光学的に純粋である。
治療剤−脂質粒子の組成物および製剤
本発明は、本発明の脂質粒子および活性剤を含み、活性剤が脂質粒子と会合している組成物を含む。特定の実施形態では、活性剤は治療剤である。特定の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の水性内部に封入されている。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の１つ以上の脂質層の内側に存在する。他の実施形態では、活性剤は、脂質粒子の外側または内側の脂質表面に結合している。
本明細書で使用される「完全に封入された」とは、粒子中の核酸が、遊離のＤＮＡを著しく分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝された後にそれほど分解されないことを意味する。完全に封入された系では、通常は遊離の核酸の１００％を分解する処置において、粒子核酸の２５％未満が分解されることが好ましく、粒子核酸の１０％未満が分解されることがより好ましく、粒子核酸の５％未満が分解されることが最も好ましい。あるいは、完全に封入されていることを、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイで決定してもよい。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度の蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ社製（米国カリフォルニア州所在）から入手可能）。完全に封入されていることにより、粒子が血清安定性であること、すなわち、インビボ投与の後、粒子が速やかにその構成部分へと分解することはないことも示唆される。
本明細書で使用される活性剤には、細胞、組織、器官、または対象に対して所望の効果を発揮することができる任意の分子または化合物が含まれる。このような効果は、例えば、生物学的なもの、生理学的なもの、または美容上のものであってもよい。活性剤は、例えば、核酸、ペプチドおよびポリペプチド（例えば、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、および霊長類化（商標）抗体）、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそのリガンド；ホルモンを含む）；ならびに小分子（有機小分子または有機小化合物を含む）を含む、任意の種類の分子または化合物であってもよい。
一実施形態では、活性剤は、治療的活性剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体に治療的活性があってもよく、または治療剤誘導体は、さらに修飾されることによって活性を持つようになるプロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、未修飾の薬剤と比較した場合に治療的活性の一部または全てを保持するが、別の実施形態では、治療剤誘導体は治療的活性を欠く。
さまざまな実施形態では、治療剤には、任意の治療的に有効な薬剤または薬物、例えば、抗炎症化合物、抗鬱薬、興奮剤、鎮痛剤、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張剤、抗血管新生薬、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心血管薬（例えば、抗不整脈剤）、血管収縮薬、ホルモン、およびステロイドが含まれる。
ある実施形態では、治療剤は腫瘍学薬物であり、これは、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、抗新生物剤などと呼ばれることもある。本発明に従って使用し得る腫瘍学薬物としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミフォスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、亜ヒ酸、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈用ブスルファン、経口用ブスルファン、カペシダビン（ゼローダ）、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメサゾン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ジェムシタビン（ジェムザール）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（カンプトスター、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミゾール、リトレチノイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニソン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾールアミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（ハイカムチン）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、ならびにビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って使用し得る腫瘍学薬物の他の例は、エリプチシンおよびエリプチシン類似体またはエリプチシン誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンである。
核酸−脂質粒子
ある実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と会合し、核酸−脂質粒子を生じる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中に完全に封入されている。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。最大５０ヌクレオチドまでを含有する断片を、一般に、オリゴヌクレオチドと呼び、より長い断片をポリヌクレオチドと呼ぶ。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドの長さは２０〜５０ヌクレオチドである。
本発明との関連において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドモノマーもしくはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語には、同様に機能する天然には存在しないモノマー、またはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーも含まれる。例えば、増強された細胞への取込みおよびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性などの特性のために、このような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドが天然の形態よりも好ましいことが多い。
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる５炭素糖からなり、デオキシリボースは、この糖の５’炭素と３’炭素でホスフェートに共有結合して交互の未分岐ポリマーを形成する。リボオリゴヌクレオチドは、５炭素糖がリボースである類似の繰り返し構造からなる。
本発明による脂質−核酸粒子中に存在する核酸には、任意の形態の公知の核酸が含まれる。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域と終結領域とを含む遺伝子、および自己複製系（例えば、ウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明の核酸は、通常は核酸の特定の形態によって、さまざまな長さであってもよい。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子の長さは、約１，０００〜１００，０００ヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、約１０〜１００ヌクレオチドの範囲であってもよい。さまざまな関連する実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、一本鎖、二本鎖、および三本鎖ともに、約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチドの範囲であってもよい。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするかまたは標的ポリヌクレオチドに相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列に１００％相補的である必要はないといことが理解される。標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常な機能を妨害して、標的分子からの効用または発現を失わせており、かつ特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性があるとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的とするかまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子配列またはｍＲＮＡ配列と比較して、１つ、２つ、または３つの塩基置換を含む。
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と会合している。目的とする遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を妨害するために、ＲＮＡｉ分子を用いるＲＮＡ干渉法を使用してもよい。これらのＲＮＡｉ分子はｉＲＮＡ剤とも呼ばれ、以下に説明する。
ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子と十分に相同な領域を含み、かつヌクレオチドに関して、ｉＲＮＡ剤またはその断片が標的遺伝子の下方調節を仲介することができるほどの十分な長さであるべきである。（説明しやすくするために、本明細書では、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語を、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書での「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の用法は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物置換部分も示すことができるということが理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に、および一実施形態では、完全に、相補的な領域であるか、またはこのような領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、対応性は、ｉＲＮＡ剤、またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的なサイレンシングを導くことが可能となる程度に十分でなければならない。相補性、すなわち、標的鎖との相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。多くの場合、特にアンチセンス鎖における完全な相補性が所望されるものの、一実施形態は、特にアンチセンス鎖において、（標的ＲＮＡに対して）１つ以上の、または例えば、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、もしくはそれより少ないミスマッチを含むことができる。特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最も許容され、かつ、存在する場合は、末端領域（単数または複数）において、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、または３ヌクレオチド以内であり得る。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることのみである。
本明細書の他の箇所で議論されるように、およびその全体が参照により組み入れられる文献において、ｉＲＮＡ剤は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域またはヘアピン構造の領域（例えば、２つの相補的な領域を繋ぐ領域）は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３'末端または５'末端を安定化する修飾またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入るように有利に働く修飾も想定される。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬（これらは、ホスホロアミダイトとして生じ、ＲＮＡ合成の間に複数のカップリングが行なえるように、ＤＭＴ保護ヒドロキシル基を別に有する）を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤としては次のようなものが挙げられる：インターフェロン応答を誘発するのに十分な長さの分子（これらは、Ｄｉｃｅｒ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６）によって切断され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）内に入ることができる）；およびインターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子（これらの分子もＤｉｃｅｒによって切断され、かつ／またはＲＩＳＣ内に入ることができる）、例えば、ＲＩＳＣ内に入ることができる大きさの分子（例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似した分子）。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子を、本明細書では、「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤」と呼ぶ。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤」とは、例えば、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘導しないぐらい十分に短い、例えば、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二重鎖領域を有するＲＮＡ剤（例えば、二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖剤）を指す。ｓｉＲＮＡ剤、またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子を下方調節することができ、この場合、標的は内在性の標的ＲＮＡまたは病原体の標的ＲＮＡを含み得る。
ｓｉＲＮＡ剤の各鎖の長さは、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド以下であることができる。鎖の長さは、少なくとも１９であってもよい。例えば、各鎖の長さは、２１〜２５ヌクレオチドであることができる。ｓｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、および１つ以上の突出、または１つもしくは２つの、２〜３ヌクレオチドの３'突出を有してもよい。
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子を下方調節する能力に加え、ｉＲＮＡ剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有してもよい。
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、ＲＩＳＣ複合体に入り、ＲＩＳＣを介した標的ｍＲＮＡの切断に関与することができるぐらい十分に長くてもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤の長さは、少なくとも１４ヌクレオチド、および他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖ｉＲＮＡ剤の長さは、２００、１００、または６０ヌクレオチド未満である。
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下である。ある実施形態では、二重鎖領域の範囲の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。ヘアピンは、一実施形態では、３’に、また、ある実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側に、一本鎖突出または末端不対領域を有してもよい。一実施形態では、突出の長さは、２〜３ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」とは、鎖間ハイブリダイゼーションによって二重鎖構造の領域が形成され得る、２つ以上の、場合によっては２つの、鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチドであってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドであってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分の長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対に等しくてもよく、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対であってもよい。二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分の長さは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下であってもよい。範囲の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対であってもよい。
多くの実施形態では、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）切断されて、より小さいｄｓ ｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ剤）を産生することができるくらいに十分大きい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖とセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい場合がある。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ部類の修飾を有することもあれば、異なる修飾を有することもあり、例えば、場合によっては、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖を不活性化して、活性のあるｓｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨げるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の５’−リン酸化を妨げる修飾によって（例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって）遂行することができる（Ｎｙｋａｎｅｎら（２００１） ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１参照）。例えば、単に５'−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換することなどの、リン酸化を妨げる他の修飾も使用することもできる。あるいは、大きな嵩高い基を５’−ホスフェートに付加して、ホスホジエステル結合に変えてもよいが、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断して、機能的なｓｉＲＮＡの５’−末端を放出し得るので、これはあまり望ましくない可能性がある。アンチセンス鎖修飾には、５’リン酸化、および本明細書で議論される任意の他の５’修飾、特に、一本鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において上で議論された５’修飾が含まれる。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、突出、例えば、１つもしくは２つの５’突出もしくは３’突出、または２〜３ヌクレオチドの３’突出を含有するように対形成した、センス鎖とアンチセンス鎖を含有し得る。多くの実施形態は、３’突出を有する。あるｓｉＲＮＡ剤は、一本鎖突出を有し、一実施形態では、各末端に１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドの長さの３’突出を有する。突出は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの２つの鎖がジグザグ状なっていることの結果として生じ得る。５’末端はリン酸化されていてもよい。
一実施形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で考察されたｓｉＲＮＡ剤の範囲において、１５〜３０ヌクレオチド長、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ剤は、天然のＤｉｃｅｒによって長いｄｓ ｉＲＮＡからプロセッシングされた産物と長さおよび構造が類似していることがあり得る。ｓｉＲＮＡ剤の２つの鎖が結合（例えば、共有結合）している実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および３’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。
ｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載される単離されたｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物）のサイレンシングを仲介することができる。便宜上、このようなｍＲＮＡを、本明細書では、サイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。一般に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを標的とすることもできる。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論に束縛されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤）が使用されると考えられている。
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。非標的配列は、典型的には、少なくとも５ヌクレオチド異なっている。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに「十分に相補的」である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに「厳密に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡとｉＲＮＡ剤は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン−クリック塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含むことができる。さらに、一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に区別することができる。この場合、ｉＲＮＡ剤は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある（例えば、７ヌクレオチド以内の）領域に見られる場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、１００、２００、３００、または４００ヌクレオチド未満の長さの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
本明細書で考察されるＲＮＡ剤は、未修飾のＲＮＡ、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、例えば、ヒトの体内に天然に存在するのと同じかまたは本質的に同じである分子を指す。当技術分野では、稀であるかまたは通常とは異なるが、天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼ぶことが多く、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら （１９９４） Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３−２１９６を参照されたい。（典型的には転写後修飾の結果であることが明白なので）修飾ＲＮＡと呼ばれることが多い、このような稀であるかまたは通常とは異なるＲＮＡは、本明細書で使用される「未修飾のＲＮＡ」という用語の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、例えば、ヒトの体内に存在するものと異なる分子を指す。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物とは、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子のことであり、この非リボリン酸構築物は、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸骨格の場合に見られるのと実質的に同様（例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物）であるように、塩基が正しい空間的関係性で提示されることを可能にする。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない、高度に保存されたクラスの小さいＲＮＡ分子である。プロセッシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれるようになる一本鎖の約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシス、および分化の重要な調節因子として同定されている。プロセッシングされたｍｉＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に結合することによって遺伝子発現の調節に役割を果たすと考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳の阻害、転写物の切断、またはその両方によって遺伝子発現の下方調節を仲介する。ＲＩＳＣは、広範な真核生物の核内での転写サイレンシングにも関与している。
これまでに同定されたｍｉＲＮＡの数は多く、ますます増えているが、その実例となる例を、例えば、「ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４；「Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に見出すことができ、また、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見出すこともできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的とされるポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの場合は、それらが相補的ＲＮＡ鎖に結合することによって相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を妨げる。アンチセンスＤＮＡは、特異的で、相補的な（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とするために使用することができる。結合が生じた場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮアーゼＨという酵素によって分解されることができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の標的遺伝子に厳密に相補的でない可能性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、アンチセンスを用いて標的特異的でない活性が見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合に、利用することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、効果的で、かつ標的とされるタンパク質合成の阻害剤であることが示されており、したがって、標的遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドがタンパク質合成を阻害する効力は十分に証明されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）とムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、これらのそれぞれのｍＲＮＡ配列に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦについて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号、および米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害し、これらを治療するのに使用し得るアンチセンス構築物も記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；米国特許第５，５９１，３１７、および米国特許第５，７８３，６８３号）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する方法は当技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するように容易に適合させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の解析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的な安定性の決定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞における標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低下させるかまたは邪魔することになるダイマー、ヘアピン、または他の二次構造を形成する能力が相対的にないことに基づいて選択されてもよい。極めて好ましいｍＲＮＡの標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドン上またはその付近にある領域、およびｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造解析および標的部位選択の検討は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ)のバージョン４および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を用いて行なうことができる。
リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと会合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を持つ特異的触媒ドメインを有するＲＮＡ−タンパク質複合体である（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多くのリボザイムは、高い特異性で、リン酸エステル転移反応を加速させ、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら，Ｃｅｌｌ．１９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、化学反応の前に、基質が特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることによるものである。
少なくとも６つの基本的な種類の天然に存在する酵素的ＲＮＡが現在知られている。各々が、生理的条件下でトランス形のＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分のごく近傍にある酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。したがって、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡを認識し、次に、相補的な塩基対形成を介して標的ＲＮＡに結合し、ひとたび正しい部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断によって、コードされたタンパク質を合成する標的ＲＮＡの能力が破壊されることになる。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合し、それを切断した後、酵素的核酸はそのＲＮＡから放出されて、別の標的を探し求めて、新たな標的への結合とその切断を繰り返すことができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド型、ヘアピン、δ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連している）、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフとなって形成され得る。ハンマーヘッド型モチーフの具体的な例は、Ｒｏｓｓｉら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｓｅｐ １１；２０（１７）：４５５９−６５によって記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開ＥＰ第０３６０２５７号）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４、および米国特許第５，６３１，３５９号によって記載されている。δ肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２によって記載されており、ＲＮアーゼＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７によって記載されており；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）によって記載されており；グループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸の重要な特徴は、これらが標的遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有していること、およびこれらが、分子に対してＲＮＡ切断活性を付与するその基質結合部位の中またはその周囲のヌクレオチド配列を有していることである。したがって、リボザイム構築物が、本明細書に記載される特異的モチーフに限定される必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列に標的されるリボザイムを産生する方法は当技術分野で公知である。リボザイムを、国際公開第９３／２３５６９号および国際公開第９４／０２５９５号の各パンフレット（各々、具体的に、参照により本明細書に援用される）に記載されているように設計し、そこに記載されているように合成して、インビトロおよびインビボで試験し得る。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変えることまたは血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防ぐ修飾を有するリボザイム（例えば、国際公開第９２／０７０６５号；同第９３／１５１８７号；同第９１／０３１６２号の各パンフレット；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号の各明細書；および国際公開第９４／１３６８８号パンフレットを参照されたく、これらには、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に施すことができるさまざまな化学修飾が記載されている）、細胞内でのそれらの効力を増強する修飾を有するリボザイム、ならびにＲＮＡ合成時間を短縮し、化学反応の必要性を減らすためにステムＩＩ塩基が除去されたリボザイムを化学合成することによって最適化することができる。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子と会合する核酸は、免疫刺激性であってもよく、これには、対象（哺乳類の患者であっても、または他の患者であってもよい）に投与されたときに、免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）が含まれる。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造を生じさせる特定のパリンドロム（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓら（１９９２） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６参照）、またはＣｐＧモチーフ、および他の公知のＩＳＳ特徴（例えば、多重Ｇドメイン、国際公開第９６／１１２６６号パンフレット参照）が含まれる。
免疫応答は、先天性免疫応答または適応免疫応答であり得る。免疫系は、より先天性の免疫系と、脊椎動物の後天性の適応免疫系に分けられ、後者は、液性の細胞成分にさらに分けられる。特定の実施形態では、免疫応答は、粘膜によるものであってもよい。
特定の実施形態では、免疫刺激性核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与された場合にのみ免疫刺激性であり、その「遊離形態」で投与された場合には、免疫刺激性ではない。本発明によれば、このようなオリゴヌクレオチドが免疫刺激性であると考えられる。
免疫刺激性核酸は、免疫応答を誘発するために標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる必要がない場合には、配列非特異的であると考えられる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、依然として配列非特異的な免疫刺激性核酸と考えられ得る。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼからの保護および薬理学的特性（例えば、組織および細胞への取込みの増強）のためのさまざまな修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、例えば、糖の完全な２’−メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば、３’−末端のコレステロール部分によって、普通のＲＮＡとは異なる。アンタゴｍｉｒは、内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングし、それによってｍｉＲＮＡ誘導性の遺伝子サイレンシングを妨害するために使用し得る。アンタゴｍｉｒ介在性のｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９（これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる）に記載されているｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡがない場合でも、それらの比較的短い結合配列を認識することができるので、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を持つ短いオリゴヌクレオチドを、生きた細胞での遺伝子発現を操作するための道具として使用することができる。この戦略では、このような「デコイオリゴヌクレオチド」が細胞内に送達され、その後、標的因子によって認識および結合されることが必要になる。デコイによって転写因子のＤＮＡ結合部位が占められると、転写因子が後に標的遺伝子のプロモーター領域に結合することができなくなる。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子の発現を阻害するために、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方調節するために、治療剤として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの利用例は、Ｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に見出すことができ、これは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
核酸修飾
以下の考察の大部分は、一本鎖分子について言及するものである。本発明の多くの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的二本鎖ｉＲＮＡ剤）が想定されている。したがって、以下に記載される一本鎖構造からできた二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成している場合、または分子内対形成によって二本鎖領域が形成されている場合（例えば、ヘアピン構造））は、本発明の範囲内にある。長さについては、本明細書の他の箇所で記載されている。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾）は、核酸内で繰り返される位置で生じる。修飾が核酸中のこれらの位置全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’末端位置または５’末端位置でのみで生じ得、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域でのみ生じ得るか、またはＲＮＡの一本鎖領域でのみ生じ得る。例えば、非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端で生じ得るか、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でもしくは鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドでのみ生じ得るか、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じ得る。５’末端（単数または複数）をリン酸化することができる。
一実施形態では、例えば、安定性を高めるために、突出に特定の塩基を含めるか、または一本鎖突出（例えば、５’突出もしくは３’突出、もしくはその両方）に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。一実施形態では、３’突出または５’突出中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載される修飾を用いて、修飾する。修飾には、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基での修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）が含まれることができる。突出が標的配列と相同である必要はない。
未修飾のオリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴリボヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記ＲＮＡ成分の１つ以上に対する化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴリボヌクレオチドをより安定にすることができる。
具体的な修飾を以下に詳細に考察する。
リン酸基
リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、２つの非結合酸素原子に均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の１つを異なる置換基で置換することによって修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対するこの修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、一実施形態では、非荷電リンカーかまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネートまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置換されている。ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対するさまざまな耐性を示す調製物を生じさせることが可能である。さらに、キラルリン酸基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のＲＮＡ種と比べてより低い可能性がある。したがって、ホスホジエステル結合の酸素は、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルもしくはアリールである）のいずれか１つに置換することができる。
リン酸リンカーは、結合酸素を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。
糖基
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルが、２’アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化されることがもはやできないので、安定性の増強が予測される。２’アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。再び、理論によって束縛されることを望まないが、２’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが、ある実施形態に対して望ましい可能性がある。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＰＥＧ誘導体である、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）のみを含有するオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にｄｓのＲＮＡの突出部に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは随意的に、例えば、アミノ官能基で置換されていてもよい）が挙げられる。ある実施形態の他の置換基としては、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロが挙げられる。
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾ＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’にヌクレオ塩基を欠く「無塩基」糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、１つ以上の構成成分の糖原子におけるさらなる修飾を含有することもできる。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、２’修飾を、１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部に置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。
リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施形態では、置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれてもよい。
リン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物に置換されているオリゴヌクレオチド模倣スキャフォールドを構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電した骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）というヌクレオシド代用物が挙げられる。ある実施形態では、ＰＮＡ代用物を使用してもよい。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。これらの修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルをベースにしたもの）にコンジュゲートすることができる。機能的分子実体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に付着させることが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ基、Ｎ基、Ｓ基、もしくはＣ基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。これらのスペーサーまたはリンカーとしては、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。「スペーサー／リン酸−機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりになることが可能である。３’末端は−ＯＨ基とすることができる。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分のコンジュゲーションは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性特性を改善することができると考えられている。再び、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の改変を導入することが望ましい可能性がある。末端修飾の他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体）が挙げられる。
末端修飾は、本明細書の他の箇所で考察されるような理由を含む多くの理由のために、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために加えることができる。活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾が含まれる。例えば、ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤、とりわけアンチセンス鎖は、５’リン酸化されているか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣを介した遺伝子サイレンシングと適合可能なものが含まれる。好適な修飾には、５’モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオトリホスフェート、５’−γ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）が含まれる。
末端修飾は、分布をモニターするためにも有用であり得るが、このような場合、付加される基には、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ ４８８）が含まれ得る。末端修飾は、取込みを増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾は、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルはＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然のヌクレオ塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、またはツベルシジン）および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基および「汎用的な塩基」のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンならびに８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換グアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されているものが挙げられる。
一般に、塩基の変化は、安定性を促進するためには使用されないが、他の理由のために有用である可能性があり、例えば、いくつかのもの（例えば、２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリン）は蛍光性である。修飾塩基は、標的特異性を低下させることがあり得る。このことは、ｉＲＮＡ剤の設計において考慮されてもよい。
参考文献
本明細書で列挙した刊行物、特許、および公開特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
一般的な参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成によるものであってもよく、例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」エフ エックスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１（とりわけ、第１章「Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２章「Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３章「２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第４章「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、第５章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ」、第６章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ」、および第７章「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ」）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１、ならびにＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはこれらの文献中で参照されている参考文献に記載されている。国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／７５１６４号、または国際公開第０２／４４３２１号の各パンフレットに記載の修飾を本明細書で使用することができる。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載されている。アルキルホスホン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載されている。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号明細書または米国特許第５，３６６，８７８号明細書に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載されている。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号明細書および米国特許第５，１７７，１９８号に記載されている。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートリボオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されている。３’−デオキシ３’−メチレンホスホン酸オリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１、およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載されている。
糖基の参考文献
２’修飾に対する修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９〜１３４および同文献中の全ての参考文献に見出すことができる。リボースに対する特異的修飾は、以下の参考文献に見出すことができる：２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１〜８４１，２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ． Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０〜１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１〜３１０）。
リン酸基の置換に関する参考文献
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書では、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書では、アミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別される）、ならびに例えば、ＭＭＩとＰＯ結合またはＰＳ結合を交互に有する混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号の各明細書、ならびに公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号および第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開第９２／２０８２２号および国際公開第９２／２０８２３号として公開されている）の各パンフレットに記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号明細書および同第５，２６４，５６４号明細書に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載されている。カルボネート置換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１，１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載されている。カルバメート置換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載されている。
リン酸−リボース骨格の置換に関する参考文献
シクロブチル糖代用物の化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号明細書に記載されているように調製することができる。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号明細書に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，２３５，０３３号の各明細書、ならびに他の関連する特許の開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体公知であり、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３で参照されているさまざまな手順のいずれかに従って調製することができる。これらは、米国特許第５，５３９，０８３号明細書に従って調製してもよい。
末端修飾の参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）および同文献中の参考文献に記載されている。
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されているように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されているように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されているように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されているように調製することができる。さらなる参考文献は、塩基修飾についての上記の節に開示することができる。
本発明による脂質−核酸粒子で使用される核酸には、公知の任意の形態の核酸が含まれる。したがって、核酸は、ヌクレアーゼ耐性および血清安定性を増強するために過去に使用されているタイプの修飾核酸であってもよい。しかしながら、驚くべきことに、天然核酸ポリマーのホスホジエステル結合が修飾されていない核酸から脂質−核酸粒子を製剤化する本発明の方法を用いて、許容可能な治療製品を調製することもでき、未修飾のホスホジエステル核酸（すなわち、全ての結合がホスホジエステル結合である核酸）の使用は、本発明の好ましい実施形態である。
キメラオリゴヌクレオチド
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、それどころか、２つ以上の前記の修飾が、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにさえ組み込まれていてもよい。本発明の特定の好ましいオリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドである。本発明の文脈における「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」とは、各々少なくとも１ヌクレオチドから構成された、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドのことである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、１つ以上の有益な特性（例えば、増大したヌクレアーゼ耐性、増大した細胞への取込み、ＲＮＡ標的に対する増大した結合親和性など）を付与する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの領域とＲＮアーゼＨ切断の基質となる領域とを含有する。
一実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合親和性を増大させるように修飾された少なくとも１つの領域を含む。標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することによってごく普通に決定される。Ｔｍとは、オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度のことであり、解離は分光光度法によって検出される。Ｔｍが高ければ高いほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は大きい。一実施形態では、標的ｍＲＮＡへの結合親和性を増大させるように修飾されたオリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’位で修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２'−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、２'−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、または２'−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドにごく普通に組み込まれており、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２'−デオキシオリゴヌクレオチドよりもＴｍが高い（すなわち、標的結合親和性が高い）ことが示されている。このような増大した親和性の効果は、オリゴヌクレオチドによる標的遺伝子発現の阻害を大いに増強することである。
別の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨの基質として働く領域を含む。当然、オリゴヌクレオチドは、本明細書で記載されているさまざまな修飾の任意の組合せを含み得るということが理解される。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞への取込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを伴う。このようなコンジュゲートおよびそれを調製する方法は当技術分野で公知である。
当業者は、治療的効力などのインビボでの効用について、妥当な経験則では、チオエート型の配列が遊離形態で作用するならば、同じ配列の、任意の化学的性質の封入された粒子にも効果があることを理解するであろう。封入された粒子はまた、より広範なインビボ効用を有し、別の方法ではアンチセンス治療に応答することが知られていない条件およびモデルにおいて効力を示す可能性がある。当業者は、本発明を適用すれば、今度はアンチセンス治療に応答する古いモデルを発見し得るということが分かっている。さらに、当業者は、本発明を利用することによって、廃棄されたアンチセンス配列または化学反応を再検討し、効果を発見する可能性がある。
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成の技術によって好都合にかつごく普通に作成し得る。このような合成のために機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓをはじめとするいくつかのベンダーによって販売されている。このような合成のための任意の他の手段も利用してよく、オリゴヌクレオチドの実際の合成は、ルーチンワークをする人の能力の範囲内に十分にある。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも周知である。
核酸−脂質粒子の特徴
ある実施形態では、本発明は、核酸が脂質層の中に封入されている脂質封入核酸粒子を産生するための方法および組成物に関する。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを取り込んでいる、このような核酸−脂質粒子は、（１）薬物対脂質比；（２）封入効率；および（３）粒子サイズを含む種々の生物物理学的パラメータを用いて特徴付けられる。高い薬物対脂質比、高い封入効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに制御可能な粒子サイズ（通常、直径２００ｎｍ未満）が望ましい。さらに、核酸ポリマーの性質が重要であるが、それは、ヌクレアーゼ耐性を付与する目的で核酸を修飾すると、治療薬の費用が上乗せされるものの、限られた耐性しかもたらさない場合が多いからである。別途明記しない限り、これらの基準は、本明細書では以下のように算出される。
核酸対脂質比は、規定容量の調製物中の核酸の量を、同じ容量中の脂質の量で割ったものである。これは、モル対モルとしてであっても、または重量対重量としてであっても、または重量対モルとしてであってもよい。最終的な投与可能製剤については、透析、クロマトグラフィー、および／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化を利用して、できるだけ多くの外部核酸を除去した後に、核酸：脂質比を算出する。
封入効率とは、出発混合物の薬物対脂質比を、最終的な投与可能製剤の薬物対脂質比で割ったものを指す。これは、相対効率の尺度である。絶対効率の尺度については、投与可能製剤となる出発混合物に添加される核酸の総量を算出することもできる。また、製剤化プロセスで失われる脂質の量を算出してもよい。効率は、製剤化の損失高と経費の尺度である。
サイズは、生成される粒子のサイズ（直径）を意味する。サイズ分布は、Ｎｉｃｏｍｐ Ｍｏｄｅｌ ３７０サブミクロン粒子サイズ測定器で準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて決定し得る。新生物および炎症部位などの、血管新生した（漏れやすい）組織への分布のために、２００ｎｍ未満の粒子が好ましい。
薬学的組成物
本発明の脂質粒子は、特に治療剤と会合している場合に、薬学的組成物として製剤化されてもよく、例えば、これは、投与の経路および標準的な薬学的慣行に従って選択される、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体（例えば、生理的食塩水もしくはリン酸緩衝液）をさらに含む。
特定の実施形態では、本発明の脂質−核酸粒子を含む薬学的組成物は、標準的な技術に従って調製され、これは、薬学的に許容される担体をさらに含む。一般に、生理食塩水が薬学的に許容される担体として利用される。他の好適な担体としては、例えば、安定性を増強するために糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）を含む、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられる。食塩水または他の塩含有担体を含む組成物において、担体が、以下の脂質粒子製剤に添加されることが好ましい。したがって、脂質−核酸組成物を生成した後、これらの組成物を薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）中に希釈することができる。
得られた薬学的調製物を従来的な周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。その後、水性溶液を、無菌条件下で、使用のために包装するかまたは濾過し、凍結乾燥させ、凍結乾燥させた調製物を、投与の前に滅菌水性溶液と組み合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤およびｐＨ緩衝剤、張性調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含有してもよい。さらに、脂質懸濁液は、保存時のフリーラジカルおよび脂質過酸化による傷害に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。親油性のフリーラジカルクエンチャー（例えば、α−トコフェロール）および水溶性の鉄特異的キレート剤（例えば、フェリオキサミン）が好適である。
薬学的製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は、さまざまに（すなわち、約０．０１重量％未満、通常は、約０．０５〜５重量％または少なくとも約０．０５〜５重量％から１０〜３０重量％までにも）異なる可能性があり、主に、選択される特定の投与様式に従う液量、粘性などによって選択される。例えば、治療に伴う流体負荷を下げるために、この濃度を増大させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症に関連する鬱血性心不全または重症高血圧を有する患者で特に望ましい可能性がある。あるいは、投与部位での炎症を緩和するために、刺激性の脂質から構成された複合体を希釈して、濃度を下げてもよい。一群の実施形態では、核酸は、標識が付着しており、（相補的核酸の存在を示すことによって）診断に使用される。この例では、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断されている疾患状態、および臨床医の判断によって決定されるが、一般に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重である。
上記のように、本発明の脂質−治療剤（例えば、核酸）粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾リン脂質、ＰＥＧ−セラミド、もしくはガングリオシドＧＭ１−修飾脂質、または凝集を防ぐかまたは制限するのに有効な他の脂質を含んでもよい。このような成分の添加は、単に複合体凝集を防ぐだけではない。それどころか、これは、循環寿命を増大させ、標的組織への脂質−核酸組成物の送達を増大させる手段も提供する可能性がある。
本発明は、キット形態の脂質−治療剤組成物も提供する。キットは、典型的には、キットのさまざまな要素を入れるために区画化された容器から構成されている。キットは、好ましくは脱水または濃縮された形態の、本発明の粒子または薬学的組成物を、それらを再水和または希釈および投与するための指示書とともに含有する。ある実施形態では、粒子は活性剤を含むが、他の実施形態では、含まない。
製造方法
本発明の方法および組成物は、特定の標的化脂質、付随する実施例に記載されるその合成、調製、および特性解析を利用する。さらに、本発明は、治療剤（例えば、核酸）と会合した脂質粒子を含む、脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載される方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水性溶液と組み合わせて、脂質粒子中に封入された核酸を含有する中間混合物を生成させるが、脂質粒子中では、この封入された核酸が、約１重量％〜約３０重量％、好ましくは３〜２５重量％、一層より好ましくは５〜１５重量％の核酸／脂質比で存在する。随意的に、脂質部分が、好ましくは直径２０〜２００ｎｍ、より好ましくは３０〜１５０ｎｍ、一層より好ましくは約４０〜９０ｎｍの単層小胞となる脂質封入核酸粒子が得られる大きさに中間混合物を作り得る。その後、ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質封入核酸組成物を提供する。
上記のように、カチオン性脂質のうちのいくつかは、アミノ基のｐＫａよりも低いｐＨで荷電し、アミノ基のｐＫａよりも高いｐＨにおいては実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２段階のプロセスを用いる本発明の製剤化で使用することができる。まず、脂質小胞を、核酸の存在下で滴定可能なカチオン性脂質と他の小胞成分を用いてより低いｐＨで形成させることができる。このようにして、小胞は、核酸を封入し、閉じ込める。次に、媒質のｐＨを、存在する滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａよりも高いレベルにまで、すなわち、生理的ｐＨ以上にまで増大させることによって、新たに形成された小胞の表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有利な態様は、表面吸着した全ての核酸と結果として得られる中性の表面を有する核酸送達小胞の両方を容易に除去することを含む。中性の表面を有するリポソームまたは脂質粒は、循環からの速やかな排除を回避し、かつカチオン性リポソームの調製物と関連する特定の毒性を回避すると考えられる。核酸−脂質粒子の製剤化におけるこのような滴定可能なカチオン性脂質のこれらの使用に関するさらなる詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号の各明細書に提供されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
このように形成される小胞は、核酸の含有量が高い、均一な小胞サイズの製剤を提供することにさらに留意されたい。さらに、小胞のサイズの範囲は、約２０〜約２００ｎｍ、好ましくは３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍである。
任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、核酸封入の非常に高い効率性は、低いｐＨでの静電相互作用の結果であると考えられている。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）では、小胞表面は荷電し、静電相互作用を通じて核酸の一部と結合する。外部の酸性緩衝液をより中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）と交換すると、脂質粒子またはリポソームの表面は中和され、任意の外部の核酸を除去することができる。製剤化プロセスに関するより詳細な情報は、さまざまな刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号の各明細書）に提供されている。
上記のことを考慮して、本発明は、脂質／核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書に記載される方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水性溶液と組み合わせて、脂質粒子に封入された核酸を含有する中間混合物を生成させるが、この脂質粒子中では、例えば、この封入された核酸が、約１０重量％〜約２０重量％の核酸／脂質比で存在する。随意的に、脂質部分が、好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの単層小胞となる脂質封入核酸粒子を得る大きさに中間混合物を作り得る。その後、ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部を中和し、それによって、少なくとも部分的に表面が中和された脂質封入核酸組成物を提供する。
本発明の核酸−脂質粒子の調製において、脂質の混合物は、典型的には、脂質の有機溶媒溶液である。その後、この脂質の混合物を、乾燥させて薄膜を形成させるか、または凍結乾燥して粉末を形成させた後に、水性緩衝液で水和してリポソームを形成させるができる。あるいは、好ましい方法において、脂質混合物を、エタノールなどの水混和性のアルコール中で溶解させ、このエタノール溶液を水性緩衝液に添加して、自発的にリポソームを形成させることができる。大部分の実施形態では、アルコールは、市販の形態で使用される。例えば、エタノールは、完全エタノール（１００％）として、または９５％エタノール（その残りは水）として使用することができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号明細書により詳細に記載されている。
例示的な一実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒中の、標的化脂質、カチオン性脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ、またはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物である。好ましい実施形態では、脂質の混合物は、アルコール、より好ましくはエタノール中の、標的化脂質、カチオン性アミノ脂質、中性脂質、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質から本質的になる。さらに好ましい実施形態では、第１の溶液は、標的化脂質約０．５〜５０％：カチオン性脂質２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％というモル比の上記の脂質混合物からなる。
本発明に従って、脂質混合物を、核酸を含有し得る緩衝水性溶液と組み合わせる。緩衝水性溶液は、典型的には、緩衝剤のｐＨが脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａよりも低い溶液である。好適な緩衝剤の例としては、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、およびＭＥＳが挙げられる。特に好ましい緩衝剤は、クエン酸緩衝剤である。好ましい緩衝剤は、封入されている核酸の化学的性質によって、アニオンの範囲が１〜１０００ｍＭであり、高い充填レベルを達成するために、緩衝剤濃度の最適化が重要である場合がある（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号の各明細書参照）。あるいは、塩化物、硫酸塩などでｐＨ５〜６まで酸性化した純水が有用である場合がある。この場合、５％グルコース、または粒子を透析してエタノールを除去し、ｐＨを上昇させたときに、もしくは薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）と混合したときに、粒子膜を隔てた浸透ポテンシャルの平衡を保つ別の非イオン性溶質を添加することが好適である可能性がある。緩衝液中の核酸の量は、さまざまに異なり得るが、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
脂質の混合物と治療的核酸の緩衝水性溶液を組み合わせて、中間混合物を提供する。中間混合物は、典型的には、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに、中間混合物は、負に荷電した核酸と、脂質粒子上の正に荷電した脂質（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質上のプロトン化可能な基のｐＫａよりも低いｐＨの緩衝液中で正に荷電する）のイオン引力が原因で脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に付着する核酸の一部も含有し得る。一群の好ましい実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、各々の溶液の容量は、組み合わせたときに、結果として得られるアルコール含有量が、約２０容量％〜約４５容量％となるように調整される。混合物を組み合わせる方法は、多くの場合、生産される製剤の規模によって、任意の種々のプロセスを含むことができる。例えば、総容量が約１０〜２０ｍＬ以下であるとき、溶液は、試験管の中で組み合わせ、ボッルテックスミキサーを用いて撹拌一体化することができる。大規模なプロセスは、好適な生産規模のガラス製品の中で実行することができる。
随意的に、脂質混合物と治療剤（核酸）の緩衝水性溶液とを組み合わせることによって産生される脂質封入治療剤（例えば、核酸）の複合体を、所望のサイズ範囲および比較的狭い脂質粒子サイズの分布を達成する大きさに作ることができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物を、約７０〜約２００ｎｍの、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの平均直径に合わせて作る。リポソームを所望のサイズに合わせて作るために、いくつかの技術が利用可能である。１つのサイジング法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。浴式またはプローブ式のいずれかの超音波処理によるリポソーム懸濁液の超音波処理は、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さい単層小胞（ＳＵＶ）にまで、次第にサイズを小さくする。ホモジナイゼーションは、剪断エネルギーに頼って大きいリポソームをより小さいリポソームに断片化する別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、選択されたリポソームサイズ（典型的には、約０．１〜０．５ミクロン）が観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して多層小胞を繰り返し循環させる。両方の方法において、粒子サイズ分布は、従来のレーザービームによる粒子サイズ決定によってモニターすることができる。本明細書中のある方法については、押し出し成形を用いて、均一な小胞サイズを得る。
小孔性ポリカーボネート膜または非対称性セラミック膜を通してリポソーム組成物を押し出すことにより、比較的良く画定されたサイズ分布が得られる。典型的には、所望のリポソーム複合体サイズ分布が得られるまで、一回または複数回、膜を通して懸濁液を循環させる。リポソームを、孔が連続的に小さくなる膜を通して押し出して、リポソームのサイズが徐々に小さくなるのを達成してもよい。いくつかの例において、形成される脂質−核酸組成物は、サイジングを行なうことなく使用することできる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分上の表面電荷の少なくともいくらかを中和する工程をさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって、封入されていない核酸を脂質粒子表面から剥がし、従来技術を用いて組成物から除去することができる。封入されていない、表面吸着した核酸を、緩衝液の交換によって、得られる組成物から除去することが好ましい。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物を生成するのに使用される）をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ、ｐＨ約７．５）と置換することによって、リポソーム表面の中和と表面からの核酸の放出がもたらされる。その後、放出された核酸を、標準的な方法を用いてクロマトグラフィーで除去し、その後、使用される脂質のｐＫａよりも高いｐＨの緩衝液に切り換えることができる。
随意的に、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を、水性緩衝液中での水和によって形成させ、核酸を添加する前に、上記の方法のいずれかを用いてサイジングすることができる。上記のように、水性緩衝液は、アミノ脂質のｐＫａよりも低いｐＨであるべきである。その後、核酸の溶液を、これらのサイジングされた、あらかじめ形成された小胞に添加することができる。このような「あらかじめ形成された」小胞への核酸の封入を可能にするために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含有すべきである。エタノールの場合、約２０％（ｗ／ｗ）〜約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在するべきである。さらに、あらかじめ形成された小胞と核酸の混合物を、水性緩衝液−エタノール混合物中で、脂質小胞の組成と核酸の性質に応じて約２５℃〜約５０℃の温度まで温める必要がある場合がある。脂質小胞中の所望の核酸レベルを達成するために封入プロセスを最適化するには、エタノール濃度および温度などの変数を操作する必要があるということが当業者には明白であろう。核酸封入に好適な条件の例は、実施例に提供されている。ひとたび核酸があらかじめ形成された小胞に封入されれば、外部のｐＨを増大させて、表面電荷を少なくとも部分的に中和することができる。その後、封入されていない、表面吸着した核酸を上記のように除去することができる。
使用方法
本発明の脂質粒子を、インビトロまたはインビボで、治療剤を細胞に送達するために使用し得る。特定の実施形態では、治療剤は、本発明の核酸−脂質粒子を用いて細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子および関連する薬学的組成物のさまざまな使用方法に関する以下の説明は、核酸−脂質粒子に関する説明によって例示されるが、これらの方法および組成物が、そのような治療から恩恵を受ける任意の疾患または障害を治療するための任意の治療剤を送達するために容易に適用され得ることが理解される。
ある実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞への導入に好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイムである。これらの方法は、本発明の粒子または組成物を、細胞内送達が起こるのに十分な時間、細胞と接触させることによって実行し得る。
本発明の組成物は、ほとんど全ての細胞型に吸着させることができる。ひとたび吸着すれば、核酸−脂質粒子は、細胞の一部によってエンドサイトーシスされるか、細胞膜と脂質を交換するか、または細胞と融合することができる。複合体の核酸部分の移入または取込みは、これらの経路のいずれか１つを介して起こり得る。本発明の範囲に関して限定されることを意図するものではないが、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた粒子の場合、粒子はその後、エンドソーム膜と相互作用し、おそらくは二重層でない相を形成することによってエンドソーム膜を不安定化し、封入された核酸を細胞質に導入すると考えられている。同様に、粒子と細胞形質膜との直接的な融合の場合、融合が起こると、リポソーム膜は、細胞膜に組み込まれ、リポソームの内容物が細胞内液と組み合わさる。インビトロで実行される場合、細胞と脂質−核酸組成物の接触は、生物学的に適合する媒質中で起こる。組成物の濃度は、特定の用途によってさまざまに異なり得るが、一般に、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。ある実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の治療は、一般に、生理的温度（約３７℃）で、約１〜２４時間、好ましくは約２〜８時間実行される。インビトロでの適用については、核酸の送達は、植物起源のものであれ、または動物起源のものであれ、脊椎動物であれ、または無脊椎動物であれ、いかなる組織またはタイプのものであれ、培養で増殖した任意の細胞に対して行なわれるものであり得る。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、および最も好ましくはヒト細胞である。
一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、６０〜８０％コンフルエントでプレーティングされた、細胞密度が約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞に添加する。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
典型的な適用には、特異的な細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングするｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらす周知の手順の使用が含まれる。あるいは、適用には、治療的に有用なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列の送達が含まれる。このように、欠損または欠如した遺伝子産物を供給することによって、遺伝的疾患に対する（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィー、Ｋｕｎｋｅｌら，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４５（３）：６３０−６４３（１９８９）参照、および嚢胞性線維症、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３（１９８９）参照）に対する治療を提供する。本発明の組成物の他の用途には、細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれる（Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４１：１０２３−１０３３（１９９２）参照）。
あるいは、本発明の組成物を、当業者に公知の方法を用いて、インビボで細胞に核酸を送達するために使用することもできる。ＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を送達するための本発明の適用に関して、Ｚｈｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）（これは、参照により本明細書に組み入れられる）には、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ錯体を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達が記載されている。Ｈｙｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）（これは、参照により本明細書に組み入れられる）には、リポソームを用いた、マウスの気道上皮へのおよび肺の肺胞への嚢包性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達が記載されている。Bｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９）（これは、参照により本明細書に組み入れられる）には、細胞内酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性の原核生物遺伝子によるマウスの肺のインビボトランスフェクションが記載されている。このように、本発明の組成物を感染性疾患の治療で使用することができる。
インビボ投与については、薬学的組成物を、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与することが好ましい。特定の実施形態では、薬学的組成物を、ボーラス注射によって、静脈内または腹腔内に投与する。一例として、Ｓｔａｄｌｅｒら，米国特許第５，２８６，６３４号明細書明細書を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。細胞内核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０１：５１２−５２７（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．６：２３９−２７１（１９８９）、およびＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８（１９９３）でも考察されている。脂質をベースにした治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら，米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ，米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら，米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら，米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら，米国特許第４，５８８，５７８号の各明細書に記載されている。
他の方法において、薬学的調製物を組織に直接適用することにより、この調製物を標的組織と接触させてもよい。適用は、局所的処置、「開かれた」処置、または「閉じた」処置によって行ない得る。「局所的」は、環境に露出している組織（例えば、皮膚、中咽頭、外耳道など）に薬学的調製物を直接適用することを意味する。「開かれた」処置とは、患者の皮膚を切開し、薬学的調製物が適用される下層組織を直接可視化することを含む処置のことである。これは、一般に、肺にアクセスするための開胸手術、腹部内臓にアクセスするための腹式開腹術、または標的組織への他の直接的な外科的アプローチなどの外科的処置によって遂行される。「閉じた」処置とは、内部の標的組織を直接可視化するのではなく、皮膚の小さい傷を通した挿入器具で内部の標的組織にアクセスする侵襲的な処置のことである。例えば、調製物を針洗浄で腹膜に投与してもよい。同様に、薬学的調製物を、脊髄麻酔またはメトラズアミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）による脊髄の画像化のために一般に行われるように、腰椎穿刺と、それに続く患者の適当な位置決めの間に、注入によって髄膜または脊髄に投与してもよい。あるいは、調製物を内視鏡装置で投与してもよい。
脂質−核酸組成物を、肺に吸入されるエアロゾル（Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８−２８１（１９８９）参照）で、または疾患部位での直接的な注射によって（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４））投与することもできる。
本発明の方法は、種々の宿主で実施され得る。好ましい宿主には、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳類種が含まれる。
本発明の脂質−治療剤粒子の投薬量は、治療剤対脂質の比率、ならびに患者の年齢、体重、および状態に基づいた投与医師の意見によって決まることになる。
一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を調節することができる核酸と会合している本発明の脂質粒子と細胞を接触させる工程を含む。本明細書で使用される場合、「調節すること」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を変化させることを指す。異なる実施形態では、調節することは、増大させることもしくは増強することを意味することができ、または減少させることもしくは低下させることを意味することができる。標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現レベルを測定する方法は当技術分野で公知かつ利用可能であり、例えば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学技術を利用する方法を含む。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現レベルは、適当な対照値と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％より大きく増大または低下する。
例えば、ポリペプチドの発現の増大が所望される場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよい。他方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下が所望される場合、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、それによって標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであってもよい。あるいは、核酸は、そのようなオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡなどを発現するプラスミドであってもよい。
特定の実施形態では、治療剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、ここで、これらのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を低下させるように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能性変異体もしくは断片の発現が増大するように、これらのポリペプチドまたはその機能性変異体もしくは断片をコードするプラスミドである。
関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、その治療剤が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、これらのｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補体を含む、本発明の薬学的組成物を対象に提供する工程を含む方法を提供する。
別の関連する実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、その治療剤が、このポリペプチドまたはその機能性変異体もしくは断片をコードするプラスミドである、本発明の薬学的組成物を対象に提供する工程を含む方法を提供する。
さらなる実施形態では、薬学的組成物を、ワクチンまたは抗原と組み合わせて対象に投与する。したがって、本発明それ自体が、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含み、免疫応答が望ましい抗原と関連してもいる、本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供する。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であるか、または例えば、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫などの感染性因子と関連する。
種々の腫瘍抗原、感染性因子抗原、および他の疾患と関連する抗原が当技術分野で周知であり、これらの例が本明細書で引用される参考文献に記載されている。本発明で使用するのに好適な抗原の例としては、ポリペプチド抗原またはＤＮＡ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。抗原の具体的な例は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽、インフルエンザ、発疹チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、および風疹の抗原である。好ましい実施形態では、抗原は、Ｂ型肝炎の組換え抗原である。他の態様では、抗原は、Ａ型肝炎の組換え抗原である。別の態様では、抗原は、腫瘍抗原である。このような腫瘍関連抗原の例は、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原、およびバーキットリンパ腫と関連する抗原である。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原の組換え抗原である。当業者は、本発明で使用するのに好適な他の抗原を理解しているであろう。
本発明で使用するために好適な腫瘍関連抗原には、突然変異分子と非突然変異分子の両方が含まれ、これらの分子は、単一の腫瘍型を示してもよく、いくつかの腫瘍型で共有されてもよく、かつ／または正常細胞と比較して腫瘍細胞でもっぱら発現もしくは過剰発現していてもよい。タンパク質および糖タンパク質に加えて、糖質、ガングリオシド、糖脂質、およびムチンの腫瘍特異的な発現パターンも記載されている。本癌ワクチンで使用される例示的な腫瘍関連抗原には、オンコジーン、腫瘍抑制因子遺伝子、および腫瘍細胞に特有の突然変異もしくは再配列を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚性遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的（だが、腫瘍特異的ではない）分化抗原、増殖因子受容体、細胞表面糖質残基、外来ウイルスタンパク質、ならびに多くの他の自己タンパク質が含まれる。
腫瘍関連抗原の具体的な実施形態には、例えば、突然変異抗原（例えば、Ｒａｓ ｐ２１プロトオンコジーン、腫瘍抑制因子ｐ５３、およびＢＣＲ−ａｂｌオンコジーンのタンパク質産物、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、およびβカテニン）；過剰発現抗原（例えば、ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水素酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、およびＫＳＡ、腫瘍胎児性抗原（例えば、αフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）））；自己抗原（例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原（例えば、Ｍａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＴＲＰ２））；前立腺関連抗原（例えば、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、およびＰＳＭ−Ｐ２）；再活性化胚性遺伝子産物（例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、および他の癌精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、およびＳＣＰ１））；ムチン（例えば、Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２）；ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、およびＧＤ３）、中性糖脂質、ならびに糖タンパク質（例えば、ルイス（ｙ）およびグロボ−Ｈ））；ならびに糖タンパク質（例えば、Ｔｎ、トンプソン−フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原（ＴＦ）、およびｓＴｎ）が含まれる。全細胞および腫瘍細胞ライセート、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用されるＢリンパ球のモノクローナル増殖物上に発現した免疫グログリンイディオタイプ、およびその免疫原性部分も、本明細書に記載される腫瘍関連抗原として含まれる。
病原体には、哺乳類（より特には、ヒト）に感染する感染性因子、例えば、ウイルスが含まれるが、これに限定されない。感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；および他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パピローマウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポッククウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；ならびにイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎（クラス１＝内部で伝染する；クラス２＝非経口で伝染する（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌も脊椎動物における抗原としての役割を果たす。このようなグラム陽性細菌には、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体的な例には、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア菌（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲルス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネマ・パルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が含まれるが、これらに限定されない。
病原体のさらなる例には、哺乳類（より特には、ヒト）に感染する感染性真菌が含まれるが、これに限定されない。感染性真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれるが、これらに限定されない。感染性寄生虫の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）などの変形体が挙げられる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）には、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
一態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、該細胞に本発明の組成物を提供する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子の突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異、ＲＡＳ遺伝子の突然変異、カベオリンＩ遺伝子の突然変異、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異、Ｍ６８遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される。
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および付随する特許請求の範囲で使用される特定の用語および語の意味が、以下に提供される。本明細書の他の部分におけるある用語の用法と本節で示されるその定義との間に明白な矛盾がある場合には、本節の定義が優先されるものとする。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、通常、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれ含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置換部分も指すことができるということが理解されよう。当業者にはよく知られていることであるが、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分に置換し、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させないでおくことが可能である。例えば、限定するものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドに置換し得る。このような置換部分を含む配列は本発明の実施形態である。
本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、当技術分野で、ＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固因子ＶＩＩ前駆体、凝固因子ＶＩＩ、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進因子、ＦＶＩＩ凝固タンパク質、およびエプタコグアルファとしても知られている。
本明細書で使用される場合、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを含む、遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。
本明細書で使用される場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって説明される、ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、および別途示されない限り、ヌクレオチド対との関連で使用される場合の「相補的」という用語は、古典的なワトソン−クリック対、すなわち、ＧＣ、ＡＴ、またはＡＵを意味する。この用語は、一方または両方のヌクレオチドが、例えば、リボース修飾またはリン酸骨格修飾によって、本明細書に記載されるように修飾されている古典的なワトソン−クリック対形成にまでも及ぶ。この用語は、イノシンまたは塩基対形成特性を実質的には変化させない他の実体との対形成も含むことができる。
本明細書で使用される場合、および別途示されない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を説明するのに使用される場合の「相補的」という用語は、当業者に理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、特定の条件下で二重鎖構造を形成する能力を指す。相補性は、生理的条件下での、すなわち、生物内で直面し得る生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする完全な相補性、実質的な相補性、および十分な相補性を含むことができる。完全な相補性とは、個々の対について上で定義されるような、第１の配列と第２の配列の対の全てにおける相補性を指す。ある配列が、本明細書中の第２の配列に対して「実質的に相補的」である場合、この２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはこれらの配列は、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の、しかし通常は、多くて４つ、３つ、もしくは２つのミスマッチの塩基対を形成しながらも、その最終的な適用に最も関連がある条件下でハイブリダイズする能力を保持し得る。実質的な相補性は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとしても定義することができ、この場合、ストリンジェントな条件は、以下を含み得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間の後、洗浄。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件の組を決定することができるであろう。
しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしたときに、１つ以上の一本鎖突出を形成するように設計される場合、そのような突出は、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、一方の２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、もう一方の２３ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的のために、やはり「完全に相補的」と呼ばれ得る。
本明細書で使用される「相補的」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対ならびに／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、またはこれらの塩基対から完全に形成されてもよい。
生理的条件下での、例えば、生物内で直面し得る生理的に関連のある条件下でのハイブリダイゼーションを可能にする「相補的」、「完全に相補的」、「実質的に相補的」、および十分な相補性という用語は、これらを使用する文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基ミスマッチに関して本明細書で使用され得る。
本明細書で使用される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に相補的な、例えば、実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、対象となる（例えば、第ＶＩＩ因子をコードする）ｍＲＮＡの連続した部分に相補的な、例えば、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、かつ上で定義されたような、実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、またはリボ核酸分子の複合体を指す。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２つの鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの分子が１つのより大きい分子の部分であり、したがって、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’−末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’−末端の間の中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’−末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’−末端の間の中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、接続構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチド突出を含み得る。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは、「小さい阻害性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド突出」とは、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’−末端がもう一方の鎖の５’−末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する不対ヌクレオチド（単数または複数）を指す。「平滑」または「平滑末端」とはｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわち、ヌクレオチド突出がないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡとは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチド突出がないｄｓＲＮＡのことである。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される場合、「相補領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列（例えば、標的配列）に実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、かつ、存在する場合は、通常、末端領域（単数または複数）に、例えば、５’末端および／または３’末端から６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内にある。
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖のある領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
「同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列を比較することによって決定される、このような配列間の関係性のことである。同一性はまた、一連のポリヌクレオチド配列間の一致によって決定される、このような配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）参照）。本明細書で使用される「実質的に同一」とは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応する部分との間に非常に高い相同性（好ましくは１００％の配列同一性）があることを意味する。しかしながら、９０％超、または９５％の配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明で使用してもよく、したがって、遺伝子突然変異、系統多形、または進化的分岐のために見込まれ得る配列の変異も許容することができる。１００％同一性が好ましいが、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡと標的遺伝子の間に単一または複数の塩基対のランダムなミスマッチを含有してもよい。
当業者には理解されるように、「細胞に導入する」とは、ｄｓＲＮＡに関する場合、細胞内への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、人の手を借りない拡散プロセスまたは細胞の能動的プロセスを通じてなされ得るし、または補助的な薬剤もしくは装置によってなされ得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されるものではない。ｄｓＲＮＡは、生きた生物の一部である「細胞に導入される」場合もある。このような例では、細胞への導入は、生物への送達を含むことになる。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注入することができるし、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
「サイレンシングする」および「発現を阻害する」という用語は、これらの用語が第ＶＩＩ因子遺伝子を指すものである限り、本明細書では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を指し、この抑制は、第ＶＩＩ因子遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群であって、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現が阻害されるように処理された細胞または細胞群から単離し得る、第ＶＩＩ因子遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群であって、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、第１の細胞または細胞群のように処理されていない細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、減少していることによって明らかにされるようなものである。阻害の程度は通常；
（対照細胞のｍＲＮＡ）−（処理細胞のｍＲＮＡ）×１００／（対照細胞のｍＲＮＡ）
で表される。
あるいは、阻害の程度は、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写に関数関係があるパラメータ、例えば、細胞によって分泌される、第ＶＩＩ因子遺伝子にコードされたタンパク質の量、またはある表現型（例えば、アポトーシス）を示す細胞の数、の減少という観点から与えられる場合もある。原則として、第ＶＩＩ因子遺伝子のサイレンシングは、構成的にかまたはゲノム工学によるかのいずれかで、標的を発現している任意の細胞において、任意の適当なアッセイによって測定し得る。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡが第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を一定の度合いで阻害するかどうか、したがって、このｓｉＲＮＡが本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、以下の実施例に提供されるアッセイが、そのような参照としての役割を果たすものとする。
例えば、ある例では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約２０％、２５％、３５％、４０％、または５０％抑制される。好ましい実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。より好ましい実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子は、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
「治療する」、「治療」などの用語は、疾患または障害の緩和または軽減を指す。本発明との関連において、以下に本明細書で引用される他の状態（例えば、血栓疾患以外の第ＶＩＩ因子が仲介する状態）のいずれかに関する限り、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を遅延もしくは逆行させることを意味する。
「治療的に有意義な」組成物は、適切な用量で投与されたときに、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を緩和または軽減することができる。
本明細書で使用される場合、「第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患」という用語ならびに関連用語および関連語句は、不適切な（例えば、正常よりも大きい）第ＶＩＩ因子の活性を特徴とする状態または障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性は、通常は第ＶＩＩ因子を発現しない細胞での第ＶＩＩ因子の発現、または（例えば、ウイルス性出血熱の症状、もしくは血栓を引き起こす）第ＶＩＩ因子発現の増大の結果として生じ得る。第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、不適切な第ＶＩＩ因子の機能的活性によって完全にまたは部分的に仲介され得る。しかしながら、第ＶＩＩ因子が仲介する状態または疾患は、第ＶＩＩ因子の調節によって、根本的な状態または障害にいくらかの影響を及ぼせるものである（例えば、第ＶＩＩ因子の阻害剤によって、少なくとも一部の患者では健康がいくらか改善される）。
「出血熱」には、ウイルス感染によって引き起こされる病気の組合せが含まれる。典型的には、発熱と消化管症状に続いて、毛細血管の出血が起こる。
「凝固障害」とは、対象の血液凝固機構の任意の欠陥のことである。
本明細書で使用される場合、「血栓障害」とは、好ましくは望まない第ＶＩＩ因子発現に起因する任意の障害のことであり、望ましくない血液凝固を特徴とする任意の障害を含む。
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」および「予防的有効量」という語句は、ウイルス性出血熱、またはそのような障害の明らかな症状（例えば、出血、発熱、衰弱、筋肉痛、頭痛、炎症、もしくは循環性ショック）の治療、予防、もしくは管理において治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、普通の医師により容易に決定可能であり、当技術分野で公知の要因、例えば、血栓障害のタイプ、患者の病歴および年齢、疾患の段階、ならびに他の薬剤の投与などによって変わり得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」には、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡと薬学的に許容される担体とが含まれる。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」、または単に「有効量」とは、意図される薬理学的結果、治療的結果、または予防的結果をもたらすのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低下したときに、所与の臨床治療が有効であると考えられる場合、その疾患または障害を治療するための薬物の治療的有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％低下をもたらすのに必要な量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤を投与するための担体を指す。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、細胞培養培地を特に除外する。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、香料、着色剤、および防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得、一方、潤滑剤は、存在する場合には、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望の場合には、消化管内での吸収を遅らせるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングし得る。
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」とは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することが可能なベクターが導入された細胞のことである。
「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状の、非環状または環状の、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが含まれ、一方、飽和分枝アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれ、一方、不飽和環状アルキルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。
「アルケニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるような、アルキルを意味する。アルケニルには、シス異性体とトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖アルケニルおよび分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれる。
「アルキニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上で定義されるような、任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖アルキニルおよび分枝アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが含まれる。
「アシル」は、結合位置の炭素が、以下で定義されるような、オキソ基で置換されている任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
「ヘテロ環」は、飽和、不飽和、もしくは芳香族のいずれかで、窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する、５〜７員の単環式ヘテロ環、または７〜１０員の二環式ヘテロ環を意味し、ここで、窒素および硫黄のへテロ原子は、随意的に酸化されていてもよく、窒素へテロ原子は、随意的に四級化されていてもよく、任意の上記のヘテロ環がベンゼン環に融合されている二環式環を含む。ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。ヘテロ環には、以下で定義されるヘテロアリールが含まれる。ヘテロ環には、モルフォニリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロールアクタミル（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍｙｌ）、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
「ヘテロアリール」は、炭素原子、水素原子、ならびに窒素、酸素、および、硫黄から独立に選択される１個以上のヘテロ原子（好ましくは１〜３個のへテロ原子）を含む単環式または多環式の芳香族環を意味する。当業者には周知であるように、ヘテロアリール環は、全て炭素の対応物よりも芳香族性が少ない。したがって、本発明の目的のために、ヘテロアリール基は、ある程度の芳香族性を有することのみが必要である。例示的なヘテロアリール基には、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジル、ピラジル、トリアジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、（１，２，３，）−トリアゾリルおよび（１，２，４）−トリアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、テトラゾリルが含まれるが、これらに限定されない。
「随意的に置換されたアルキル」、「随意的に置換されたアルケニル」、「随意的に置換されたアルキニル」、「随意的に置換されたアシル」、および「随意的に置換されたヘテロ環」という用語は、置換されるときに、少なくとも１つの水素原子が置換基と置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換される。この点に関して、置換基には、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙ（式中、ｎは０、１、または２であり、ＲｘおよびＲｙは同じか、または異なり、かつ独立に水素、アルキル、もしくはヘテロ環であり、該アルキル置換基とヘテロ環置換基は各々、１つ以上のオキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、ヘテロ環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、および−ＳＯｎＮＲｘＲｙでさらに置換されていてもよい）が含まれる。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
一実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基に関する方法論は、当業者によく知られている（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ら，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９参照）。簡潔に述べると、本発明との関連における保護基とは、官能基の望まない反応性を低下させるかまたは排除する任意の基のことである。特定の反応中の反応性をマスキングするために、保護基を官能基に付加し、その後、もとの官能基を露出させるために除去することができる。一実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」とは、アルコール官能基の望まない反応性を減少させるかまたは排除する任意の基のことである。保護基は、当技術分野で周知の技術を用いて付加および除去することができる。
本発明の化合物は、実施例にさらに詳細に記載される方法を含む、公知の有機合成技術によって調製することができる。
以下の実施例は、特許請求された本発明を例証するために提供されるのであって、それを限定するために提供されるのではない。
実施例１．コンジュゲーション用の糖質ビルディングブロックの合成
Figure 2021020928
１０１の調製：
ガラクトサミンペンタアセテート１００(５２．００ｇ、１３３．６３ｍｍｏｌ)を、周囲温度でジクロロエタン（３００ｍＬ）中に入れた。そこに、ＴＭＳＯＴｆ（４４．５５ｇ、２００．４４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で９０分間、水浴で撹拌し、加熱を停止し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を暗色の粘性物質（４４．５０ｇ、定量的）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。１Ｈ ＮＭＲとＭＡＬＤＩで生成物の生成を確認した。ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ８の計算値３２９．１１；実測値３５２．１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０２の調製：
化合物１０１（４３．７０ｇ、１３３．５６ｍｍｏｌ）とそのベンジルエステル（４１．７１ｇ、２００．３４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．５０ｇ、６６．７８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０％−１００％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（６０．５０ｇ、８６％）として得た。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ ＭＳ：Ｃ２６Ｈ３５ＮＯ１１の計算値５３７．２２；実測値５６０．２１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０３の調製：
化合物１０２（６０．００ｇ、１１１．６８ｍｍｏｌ）を、メタノール／酢酸エチルの混合物に溶解させ、アルゴンで脱気した。Ｐｄ／Ｃ（６．００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、ウェットタイプ）を添加し、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄し、高真空下で一晩乾燥して、生成物（４８．８５ｇ、９８％）を得た。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２９ＮＯ１１の計算値４４７．１７；実測値４６９．９（Ｍ＋Ｎａ）。
１０４の調製：
化合物１０１（４２．３０ｇ、１２８．４３ｍｍｏｌ）とそのアジドエタノール（２６ｇ、１９２．４５ｍｍｏｌ）をジクロロエタン（３００ｍＬ）に溶解させ、そこに分子ふるい（５０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。そこにＴＭＳＯＴｆ（１４．２９ｇ、６４．２１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出：２０％−１００％の酢酸エチル／ヘキサン、次いで５％−１０％のメタノール／酢酸エチル）で精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体（５９．２３ｇ、９１．００％）として得た。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３２Ｎ４Ｏ１１の計算値５０４．２１；実測値５２７．１（Ｍ＋Ｎａ）。
１０５の調製：
化合物１０４（９．３３ｇ、１８．５０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ３（５．９７ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。出発材料が完全に消失したことをＴＬＣで確認した。水（１ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに２４時間撹拌した。ＴＦＡ（２．８５ｍＬ、２３．１２ｍｍｏｌ）とトルエン（４０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ（２×４０ｍＬ）、高真空下で乾燥させた。これを同日中に次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ２０Ｈ３４Ｎ２Ｏ１１の計算値４７８．２２；実測値５００．８（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１０７の調製：
化合物１０６（ＪＯＣ ２００２）（６．９４ｇ、１４．７３ｍｍｏｌ）とモノｂｏｃプロピルアミン（１０．２６ｇ、５８．８９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（１７．２６ｇ、４５．５０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１５．３６ｍＬ、８８．１４ｍｍｏｌ）を添加し、一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に入れ、ジクロロメタンで抽出し、重炭酸ナトリウム溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで２％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物を白色の綿毛状の固体（１０．４９ｇ、７６％）として得た。ＭＳ：Ｃ４５Ｈ７７Ｎ７Ｏ１４の計算値９３９．５５；実測値９４０．５３（Ｍ＋Ｈ）。
１０８の調製：
化合物１０７（２．４０ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、そこにＴＦＡ／ＤＣＭ（１：４、１０ｍＬ）の混合物を添加し、３０分間撹拌した。反応を質量スペクトルでモニターした。１００ｍＬのトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ（２×１００ｍＬ）、高真空下で乾燥させて、化合物をそのＴＦＡ塩（白色の粘着性物質、２．４７ｇ、９９％）として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ３０Ｈ５３Ｎ７Ｏ８の計算値６３９．４０；実測値６４０．４５（Ｍ＋Ｈ）。
１０９の調製：
ＧａｌＮＡｃ酸１０３（４．００ｇ、８．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、そこにＨＢＴＵ（３．７５ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１．３４ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（５ｍＬ、３．２当量）を添加し、３〜４分間撹拌した。そこに１０８（２．４７ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで勾配溶出５％−１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物１０９を白色の固体（４．２０ｇ、８７％）として得た。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１３４Ｎ１０Ｏ３８の計算値１９２６．８９；実測値１９４９．５（Ｍ＋Ｎａ）。
１１０の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１０９（７．５０ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）を、アルゴンで脱気したメタノール（５０ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．８００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａタイプ、ウェット）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で一晩水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．４６５ｍＬ、５．２２ｍｍｏｌ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（淡黄色の固体、７．３０ｇ、９９％）として得た。ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１２８Ｎ１０Ｏ３６の計算値１７９２．８５；実測値１８１５．９（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１１１の調製：
トリカルボン酸１０６（２．１７ｇ、４．６２５ｍｍｏｌ）とアミン（１８．５０ｍｍｏｌ、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（５．３４ｇ、１６．６３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．２４ｇ、１６．５９ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（５．６４ｍＬ、３２．３６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（４ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％−１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１１１を白色の固体（５．８０ｇ、６８％）として得た。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ７Ｏ４１の計算値１８５１．７９；実測値１８７４．２０（Ｍ＋Ｎａ）。
１１２の調製：
ＧａｌＮＡｃ誘導体１１１（５．７５ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）を、アルゴンで脱気したメタノール（１００ｍＬ）中に入れた。Ｐｄ／Ｃ（０．６００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、含水型）と数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。ＴＦＡ（０．３５４ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（３０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと共蒸発させ（２回）、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をＴＦＡ塩（５．７０ｇ、粗製物）として得た。ＭＳ：Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ７Ｏ４１の計算値１７１７．７５；実測値１７４０．５（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１１３の調製：
Ｚ−アミノカプロン酸（２．１９ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（３．１３ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．１９ｍＬ、５．００当量）を添加し、混合物を数分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン１１２（１０．１０ｇ、５．５２ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、前記混合物に添加し、４８時間撹拌した。ＴＬＣとＭＡＬＤＩで生成物の生成について確認した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、ＮａＨＣＯ３溶液と水で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチルによる溶出、次いで５％−１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出）で精製して、所要の化合物１１３をオフホワイトの固体（６．２０ｇ、５７％）として得た。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ１３６Ｎ８Ｏ４２の計算値１９６４．８８；実測値１９８７．７５（Ｍ＋Ｎａ）。
１１４の調製：
化合物１１３（６．１０ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、そこに１ｍＬの酢酸を添加した。反応混合物を脱気し、そこにＰｄ／Ｃ（０．７００ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、含水型）を添加し、バルーン圧下で３６時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨで洗浄した。そこに１．２５当量のＴＦＡとトルエン（５０ｍＬ）を添加し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させて、所要の化合物をオフホワイトの固体（６．１０ｇ、定量的）として得た。この化合物を、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ７９Ｈ１３０Ｎ８Ｏ４０の計算値１８３０．８４；実測値１８５３．８１（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１１６の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１１５（１５．００ｇ、２０．２４ｍｍｏｌ）とアジドアルコール（４．２５ｇ、１．２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸騰させた。残渣を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＴＥＡでクエンチした。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（２０％−５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（８．３６ｇ、５５％）として得た。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ３９Ｎ３Ｏ１２の計算値７５３．２５；実測値７７６．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
１１７の調製：
化合物１１６（８．３０ｇ、１１．０１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（７０ｍＬ）に溶解させ、そこにＰＰｈ３（３．４６ｇ、１．２当量）を添加し、混合物を周囲温度で２日間撹拌した。そこに水（１ｍＬ）を添加し、混合物をさらに２４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。そこにトリフルロ酢酸（１．０６ｍＬ、１．２５当量）とトルエン（５０ｍＬ）を添加した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をトルエンと２回共蒸発させ、高真空下で乾燥させた。これを、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ４０Ｈ４１ＮＯ１２の計算値７２７．２６；実測値７５０．２３（Ｍ＋Ｎａ）。
１１８の調製：
トリカルボン酸（１１．０５ｇ、２３．４５ｍｍｏｌ）とアミン（６８．１９ｇ、９４ｍｍｏｌ、先の反応からの粗製物）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解させた。そこにＴＢＴＵ（２７．０９ｇ、８４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１１．３４ｇ、８４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（２８ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。２４時間撹拌した後、追加量のＤＩＥＡ（２８ｍＬ）を添加し、撹拌を続けた。４８時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、１Ｍリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、および水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次いで３％−１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物１１８を白色の固体（４１．９５ｇ、６７％）として得た。ＭＳ：Ｃ１４１Ｈ１４６Ｎ４Ｏ４４の計算値２５９８．９３；実測値２６２１．８９（Ｍ＋Ｎａ）。
１１９の調製：
化合物１３３（３．０５ｇ、１．１７６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＭｅＯＨの混合物に溶解させた。そこに５０当量のギ酸アンモニウム、次いで５％Ｐｄ／Ｃ（１．５ｇ、５０重量％）を添加し、周囲温度で８時間撹拌した。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、ＭｅＯＨ／ＤＣＭで洗浄し、溶媒を除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を白色の固体（２．６５ｇ、９２％）として得た。ＭＳ：Ｃ１３３Ｈ１４０Ｎ４Ｏ４２の計算値２４６４．８９；実測値２４８７．９２（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１１６’の調製：
マンノーストリクロロアセトイミデート１１５（１５．２３ｇ、２０．５５ｍｍｏｌ）とＡ（４．３６ｇ、１．０２当量）をトルエンに溶解させ、２回共沸騰させた。残渣を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル（３０ｍＬ）と分子ふるい（１０ｇ）を添加した。反応混合物を氷水浴で冷却した。そこにＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ、０．１当量）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＴＥＡでクエンチした。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン、１５％−２５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を無色の液体（１４．５２ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ４６Ｈ４２Ｏ１２の計算値７８６．２７；実測値８０９．２５（Ｍ＋Ｎａ）。
１１７’の調製：
マンノースベンジルエステル（１４．３０ｇ、１８．１７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させ、そこに２滴の酢酸を添加した。脱気し、Ｐｄ／Ｃ（１．５０ｇ、１０重量％ Ｄｅｇｕｓｓａ、含水型）を添加し、バルーン圧下で２４時間水素化した。反応をＴＬＣとＭＡＬＤＩでモニターした。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を除去し、残渣を高真空下で乾燥させて、化合物を無色のオイル（１１．２０ｇ、９０％）として得た。ＭＳ：Ｃ３９Ｈ３６Ｏ１２の計算値６９６．２２；実測値７１９．１８（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１２２の調製：
化合物１２０（２６．５５ｇ、６４．０６ｍｍｏｌ）と１２１（１０．００ｇ、５３．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（２４．１２ｇ、６４ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４６ｍＬ、５当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（２０％−５０％の酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（２３．２０ｇ、７４％）として得た。ＭＳ．Ｃ３２Ｈ４５Ｎ３Ｏ７のＭＷ計算値：５８３．７２、実測値５８４．７３（Ｍ＋Ｈ）。
１２３の調製：
化合物１２２（３．３０ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル／ＭｅＯＨの混合物に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）を触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。ＭＳ．Ｃ１６Ｈ３３Ｎ３Ｏ３のＭＷ計算値：３１５．２５、実測値３１６．２６（Ｍ＋Ｈ）。
１２４の調製：
化合物１２３（５．６５ｍｍｏｌ）とＧａｌＮＡｃ酸１０３（５．８１ｇ、１２．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（４．９７ｇ、１３．１０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（７．００ｍＬ，３当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭに溶解させ、水とブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いで３％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体（５．２５ｇ、７９％）として得た。ＭＳ．Ｃ５４Ｈ８７Ｎ５Ｏ２３のＭＷ計算値：１１７３．５８、実測値１１９６．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
１２５の調製：
二分岐のＧａｌＮＡｃ誘導体１２４（５．１５ｇ、４．４０ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させ、そこに３ｍＬのアニソールと３０ｍＬのＴＦＡを添加し、この反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣで確認し、反応混合物にトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。トルエンと２回共蒸発させ、残渣をＤＣＭに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を濾過カラム（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を薄茶色の固体（４．４０ｇ、９１％）として得た。ＭＳ．Ｃ５０Ｈ７９Ｎ５Ｏ２３のＭＷ計算値：１１１７．５２、実測値１１４０．６２（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
ビルディングブロック１２６と１２７は、１０３の合成手順と同様の手順を用いて合成する。ビルディングブロック１２８と１２９は、１０５の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
Figure 2021020928
１３５の調製：
ビルディングブロック１３５は、１１０の合成手順と同様の手順を用いて合成する。
Figure 2021020928
１３７の調製：
マンノース（１０．００ｇ、５５．５３ｍｍｏｌ）とデシノール（１００ｇ、溶媒）とＣＳＡ（５００ｍｇ）を１１０℃で、油浴で一晩撹拌した。デシノールの色は一晩で濃い茶色になった。デシノールの大部分を減圧下で完全蒸留した。残渣をＤＣＭに溶解させ、ＴＥＡで中和した。この溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドによる濾過（初めに酢酸エチル、次に１０％−１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物（７．５２ｇ、４２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）（７．５２ｇ、４２％）．オール）とデシノール（１００ｇ、溶媒）とＣＳＡ（５００ｍｇ）を１１０℃で、油浴で撹拌した。
１３９の調製：
化合物１３７（０．１７２ｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（１０μ（１０２ｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。ＭＳを添加し、５ｍＬのＤＣＭ中の１３８（１．００ｇ．１．３５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下して添加した。反応をＴＬＣでモニターし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をＴＥＡでクエンチし、ＤＣＭで希釈し、ＭＳを濾過で除去し、乾燥させた。残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％−４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．５５０ｇ、６９％）として得た。５ｍＬのＤＣＭ中の１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）３５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下して添加した。反応をＴＬＣでモニターし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をＴＥＡでクエンチし、ＤＣＭで希釈し、濾過し、５ｍＬのＤＣＭ中の１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１００ＭＨｚ）３５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下して添加した。反応をＴＬＣでモニターし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をＴＥＡと２Ｈでクエンチした）、１．３０−０．９２（ｍ，１２Ｈ．６３，１２８．６１，１２８．５４，１２８．４７，１２８．４４，１１４．３７，１０２．７４，１０２．６８，９８．８１，８５．２７，７２．４３，７１．９６，７１．３７，７１．３１，７１．０１，７０．３０，７０．２６，７０．０５，６８．３１，６８．２３，６７．４１，６６．１１，６２．６３，６２．０８，３３．９６，２９．６５，２９．５８，２９．５３，２９．５８，２９．０８，２６．２０。ＭＳ．Ｃ８４Ｈ８２Ｏ２４について計算された分子量、計算値１４７４．５２、実測値１４９７．６０（Ｍ＋Ｎａ）。
１４０の調製：
化合物１３９（０．１０４ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／Ｐｙ（１０ｍＬ、１：１）とＡｃ２Ｏ（０．５ｍＬ、過剰）とＤＭＡＰ（０．０５０ｇ）の混合物に溶解させ、反応物を一晩撹拌した。反応物をＭｅＯＨでクエンチし、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出１０％−３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の綿毛状の固体（０．１０８ｇ、９９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）過剰）とＤＭＡＰ（０．０５０ｇ）、そして反応物を一晩撹拌した。反応物をＭｅＯＨでクエンチし、溶媒を除去した。０７（ｍ，１３Ｈ），３．９０−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９８−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０−２．０１（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｓ，３Ｈ），１．４２−１．２０（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１００ＭＨｚ）過剰）とＤＭＡＰ（０．０５０ｇ）、そして反応物を一晩撹拌した。反応物。７．８２，１０．４３Ｈｚ，１Ｈ），５．６５−５．４７（ｍ，２Ｈ），５．１０−４．０７（ｍ，１３Ｈ），３．９０−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．６１（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．２８（ｍ，１Ｈ），２．９８−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．１０−２．０１（ｍ，４Ｈ），１２８．４７，１２８．４０，１１４．３５，１０２．３２，９９．５８，９６．６４，７４．５１，７２．１１，７１．９１，７１．４６，７１．２１，６９．７８，６９．７２，６９．５１，６９．２８，６８．１９，６８．０３，６７．８２，６７．１２，６１．９７，６１．８３，３３．９４，２９．６３，２９．６１，２９．５５，２９．４９，２９．２７，２９．２０，２９．０５，２６．１１，２１．０６，２０．０２。ＭＳ：Ｃ８８Ｈ８６Ｏ２６について計算された分子量、計算値１５５８．５４、実測値１５８１．８（Ｍ＋Ｎａ）。
１４１の調製：
化合物１４１（１．３６ｇ、０．８７３ｍｍｏｌ）をジオキサン：水（４０ｍＬ、３：１）の混合物に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．２０３ｍＬ、２当量）、次いでＯｓＯ４溶液（１ｍＬ。０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（０．７７４ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭ（３回）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を全て除去し、残渣を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残渣をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（０．５９０ｇ、１．０５当量）を添加し、周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、２ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配抽出０％−４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物を白色の固体（１．０８ｇ ７９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）−ｄ 当量）、そして周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、２ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、乾燥させた。１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９０−４．３５（ｍ，７Ｈ），４．１０−３．５５（ｍ，４Ｈ），３．３０−３．２０（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．８７（ｍ，１Ｈ），２．１８−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），２．０１−１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５１−１．３９（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｓ，３Ｈ），１．２０−１．０１（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１００ＭＨｚ）−ｄ 当量）、そして周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、２ｍＬの１．６０，１３３．４９，１３０．１８，１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．５２，１２９．４４，１２９．２０，１２９．１３，１２８．９１，１２８．８９，１２８．８１．１２８．７８，１２８．７１，１２８．５１，１２８．４５，１０２．３４，９９．６７，９６．６５，７４．６０，７２．１７，７１．９４，７１．４９，７１．２１，６９．８２，６９．７９，６９．５９，６９．３７，６８．２２，６８．１１，６７．８１，６７．２０，６４．５５，６１．９９，６１．８５，６０．５９，４４．０６，３３．９６，３０．７９，２９．３９，２９．３１，２９．２４，２９．２０，２９．１７，２９．０８，２６．０８，２４．８５，２４．７９，２２．２０，２１．２４，２１．１１，２０．０７。ＭＳ：Ｃ８７Ｈ８４Ｏ２８について計算された分子量、計算値１５７６．５１、実測値１５９９．５０（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
１４８の調製：
化合物１４８は、報告されている手順に従って合成した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．；Ｋａｒｅｎ，Ｐ．；Ｌａｕｒｅｎｃｅ，Ｖ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００４，５２，９６５−９７１．）。
１４９の調製：
１−デシノール（０．３００ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）とトリクロロアセトイミデート１４８（２．３３ｇ、１．２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（３０μ（３０ｇ、１．２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．５２，１２９．４４，１２９．２０，１２９．１３，１２８．９１，１２８．８９，１２８．８１．１２８．７８，１２８．７１，１２８．５１，１２８．４５，１０２．３４，９９．６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、化合物を白色の綿毛状の固体（２．０１ｇ、８６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．１０（ｍ，４Ｈ），１．００−１．６０（ｍ，１１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１００ＭＨｚ）δ１００ＭＨｚ）２当量）をアルゴン下で無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。そこにＭＳを添加し、反応物を氷浴で冷却した。ＢＦ１３０．０８，１２８．８５，１２９．６１，１２９．１０（ｍ，４Ｈ），１．００−１．６０（ｍ，１１Ｈ）．８．９１，１２８．８１，１３０．１２，１３０．０５，１２９．９８，１２９．９５，１２９．９２，１２９．８８，１２９．８０，１２９．７７，１２９．７３，１２９．６８，１２９．６２，１２９．５５，１２９．５０，１２９．４７，１２９．４１，１２９．４０，１２９．２９，１２９．１４，１２９．１１，１２９．０３，１２８．９６，１２８．８７，１２８．８４，１２８．８３，１２８．７８，１２８．７６，１２８．６３，１２８．５６，１２８．５４，１２８．４８，１２８．３７，１２８．２６，１１４．３３，１１４．２６，１００．９２，１００．８４，９７．０４，９６．５２，７５．３６，７５．１７，７４．８４，７３．３７，７２．９５，７２．９０，７２．８１，７２．５７，７２．５０７，７１．９４，７１．５８，７１．０５，７０．３７，７０．２７，７０．１９，７０．０６，６９．８６，６９．２４，６９．１９，６９．０２，６３．７１，６３．５６，６３．２０，６２．９３，６２．６９，３３．９６，３３．９１，３２．９３，２９．６０，２９．５３，２９．５０，２９．４６，２９．４２，２９．３３，２９．３０，２９．２２，２９．１４，２９．０６，２９．００。ＭＳ．Ｃ７１Ｈ６８Ｏ１８について計算された分子量、計算値１２０８．４４、実測値１２３１．４（Ｍ＋Ｎａ）。
１５０の調製：
化合物１４９（７．２６ｇ、６ｍｍｏｌ）をジオキサン：水の混合物（１００ｍＬ、３：１）に溶解させた。反応混合物に、ルチジン（０．７ｍＬ、２当量）、次いでＯｓＯ４溶液（５ｍＬ．０．０５Ｍのｔブタノール溶液）を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム（５．１１ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで抽出し（３回）、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を全て除去し、残渣を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残渣をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解させ、そこにオキソン（３．８６ｇ、１．０５当量）、そして周囲温度で３時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、１０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（勾配溶出２０％−４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、化合物１５０を白色の固体（５．５０ｇ、７５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ４００ＭＨｚ）−ｄｏｌｉｄ（５．５０ｇ、７５％）。ヨード酸塩（５．１１ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。Ｒｅ１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１００ＭＨｚ）δ１００ＭＨｚ）−ｄｏｌｉｄ（５．５０ｇ、７５％）．ヨード酸塩（５．１１ｇ、４当量）を添加し、室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料が消費された時点で、混合物を希釈した。９９，１６４．８８，１６４．７５，１６４．７０，１６４．６０，１６４．５４，１６４．５０，１３３．８０，１３３．７１，１３３．５８，１３３．４２，１３３．２９，１３３．１５，１２９．８８，１２９．４２，１２９．３６，１２９．２９，１２９．２３，１２９．２０，１２９．１２，１２９．０７，１２９．０５，１２９．０３，１２８．９１，１２８．８８，１２８．７２，１２８．５９，１２８．４８，１２８．３８，９９．９６，９９．２９，９９．２２，９５．９６，９５．６４，９５．２２，９３．１０，７５．６１，７４．８６，７４．５７，７４．３７，７４．１５，７３．５９，７３．１４，７２．５８，７１．４６，７１．１５，７０．４８，７０．３１，７０．０９，６９．９７，６９．００，６８．８７，６８．２２，６７．８１，６３．６５，６２．４９，６０．７３，５９．７６，４３．０１，３３．６８，３３．６２，３２．５４，２８．８４，２８．８２，２８．６１，２８．５５，２８．４７，２８．４０，２５．４７，２５．２１，２４．５２，２４．４３，２０．４５。ＭＳ．Ｃ７０Ｈ６６Ｏ２０について計算された分子量、計算値１２２６．４１、実測値１２４９．４（Ｍ＋Ｎａ）。
実施例２．コンジュゲーション用のプテロイン酸の前駆体
適切に置換されたプテロイン酸前駆体１１０を以下のように調製した。
Figure 2021020928
４−［（２−イソブチリルアミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−プテリジン−６−イルメチル）−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−アミノ］ベンゼン酸１５２の合成
プテロイン酸（２５ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１．２５ｇ、９２ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（４００ｍＬ）懸濁液に、ＴＢＤＰＳの塩化物（４２ｇ、１５３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０時間撹拌した後、イソ酪酸無水物（１４．６ｇ、９２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を少し温めた。さらに６０ｍＬのピリジンも添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物が均一になった後、ピリジンと他の揮発性物質をロータリーエバポレーター中で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）と酢酸（１００ｍＬ）と水（５００ｍＬ）とともに２４時間撹拌した。こうして得られたスラリーを濾過し、残渣を水（５００ｍＬ）、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で洗浄し、乾燥させて、純粋な生成物を白色の固体（２６．１ｇ、８９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝８．８７（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），２．７９−２．７４（ｍ，１Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．８３Ｈｚ，６Ｈ）、１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１８０．７２，１６６．４９，１５９．２５，１４９．８７，１４７．６８，１４２．６９，１３６．３４，１３４．４５，１３０．５４，１２９．１６，１２８．８６，１２７．４９，３４．９６，３３．０９，２６．５２，１８．８８，１８．７４。１９Ｆ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６） ｄ−６４．３２。ＭＳ．Ｃ２０Ｈ１７Ｆ３Ｎ６Ｏ５について計算された分子量、計算値４７８．１２、実測値４７９．１２（ＭＨ＋）。
Figure 2021020928
ＲＮＡ合成に適した、適切に置換された、より用途の広い葉酸の前駆体を合成するために、以下の戦略を用いた。この方法では、保護葉酸１５２を、γ−ｔｅｒｔ−ブチル、グルタミン酸のα−Ｍｅエステル、１５６で処理して、エステル１５７を得た。これをＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２で処理して、前駆体１５８を得た。
２−｛４−［（２−イソブチリルアミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−プテリジン−６−イルメチル）−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−アミノ］−ペンタンジオン酸５−ｔｅｒｔ−ブチルエステル１−メチルエステル１５７の合成
代表的な手順において、プテロイン酸前駆体１５２（２．４ｇ、５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、ＨＢＴＵ（１．９ｇ、１当量）、次いでＤＩＥＡ（１ｍＬ、５当量）を添加し、２０分間撹拌した。反応混合物に、アミン塩酸塩１５６（１．２ｇ、１当量）をＤＭＦ溶液（６ｍＬ）として添加した。反応をＴＬＣでモニターした（８％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＰＭＡ染色）。反応混合物のＴＬＣは反応の完了を示した。激しく撹拌しながら、反応混合物をゆっくりと氷の中に入れた。沈殿生成物を濾過して、生成物１５７を白色の固体（収量＝２．８５ｇ、８６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ） δ＝１２．３３（ｓ，１Ｈ），１１．９４（ｓ，１Ｈ），８．８８（ｓ，１Ｈ），８．８２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４６−４．４０（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），２．８６−２．７３（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｍ，９Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ ＤＭＳＯ−ｄ６｝ δ＝１８０．７５，１７２．１３，１７１．４５，１６５．６４，１５９．１０，１５４．８０，１４９．９７，１４９．７９，１４７．７２，１４１．７５，１３４．１５，１３０．５３，１２８．７０，１２８．４９，１１７．５０，１１４．６４，７９．７９，５１．９６，５１．９１，３４．９６，３１．２２，２７．６８，２５．７１，１８．７２。ＭＳ．Ｃ３０Ｈ３４Ｆ３Ｎ７Ｏ８について計算された分子量、計算値６７７．６３、実測値６７６．７２（Ｍ−Ｈ−）。
２−｛４−［（２−イソブチリルアミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−プテリジン−６−イルメチル）−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−アミノ］−ペンタンジオン酸１−メチルエステル１５８の合成
エステル１５７（２ｇ、２．９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中の２０ｍＬの５０％ＴＦＡに溶解させ、この溶液を室温で３０分間撹拌した後、ＴＬＣは出発エステルが完全に消失したことを示した。反応混合物を濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン（２：３）から結晶化し、結晶化した生成物を濾過除去し、乾燥させて、純粋な生成物１５８（１．７６ｇ、９６％）をオフホワイトの粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．３２（ｂｓ，１Ｈ），１１．９４（ｓ，１Ｈ），８．８８（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４５−４．４１（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），２．７８−２．７５（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）２．０７−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ ＤＭＳＯ−ｄ６｝δ＝１８０．７７，１７３．７０，１７２．１９，１６５．７０，１５９．２１，１５５．５４，１４９．９３，１４９．８４，１４７．７５，１４１．７８，１３４．１８，１３０．５３，１２８．７１，１２８．４９，１１７．５１，１１４．６４，５３．９８，５２．０６，５１．９３，３４．９７，３０．１１，２５．６８，１８．７３。ＭＳ．Ｃ２６Ｈ２６Ｆ３Ｎ７Ｏ８について計算された分子量、６２１．１８、実測値６２０．１８（Ｍ−Ｈ−）。
Figure 2021020928
１６０の合成
化合物１５９（０．２ｇ、０．０００６７１モル）の無水ピリジン（５ｍＬ）懸濁液に、ＤＭＡＰ（０．１３ｇ、０．００１０モル）、次いでイソ酪酸無水物（０．６ｍＬ、０．００４０モル）を室温で添加した。その後、得られた混合物を４時間還流させた。反応の完了後（ＴＬＣによる）、混合物を氷ＨＣｌ／ヘキサン中に入れ、よく撹拌した。得られた固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、さらなる反応に直接使用した。収量（０．１ｇ、３４％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝１２．０８（ｓ，１Ｈ），１１．４８（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，２Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），２．９８（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｍ，１Ｈ），１．１９（ｄ，６Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ＝１７９．８５，１７５．２１，１６７．００，１５６．６４，１４７．８１，１４７．３４，１４６．７３，１２９．０８，１２８．３２，１２８．１４，１２１．２７，１１６．００，１０６．０７，３５．０２，３４．５１，３３．３７，２６．９０，１８．７２，１８．６４。ＭＳ（ＭＨ）＋：４３９．４０。
１９７の合成
１６０（０．４ｇ、０．０００９１モル）のＭｅＯＨ撹拌溶液５ｍｌに、ＤＩＰＥＡ（０．０３６ｍＬ、０．００２７８モル）を室温で添加した。（注：ＤＩＰＥＡの添加後、反応混合物は透明になる。）１０分後、混合物にＤＭＡＰ（触媒）を添加した。反応の完了をＴＬＣ（＆ＬＣＭＳ）でモニターした。その後、ＭｅＯＨを濃縮し、残渣を水（５ｍＬ）で希釈した。希ＨＣｌで酸性化した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。粗混合物は十分に純粋であったので、さらなる反応に直接使用した。収量：２６０ｍｇ（５４％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ），δ＝１２．７７（ｂｓ，１Ｈ），１１．６８（ｓ，１Ｈ），１１．３４（ｓ，２Ｈ），７．８４（ｄ，２Ｈ），７．３２（ｄ，２Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），３．０１（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，１Ｈ），１．０９（ｄ，６Ｈ）。ＭＳ（ＭＨ）＋：３６９．１０。
葉酸コンジュゲートを含有するアジド官能基を合成するために、以下の戦略を使用した。アジドアミンテザー１６５は、以下に示すような市販のジアミン１６２から合成した。
Figure 2021020928
アミン１６３の合成
ジアミン（２２ｇ、０．１ｍｏｌ）のジクロロメタン（３００ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（１５ｍＬ）を添加し、混合物を氷浴で冷却した。この冷溶液に、（Ｂｏｃ）２ＯのＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液を滴下して添加し、混合物を一晩撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、水（３００ｍＬ）、ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。この有機層を濃縮した後、カラム精製することによって、純粋なモノＢｏｃアミン２０２が５５％の収率で得られた。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ３２Ｎ２Ｏ５のＭＷ計算値：３２０．４２；実測値３２１．４１（ＭＨ＋）。
アジド１６４の合成
トリフル酸アジド原液を、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７（２００６） ２３８２−２３８５に報告されている通りに調製した。アミン（０．９６ｇ、３ｍｍｏｌ）、重炭酸ナトリウム（０．８５ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）、および硫酸銅（ＩＩ）五水和物（２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）に溶解させた。トリフル酸アジド原液（５ｍＬ）を添加した後、メタノール（２０ｍＬ）を添加すると、均一系が得られた。この青色の混合物を３０分間撹拌した後、ＴＬＣとＭＳによって、出発アミンが完全に消失したことが示された。反応混合物をロータリーエバポレーター中で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ジクロロメタン−メタノール）で精製して、純粋なアジド１６４（１ｇ、９６％）をオイルとして得た。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ３０Ｎ４Ｏ５のＭＷ計算値：３４６．４２；実測値３４７．４１（ＭＨ＋）。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ＝４．６８（ｂｓ，１Ｈ），３．４０−３．３０（ｍ，１２Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．００−２．９５（ｍ，２Ｈ），１．６８−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．０４（ｓ，９Ｈ）。
１６５の合成
アジド２０３（１ｇ、２．８８ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に溶解させ、これにＨＣｌの２Ｍエーテル溶液を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。ＭＳで出発材料がないことが示された。反応混合物を濃縮し、こうして得られたオイルを、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ１０Ｈ２３ＣｌＮ４Ｏ３のＭＷ計算値：２４６．１７；実測値２４７．１７（ＭＨ＋）。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６ ４００ＭＨｚ）δ＝８．９６（ｂｓ，１Ｈ），７．９２（ｂｓ，２Ｈ），３．５２−３．４０（ｍ，１２Ｈ），３．３７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．８５−２．７７（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．７０（ｍ，４Ｈ）。
Figure 2021020928
アミン１６５（０．６ｇ）と酸１５８（１．２ｇ）との共役によって、共役アジド１６６（１．６８ｇ、９３％）が淡黄色の泡状物質として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）δ＝１２．３４（ｓ，１Ｈ），１１．９５（ｓ，１Ｈ），８．８９（ｓ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），４．４０−４．３４（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．５０−３．３１（ｍ，１５Ｈ），３．０９−３．００（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．７２（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．１０−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ．Ｃ３６Ｈ４６Ｆ３Ｎ１１Ｏ１０について計算された分子量、計算値８４９．８１、実測値８５０．２（ＭＨ＋）。
１６７の合成：
アジド１６６（１ｇ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、そこに水酸化リチウム（２ｍＬの水中に１００ｍｇ）の水溶液を添加し、この溶液を室温で４時間撹拌した後、ＭＳでＳＭが完全に消失したことが示された。反応混合物を、酢酸を用いてｐＨ５まで酸性化し、ＲＭを酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈した。沈殿生成物を濾過除去し、水と酢酸エチルで洗浄し、真空下、４０℃で一晩乾燥させて、純粋なアジド１６７（０．４５５ｇ、５５％）をオレンジ色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ） δ＝８．５９（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｂｓ，１Ｈ），７．７２（ｂｓ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｂｓ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｓ，２Ｈ），４．００−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．５０−３．３３（ｍ，１４Ｈ），３．０４−３．００（ｍ，２Ｈ），２．０７−１．８３（ｍ，４Ｈ），１．７６−１．５４（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ．Ｃ２９Ｈ３９Ｎ１１Ｏ８について計算された分子量、計算値６６９．６９、実測値６６８．２（Ｍ−Ｈ−）。
別の実施形態では、葉酸を含有するアルキンを以下のように合成する。この場合には、保護プテロイン酸１５８を保護リジン１６８と共役させて、共役生成物１６９を得た。これは、Ｃｂｚ脱保護されるとアミン１７０を生じた。このアミン１７０を酸１７１と共役させることによって、共役生成物１７２を得た。これを精製し、脱保護した後、以下に記載される生成物１７３が得られた。
Figure 2021020928
１６９の合成：
１６６の合成に使用したのと同様の手順を用いて、酸１５８をリジン誘導体１６８と共役させることによって、共役生成物１６９を白色の固体として９５％の収率で得た。
１７０の合成：
化合物１６９をＰｄ／Ｃで水素化することによって、脱保護アミン１７０を黄色の固体として得た。
１７２の合成：
１６６の合成に使用したのと同様の手順を用いて、アミン１７０を酸１７１と共役させることによって、共役生成物１７２を高い収率で得た。
１７３の合成：
１６７の合成について記載されたものと同様の手順を用いて、保護基の脱保護を達成し、完全に脱保護されたアルキン１７３を単離した。
Figure 2021020928
１７５の調製
葉酸１７４をＤＣＣ、次いでＮ−ヒドロキシスクシニミドで処理することによって、活性化エステル１７５を８０％の収率で得た。典型的な手順において、葉酸 （５ｇ、１１．３３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）に溶解させ、この溶液にトリエチアミン（２．５ｍＬ）、ＤＣＣ（４．７ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）、およびＮ−ヒドロキシスクシニミド（２．６ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を室温暗所で１８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾過液にＥｔＯＡｃ（１Ｌ）を添加し、沈殿生成物を濾過し、酢酸エチル（５００ｍＬ）、エーテル（２００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、生成物を黄色の粉末として単離した。ＨＰＬＣにより、生成物の純度が８３％であることが分かった。この生成物を、さらに精製することなく、そのまま共役工程に使用した。
Figure 2021020928
１８３の調製
報告されている手順（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ，Ｓ．Ｅ．；Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｅ．Ｍ．；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ，Ｔ．Ｔ．；Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．；Ｄａｓｈｅ，Ｊ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，ＪｅａｎＭ．Ｊ．Ｆｕｌｌｙ Ａｃｉｄ−Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙａｃｅｔａｌ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８），１９（４），９１１−９１９）を用いて、ケタール１７６を合成した。このケタールの一時的な保護を、２ステップのワンポット法で、初めにこのジアミンを１当量のエチルトリフルオロ酢酸で処理し、次いで１当量のＣｂｚ−ＯＳｕで処理することによって行ない、カラム精製後に、ジ保護された誘導体１７７を８０％の収率で得た。保護アミン１７７を水性ＬｉＯＨで処理することによって、アミン１７８を定量的な収率で得た。このアミン１７８（０．５ｇ）を、保護葉酸１５８（１ｇ）と共役させることによって、共役生成物１７９（１．１ｇ）を得、これを水素化することによって、アミン１８０を定量的な収率で得た。マレイミドプロピオン酸１８１を用いてアミン１８０の共役を行なうと、共役生成物１８２が良好な収率で生じた。ＴＨＦ中の氷冷した水性ＬｉＯＨを用いて、１８２の全ての保護基の最終的な脱保護を行ない、前駆体１８３をオレンジ色の固体として得た。
実施例３．脂質コンジュゲートの合成
Figure 2021020928
２０１の調製：
１，２−ジオクタデシルｓｎグリセロール（８．５０ｇ、１４．２３ｍｍｏｌ）とＤＳＣ（５．４７ｇ、１．５当量）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させ、氷水浴で冷却した。トリエチルアミン（６．００ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を分液漏斗に移し、ＤＣＭで希釈し、重炭酸溶液と水で洗浄した。ＤＣＭ層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させた。これを、さらに精製することなく、次の反応で使用した（収量、１１．５０ｇ）。
２０２の調製：
化合物２０１（４．００ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）と６−アミノヘキサン酸塩化物（１．４７７ｇ、１．５当量）をＤＣＭに溶解させ、氷浴で冷却した。混合物にピリジン（５ｍＬ）を添加し、一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣をジクロロメタンで抽出し、重炭酸と水で洗浄した。粗生成物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサンの勾配溶出）で精製して、所要の生成物２０２（収量−３．８０ｇ、９１％）を得た。ＭＳ：Ｃ４７Ｈ９３ＮＯ６の計算値７６７．７０；実測値７６８．６８（Ｍ＋Ｈ）。
２０３の調製：
化合物２０２（４．５０ｇ、５．８６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／水（２：２：１）の混合物に溶解させ、氷浴で冷却した。ＬｉＯＨ（１．２３ｇ、５当量）を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物をＡｃＯＨで中和した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィーで精製して、所要の化合物を白色の固体として得た（収量、４．３２ｇ、９７％）。ＭＳ：Ｃ４６Ｈ９１ＮＯ６の計算値７５３．６８；実測値７５２．７０（Ｍ−Ｈ）。
２０４の調製：
化合物２０３（０．８３２ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．４６１ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．５７３ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＰＥＧアミノ酸（２．００ｇ、０．９２１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次に５％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製し、所要の生成物を得た（２．５８ｇ、９５％）。ＭＳで計算された平均分子量２７００−２９００、実測値２７２０−２９６０。
Figure 2021020928
２０６の調製：
化合物２０５（２．１１ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）とメチルアミノヘキサン酸塩（０．６８８ｇ、１．２当量）をＤＭＦ／ＤＣＭ（５０ｍＬ）の混合物に溶解させた。そこにＨＢＴＵ（１．３１ｇ、１．０５当量）とＤＩＥＡ（２ｍＬ、過剰）を添加した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物を氷と水の混合物中に注ぎ入れ、エーテルで抽出した。エーテル層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィーで精製して、所要の生成物２０６を得た（収量−２．２７ｇ、９０％）。
２０７の調製：
化合物２０６（２．２５ｇ、２．９２５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ／水（５０ｍＬ、２：２：１）の混合物に溶解させ、氷浴で冷却した。ＬｉＯＨ（０．６１４ｇ、５当量）を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、混合物をＡｃＯＨで中和した。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィーで精製して、所要の化合物を白色の固体として得た（収量、２．１２ｇ、９６％）。ＭＳ：Ｃ４９Ｈ８６Ｎ２Ｏ５の計算値７８２．６５；実測値７８１．７０（Ｍ−Ｈ）。
２０８の調製：
化合物２０７（０．８６５ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．４６１ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．５７３ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＰＥＧアミノ酸（２．００ｇ、０．９２１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次に５％−１２％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．６０ｇ、５９％）。ＭＳで計算された平均分子量２７５０−２９５０；実測値２７３０−２９７０。
Figure 2021020928
２０９の調製：
化合物２０７（０．９９４ｇ、１．２６９ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．５０５ｇ、１．０５当量）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．６６０ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン（２．００ｇ、１．０５７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（ＤＣＭ、酢酸エチル、次に５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．８３ｇ、６８％）。ＭＳ：Ｃ１２８Ｈ２１２Ｎ１２Ｏ４０の計算値２５５７．４９；実測値２５７９．９４（Ｍ＋Ｎａ）。
２１０の調製：
化合物２０９（０．５０６ｇ、０．１９７８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（４ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。酢酸を用いて、ｐＨを５〜６に合わせた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＨに溶解させ、０．２μｍフィルターに通して濾過した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を粘着性の液体として得た（０．４０７ｇ、９２％）。ＭＳ：Ｃ１１０Ｈ１９４Ｎ１２Ｏ３１の計算値２１７９．４０；実測値２２０２．３２（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
２１１の調製：
化合物２０８（１．５１ｇ、０．５１４ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．１９５ｇ、０．５１４当量）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．２６８ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン（０．９７１ｇ、０．５１４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（ＤＣＭ、酢酸エチル、次に５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．９２ｇ、７８％）。ＭＳで計算された平均分子量４６００−４９００；実測値４６００−４９００。
２１０の調製：
化合物２０９（０．５０３ｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（２ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。酢酸を用いて、ｐＨを５〜６に合わせた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＨに溶解させ、０．２μｍフィルターに通して濾過した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．４２０ｇ、９２％）。ＭＳで計算された平均分子量４２００−４５００；実測値４２００−４５００。
Figure 2021020928
２１３の調製：
化合物２０３（０．９５６ｇ、１．２６８ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．５０５ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．６６１ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン（２．００ｇ、１．０５７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（ＤＣＭ、酢酸エチル、次に５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．７８ｇ、６７％）。ＭＳ：Ｃ１２５Ｈ２１７Ｎ１１Ｏ４１の計算値２５２８．５２；実測値２５５１．４８（Ｍ＋Ｎａ）。
２１４の調製：
化合物２１３（０．５１８ｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（４ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。酢酸を用いて、ｐＨを５〜６に合わせた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＨに溶解させ、０．２μｍフィルターに通して濾過した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．３６０ｇ、８６％）。ＭＳ：Ｃ１０７Ｈ１９９Ｎ１１Ｏ３２の計算値２１５０．４３；実測値２１７３．３１（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
２１５の調製：
化合物２０４（２．５８ｇ、０．８８０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．３３３ｇ、０．８８０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．４６３ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。ＧａｌＮＡｃアミン（１．６７９ｇ、０．５１４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（ＤＣＭ、酢酸エチル、次に５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（２．３０ｇ、５５％）。ＭＳで計算された平均分子量４５００−４８００；実測値４５００−４８００．
２１６の調製：
化合物２１５（０．５４５ｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（２ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。酢酸を用いて、ｐＨを５〜６に合わせた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をＥｔＯＨに溶解させ、０．２μｍフィルターに通して濾過した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．３３９ｇ、６８％）。ＭＳで計算された平均分子量４２００−４５００；実測値４２００−４５００。
Figure 2021020928
２１７の調製：
化合物２０３（１．０９９ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．５５０ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（１．２６ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。マンノースアミン（１．４７ｇ、１．２当量）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（５０％−８０％の酢酸エチル／ヘキサン、次に酢酸エチル）で精製して、所要の生成物を得た（１．９０ｇ、８９％）。ＭＳ：Ｃ８６Ｈ１３０Ｎ２Ｏ１７の計算値１４６２．９４；実測値１４６３．９５（Ｍ＋Ｈ）。
２１８の調製：
化合物２１７（１．８７ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（１２ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。５ｍＬのＮａＯＭｅ溶液を再び添加し、さらに２４時間撹拌を続けた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（５％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．５６７ｇ、４２％）。ＭＳ：Ｃ５８Ｈ１１４Ｎ２Ｏ１３の計算値１０４６．８３；実測値１０６９．８０（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
２１９の調製：
化合物２０７（１．０３９ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．５１０ｇ、１．３３９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（１．１５ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。マンノースアミン（１．３３８ｇ、１．２当量）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（５０％−８０％の酢酸エチル／ヘキサン、次に酢酸エチル、次に５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．６３ｇ、８３％）。ＭＳ：Ｃ８９Ｈ１２５Ｎ３Ｏ１６の計算値１４９１．９１；実測値１５１５．０１（Ｍ＋Ｎａ）。
２２０の調製：
化合物２１９（１．５５ｇ、１．０３８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（１０ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。５ｍＬのＮａＯＭｅ溶液を再び添加し、さらに２４時間撹拌を続けた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（まず５０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＥｔＯＡｃ、次に５％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．６１６ｇ、５５％）。ＭＳ：Ｃ６１Ｈ１０９Ｎ３Ｏ１２の計算値１０７５．８０；実測値１０９８．８１（Ｍ＋Ｎａ）。
Figure 2021020928
２２１の調製：
化合物２０４（１．１７ｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．１６８ｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．４２０ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。マンノースアミン（０．４０６ｇ、０．４８２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次に３％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．１０ｇ、７５％）。ＭＳで計算された平均分子量３４００−３８００；実測値３４００−３８００。
２２２の調製：
化合物２２１（０．９５２ｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（３ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。２ｍＬのＮａＯＭｅ溶液を再び添加し、さらに２４時間撹拌を続けた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（まずＥｔＯＡｃ、次いで５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．５０ｇ、５９％）。ＭＳで計算された平均分子量３１００−３４００；実測値３１００−３４００。
Figure 2021020928
２２３の調製：
化合物２０８（１．１４ｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（０．１６２ｇ、０．４２６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に溶解させ、そこにＤＩＥＡ（０．４０５ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌した。マンノースアミン（０．３９２ｇ、０．４６６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣで確認し、溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（酢酸エチル、次に３％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の生成物を得た（１．３０ｇ、９２％）。ＭＳで計算された平均分子量３４００−３８００；実測値３４００−３８００。
２２４の調製：
化合物２２３（１．３０３ｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１０ｍＬ、２：１）の混合物に溶解させ、そこにＮａＯＭｅ（３．５ｍＬ、０．５ＭのＭｅＯＨ溶液）を添加し、混合物を一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。２ｍＬのＮａＯＭｅ溶液を再び添加し、さらに２４時間撹拌を続けた。溶媒を除去し、残渣をＭｅＯＨ／ＤＣＭに溶解させ、カチオン交換樹脂に通した。溶媒を除去し、残渣をクロマトグラフィー（まずＥｔＯＡｃ、次いで５％−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出）で精製した。残渣を高真空下、４０℃で２日間乾燥させて、所要の化合物を白色の固体として得た（０．４５６ｇ、４０％）。ＭＳで計算された平均分子量３１００−３４００；実測値３１００−３４００。
実施例４：ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−ＤＭＧ）の合成
ＰＥＧ−脂質、例えば、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ−ＤＭＧ）を以下の手順を用いて合成した。
Figure 2021020928
化合物２２８ａの調製：
１，２−Ｄｉ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセリド２２５ａ（３０ｇ、６１．８０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−スクシニミジルカルボネート（ＤＳＣ、２３．７６ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（ＤＣＭ、５００ｍＬ）の中に入れ、氷水混合物上で撹拌した。撹拌溶液にトリエチルアミン（２５．３０ｍＬ、３当量）を添加し、その後、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。反応混合物をＤＣＭ（４００ｍＬ）で希釈し、有機層を水（２×５００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した後、標準的な後処理を行なった。得られた残渣を、高真空下、周囲温度で一晩乾燥させた。乾燥後、こうして得られた粗カルボネート２２６ａをジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（２２７、１０３．００ｇ、４７．２０ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）と無水ピリジン（８０ｍＬ、過剰）をアルゴン下で添加した。一実施形態では、メトキシ−（ＰＥＧ）ｘ−アミンは、ｘ＝４５〜４９、好ましくは４７〜４９、およびより好ましくは４９である。その後、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒と揮発性物質を真空下で除去し、残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチル中に詰められたシリカゲルのカラムに充填した。このカラムをまず酢酸エチルで溶出し、その後、ジクロロメタン中の５％−１０％のメタノール勾配で溶出して、所望のＰＥＧ−脂質２２８ａを白色の固体として得た（１０５．３０ｇ、８３％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝５．２０−５．１２（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８０−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．１０−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５６−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，４８Ｈ），０．８４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲；実測値：２６６０−２８３６。
２２８ｂの調製：
１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセリド２２５ｂ（１．００ｇ、１．８４８ｍｍｏｌ）とＤＳＣ（０．７１０ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に一緒に入れ、氷水混合物中で０℃まで冷却した。そこにトリエチルアミン（１．００ｍＬ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。反応物をＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣２２６ｂを高真空下で一晩除去した。この化合物を、さらに精製することなく、次の反応に直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ ２２７（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）と前の工程からの化合物２２６ｂ（０．７０２ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応物を０℃に冷却した。そこにピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。溶媒と揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（溶出勾配として、まず酢酸エチル、次に５％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物２２８ｂを白色の固体として得た（１．４６ｇ、７６％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ＝５．１７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．４５（ｍ，６Ｈ），１．３５−１．１７（ｍ，５６Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲；実測値：２７１６−２８９２。
２２８ｃの調製：
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセリド２２５ｃ（４．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）とＤＳＣ（２．５８ｇ、１．５当量）をジクロロメタン（６０ｍＬ）中に一緒に取り、氷水混合物中で０℃まで冷却した。そこにトリエチルアミン（２．７５ｍＬ、３当量）を添加し、一晩撹拌した。反応物をＴＬＣにかけ、ＤＣＭで希釈し、水（２回）、ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下で一晩除去した。この化合物を、さらに精製することなく、次の反応に直接使用した。ＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２ ２２７（１．５０ｇ、０．６８７ｍｍｏｌ、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎから購入）と前の工程からの化合物２２６ｃ（０．７６０ｇ、１．５当量）をアルゴン下でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。反応物を０℃に冷却した。そこにピリジン（１ｍＬ、過剰）を添加し、一晩撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした。溶媒と揮発性物質を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィー（溶出勾配として、まず酢酸エチル、次に５％−１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、所要の化合物２２８ｃを白色の固体として得た（０．９２ｇ、４８％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ＝５．２２−５．１５（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｄｄ，Ｊ＝５．００Ｈｚ，１１．００Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．７５（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．２０（ｍ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，ＰＥＧ−ＣＨ２），１．８０−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１５（ｍ，６４Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ）。ＭＳ範囲；実測値：２７７４−２９４８。
実施例５．第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）のインビトロアッセイ
トランスフェクションのための細胞播種
ｓｉＲＮＡをトランスフェクションする１日前に、細胞を、抗生物質を含まない培地中、１５，０００細胞／ウェルの密度で（１５０，０００細胞／ｍｌ培地、１００μｌ／ウェル）、９６ウェルプレートに播く。
ＦＶＩＩ安定細胞株のための標準的なトランスフェクション条件
・９６ウェルプレート設定でのトランスフェクション用に、０．５μＬ／ウェルの濃度のリポフェクトアミン２０００を使用する。
・ＦＶＩＩ標的化ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ中で６ｎＭの濃度に希釈する。
・ｓｉＲＮＡとトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００）を混合し、室温で２０分間インキュベートすることによって複合体を形成させる。
・２０分後、（合計６０μＬの容量のうち）５０μＬの複合体を、その前日に播かれた細胞を含有する単一のウェル（ウェルには既に１００μＬの増殖培地が含まれている）に添加し、穏やかに上下にピペッティングすることによって、試料を混合する。この時点で、ウェルには、１５０μＬの総容量、１ｎＭのｓｉＲＮＡ、０．５μＬのＬＦ２０００試薬が含まれる。
・プレートを３７℃インキュベーターに戻す。
・２４時間後、培地を除去し、新鮮培地と置き換える（１００μＬ／ウェル）。
・培地交換してから２４時間後、ＦＶＩＩ活性のアッセイのために培地の上清を回収する。
・上清中の第ＶＩＩ因子タンパク質のレベルを、製造元のプロトコルに従って、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ，ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ社製（米国オハイオ州所在）またはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（米国オハイオ州所在））を用いて試料中で測定する。
実施例６：ＦＶＩＩとａｐｏＢのインビボアッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ社製（米国マサチューセッツ州所在））とＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ社製（米国マサチューセッツ州所在））に、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの容量で、食塩水または所望の製剤中のｓｉＲＮＡのいずれかを投与する。投与後のさまざまな時点で、イソフルオラン吸入によって動物に麻酔をかけ、後眼窩採血によって血清分離管の中に血液を採取する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、製造元のプロトコルに従って、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ，ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ社製（米国オハイオ州所在）またはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（米国オハイオ州所在））を用いて試料中で測定する。食塩水処理した動物から採取した血液を用いて、標準曲線を作成する。投与後のさまざまな時点で肝臓ｍＲＮＡレベルを評価する実験では、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結する。凍結した肝臓組織をすり潰して粉末にする。組織ライセートを調製し、ＦＶＩＩとａｐｏＢの肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製（米国カリフォルニア州所在））を用いて測定する。
実施例７：齧歯類の肝遺伝子サイレンシングモデルでの標的化脂質を介する送達
潜在的な肝標的の数が多いことと、この臓器がよく灌流する性質（これは、外因性ｓｉＲＮＡをより送達しやすくする可能性がある）であることの両方の理由から、肝臓は、治療的介入にとっての魅力的な臓器である。肝実質を含む、肝細胞でのｓｉＲＮＡが仲介する高レベルの遺伝子サイレンシングを促進する標的化脂質／ｓｉＲＮＡ複合体を同定するために、肝臓に対するインビボスクリーニングが使用される。血液凝固因子である第ＶＩＩ因子は、肝臓への機能的ｓｉＲＮＡ送達をアッセイするのに理想的な標的遺伝子である。これは肝細胞で特異的に産生される。したがって、遺伝子サイレンシングは、網内系の細胞（例えば、クッパー細胞）のみへの送達ではなく、実質への送達の成功を意味する。さらに、第ＶＩＩ因子は、血清中で容易に測定可能な分泌タンパク質であるので、動物を屠殺する必要性をなくす。最後に、半減期が短い（２〜５時間）ため、ｍＲＮＡレベルでのサイレンシングは、最小限のタイムラグでタンパク質レベルでのサイレンシングとなって現れる。
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。マウスに、ｓｉＲＮＡのさまざまな脂質製剤を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、１日に２回、静脈内注射で投与する。２回目の投与の２４時間後に、第ＶＩＩ因子のタンパク質レベルを定量する。あるいは、ラットに、１．２５、２．５、５、および１０ｍｇ／ｋｇで、カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡを注射する。動物を、さまざまな時点で採血し、投与の４８時間後に屠殺する。肝臓の第ＶＩＩ因子のｍＲＮＡレベル、血清第ＶＩＩ因子のタンパク質レベル、およびプロトロンビン時間を評価する。
実施例８：齧歯類の肝遺伝子サイレンシングモデルでのリポソームを介する送達の特異性
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。遺伝子サイレンシングの特異性を確認するために、第ＶＩＩ因子と別の肝細胞発現遺伝子であるアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）の両方について、肝臓ｍＲＮＡレベルを測定する。動物を、ｓｉＦＶＩＩのみ、またはｓｉａｐｏＢのみを含有する製剤で処理し、両方の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルを測定する。さらに、２つのｓｉＲＮＡの混合物のカチオン性脂質製剤の投与を、ミスマッチのある第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡの効果と同様に、評価する。これらのデータによって、観察された遺伝子サイレンシングが、肝臓のｍＲＮＡレベルに対する脂質／ｓｉＲＮＡの特異的な効果の直接的な結果であることと、これらの効果が複数の肝細胞発現遺伝子に適用可能であることが示される。
実施例９：インビボでの齧歯類第ＶＩＩ因子とａｐｏＢのサイレンシング実験
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ社製（米国マサチューセッツ州所在））とＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ社製（米国マサチューセッツ州所在））に、尾静脈注射によって、０．０１ｍＬ／ｇの容量で、食塩水または所望の製剤中のｓｉＲＮＡのいずれかを投与する。投与後のさまざまな時点で、イソフルオラン吸入によって動物に麻酔をかけ、後眼窩採血によって血清分離管の中に血液を採取する。第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、製造元のプロトコルに従って、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ，ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ社製（米国オハイオ州所在）またはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ，Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（米国オハイオ州所在））を用いて試料中で測定する。食塩水処理した動物から採取した血液を用いて、標準曲線を作成する。投与後のさまざまな時点で肝臓ｍＲＮＡレベルを評価する実験では、動物を屠殺し、肝臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結する。凍結した肝臓組織をすり潰して粉末にする。組織ライセートを調製し、ＦＶＩＩとａｐｏＢの肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製（米国カリフォルニア州所在））を用いて測定する。
実施例１０：インビボでのマウスＲＳＶのサイレンシング実験
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。２，２，２−トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ社製）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によって、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製（米国インディアナ州インディアナポリス所在））に麻酔をかけ、総容量５０μＬの脂質／ｓｉＲＮＡ製剤を鼻腔内（ｉ．ｎ．）注入する。ｓｉＲＮＡ注入の４時間後、マウスに麻酔をかけ、１０６ ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ２またはＲＳＶ／Ｂ１を鼻腔内に感染させる。感染後４日目に肺を摘出する前に、右尾動脈を切断して、麻酔をかけたマウスから血を抜く。肺組織を、氷上でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に採取し、ウイルス力価を測定する。肺のＲＳＶ力価は、免疫染色プラークアッセイで測定する。手持ち式のＴｉｓｓｕｍｉｓｅｒホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ所在））を用いて、肺をホモジナイズする。肺のホモジネートを氷上に５〜１０分間置き、破片を沈殿させる。清澄化された肺のライセートを、無血清Ｄ−ＭＥＭ中で１０倍に希釈し、Ｄ−ＭＥＭを含む２４ウェルプレート中で培養された９５％コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで２％のメチルセルロースを重層する。感染後５日目に、培地を除去し、細胞をアセトン：メタノール（６０：４０）で固定し、免疫染色する。プラークをカウントし、ＰＢＳまたはｓｉＲＮＡミスマッチ対照と比べたｌｏｇ（１０）ｐｆｕ／ｇ肺を測定する。
実施例１１：腹腔マクロファージでのサイレンシング
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。１０ｍｇ／ｋｇの脂質／ｓｉＲＮＡをｉ．ｐ注射する３日前に、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ社製）に、４％のＢｒｅｗｅｒｓチオグリコレート培地（Ｄｉｆｃｏ社製）１ｍＬを腹腔内注射する（１グループにつき４匹のマウス）。４日後に腹腔洗浄液を回収し、適切なフルオロフォアコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で染色する。フローサイトメトリー用の試料をＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で解析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社製）を用いて、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＧｒ１ｌｏｗのマクロファージ集団を同定し、対象となる表面タンパク質の発現を定量する。
実施例１２：インビボでのｍｉＲＮＡサイレンシング実験
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社製（独国スールツフェルト所在））に、３日間連続で、尾静脈注射によって、５ｍｇ／ｋｇ（０．５ｍｇ／ｍＬ）で、アンタゴｍｉｒまたは抗ｍｉＲの脂質製剤を投与する。４日目に肝臓を摘出し、対象となるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する。肝臓組織を、プロテイナーゼＫを含む細胞／組織の溶解緩衝液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製（米国ウィスコンシン州マディソン所在））に溶解させ、超音波処理にかける。ＴＥ飽和フェノール（Ｒｏｔｈ社製（独国カールスルーエ所在））でトータルＲＮＡを抽出し、その後、エタノールを用いて沈殿させる。対象となるマウスｍｉＲＮＡに相補的な合成ＤＮＡプローブ、および対照としてのマウスＵ６ ＲＮＡの５’末端を、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とγ−３２Ｐ ＡＴＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて標識する。
トータルの肝臓ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブとＵ６プローブに溶液中で同時にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション条件は、Ｕ６ ＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡの検出を可能にするが、プレ−ｍｉＲＮＡの検出は可能にしない。Ｓ１ヌクレアーゼで処理した後、試料を変性１０％アクリルアミドゲルに充填する。ゲルをホスホイメージャースクリーンに露出させ、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で解析する。ｍｉＲＮＡ対Ｕ６の相対シグナル強度を各試料について計算する。
実施例１３：一本鎖オリゴリボヌクレオチド(アンタゴｍｉｒ)のインビボでのカチオン性脂質を介する送達
ｓｉＲＮＡ以外の核酸薬物の送達におけるカチオン性脂質材料の有用性を調べるために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡを標的とする一本鎖２’−Ｏ−Ｍｅオリゴリボヌクレオチド（アンタゴｍｉｒまたは抗ｍｉＲ）の送達を促進するカチオン性脂質の潜在能力を検討する。抗ｍｉＲのインビボ送達によって、特異的な標的ｍｉＲＮＡサイレンシングが生じ、結果として標的ｍｉＲＮＡによって調節される遺伝子の特異的な上方調節が生じる。カチオン性脂質で製剤化された抗ｍｉＲ１２２を、上記のように、３日間連続で、５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに投与する。
ｍｉＲ−１２２によって調節される遺伝子の発現は、分岐ＤＮＡアッセイを用いて解析する。簡潔に述べると、３０〜５０ｍｇの凍結肝臓組織を、１ｍＬの組織／細胞溶解緩衝液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製（米国ウィスコンシン州所在））中で超音波処理によって溶解させる。標的遺伝子のシグナル強度に応じて、１０〜４０μＬのライセートを分岐ＤＮＡアッセイに使用する。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェアを用いて、プローブセットを設計する。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙの奨めに従って、標的遺伝子発現をアッセイし、同じ肝臓組織ライセートからの対応するＧＡＰＤＨハウスキーパーの発現に対して正規化する。
実施例１４：毒性の評価
Ａｌｎｙｌａｍで実施される動物研究で使用される手順は全て、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されており、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠している。ラットに、１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で、製剤化されたｓｉＲＮＡの静脈内ボーラス注射を週に１度、４回投与する。標的サイレンシングに関連する毒性の可能性を全て排除するために、既知のどのｍＲＮＡにもハイブリダイズしないはずの対照ｓｉＲＮＡを使用する。全ての臓器の外見と重量を測定する。
実施例１５：ヒト以外の霊長類での標的化脂質を介する遺伝子サイレンシング
３つ目の動物種での、カチオン性脂質で製剤化されたｓｉＲＮＡの効果を測定するために、ヒト以外の霊長類での研究を実施する。カニクイザルを用いる手順は全て、適用される地域、州、および連邦の規制に準拠するプロトコルを用いて、公認の開発業務機関によって実施されるものであり、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されている。カニクイザル（１グループにつきｎ＝６）に、５ｍＬ／ｋｇのリン酸緩衝食塩水、２．５ｍｇ／ｋｇの製剤化された対照ｓｉＲＮＡ（１．２５ｍＬ／ｋｇ）、２．５ｍｇ／ｋｇ（１．２５ｍＬ／ｋｇ）の製剤化されたｓｉＡｐｏＢ、または６．２５ｍｇ／ｋｇ（３．１２５ｍＬ／ｋｇ）の製剤化されたｓｉＡｐｏＢのいずれかを、ボーラスの静脈内注射として、上腕静脈を通して投与する。ａｐｏＢ−１００タンパク質の測定のために、投与前、ならびに投与の０．５、１、２、３、４、６、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、および３０日後に、血清を採取する。その後の実験で、カニクイザル（１グループにつきｎ＝３）に、２．５ｍｇ／ｋｇの製剤化された対照ｓｉＲＮＡ、または２．５もしくは６．２５ｍｇ／ｋｇの製剤化されたｓｉＡｐｏＢのいずれかを、ボーラスの静脈内注射として、伏在静脈を通して投与する。ａｐｏＢ−１００タンパク質の測定のために、投与前、ならびに投与の１２、２４および４８時間後に血清を採取する。ＡｐｏＢ−１００タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定する。臨床化学物質を、投与前、ならびに投与の２４および４８時間後に解析する。血液学的パラメータと凝固パラメータを、投与前、および投与の４８時間後に解析する。４８時間で動物を屠殺する。肝臓のＡｐｏｂ ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製（米国カリフォルニア州所在））を用いて、試料中で測定する。
上記のさまざまな実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照されるおよび／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。必要があれば、さまざまな特許、出願、および刊行物の概念を利用するように実施形態の態様を修正して、またさななる実施形態を提供することができる。
上記の説明に照らして、これらのおよび他の変更を実施形態に対して行ない得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、本特許請求の範囲を、本明細書および本特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものとみなされるべきではなく、このような特許請求の範囲に対して権利が与えられる全ての範囲の等価物に加えて、全ての可能な実施形態を含むものとみなされるべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
他の実施態様
１．下記式（ＣＩ）に示す構造を有する標的化脂質：
Figure 2021020928
 式中、
Ｌ１００は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ１０１は、それぞれ存在ごとに独立して、リガンドまたは−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−リガンドであり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
２．下記式（ＣＩＩＩ）に示す構造を有する標的化脂質：
Figure 2021020928
 式中、
Ｌ１１０は、Ｌ１１２、
Figure 2021020928
 であり；
Ｒ１００は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−Ｓ−、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ヘテロアリール、ヘテロ環、
Figure 2021020928
 であり；
Ａは、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ３、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ−Ｓ、−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｓ−Ｓ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｍｅ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｍｅ）−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ−、
Figure 2021020928
 ヘテロ環、またはヘテロアリールであり；
Ｌ１１１は、Ｌ１１３、Ｌ１１４、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ１１２は、それぞれ存在ごとに独立して、脂質、親油性物質、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、これらは各々、随意的に、１つ以上の置換基で置換されており；
Ｌ１１３は、それぞれ存在ごとに独立して、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ（ＣＨ２）ｑＣＨ２−Ｌ１１４であり；
Ｌ１１４は、それぞれ存在ごとに独立して、リガンド、−Ｃ（Ｏ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−リガンド、−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−リガンド、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−リガンド、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−リガンド、−Ｓ−Ｓ−リガンド、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−リガンド、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−リガンド、−Ｃ＝Ｎ−Ｏ−リガンド、−Ｃ＝Ｎ−Ｎ（Ｈ）−リガンド、ヘテロ環−リガンド、ヘテロアリール−リガンド、
Figure 2021020928
 であり；
ｐは、１〜１０００であり；かつ
ｑは、１〜２０である。
３．下記式（ＣＩ）に示す構造を有する標的化脂質：
Figure 2021020928
 式中、
ＬＡは、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、ペプチドから選択されるリガンドであるか、または下記式ＩＩ〜Ｖ：
Figure 2021020928
 に示す構造を有し：
ｑ、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；
Ｐ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、およびＴ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ＣＨ２Ｓ、尿素、ヘテロ環、ヘテロアリール、
Figure 2021020928
 であり；
Ｑ、Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、およびＱ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ’’）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
ＬＢは、親油性物質、ステロイド、テルペン、ビタミン、セラミドからなる群から選択されるか、または下記式（ＶＩ）：
Figure 2021020928
 の構造を有し；
Ｒ、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ６、Ｒ６Ａ、およびＲ６Ｂは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、糖質類似体、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、またはペプチドであり；
Ｒ’およびＲ’’は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＲ１０Ｒ２０、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｒ１０およびＲ２０は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂは、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、その各々は、随意的に１つ以上の置換基で置換されており；
ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０であり；
ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、１〜２０であり；かつ
ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０である。
４．ＬＡが、
Figure 2021020928
 である、実施態様３に記載の標的化脂質。
５．ＬＡが、
Figure 2021020928
 式中、
ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；
Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、およびＴ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、およびＱ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ’’）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、およびＲ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、グルコサミン、ラクトース、マルトース、葉酸、またはペプチドであり；
Ｒ’は、独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、またはＮＨ（ジアルキル）であり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；かつ
ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０である）
である、実施態様３に記載の標的化脂質。
６．ＬＡが、
Figure 2021020928
 である、実施態様５に記載の標的化脂質。
７．ＬＢが、
Figure 2021020928
 である、実施態様３に記載の標的化脂質。
８．ＬＢが、
Figure 2021020928
 式中、
Ｒ６、Ｒ６Ａ、およびＲ６Ｂは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021020928
 であり；
Ｒ’は、それぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、イソＰｒ、Ｂｕ、Ｂｎ）、またはＮ（ジアルキル＝Ｍｅ２、Ｅｔ２、Ｂｎ２）であり；
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
Ｌ６ＡとＬ６Ｂは、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、その各々は、随意的に１つ以上の置換基で置換されている、実施態様３に記載の標的化脂質。
９．Ｒ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨから選択される、実施態様８に記載の標的化脂質。
１０．Ｒ６ＡおよびＲ６Ｂが、Ｏ、Ｓ、またはＮＨから選択される、実施態様８に記載の標的化脂質。
１１．Ｒ、Ｒ６Ａ、およびＲ６ＢがＯである、実施態様８に記載の標的化脂質。
１２．Ｌ６ＡおよびＬ６Ｂがアルキルである、実施態様８に記載の標的化脂質。
１３．ＬＢが、
Figure 2021020928
 である、実施態様８に記載の標的化脂質。
１４．ＬＢが、
Figure 2021020928
 である、実施態様８に記載の標的化脂質。
１５．ＬＢが、
Figure 2021020928
 である、実施態様８に記載の標的化脂質。
１６．（ｉ）実施態様１または２に記載の標的化脂質；（ｉｉ）カチオン性脂質；（ｉｉｉ）ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される中性脂質；（ｉｖ）コレステロール；ならびに（ｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡを含み、
これらの構成要素が、標的化脂質約０．５〜５０％：カチオン性脂質２０〜６０％：中性脂質５〜２５％：コレステロール２５〜５５％：ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ０．５〜１５％というモル比である薬学的組成物。
１７．治療剤をさらに含む、実施態様１６に記載の薬学的組成物。
１８．前記治療剤がオリゴヌクレオチドである、実施態様１７に記載の薬学的組成物。
１９．前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、実施態様１８に記載の薬学的組成物。
２０．前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、実施態様１８に記載の薬学的組成物。
２１．前記オリゴヌクレオチドがｉＲＮＡ剤である、実施態様１８に記載の薬学的組成物。
２２．前記オリゴヌクレオチドが分解に耐えるように修飾される、実施態様１８に記載の薬学的組成物。
２３．前記オリゴヌクレオチドが、コンジュゲートされたリガンドを含む、実施態様１８に記載の薬学的組成物。

Claims (1)

  1. 下記式（Ｉ）に示される構造を有する標的化脂質：
    Figure 2021020928
     式中、
    ＬＡは、マンノース、ガラクトース、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンであるか、あるいは下記式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶに示す構造を有し：
    Figure 2021020928
     ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜２０であり；
    Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５ＢおよびＴ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ＣＨ２Ｓ、尿素、ヘテロ環、ヘテロアリール、
    Figure 2021020928
     であり；
    Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５ＢおよびＱ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ’’）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ’’）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
    Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５ＢおよびＲ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
    Figure 2021020928
     であり；
    Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、それぞれ存在ごとに独立して、マンノース、ガラクトース、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンであり；
    ｑは０〜２０であり；
    Ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、ＣＨ２Ｓ、尿素、ヘテロ環、ヘテロアリール、
    Figure 2021020928
     であり；
    Ｑは、それぞれ存在ごとに独立して、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）（Ｒ”）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｒ’）（Ｒ”）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２−、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−であり；
    Ｒは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、ＮＲ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ２、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨもしくはＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
    Figure 2021020928
     であり；
    ＴはＣＨ２ＮＨであり；
    ＬＢは、
    Figure 2021020928
     の構造を有し；
    Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＲ１０Ｒ２０、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
    Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり；
    Ｒ１０およびＲ２０は、それぞれ独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
    ｍは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０であり；
    ｎは、それぞれ存在ごとに独立して、１〜２０であり；かつ
    ｐは、それぞれ存在ごとに独立して、０〜５０である。
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