CN116179549A

CN116179549A - 通过5’utr序列变体修饰基因转录和翻译效率

Info

Publication number: CN116179549A
Application number: CN202211544617.0A
Authority: CN
Inventors: 李宰宇; 王德华; 郝肖瑶; 高悦; 刘杰; 何珊; 何婷; 柴旦
Original assignee: Nanjing Geneleap Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Geneleap Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-05-30
Also published as: US20230310484A1; US11951120B2

Abstract

本发明涉及mRNA疫苗、mRNA治疗和基因治疗领域，并且具体涉及使用含有5’UTR后接编码序列的基因表达载体或PCR扩增子用于体外和体内生产感兴趣的mRNA或蛋白质。

Description

通过5’UTR序列变体修饰基因转录和翻译效率

技术领域

背景技术

mRNA疫苗、mRNA疗法和基因疗法旨在使用编码疾病特异性蛋白的mRNA和基因来治疗或预防各种疾病。在当前的mRNA疫苗和mRNA疗法中，mRNA是通过体外转录编码靶蛋白的基因产生并施用于患者的。然后该mRNA在体内被翻译成靶蛋白，这触发宿主针对例如癌细胞和/或病毒的免疫反应，从而导致肿瘤和/或病毒的根除，和/或阻止肿瘤复发和/或病毒感染/再感染。另一方面，基因治疗将靶基因引入患者。这些靶基因在体内被转录和翻译以产生靶蛋白。因此，提高编码靶蛋白的基因的转录和翻译效率是提高mRNA疫苗、mRNA疗法和基因疗法的治疗效果，以及降低mRNA疫苗和mRNA疗法成本的关键因素。

5’UTR是mRNA编码区上游的序列，是mRNA翻译成蛋白质的中心调节因子。核糖体识别5’UTR并启动mRNA的翻译。每个mRNA都有一个独特的5’UTR序列来控制mRNA的翻译。已经表明，mRNA的翻译效率在很大程度上取决于5’UTR中RNA结构的热力学稳定性、位置和GC含量(Babendure JR et al.RNA.2006.12:851)。然而，尚未确定最佳的5’UTR结构。对此，我们为mRNA的翻译设计了新的和最佳的5’UTR序列。

除了调节mRNA翻译外，5’UTR还可能影响基因转录。Conrad等人使用5’cDNA末端快速扩增(RACE)-Seq筛选T7启动子的随机初始转录区域。该研究表明，使用T7噬菌体聚合酶从DNA模板体外转录的mRNA产量取决于所采用的特定5’UTR序列(Conrad T etal.Communications Biol.2020.3:439)。这些数据使我们假设5’UTR不仅调节mRNA翻译成蛋白质，还调节基因转录成mRNA。

以前没有研究为DNA或RNA文库中基因的转录和翻译设计或筛选出最佳的5’UTR。在本发明中，我们生成并比较了两种不同基因的各种5’UTR序列关于转录和翻译的效率，并发现了新的5’UTR序列，与已知的5’UTR序列相比，这些新的5’UTR序列增加了基因的翻译和/或转录效率。我们的研究结果将对mRNA疫苗、mRNA疗法、基因疗法和mRNA制造产生重大影响。

发明内容

本发明中，我们设计了超过70条不同的新型5’UTR序列，这些序列具有不同的长度和二级结构，以及使用Optimus 5-Prime程序手动计算的高的平均核糖体负荷(MRL)预测分数。我们证明了不同的5’UTR序列不同程度地调节了体外从编码报告基因，细胞因子基因或HPV抗原多肽编码序列的质粒转录的mRNA的产量和从编码相同蛋白质的mRNA翻译的蛋白质的产量。另外，我们发现与已知5’UTR序列相比，本发明的多条5’UTR序列导致更高的转录和/或翻译效率，所述已知5’UTR序列来自：Biontech的COVID疫苗mRNA BNT162b2、Moderna的COVID疫苗mRNA1273(NCBI GenBank:MZ362873.1)、人血红蛋白beta mRNA(HBB,NCBIGenBank:BC007075.1)，和人血红蛋白alpha1 mRNA(HBA1,NCBI Sequence:NM_000558.5)。而与其他5’UTR序列相比，一些5’UTR序列的翻译和转录效率显著降低。这些新颖的5’UTR序列将用于改善或调节用于mRNA疫苗、mRNA治疗和基因治疗的mRNA和基因的翻译和/或转录。

附图说明

图1显示了通过5’UTR序列优化调节FLuc基因的翻译效率。

图2显示了含有各种5’UTR序列的FLuc基因的转录效率比较结果。

图3显示了含有各种5’UTR序列的人scIL-12mRNA的翻译效率比较结果。

图4显示了含有各种5’UTR序列的人scIL-12基因的转录效率比较结果。

图5显示了用scIL-12mRNA转染的HeLa细胞的培养上清液刺激的人PBMC产生的IFN-γ的比较结果。

图6显示了含有各种5’UTR序列的人scIL-12mRNA的翻译效率比较结果。

图7显示了含有各种5’UTR序列的HPV的翻译效率比较结果。

图8A、8B、8C显示了含有各种5’UTR序列的HPV的翻译效率比较结果。

发明详述

在一个实施方案中，本发明公开了分离的核酸，其在5’至3’方向包含：

a)至少一个5’UTR元件，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.1-63,72-84中任何一个的多核苷酸；和

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。

优选地，所述本发明公开的所述分离的核酸还包含3’UTR元件(例如包含如SEQ IDNO:87所示序列)和polyA序列。

一方面，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.38,43,46,61或72中任何一个的多核苷酸。

一方面，所述5’UTR元件由SEQ ID NOs.38,43,46,61或72组成。

一方面，所述感兴趣的肽或蛋白质是药用活性蛋白，优选选自下组：细胞因子(例如白介素(优选IL-12或IL-2或IL-7))；例如促红细胞生成素；黏附分子，例如整联蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如，一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒抗原，例如一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)人乳头瘤病毒(HPV)抗原、猴痘病毒抗原、流感病毒(A、B或C)抗原、CMV抗原或RSV抗原)、变应原或自身抗原；激素，例如加压素、胰岛素或生长激素；生长因子，例如VEGFA；酶，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶或乳糖酶；受体，例如生长因子受体；蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡调节剂，例如BAX；转录因子，例如FOXP3；肿瘤抑制蛋白，例如p53；结构蛋白，例如表面活性型蛋白质；重编程因子，例如OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28或NANOG；基因组改造蛋白，例如成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；以及血蛋白，例如纤维蛋白原。

优选地，所述白介素为hIL-12；更优选地，所述hIL-12编码序列包含SEQ ID NO:69或65所示序列；

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

一方面，本发明公开的分离的核酸包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:86所示序列。

在使用本发明的RNA或RNA组合物的方法的一个实施方案中，该方法可以包括将所述RNA或RNA组合物转移到细胞中的步骤。在这方面，可以使用适合将RNA转移到细胞中的任何技术。优选地，通过本文所述的标准技术将RNA转染到细胞中，例如磷酸钙沉淀、DEAE转染、电穿孔、脂转染或显微注射。细胞可以是可以用RNA转染的任何细胞，并且优选是抗原呈递细胞，例如未成熟的抗原呈递细胞，更优选选自巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突状细胞。生产目的肽或蛋白质的方法可以在体内或体外进行。

根据本发明，术语“细胞因子”指分子量约为1至200kDa并参与细胞信号传导(例如旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白质。特别是，当释放时，细胞因子会对释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的例子包括淋巴因子、白细胞介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。根据本申请，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于：(i)它们通常以比激素更可变的浓度作用；以及(ii)通常由广泛范围的细胞产生(几乎所有有核细胞都可以产生细胞因子)。干扰素通常以抗病毒、抗增殖和免疫调节活性为特征。干扰素是通过与被调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因的转录从而阻止病毒在细胞内复制的蛋白质。干扰素可分为三种类型。I型IFN包括IFN-alpha,IFN-beta,and IFN-omega。II型IFN包括IFN-gamma。III型IFN包括IFN-lambda1,2,3,和4。细胞因子的具体实例包括促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、骨形态发生蛋白(BMP)、α干扰素(IFNα)、β干扰素(IFNβ)、γ干扰素(INFγ)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)，和白介素32(IL-32)。

根据本发明，术语“激素”涉及由腺体产生的一类信号传导分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)特定组织中激素的合成；(ii)储存和分泌；(iii)将激素转运至其靶标；(iv)激素与受体的结合；(v)信号的中继和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于：(1)激素通常以较小可变的浓度作用，以及(2)通常由特定种类的细胞产生。激素的具体实例包括胰岛素、升压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺激素、生长激素(例如人生长激素或牛生长激素)、催产素、心房利钠肽(ANP)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素、瘦素、儿茶酚胺、促性腺激素、营养激素和多巴胺。在一个实施方案中，“激素”是肽或蛋白质激素，例如胰岛素、升压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺激素、生长激素(例如人生长激素或牛生长激素)、催产素、心房利钠肽(ANP)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素。

根据本发明，术语“黏附分子”涉及位于细胞表面上并且参与细胞与其他细胞或与细胞外基质(ECM)的结合的蛋白质。黏附分子通常是跨膜受体，并且可以分为钙非依赖性(例如整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙黏着蛋白和选择素)。黏附分子的具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如，P-选择素)和地址素。

整合素也参与信号转导。特别地，在配体结合后，整合素调节细胞信号传导途径，例如跨膜蛋白激酶如受体酪氨酸激酶(RTK)的途径。这样的调节可导致细胞生长、分裂、存活或分化或者凋亡。整合素的具体实例包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、αLβ2、αMβ2、αIIbβ3、αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6、αVβ8和α6β4。

根据本发明，术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”意指参与细胞的识别、结合和/或黏附过程的分子。属于该超家族的分子的共有特征是其包含被称为免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的成员包括抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、T细胞受体(TCR)、主要组织相容性复合体(MHC)分子、共受体(例如CD4、CD8、CD19)、抗原受体辅助分子(例如CD-3γ、CD3-δ、CD-3ε、CD79a、CD79b)、共刺激或抑制分子(例如CD28、CD80、CD86)和其他(例如CD147、CD90、CD7)。

根据本发明，术语“免疫活性化合物”涉及任何改变免疫应答的化合物(优选通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成)和/或通过刺激B细胞的抗体产生改变体液免疫的化合物。免疫活性化合物具有强效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从TH2免疫应答转移出去，这可用于治疗广泛的TH2介导的疾病。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的具体实例包括白介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体和抗原，特别是肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如细菌、寄生虫或病毒抗原(例如人乳头状瘤病毒(HPV)、猴痘病毒、流感病毒(A、B或C)、CMV或RSV的一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)抗原)、过敏原和自身抗原。

根据本发明，术语“自身抗原”或“自体抗原”是指源自对象体内(即，自身抗原也可以称为“自体抗原”)并且产生针对身体的该正常部分的异常剧烈免疫应答的抗原。这样的针对自身抗原的剧烈免疫应答可能是“自身免疫病”的原因。

根据本发明，术语“过敏原”是指源自对象身体外部(即，过敏原也可以称为“异源抗原”)并且产生异常剧烈的免疫应答的一类抗原，其中对象的免疫系统对抗原本对对象无害的感知到的威胁。“过敏”是由针对过敏原的这样的剧烈免疫应答引起的疾病。过敏原通常是能够在特应性个体中通过免疫球蛋白E(IgE)应答刺激I型超敏反应的抗原。过敏原的具体实例包括源自花生蛋白(例如，Ara h 2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如，Phl p 5)和尘螨蛋白(例如，Der p 2)的过敏原。

根据本发明，术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常，生长因子充当细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面上的特定受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)(例如VEGFA)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、肝配蛋白(ephrin)、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养蛋白(例如，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF))、胎盘生长因子(PGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、肾酶(RNLS)(抗凋亡生存因子)、T细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子(转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β))和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在一个实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白质生长因子。

根据本发明，术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶在它们催化的反应中不被消耗，并且不改变所述反应的平衡。与许多其他催化剂不同，酶的特异性高得多。在一个实施方案中，酶对于对象的体内平衡是必不可少的，例如，酶的任何功能障碍(特别是活性降低，其可由突变、缺失或产量降低中的任一种引起)都导致疾病。酶的实例包括胆固醇的生物合成或降解的酶、类固醇生成酶、激酶、核酸酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脱甲基酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶，以及神经酰胺酶，例如组织纤溶酶原激活物、链激酶、1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)、己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰腺酶(例如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶或其混合物(例如胰脂肪酶))和乳糖酶。

根据本发明，术语“受体”是指从细胞外部接收信号(特别是称为配体的化学信号)的蛋白质分子。信号(例如配体)与受体的结合引起细胞的一些类型的响应，例如激酶的胞内活化。受体包括跨膜受体(例如离子通道连接(离子移变)受体、G蛋白连接(代谢)受体和酶连接受体)和胞内受体(例如胞质受体和核受体)。受体的具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即，其配体为肽的受体)，例如P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。生长因子受体是细胞分化和增殖的信号级联的第一步。生长因子受体可使用JAK/STAT、MAP激酶和PI3激酶途径。

根据本发明，术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白质。蛋白酶抑制剂可以通过被抑制的蛋白酶分类(例如天冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂)或通过其作用机理分类(例如自杀抑制剂，例如丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin))。蛋白酶抑制剂的具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素(bestatin)。

根据本发明，术语“凋亡调节剂”是指调节凋亡(即激活或抑制凋亡)的分子，特别是肽或蛋白质。凋亡调节剂可分为两大类：调节线粒体功能的凋亡调节剂和调节胱天蛋白酶的凋亡调节剂。第一类包括用于通过阻止线粒体膜电位的损失和/或促凋亡蛋白(例如细胞色素C)释放到胞质溶胶中来维持线粒体完整性的蛋白质(例如BCL-2、BCL-xL)。此第一类还包括促进细胞色素C释放的促凋亡蛋白(例如BAX、BAK、BIM)。第二类包括例如凋亡蛋白的抑制剂(例如XIAP)或FLIP的蛋白质，其阻断胱天蛋白酶的激活。凋亡调节剂的具体实例是BAX、BCL-2、BCL-xL、BAK、BIM、XIAP和FLIP，特别是BAX。

根据本发明，术语“转录因子”涉及特别是通过与特定DNA序列结合来调节遗传信息从DNA到信使RNA的转录速率的蛋白质。转录因子可能在整个生命中调节细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；在胚胎发育过程中调节细胞迁移和组织；和/或响应来自细胞外的信号(例如激素)。转录因子包含至少一个与特定DNA序列结合的DNA结合结构域，其通常与受转录因子调节的基因相邻。转录因子的具体实例包括肝细胞核因子、MECP2、胰岛素启动子因子1、FOXP2、FOXP3、STAT蛋白家族、p53、HOX蛋白家族和SOX蛋白，例如SOX2。

根据本发明，术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞免于致癌途径上的一个步骤的分子，特别是肽或蛋白质。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)在调节细胞周期方面表现出弱化或抑制作用和/或促进凋亡。其功能可能是以下一种或更多种：抑制持续细胞周期所必需的基因；使细胞周期与DNA损伤相关(只要细胞中存在受损的DNA，就不应发生细胞分裂)；如果受损的DNA无法修复，则启动凋亡；转移抑制(例如阻止肿瘤细胞扩散，阻止接触抑制的损失以及抑制转移)；以及DNA修复。肿瘤抑制蛋白的具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、SWI/SNF(SWItch/不可发酵蔗糖(SWItch/Sucrose Non-Fermentable))、希佩尔林道肿瘤抑制物(pVHL)、腺瘤性结肠息肉病(APC)、CD95、肿瘤发生抑制蛋白5(suppression of tumorigenicity 5，ST5)、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5)、肿瘤发生抑制蛋白14(STM)和Yippee-like 3(YPEL3)。

根据本发明，术语“结构蛋白”意指赋予原本为流体的生物组分以硬度和刚性的蛋白质。结构蛋白主要是纤维状的(例如胶原蛋白和弹性蛋白)，但也可能是球形的(例如肌动蛋白和微管蛋白)。通常，球形蛋白质可作为单体溶解，但是聚合以形成可构成细胞骨架的长纤维。另一些结构蛋白是能够产生机械力的运动蛋白(例如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)以及表面活性蛋白。结构蛋白的具体实例包括胶原蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。

根据本发明，术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及这样的分子，特别是肽或蛋白质，当其在体细胞中表达(任选地与其他物质例如其他重编程因子一起)时，导致所述体细胞重编程或去分化为具有干细胞特性，特别是多能性的细胞。重编程因子的具体实例包括OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG。

根据本发明，术语“基因组工程蛋白”涉及能够插入、缺失或替换对象基因组中的DNA的蛋白质。基因组工程蛋白的具体实例包括兆核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)。

根据本发明，术语“血液蛋白质”涉及存在于对象的血浆中，特别是健康对象的血浆中的肽或蛋白质。血液蛋白质具有多种功能，例如转运(例如白蛋白、转铁蛋白)、酶活性(例如凝血酶或血浆铜蓝蛋白)、血液凝结(例如纤维蛋白原)、对病原体的防御(例如补体成分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白质的具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白质C、维勒布兰德因子(von Willebrand factor)、抗凝血酶III、葡萄糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、经修饰的因子VIII和抗凝剂。

根据本发明，术语“蛋白质替代治疗”涉及补充或替换与健康对象相比在患者中活性降低的肽或蛋白质的医学治疗。活性降低(包括零活性，当患者中不存在所述肽或蛋白质时可能是这种情况)可能是由于以下：(i)所述肽或蛋白质的表达降低(即，所述肽或蛋白质是完全功能的，但是其量减少)或(ii)在表达的肽或蛋白质的氨基酸序列中存在一个或更多个突变(即，肽或蛋白质不是完全功能的)。例如，肽或蛋白质的这种活性降低可能是编码该肽或蛋白质但包含一个或更多个突变的基因的结果，其方式为(i)所述基因的表达降低或被沉默，从而导致肽或蛋白质的量减少(其可能仍是完全功能的)和/或(ii)由所述基因编码的肽或蛋白质的氨基酸序列包含一个或更多个突变，从而导致非完全功能(或非功能)肽或蛋白质。由患者中肽或蛋白质的活性降低引起的疾病或障碍可通过替代或补充肽或蛋白质(蛋白质替代治疗)来治疗，例如通过向患有这样的疾病或障碍的患者施用包含编码肽或蛋白质的核苷酸序列的RNA(特别是本发明的RNA)。编码肽或蛋白质的核苷酸序列可以是患者自体的或异源的。然而，如果患者中肽或蛋白质的活性降低是由于一个或更多个突变引起的(即导致了非完全功能(或非功能)肽或蛋白质)，则优选地编码所述肽或蛋白质的核苷酸序列是患者异源的，特别是获自表达天然(即，未突变)形式的肽或蛋白质的健康对象(同一物种)。例如，这样的蛋白质替代治疗可以包括以下步骤：向患者施用(i)包含编码所述肽或蛋白质的核苷酸序列的RNA(特别是本发明的RNA)(其中所述核苷酸序列优选是异源的并且可获自健康对象)或(ii)包含这样的RNA的组合物，例如药物组合物；或者替代地包括以下步骤：(a)将包含编码所述肽或蛋白质的核苷酸序列的RNA(特别是本发明的RNA)(其中所述核苷酸序列优选是异源的并且可获自健康对象)转移到细胞(其中所述细胞可以是患者自体的)中，以及(b)将所述经转染的细胞施用于患者。在替代方案(i)中，优选将RNA摄取到细胞(例如，抗原呈递细胞，例如单核细胞、巨噬细胞或树突细胞，或者其他细胞)中并且形成编码肽或蛋白质的核苷酸序列的翻译产物(并且任选地进行翻译后修饰)以产生所述肽或蛋白质。在替代方案(ii)中，在将经转染的细胞施用于患者后，经转染的细胞优选表达所述肽或蛋白质。

术语“基因组工程”涉及其中优选地通过使用基因组工程蛋白在对象的基因组中插入、缺失或替代DNA的过程。基因组工程蛋白的具体实例包括兆核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和成簇规则间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)。

在一个实施方案中，本发明公开了一种mRNA，其在5’至3’方向包含：

a)至少一个5’UTR元件，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.1-63,72-84(优选SEQ ID NOs.38,43,46,61或72)中任何一个的多核苷酸；和

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。

优选地，所述本发明公开的所述mRNA还包含3’UTR元件(例如包含如SEQ ID NO:87所示序列)和polyA序列。

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

一方面，所述mRNA包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:86所示序列。

一方面，所述mRNA包含至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸，

另一方面，所述至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸包含至少一个骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。

另一方面，所述至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸包含至少一个碱基修饰。

另一方面，所述至少一个碱基修饰选自下组：2-氨基-6-氯嘌呤-核苷-5’-三磷酸、2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2-硫代胞苷-5’-三磷酸、2-硫代尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤-核苷-5’-三磷酸、7-去氮腺苷-5’-三磷酸、7-去氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸，8-叠氮腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N1-甲基-甲尿嘧啶-5’-三磷酸、嘌呤霉素-5’-三磷酸、黄嘌呤-5’-三磷酸、甲尿嘧啶5’-三磷酸。

另一方面至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸是N1-甲基甲尿嘧啶-5’-三磷酸。

在一个实施方案中本发明公开了一种载体，其在5’至3’方向包含：

a)至少一个5’UTR元件，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.1-63(优选SEQ IDNOs.38,43,46,61或72)中任何一个的多核苷酸；和

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。

优选地，所述本发明公开的所述载体还包含3’UTR元件(例如包含如SEQ ID NO:87所示序列)和polyA序列。

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

一方面，所述载体包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:86所示序列。

在一个实施方案中，本发明公开了一种细胞，其包含本发明的分离的核酸、mRNA，或载体。

在一个实施方案中，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明的分离的核酸、mRNA、载体，或细胞。在另一方面，本发明的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，以及更优选地进一步包含一种或多种额外的活性化合物。

一方面，本发明公开了用于治疗的如本文所述的药物组合物。例如，本发明的药物组合物可用于蛋白质替代疗法、基因组工程疗法、基因组重编程疗法或免疫疗法。

本发明的药物组合物可通过任何途径，优选肠胃外施用于个体。本文中使用的表述“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指除肠内施用(本文中使用的“肠内施用”和“经肠内施用”意指施用的药物被胃和/或肠吸收)以外的施用方式。肠胃外施用通常通过注射和/或输注进行，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、骨内、眶内、心内、节内、皮内、腹膜内、经气管内、皮下、表皮下、关节内、包膜下、脑内、脑室内、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外胸骨内和表面施用。对于除免疫治疗之外的应用(例如，用于蛋白质替代治疗、基因组改造治疗或基因重编程治疗)，优选的是将本发明的药物组合物经腹膜内、肌内或皮内施用。对于免疫治疗应用，优选的是将本发明的药物组合物静脉内、腹膜内、肌内、皮下、淋巴管内、皮内或节内，更优选皮内或节内，例如通过节内注射施用。

在一个实施方案中，本发明公开了治疗或预防疾病的方法，包括向有此需要的受试者(优选人类患者)施用本发明的分离的核酸、mRNA、载体、细胞或药物组合物。

针对本发明的RNA或药物组合物的蛋白质替代治疗的举例说明性应用包括治疗(包括预防性治疗)由肽或蛋白质的活性降低引起的病症、障碍或疾病，例如贫血(替代蛋白质：例如，促红细胞生成素)、糖尿病(替代蛋白质：例如，加压素)、先天性肺病(替代蛋白质：例如，表面活性型蛋白质B)、哮喘(替代蛋白质：例如，FOXP3)、心肌梗死(替代蛋白质：例如，VEGFA)、黑素瘤(替代蛋白质：例如，BAX)、自身免疫性糖尿病(替代蛋白质：例如，IL-4)、自身免疫性心肌炎(替代蛋白质：例如，IL-10)、炎症(替代蛋白质：例如，P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-l，PSGL-1)、Sialyl-Lewisx(SLeX)和IL-10))、因子VII缺乏(替代蛋白质：例如，因子VIIa)、血友病A(替代蛋白质：例如，因子VIII)、血友病B(替代蛋白质：例如，因子IX)、因子X缺乏(替代蛋白质：例如，因子X)、因子XI缺乏(替代蛋白质：例如，因子XI)、因子XIII缺乏(替代蛋白质：例如，因子XIII)、血管性血友病(vonWillebrand disease)(替代蛋白质：例如，血管性血友病因子)、蛋白C缺乏(替代蛋白质：例如，蛋白C)、抗凝血酶缺乏(替代蛋白质：例如，抗凝血酶III)，纤维蛋白原缺乏(替代蛋白质：例如，纤维蛋白原)、遗传性血管性水肿(替代蛋白质：例如，Cl-酯酶抑制剂)、αl-PI缺乏(替代蛋白质：例如，α-1蛋白酶抑制剂)、戈谢病(Gaucher disease)(替代蛋白质：例如，葡糖脑苷脂酶)、黏多糖贮积症I(mucopolysaccharidosis I)(替代蛋白质：例如，α-L-艾杜糖醛酸酶)、黏多糖贮积症II(替代蛋白质：例如，艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、黏多糖贮积症VI(替代蛋白质：例如，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)、黏多糖贮积症IVA(替代蛋白质：例如，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶)、黏多糖贮积症IIIA(替代蛋白质：例如，硫酸乙酰肝素硫酸酯酶)、法布里病(Fabry disease)(替代蛋白质：例如，α-半乳糖苷酶A)、蓬佩病(Pompedisease)(替代蛋白质：例如，α-葡糖苷酶)、尼曼-匹克病B型疾病(Niemann-Pick type Bdisease)(替代蛋白质：例如，酸性鞘磷脂酶)、α-甘露糖苷贮积症(替代蛋白质：例如，α-甘露糖苷酶)、异染性脑白质营养不良(替代蛋白质：例如，芳基硫酸酯酶A)、LAL缺乏(替代蛋白质：例如，溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase，LAL))、蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏(替代蛋白质：例如，蔗糖酶-异麦芽糖酶)、ADA缺乏(替代蛋白质：例如，腺苷脱氨酶(ADA))、原发性IGF-1缺乏(替代蛋白质：例如，胰岛素样生长因子1(IGF-1))、低磷酸酯酶症(替代蛋白质：例如，碱性磷酸酶)和急性间歇性卟啉病(替代蛋白质：例如，胆色素原脱氨酶)。

针对本发明的RNA或药物组合物的基因组改造治疗的举例说明性应用包括治疗(包括预防性治疗)选自以下的病症、障碍或疾病：X连锁重症联合免疫缺陷(X-linkedsevere combined immunodeficiency，X-SCID))(用编码白介素2受体共同γ链(IL-2Rγ)的DNA进行校正)、着色性干皮症(Xeroderma pigmentosum)(用天然的，即未突变的DNA进行校正)，以及上述有关蛋白质替代治疗的举例说明性应用的病症、障碍或疾病。针对本发明的RNA或药物组合物的另外的基因组改造治疗包括利用例如CRISPR/CAS进行基因组编辑。

针对本发明的药物组合物的举例说明性免疫治疗应用包括治疗(包括预防性治疗)选自以下的病症、障碍或疾病：感染性疾病(例如，由病原体例如病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV)、猴痘病毒、流感病毒(A、B或C)、CMV或RSV、SARS-CoV-1,SARS-CoV-2或MERS-CoV)、细菌、真菌或其他微生物引起的那些)；不期望的炎症(例如免疫障碍)；和癌症(如三阴性乳腺癌)。

癌症(医学术语：恶性赘生物)是一类这样的疾病，其中一组细胞显示出不受控制的生长(超出正常范围的分裂)、侵入(侵入和破坏邻近组织)并且有时转移(通过淋巴或血液扩散至身体中的其他位置)。癌症的这三种恶性特征将其与自限性且不侵入或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌症形成肿瘤，即由细胞(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变，但一些(像白血病)则不会。根据本发明的术语“癌症”包括三阴性乳腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌(intestinal cancer)、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌(intestine cancer)、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉癌(ENT)、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。其实例是三阴性乳腺癌、肺癌、乳房癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或上述癌症类型或肿瘤的转移。根据本发明的术语癌症还包含癌症转移。

可用本发明的RNA和药物组合物治疗的癌症的实例包括恶性黑素瘤，所有类型的癌(三阴性乳腺癌、结肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞和小细胞肺癌等)、淋巴瘤、肉瘤、胚胎瘤、胶质瘤等。

此外，本发明的mRNA和药物组合物可用于治疗癌前病变(precancerous lesions)(如宫颈癌癌前病变)，尖锐湿疣(condylomata acuminate)等由HPV感染或由HPV感染引起的疾病或病患(如HPV相关的宫颈癌)。

示例性免疫障碍包括但不限于自身免疫病(例如，糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎和银屑病关节炎)，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫性甲状腺炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)，银屑癣，干燥综合征，克罗恩病(Crohn’s disease)，口疮性溃疡，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性结肠炎，哮喘，变应性哮喘，脓毒症和感染性休克，炎性肠病，皮肤红斑狼疮，硬皮病，阴道炎，直肠炎，药疹，麻风逆转反应，麻风结节性红斑(erythema nodosum leprosum)，自身免疫性葡萄膜炎，变应性脑脊髓炎，急性坏死出血性脑病，特发性双侧进行性感音神经性耳聋(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)，再生障碍性贫血，纯红细胞性贫血，特发性血小板减少症，多软骨炎，韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)，慢性活动性肝炎，史蒂文斯-约翰逊综合(Stevens-Johnson syndrome)征，肾小球肾炎，特发性口炎，扁平苔癣，格雷夫斯病(Graves’disease)，结节病，原发性胆汁性肝硬化，后葡萄膜炎和肺间质纤维化)，移植物抗宿主病，移植病例，以及变态反应例如特应性变态反应。

示例性病毒包括但不限于人乳头瘤病毒(HPV)、猴痘病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、巨细胞病毒(CMV)(例如，CMV5)、人疱疹病毒(HHV)(例如，HHV6、7或8)、单纯疱疹病毒(HSV)、牛疱疹病毒(BHV)(例如，BHV4)、马疱疹病毒(EHV)(例如，EHV2)、人T-细胞白血病病毒(HTLV)5，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，麻疹病毒，乳多空病毒(JC和BK)，肝炎病毒(例如，HBV或HCV)，黏液瘤病毒，腺病毒，细小病毒，多瘤病毒，流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒)，呼吸道合胞病毒(RSV)，乳头瘤病毒和痘病毒(例如，痘苗病毒和传染性软疣病毒(MCV)和狂犬病病毒属。这样的病毒可能或可能不表达凋亡抑制剂。由病毒感染引起的示例性疾病包括但不限于水痘、巨细胞病毒感染性疾病、生殖器疱疹、乙型肝炎和丙型肝炎、流感和带状疱疹以及狂犬病。

示例性细菌包括但不限于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠杆菌属物种、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如，大肠杆菌O157：H7)、A组链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、李斯特菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，以及疏螺旋体和立克次氏体。由细菌感染引起的示例性疾病包括但不限于炭疽、霍乱、白喉、食源性疾病(foodborne illness)、麻风病、脑膜炎、消化性溃疡病、肺炎、脓毒症、脓毒症性休克、梅毒、破伤风、肺结核、伤寒和泌尿道感染以及莱姆病(Lyme disease)和落基山斑疹热(RockyMountain spotted fever)。

可用本发明的RNA和药物组合物治疗的感染性疾病的特定实例包括病毒感染性疾病，例如人乳头瘤病毒(HPV)感染或HPV感染相关疾病(如HPV相关的宫颈癌)、猴痘病毒感染、AIDS(HIV)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎、疱疹、带状疱疹(水痘)、德国麻疹(风疹病毒)、黄热病、登革热；黄病毒引起的感染性疾病；流感；由RSV引起的感染性疾病；由CMV引起的感染性疾病；出血性感染性疾病(马尔堡或埃博拉病毒)；细菌感染性疾病(例如军团病(军团菌，Legionella)、胃溃疡(螺杆菌，Helicobacter)、霍乱(弧菌，Vibrio)，大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌或链球菌(破伤风)引起的感染；原生动物病原体感染，例如疟疾、昏睡病、利什曼病、弓形虫病，即由疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)、利什曼原虫(Leishmania)和弓形虫(Toxoplasma)引起的感染；或真菌感染，其由例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠菌(Candida albicans)引起。

可用本发明的分离的核酸、RNA或药物组合物治疗的疾病的具体实例包括癌前病变(如宫颈癌前病变)、癌症(如三阴性乳腺癌)、尖锐湿疣，或其他HPV感染或HPV感染相关疾病或病患(如HPV相关的宫颈癌)。

具体实施方式

实施例1.5’UTR序列的表征

下表1中列出了本研究中生产并测试的新颖的5’UTR序列。所有这些序列都是自主设计的，以达到使用Optimus 5-Prime程序预测的高MRL分数。

表1本发明的5’UTR序列

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*5’UTR 001(SEQ ID NO.64)是WO2013071047A1中公开的SEQ ID NO.20。

使用RNA Folding Form V2.3程序(http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form-v2.php)预测了本研究中测试的5’UTR序列的二级结构。本研究中测试的本发明的5’UTR序列的二级结构具有具有最大的负delta G。

实施例2.通过5’UTR序列优化调节FLuc基因的翻译效率

萤火虫荧光素酶基因(FLuc)被广泛用作报告基因来研究UTR调节的转录和翻译。使用T7表达质粒载体来克隆具有各种5'UTR序列的FLuc基因(NCBI GeneBank:MK484107.1)，其中FLuc基因在T7启动子的控制下表达。加帽的(Capped)FLuc mRNA是使用HiScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB,Ipswich,MA)和CleanCap AG(Trilink,San Diego,CA)通过体外转录产生的。为了测量FLuc mRNA翻译的效率，按照制造商的说明，使用Lipofectamine MessengerMAX(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)在HeLa细胞(ATCC,Manassas,VA)中转染500ng的FLuc mRNA。孵育24小时后，使用Bio-Lite萤光素酶测定系统(Vazyme，南京，中国)通过测量萤光素酶活性间接测定FLuc蛋白的水平。将相对荧光素酶活性标准化为含有Moderna的COVID疫苗mRNA-1273的5’UTR序列的FLucmRNA。

如图1所示，含有新的5’UTR序列(序列名：2、001-opt、17-opt、18-opt或HBB-opt)的FLuc mRNA所产生的FLuc蛋白比含有mRNA-1273的5'UTR序列的FLucmRNA多1.5到2.7倍。而含有新的5’UTR序列(序列名：8、17、18和24)的FLuc mRNA所产生的FLuc蛋白比含有mRNA-1273的5’UTR序列的Fluc mRNA少0.5到0.6倍。

有趣的是，MRL分数与Fluc mRNA翻译的效率没有直接关系。此外，mRNA二级结构与翻译效率之间没有显著关系。

实施例3.不同5’UTR序列的FLuc基因转录效率比较

为了确定5’UTR序列对FLuc基因转录效率的影响，使用HiScribe^TM T7 High YieldRNA Synthesis Kit(NEB)体外转染0.5μg的表达质粒，所述表达质粒包含在T7启动子控制下的具有各种5’UTR的Fluc基因。在体外转录反应2小时后，用DNase I消化质粒模板，然后使用磁珠纯化mRNA(Yeasen,上海,中国)。使用NanoDrop分光光度计(Thermo FisherScientific)测量mRNA的量。Fluc mRNA转录物的量被标准化为包含Moderna的COVID疫苗mRNA-1273的5’UTR序列的Fluc基因所表达的Fluc mRNA转录物的量。

如图2所示，含有以下5’UTR序列的Fluc基因所产生的Fluc mRNA转录物与含有mRNA-1273的5’UTR序列的Fluc基因所产生的Fluc mRNA转录物相当：1,4,5,6,9,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,26,001-30+HBB,001,001-opt,17-opt,18-opt,HBB-opt,HBB long,miniUTR3+,miniUTR3,miniUTR7+,miniUTR7,或RPL32。

有趣的是，含有新的5’UTR序列2、3、7、8、11、25、HBA1 mut和HBB short的FLuc基因所产生的FLuc mRNA转录物比含有mRNA-1273的5’UTR序列的FLuc基因所产生的FLuc mRNA转录物少0.2到0.7倍。

实施例4.含有各种5’UTR序列的人scIL-12mRNA的翻译效率比较

单链白细胞介素12(scIL-12)mRNA先前已被开发为实体癌的抗肿瘤细胞因子mRNA疗法(Etxeberria I et al.Cancer Cell.2019.36:613；Lieschke GJ et al.NatBiotech.1997.15:35)。使用T7表达质粒载体克隆具有各种5’UTR序列的人scIL-12基因(SEQ ID NO.65)。使用HiScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit和CleanCap AG通过体外转录产生加帽的scIL-12mRNA。

为了测量scIL-12mRNA(scIL-12编码序列为SEQ ID NO.65)翻译的效率，按照制造商的说明，使用Lipofectamine MessengerMAX在HeLa细胞(ATCC,Manassas,VA)中转染500ng的scIL-12mRNA。孵育24小时后，使用人IL-12ELISA试剂盒(Bio-Techne,Minneapolis,MN)来测量scIL-12蛋白水平。将由转染了包含各种5’UTR序列的scIL-12mRNA的Hela细胞所生产的IL-12的的蛋白水平标准化为转染了包含Biontech’s COVID疫苗BNT162b2的5’UTR序列的scIL-12mRNA的Hela细胞所生产的IL-12的的蛋白水平。如图3所示，除了1-opt,26-opt,001-opt,HBB short-opt,BNT162b2-opt,和hAg Kozak-opt以外，其他5’UTR序列均显示出与BNT162b2的5’UTR序列相当或更高的翻译效率。而与BNT162b2的5’UTR序列相比，新的5’UTR序列001-opt,HBB short-opt,BNT162b2-opt,和hAg Kozak-opt显著降低了scIL-12mRNA的翻译效率。

实施例5.含有各种5’UTR序列的人scIL-12mRNA的翻译效率比较

我们使用MessengerMax针对不同的人(h)IL-12mRNA分子进行Hela细胞转染，所述hIL-12mRNA分子包括我们的高转录(High Translation,H-T)hGL-001序列(hGL-001序列为SEQ ID NO:68)(hIL-12的编码序列为SEQ ID NO:69)，以及带有来源于Moderna的UTR序列的hMD-001(SEQ ID NO:71)和带有来源于BioNTech的UTR序列的hBT-001(SEQ ID NO:70)(Biontech专利：WO2018160540A1,Moderna专利：WO2017201350A1,参考文献：Hewitt SLetc.Intratumoral IL12mRNA Therapy Promotes TH1 Transformation of the TumorMicroenvironment.Clin Cancer Res.2020Dec 1；26(23):6284-6298.doi:10.1158/1078-0432.CCR-20-0472.Epub 2020Aug 17.PMID:32817076.)。

使用ELISA定量细胞上清液中的蛋白表达。如图6所示，hGL-001的表达量分别比hBT-001和hMD-001高1.8倍和2.6倍。

实施例6.含有各种5’UTR序列的人scIL-12基因转录效率比较

为了确定5’UTR序列对人scIL-12基因(人scIL-12编码序列为SEQ ID NO.65)转录效率的影响，使用HiScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)体外转染0.5μg的表达质粒，所述表达质粒包含在T7启动子控制下的具有各种5’UTR的人scIL-12基因(Etxeberria I et al.Cancer Cell.2019.36:613)。在体外转录反应2小时后，用DNase I消化质粒模板，然后使用磁珠纯化mRNA(翌圣生物(Yeasen),上海,中国)。使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量mRNA的量。包含各种新型5’UTR序列的scIL-12基因所表达的scIL-12mRNA转录物的量被标准化为包含BNT162b2的5’UTR序列中scIL-12基因所表达的scIL-12mRNA转录物的量。

如图4所示，含有本发明5’UTR序列001-30+HBB,001,17-opt,18-opt,HBB-opt,或001-opt的人scIL-12基因所产生的scIL-12mRNA转录物比含有BNT162b2的5’UTR序列的人scIL-12基因所产生的scIL-12mRNA转录物高0.2至0.3倍。与含BNT162b2的5’UTR序列的人scIL-12基因相比，含5’UTR序列1-opt,2-opt,11-opt,12-opt,23-opt,25-opt,26-opt,HBBlong-opt,HBB short-opt,BNT162b2-opt,和hAg Kozak-opt的人scIL-12基因所产生的scIL-12mRNA转录物有0.4-0.8倍的降低。

实施例7.含有各种5’UTR序列的HPV的翻译效率比较

使用T7表达质粒载体克隆带有如表1所述的各种5’UTR序列的HPV抗原多肽编码序列。使用T7聚合酶(Roche)和Clean Cap AG(Trilink)通过体外转录的方式产生加帽的HPVmRNA。其中，HPV抗原多肽编码序列为SEQ ID NO:85。含有HBB-opt 5’UTR(SEQ ID NO:38)和HPV抗原多肽编码序列的mRNA序列为SEQ ID NO:86。

为了测量HPV mRNA翻译效率，按照制造商的说明，使用lipofectamineMessengerMAX将500ng的HPV mRNA转染到293Hek细胞中。孵育48小时后(图7)或孵育24小时(图8A)/48小时(图8B)/72小时(图8C)后，使用流式细胞术和抗E7-PE偶联抗体(Santa CruzBiotechnology)测量HPV蛋白水平。在Attune NxT Focusing Cytometer(ThermoFisherScientific)上进行流式细胞术分析。使用FlowJo软件(BD Life Sciences)进行数据分析。为了量化结果，使用Prism 4(GraphPad Software,Inc.)绘制阳性细胞的百分比。

如图7所示，BNT162b2是BioNtech用于其商业化COVID-19疫苗的首选5’UTR。在所筛选5’UTR中，与BioNtech的5’UTR(BNT162b2)相比，hHBB 5UTR-kozak(SEQ ID NO:72)显著改善了HPV抗原多肽编码序列的翻译效率。

如图8所示，正如预期的那样，所有组中的蛋白质表达均随时间而降低。在转染后72小时，与基准5’UTR相比，我们的HPV mRNA与HBB-opt 5’UTR显示出E7蛋白表达增加。在翻译后24小时和48小时没有观察到E7蛋白表达的显著差异。

实施例8.用scIL-12mRNA转染的HeLa细胞的培养上清液刺激的人PBMC产生的IFN-γ的比较

我们确定了由含有上述5’UTR变体的人scIL-12mRNA(scIL-12编码序列为SEQ IDNO.65)转染的HeLa细胞产生的scIL-12蛋白是否具有生物学活性，以及生物学活性水平是否与人scIL-12mRNA的翻译效率水平正相关。

为此，将人PBMC接种在96孔板中，然后用物种特异性抗CD3ε抗体(1μg/ml,Biolegend,San Diego,CA)处理空白或50μl转染有scIL-12mRNA的HeLa细胞的培养物上清液3天。为了确定从scIL-12mRNA表达的scIL-12蛋白的生物学活性与scIL-12mRNA的翻译效率之间的相关性，用PBS以各种稀释因数(dilution factor)稀释转染scIL-12mRNA的HeLa细胞的培养物的上清液。孵育三天后，根据制造商的说明，收集PBMC的培养物上清液以通过ELISA(Biotechne)测量人IFN-γ。

如图5所示，与如图3中所示的含有各种5’UTR的人scIL-12mRNA的翻译效率的结果相一致，与转染了具有BNT162b2的5’UTR序列的scIL-12mRNA的Hela细胞的培养物上清液相比，转染了具有5’UTR序列001-opt,HBB short-opt,BNT162b2-opt,或hAg Kozak-opt的scIL-12mRNA的Hela细胞的培养物上清液具有0.5倍更低的EC₅₀稀释因数。以上结果表明，mRNA的翻译效率水平与该mRNA通过其产生的蛋白质的生物学活性直接相关。

Claims

1.分离的核酸，其在5’至3’方向包含：

a)至少一个5’UTR元件，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.1-63,72-84(优选SEQIDNOs.38,43,46,61或72)中任何一个的多核苷酸；和

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)，

优选地，所述感兴趣的肽或蛋白质是药用活性蛋白，优选选自下组：细胞因子(例如白介素(优选IL-12或IL-2或IL-7))；例如促红细胞生成素；黏附分子，例如整联蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如，一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒抗原，例如一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)人乳头瘤病毒(HPV)抗原、猴痘病毒抗原、流感病毒(A、B或C)抗原、CMV抗原或RSV抗原)、变应原或自身抗原；激素，例如加压素、胰岛素或生长激素；生长因子，例如VEGFA；酶，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶或乳糖酶；受体，例如生长因子受体；蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡调节剂，例如BAX；转录因子，例如FOXP3；肿瘤抑制蛋白，例如p53；结构蛋白，例如表面活性型蛋白质；重编程因子，例如OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28或NANOG；基因组改造蛋白，例如成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；以及血蛋白，例如纤维蛋白原；

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

2.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸还包含3’UTR元件(例如包含如SEQID NO:87所示序列)和polyA序列。

3.权利要求2所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸包含SEQ ID NO:68或SEQ IDNO:86所示序列。

4.mRNA，其在5’至3’方向包含：

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)；

优选地，所述mRNA还包含3’UTR元件(例如包含如SEQ ID NO:87所示序列)和polyA序列；

优选地，所述感兴趣的肽或蛋白质是药用活性蛋白，优选选自下组：细胞因子(例如白介素(优选IL-12或IL-2或IL-7))；例如促红细胞生成素；黏附分子，例如整联蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如，一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒抗原，例如一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)人乳头瘤病毒(HPV)、猴痘病毒、流感病毒(A、B或C)抗原、CMV抗原或RSV抗原)、变应原或自身抗原；激素，例如加压素、胰岛素或生长激素；生长因子，例如VEGFA；酶，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶或乳糖酶；受体，例如生长因子受体；蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡调节剂，例如BAX；转录因子，例如FOXP3；肿瘤抑制蛋白，例如p53；结构蛋白，例如表面活性型蛋白质；重编程因子，例如OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28或NANOG；基因组改造蛋白，例如成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；以及血蛋白，例如纤维蛋白原；

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

5.权利要求4所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:86所示序列。

6.权利要求4或5所述的mRNA，其中所述mRNA包含至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸，

优选地，所述至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸包含至少一个骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。

7.权利要求6所述的mRNA，其中所述至少一个修饰的或非天然存在的核苷酸包含至少一个碱基修饰，

其中优选地，所述碱基修饰选自下组：2-氨基-6-氯嘌呤-核苷-5’-三磷酸、2-氨基腺苷-5’-三磷酸、2-硫代胞苷-5’-三磷酸、2-硫代尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸、5-溴胞苷-5’-三磷酸、5-溴尿苷-5’-三磷酸、5-碘胞苷-5’-三磷酸、5-碘尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸、6-氯嘌呤-核苷-5’-三磷酸、7-去氮腺苷-5’-三磷酸、7-去氮鸟苷-5’-三磷酸、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸，8-叠氮腺苷-5’-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸、N1-甲基-甲尿嘧啶-5’-三磷酸、嘌呤霉素-5’-三磷酸、黄嘌呤-5’-三磷酸、甲尿嘧啶-5’-三磷酸。

8.载体，其包含：

a)至少一个5’UTR元件，所述5’UTR元件包含含有SEQ ID NOs.38,43,46,61或72中任何一个的多核苷酸；和

b)至少一个编码感兴趣的肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)；

优选地，所述载体还包含3’UTR元件(例如包含如SEQ ID NO:87所示序列)和polyA序列；

优选地，所述感兴趣的肽或蛋白质是药用活性蛋白，优选选自下组：细胞因子(例如白介素(优选IL-12或IL-2或IL-7))；例如促红细胞生成素；黏附分子，例如整联蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(例如，一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)病毒抗原，例如一种或更多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)人乳头瘤病毒(HPV)、猴痘病毒、流感病毒(A、B或C)抗原、CMV抗原或RSV抗原)、变应原或自身抗原；激素，例如加压素、胰岛素或生长激素；生长因子，例如VEGFA；酶，例如单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶或乳糖酶；受体，例如生长因子受体；蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡调节剂，例如BAX；转录因子，例如FOXP3；肿瘤抑制蛋白，例如p53；结构蛋白，例如表面活性型蛋白质；重编程因子，例如OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28或NANOG；基因组改造蛋白，例如成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；以及血蛋白，例如纤维蛋白原

优选地，所述HPV编码序列包含SEQ ID NO:85所示序列。

9.权利要求8所述载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:86所示序列。

10.细胞，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸、权利要求4-7中任一项所述的mRNA，或权利要求8或9所述的载体。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸、权利要求4-7中任一项所述的mRNA、权利要求8或9所述的载体，或权利要求10所述的细胞。

12.权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

13.权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸、权利要求4-7中任一项所述的mRNA、权利要求8或9所述的载体，或权利要求10所述的细胞在制备治疗或预防疾病的药物中的用途，

其中优选地，所述疾病选自：癌前病变(如宫颈癌癌前病变)、癌症(如三阴性乳腺癌)、尖锐湿疣、由HPV感染或由HPV感染所引起的疾病或病患(例如HPV相关的宫颈癌)、传染病、贫血、糖尿病、先天性肺病、哮喘、心肌梗塞、黑色素瘤、自身免疫性糖尿病、自身免疫性心肌炎、炎症、因子VII缺乏，血友病A，血友病B，因子X缺乏，因子XI缺乏，因子XIII缺乏，vonWillebrand病、蛋白C缺乏症、抗凝血酶缺乏症、纤维蛋白原缺乏症、遗传性血管性水肿、al-PI缺乏症、戈谢病(Gaucher disease)、粘多糖贮积症I、粘多糖贮积症II、粘多糖贮积症VI、粘多糖贮积症IVA、粘多糖贮积症IIIA、Fabry病、Pompe病、Niemann-Pick B型病、α-甘露糖苷病、异染性脑白质营养不良、LAL缺乏症、蔗糖酶异麦芽糖酶缺乏症、ADA缺乏症、原发性IGF-1缺乏症、低磷酸酯酶症、急性间歇性卟啉症、X连锁严重联合免疫缺陷(X-SCID)、色素性干皮病或免疫疾病。