JP2023072056A - インターロイキン-12(il12)をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
インターロイキン-12(il12)をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本開示は、ヒトインターロイキン-12(IL12)、その機能的断片、およびIL12を含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドに関する。【解決手段】一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列最適化されている。特定の実施形態では、本開示は、ヒトIL12のポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む、配列最適化されたポリヌクレオチド、またはこれらの配列最適化されたポリヌクレオチドとの高い配列同一性を有する配列を提供する。【選択図】なし
Description
本出願は、2016年5月18日に出願された米国仮特許出願第62/338,483号、および2017年1月7日に出願された第62/443,693号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれの全体が、本明細書に参考として援用される。
電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに出願された、電子的に提出された配列表(名称:MRNA_129_D01JP_SeqList_ST26.xml、サイズ:579,640バイト、および作成日:2023年3月13日)の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願とともに出願された、電子的に提出された配列表(名称:MRNA_129_D01JP_SeqList_ST26.xml、サイズ:579,640バイト、および作成日:2023年3月13日)の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インターロイキン-12(IL12)は、自然免疫および獲得免疫において重要な役割を果たす炎症促進性サイトカインである。Gately, MKら、Annu Rev Immunol.、16巻:495~521頁(1998年)。IL12は、主として、p35およびp40というジスルフィド結合された2つのサブユニットからなる、70kDaのヘテロダイマータンパク質として機能する。IL12 p40ホモダイマーが存在するが、IL12受容体に結合するアンタゴニストとして機能する以外には、生物学的応答を媒介するとは考えられていない。(同書)。IL12 p40サブユニット(NM_002187;P29460;IL12B、ナチュラルキラー細胞刺激因子2、細胞傷害性リンパ球成熟因子2とも称される)の前駆体形態は、328アミノ酸長であるが、その成熟形態は、306アミノ酸長である。IL12 p35サブユニット(NM_000882;P29459;IL12A、ナチュラルキラー細胞刺激因子1、細胞傷害性リンパ球成熟因子1とも称される)の前駆体形態は、219アミノ酸長であり、成熟形態は、197アミノ酸長である。(同書)。IL12 p35およびp40サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Gately, MKら、Annu Rev Immunol.、16巻:495~521頁(1998年)。多数の異なる免疫細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびB細胞)は、抗原刺激時にIL12を産生する。活性なIL12ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。(同書)。
IL12タンパク質は、NK細胞および細胞傷害性T細胞の両方を活性化するその能力に起因して、1994年以来、有望な抗がん治療薬として研究されている。Nastala, C. L.ら、J Immunol、153巻、1697~1706頁(1994年)を参照されたい。しかしながら、高い期待にもかかわらず、早期臨床研究では、満足のいく結果が得られなかった。Lasek W.ら、Cancer Immunol Immunother、63巻、419~435号、424頁(2014年)。IL12の反復投与は、ほとんどの患者において、獲得応答をもたらし、IL12により誘導されるインターフェロンガンマ(IFN-γ)の血中レベルを次第に減少させた。(同書)。さらに、IL12に誘導される抗がん活性は、大部分がIFNγの二次分泌によって媒介されることが認識されていたが、IL12によるIFN-γと他のサイトカイン(例えば、TNF-α)またはケモカイン(IP-10もしくはMIG)との同時誘導は、重度の毒性を引き起こした。(同書)。
負のフィードバックおよび毒性に加えて、臨床環境におけるIL12療法のわずかな有効性は、ヒトにおける強力な免疫抑制環境によって引き起こされる可能性がある。(同書)。IFN-γの毒性を最低限に抑え、IL12の有効性を改善させるために、科学者たちは、様々なアプローチ、例えば、様々な用量および時間のプロトコールをIL12療法に試した。Sacco, S.ら、Blood、90巻、4473~4479頁(1997年);Leonard, J. P.ら、Blood、90巻、2541~2548頁(1997年);Coughlin, C. M.ら、Cancer Res.、57巻、2460~2467頁(1997年);Asselin-Paturel, C.ら、Cancer、91巻、113~122頁(2001年);およびSaudemont,
A.ら、Leukemia、16巻、1637~1644頁(2002年)を参照されたい。それにもかかわらず、これらのアプローチは、患者の生存に有意な影響を及ぼさなかった。Kang, W. K.ら、Human Gene Therapy、12巻、671~684頁(2001年)。
現在のところ、いくつかのIL12臨床試験が、進行中である。これらの複数の臨床試験は、1996年のIL12の初めてのヒト臨床試験から、20年近くも進行中であるが、FDAに承認されたIL12製品は、依然として利用可能ではない。したがって、当技術分野において、IL12を使用して腫瘍を処置するための改善された治療的アプローチに対する必要性が存在している。
A.ら、Leukemia、16巻、1637~1644頁(2002年)を参照されたい。それにもかかわらず、これらのアプローチは、患者の生存に有意な影響を及ぼさなかった。Kang, W. K.ら、Human Gene Therapy、12巻、671~684頁(2001年)。
現在のところ、いくつかのIL12臨床試験が、進行中である。これらの複数の臨床試験は、1996年のIL12の初めてのヒト臨床試験から、20年近くも進行中であるが、FDAに承認されたIL12製品は、依然として利用可能ではない。したがって、当技術分野において、IL12を使用して腫瘍を処置するための改善された治療的アプローチに対する必要性が存在している。
Gately, MKら、Annu Rev Immunol.、16巻:495~521頁(1998年)
Nastala, C. L.ら、J Immunol、153巻、1697~1706頁(1994年
Lasek W.ら、Cancer Immunol Immunother、63巻、419~435号、424頁(2014年)
Sacco, S.ら、Blood、90巻、4473~4479頁(1997年)
Leonard, J. P.ら、Blood、90巻、2541~2548頁(1997年)
Coughlin, C. M.ら、Cancer Res.、57巻、2460~2467頁(1997年)
Asselin-Paturel, C.ら、Cancer、91巻、113~122頁(2001年)
Saudemont, A.ら、Leukemia、16巻、1637~1644頁(2002年)
Kang, W. K.ら、Human Gene Therapy、12巻、671~684頁(2001年)
本開示は、がんの処置のためのmRNA治療薬を提供する。本開示のmRNA治療薬は、特に、この技術が、免疫調節性ポリペプチド(例えば、免疫腫瘍学(「IO」)において有用な免疫刺激性ポリペプチド、例えば、IL-12など)をコードするmRNAの細胞内送達、続いて標的細胞内、例えば、腫瘍中の標的細胞内における機能的タンパク質のde novo合成を提供するため、がんの処置に極めて好適である。本開示は、(1)望ましくない免疫活性化(例えば、外来核酸のin vivo導入と関連する自然免疫応答)を最低限に抑え、(2)mRNAのタンパク質への翻訳効率を最適化するように修飾されたヌクレオチドを有する、治療用mRNAを特徴とする。本開示の例示的な態様は、タンパク質の発現を増強するために、自然免疫応答を低減するヌクレオチド修飾と配列最適化との組合せを、特に、免疫調節性ポリペプチド(例えば、免疫刺激性ポリペプチド、例えば、IL-12)をコードする治療用mRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)内に有する、治療用mRNAを特徴とする。
他の態様では、本開示のmRNA治療薬技術は、脂質ナノ粒子(LNP)送達系を介した、免疫調節性(例えば、免疫刺激性)ポリペプチドをコードするmRNAの送達を特徴とする。例示的な実施形態では、本開示のmRNA治療薬技術は、脂質ナノ粒子(LNP)送達系を介した、免疫調節性ポリペプチドをコードするmRNAの腫瘍への送達を特徴とする。本開示はまた、免疫調節性(例えば、免疫刺激性)ポリペプチドをコードするmRNAと組み合わせて、in vivoで投与した場合に、改善された特性、例えば、細胞内取り込み、細胞内輸送、および/またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有する、新規なイオン化可能脂質に基づくLNPを特徴とする。本開示のLNP製剤はまた、LNPのin vivo投与と関連する免疫原性の低減も示す。
本開示のある特定の態様は、腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、インターロイキン12 p40サブユニット(「IL12B」)ポリペプチドおよびインターロイキン12 p35サブユニット(「IL12A」)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(「ORF」)を含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、方法は、対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、PD1、PD-L1、CTLA-4、またはこれらの組合せを阻害する。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象におけるT細胞を活性化する。
本開示の別の態様は、T細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、T細胞の活性化は、T細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、T細胞の活性化は、腫瘍へのT細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤T細胞の数を増大させることを含む。一部の実施形態では、T細胞の活性化は、メモリーT細胞応答を誘導することを含む。一部の実施形態では、活性化されたT細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはその両方を含む。ある特定の実施形態では、組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における活性化NK細胞の数をさらに増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる。一部の実施形態では、組成物を投与することは、対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する。
本開示の別の態様は、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比は、CD8+T細胞:制御性T(Treg)細胞の比である。
本開示の別の態様は、活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法を対象とする。
本開示の別の態様は、交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、交差提示樹状細胞は、CD103+細胞である。
本開示の他の態様は、ヒトIL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ポリヌクレオチドは、ヒトIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたヒトIL12BポリペプチドをコードするORFを含む。
一部の実施形態では、IL12BポリペプチドおよびIL12Aポリペプチドは、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸23~328に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、IL12B活性を有する。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチドは、配列番号48のアミノ酸336~532に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、IL12A活性を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、IL12Bシグナルペプチドである。
一部の実施形態では、組成物は、リンカーを介してIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたIL12BポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む法。一部の実施形態では、組成物は、IL12Bシグナルペプチド、IL12Bポリペプチド、リンカー、およびIL12AポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Gly/Serリンカーを含む。
一部の実施形態では、IL12ポリペプチドが、配列番号48に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、配列番号5~44、236、および237からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号236または237に少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含む。
ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むORFを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ORFにおける化学的に修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miR-122結合部位である。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miR-122-3pまたはmiR-122-5p結合部位である。ある特定の実施形態では、miRNA結合部位は、aacgccauua ucacacuaaa ua(配列番号51)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、miRNA結合部位はmiR-122に結合する。ある特定の実施形態では、miRNA結合部位は、uggaguguga caaugguguu ug(配列番号53)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、miRNA結合部位がmiR-122に結合する。ある特定の実施形態では、miRNA結合部位は、caaacaccau ugucacacuc ca(配列番号54)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、miRNA結合部位はmiR-122に結合する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、5’非翻訳領域(UTR)を含む。ある特定の実施形態では、5’UTRは、表3に列挙される配列に少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)を含む。ある特定の実施形態では、3’UTRは、表4Aまたは4Bに列挙される配列に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、3’UTR内にmiRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、5’末端キャップ構造を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、3’ポリA尾部を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化ORFを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、in vitroで転写された(IVT)ポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状である。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、送達剤とともに製剤化されている。一部の実施形態では、送達剤は、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子である。一部の実施形態では、送達剤は、式(I)を有する化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない。
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない。
一部の実施形態では、化合物は、式(IA)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、lは、1、2、3、4、および5から選択され、mは、5、6、7、8、および9から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、1、2、3、4、または5であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、lは、1、2、3、4、および5から選択され、mは、5、6、7、8、および9から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、1、2、3、4、または5であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化合物は、式(II)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、lは、1、2、3、4、および5から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、lは、1、2、3、4、および5から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、化合物は、化合物1から化合物147、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される。一部の実施形態では、送達剤は、式(I)を有する化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-(CH2)nN(R)2、-(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)ORおよび-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、およびHからなる群から選択され、各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない。
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-(CH2)nN(R)2、-(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)ORおよび-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、およびHからなる群から選択され、各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない。
一部の実施形態では、送達剤は、リン脂質をさらに含む。一部の実施形態では、リン脂質は、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DUPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 ジエーテルPC)、1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16 Lyso PC)、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(ME 16:0 PE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、リン脂質は、1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-16:0 PC、MPPC)、1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-18:0 PC、MSPC)、1-パルミトイル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-02:0 PC)、1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-14:0 PC、PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:0 PC、PSPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:1 PC、POPC)、1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:2
PC、PLPC)、1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-20:4 PC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-22:6 PC)、1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-14:0 PC、SMPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-16:0 PC、SPPC)、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:1 PC、SOPC)、1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:2 PC)、1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-20:4 PC)、1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-22:6 PC)、1-オレオイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-14:0 PC、OMPC)、1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-16:0 PC、OPPC)、1-オレオイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-18:0 PC、OSPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:1 PE、POPE)、1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:2 PE)、1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-20:4 PE)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-22:6 PE)、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:1 PE)、1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:2 PE)、1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-20:4 PE)、1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-22:6 PE)、1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
PC、PLPC)、1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-20:4 PC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-22:6 PC)、1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-14:0 PC、SMPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-16:0 PC、SPPC)、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:1 PC、SOPC)、1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:2 PC)、1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-20:4 PC)、1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-22:6 PC)、1-オレオイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-14:0 PC、OMPC)、1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-16:0 PC、OPPC)、1-オレオイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-18:0 PC、OSPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:1 PE、POPE)、1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:2 PE)、1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-20:4 PE)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-22:6 PE)、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:1 PE)、1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:2 PE)、1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-20:4 PE)、1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-22:6 PE)、1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、送達剤は、構造脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、PEG脂質をさらに含む。一部の実施形態では、送達剤は、3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、N1-[2-(ジドデシルアミノ)エチル]-N1,N4,N4-トリドデシル-1,4-ピペラジンジエタンアミン(KL22)、14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLin-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2R))、および(2S)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2S))からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む。
一部の実施形態では、送達剤は、第四級アミン化合物をさらに含む。ある特定の実施形態では、第四級アミン化合物は、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-(1,2-ジオレオイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLePC)、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DSTAP)、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DPTAP)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DLTAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DMTAP)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSePC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMePC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOePC)、1,2-ジ-(9Z-テトラデセノイル)-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、組成物が、in vivo送達のために製剤化されている。一部の態様では、組成物は、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている。
ある特定の態様では、投与は、がんを処置する。一部の実施形態では、がんは、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸/直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の態様では、組成物は、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末/粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、RFエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される。一部の態様では、有効量は、約0.10mg/kg~約1,000mg/kgである。
本開示は、免疫応答を刺激する物質(例えば、IL12をコードするmRNA)、すなわち、免疫療法による疾患の予防または処置を含む、がんを処置するための新規なアプローチを提供する。
一態様では、本開示は、IL12をコードするポリヌクレオチドを使用して、がんを処置する方法に関する。本明細書に開示されるIL12ポリペプチドは、IL12A、IL12B、またはIL12AおよびIL12Bの両方を含む。別の態様では、本開示は、IL12をコードするmRNAならびに抗がん剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/または抗CTLA-4抗体を特徴とする組合せアプローチを使用してがんを処置する方法を提供する。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、抗がん免疫応答のプライミングは、例えば、T細胞および/またはナチュラルキラー細胞の刺激時に、IL12をコードするmRNAを、例えば腫瘍内に投与することによって、可能であると考えられる。したがって、IL12をコードするmRNAは、例えば、mRNAの腫瘍内注射により、例えば、腫瘍環境内において免疫系に第1の刺激シグナルを提供すると考えられる。IL12はまた、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞からのインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)の産生を刺激し得る。本明細書に開示されるように、IL12はまた、直接的またはIFN-γを通じて間接的に、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現を増大させ得、これにより、局所的腫瘍免疫が損なわれ得る。したがって、一部の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、PD-L1とその受容体、すなわち、PD-1との間の相互作用を遮断する抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。他の態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、抗CTLA-4抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を含む。さらなる態様では、本開示は、腫瘍を処置する方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体および抗CTLA-4抗体と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。本開示の一部の態様はまた、追加の薬剤、例えば、OX40L、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、またはOX40LをコードするmRNAを含む。他の態様では、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。同様に、抗CTLA-4抗体は、ポリヌクレオチドの形態で投与され得る。例示的な態様は、脂質ナノ粒子-(LNP-)封入型mRNAを用いた処置を特徴とする。例示的な態様は、カチオン性脂質に基づくLNPにおけるmRNAの腫瘍内投与を特徴とする。
1.がんを処置する方法
1.がんを処置する方法
本開示のある特定の態様は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ、質量、および/もしくは体積を低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を予防する方法であって、本明細書に開示されるIL12Bおよび/もしくはIL12Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNA、またはポリヌクレオチドを含むベクターもしくは宿主細胞、またはポリヌクレオチドによってコードされるIL12Bおよび/もしくはIL12Aポリペプチドを投与することを含む、方法を対象とする。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、IL-12ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、IL12BおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む。一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズ(質量および/もしくは体積を含む)を低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL-12ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12BポリペプチドをコードするORFを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12AポリペプチドをコードするORFを含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む。
一部の実施形態では、方法は、第2の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第2の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第2の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体である。一部の実施形態では、第2の薬剤は、OX40LをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体、抗PD-1抗体、および/または抗CTLA-4抗体、またはOX40Lをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書に開示の任意の他の薬剤から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、1つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。1つの特定の実施形態では、本方法は、(i)本明細書に開示されるIL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするmRNA、ならびに(ii)抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍のサイズを、投与前の腫瘍のサイズと比較して、低減する。ある特定の実施形態では、腫瘍のサイズは、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは約100%だけ低減される。ある特定の実施形態では、対象は、部分奏功を呈する。ある特定の実施形態では、対象は、完全奏功を呈する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、それを必要とする対象において、腫瘍の成長を、阻害、停止、または遅延させる。ある特定の実施形態では、腫瘍成長は、少なくとも約1週間、少なくとも約2週間、少なくとも約3週間、少なくとも約1か月間、少なくとも約2か月間、少なくとも約3か月間、少なくとも約4か月間、少なくとも約5か月間、少なくとも約6か月間、少なくとも約9か月間、少なくとも約12か月間、少なくとも約15か月間、少なくとも約18か月間、少なくとも約24か月間、または少なくとも約36か月間阻害、停止または遅延される。他の実施形態では、腫瘍の成長は、無期限に阻害される。
他の実施形態では、本開示は、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、単独でまたはこのポリヌクレオチドを本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて投与することによって、抗腫瘍効果を促進する(例えば、T細胞増殖を誘導する、腫瘍へのT細胞の浸潤を誘導する、メモリーT細胞応答を誘導する、NK細胞の数を増大させるなど)方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてT細胞を活性化する、それを必要とする対象においてT細胞増殖を誘導する、それを必要とする対象の腫瘍へのT細胞の浸潤を誘導する、および/またはそれを必要とする対象においてメモリーT細胞応答を誘導する方法であって、対象に、本明細書に開示される組成物、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、単独であるいは第2の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤ポリペプチド、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチド、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/もしくは抗CTLA-4抗体、またはOX40Lをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に開示される任意の他の薬剤を含む組成物と組み合わせて投与するステップを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)の、単独でまたは第2の薬剤と組み合わせた腫瘍内投与は、他の投与経路と比較して、抗腫瘍効果(例えば、腫瘍へのT細胞の浸潤)の有効性を増大させ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することにより、対象においてT細胞が活性化される。T細胞の活性化は、当技術分野において公知の任意の手段で特徴付けることができる。一部の実施形態では、活性化されたT細胞は、CD4を発現する。一部の実施形態では、活性化されたT細胞は、CD8を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたT細胞は、CD4およびCD8を発現する。ある特定の実施形態では、活性化されたT細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはCD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方を含む。
一実施形態では、対象における活性化されたT細胞は、対象における腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する。T細胞の活性化は、当技術分野における適用、例えば、T細胞増殖を測定すること;酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)もしくは酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)によってサイトカイン産生を測定すること;またはフローサイトメトリーなどの技法によるT細胞活性化と関連する細胞表面マーカー(例えば、CD69、CD40L、CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、およびCD134)の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、T細胞の活性化は、T細胞増殖を誘導することを含む。一部の実施形態では、T細胞増殖は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12の投与前のT細胞増殖のレベルと比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。
一実施形態では、対象におけるT細胞増殖は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるT細胞増殖は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。T細胞増殖は、当技術分野における適用、例えば、細胞計数、生存性染色、光学密度アッセイ、またはフローサイトメトリーなどの技法によるT細胞活性化と関連する細胞表面マーカー(例えば、CD69、CD40L、CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、およびCD134)の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、T細胞の活性化は、腫瘍のT細胞の浸潤の誘導を含む。一部の実施形態では、腫瘍におけるT細胞浸潤は、レベルポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12の投与前の腫瘍のT細胞浸潤のレベルと比較して少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。
一部の実施形態では、T細胞の活性化は、腫瘍浸潤T細胞の数を増大させることを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍における腫瘍浸潤T細胞の数は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12の投与前の腫瘍における腫瘍浸潤T細胞の数と比較して少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。
一実施形態では、対象の腫瘍へのT細胞の浸潤は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象の腫瘍へのT細胞の浸潤は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍へのT細胞の浸潤は、当技術分野における適用、例えば、組織切片化および細胞マーカーの染色、腫瘍部位における局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるT細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、T細胞の活性化は、それを必要とする対象において、メモリーT細胞応答を誘導することを含む。ある特定の実施形態では、メモリーT細胞応答は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12の投与前のメモリーT細胞応答と比較して少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。
一実施形態では、対象におけるメモリーT細胞応答は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるメモリーT細胞応答は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。メモリーT細胞応答は、当技術分野における適用、例えば、メモリーT細胞と関連するT細胞マーカーの測定、メモリー免疫応答と関連する局所的サイトカイン産生の測定、またはフローサイトメトリーなどの技法によるメモリーT細胞表面マーカーの検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比を増大させる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比は、対象における(i)CD8+、CD4+、もしくはCD8+/CD4+T細胞の、(ii)Treg細胞に対する比によって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、CD8+T細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、CD4+T細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、CD8+/CD4+T細胞の数の増大と相関する。一部の実施形態では、エフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、Treg細胞の数の減少と相関する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12(単独で、または抗PD-1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、またはOX40Lをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて)の投与後のエフェクター対サプレッサーT細胞比、例えば、CD8+T細胞対Treg細胞比は、少なくとも約1.5:1、少なくとも約2:1、少なくとも約2.5:1、少なくとも約3:1、少なくとも約3.5:1、少なくとも約3.5:1、少なくとも約4:1、少なくとも約4.5:1、少なくとも約5:1、少なくとも約6:1、少なくとも約7:1、少なくとも約8:1、少なくとも約9:1、少なくとも約10:1、少なくとも約15:1、少なくとも約20:1、少なくとも約25:1、少なくとも約30:1、少なくとも約35:1、少なくとも約40:1、少なくとも約45:1、少なくとも約50:1、少なくとも約60:1、少なくとも約70:1、少なくとも約80:1、少なくとも約90:1、少なくとも約100:1、少なくとも約110:1、少なくとも約120:1、少なくとも約130:1、少なくとも約140:1、少なくとも約150:1、少なくとも約200:1、少なくとも約250:1、または少なくとも約500:1である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)をコードするIL12(単独で、または抗PD-1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、またはOX40Lをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて)の投与後のエフェクター対サプレッサーT細胞比、例えば、CD8+T細胞対Treg細胞比は、少なくとも約1.5、少なくとも約2、少なくとも約2.5、少なくとも約3、少なくとも約3.5、少なくとも約3.5、少なくとも約4、少なくとも約4.5、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約110、少なくとも約120、少なくとも約130、少なくとも約140、少なくとも約150、少なくとも約200、少なくとも約250、または少なくとも約500である。
一実施形態では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比は、当技術分野における適用を使用して、例えば、IHCおよび/またはフローサイトメトリーを含む当技術分野において公知の任意の方法を使用してCD8+、CD4+、またはCD8+/CD4+T細胞の、Treg細胞に対する比を測定することによって、測定することができる。
ある特定の実施形態では、本方法による活性化T細胞は、CD4+細胞、CD8+細胞、CD62+(L-セレクチン+)細胞、CD69+細胞、CD40L+細胞、CD137+細胞、CD25+細胞、CD71+細胞、CD26+細胞、CD27+細胞、CD28+細胞、CD30+細胞、CD45+細胞、CD45RA+細胞、CD45RO+細胞、CD11b+細胞、CD154+細胞、CD134+細胞、CXCR3+細胞、CCR4+細胞、CCR6+細胞、CCR7+細胞、CXCR5+細胞、Crth2+細胞、ガンマデルタT細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による活性化T細胞は、Th1細胞である。他の実施形態では、本方法によって活性化されたT細胞は、Th2細胞である。他の実施形態では、本開示によって活性化されるT細胞は、細胞傷害性T細胞である。
一部の実施形態では、本方法による浸潤T細胞は、CD4+細胞、CD8+細胞、CD62+(L-セレクチン+)細胞、CD69+細胞、CD40L+細胞、CD137+細胞、CD25+細胞、CD71+細胞、CD26+細胞、CD27+細胞、CD28+細胞、CD30+細胞、CD45+細胞、CD45RA+細胞、CD45RO+細胞、CD11b+細胞、CD154+細胞、CD134+細胞、CXCR3+細胞、CCR4+細胞、CCR6+細胞、CCR7+細胞、CXCR5+細胞、Crth2+細胞、ガンマデルタT細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法による浸潤T細胞は、Th1細胞である。他の実施形態では、本方法による浸潤T細胞は、Th2細胞である。他の実施形態では、本開示による浸潤T細胞は、細胞傷害性T細胞である。
一部の実施形態では、本方法によって誘導されるメモリーT細胞は、CD4+細胞、CD8+細胞、CD62+(L-セレクチン+)細胞、CD69+細胞、CD40L+細胞、CD137+細胞、CD25+細胞、CD71+細胞、CD26+細胞、CD27+細胞、CD28+細胞、CD30+細胞、CD45+細胞、CD45RA+細胞、CD45RO+細胞、CD11b+細胞、CD154+細胞、CD134+細胞、CXCR3+細胞、CCR4+細胞、CCR6+細胞、CCR7+細胞、CXCR5+細胞、Crth2+細胞、ガンマデルタT細胞、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、本方法によるメモリーT細胞は、Th1細胞である。他の実施形態では、本方法によるメモリーT細胞は、Th2細胞である。他の実施形態では、本開示によるメモリーT細胞は、細胞傷害性T細胞である。
ある特定の実施形態では、本開示は、腫瘍に対する獲得免疫応答、自然免疫応答、または獲得免疫応答および自然免疫応答の両方を誘導する方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAを、単独であるいは第2の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/もしくは抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、ならびに/または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を含む。
本開示は、さらに、それを必要とする対象において、ナチュラルキラー(NK)細胞の数を増大させる方法であって、IL12をコードするmRNAを含むポリヌクレオチドを、単独であるいは第2の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/もしくは抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、ならびに/または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。一態様では、対象におけるNK細胞の数の増大は、対象における抗腫瘍免疫応答に指向される。別の態様では、対象におけるNK細胞の数の増大は、対象における腫瘍のサイズを低減もしくは減少させるか、または腫瘍の成長を阻害する。対象におけるNK細胞の数の増大は、当技術分野における適用、例えば、NK細胞表面マーカー(例えば、CD335/NKp46;CD336/NKp44;CD337/NPp30)または細胞内NK細胞マーカー(例えば、パーフォリン、グランザイム、グラニュライシン)の検出を使用して、測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象における活性化NK細胞の数を、投与前の活性化NK細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、活性化NK細胞の数は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。一部の実施形態では、活性化NK細胞の増大は、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、少なくとも約20日間、少なくとも約21日間、または少なくとも約28日間維持される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、対象の腫瘍における交差提示樹状細胞の数を、投与前の腫瘍における交差提示樹状細胞の数と比較して、増大させる。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の数は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍だけ増大する。一部の実施形態では、腫瘍中の交差提示樹状細胞の増大は、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間、少なくとも約19日間、少なくとも約20日間、少なくとも約21日間、または少なくとも約28日間維持される。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、腫瘍を有する対象におけるIFNγ発現を増大させる方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAを、単独であるいは第2の薬剤、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/もしくは抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、ならびに/または本明細書に開示される任意の他の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法を対象とする。
他の実施形態には、腫瘍を有する対象におけるIFNγ、TNFα、IL-10、IL-13、IL-15/15R、IL-27、MIP-1β、MIP-1α、MCP-1、MCP-3、M-CSF、IL-4、IL-5、またはこれらの任意の組合せの発現を増大させる方法であって、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAを、単独でまたは本明細書に開示される別の薬剤と組み合わせて投与することを含む、方法も含まれる。さらに他の実施形態では、本開示の方法には、GM-CSF、IL-18、IL-3、RANTES、IL-6、またはこれらの任意の組合せの発現を誘導する方法が含まれ得る。
IL12をコードするポリヌクレオチドは、直接的または間接的にのいずれかで、腫瘍に投与するのに好適な医薬組成物として製剤化され得る。「腫瘍」という用語は、本明細書において広義に使用され、生理学的機能を有さず、通常は急速な無制御な細胞増殖により生じる、組織のあらゆる異常な新成長を指す。本明細書において使用されるとき、「腫瘍」という用語は、良性腫瘍および悪性腫瘍の両方に関する。
本開示のある特定の態様は、単回投与用量の、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAを、単独でまたは本明細書に開示される任意の薬剤と組み合わせて腫瘍内投与する方法を提供する。そのような実施形態では、IL12をコードするmRNAは、1回のみ投与され得、一方で、他の薬剤は、その通常の投薬スケジュールに従って、定期的に投与され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/または抗CTLA-4抗体は、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAの投与の前に投与される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、例えば、本明細書に開示される化合物18において、製剤化される。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、一部の態様では、IL12をコードするポリヌクレオチドおよび/または本明細書に開示される脂質ナノ粒子製剤の腫瘍内送達は、抗腫瘍有効性を誘発し、腫瘍を処置するための投薬に十分な単回用量の投与を可能にする。IL-12によって誘導されるIFNγの潜在的毒性を考慮すると、本開示のポリヌクレオチドのこの単回投薬レジメンは、処置を必要とする対象にとって有益であり得る。
ある特定の実施形態では、本方法は、IL12をコードするポリヌクレオチドの単回用量を、第2の薬剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせて投与することを含み、この第2の薬剤は、その通常の(例えば、承認されている)スケジュールに従って同様に単回投与で提供されてもよく、または複数回投与で提供されてもよい。他の実施形態では、方法は、任意選択で、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-1抗体、および/または抗CTLA-4抗体、またはOX40Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、IL12をコードするポリヌクレオチドの2回以下の投与、IL12をコードするポリヌクレオチドの3回以下の投与、IL12をコードするポリヌクレオチドの4回以下の投与、またはIL12をコードするポリヌクレオチドの5回以下の投与を含む。
他の実施形態では、本方法は、アブスコパル効果、例えば、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAによる、腫瘍の局所的な処置、例えば、腫瘍内送達が、処置された腫瘍の退縮だけでなく、局所的な処置の範囲外の腫瘍(「遠位腫瘍」)の退縮も引き起こす、腫瘍の処置をもたらし得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍のサイズを低減する。ある特定の実施形態では、投与は、第1の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第2の遠位腫瘍のサイズを低減する。一部の実施形態では、遠位腫瘍のサイズは、少なくとも約10%、少なくとも約20%少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%だけ低減される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することは、遠位腫瘍の成長を阻害する。ある特定の実施形態では、投与は、第1の腫瘍に対して腫瘍内であり、この投与は、第2の遠位腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、遠位腫瘍の成長は、少なくとも約7日間、少なくとも約14日間、少なくとも約21日間、少なくとも約28日間、少なくとも約2か月間、少なくとも約3か月間、少なくとも約4か月間、少なくとも約5か月間、少なくとも約6か月間、少なくとも約7か月間、少なくとも約8か月間、少なくとも約9か月間、少なくとも約10か月間、少なくとも約11か月間、少なくとも約12か月間、少なくとも約18か月間、少なくとも約24か月間、少なくとも約30か月間、少なくとも約36か月間、少なくとも約4年間、または少なくとも約5年間阻害される。
本明細書に開示される腫瘍内投与のための医薬組成物を使用した、IL12をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達により、
(i)腫瘍におけるポリヌクレオチドの保持が増大され得る、
(ii)腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルが、腫瘍周囲の組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較して、増大され得る、
(iii)ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織(例えば、腫瘍周囲組織、もしくは遠位位置、例えば、肝臓組織)への漏出が減少され得る、または
(iv)これらの任意の組合せが起こり得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物(例えば、式(I)の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3によって置換されている、組成物)と比べたものである。
(i)腫瘍におけるポリヌクレオチドの保持が増大され得る、
(ii)腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルが、腫瘍周囲の組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較して、増大され得る、
(iii)ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織(例えば、腫瘍周囲組織、もしくは遠位位置、例えば、肝臓組織)への漏出が減少され得る、または
(iv)これらの任意の組合せが起こり得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物(例えば、式(I)の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3によって置換されている、組成物)と比べたものである。
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
IL12をコードするポリヌクレオチドの腫瘍への送達は、IL12をコードするポリヌクレオチドを含む、例えば、ナノ粒子形態の、本明細書に開示される医薬組成物を、対象に投与することを含み、ここで、医薬組成物の投与は、腫瘍を組成物と接触させることを含む。
IL12をコードするポリヌクレオチドが、mRNAである事例では、腫瘍内の細胞を、医薬組成物と接触させると、翻訳可能なmRNAが、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドが産生され得る。しかしながら、実質的に翻訳可能ではないmRNAもまた、腫瘍に送達され得る。実質的に翻訳可能ではないmRNAは、ワクチンとして有用であり得る、および/または細胞の翻訳成分を封鎖して、細胞における他の種の発現を低減することができる。
本明細書に開示される医薬組成物により、特異的送達を増大させることができる。本明細書において使用されるとき、「特異的送達」という用語は、本明細書に開示される医薬組成物(例えば、ナノ粒子形態)による、目的の標的組織(例えば、腫瘍)への、標的外組織(例えば、哺乳動物の肝臓)へと比較してより多くの(例えば、少なくとも1.5倍多い、少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、少なくとも5倍多い、少なくとも6倍多い、少なくとも7倍多い、少なくとも8倍多い、少なくとも9倍多い、少なくとも10倍多い)、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの送達を意味する。
特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、例えば、
(i)組織の重量に対する、組織内の、IL12をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量、
(ii)組織の重量に対する、組織内のポリヌクレオチドの量、または
(iii)組織内の総タンパク質の量に対する、組織内の、IL12をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量
を比較することによって測定することができる。
(i)組織の重量に対する、組織内の、IL12をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量、
(ii)組織の重量に対する、組織内のポリヌクレオチドの量、または
(iii)組織内の総タンパク質の量に対する、組織内の、IL12をコードするポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の量
を比較することによって測定することができる。
腫瘍または腫瘍内の特定のクラスの細胞への特異的な送達は、医薬組成物を対象に投与したときに、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物が、標的到達地(例えば、標的組織)に、他の標的外到達地と比べて高い比率で送達されることを示す。
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む医薬組成物(例えば、ナノ粒子形態)を腫瘍に投与する場合に、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを腫瘍内に送達するための方法を提供する。腫瘍内投与は、
(i)腫瘍におけるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの保持の増大、(ii)腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルの、腫瘍周囲組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較した、増大、
(iii)ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織(例えば、腫瘍周囲組織、または遠位位置、例えば、肝臓組織への)への漏出の減少、ならびに
(iv)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される1つまたは複数の特性を示し得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物(例えば、式(I)の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3によって置換されている、組成物)と比べたものである。
(i)腫瘍におけるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの保持の増大、(ii)腫瘍における発現されるポリペプチドのレベルの、腫瘍周囲組織における発現されるポリペプチドのレベルと比較した、増大、
(iii)ポリヌクレオチドまたは発現される産物の標的外組織(例えば、腫瘍周囲組織、または遠位位置、例えば、肝臓組織への)への漏出の減少、ならびに
(iv)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される1つまたは複数の特性を示し得、
ここで、ある特性に関して観察される増大または減少とは、対応する参照組成物(例えば、式(I)の化合物が存在しないか、または別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3によって置換されている、組成物)と比べたものである。
一実施形態では、漏出の減少は、非腫瘍組織、例えば、腫瘍周囲組織、または別の組織もしくは器官、例えば、肝臓組織におけるポリペプチドの発現に対する、腫瘍におけるポリペプチドの発現の比の減少として定量化することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を使用することにより結果として生じる送達における別の特性は、他の脂質成分を使用して同じ治療剤または治療剤をコードするポリヌクレオチドを送達した場合に観察される免疫応答に対する、免疫応答の低減である。
したがって、本開示は、対象の腫瘍組織における治療剤(例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは投与の結果として発現されるポリペプチド)の保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織における治療剤の保持が、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の腫瘍組織における治療剤の保持と比較して増大する、方法を提供する。
対象の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持が、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の腫瘍組織におけるポリヌクレオチドの保持と比較して増大する方法もまた、提供される。
対象の腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持を増大させる方法であって、本明細書に開示される医薬組成物を、腫瘍組織に投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、腫瘍組織における発現されるポリペプチドの保持が、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の腫瘍組織におけるポリペプチドの保持と比較して増大する、方法もまた、提供される。
本開示はまた、それを必要とする対象に腫瘍内投与されるポリヌクレオチドの発現漏出を減少させる方法であって、前記ポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルが、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の非腫瘍組織におけるポリペプチドの発現レベルと比較して減少する、方法を提供する。
それを必要とする対象に腫瘍内投与される治療剤(例えば、医薬組成物の一部として投与されるポリペプチド)の発現漏出を減少させる方法であって、治療剤を、本明細書に開示される医薬組成物として腫瘍組織に腫瘍内投与するステップを含み、非腫瘍組織における治療剤の量が、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の非腫瘍組織における治療薬の量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
対象の腫瘍における発現されるポリペプチドの発現漏出を減少させる方法であって、腫瘍組織に、本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含み、医薬組成物が、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量が、対応する参照組成物(例えば、MC3)を投与した後の非腫瘍組織における発現されるポリペプチドの量と比較して減少する、方法もまた、提供される。
一部の実施形態では、非腫瘍組織は、腫瘍周囲組織である。他の実施形態では、非腫瘍組織は、肝臓組織である。
本開示はまた、医薬組成物、例えば、当技術分野において公知の脂質を含む医薬組成物の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答を、そのような組成物中の1つまたはすべての脂質を式(I)の化合物で置き換えることによって、低減または予防するための方法を提供する。例えば、MC3(または当技術分野において公知の他の脂質)を含む医薬組成物におけるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与によって引き起こされる免疫応答は、MC3を、式(I)の化合物、例えば、化合物18で置き換えることによって、予防(回避)または緩和することができる。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、治療剤、またはIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、リン酸緩衝食塩水(PBS)または別の生理学的緩衝溶液(例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など)において投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
一部の実施形態では、治療剤、またはIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に開示される医薬組成物において投与した後に観察される免疫応答は、PBSまたは別の生理学的緩衝溶液を単独で投与した場合に観察される免疫応答と比較して、上昇しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物を対象に腫瘍内投与した場合に、免疫応答は観察されない。
したがって、本開示はまた、それを必要とする対象に、治療剤、またはIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達する方法であって、対象に、本明細書に開示される医薬組成物を腫瘍内投与するステップを含み、医薬組成物の投与によって引き起こされる免疫応答が、
(i)PBS単独または別の生理学的緩衝溶液(例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など)、
(ii)PBSまたは別の生理学的緩衝溶液における、治療剤、またはIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
(iii)対応する参照組成物、すなわち、式(I)の化合物が、別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3で置換された、同じ医薬組成物
の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答と比較して、上昇しない方法を提供する。
(i)PBS単独または別の生理学的緩衝溶液(例えば、リンガー溶液、タイロード溶液、ハンクス平衡塩類溶液など)、
(ii)PBSまたは別の生理学的緩衝溶液における、治療剤、またはIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは
(iii)対応する参照組成物、すなわち、式(I)の化合物が、別のイオン化可能アミノ脂質、例えば、MC3で置換された、同じ医薬組成物
の腫瘍内投与によって引き起こされる免疫応答と比較して、上昇しない方法を提供する。
ある特定の実施形態では、投与により、がんが処置される。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、腫瘍内、腸内、胃腸内、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳内に)、側脳室内(脳室内に)、皮膚上(皮膚の上への適用)、皮内(皮膚そのものに)、皮下(皮膚の下に)、鼻内投与(鼻を通じて)、静脈内(静脈の中に)、腹腔内(腹膜に)、動脈内(動脈の中に)、筋肉内(筋肉の中に)、心臓内(心臓の中に)、骨内注入(骨髄の中に)、髄腔内(脊柱管に)、腹腔内(腹膜への注入もしくは注射)、膀胱内注入、硝子体内(眼を通じて)、空洞内注射(陰茎の基底部に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散)、経粘膜(粘膜を通じた拡散)、吹送(吸飲)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上)、または点耳を含むがこれらに限定されない、利用可能な任意の経路で投与され得る。他の実施形態では、本開示のmRNAは、非経口(例えば、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内への注射もしくは注入技法を含む)、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、組成物、またはポリペプチドは、皮下、静脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、皮内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して、投与される。1つの特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、腫瘍内投与される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末/粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、RFエネルギー、電流を利用するデバイス、またはこれらの任意の組合せによって送達される。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含有する細胞の、哺乳動物対象への移植に関する。細胞の、哺乳動物対象への投与は、当業者には公知であり、これには、局所的埋込み(例えば、局所もしくは皮下投与)、器官送達または全身注射(例えば、静脈内注射もしくは吸入)、および薬学的に許容される担体における細胞の製剤化が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、mRNAは、約0.10μg/kg~約1000mg/kgの量で投与される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象の細胞におけるIL12の発現をもたらす。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、または製剤の投与は、対象におけるIL12活性の増大をもたらす。例えば、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびにIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするmRNAを含む組成物または製剤を対象に投与する方法において使用され、ここで、この方法は、対象の少なくとも一部の細胞においてIL12活性の増大をもたらす。
一部の実施形態では、対象に対するIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、およびIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするmRNAを含む組成物又は製剤の投与は、正常対象において予測される活性レベルの少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%またはそれより大きなレベルまでの細胞対象におけるIL12活性の増大をもたらす。
本開示の他の実施形態はまた、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびにIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするmRNAを含むポリヌクレオチドを、1つまたは複数の抗がん剤とともに投与するステップ(例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に)を含む、方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびにIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害するために使用することができる。
一部の実施形態では、腫瘍は、疾患、障害、および/または状態と関連している。特定の実施形態では、疾患、障害、および/または状態は、がんである。したがって、一態様では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびにIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)の投与により、がんが処置される。
「がん」は、身体における異常な細胞の無制御な成長により特徴付けられる様々な疾患の広範な群を指す。制御されない細胞の分裂および成長は、近傍の組織に侵入し、またリンパ系または血流を通じて身体の遠位部分に転移し得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。「がん」または「がん組織」は、様々なステージの腫瘍を含み得る。ある特定の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージ0であり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、発達の非常に初期にあり、転移はしていない。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージIであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、比較的サイズが小さく、近傍の組織に拡がっておらず、転移していない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージIIまたはステージIIIであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、ステージ0またはステージIよりも大きく、成長して近傍の組織に入っているが、リンパ節への可能性を除き転移はしていない。他の実施形態では、がんまたは腫瘍は、ステージIVであり、その場合、例えば、がんまたは腫瘍は、転移している。ステージIVはまた、進行性がんまたは転移性がんとも称され得る。
一部の態様では、がんは、これらに限定されないが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸/直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。「固形腫瘍」としては、肉腫、黒色腫、癌腫、または他の固形腫瘍がんが挙げられるが、これらに限定されない。「肉腫」は、胚結合組織のような物質からできた腫瘍を指し、通常、線維性物質または均質な物質に包埋された緊密に詰まった細胞から構成される。肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバメシー肉腫(Abemethy’s sarcoma)、脂肪肉腫(adipose sarcoma)、脂肪肉腫(liposarcoma)、包巣状軟部肉腫(alveolar soft part sarcoma)、エナメル上皮肉腫、ブドウ状横紋筋肉腫、緑色肉腫(chloroma sarcoma)、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、または末梢血管拡張性肉腫(telangiectaltic sarcoma)が挙げられるが、これらに限定されない。
「黒色腫」という用語は、皮膚または他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を指す。黒色腫としては、例えば、末端性黒子性黒色腫(acra-lentiginous melanoma)、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、S91黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子性黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向にある上皮細胞からできた、悪性の新成長を指す。例示的な癌腫としては、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌(carcinoma adenomatosum)、副腎皮質の癌腫、肺胞上皮癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma)、基底細胞癌(carcinoma basocellulare)、類基底細胞癌、基底扁平上皮細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳状癌(cerebriform carcinoma)、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様癌、面疱癌、体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱状癌、円柱細胞癌、管癌、緻密性癌(carcinoma durum)、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、咽頭扁桃上皮癌、外方増殖性癌、潰瘍癌、線維性癌、ゼラチン性癌、ゼラチン状癌、巨細胞癌(giant cell carcinoma)、巨細胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌(hematoid carcinoma)、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、副腎様癌(hypemephroid carcinoma)、幼児型胎児性癌、上皮内癌(carcinoma in situ)、表皮内癌、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、クロンペッカー癌(Krompecher’s carcinoma)、クルチツキー細胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌、レンズ状癌(lenticular carcinoma)、レンズ状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪腫性癌、リンパ上皮癌、髄様癌(carcinoma medullare)、髄様癌(medullary carcinoma)、黒色癌、軟性癌(carcinoma molle)、粘液性癌(mucinous carcinoma)、粘液性癌(carcinoma muciparum)、粘液細胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘表皮癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌(solanoid carcinoma)、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、紐状癌(string carcinoma)、毛細血管拡張性癌、毛細血管拡張様癌、移行細胞癌、結節癌(carcinoma tuberosum)、結節癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、または絨毛癌(carcinoma viflosum)が挙げられる。
処置することができるさらなるがんは、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳がん、卵巣がん、肺がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃がん、結腸がん、悪性膵臓インスリノーマ(malignant pancreatic insulanoma)、悪性カルチノイド、膀胱がん、前悪性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、乳頭様甲状腺がん、神経芽細胞腫、神経内分泌がん、食道がん、泌尿生殖器管がん、悪性高カルシウム血症、子宮頸がん、子宮内膜がん、副腎皮質がん、前立腺がん、ミュラー管がん、卵巣がん、腹膜がん、卵管がん、または子宮漿液性乳頭状癌(uterine papillary serous carcinoma)が挙げられる。
2.組合せ療法
2.組合せ療法
本開示は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするORF(例えば、mRNA)を含むポリヌクレオチド、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、IL-12ポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドは、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORF、または組合せ療法としての、すなわち、任意の他の抗がん剤との組合せでのその使用を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、1つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせた、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、もしくはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするmRNAを含むポリヌクレオチド、または対象への1つもしくは複数の抗がん剤と組み合わせたポリヌクレオチドの使用を対象とする。一実施形態では、組合せ療法は、IL12をコードするポリヌクレオチドと、1つまたは複数の標準的な治療法との組合せであり得る。別の実施形態では、本開示の方法は、2つの追加の抗がん剤、3つの追加の薬剤、4つの追加の薬剤などを含む。追加の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体、またはポリヌクレオチド、例えば、mRNAであり得る。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、mRNAである。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原をコードするmRNAである。他の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、腫瘍抗原でも腫瘍抗原をコードするmRNAでもない。他の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、タンパク質、例えば、抗体である。
一部の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、United States Food and Drug Administrationによって承認された薬剤である。他の実施形態では、1つまたは複数の抗がん剤は、United States Food and Drug Administrationによって予備承認された(pre-approved)薬剤である。
当業者であれば、本開示の代替的な実施形態には、ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質として、IL12と、任意の他の薬剤、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、および/もしくは抗CTLA-4抗体、またはOX40Lとの組合せ療法が含まれることも認識するであろう。例えば、本開示は、(i)IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)と抗PD-1抗体もしくは抗PD-L1抗体を含むタンパク質、(iii)IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)と抗CTLA-4抗体を含む第2のタンパク質、または(iv)IL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)とOX40Lを含む第2のタンパク質の組合せ療法を包含する。他の実施形態では、IL12はまた、タンパク質として投与することもできる。
他の実施形態では、追加の薬剤は、IL12をコードするポリヌクレオチド、例えば、mRNAと一緒に製剤化されてもよく、または別個に製剤化されてもよい。さらに、別個に製剤化される場合であっても、追加の薬剤は、IL12をコードするポリヌクレオチドと同時または逐次的に投与することができる。一実施形態では、IL12をコードするポリヌクレオチドは、第2の薬剤の前に投与される。別の実施形態では、IL12をコードするポリヌクレオチドは、第2の薬剤の後に投与される。
ある特定の実施形態では、追加の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはOX40Lをコードするポリヌクレオチドもまた、腫瘍内投与される。他の実施形態では、第2の薬剤、例えば、本明細書に開示される任意の抗体またはOX40Lをコードするポリヌクレオチドは、異なる経路を介して、例えば、静脈内、皮下、腹腔内などで投与される。
一部の態様では、本方法または組成物の対象は、1つまたは複数の標準的な治癒療法による処置を受けている。別の態様では、本方法または組成物の対象は、1つまたは複数の標準的な治癒療法または抗がん療法に対して応答性ではなかった。一態様では、対象は、これまでに、IL12タンパク質またはIL12 DNA遺伝子療法により処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗PD-1アンタゴニストまたは抗CTLA-4アンタゴニストで処置される。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-1に結合するモノクローナル抗体で、および/または本開示のポリヌクレオチドの前に、CTLA-4に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗PD-1モノクローナル抗体および/または抗CTLA-4モノクローナル抗体療法で処置されている。
近年、治療目的での免疫チェックポイント阻害剤の導入は、がんの処置に革命を起こした。チェックポイント阻害剤と、他の共刺激または阻害性分子との組合せを特徴とする治療法に、関心が持たれている。
T細胞の制御、すなわち、活性化または阻害は、共刺激シグナルまたは共阻害性シグナルによって媒介される。この相互作用は、リガンド/受容体の相互作用を介して発生する。T細胞は、OX40などの活性化受容体およびプログラム死受容体1(PD-1)または細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)などの阻害性受容体(すなわち、免疫チェックポイント)の両方を無数に保有している(Mellmanら、2011年、Nature.、480巻、480~489頁)。この免疫チェックポイントの活性化は、T細胞の脱活性化をもたらし、腫瘍細胞によりこれらの経路が奪われることは、腫瘍細胞の免疫脱出の成功に寄与する。
一部の実施形態では、それを必要とする対象において、腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍の成長を阻害する方法は、対象に、1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、有効量の組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL-12ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12Bポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(「ORF」)を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12AポリペプチドをコードするORFを含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む。
一部の実施形態では、方法は、第2の薬剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第2の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、第2の薬剤は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該分野において公知または本明細書に記載される任意のチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体である。一部の実施形態では、第2の薬剤は、OX40LをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を含む。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、本明細書に開示の任意の他の薬剤、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む組成物は、1つより多くのチェックポイント阻害剤を含む。1つの特定の実施形態では、本方法は、(i)本明細書に開示されるIL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするmRNA、ならびに(ii)抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、OX40Lをコードするポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。
一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体の抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、抗体は、CTLA-4に特異的に結合する抗CTLA-4抗体もしくはその抗原結合断片であるPD-1に特異的に結合する抗PD-1抗体もしくはその抗原結合断片であるPD-L1に特異的に結合する抗PD-1抗体もしくはその抗原結合断片であるまたはそれらの組合せである。一実施形態では、抗体は、CTLA4に特異的に結合する抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、PD-1に特異的に結合する抗体は、抗PD-1抗体もしくはその抗原結合断片である。他の実施形態では、PD-L1に特異的に結合する抗体は、抗PD-1抗体もしくはその抗原結合断片である。
プログラム死受容体1/プログラム死リガンド1(PD-1/PDL-1)とPDL-2との間の相互作用を標的とするペンブロリズマブまたはニボルマブなどの免疫チェックポイント阻害剤は、近年、様々な悪性腫瘍の処置に関して承認されており、現在、黒色腫、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSCC)を含むがんに関して臨床試験で調査が行われている。これらの試験から得られるデータは、これらの患者集団において、好ましい安全性および毒性プロファイルを伴った、実質的な活性を示す。
例えば、チェックポイント阻害剤は、黒色腫の処置に関して、臨床試験で試験されている。特に、フェーズIIIの臨床試験では、それぞれ、CTLA-4およびPD-1免疫チェックポイントを標的とするイピリムマブおよびペンブロリズマブなどの治療法が、黒色腫を有する患者の3年生存率を、約70%に引き上げ、全生存率(5年を上回る)を約30%に引き上げたことが明らかとなっている。
同様に、チェックポイント阻害剤は、頭頸部がんの処置に関して、臨床試験で試験されている。前臨床研究では、HNSCC腫瘍の45~80%が、プログラム死リガンド1(PD-L1)を発現することが示されている(Zandbergら、(2014年)、Oral Oncol.、50巻、627~632頁)。現在のところ、HNSCCにおいて単剤療法としてまたは組合せレジメンで免疫チェックポイント阻害剤の有効性および安全性を評価する臨床試験が、数十存在している。例えば、PD 1、PD-L1、およびCTLA-4阻害剤による臨床試験が、HNSCCにおいて試験されている。PD-1抗体ペンブロリズマブが、転移性/再発性(R/M)HNSCC患者において有効であり得るというデータが、フェーズ1b、Keynote-012フェーズI/II試験で得られている(Cheng. ASCO、2015年、口頭発表)。より最近では、無作為化CheckMate-141フェーズIII臨床試験のデータが、提示された(Gillison. AACR、2016年、口頭発表)。この研究では、白金-不応性R/M HNSCC患者において2週間ごとに提供されるモノクローナルPD-1抗体ニボルマブの有効性が調査された。この研究は、この研究のニボルマブアームの優位性に起因して、早期に終了した。
一態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-1アンタゴニストで以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-1に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗PD-1モノクローナル抗体療法で処置されている。他の態様では、抗PD-1モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-L1に結合するモノクローナル抗体で処置されている。別の態様では、対象は、本方法または組成物のポリヌクレオチドの前に、抗PD-L1モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗PD-L1モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、MEDI473、BMS-936559、アテゾリズマブ(aezolizumab)、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の態様では、対象は、本開示の組成物での処置の前に、CTLA-4アンタゴニストで処置されている。別の態様では、対象は、本開示の組成物の前に、CTLA-4に結合するモノクローナル抗体で以前に処置されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、抗CTLA-4モノクローナル抗体で処置されている。他の態様では、抗CTLA-4抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および/またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、PD-L1アンタゴニスト、例えば、PD-L1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗PD-L1モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ(例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に)を含み、例えば、抗PD-L1モノクローナル抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、MEDI473、BMS-936559、アテゾリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
ある特定の実施形態では、本開示に有用な抗PD-L1抗体は、MSB0010718C(アベルマブとも称される;US2014/0341917を参照されたい)またはBMS-936559(以前の12A4またはMDX-1105)(例えば、米国特許第7,943,743号、WO2013/173223を参照されたい)である。他の実施形態では、抗PD-L1抗体は、アテゾリズマブ(TECENTRIQ(登録商標)としても公知である)である。他の実施形態では、抗PD-L1抗体は、MPDL3280A(アテゾリズマブ、TECENTRIQ(登録商標)、およびRG7446としても公知である)(例えば、Herbstら、(2013年)、J Clin Oncol 31(付録):3000.要約;米国特許第8,217,149号)、MEDI4736(デュルバルマブとも称される;Khleif(2013年)、Proceedings from the European Cancer Congress 2013、2013年9月27日~10月1日、Amsterdam、The Netherlandsである。
一部の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および/またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、PD-1アンタゴニスト、例えば、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗PD-1モノクローナル抗体と組み合わせて、投与するステップ(例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に)を含む、方法を対象とする。
一実施形態では、本開示に有用な抗PD-1抗体(またはその抗原結合性部分)は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ(「KEYTRUDA(登録商標)」、ランブロリズマブ、およびMK-3475としても公知である)は、ヒト細胞表面受容体PD-1(プログラム死-1またはプログラム細胞死-1)を対象とするヒト化モノクローナルIgG4抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第8,900,587号に記載されており、http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789(最終アクセス:2014年12月14日)も参照されたい。ペンブロリズマブは、再発性または不応性黒色腫および進行性NSCLCの処置に関して、FDAによって承認されている。
別の実施形態では、本開示に有用な抗PD-1抗体は、ニボルマブである。ニボルマブ(「OPDIVO(登録商標)」としても公知であり、以前は5C4、BMS-936558、MDX-1106、またはONO-4538と表記されていた)は、PD-1リガンド(PD-L1およびPD-L2)との相互作用を選択的に予防し、それによって抗腫瘍T細胞機能の下方制御を遮断する、完全ヒトIgG4(S228P)PD-1免疫チェックポイント阻害剤抗体である(米国特許第8,008,449号、Wangら、2014年、Cancer Immunol Res.、2巻(9号)、846~56頁)。ニボルマブは、腎細胞癌(腎臓腺癌、または副腎腫)、黒色腫、および非小細胞肺がん(NSCLC)を含む様々な進行性固形腫瘍において、活性を示している(Topalianら、2012a;Topalianら、2014年;Drakeら、2013年;WO2013/173223。
他の実施形態では、抗PD-1抗体は、MEDI0680(以前のAMP-514)であり、これは、PD-1受容体に対するモノクローナル抗体である。MEDI0680は、例えば、米国特許第8,609,089号B2またはhttp://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047(最終アクセス、2014年12月14日)に記載されている。
ある特定の実施形態では、抗PD-1抗体は、BGB-A317であり、これは、ヒト化モノクローナル抗体である。BGB-A317は、米国公開第2015/0079109号に記載されている。
ある特定の実施形態では、PD-1アンタゴニストは、AMP-224であり、これは、B7-DC Fc融合タンパク質である。AMP-224は、米国公開第2013/0017199号またはhttp://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=700595(最終アクセス2015年7月8日)において考察されている。
他の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および/またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗PD-1モノクローナル抗体と一緒に投与するステップ(例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に)を含み、例えば、抗PD-1モノクローナル抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を含む。
他の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法および/またはその対象における免疫療法の方法であって、対象に、IL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、CTLA-4アンタゴニスト、例えば、CTLA-4に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分、例えば、抗CTLA-4モノクローナル抗体と組み合わせて投与するステップ(例えば、腫瘍内、腹腔内、または静脈内に)を含み、例えば、抗CTLA-4モノクローナル抗体は、イピリムマブもしくはトレメリムマブ、またはこれらの任意の組合せを含む、方法を対象とする。
例示的な臨床抗CTLA-4抗体は、米国特許第6,984,720号に開示されているヒトmAb 10D1(現在では、イピリムマブとして公知であり、YERVOY(登録商標)として販売されている)である。本方法に有用な別の抗CTLA-4抗体は、トレメリムマブ(CP-675,206としても公知である)である。トレメリムマブは、ヒトIgG2モノクローナル抗CTLA-4抗体である。トレメリムマブは、WO2012/122444、米国公開第2012/263677号、または国際公開第2007/113648号A2に記載されている。
一実施形態では、IL12をコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)およびOX40Lポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)は、組み合わせて投与される。別の実施形態では、IL12をコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)およびOX40Lポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)は、CTLA-4に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、PD-1受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはPD-L1受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分と組み合わせて、投与される。
一実施形態では、IL12ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)およびOX40Lポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)は、PD-1もしくはPD-L1受容体に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分、またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
別の実施形態では、IL12ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)およびOX40Lポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)は、CTLA-4に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性部分またはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与される。
さらに別の実施形態では、IL12ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)およびOX40Lポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)は、PD-1またはPD-L1受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分およびCTLA-4に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分(またはそれらのポリヌクレオチド)と組み合わせて、投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、(i)IL12をコードする第1のポリヌクレオチド(例えば、第1のmRNA)、および(ii)CTLA-4に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分をコードする第2のポリヌクレオチド(例えば、第2のmRNA)を、単一の製剤に含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、IL12をコードするポリヌクレオチドおよびOX40Lタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、単一の製剤に含む。
ヒトOX40Lは、Tanakaらによって、ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I)に感染したヒトリンパ球の表面上において、初めて特定された(Tanakaら、International Journal of Cancer(1985年)、36巻(5号)、549~55頁)。OX40Lは、OX40(CD134)のリガンドである。OX40Lは、CD252(分化クラスター252)、腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー4、tax転写により活性化される糖タンパク質1、TXGP1、またはgp34とも表記されていた。ヒトOX40Lは、183アミノ酸長であり、アミノ酸1~23の細胞質ドメイン、アミノ酸24~50の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸51~183の細胞外ドメインという3つのドメインを含有する。
一部の実施形態では、IL12をコードするポリヌクレオチドと組み合わせられ得るOX40Lをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物のOX40LポリペプチドをコードするmRNAを含む。一部の実施形態では、哺乳動物のOX40Lポリペプチドは、マウスOX40Lポリペプチドである。一部の実施形態では、哺乳動物のOX40Lポリペプチドは、ヒトOX40Lポリペプチドである。一部の実施形態では、OX40Lポリペプチドは、表1に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の各ポリヌクレオチドは、mRNA、すなわち、IL12ポリペプチドをコードするmRNAおよびOX40LポリペプチドをコードするmRNAを含む。一部の実施形態では、IL12ポリペプチドをコードするmRNAは、哺乳動物のIL12ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、OX40LポリペプチドをコードするmRNAは、哺乳動物のOX40Lポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、IL12ポリペプチドをコードするmRNAは、マウスIL12ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、OX40LポリペプチドをコードするmRNAは、マウスOX40Lポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、IL12ポリペプチドをコードするmRNAは、ヒトIL12ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、OX40LポリペプチドをコードするmRNAは、ヒトOX40Lポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、IL12ポリペプチドは、表4に示されるヒトアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、OX40Lポリペプチドは、表1に示されるヒトアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、OX40Lポリペプチドは、表1に列挙されるアミノ酸配列または表1に列挙されるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%同一であるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列はOX40受容体に結合することができる。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるOX40Lポリペプチドは、1つまたは複数の保存的置換を有する、表1に列挙されるアミノ酸配列を含み、ここで、この保存的置換は、OX40Lポリペプチドのその受容体への結合活性に有意に影響を及ぼさない、すなわち、OX40Lポリペプチドは、置換後にOX40受容体に結合する。
他の実施形態では、OX40Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(すなわち、mRNA)は、表1に列挙される核酸配列に少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%同一である配列を含む。当業者であれば、配列が、本出願において、DNAの形態(チミジンを含有する)で記述されている場合、対応するRNA配列は、チミジンの代わりにウリジンを含有することを理解する。
一部の実施形態では、本方法および組成物に有用なポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの細胞外ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの膜貫通ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの細胞外ドメインおよびOX40Lの膜貫通をコードするオープンリーディングフレームを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの細胞外ドメインおよびOX40Lの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)は、OX40Lの細胞外ドメイン、OX40Lの膜貫通、およびOX40Lの細胞質ドメインをコードするオープンリーディングフレームを含む。
表1は、例えば、OX40Lの前駆体および成熟配列、ならびにOX40L配列を含む構築物を提示する。さらに、OX40Lをコードするポリヌクレオチドを含み、3’UTRおよび5’UTRなどの構成要素をさらに含む、構築物は、OX40Lをコードするポリヌクレオチドと考えられるであろう。当業者であれば、表1に開示される天然のシグナル配列およびプロペプチド配列(前駆体では存在しており、対応する成熟形態では不在である、配列)ならびに表1に開示される非天然のシグナルペプチドに加えて、その他のシグナル配列が使用され得ることを理解するであろう。したがって、表1によるOX40Lポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの言及は、当技術分野において公知の代替的なシグナルペプチド(またはコーディング配列)がOX40Lポリペプチド(またはポリヌクレオチド)に結合されているバリアントを包含する。本出願全体を通じて、表1に開示される配列への言及は、本出願が出願された時点で当技術分野において公知のそれらの配列のオルソログおよび機能的バリアント(例えば、多形体バリアント)ならびにアイソフォームにも同等に適用可能であり、それらを包含することも、理解されたい。
3.インターロイキン-12(IL12)
3.インターロイキン-12(IL12)
IL12(IL-12とも示される)は、多面的サイトカインであり、その作用により、自然免疫と獲得免疫との間の相互接続が形成される。IL12は、主として、p35およびp40というジスルフィド結合された2つのサブユニットからなる、70kDaのヘテロダイマータンパク質として機能する。IL12 p40サブユニット(NM_002187;P29460;IL12B、ナチュラルキラー細胞刺激因子2、細胞傷害性リンパ球成熟因子2とも称される)の前駆体形態は、328アミノ酸長であるが、その成熟形態は、306アミノ酸長である。IL12 p35サブユニット(NM_000882;P29459;IL12A、ナチュラルキラー細胞刺激因子1、細胞傷害性リンパ球成熟因子1とも称される)の前駆体形態は、219アミノ酸長であり、成熟形態は、197アミノ酸長である。(同書)。IL12 p35およびp40サブユニットの遺伝子は、異なる染色体に存在し、互いに独立して制御されている。Gately, MKら、Annu Rev Immunol.、16巻:495~521頁(1998年)。多数の異なる免疫細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、およびB細胞)は、抗原刺激時にIL12を産生する。活性なIL12ヘテロダイマーは、タンパク質合成後に形成される。(同書)。
IL12は、4つのアルファヘリックスのバンドルから構成される。これは、2つの別個の遺伝子であるIL12A(p35)およびIL12B(p40)によってコードされるヘテロダイマーサイトカインである。活性なヘテロダイマー(「p70」と称される)およびp40のホモダイマーが、タンパク質合成後に形成される。
したがって、一部の実施形態では、本開示のIL12ポリペプチドは、直接またはリンカーによって融合されたIL12BおよびIL12Aを含む、単一のポリペプチド鎖を含む。他の実施形態では、本開示のIL12ポリペプチドは、IL12Bを含む第1のポリペプチドおよびIL12Aを含む第2のポリペプチドという2つのポリペプチドを含む。ある特定の態様では、本開示は、IL12AポリペプチドおよびIL12Bポリペプチドを提供し、IL12AおよびIL12Bポリペプチドは、同じ鎖にあるか、または異なる鎖にある。一部の実施形態では、本開示のIL12AまたはIL12Bポリペプチドは、野生型IL12AまたはIL12B配列に対する置換、ならびに挿入および/または付加、欠失および/または共有結合修飾を含有する、バリアント、ペプチド、またはポリペプチドである。一部の実施形態では、配列タグ(エピトープタグ、例えば、V5タグなど)またはアミノ酸が、例えば、局在化のために、本開示のポリヌクレオチドによってコードされる配列に(例えば、N末端またはC末端に)付加されてもよい。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を、任意選択で、欠失させて、断片を得てもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)によってコードされるIL12Aおよび/またはIL12Bポリペプチドは、IL12Aおよび/またはIL12B配列の置換バリアントを含み、このバリアントは、1つ、2つ、3つ、またはそれより多くの置換を含み得る。一部の実施形態では、置換バリアントは、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
他の実施形態では、IL12Aおよび/またはIL12Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12AおよびIL12Bポリペプチドを融合するリンカーを含む。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
本開示の一部の態様は、ヒトIL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を含む脂質ナノ粒子であって、ポリヌクレオチドが、ヒトIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたヒトIL12BポリペプチドをコードするORFを含む、脂質ナノ粒子を対象とする。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、IL12Aポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドは、IL12Aポリペプチドまたはペプチドリンカーの5’末端に位置する。他の実施形態では、IL12Aポリペプチドは、IL12Bポリペプチドまたはペプチドリンカーの5’末端に位置する。
当業者には理解されるように、IL12タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、および相同タンパク質(オルソログ)もまた、本開示のIL12ポリペプチドの範囲内にあると考えられる。本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例は、図1~2に示されている。例えば、表2は、配列番号における相関するアミノ酸の番号付け、配列番号におけるヌクレオチド番号付け、ならびに5’UTR、IL12Bシグナルペプチド、成熟IL12AおよびIL12Bペプチド、ならびにリンカーを示す。
4.ポリヌクレオチドおよびオープンリーディングフレーム(ORF)
4.ポリヌクレオチドおよびオープンリーディングフレーム(ORF)
ある特定の態様では、本開示は、1つまたは複数のIL12ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF、例えば、mRNA)を含む、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を提供する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、IL-12ポリペプチドをコードし、ここで、ポリヌクレオチドは、IL12BポリペプチドおよびIL12Aポリペプチドをコードする単一のORFを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、直接またはリンカーによって融合されたIL12BポリペプチドおよびIL12Aポリペプチドを含む単一のIL12ポリペプチド鎖をコードし、ここで、IL12Bポリペプチドは、
(i)全長IL12Bポリペプチド(例えば、野生型IL12Bと同じかまたは本質的に同じ長さを有する)、
(ii)全長IL12Bポリペプチドの機能的断片(例えば、IL12B野生型よりも短いが、IL12B酵素活性を依然として保持している、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型IL12Bタンパク質、例えば、野生型IL12Bポリペプチドに対してポリペプチドのIL12B活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、V33I、V298F、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント))、ならびに
(iv)(i)全長IL12B野生型、その機能的断片、またはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに/または
IL12Aポリペプチドは、
(v)全長IL12Aポリペプチド(例えば、野生型IL12Aと同じかまたは本質的に同じ長さを有する)、
(vi)全長IL12Aポリペプチドの機能的断片(例えば、IL12A野生型よりも短いが、IL12A酵素活性を依然として保持している、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(vii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型IL12Aタンパク質、例えば、wtIL12Aポリペプチドに対してポリペプチドのIL12A活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント))、ならびに
(viii)(i)全長IL12A野生型、その機能的断片、またはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
(i)全長IL12Bポリペプチド(例えば、野生型IL12Bと同じかまたは本質的に同じ長さを有する)、
(ii)全長IL12Bポリペプチドの機能的断片(例えば、IL12B野生型よりも短いが、IL12B酵素活性を依然として保持している、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型IL12Bタンパク質、例えば、野生型IL12Bポリペプチドに対してポリペプチドのIL12B活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、V33I、V298F、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント))、ならびに
(iv)(i)全長IL12B野生型、その機能的断片、またはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに/または
IL12Aポリペプチドは、
(v)全長IL12Aポリペプチド(例えば、野生型IL12Aと同じかまたは本質的に同じ長さを有する)、
(vi)全長IL12Aポリペプチドの機能的断片(例えば、IL12A野生型よりも短いが、IL12A酵素活性を依然として保持している、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(vii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長または短縮型IL12Aタンパク質、例えば、wtIL12Aポリペプチドに対してポリペプチドのIL12A活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント))、ならびに
(viii)(i)全長IL12A野生型、その機能的断片、またはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bポリペプチドを含む第1の鎖およびIL12Aポリペプチドを含む第2の鎖という2つのポリペプチド鎖をコードし、ここで、IL12Bポリペプチドは、
(i)シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟IL12Bポリペプチド(例えば、野生型IL12Bと同じかまたは実質的に同じ長さを有する)、
(ii)成熟IL12Bポリペプチドのいずれかの機能的断片(例えば、IL12B野生型よりも短いが、依然としてIL12B酵素活性を保持する、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている、全長、成熟、または短縮型IL12Bタンパク質、例えば、野生型IL12Bポリペプチドに対して、ポリペプチドのIL12B活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、V33I、V298F、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント))、ならびに
(iv)(i)シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟IL12B野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに/または
IL12Aは、
(v)シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟IL12Aポリペプチド(例えば、野生型IL12Aと同じかまたは実質的に同じ長さを有する)、
(vi)野生型IL12Aポリペプチドのいずれかの機能的断片(例えば、IL12A野生型よりも短いが、依然としてIL12A酵素活性を保持する、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(vii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長、成熟、または短縮型IL12Aタンパク質、例えば、参照アイソフォームに対して、ポリペプチドのIL12A活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント))、ならびに
(viii)(i)シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟IL12A野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
(i)シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟IL12Bポリペプチド(例えば、野生型IL12Bと同じかまたは実質的に同じ長さを有する)、
(ii)成熟IL12Bポリペプチドのいずれかの機能的断片(例えば、IL12B野生型よりも短いが、依然としてIL12B酵素活性を保持する、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている、全長、成熟、または短縮型IL12Bタンパク質、例えば、野生型IL12Bポリペプチドに対して、ポリペプチドのIL12B活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、V33I、V298F、または当技術分野において公知の任意の他の天然もしくは人工バリアント))、ならびに
(iv)(i)シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟IL12B野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される、ならびに/または
IL12Aは、
(v)シグナルペプチドを有するかまたは有さない成熟IL12Aポリペプチド(例えば、野生型IL12Aと同じかまたは実質的に同じ長さを有する)、
(vi)野生型IL12Aポリペプチドのいずれかの機能的断片(例えば、IL12A野生型よりも短いが、依然としてIL12A酵素活性を保持する、短縮型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列)、
(vii)そのバリアント(例えば、1つまたは複数のアミノ酸が置き換えられている全長、成熟、または短縮型IL12Aタンパク質、例えば、参照アイソフォームに対して、ポリペプチドのIL12A活性のすべてまたはほとんどを保持するバリアント(例えば、当技術分野において公知の天然または人工バリアント))、ならびに
(viii)(i)シグナルペプチドを有するかもしくは有さない、成熟IL12A野生型、その機能的断片、もしくはバリアント、および(ii)異種タンパク質を含む、融合タンパク質からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、哺乳動物のIL12ポリペプチド、例えば、ヒトIL12ポリペプチド、機能的断片またはそのバリアントをコードする。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてIL12Bおよび/またはIL12Aタンパク質発現レベルおよび/または検出可能なIL12酵素活性レベルを、本開示のポリヌクレオチドの投与前の細胞におけるIL12Bおよび/またはIL12Aタンパク質発現レベルおよび/または検出可能なIL12酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%だけ増大させる。IL12Bおよび/もしくはIL12Aタンパク質の発現レベルならびに/またはIL12酵素活性は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、in
vitroで細胞に導入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、in vivoで細胞に導入される。
vitroで細胞に導入される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、in vivoで細胞に導入される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、野生型ヒトIL12Bおよび/またはIL12A(図1を参照)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、コドン最適化核酸配列を含み、コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム(ORF)は野生型IL12Aおよび/またはIL12B配列に由来する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、ヒトIL12Bおよび/またはIL12Aの全長配列(すなわち、開始メチオニンおよびシグナルペプチドを含む)を有するIL12Bおよび/またはIL12Aをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟ヒトIL12Bおよび/またはIL12Aでは、開始メチオニンおよび/またはシグナルペプチドを、除去して、それぞれ、配列番号1および配列番号3のアミノ酸残基を含む「成熟IL12B」および/または「成熟IL12A」を得ることができる。それぞれ、配列番号1は、配列番号48のアミノ酸23~328に対応し、配列番号3は、配列番号48のアミノ酸336~532に対応する。ヒトIL12Bおよび/またはIL12Aの全配列を対象とする本開示の教示は、開始メチオニンおよび/またはシグナルペプチドを欠くヒトIL12Bおよび/またはIL12Aの成熟形態にも適用可能である。したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、ヒトIL12Bおよび/またはIL12Aの成熟配列を有するIL12Bおよび/またはIL12Aをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12Aをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、変異体IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12A配列において少なくとも1の点変異、少なくとも2の点変異、少なくとも3変異、少なくとも4変異、少なくとも5変異、少なくとも6変異、少なくとも7変異、少なくとも8変異、少なくとも9変異、または少なくとも10変異を含み、IL12Bおよび/またはIL12A酵素活性を保持するIL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするORFを含む。一部の実施形態では、変異体IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドは、対応する野生型IL12Bおよび/またはIL12A(すなわち、1または複数の変異がない以外は同じ)のIL12Bおよび/またはIL12A活性の少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%であるIL12Bおよび/またはIL12A活性を有する。一部の実施形態では、変異体IL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするORFを含む本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bおよび/またはIL12A酵素活性を変化させない変異を有するIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。そのような変異体IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドは、機能的に中立と称され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の機能的に中立な点変異を含む変異体IL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするORFを含む。
一部の実施形態では、変異体IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドは、対応する野生型IL12Bおよび/またはIL12Aより高いIL12Bおよび/またはIL12A酵素活性を有する。一部の実施形態では、変異体IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドは、対応する野生型IL12Bおよび/またはIL12A(すなわち、1または複数の変異がない以外は同じIL12Bおよび/またはIL12A)の活性より少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%高いIL12Bおよび/またはIL12A活性を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、機能的IL12Bおよび/またはIL12A断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、例えば、1つもしくは複数の断片は、野生型IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、IL12Bおよび/またはIL12A酵素活性を保持する。一部の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12A断片は、対応する全長IL12Bおよび/またはIL12AのIL12活性の少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも100%であるIL12Bおよび/またはIL12A活性を有する。一部の実施形態では、機能的IL12Bおよび/またはIL12A断片をコードするORFを含む本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化されている。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、対応する全長IL12Bおよび/またはIL12Aよりも高いIL12Bおよび/またはIL12A酵素活性を有するIL12Bおよび/またはIL12A断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。したがって、一部の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12A断片は、対応する全長IL12Bおよび/またはIL12AのIL12Bおよび/またはIL12A活性より少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%高いIL12Bおよび/またはIL12A活性を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、野生型IL12Bおよび/またはIL12Aより少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%または25%短いIL12Bおよび/またはIL12A断片をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、これは、
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチドヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する100%の配列同一性
を有する。
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチドヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する100%の配列同一性
を有する。
他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、これは、
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1589に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%の配列同一性
を有する。
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1589に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%の配列同一性
を有する。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12BおよびIL12Aをコードする単一のORFを含み、ORFは、
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する約100%の配列同一性;
を有する配列、ならびに
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1599に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%の配列同一性
を有する配列を含む。
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する約100%の配列同一性;
を有する配列、ならびに
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1599に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%の配列同一性
を有する配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bをコードする第1のORFおよびIL12Aをコードする第2のORFを含み、第1のORFは、
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する約100%の配列同一性
を有する配列を含み、かつ/または
第2のORFは、
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1599に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%配列の配列同一性
を有する配列を含む。
(i) hIL12AB_007、hIL12AB_010、またはhIL12AB_012のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_018またはhIL12AB_019のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_008のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_005、hIL12AB_013、またはhIL12AB_017のヌクレオチド67~984あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド70~987に対する少なくとも約87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_001またはhIL12AB_009のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_022またはhIL12AB_038のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(viii) hIL12AB_024、hIL12AB_031、hIL12AB_032、またはhIL12AB_036のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_021、hIL12AB_023、hIL12AB_025、hIL12AB_026、hIL12AB_027、hIL12AB_029、hIL12AB_030、hIL12AB_034、hIL12AB_039、またはhIL12AB_040のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_016、hIL12AB_035、またはhIL12AB_037のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_011、hIL12AB_028、またはhIL12AB_033のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_015のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020のヌクレオチド67~984に対する少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xiv) hIL12AB_006のヌクレオチド67~984に対する約100%の配列同一性
を有する配列を含み、かつ/または
第2のORFは、
(i) hIL12AB_010のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ii) hIL12AB_019のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iii) hIL12AB_013のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(iv) hIL12AB_007またはhIL12AB_014のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(v) hIL12AB_002、hIL12AB_008のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vi) hIL12AB_012またはhIL12AB_005のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(vii) hIL12AB_001、またはhIL12AB_009のヌクレオチド1006~1596あるいはhIL12AB_004のヌクレオチド1009~1599に対する少なくとも約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;(viii) hIL12AB_17のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(ix) hIL12AB_029またはhIL12AB_027のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(x) hIL12AB_039またはhIL12AB_040のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xi) hIL12AB_036、hIL12AB_034、hIL12AB_016、hIL12AB_023、hIL12AB_030、hIL12AB_031、hIL12AB_025、またはhIL12AB_035のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xii) hIL12AB_021、hIL12AB_024、hIL12AB_032、hIL12AB_033、hIL12AB_037、またはhIL12AB_022のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiii) hIL12AB_020、hIL12AB_026、またはhIL12AB_038のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;
(xiv) hIL12AB_015、hIL12AB_011、またはhIL12AB_028のヌクレオチド1006~1596に対する少なくとも約94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性;または
(xv) hIL12AB_003のヌクレオチド1006~1596に対する約100%配列の配列同一性
を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、hIL12AB_002(配列番号6)またはhIL12AB_002(配列番号6)として示される配列に少なくとも約60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%配列同一であるヌクレオチド配列を含むORFを含む。
一実施形態では、IL12Bポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列(例えば、第1のORF)およびIL12Aポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列(例えば、第2のORF)は、直接的に、またはリンカーによって融合されている。他の実施形態では、IL12Bポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列(例えば、第1のORF)およびIL12Aポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列(例えば、第2のORF)は、互いに融合されていない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12B-IL12A融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号5~44からなる群から選択される配列に少なくとも約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有する。表4を参照のこと。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12B-IL12A融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号5~44からなる群から選択される配列に70%~100%、75%~100%、80%~100%、85%~100%、70%~95%、80%~95%、70%~85%、75%~90%、80%~95%、70%~75%、75%~80%、80%~85%、85%~90%、90%~95%、もしくは95%~100%の配列同一性を有する。表4を参照のこと。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、約900~約100,000ヌクレオチド(例えば、900~1,000、900~1,100、900~1,200、900~1,300、900~1,400、900~1,500、1,000~1,100、1,000~1,100、1,000~1,200、1,000~1,300、1,000~1,400、1,000~1,500、1,083~1,200、1,083~1,400、1,083~1,600、1,083~1,800、1,083~2,000、1,083~3,000、1,083~5,000、1,083~7,000、1,083~10,000、1,083~25,000、1,083~50,000、1,083~70,000、または1,083~100,000)を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12B-IL12A融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ヌクレオチド配列(例えば、ORF)の長さは、少なくとも500ヌクレオチド長(例えば、少なくとも、もしくは約500、600、700、80、900、1,000、1,050、1,083、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,600、3,700、3,800、3,900、4,000、4,100、4,200、4,300、4,400、4,500、4,600、4,700、4,800、4,900、5,000、5,100、5,200、5,300、5,400、5,500、5,600、5,700、5,800、5,900、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000より大きい、または100,000を含め、これまでのヌクレオチド)である。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、ノンコーディングである少なくとも1つの核酸配列、例えば、miRNA結合部位をさらに含むIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bおよび/または、一本鎖または二本鎖であるIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む本開示のポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、RNAである。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA(mRNA)であるか、またはこれとして機能する。一部の実施形態では、mRNAは、少なくとも1つのIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードし、翻訳されて、コードされたIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドを、in vitro、in vivo、in situ、またはex vivoで産生することができる、ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド(例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント)をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のうちのいずれか、または化合物1~232のうちのいずれかとともに、製剤化される。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)はまた、コードされるポリペプチドの、治療上関連する部位への輸送を促進する、追加の特徴をコードするヌクレオチド配列を含む。タンパク質輸送を補助する1つのそのような特徴は、シグナル配列または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、およびシグナルペプチドを含め、様々な名称で公知である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、本明細書に記載されるIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードする、ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
一部の実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、約9~200ヌクレオチド長(3~70アミノ酸)であり、任意選択で、それぞれ、コーディング領域またはポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加により、1つまたは複数の標的化経路を通じた、コードされるポリペプチドの所望される部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアへの輸送がもたらされる。一部のシグナルペプチドは、タンパク質が所望される部位に輸送された後に、例えば、シグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする5’核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ヌクレオチド配列は、天然のシグナルペプチドをコードする核酸配列を欠く。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする5’核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第1のORFの5’末端に位置するシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、第1のORFは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトIL12Bシグナルペプチドである。
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号48のアミノ酸1~22に少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一である配列を含む。
提供されるRNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するDNA配列(例えば、ウラシルからチミンへの変換)を理解するであろう。同様に、提供されるDNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するRNA配列(例えば、チミンからウラシルへの変換)を理解するであろう。
5.キメラタンパク質
5.キメラタンパク質
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、1つまたは複数の目的のポリペプチドをコードする1つより多くの核酸配列(例えば、1つより多くのORF)を含み得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする単一のORFを含む。しかしながら、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、1つより多くのヌクレオチド配列、例えば、IL12Bポリペプチド(第1の目的のポリペプチド)、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第1のヌクレオチド配列、IL12Aポリペプチド(第2の目的のポリペプチド)、その機能的断片、もしくはバリアントをコードする第2のヌクレオチド配列、および第3の目的のポリペプチド(例えば、IL12に対して異種のポリペプチド)を発現する第3のヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態では、第3の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、IL12Bポリペプチドに融合され得る。別の実施形態では、第3の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、IL12Aポリペプチドに融合され得る。他の実施形態では、第3の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、IL12BポリペプチドおよびIL12Aポリペプチドの両方に融合され得る。さらなる実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、3つより多くのヌクレオチド配列、例えば、IL12Bポリペプチド(第1の目的のポリペプチド)、その機能的断片、またはバリアントをコードする第1のヌクレオチド配列、IL12Aポリペプチド(第2の目的のポリペプチド)、その機能的断片、またはバリアントをコードする第2のヌクレオチド配列、第3の目的のポリペプチドを発現する第3のヌクレオチド配列、および第4の目的のポリペプチドを発現する第4のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態では、第3の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、IL12Aポリペプチドに融合され、第4の目的のポリペプチドは、直接またはリンカーによって、IL12Bポリペプチドに融合される。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドは、遺伝子融合され得る、すなわち、2つまたはそれよりも多いポリペプチドは、同じヌクレオチド配列によってコードされ得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多い目的のポリペプチドの間に、リンカー(例えば、G4Sペプチドリンカーまたは当技術分野において公知の別のリンカー)をコードする核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、それぞれが目的のポリペプチドを発現する、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多いヌクレオチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードする第1の核酸配列(例えば、第1のORF)、ならびに第2の目的のポリペプチドをコードする第2の核酸配列(例えば、第2のORF)を含み得る。
6.リンカー
6.リンカー
一態様では、IL12Bおよび/またはIL12Aは、直接またはリンカーによって、融合され得る。他の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12Aは、直接またはリンカーによって、異種ポリペプチドに融合され得る。IL12BをIL12Aに、またはIL12Bおよび/もしくはIL12Aを異種ポリペプチドに、融合するのに好適なリンカーは、ポリペプチド(もしくはペプチド)部分または非ポリペプチド部分であり得る。
本開示の一部の態様は、ヒトIL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、ヒトIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたヒトIL12BポリペプチドをコードするORFを含む。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドは、ペプチドリンカーによってIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドは、IL12Aポリペプチドまたはペプチドリンカーの5’末端に位置する。他の実施形態では、IL12Aポリペプチドは、IL12Bポリペプチドまたはペプチドリンカーの5’末端に位置する。
一部の実施形態では、リンカーは、1アミノ酸~約200アミノ酸を含むペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、または少なくとも40アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、リンカーはGS(Gly/Ser)リンカーであり得、例えば、(GnS)mを含み、ここで、nは1~20の整数であり、mは1~20の整数である。一部の実施形態では、Gly/Serリンカーは、(GnS)m(配列番号203)を含み、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20であり、mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20である。一部の実施形態では、GSリンカーは、(GGGGS)o(配列番号204)を含み得、ここで、oは、1~5の整数である。一部の実施形態では、GSリンカーは、GGSGGGGSGG(配列番号205)、GGSGGGGG(配列番号206)、またはGSGSGSGS(配列番号207)を含み得る。ある特定の実施形態では、Gly/Serリンカーは、(GnS)mを含み、ここで、nは6であり、mは1である。
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーはGly豊富なリンカーであり得、例えば、(Gly)p(配列番号208)を含み、ここで、pは、1~40の整数である。一部の実施形態では、Gly豊富なリンカーは、GGGGG、GGGGGG、GGGGGGGまたはGGGGGGGGを含み得る。
一部の実施形態では、本開示に好適なリンカーは、(EAAAK)q(配列番号209)を含み得、ここで、qは、1~5の整数である。一実施形態では、本開示に好適なリンカーは、(EAAAK)3を含み得る。
さらなる例示的なリンカーとして、これらに限定されないが、GGGGSLVPRGSGGGGS(配列番号210)、GSGSGS(配列番号211)、GGGGSLVPRGSGGGG(配列番号212)、GGSGGHMGSGG(配列番号213)、GGSGGSGGSGG(配列番号214)、GGSGG(配列番号215)、GSGSGSGS(配列番号216)、GGGSEGGGSEGGGSEGGG(配列番号217)、AAGAATAA(配列番号218)、GGSSG(配列番号219)、GSGGGTGGGSG(配列番号220)、GSGSGSGSGGSG(配列番号221)、GSGGSGSGGSGGSG(配列番号222)、およびGSGGSGGSGGSGGS(配列番号223)が挙げられる。
リンカーをコードするヌクレオチドは、本開示のヌクレオチド配列を融合するように構築され得る。提供されるRNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するDNA配列(例えば、ウラシルからチミンへの変換)を理解するであろう。同様に、提供されるDNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するRNA配列(例えば、チミンからウラシルへの変換)を理解するであろう。
7.IL12ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
7.IL12ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化される。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bおよび/もしくはIL12Aポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’-UTR、3’-UTR、miRNA、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはこれらの任意の組合せを含む。
IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、コドン最適化されたmRNA配列は、参照配列(例えば、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列)に対して、少なくとも1つの同義核酸塩基置換を含む、配列である。
配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照配列とは、配列が部分的または完全に異なり得る。例えば、TCTコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、AGCコドンによって一様にコードされるであろうポリセリンをコードする配列が得られるように、その核酸塩基の100%が置換される(それぞれのコドンに関して、1位のTがAによって置き換えられ、2位のCがGによって置き換えられ、3位のTがCによって置き換えられる)ことによって、配列最適化され得る。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化されたポリセリン核酸配列との間のグローバルペアワイズアライメントから得られる配列同一性の百分率は、0%であろう。しかしながら、両方の配列から得られるタンパク質産物は、100%同一である。
一部の配列最適化(コドン最適化と称されることもある)方法は、当技術分野において公知であり(以下により詳細に考察され)、1つまたは複数の所望される結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果としては、例えば、適正なフォールディングを確保するために、ある特定の組織標的および/もしくは宿主生物におけるコドン頻度を一致させること;mRNAの安定性を増大させるかもしくは二次構造を低減するようにG/C含量をバイアスすること;遺伝子の構築もしくは発現を損傷し得るタンデム反復コドンもしくは塩基の回数を最小限に抑えること;転写および翻訳調節領域をカスタマイズすること;タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること;コードされるタンパク質に翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加すること;タンパク質ドメインを付加、除去、もしくはその順序を入れ替えること;制限部位を挿入もしくは欠失すること;リボソーム結合部位およびmRNA分解部位を修飾すること;タンパク質の様々なドメインが適正にフォールディングするのを可能にするように、翻訳速度を調整すること;ならびに/またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除することを挙げることができる。配列最適化のツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において公知であり、非限定的な例としては、GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)によるサービス、および/または専売的方法が挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含み、ここで、配列最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントは、改善された特性(例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされるIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントと比較して)、例えば、in vivo投与した後の発現有効性に関連する改善された特性を有する。そのような特性としては、核酸の安定性(例えば、mRNA安定性)の改善、標的組織における翻訳有効性の増大、発現される短縮型タンパク質の数の低減、発現されるタンパク質のフォールディングの改善またはミスフォールディングの予防、発現される産物の毒性の低減、発現される産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増大および/または減少が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化されており、当技術分野における1つまたは複数の問題を回避する構造的および/または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持しながら核酸に基づく治療薬の製剤化および送達を最適化すること、発現の閾値を克服すること、発現率を改善すること、半減期および/またはタンパク質濃度、タンパク質局在化を最適化すること、ならびに免疫応答などの有害な生体応答および/または分解経路を回避することに有用な特徴を有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、追加の目的のポリペプチド、5’-UTR、3’-UTR、マイクロRNAをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、リンカーをコードする核酸配列、またはこれらの任意の組合せ)を含み、このヌクレオチド配列は、
(i)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、ウリジン修飾配列を生成するために、ウリジン含量を増大もしくは減少させるように、代替的なコドンで置換すること、
(ii)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、同義コドンセットにおいてより高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換すること、
(iii)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、G/C含量を増大させるように代替的なコドンで置換すること、または
(iv)これらの組合せ
を含む方法によって、配列最適化されている。
(i)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、ウリジン修飾配列を生成するために、ウリジン含量を増大もしくは減少させるように、代替的なコドンで置換すること、
(ii)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、同義コドンセットにおいてより高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換すること、
(iii)参照ヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/もしくはIL12AポリペプチドをコードするORF)における少なくとも1のコドンを、G/C含量を増大させるように代替的なコドンで置換すること、または
(iv)これらの組合せ
を含む方法によって、配列最適化されている。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/またはIL12AポリペプチドをコードするORF)は、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも1つの改善された特性を有する。
一部の実施形態では、配列最適化方法は、多重パラメーターのものであり、本明細書に開示される1つ、2つ、3つ、4つ、もしくはそれよりも多くの方法ならびに/または当技術分野において公知の他の最適化方法を含む。
本開示の一部の実施形態において有益であると考えることができる特徴は、ポリヌクレオチドによってまたはその領域内にコードされ得、そのような領域は、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードする領域の上流(5’)、下流(3’)、またはその中にあり得る。これらの領域は、タンパク質コーディング領域またはオープンリーディングフレーム(ORF)の配列最適化の前および/または後に、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。そのような特徴の例としては、非翻訳領域(UTR)、マイクロRNA配列、コザック配列、オリゴ(dT)配列、ポリ-A尾部、および検出可能なタグが挙げられるがこれらに限定されず、XbaI認識を有し得る多重クローニング部位が含まれ得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、5’UTR、3’UTR、および/またはmiRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの5’UTRおよび/または3’UTRを含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くのmiRNA結合部位を含み、これらは、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。5’UTR、3’UTR、および/またはmiRNA結合部位の任意の部分は、すべて対象外の場合も含め、配列最適化され得、独立して、配列最適化の前および/または後に、1つまたは複数の異なる構造的または化学的修飾を含有し得る。
一部の実施形態では、最適化の後に、ポリヌクレオチドは、再構築され、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などであるがこれらに限定されない、ベクターに形質転換される。例えば、最適化されたポリヌクレオチドは、再構築され、化学的にコンピテントなE.coli、酵母、neurospora、maize、ショウジョウバエなどに形質転換され得、ここで、高コピー数のプラスミド様または染色体構造体が、本明細書に記載される方法によって生じる。
8.IL12ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列
8.IL12ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードする、配列最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、ここで、ORFは、配列最適化されている。
ヒトIL12Bおよび/またはIL12Aをコードする例示的な配列最適化されたヌクレオチド配列を、表4A~4Dに示す。一部の実施形態では、表4A~4Dの配列最適化されたIL12Bおよび/またはIL12A配列、それらの断片、ならびにバリアントは、本明細書に開示される方法を実施するために使用される。一部の実施形態では、表4A~4Dの配列最適化されたIL12Bおよび/またはIL12A配列、それらの断片、ならびにバリアントは、図1に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替物である。提供されるRNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するDNA配列(例えば、ウラシルからチミンへの変換)を理解するであろう。同様に、提供されるDNA配列に基づいて、当業者であれば、対応するRNA配列(例えば、チミンからウラシルへの変換)を理解するであろう。
本明細書に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列および他の公知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化された核酸は、固有の組成特徴を有する。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする)におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率は、参照野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン核酸塩基の百分率に対して、修飾(例えば、低減)されている。そのような配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量の百分率は、配列中のウラシルまたはチミンの数を、ヌクレオチドの総数で除し、100を乗じることによって、決定することができる。一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。一部の実施形態では、本開示の配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも多く、参照野生型配列と比較した場合に、依然として、有益な効果、例えば、発現の増大および/またはToll様受容体(TLR)応答の低減を維持する。
一部の実施形態では、本開示の最適化された配列は、配列中に固有の範囲のウラシルまたはチミン(DNAの場合)を含有する。最適化された配列のウラシルまたはチミン含量は、様々な方式、例えば、理論上の最小値に対する最適化された配列のウラシルまたはチミンの含量(%UTMまたは%TTM)、野生型に対する含量(%UWTまたは%TWT)、および総ヌクレオチド含量に対する含量(%UTLまたは%TTL)で表すことができる。DNAについては、チミンはウラシルの代わりに存在することが認識されており、Uが出現するところをTで置き換えるであろう。したがって、例えば、RNAに関する%UTM、%UWT、または%UTLに関連するすべての開示は、DNAに関する%TTM、%TWT、または%TTLに同等に適用可能である。
ウラシルまたはチミンの理論上の最小値に対するウラシルまたはチミン含量は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの数を、仮説上の配列におけるすべてのコドンが可能な最低のウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられた仮説上のヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、100を乗じることによって決定される、パラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、%UTMまたは%TTMと略される。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、196%未満、195%未満、190%未満、185%未満、180%未満、175%未満、170%未満、165%未満、160%未満、155%未満、150%未満、145%未満、140%未満、139%未満、138%未満、137%未満、136%未満、135%未満、134%未満、133%未満、132%未満、131%未満、130%未満、129%未満、128%未満、127%未満、126%未満、125%未満、124%未満、123%未満、122%未満、121%未満、120%未満、119%未満、118%未満、117%未満、116%未満、または115%未満である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、196%未満かつ100%を上回る、101%を上回る、102%を上回る、103%を上回る、104%を上回る、105%を上回る、106%を上回る、107%を上回る、108%を上回る、109%を上回る、110%を上回る、111%を上回る、112%を上回る、113%を上回る、114%を上回る、115%を上回る、116%を上回る、117%を上回る、118%を上回る、119%を上回る、120%を上回る、121%を上回る、122%を上回る、123%を上回る、124%を上回る、125%を上回る、126%を上回る、127%を上回る、128%を上回る、129%を上回る、または130%を上回る、135%を上回る、130%を上回る、131%を上回る、または132%を上回る。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、132%~150%、133%~150%、134%~150%、135%~150%、136%~150%、137%~150%、138%~150%、139%~150%、140%~150%、132%~151%、132%~152%、132%~153%、132%~154%、132%~155%、132%~156%、132%~157%、132%~158%、132%~159%、132%~160%、133%~151%、134%~152%、135%~153%、136%~154%、137%~155%、138%~156%、138%~157%、139%~158%、140%~159%、もしくは141%~160%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、約133%~約152%、例えば、132.32%~150.51%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、198%未満、195%未満、190%未満、185%未満、180%未満、175%未満、170%未満、165%未満、160%未満、155%未満、150%未満、145%未満、140%未満、139%未満、138%未満、137%未満、136%未満、135%未満、134%未満、133%未満、132%未満、131%未満、130%未満、129%未満、128%未満、127%未満、126%未満、125%未満、124%未満、123%未満、122%未満、121%未満、120%未満、119%未満、118%未満、117%未満、116%未満、または115%未満である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、198%未満かつ100%を上回る、101%を上回る、102%を上回る、103%を上回る、104%を上回る、105%を上回る、106%を上回る、107%を上回る、108%を上回る、109%を上回る、110%を上回る、111%を上回る、112%を上回る、113%を上回る、114%を上回る、115%を上回る、116%を上回る、117%を上回る、118%を上回る、119%を上回る、120%を上回る、121%を上回る、122%を上回る、123%を上回る、124%を上回る、または125%を上回る。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、125%~143%、126%~143%、127%~143%、128%~143%、129%~143%、130%~143%、131%~132%、133%~134%、135%~143%、125%~144%、125%~145%、125%~146%、125%~147%、125%~148%、125%~149%、125%~150%、125%~151%、125%~152%、125%~153%、125%~154%、125%~155%、126%~144%、127%~145%、128%~146%、129%~147%、130%~148%、131%~149%、132%~150%、もしくは133%~151%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列の%UTMは、約124%~約145%、例えば、125%~144.42%である。
本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対する、そのウラシルまたはチミン含量にしたがって記載され得る(%UWTまたは%TWT)。
「野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量に対するウラシルまたはチミン含量」という語句は、配列最適化された核酸におけるウラシルまたはチミンの数を、対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、100を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、%UWTまたは%TWTと略される。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、50%を上回る、55%を上回る、60%を上回る、65%を上回る、70%を上回る、75%を上回る、80%を上回る、85%を上回る、90%を上回る、または95%を上回る。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、55%~88%、56%~87%、57%~86%、58%~85%、59%~84%、60%~83%、61%~82%、62%~81%、63%~80%、64%~79%、65%~78%、もしくは65%~77%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、66%~78%、66%~77%、67%~77%、67%~76%、もしくは65%~77%である。
特定の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、約66%~約77%、例えば、67%~76%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、50%を上回る、55%を上回る、60%を上回る、65%を上回る、70%を上回る、75%を上回る、80%を上回る、85%を上回る、90%を上回る、または95%を上回る。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、50%~85%、51%~84%、52%~83%、53%~82%、54%~81%、55%~80%、56%~79%、57%~78%、58%~77%、59%~76%、60%~75%、61%~74%、もしくは62%~73%である。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、61%~74%、61%~73%、61%~72%、61%~73%、62%~73%、62%~72%、62%~74%、もしくは63%~72%である。
特定の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列の%UWTまたは%TWTは、約62%~約73%、例えば、63%~72%である。
総ヌクレオチド含量に対する野生型IL12Bのウラシルまたはチミン含量(%)は、約21%である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%)(%UTLまたは%TTL)は、21%未満である。一部の実施形態では、%UTLまたは%TTLは、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、または10%未満である。一部の実施形態では、%UTLまたは%TTLは、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%以上である。
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%UTLまたは%TTL)は、10%~20%、11%~20%、11.5%~19.5%、12%~19%、12%~18%、13%~18%、13%~17%、13%~16%、13%~16%、14%~16%、14%~17%、もしくは13%~17%である。
特定の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル-またはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%UTLまたは%TTL)は、約13%~約17%、例えば、14%~16%である。
総ヌクレオチド含量に対する野生型IL12Aのウラシルまたはチミン含量(%)は、約26%である。一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対するIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%)(%UTLまたは%TTL)は、25%未満である。一部の実施形態では、%UTLまたは%TTLは、25%未満、24%未満、23%未満、22%未満、21%未満、20%未満、19%未満、18%未満、17%未満、16%未満、15%未満、14%未満、13%未満、12%未満、11%未満、または10%未満である。一部の実施形態では、%UTLまたは%TTLは、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%以上である。
一部の実施形態では、総ヌクレオチド含量に対する本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%UTLまたは%TTL)は、10%~25%、11%~25%、12%~25%、13%~25%、14%~25%、15%~25%、16%~25%、10%~24%、10%~23%、11%~22%、11%~21%、11%~20%、11%~19%、11%~18%、12%~24%、12%~23%、13%~22%、14%~21%、13%~20%、15%~19%、15%~20%、16%~19%、16%~18%、もしくは13%~17%である。
特定の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシルまたはチミン修飾された配列のウラシルまたはチミン含量(%UTLまたは%TTL)は、約15%~約19%、例えば、16%~18%である。一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、低減された数の連続したウラシルを有する。例えば、2つの連続したロイシンは、配列CUUUUGによってコードされ得、これは、4ウラシルのクラスターを含む。そのような部分配列は、例えば、CUGCUCで置換され得、これにより、ウラシルクラスターが除去される。
フェニルアラニンは、UUCまたはUUUによってコードされ得る。したがって、UUUによってコードされるフェニルアラニンが、UUCによって置き換えられた場合であっても、同義コドンは、依然として、ウラシルペア(UU)を含有する。したがって、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされるポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させずには排除することができないウラシルペア(UU)の最小の数を確立する。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、低減された数のウラシルトリプレット(UUU)を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、4、3、2、1のウラシルトリプレット(UUU)を含有するか、または全く含有しない。
一部の実施形態では、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア(UU)の数に対して、低減された数のウラシルペア(UU)を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシルペア(UU)の可能な最小の数に対応する数のウラシルペア(UU)を有する。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア(UU)の数より少なく、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23のウラシルペア(UU)を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、7~13、8~14、9~15、10~16、11~7、12~18のウラシルペア(UU)を有する。
一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、野生型核酸配列中のウラシルペア(UU)の数より少なく、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のウラシルペア(UU)を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、7~13、8~14、9~15、10~16、11~7、12~18のウラシルペア(UU)を有する。
「野生型核酸配列におけるウラシルペア(UU)に対するウラシルペア(UU)」という語句は、配列最適化されたヌクレオチド配列におけるウラシルペア(UU)の数を、対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルペア(UU)の総数で除し、100を乗じることによって決定されるパラメーターを指す。このパラメーターは、本明細書において、%UUwtと略される。
一部の実施形態では、本開示のIL12AまたはIL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、60%未満、65%未満、60%未満、55%未満、50%未満、40%未満、30%未満、または20%未満の%UUwtを有する。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、24%~59%の%UUwtを有する。特定の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、29%~55%の%UUwtを有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、14%~57%の%UUwtを有する。特定の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、19%~52%の%UUwtを有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列を含む。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中の核酸塩基(例えば、ウラシル)のうちの少なくとも95%は、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列中のウラシルのうちの少なくとも95%は、5-メトキシウラシルである。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、ウラシル修飾された配列を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のいずれかまたは化合物1~232のいずれかとともに製剤化される。
一部の実施形態では、%GTMXと略される「IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大グアニン含量に対する、IL12Bおよび/またはIL12Aをコードする配列最適化ORFのグアニン含量」は、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%である。一部の実施形態では、%GTMXは、約70%~約80%、約71%~約79%、約71%~約78%、もしくは約71%~約77%である。
一部の実施形態では、%CTMXと略される「IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最大シトシン含量に対するORFのシトシン含量」は、少なくとも59%、少なくとも60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%である。一部の実施形態では、%CTMXは、約60%~約80%、約62%~約80%、約63%~約79%、もしくは約68%~約76%である。
一部の実施形態では、%G/CTMXと略される「IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の理論上の最大G/C含量に対するORF中のグアニンおよびシトシン含量(G/C)」は、少なくとも約81%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%である。%G/CTMXは、約80%~約100%、約85%~約99%、約90%~約97%、もしくは約91%~約96%である。
一部の実施形態では、%G/CWTと略される「対応する野生型ORF中のG/C含量に対するORF中のG/C含量」は、少なくとも102%、少なくとも103%、少なくとも104%、少なくとも105%、少なくとも106%、少なくとも107%、少なくとも110%、少なくとも115%、もしくは少なくとも120%である。
一部の実施形態では、ORF中の3番目のコドン位置における平均G/C含量は、対応する野生型ORF中の3番目のコドン位置における平均G/C含量より少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、もしくは少なくとも30%高い。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、IL12Bおよび/またはIL12Aポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、ここで、ORFは、配列最適化されており、%UTL、%UWT、%UTM、%GTL、%GWT、%GTMX、%CTL、%CWT、%CTMX、%G/CTL、%G/CWT、または%G/CTMXのそれぞれは、単独またはそれらの組合せで、(i)パラメーターの最大値(MAX)に、約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、または10標準偏差(STD DEV)を加えたものに対応する最大値から、(ii)パラメーターの最小値(MIN)から、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、または10標準偏差(STD DEV)を差し引いたものに対応する最小値の範囲にある。
9.配列最適化の方法
9.配列最適化の方法
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント)をコードするヌクレオチド配列、例えば、ORFを含む、ポリヌクレオチド)は、配列最適化される。配列最適化されたヌクレオチド配列(ヌクレオチド配列は、本明細書において「核酸」とも称される)は、参照配列(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする野生型配列)に対して、少なくとも1つのコドン修飾を含む。したがって、配列最適化された核酸において、少なくとも1のコドンが、参照配列(例えば、野生型配列)における対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化された核酸は、参照配列におけるコドンを同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)で置換することを含む少なくとも1つのステップによって生成される。そのような置換は、例えば、コドン置換マップ(すなわち、コドン最適化配列におけるそれぞれのアミノ酸をコードするであろうコドンを提供する表)を適用することによって、または規則のセット(例えば、グリシンが、中性アミノ酸の次にある場合、グリシンは、ある特定のコドンによってコードされるが、極性アミノ酸の次にある場合は、別のコドンによってコードされる)を適用することによって、実行され得る。コドン置換(すなわち、「コドン最適化」)に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去(脱安定化モチーフ置換)など、厳密にはコドン最適化を対象とはしない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含む組成物および製剤は、機能的に活性なIL12のin vivo発現を促進するために、それを必要とする対象に投与され得る。
細胞培養物における大型分子の組換え発現は、多くの制限(例えば、乏しいタンパク質発現レベル、短縮された発現産物をもたらす分割された翻訳、タンパク質のミスフォールディングなど)を伴う困難な作業であり得る。これらの制限は、機能的に活性なIL12をコードするポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)またはそれを含む組成物もしくは製剤を、がんを患う患者に投与し、それによって、がんを処置するためのIL12ポリペプチドの合成および送達が内因的に生じるようにすることによって、低減または回避することができる。
in vitro発現系(例えば、細胞培養物)からin vivo発現へ変更するには、治療剤をコードする核酸配列の再設計が必要である。必ずしもコードされるアミノ酸配列の変化を伴うことなく、異なるコドンを選択することによって、天然に存在する遺伝子配列を再設計することにより、多くの場合、タンパク質の発現レベルに劇的な増大をもたらすことが可能である(Gustafssonら、2004年、Journal/Trends Biotechnol、22巻、346~53頁)。コドン適合性指標(CAI)、mRNA二次構造、cis制御配列、GC含量などの変数、および多数の他の類似の変数は、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている(Villalobosら、2006年、「Journal/BMC Bioinformatics 7巻、285頁)。しかしながら、遺伝子コードの縮重に起因して、すべてが同じ治療剤をコードする、多数の異なる核酸配列が存在する。それぞれのアミノ酸は、最大で6の同義コドンによってコードされ、これらのコドン間の選択肢が、遺伝子発現に影響を及ぼす。加えて、コドン使用頻度(すなわち、異なる生物が、ポリペプチド配列を発現するためにコドンを使用する頻度)は、生物間で異なる(例えば、ヒトまたはヒト化治療用抗体の組換え産生は、ハムスター細胞培養物において頻繁に生じる)。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、コドンマップを適用することによって配列最適化することができる。当業者であれば、以下に開示されるコドンマップにおけるT塩基はDNAに存在し、一方で、T塩基は、対応するRNAではU塩基によって置き換えられるであろうことを理解するであろう。例えば、DNA形態の本明細書に開示される配列最適化された核酸、例えば、ベクターまたはin vitro翻訳(IVT)鋳型は、そのT塩基が、その対応する転写mRNAでは、U塩基として転写されるであろう。この点に関して、配列最適化されたDNA配列(Tを含む)およびそれらの対応するRNA配列(Uを含む)のいずれも、本開示の配列最適化された核酸と考えられる。当業者であれば、1つまたは複数の塩基を、非天然の塩基で置き換えることによって、同等のコドンマップを生成することができることも、理解するであろう。したがって、例えば、TTCコドン(DNAマップ)は、UUCコドン(RNAマップ)に対応し、これは、ΨΨCコドン(Uがシュードウリジンで置き換えられているRNAマップ)に対応し得る。
一実施形態では、IL12A、IL12B、またはIL12AおよびIL12Bの両方をコードする参照配列は、ある特定のアミノ酸をコードするすべてのコドンを、コドンマップに提供される代替的なコドンのうちの1つだけで置き換えることによって、最適化することができる。例えば、最適化された配列におけるすべてのバリンは、GTGまたはGTCまたはGTTによってコードされるであろう。
本開示の配列最適化されたポリヌクレオチドは、1つもしくは複数のコドン最適化方法、またはそれらの組合せを使用して、生成することができる。核酸配列を配列最適化するために使用することができる配列最適化方法は、本明細書に詳細に記載されている。この方法の一覧は、包括的でも制限的でもない。
以下において考察される配列最適化方法のそれぞれについて記載される設計の原理および規則は、多数の異なる方式で組み合わせることができ、例えば、参照核酸配列の一部の領域に関する高G/C含量配列最適化、または他の領域に関するウリジン含量配列最適化、ならびに配列全体で二次構造を最小限に抑えるためまたは有害なモチーフを排除するための標的化ヌクレオチド変異がある。
配列最適化方法の可能な組合せの選択は、例えば、合成ポリヌクレオチドを産生するために使用される特定の化学的性質に依存し得る。そのような選択肢はまた、配列最適化された核酸、例えば、IL12を含む完全配列、機能的断片、または融合タンパク質などによってコードされるタンパク質の特徴にも依存し得る。一部の実施形態では、そのような選択肢は、配列最適化された核酸(例えば、治療用合成mRNA)によって標的とされる特定の組織または細胞に依存し得る。
最適化方法の適用および分析により得られる配列最適化方法または設計規則を組み合わせる機構は、単純なものも複雑なものもある。例えば、組合せは、次のものであり得る:(i)逐次的:それぞれの配列最適化方法および設計規則のセットを、全体の配列の異なる部分配列に適用し、例えば、コドン1~30位のウリジンを低減させ、次いで、配列の残りに関して高頻度のコドンを選択する;
(ii)階層的:複数の配列最適化方法または設計規則のセットを、階層的な決定論的様式で組み合わせる。例えば、最もGCの豊富なコドンを使用し、それらのコドンの最も高い頻度のものを選択することによって、(共通の)つながりを破壊する。
(iii)多因子/多重パラメーター:機械学習または他のモデリング技法を使用して、複数の重複する要件および矛盾する可能性のある要件を最も良好に満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、コンピュータを使用して、いくつかの数学的技法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用することを必要とするであろう。
(ii)階層的:複数の配列最適化方法または設計規則のセットを、階層的な決定論的様式で組み合わせる。例えば、最もGCの豊富なコドンを使用し、それらのコドンの最も高い頻度のものを選択することによって、(共通の)つながりを破壊する。
(iii)多因子/多重パラメーター:機械学習または他のモデリング技法を使用して、複数の重複する要件および矛盾する可能性のある要件を最も良好に満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、コンピュータを使用して、いくつかの数学的技法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用することを必要とするであろう。
最終的に、これらのアプローチのそれぞれにより、特定の規則のセットを得ることができ、これは、多くの場合に、単一のコドン表、すなわち、標的タンパク質(すなわち、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチド)におけるそれぞれのアミノ酸のコドンの分類された一覧に要約され得、特定の規則または規則のセットが、それぞれのアミノ酸位について特定のコドンをどのように選択するかを示す。
a.ウリジン含量最適化
a.ウリジン含量最適化
核酸配列における局所的に高い濃度のウリジンの存在は、特に、修飾されたウリジン類似体を合成mRNAの産生に使用した場合に、翻訳に対して有害な影響、例えば、翻訳の遅延または早すぎる翻訳の終止を有する場合がある。例えば、高ウリジン含量はまた、TLR活性化に起因して、合成mRNAのin vivo半減期を低減させ得る。
したがって、核酸配列は、少なくとも1つのウリジン含量最適化ステップを含む方法を使用して、配列最適化され得る。そのようなステップは、例えば、参照核酸における少なくとも1のコドンを、代替的なコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含み、ここで、ウリジン修飾配列は、以下の特性のうちの少なくとも1つを有する:
(i)全体的なウリジン含量の増大もしくは減少、
(ii)局所的ウリジン含量の増大もしくは減少(すなわち、特定の部分配列に限定されたウリジン含量の変化)、
(iii)全体的なウリジン含量を変化させない、ウリジン分布の変更、
(iv)ウリジンクラスタリング(例えば、クラスター数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離)の変化、または
(v)これらの組合せ。
(i)全体的なウリジン含量の増大もしくは減少、
(ii)局所的ウリジン含量の増大もしくは減少(すなわち、特定の部分配列に限定されたウリジン含量の変化)、
(iii)全体的なウリジン含量を変化させない、ウリジン分布の変更、
(iv)ウリジンクラスタリング(例えば、クラスター数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離)の変化、または
(v)これらの組合せ。
一部の実施形態では、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含量を最適化すること、すなわち、配列最適化された核酸におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、最適化することを含む。例えば、参照配列では、核酸塩基の30%がウリジンであり得、配列最適化された核酸では、核酸塩基の10%がウリジンであり得る。
他の実施形態では、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的なウリジン含量を低減すること、すなわち、配列最適化された核酸の部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率を、参照核酸配列の対応する部分配列におけるウリジン核酸塩基の百分率に対して、低減することを含む。例えば、参照核酸配列は、局所的なウリジン含量が30%の5’末端領域(例えば、30コドン)を有し得、配列最適化された核酸配列では、同じ領域におけるウリジン含量が、10%まで低減され得る。
特定の実施形態では、コドンは、参照核酸配列において、例えば、タンパク質翻訳に有害な影響を有し得るウリジンクラスターの数、サイズ、位置、または分布を低減または修飾するように、置き換えられ得る。一般則としては、参照核酸配列のウリジン含量を低減することが望ましいとはいえ、ある特定の実施形態では、参照核酸配列の一部の部分配列のウリジン含量、および特に局所的なウリジン含量を、増大させてもよい。
翻訳に対する悪影響を回避するためのウリジン含量の低減は、他の設計目標を達成するために、本明細書に開示される他の最適化方法と組み合わせて行うことができる。例えば、ウリジン含量最適化は、ランプ設計と組み合わせてもよいが、これは、ほとんどのアミノ酸について最も稀なコドンを使用することにより、一部の例外はあるが、U含量を低減することになるためである。
一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較した場合に、より低いToll様受容体(TLR)応答を誘導するように設計される。いくつかのTLRは、核酸を認識し、応答する。頻繁なウイルス構成物質である二本鎖(ds)RNAは、TLR3を活性化することが示されている。Alexopoulouら、(2001年)Nature、413巻、732~738頁およびWangら、(2004年)Nat. Med.、10巻、1366~1373頁を参照されたい。一本鎖(ss)RNAは、TLR7を活性化する。Dieboldら、(2004年)Science、303巻、1529~1531頁を参照されたい。RNAオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するRNAは、ヒトTLR8のリガンドである。Heilら、(2004年)Science、303巻、1526~1529頁を参照されたい。細菌およびウイルスDNAの特徴である非メチル化CpGモチーフを含有するDNAは、TLR9を活性化する。Hemmiら、(2000年)Nature、408巻、740~745頁を参照されたい。
本明細書において使用されるとき、「TLR応答」という用語は、TLR7受容体による一本鎖RNAの認識と定義され、一部の実施形態では、受容体による一本鎖RNAの認識によって引き起こされるRNAの分解および/または生理学的応答を包含する。RNAのTLR7への結合を判定および定量化するための方法は、当技術分野において公知である。同様に、RNAが、TLR7に媒介される生理学的応答(例えば、サイトカイン分泌)を誘発したかどうかを判定するための方法も、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、TLR応答は、TLR7の代わりに、TLR3、TLR8、またはTLR9によって媒介されてもよい。
TLR7に媒介される応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成することができる。RNAは、本質的に、100を上回る異なるヌクレオシド修飾を受ける(mods.rna.albany.eduにおいて利用可能なRNA Modification Databaseを参照されたい)。ヒトrRNAは、例えば、細菌rRNAよりも10倍多いシュードウリジン(Ψ)および25倍多い2’-O-メチル化ヌクレオシドを有する。細菌mRNAは、ヌクレオシド修飾を含有しないが、一方で、哺乳動物mRNAは、N7-メチルグアノシン(m7G)に加えて、5-メチルシチジン(m5C)、N6-メチルアデノシン(m6A)、イノシン、および多数の2’-O-メチル化ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを有する。
RNAの2つの決定的な特徴であるウラシルおよびリボースは、TLR7刺激に必要かつ十分であり、短い一本鎖RNA(ssRNA)は、いくつかのウリジンを近傍に含有する限り、配列独立様式で、TLR7アゴニストとして作用する。Dieboldら、(2006年)Eur. J. Immunol.、36巻、3256~3267頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される最適化方法のうちの1つまたは複数は、ウリジン含量を(局所的および/もしくは局所的に)低減すること、ならびに/またはTLR7に媒介される応答を低減もしくは抑制するように、ウリジンクラスタリングを低減もしくは修飾することを含む。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるTLR応答(例えば、TLR7によって媒介される応答)は、参照核酸配列によって引き起こされるTLR応答より少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%低い。
一部の実施形態では、参照核酸配列によって引き起こされるTLR応答は、ウリジン修飾された配列によって引き起こされるTLR応答より少なくとも約1倍、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約1.9倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、または少なくとも約10倍高い。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量(平均の全体的なウリジン含量)(絶対的もしくは相対的)は、参照核酸配列のウリジン含量(絶対的もしくは相対的)より高い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%多くのウリジンを含む。
他の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量(平均の全体的なウリジン含量)(絶対的もしくは相対的)は、参照核酸配列のウリジン含量(絶対的もしくは相対的)より低い。したがって、一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列は、参照核酸配列より少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%少ないウリジンを含む。
一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量(平均の全体的なウリジン含量)(絶対的もしくは相対的)は、ウリジン修飾された配列中の総核酸塩基のうちの50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%未満である。一部の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約10%~約20%である。一部の特定の実施形態では、ウリジン修飾された配列のウリジン含量は、約12%~約16%である。
一部の実施形態では、参照核酸配列のウリジン含量は、スライドウインドウを使用して測定することができる。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、40を上回る核酸塩基長である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、20核酸塩基長である。スライドウインドウで測定されるウリジン含量に基づいて、参照核酸配列および配列最適化された核酸の長さ全体のウリジン含量を表すヒストグラムを生成することが可能である。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、ある特定の百分率の値よりも高いかまたは低い、ヒストグラム内のピークを低減または排除するように修飾することができる。一部の実施形態では、参照核酸配列は、スライドウインドウ表示における65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、または30%ウリジンよりも高いピークを排除するように修飾することができる。別の実施形態では、参照核酸配列は、20核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸に、30%ウリジンを上回るピークがないように、修飾され得る。一部の実施形態では、参照核酸配列は、20核酸塩基のスライドウインドウを使用して測定した場合に、配列最適化された核酸配列における所定の数を上回るかまたは下回るピークが、ある特定の閾値よりも上または下に存在しないように、修飾され得る。例えば、一部の実施形態では、参照核酸配列は、配列最適化された核酸において、10%、15%、20%、25%、または30%ウリジンよりも高くにピークが存在しないか、またはそこに1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10より多くのピークが存在しないように、修飾され得る。別の実施形態では、配列最適化された核酸は、30%またはそれよりも高いウリジン含量に、0個のピーク~2個のピークを含有する。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、連続したウリジンの発生を低減するように配列最適化され得る。例えば、2つの連続したロイシンは、配列CUUUUGによってコードされ得、これは、4ウリジンのクラスターを含む。そのような部分配列は、CUGCUCで置換され得、これにより、ウリジンクラスターが有効に除去されるであろう。したがって、参照核酸配列は、ウリジンペア(UU)、ウリジントリプレット(UUU)、またはウリジンクアドロップレット(UUUU)を低減または排除することによって、配列最適化され得る。より高次のUの組合せは、より低次の組合せを組み合わせたものとは考えない。したがって、例えば、UUUUは、2つの連続したUペアではなく、厳密にクアドロップレットと考えられるか、またはUUUUUUは、3つの連続したUペアでも2つの連続したUトリプレットでもなく、セクツプレットと考えられる、などである。
一部の実施形態では、すべてのウリジンペア(UU)および/またはウリジントリプレット(UUU)および/またはウリジンクアドロップレット(UUUU)が、参照核酸配列から除去され得る。他の実施形態では、ウリジンペア(UU)および/またはウリジントリプレット(UUU)および/またはウリジンクアドロップレット(UUUU)は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、例えば、配列最適化された核酸における発生は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1未満のウリジンペアを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、ウリジンペアおよび/またはトリプレットを含有しない。
フェニルアラニンコドン、すなわち、UUCまたはUUUは、ウリジンペアまたはトリプルを含み、したがって、ウリジン含量を低減する配列最適化は、最大でも、フェニルアラニンのUトリプレットをフェニルアラニンのUペアに低減することができる。一部の実施形態では、ウリジンペア(UU)および/またはウリジントリプレット(UUU)の発生は、非フェニルアラニンUペアまたはトリプレットのみを指す。したがって、一部の実施形態では、非フェニルアラニンウリジンペア(UU)および/またはウリジントリプレット(UUU)は、ある特定の閾値よりも下に低減され得、配列最適化された核酸における発生は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20を上回らない。特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1未満の非フェニルアラニンウリジンペアおよび/またはトリプレットを含有する。別の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、非フェニルアラニンウリジンペアおよび/またはトリプレットを含有しない。
一部の実施形態では、配列最適化された核酸におけるウリジンの組合せ(例えば、ペア、トリプレット、クアドロップレット)の低減は、参照核酸配列に存在するウリジンの組合せに対する低減の百分率として表すことができる。
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンペアの総数のうちの約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、もしくは65%を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジントリプレットの総数のうちの約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、もしくは65%を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジンクアドルプレットの総数のうちの約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、もしくは65%を含有し得る。
一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジンペアの総数のうちの約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、もしくは65%を含有し得る。一部の実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジントリプレットの総数のうちの約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、もしくは65%を含有し得る。
一部の実施形態では、配列最適化された配列におけるウリジン含量は、この配列における理論上の最小ウリジン含量に対して表すことができる。「理論上の最小ウリジン含量」という用語は、配列中のすべてのコドンを、ウリジン含量が最も低い同義コドンで置き換えた後の、配列の長さに対する百分率としての核酸配列のうちのウリジン含量と定義される。一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列(例えば、野生型配列)の理論上の最小ウリジン含量と同一である。一部の態様では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列(例えば、野生型配列)の理論上の最小ウリジン含量の約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、約150%、約155%、約160%、約165%、約170%、約175%、約180%、約185%、約190%、約195%または約200%である。
一部の実施形態では、配列最適化された核酸のウリジン含量は、参照配列(例えば、野生型配列)の理論上の最小ウリジン含量と同一である。
参照核酸配列(例えば、野生型配列)は、ウリジンクラスターを含み得、これは、それらの数、サイズ、位置、分布、またはこれらの組合せに起因して、翻訳に対して負の影響を有する。本明細書において使用されるとき、「ウリジンクラスター」という用語は、ある特定の閾値を上回るウリジン含量(通常、百分率として記載される)を含有する、参照核酸配列または配列最適化された核酸配列における部分配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、部分配列が、約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、または65%より大きなウリジン含量を含む場合、そのような部分配列は、ウリジンクラスターと考えられる。
ウリジンクラスターの負の影響は、例えば、TLR7応答を誘起することであり得る。したがって、本明細書に開示される核酸配列最適化方法の一部の実施形態では、クラスターの数、クラスターのサイズ、クラスターの位置(例えば、核酸配列の5’および/もしくは3’末端の近傍)、クラスター間の距離、またはウリジンクラスターの分布(例えば、核酸配列に沿ったクラスターのある特定のパターン、発現される産物における二次構造エレメントに対するクラスターの分布、もしくはmRNAの二次構造に対するクラスターの分布)を低減することが望ましい。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも1つのウリジンクラスターを含み、このウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、この部分配列中の総ウリジン核酸塩基の百分率は所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、部分配列の長さは、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約55、少なくとも約60、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、または少なくとも約100核酸塩基である。一部の実施形態では、部分配列は、100核酸塩基より長い。一部の実施形態では、閾値は、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%または25%ウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、25%を上回る。
例えば、A、D、G、S、およびRを含むアミノ酸配列は、核酸配列GCU、GAU、GGU、AGU、CGUによってコードされ得る。そのような配列は、いずれのウリジンペア、トリプレット、またはクアドロップレットも含有しないが、核酸塩基のうちの3分の1は、ウリジンである。そのようなウリジンクラスターは、代替的なコドンを使用することによって、例えば、ウリジンを含有しないGCC、GAC、GGC、AGC、およびCGCを使用することによって、除去され得る。
他の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも1つのウリジンクラスターを含み、ここで、前記ウリジンクラスターは、参照核酸配列の部分配列であり、スライドウインドウを使用して測定される前記部分配列のウリジン核酸塩基の百分率は、所定の閾値を上回る。一部の実施形態では、スライドウインドウの長さは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40核酸塩基である。一部の実施形態では、スライドウインドウは、40核酸塩基長を上回る。一部の実施形態では、閾値は、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%または25%のウリジン含量である。一部の実施形態では、閾値は、25%を上回る。
一部の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも2つのウリジンクラスターを含む。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少ないウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも多くのウリジンリッチクラスターを含有する。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも短い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。他の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長い長さのウリジンリッチクラスターを含有する。
Karikoら、(2005年)Immunity、23巻、165~175頁、Kormannら、(2010年)Nature Biotechnology、29巻、154~157頁、またはSahinら、(2014年)Nature Reviews Drug Discovery | AOP、2014年9月19日オンライン刊行、doi:10.1038/nrd4278を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
b.グアニン/シトシン(G/C)含量
b.グアニン/シトシン(G/C)含量
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン/シトシン(G/C)含量(絶対的または相対的)を変化させることを含む方法を使用して、配列最適化することができる。そのような最適化は、参照核酸配列の全体的なG/C含量(絶対的もしくは相対的)を変化させる(例えば、増大もしくは減少させる)こと、参照核酸配列におけるG/C含量に局所的な変化を導入する(例えば、参照核酸配列中の選択された領域もしくは部分配列におけるG/Cを増大もしくは減少させる)こと、参照核酸配列におけるG/Cクラスターの頻度、サイズ、および分布を変化させること、またはこれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)と比較したG/C含量(絶対的もしくは相対的)の全体的な増大を含む。一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)の全体的な増大は、参照核酸配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%である。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のG/C含量に対するG/C含量(絶対的もしくは相対的)の全体的な減少を含む。一部の実施形態では、G/C含量絶対的もしくは相対的)の全体的な減少は、参照核酸配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%である。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)と比較した部分配列(すなわち、G/C修飾された部分配列)中のグアニン/シトシン(G/C)含量(絶対的もしくは相対的)の局所的な増大を含む。一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)の局所的な増大は、参照核酸配列中の対応する部分配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%である。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列中の対応する部分配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対する部分配列(すなわち、G/C修飾された部分配列)中のグアニン/シトシン(G/C)含量(絶対的もしくは相対的)の局所的な減少を含む。一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)の局所的な減少は、参照核酸配列中の対応する部分配列のG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%である。
一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)は、少なくとも約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、または1000核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
一部の実施形態では、G/C含量(絶対的もしくは相対的)は、少なくとも約1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、または10000核酸塩基長である部分配列において増大または低減される。
本明細書に記載されるGおよびC含量(絶対的または相対的)の増大または減少は、低G/C含量を有する同義コドンを、高G/C含量を有する同義コドンで置き換えること、またはその逆によって、行うことができる。例えば、Lは、6の同義コドンを有するが、そのうちの2つは、2つのG/Cを有し(CUC、CUG)、3つは、単一のG/Cを有し(UUG、CUU、CUA)、1つは、G/Cを有さない(UUA)。そのため、参照核酸が、ある特定の位置にCUCコドンを有した場合、その位置におけるG/C含量は、CUCを、単一のG/Cを有するコドンまたはG/Cを有さないコドンのうちのいずれかで置き換えることによって、低減され得る。
米国公開第US20140228558、同第US20050032730 A1、Gustafssonら、(2012年)Protein Expression and
Purification、83巻、37~46頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
c.コドン頻度-コドン使用頻度バイアス
Purification、83巻、37~46頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
c.コドン頻度-コドン使用頻度バイアス
当技術分野において公知の多数のコドン最適化方法は、参照核酸配列におけるコドンの、より高い頻度を有するコドンとの置換に基づく。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列における使用の頻度に対して、配列最適化された核酸における他の同義コドンと比べた1つまたは複数のコドンの使用の頻度の修飾の使用を含む方法を使用して最適化された配列であり得る。
本明細書において使用されるとき、「コドン頻度」という用語は、コドン使用頻度バイアス、すなわち、DNA/RNAをコードする際の同義コドンの発生頻度における差異を指す。一般に、コドンの選好性は、翻訳最適化のために、変異バイアスと天然の選択との間のバランスを反映することが、認識されている。最適なコドンは、より早い翻訳速度および高い正確性を達成するのに役立つ。これらの因子の結果として、翻訳選択は、高度に発現される遺伝子においてはより強力であることが予測される。バイオインフォマティクスおよび計算生物学の分野において、多数の統計学的方法が、コドン使用頻度バイアスを分析するために提案され、使用されている。例えば、ComeronおよびAguade(1998年)J. Mol. Evol.、47巻、268~74頁を参照されたい。「最適なコドンの頻度」(Fop)(Ikemura(1981年)J. Mol. Biol.、151巻(3号)、389~409頁)、相対的コドン適合(Relative Codon Adaptation)(RCA)(FoxおよびEril(2010年)DNA Res.、17巻(3号)、185~96頁)、または「コドン適合指標」(CAI)(SharpおよびLi(1987年)Nucleic Acids Res.、15巻(3号)、1281~95頁)などの方法は、遺伝子発現レベルを予測するために使用され、一方で、「コドンの有効数」(Nc)および情報理論によるシャノンエントロピーなどの方法は、コドン使用頻度の均等性を測定するために使用される。多変量の統計学的方法、例えば、対応分析および主成分分析は、遺伝子間のコドン使用頻度の変動性を分析するために広く使用される(Suzukiら、(2008年)DNA Res.、15巻(6号)、357~65頁、Sandhuら、In Silico Biol.、2008年、8巻(2号)、187~92頁)。
本明細書に開示されるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列など、例えば、mRNAであり得る)は、参照核酸配列における少なくとも1のコドンを、同義コドンセット内のより高いまたは低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換することを含む方法を使用して、コドン最適化することができ、ここで、結果として得られる配列最適化された核酸は、参照核酸配列と比べて、少なくとも1つの最適化された特性を有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは100%は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列における少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列における少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、IL12をコードする参照核酸配列中のコドンのうちの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、もしくは少なくとも約75%は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有する少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、より低いコドン頻度を有する少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
一部の特定の実施形態では、少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて2番目に高い、3番目に高い、4番目に高い、5番目に高い、または6番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて2番目に低い、3番目に低い、4番目に低い、5番目に低い、または6番目に低い頻度を有する。
コドン頻度に基づく最適化は、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列に対して、上述のように全体的に適用されてもよく、または局所的に適用されてもよい。一部の実施形態では、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて、ある特定の部分配列におけるコドンのすべてまたはある特定の百分率を、それらのそれぞれの同義コドンセットにおけるより高いまたは低い頻度を有するコドンで置換することで、修飾され得る。したがって、一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは100%は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列における少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換され、参照核酸配列の部分配列における少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列中のコドンのうちの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、もしくは少なくとも約75%は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より高いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有する少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換される、より低いコドン頻度を有する少なくとも1の代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も低いコドン頻度を有する。一部の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換される、より高いコドン頻度を有するすべての代替的なコドンは、同義コドンセットにおいて最も高いコドン頻度を有する。
特定の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、特定の位置、例えば、配列最適化された核酸の5’末端もしくは3’末端において、またはそれらの領域から所定の距離(例えば、配列最適化された核酸の5’末端または3’末端から少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100コドン)内で、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列を含み得る。
一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸は、全体的なコドン頻度が、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的なコドン頻度よりも高いかまたは低い1つより多くの部分配列を含み得る。当業者であれば、全体的により高いかまたは低い全体的なコドン頻度を有する部分配列が、全体的なコドン頻度がより高いまたは低いか、部分配列の長さ、部分配列間の距離、部分配列の位置などに応じて、無数のパターンで組織化され得ることを理解するであろう。
米国特許第US5082767号、同第US8126653号、同第US7561973号、同第US8401798号、米国公開第US20080046192号、同第US20080076161号、国際公開第WO2000018778号、Welchら、(2009年)PLoS ONE、4巻(9号)、e7002頁、Gustafssonら、(2012年)Protein Expression and Purification、83巻、37~46頁、Chungら、(2012年)BMC Systems
Biology、6巻、134号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
d.脱安定化モチーフ置換
Biology、6巻、134号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
d.脱安定化モチーフ置換
配列最適化に影響を及ぼすことができる様々なモチーフが存在し、それらは、様々な非排他的カテゴリー、例えば、以下のものに含まれる:
(i)一次配列に基づくモチーフ:単純なヌクレオチドの配列によって定義されるモチーフ。
(ii)構造的モチーフ:ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配列によってコードされるモチーフ。
(iii)局所的モチーフ:1つの連続した部分配列でコードされるモチーフ。
(iv)分布型モチーフ:2つまたはそれよりも多い分離した部分配列でコードされるモチーフ。
(v)利益モチーフ:ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
(vi)不利益モチーフ:ヌクレオチドの構造または機能に対する有害な作用を有するモチーフ。
(i)一次配列に基づくモチーフ:単純なヌクレオチドの配列によって定義されるモチーフ。
(ii)構造的モチーフ:ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配列によってコードされるモチーフ。
(iii)局所的モチーフ:1つの連続した部分配列でコードされるモチーフ。
(iv)分布型モチーフ:2つまたはそれよりも多い分離した部分配列でコードされるモチーフ。
(v)利益モチーフ:ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
(vi)不利益モチーフ:ヌクレオチドの構造または機能に対する有害な作用を有するモチーフ。
不利益モチーフのカテゴリーに適合する多数のモチーフが存在する。一部の例としては、例えば、比較的短い正確な配列である傾向にある制限酵素モチーフ、例えば、Xba1の制限部位モチーフ(TCTAGA(配列番号224))、EcoRIの制限部位モチーフ(GAATTC(配列番号225))、EcoRIIの制限部位モチーフ(CCWGG(配列番号226)、ここで、Wは、IUPAC不確定コードに従ってAもしくはTを意味する)、もしくはHindIIIの制限部位モチーフ(AAGCTT(配列番号227));長く、正確な配列ではなくコンセンサス配列に基づく傾向にある、酵素部位、例えば、T7 RNAポリメラーゼにおけるもの(GnnnnWnCRnCTCnCnnWnD(配列番号228)、ここで、nは、任意のヌクレオチドを意味し、Rは、AもしくはGを意味し、Wは、AもしくはTを意味し、Dは、AもしくはGもしくはTを意味するが、Cではない);構造的モチーフ、例えば、GGGG(配列番号229)リピート(Kimら、(1991年)Nature、351巻(6324号)、331~2頁);または他のモチーフ、例えば、CUGトリプレットリピート(Queridoら、(2014年)J. Cell Sci.、124巻、1703~1714頁)が挙げられる。
したがって、本明細書に開示されるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列における少なくとも1つの脱安定化モチーフを置換すること、およびそのような不利益モチーフを除去するか、またはそれを利益モチーフで置き換えることを含む方法を使用して、配列最適化され得る。
一部の実施形態では、最適化プロセスは、参照核酸配列における利益モチーフおよび/または不利益モチーフを特定することを含み、ここで、そのようなモチーフは、例えば、最適化プロセスの前または最中に、参照核酸配列において安定性の消失を引き起こし得る特定の部分配列である。例えば、最適化中の特定の塩基の置換により、制限酵素によって認識される部分配列(モチーフ)が生成され得る。したがって、最適化プロセスの最中、不利益モチーフの出現を、配列最適化された配列と、不利益となることが公知のモチーフのライブラリーとの比較によって、モニタリングすることができる。次いで、不利益モチーフの特定を、事後フィルターとして、すなわち、参照核酸配列に導入され得る可能性を有するある特定の修飾が、実際に実施されるべきかどうかを決定するために、使用することができる。
一部の実施形態では、不利益モチーフの特定は、本明細書に開示される配列最適化方法の適用の前に使用することができる、すなわち、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列におけるモチーフの特定、ならびにそれらの代替的な核酸配列との置換えは、事前処理ステップとして、例えば、ウリジン低減の前に、使用することができる。
他の実施形態では、不利益モチーフの特定およびそれらの除去は、本明細書に開示される配列最適化方法のうちの2つまたはそれよりも多くを含む多重パラメーターの核酸最適化方法に組み込まれる、追加の配列最適化技法として使用される。この様式で使用される場合、最適化プロセス中に特定された不利益モチーフは、例えば、本来の設計原理(例えば、低いU、高い頻度など)に可能な限りの近似性を保つために、可能な限り低い数の核酸塩基を置換することによって、除去されるであろう。
例えば、米国公開第US20140228558号、同第US20050032730号、または同第US20140228558号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
e.限定的コドンセット最適化
e.限定的コドンセット最適化
一部の特定の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする参照核酸配列の配列最適化は、限定的コドンセット、例えば、本来の数よりも少ないコドンを使用して20の天然のアミノ酸、20の天然のアミノ酸のサブセット、または例えば非天然のアミノ酸を含む拡大されたアミノ酸のセットをコードするコドンセットを使用して、行われ得る。
遺伝子コードは、すべての生物で高度に類似しており、単純な64エントリーの表で表すことができ、これにより、タンパク質翻訳に関与する20の標準的なアミノ酸に加え、開始および終止コドンがコードされるであろう。遺伝子コードは、縮重している、すなわち、一般に、1より多くのコドンにより、それぞれのアミノ酸が指定される。例えば、アミノ酸ロイシンは、UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、またはCUGコドンによって指定され、一方で、アミノ酸セリンは、UCA、UCG、UCC、UCU、AGU、またはAGCコドンによって指定される(第1、第2、または第3の位置における違い)。天然の遺伝子コードは、天然に存在するアミノ酸をコードする62のコドンを含む。したがって、本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、20のアミノ酸をコードするための62よりも少ないコドンを含む最適化されたコドンセット(遺伝子コード)は、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、または20のコドンを含み得る。
一部の実施形態では、限定的コドンセットは、20未満のコドンを含む。例えば、タンパク質が20種類未満のアミノ酸を含む場合、そのようなタンパク質は、20未満のコドンを含むコドンセットにコードされ得る。したがって、一部の実施形態では、最適化コドンセットは、参照核酸配列にコードされるタンパク質中に存在するアミノ酸の異なる種類と同じ数のコドンを含む。一部の実施形態では、最適化コドンセットは、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2またはさらに1のコドンを含む。
一部の実施形態では、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、およびValからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸、すなわち、天然では1より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、天然に存在する同義コドンの数よりも少ないコドンでコードされる。例えば、一部の実施形態では、Alaは配列最適化核酸中で3、2または1のコドンにコードされ得る;Cysは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Aspは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Gluは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Pheは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Glyは配列最適化核酸中で3のコドン、2のコドンまたは1のコドンにコードされ得る;Hisは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Ileは配列最適化核酸中で2のコドンまたは1のコドンにコードされ得る;Lysは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Leuは配列最適化核酸中で5のコドン、4のコドン、3のコドン、2のコドンまたは1のコドンにコードされ得る;Asnは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Proは配列最適化核酸中で3のコドン、2のコドン、または1のコドンにコードされ得る;Glnは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る;Argは配列最適化核酸中で5のコドン、4のコドン、3のコドン、2のコドン、または1のコドンにコードされ得る;Serは配列最適化核酸中で5のコドン、4のコドン、3のコドン、2のコドン、または1のコドンにコードされ得る;Thrは配列最適化核酸中で3のコドン、2のコドン、または1のコドンにコードされ得る;Valは配列最適化核酸中で3のコドン、2のコドン、または1のコドンにコードされ得る;かつTyrは配列最適化核酸中で1のコドンにコードされ得る。
一部の実施形態では、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、およびValからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸、すなわち、天然では1より多くのコドンによってコードされるアミノ酸は、限定的コドンセットにおける単一のコドンによってコードされる。
一部の特定の実施形態では、配列最適化された核酸は、DNAであり、限定的コドンセットは、20のコドンからなり、ここで、それぞれのコドンは、20のアミノ酸のうちの1つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はDNAであり、限定的コドンセットは、GCT、GCC、GCA、およびGCGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;AATまたはACCから選択される少なくとも1のコドン;GATまたはGACから選択される少なくとも1のコドン;TGTまたはTGCから選択される少なくとも1のコドン;CAAまたはCAGから選択される少なくとも1のコドン;GAAまたはGAGから選択される少なくとも1のコドン;GGT、GGC、GGA、およびGGGからなる群から選択されるCATまたはCACから選択される少なくとも1のコドン;少なくとも1のコドン;ATT、ATC、およびATAからなる群から選択される少なくとも1のコドン;TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、およびCTGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;AAAまたはAAGから選択される少なくとも1のコドン;ATGコドン;TTTまたはTTCから選択される少なくとも1のコドン;CCT、CCC、CCA、およびCCGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、およびAGCからなる群から選択される少なくとも1のコドン;ACT、ACC、ACA、およびACGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;TGGコドン;TATまたはTACから選択される少なくとも1のコドン;ならびにGTT、GTC、GTA、およびGTGからなる群から選択される少なくとも1のコドンを含む。
他の実施形態では、配列最適化核酸はRNA(例えば、mRNA)であり、限定的コドンセットは20コドンからなり、各コドンは、20のアミノ酸のうちの1つをコードする。一部の実施形態では、配列最適化核酸はRNAであり、限定的コドンセットは、GCU、GCC、GCA、およびGCGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;CGU、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;AAUまたはACCから選択される少なくとも1のコドン;GAUまたはGACから選択される少なくとも1のコドン;UGUまたはUGCから選択される少なくとも1のコドン;CAAまたはCAGから選択される少なくとも1のコドン;GAAまたはGAGから選択される少なくとも1のコドン;GGU、GGC、GGA、およびGGGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;CAUまたはCACから選択される少なくとも1のコドン;AUU、AUC、およびAUAからなる群から選択される少なくとも1のコドン;UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、およびCUGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;AAAまたはAAGから選択される少なくとも1のコドン;AUGコドン;UUUまたはUUCから選択される少なくとも1のコドン;CCU、CCC、CCA、およびCCGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;UCU、UCC、UCA、UCG、AGU、およびAGCからなる群から選択される少なくとも1のコドン;ACU、ACC、ACA、およびACGからなる群から選択される少なくとも1のコドン;UGGコドン;UAUまたはUACから選択される少なくとも1のコドン;および、GUU、GUC、GUA、およびGUGからなる群から選択される少なくとも1のコドンを含む。
一部の特定の実施形態では、限定的コドンセットは、ある特定の組織または細胞への投与後の配列最適化された核酸(例えば、合成mRNA)のin vivo発現に関して最適化されている。
一部の実施形態では、最適化されたコドンセット(例えば、20のアミノ酸をコードする20コドンのセット)は、少なくとも以下の特性のうちの1つを満たす。
(i)最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも高い平均G/C含量を有する、または
(ii)最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも低い平均U含量を有する、または
(iii)最適化されたコドンセットは、最も高い頻度を有するコドンから構成されている、または
(iv)最適化されたコドンセットは、最も低い頻度を有するコドンから構成されている、または
(v)これらの組合せ。
(i)最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも高い平均G/C含量を有する、または
(ii)最適化されたコドンセットは、元のもしくは天然のコドンセットよりも低い平均U含量を有する、または
(iii)最適化されたコドンセットは、最も高い頻度を有するコドンから構成されている、または
(iv)最適化されたコドンセットは、最も低い頻度を有するコドンから構成されている、または
(v)これらの組合せ。
一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンセットにおける少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおいて2番目に高い、3番目に高い、4番目に高い、5番目に高い、または6番目に高い頻度を有する。一部の特定の実施形態では、最適化されたコドンにおける少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおいて2番目に低い、3番目に低い、4番目に低い、5番目に低い、または6番目に低い頻度を有する。
本明細書において使用されるとき、「天然のコドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために源生物によって天然に使用される、コドンセットを指す。本明細書において使用されるとき、「元のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に、参照核酸配列をコードするために使用されるコドンセット、または配列最適化が反復的または再帰的に適用される場合には、新しい最適化反復の開始時に参照核酸配列の最適化されたバリアントをコードするために使用されるコドンセットを指す。
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%は、最高の頻度を有するものである。他の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%は、最低の頻度を有するものである。
一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%は、最高のウリジン含量を有するものである。一部の実施形態では、コドンセット中のコドンのうち5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%は、最低のウリジン含量を有するものである。
一部の実施形態では、コドンセットの平均G/C含量(絶対的もしくは相対的)は、元のコドンセットの平均G/C含量(絶対的もしくは相対的)より5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%高い。一部の実施形態では、コドンセットの平均G/C含量(絶対的もしくは相対的)は、元のコドンセットの平均G/C含量(絶対的もしくは相対的)より5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%低い。
一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量(絶対的もしくは相対的)は、元のコドンセットの平均ウラシル含量(絶対的もしくは相対的)より5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%高い。一部の実施形態では、コドンセットのウラシル含量(絶対的もしくは相対的)は、元のコドンセットの平均ウラシル含量(絶対的もしくは相対的)より5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%低い。
米国出願公開第2011/0082055号および国際公開第WO2000018778号もまた参照されたく、これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
10.配列最適化された核酸の特徴付け
10.配列最適化された核酸の特徴付け
本開示の一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を試験して、少なくとも1つの核酸配列特性(例えば、ヌクレアーゼに曝露した場合の安定性)または発現特性が、配列最適化されていない核酸に対して、改善されているかどうかを判定することができる。
本明細書において使用されるとき、「発現特性」は、in vivo(例えば、それを必要とする対象に投与した後の合成mRNAの翻訳有効性)またはin vitro(例えば、in vitroモデル系において試験した合成mRNAの翻訳有効性)のいずれかでの、核酸配列の特性を指す。発現特性としては、投与後にIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAによって産生されるタンパク質の量、ならびに産生される可溶性またはその他の機能的タンパク質の量が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される配列最適化された核酸は、本明細書に開示されるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする配列最適化された核酸配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存性によって、評価することができる。
特定の実施形態では、最適化されていない参照核酸配列に対して、コドン置換を含有する、本明細書に開示される複数の配列最適化された核酸(例えば、RNA、例えば、mRNA)を、機能性に関して特徴付けて、目的の特性、例えば、in vitroモデル系での、または標的組織もしくは細胞においてin vivoでの発現特性を測定することができる。
a.核酸配列の本質的な特性の最適化
a.核酸配列の本質的な特性の最適化
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、核酸配列の本質的な特性である。例えば、ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、in vivoまたはin vitroでの安定性に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞における発現に関して配列最適化され得る。一部の実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるその分解を予防することによって、その血漿半減期を増大させるように、配列最適化される。
他の実施形態では、核酸配列は、溶液中での加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸または配列最適化された核酸を含む医薬組成物を水溶性条件下において最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、配列最適化される。
他の実施形態では、配列最適化された核酸は、乾燥状態での保管条件における加水分解に対するその耐性を増大させるように、例えば、配列最適化された核酸を凍結乾燥後に最小限の分解で保管することができる時間を延長するように、最適化され得る。
b.タンパク質発現に関して最適化された核酸配列
b.タンパク質発現に関して最適化された核酸配列
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの所望される特性は、本明細書に開示される配列最適化された配列によってコードされるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドの発現レベルである。タンパク質の発現レベルは、1つまたは複数の発現系を使用して、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、CHO細胞またはHEK293細胞において、測定することができる。一部の実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートから調製されたin vitro発現系、または精製された個々の成分のアセンブリによって調製されたin vitro発現系を使用して、測定することができる。他の実施形態では、タンパク質発現は、例えば、マウス、ウサギ、サルなど、in vivo系において測定される。
一部の実施形態では、溶液形態におけるタンパク質発現が、望ましい場合がある。したがって、一部の実施形態では、参照配列は、溶液形態におけるタンパク質発現のレベルが最適化された、配列最適化された核酸配列が得られるように、配列最適化され得る。タンパク質発現のレベルおよび他の特性、例えば、可溶性、凝集のレベル、および短縮産物の存在(すなわち、タンパク質分解、加水分解、または欠損した翻訳に起因する断片)は、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、電気泳動(例えば、天然もしくはSDS-PAGE)またはクロマトグラフィー方法(例えば、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィーなど)を使用して、測定することができる。
c.標的組織または標的細胞の生存性の最適化
c.標的組織または標的細胞の生存性の最適化
一部の実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織または細胞において有害な作用を有し、タンパク質収率を低減させ得るか、または発現される産物の品質を低減し得る(例えば、タンパク質断片の存在もしくは封入体における発現されたタンパク質の沈降に起因する)、または毒性を引き起こし得る。
したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列、例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。
異種タンパク質発現はまた、自家または異種移植のために核酸配列がトランスフェクトされた細胞にとって、有害であり得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化を使用して、配列最適化された核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存性を増大させることができる。細胞または組織の生存性、毒性、および他の生理学的反応における変化は、当技術分野において公知の方法に従って測定することができる。
d.免疫および/または炎症性応答の低減
d.免疫および/または炎症性応答の低減
一部の事例では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチド、またはその機能的断片をコードする配列最適化された核酸の投与は、免疫応答を誘発し得、この免疫応答は、(i)治療剤(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNA)、または(ii)そのような治療剤の発現産物(例えば、mRNAによってコードされるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AおよびIL12B融合ポリペプチド)、または(iv)これらの組合せによって引き起こされ得る。したがって、本開示の一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列(例えば、mRNA)の配列最適化を使用して、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはそのような核酸によってコードされるIL12A、IL12B、ならびに/もしくはIL12AおよびIL12B融合体の発現産物によって、誘発される、免疫応答または炎症応答を減少することができる。
一部の態様では、炎症応答は、当技術分野において公知の方法、例えば、ELISAを使用して、1つまたは複数の炎症性サイトカインのレベルの増大を検出することによって、測定することができる。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症応答の際に上昇されるサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン-6(IL-6)、GROαとしても公知のCXCL1(ケモカイン(C-X-Cモチーフ))リガンド1、インターフェロン-γ(IFNγ)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターフェロンγ-誘導タンパク質10(IP-10)、または顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)が挙げられる。炎症性サイトカインという用語には、当技術分野において公知の炎症応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-13(Il-13)、インターフェロンα(IFN-α)なども含まれる。
11.IL12ポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
11.IL12ポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、mRNAは、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/IL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、ここで、mRNAは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。
本開示のある特定の態様では、5-メトキシウラシル塩基が、ポリヌクレオチド中にあるように、リボース糖に結合した場合、結果として得られる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、5-メトキシウリジンと称される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは約100%が5-メトキシウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、少なくとも95%が5-メトキシウラシルである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドのウラシルは、100%が5-メトキシウラシルである。
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも95%が5-メトキシウラシルである実施形態では、全体的なウラシル含量は、免疫応答をほとんど~全く誘導せずに好適なタンパク質発現レベルを提供するように調整され得る。一部の実施形態では、ORFのウラシル含量(%UTM)は、約105%~約145%、約105%~約140%、約110%~約140%、約110%~約145%、約115%~約135%、約105%~約135%、約110%~約135%、約115%~約145%、もしくは約115%~約140%である。他の実施形態では、ORFのウラシル含量は、約117%~約134%または118%~132%の%UTMである。一部の実施形態では、%UTMは、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、もしくは約150%である。この文脈では、「ウラシル」という用語は、5-メトキシウラシルおよび/または天然に存在するウラシルを指し得る。
一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含量は、ORF中の総核酸塩基含量の約50%、約40%、約30%、もしくは約20%未満である。一部の実施形態では、ORF中のウラシル含量は、ORF中の総核酸塩基含量の約15%~約25%である。他の実施形態では、ORF中のウラシル含量は、ORF中の総核酸塩基含量の約20%~約30%である。一実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約20%未満である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、5-メトキシウラシルおよび/または天然に存在するウラシルを指し得る。
さらなる実施形態では、5-メトキシウラシルおよび調整されたウラシル含量を有するIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、増大したシトシン(C)、グアニン(G)、またはグアニン/シトシン(G/C)含量(絶対的または相対的)を有する。一部の実施形態では、ORFのC、G、またはG/C含量(絶対的もしくは相対的)の全体的な増大は、野生型ORFのG/C含量(絶対的もしくは相対的)に対して少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%である。一部の実施形態では、ORF中のG、C、またはG/C含量は、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論上の最大G、C、またはG/C含量(%GTMX;%CTMX、または%G/CTMX)の約100%未満、約90%未満、約85%未満、または約80%未満である。他の実施形態では、ORF中のG、C、またはG/C含量は、%GTMX、%CTMX、または%G/CTMXの約70%~約80%、約71%~約79%、約71%~約78%、もしくは約71%~約77%である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるGおよび/またはC含量の増大(絶対的または相対的)は、低G、C、またはG/C含量を有する同義コドンを、高G、C、またはG/C含量を有する同義コドンで置き換えることによって、行うことができる。他の実施形態では、Gおよび/またはC含量の増大(絶対的または相対的)は、Uで終わるコドンを、GまたはCで終わる同義コドンで置き換えることによって、行われる。
さらなる実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、5-メトキシウラシルを含み、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも、少ないウラシルペア(UU)および/またはウラシルトリプレット(UUU)および/またはウラシルクアドロップレット(UUUU)を含有する調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、ウラシルペアおよび/またはウラシルトリプレットおよび/またはウラシルクアドロップレットを含有しない。一部の実施形態では、ウラシルペアおよび/またはウラシルトリプレットおよび/またはウラシルクアドロップレットは、ある特定の閾値よりも下に低減され、例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFにおける発生は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20を上回らない。特定の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1未満の非フェニルアラニンウラシルペアおよび/またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、非フェニルアラニンウラシルペアおよび/またはトリプレットを含有しない。
さらなる実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、5-メトキシウラシルを含み、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも少ないウラシルリッチクラスターを含有する、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、本開示のIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFは、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列における対応するウラシルリッチクラスターよりも短い長さのウラシルリッチクラスターを含有する。
さらなる実施形態では、代替的なより低頻度のコドンが利用される。IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードする、5-メトキシウラシル含有mRNAのORF中のコドンのうちの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは100%は、代替的コドンで置換されており、各代替的コドン同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。ORFはまた、上述のように、調整されたウラシル含量を有する。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFにおける少なくとも1のコドンは、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、5-メトキシウラシルを含むmRNAのIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFは、哺乳動物細胞に投与した場合に、対応する野生型mRNAからのIL12の発現レベルよりも高いIL12の発現レベルを呈する。他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のIL12の発現レベルは、少なくとも95%の5-メトキシウラシルを含有し、理論上の最小値の約160%、約170%、約180%、約190%、または約200%のウラシル含量を有する対応するmRNAと比べて、増大する。さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞に投与した場合のIL12の発現レベルは、対応するmRNAと比べて増大し、ここで、ウラシルの少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または約100%が、1-メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、HeLa細胞、BJ線維芽細胞、または末梢血単核細胞(PBMC)である。一部の実施形態では、IL12は、mRNAがin vivoで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、mRNAは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。一部の実施形態では、mRNAは、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、または約0.15mg/kgの量で、マウスに投与される。一部の実施形態では、mRNAは、静脈内または筋肉内投与される。他の実施形態では、IL12ポリペプチドは、mRNAが、in vitroで哺乳動物細胞に投与される場合に発現される。一部の実施形態では、発現は、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約500倍、少なくとも約1500倍、または少なくとも約3000倍だけ増大する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、60%、約70%、約80%、約90%、もしくは約100%だけ増大する。
一部の実施形態では、ウラシル含量が調整された、5-メトキシウラシルを含むmRNAのIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFは、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、mRNAは、同じ条件下における対応する野生型mRNAの安定性と比べて、細胞における安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、mRNAは、ヌクレアーゼに対する耐性、熱安定性、および/または二次構造の安定化の増大を含む、安定性の増大を呈する。一部の実施形態では、mRNAが呈する安定性の増大は、mRNAの半減期(例えば、血漿、細胞、または組織試料における)を判定すること、ならびに/またはmRNAによる経時的なタンパク質発現(例えば、in vitroまたはin vivo)の曲線下面積(AUC)を判定することによって、測定される。mRNAは、半減期および/またはAUCが、同じ条件下における対応する野生型mRNAの半減期および/またはAUCを上回る場合、安定性の増大を有するとして特定される。
一部の実施形態では、本開示のmRNAは、同じ条件下における対応する野生型mRNAによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答(例えば、自然または獲得)を誘導する。他の実施形態では、本開示のmRNAは、同じ条件下におけるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNAによって誘導される免疫応答と比べて、または同じ条件下におけるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないmRNAによって誘導される免疫応答と比べて、検出可能により低い免疫応答(例えば、自然または獲得)を誘導する。自然免疫応答は、増大した炎症促進性サイトカインの発現、細胞内PRR(RIG-I、MDA5など)の活性化、細胞死、および/またはタンパク質翻訳の終止もしくは低減によって示すことができる。一部の実施形態では、自然免疫応答の低減は、1型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、およびIFN-ζ)の発現もしくは活性レベルまたはインターフェロンにより制御される遺伝子、例えば、toll様受容体(例えば、TLR7およびTLR8)の発現、ならびに/または本開示のmRNAの細胞への1回もしくは複数回の投与の後の細胞死の減少によって、測定することができる。
一部の実施形態では、本開示のmRNAに応答した哺乳動物細胞による1型インターフェロンの発現は、対応する野生型mRNA、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNA、またはIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないmRNAと比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、または99.9%を上回って、低減される。一部の実施形態では、インターフェロンは、IFN-βである。一部の実施形態では、哺乳動物細胞への本開示のmRNAの投与によって引き起こされる細胞死の頻度は、対応する野生型mRNA、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNA、またはIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/もしくはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、調整されたウラシル含量を有さないmRNAで観察される細胞死の頻度よりも、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または95%を上回って、低い。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、BJ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、脾細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は、マウスまたはラットのものである。他の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒトのものである。一実施形態では、本開示のmRNAは、mRNAが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFを含むmRNAであり、ここで、mRNAにおけるウラシルは、少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量は、対応する野生型ORFにおける理論上の最小ウラシル含量の約115%~約135%であり、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFにおけるウラシル含量は、そのORFにおける総核酸塩基含量の約30%未満である。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFは、ORFのG/C含量(絶対的または相対的)が、対応する野生型ORFと比較して、少なくとも約40%増大するようにさらに修飾される。さらに他の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするORFは、20を下回る非フェニルアラニンウラシルペアおよび/またはトリプレットを含有する。一部の実施形態では、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAのORFにおける少なくとも1のコドンは、さらに、同義コドンセットにおける置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替的なコドンで置換される。一部の実施形態では、mRNAにおけるウラシルが、少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量が、対応する野生型ORFにおける理論上の最小ウラシル含量の約115%~約135%である、ORFを含むmRNAによってコードされるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドの発現は、対応する野生型mRNAによるIL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドの発現と比較した場合に、少なくとも約10倍増大する。一部の実施形態では、mRNAは、オープンORFを含み、ここで、mRNAにおけるウラシルは、少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量は、対応する野生型ORFの理論上の最小ウラシル含量の約115%~約135%であり、mRNAは、mRNAが導入された哺乳動物細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
12.ポリヌクレオチドを修飾するための方法
12.ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド)を含む、修飾されたポリヌクレオチドを含む。修飾されたポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得るおよび/または構造的に修飾され得る。本開示のポリヌクレオチドが、化学的および/または構造的に修飾された場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)の修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書において「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて含有する、化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたまたは非天然のヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法、例えば、化学的、酵素的、または組換えなどによって、合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結したヌクレオシドの1つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、変動する骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むであろう。
本明細書に開示される修飾されたポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。一部の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、1つ、2つ、またはそれよりも多くの(任意選択で、異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。一部の実施形態では、細胞に導入された修飾されたポリヌクレオチドは、未修飾のポリヌクレオチドと比較して、1つまたは複数の望ましい特性、例えば、改善されたタンパク質発現、低減された免疫原性、または細胞における低減された分解を呈し得る。
a.構造的修飾
a.構造的修飾
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、構造的に修飾される。本明細書において使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に対する有意な化学的修飾を伴うことなく、2つまたはそれよりも多い連結したヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて、挿入、欠失、重複、逆転、または無作為化されているものである。化学結合は、構造的修飾を実行するために、必要に応じて破壊および再形成されることになるため、構造的修飾は、化学的性質に関するものであり、したがって、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なる配列のヌクレオチドをもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG(配列番号230)」は、「AT-5meC-G」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ATCG(配列番号230)」から、「ATCCCG(配列番号231)」に構造的に修飾され得る。この場合、ジヌクレオチド「CC」が挿入されており、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾をもたらす。
b.化学的修飾
b.化学的修飾
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、化学的に修飾される。本明細書においてポリヌクレオチドを参照して使用されるとき、「化学的修飾」または適宜「化学的に修飾される」という用語は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、チミジン(T)、またはシチジン(C)リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、その核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組合せを含むがそれらに限定されない、それらの位置、パターン、パーセント、または集団のうちの1つまたは複数における、修飾を指す。通常、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する5’末端mRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部の一様な化学修飾、または同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部における同じ出発修飾の下方滴定によって得られる修飾の集団、またはすべてのウリジンが、ウリジン類似体、例えば、5-メトキシウリジンによって置き換えられる場合など、無作為な組込みを有するが同じヌクレオシド型のすべてもしくは一部のある測定パーセントの化学的修飾を有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通じて同じヌクレオシド型の2つ、3つ、または4つの一様な化学的修飾を有し得る(例えば、すべてのウリジンおよび/またはすべてのシチジンなどが、同じ様式で修飾される)。
修飾されたヌクレオチド塩基の対合は、標準的なアデノシン-チミン、アデノシン-ウラシル、またはグアノシン-シトシンの塩基対だけでなく、非標準的もしくは修飾された塩基を含むヌクレオチド間および/または修飾されたヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターの配置は、非標準的な塩基と標準的な塩基との間、または2つの相補的な非標準的な塩基構造の間の水素結合を許容する。そのような非標準的な塩基対合の1つの例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基/糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
当業者であれば、別途示される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、代表的なDNA配列において「T」が指定されるが、配列がRNAを表す場合には、「T」は、「U」に置き換えられるであろうことを理解するであろう。
本開示の組成物において有用なポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)の修飾としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない:2-メチルチオ-N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン;2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;N6-グリシニルカルバモイルアデノシン;N6-イソペンテニルアデノシン;N6-メチルアデノシン;N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;1,2’-O-ジメチルアデノシン;1-メチルアデノシン;2’-O-メチルアデノシン;2’-O-リボシルアデノシン(リン酸);2-メチルアデノシン;2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;2’-O-メチルアデノシン;2’-O-リボシルアデノシン(リン酸);イソペンテニルアデノシン;N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン;N6,2’-O-ジメチルアデノシン;N6,2’-O-ジメチルアデノシン;N6,N6,2’-O-トリメチルアデノシン;N6,N6-ジメチルアデノシン;N6-アセチルアデノシン;N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;N6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;2-メチルアデノシン;2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン;7-デアザ-アデノシン;N1-メチル-アデノシン;N6,N6(ジメチル)アデニン;N6-cis-ヒドロキシ-イソペンテニル-アデノシン;α-チオ-アデノシン;2(アミノ)アデニン;2(アミノプロピル)アデニン;2(メチルチオ)N6(イソペンテニル)アデニン;2-(アルキル)アデニン;2-(アミノアルキル)アデニン;2-(アミノプロピル)アデニン;2-(ハロ)アデニン;2-(ハロ)アデニン;2-(プロピル)アデニン;2’-アミノ-2’-デオキシ-ATP;2’-アジド-2’-デオキシ-ATP;2’-デオキシ-2’-a-アミノアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-アジドアデノシンTP;6(アルキル)アデニン;6(メチル)アデニン;6-(アルキル)アデニン;6-(メチル)アデニン;7(デアザ)アデニン;8(アルケニル)アデニン;8(アルキニル)アデニン;8(アミノ)アデニン;8(チオアルキル)アデニン;8-(アルケニル)アデニン;8-(アルキル)アデニン;8-(アルキニル)アデニン;8-(アミノ)アデニン;8-(ハロ)アデニン;8-(ヒドロキシル)アデニン;8-(チオアルキル)アデニン;8-(チオール)アデニン;8-アジド-アデノシン;アザアデニン;デアザアデニン;N6(メチル)アデニン;N6-(イソペンチル)アデニン;7-デアザ-8-アザ-アデノシン;7-メチルアデニン;1-デアザアデノシンTP;2’フルオロ-N6-Bz-デオキシアデノシンTP;2’-OMe-2-アミノ-ATP;2’O-メチル-N6-Bz-デオキシアデノシンTP;2’-a-エチニルアデノシンTP;2-アミノアデニン;2-アミノアデノシンTP;2-アミノ-ATP;2’-a-トリフルオロメチルアデノシンTP;2-アジドアデノシンTP;2’-b-エチニルアデノシンTP;2-ブロモアデノシンTP;2’-b-トリフルオロメチルアデノシンTP;2-クロロアデノシンTP;2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-メルカプトアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-アミノアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-アジドアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-ブロモアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-クロロアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-フルオロアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-ヨードアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-メルカプトアデノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシアデノシンTP;2-フルオロアデノシンTP;2-ヨードアデノシンTP;2-メルカプトアデノシンTP;2-メトキシ-アデニン;2-メチルチオ-アデニン;2-トリフルオロメチルアデノシンTP;3-デアザ-3-ブロモアデノシンTP;3-デアザ-3-クロロアデノシンTP;3-デアザ-3-フルオロアデノシンTP;3-デアザ-3-ヨードアデノシンTP;3-デアザアデノシンTP;4’-アジドアデノシンTP;4’-炭素環式アデノシンTP;4’-エチニルアデノシンTP;5’-ホモ-アデノシンTP;8-アザ-ATP;8-ブロモ-アデノシンTP;8-トリフルオロメチルアデノシンTP;9-デアザアデノシンTP;2-アミノプリン;7-デアザ-2,6-ジアミノプリン;7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン;7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン;2,6-ジアミノプリン;7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン;2-チオシチジン;3-メチルシチジン;5-ホルミルシチジン;5-ヒドロキシメチルシチジン;5-メチルシチジン;N4-アセチルシチジン;2’-O-メチルシチジン;2’-O-メチルシチジン;5,2’-O-ジメチルシチジン;5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;リシジン;N4,2’-O-ジメチルシチジン;N4-アセチル-2’-O-メチルシチジン;N4-メチルシチジン;N4,N4-ジメチル-2’-OMe-シチジンTP;4-メチルシチジン;5-アザ-シチジン;シュード-イソ-シチジン;ピロロ-シチジン;α-チオ-シチジン;2-(チオ)シトシン;2’-アミノ-2’-デオキシ-CTP;2’-アジド-2’-デオキシ-CTP;2’-デオキシ-2’-a-アミノシチジンTP;2’-デオキシ-2’-a-アジドシチジンTP;3(デアザ)5(アザ)シトシン;3(メチル)シトシン;3-(アルキル)シトシン;3-(デアザ)5(アザ)シトシン;3-(メチル)シチジン;4,2’-O-ジメチルシチジン;5(ハロ)シトシン;5(メチル)シトシン;5(プロピニル)シトシン;5(トリフルオロメチル)シトシン;5-(アルキル)シトシン;5-(アルキニル)シトシン;5-(ハロ)シトシン;5-(プロピニル)シトシン;5-(トリフルオロメチル)シトシン;5-ブロモ-シチジン;5-ヨード-シチジン;5-プロピニルシトシン;6-(アゾ)シトシン;6-アザ-シチジン;アザシトシン;デアザシトシン;N4(アセチル)シトシン;1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン;1-メチル-シュードイソシチジン;2-メトキシ-5-メチル-シチジン;2-メトキシ-シチジン;2-チオ-5-メチル-シチジン;4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン;4-メトキシ-シュードイソシチジン;4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン;4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン;4-チオ-シュードイソシチジン;5-アザ-ゼブラリン;5-メチル-ゼブラリン;ピロロ-シュードイソシチジン;ゼブラリン;(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)シチジンTP;2,2’-アンヒドロ-シチジンTP塩酸塩;2’フルオロ-N4-Bz-シチジンTP;2’フルオロ-N4-アセチル-シチジンTP;2’-O-メチル-N4-アセチル-シチジンTP;2’O-メチル-N4-Bz-シチジンTP;2’-a-エチニルシチジンTP;2’-a-トリフルオロメチルシチジンTP;2’-b-エチニルシチジンTP;2’-b-トリフルオロメチルシチジンTP;2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロシチジンTP;2’-デオキシ-2’-a-メルカプトシチジンTP;2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アミノシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アジドシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ブロモシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-クロロシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-フルオロシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ヨードシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-メルカプトシチジンTP;2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシシチジンTP;2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)シチジンTP;3’-エチニルシチジンTP;4’-アジドシチジンTP;4’-炭素環式シチジンTP;4’-エチニルシチジンTP;5-(1-プロピニル)アラ-シチジンTP;5-(2-クロロ-フェニル)-2-チオシチジンTP;5-(4-アミノ-フェニル)-2-チオシチジンTP;5-アミノアリル-CTP;5-シアノシチジンTP;5-エチニルアラ-シチジンTP;5-エチニルシチジンTP;5’-ホモ-シチジンTP;5-メトキシシチジンTP;5-トリフルオロメチル-シチジンTP;N4-アミノ-シチジンTP;N4-ベンゾイル-シチジンTP;シュードイソシチジン;7-メチルグアノシン;N2,2’-O-ジメチルグアノシン;N2-メチルグアノシン;ワイオシン;1,2’-O-ジメチルグアノシン;1-メチルグアノシン;2’-O-メチルグアノシン;2’-O-リボシルグアノシン(リン酸);2’-O-メチルグアノシン;2’-O-リボシルグアノシン(リン酸);7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;7-シアノ-7-デアザグアノシン;アルカエオシン;メチルワイオシン;N2,7-ジメチルグアノシン;N2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;N2,N2,7-トリメチルグアノシン;N2,N2-ジメチルグアノシン;N2,7,2’-O-トリメチルグアノシン;6-チオ-グアノシン;7-デアザ-グアノシン;8-オキソ-グアノシン;N1-メチル-グアノシン;α-チオ-グアノシン;2(プロピル)グアニン;2-(アルキル)グアニン;2’-アミノ-2’-デオキシ-GTP;2’-アジド-2’-デオキシ-GTP;2’-デオキシ-2’-a-アミノグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-アジドグアノシンTP;6(メチル)グアニン;6-(アルキル)グアニン;6-(メチル)グアニン;6-メチル-グアノシン;7(アルキル)グアニン;7(デアザ)グアニン;7(メチル)グアニン;7-(アルキル)グアニン;7-(デアザ)グアニン;7-(メチル)グアニン;8(アルキル)グアニン;8(アルキニル)グアニン;8(ハロ)グアニン;8(チオアルキル)グアニン;8-(アルケニル)グアニン;8-(アルキル)グアニン;8-(アルキニル)グアニン;8-(アミノ)グアニン;8-(ハロ)グアニン;8-(ヒドロキシル)グアニン;8-(チオアルキル)グアニン;8-(チオール)グアニン;アザグアニン;デアザグアニン;N(メチル)グアニン;N-(メチル)グアニン;1-メチル-6-チオ-グアノシン;6-メトキシ-グアノシン;6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン;6-チオ-7-デアザ-グアノシン;6-チオ-7-メチル-グアノシン;7-デアザ-8-アザ-グアノシン;7-メチル-8-オキソ-グアノシン;N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン;N2-メチル-6-チオ-グアノシン;1-Me-GTP;2’フルオロ-N2-イソブチル-グアノシンTP;2’O-メチル-N2-イソブチル-グアノシンTP;2’-a-エチニルグアノシンTP;2’-a-トリフルオロメチルグアノシンTP;2’-b-エチニルグアノシンTP;2’-b-トリフルオロメチルグアノシンTP;2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオログアノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-メルカプトグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-アミノグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-アジドグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-ブロモグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-クロログアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-フルオログアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-ヨードグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-メルカプトグアノシンTP;2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシグアノシンTP;4
’-アジドグアノシンTP;4’-炭素環式グアノシンTP;4’-エチニルグアノシンTP;5’-ホモ-グアノシンTP;8-ブロモ-グアノシンTP;9-デアザグアノシンTP;N2-イソブチル-グアノシンTP;1-メチルイノシン;イノシン;1,2’-O-ジメチルイノシン;2’-O-メチルイノシン;7-メチルイノシン;2’-O-メチルイノシン;エポキシクエオシン;ガラクトシル-クエオシン;マンノシルクエオシン;クエオシン;アリアミノ-チミジン;アザチミジン;デアザチミジン;デオキシ-チミジン;2’-O-メチルウリジン;2-チオウリジン;3-メチルウリジン;5-カルボキシメチルウリジン;5-ヒドロキシウリジン;5-メチルウリジン;5-タウリノメチル-2-チオウリジン;5-タウリノメチルウリジン;ジヒドロウリジン;シュードウリジン;(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン;1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)シュードウリジン;1-メチルシュードウリジン;1-メチル-シュードウリジン;2’-O-メチルウリジン;2’-O-メチルシュードウリジン;2’-O-メチルウリジン;2-チオ-2’-O-メチルウリジン;3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン;3,2’-O-ジメチルウリジン;3-メチル-シュード-ウリジンTP;4-チオウリジン;5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン;5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル;5,2’-O-ジメチルウリジン;5,6-ジヒドロ-ウリジン;5-アミノメチル-2-チオウリジン;5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;5-カルバモイルメチルウリジン;5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;5-カルバモイルメチルウリジンTP;5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン;5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;5-メトキシカルボニルメチルウリジン;5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン;5-メチル-2-チオウリジン;5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-メチルアミノメチルウリジン;5-メチルジヒドロウリジン;5-オキシ酢酸-ウリジンTP;5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP;N1-メチル-シュード-ウリジン;ウリジン5-オキシ酢酸;ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP;5-プロピニルウラシル;α-チオ-ウリジン;1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル;1置換2(チオ)-シュードウラシル;1置換2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1置換4(チオ)シュードウラシル;1置換シュードウラシル;1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル;1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジンTP;1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP;1-メチル-シュード-UTP;2(チオ)シュードウラシル;2’デオキシウリジン;2’フルオロウリジン;2-(チオ)ウラシル;2,4-(ジチオ)シュードウラシル;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-グアノシン;2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP;2’-アジド-2’-デオキシ-UTP;2’-アジド-デオキシウリジンTP;2’-O-メチルシュードウリジン;2’デオキシウリジン;2’フルオロウリジン;2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP;2-メチルシュードウリジン;3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル;4(チオ)シュードウラシル;4-(チオ)シュードウラシル;4-(チオ)ウラシル;4-チオウラシル;5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル;5(2-アミノプロピル)ウラシル;5(アミノアルキル)ウラシル;5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル;5(グアニジニウムアルキル)ウラシル;5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル;5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル;5(メチル)2(チオ)ウラシル;5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル;5(メチル)4(チオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル;5(プロピニル)ウラシル;5(トリフルオロメチル)ウラシル;5-(2-アミノプロピル)ウラシル;5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル;5-(アルキル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル;5-(アルキル)-4(チオ)シュードウラシル;5-(アルキル)シュードウラシル;5-(アルキル)ウラシル;5-(アルキニル)ウラシル;5-(アリルアミノ)ウラシル;5-(シアノアルキル)ウラシル;5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル;5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル;5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル;5-(ハロ)ウラシル;5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル;5-(メトキシ)ウラシル;5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル;5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル;5-(メチル)2(チオ)ウラシル;5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル;5-(メチル)4(チオ)ウラシル;5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル;5-(メチル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル;5-(メチル)-4(チオ)シュードウラシル;5-(メチル)シュードウラシル;5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル;5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル;5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル;5-(プロピニル)ウラシル;5-(トリフルオロメチル)ウラシル;5-アミノアリル-ウリジン;5-ブロモ-ウリジン;5-ヨード-ウリジン;5-ウラシル;6(アゾ)ウラシル;6-(アゾ)ウラシル;6-アザ-ウリジン;アリアミノ-ウラシル;アザウラシル;デアザウラシル;N3(メチル)ウラシル;シュード-UTP-1-2-エタン酸;シュードウラシル;4-チオ-シュード-UTP;1-カルボキシメチル-シュードウリジン;1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン;1-プロピニル-ウリジン;1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン;1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン;1-タウリノメチル-シュードウリジン;2-メトキシ-4-チオ-シュードウリジン;2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン;2-チオ-1-メチル-シュードウリジン;2-チオ-5-アザ-ウリジン;2-チオ-ジヒドロシュードウリジン;2-チオ-ジヒドロウリジン;2-チオ-シュードウリジン;4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン;4-メトキシ-シュードウリジン;4-チオ-1-メチル-シュードウリジン;4-チオ-シュードウリジン;5-アザ-ウリジン;ジヒドロシュードウリジン;(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP;(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP;(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP;(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP;1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP;1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)シュードウリジンTP;1-(2,2-ジエトキシエチル)シュードウリジンTP;1-(2,4,6-トリメチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)シュード-UTP;1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)シュード-UTP;1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)シュード-UTP;1-(2-アミノ-エチル)シュード-UTP;1-(2-ヒドロキシエチル)シュードウリジンTP;1-(2-メトキシエチル)シュードウリジンTP;1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(3,4-ジメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP;1-(3-アミノ-プロピル)シュード-UTP;1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)シュードウリジンTP;1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-ブチル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-アジドベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ブロモベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-クロロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-フルオロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ヨードベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メタンスルホニルベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メトキシ-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-メトキシ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-メチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メチル-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-ニトロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ニトロ-ベンジル)シュード-UTP;1(4-ニトロ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-チオメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-トリフルオロメチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(5-アミノ-ペンチル)シュード-UTP;1-(6-アミノ-ヘキシル)シュード-UTP;1,6-ジメチル-シュード-UTP;1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]シュードウリジンTP;1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}シュードウリジンTP;1-アセチルシュードウリジンTP;1-アルキル-6-(1-プロピニル)-シュード-UTP;1-アルキル-6-(2-プロピニル)-シュード-UTP;1-アルキル-6-アリル-シュード-UTP;1-アルキル-6-エチニル-シュード-UTP;1-アルキル-6-ホモアリル-シュード-UTP;1-アルキル-6-ビニル-シュード-UTP;1-アリルシュードウリジンTP;1-アミノメチル-シュード-UTP;1-ベンゾイルシュードウリジンTP;1-ベンジルオキシメチルシュードウリジンTP;1-ベンジル-シュード-UTP;1-ビオチニル-PEG2-シュードウリジンTP;1-ビオチニルシュードウリジンTP;1-ブチル-シュード-UTP;1-シアノメチルシュードウ
リジンTP;1-シクロブチルメチル-シュード-UTP;1-シクロブチル-シュード-UTP;1-シクロヘプチルメチル-シュード-UTP;1-シクロヘプチル-シュード-UTP;1-シクロヘキシルメチル-シュード-UTP;1-シクロヘキシル-シュード-UTP;1-シクロオクチルメチル-シュード-UTP;1-シクロオクチル-シュード-UTP;1-シクロペンチルメチル-シュード-UTP;1-シクロペンチル-シュード-UTP;1-シクロプロピルメチル-シュード-UTP;1-シクロプロピル-シュード-UTP;1-エチル-シュード-UTP;1-ヘキシル-シュード-UTP;1-ホモアリルシュードウリジンTP;1-ヒドロキシメチルシュードウリジンTP;1-イソ-プロピル-シュード-UTP;1-Me-2-チオ-シュード-UTP;1-Me-4-チオ-シュード-UTP;1-Me-アルファ-チオ-シュード-UTP;1-メタンスルホニルメチルシュードウリジンTP;1-メトキシメチルシュードウリジンTP;1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)シュード-UTP;1-メチル-6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP;1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP;1-メチル-6-(置換フェニル)シュード-UTP;1-メチル-6-アミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-アジド-シュード-UTP;1-メチル-6-ブロモ-シュード-UTP;1-メチル-6-ブチル-シュード-UTP;1-メチル-6-クロロ-シュード-UTP;1-メチル-6-シアノ-シュード-UTP;1-メチル-6-ジメチルアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-エトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP;1-メチル-6-エチル-シュード-UTP;1-メチル-6-フルオロ-シュード-UTP;1-メチル-6-ホルミル-シュード-UTP;1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-ヒドロキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-ヨード-シュード-UTP;1-メチル-6-イソ-プロピル-シュード-UTP;1-メチル-6-メトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-メチルアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-フェニル-シュード-UTP;1-メチル-6-プロピル-シュード-UTP;1-メチル-6-tert-ブチル-シュード-UTP;1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-トリフルオロメチル-シュード-UTP;1-モルホリノメチルシュードウリジンTP;1-ペンチル-シュード-UTP;1-フェニル-シュード-UTP;1-ピバロイルシュードウリジンTP;1-プロパルギルシュードウリジンTP;1-プロピル-シュード-UTP;1-プロピニル-シュードウリジン;1-p-トリル-シュード-UTP;1-tert-ブチル-シュード-UTP;1-チオメトキシメチルシュードウリジンTP;1-チオモルホリノメチルシュードウリジンTP;1-トリフルオロアセチルシュードウリジンTP;1-トリフルオロメチル-シュード-UTP;1-ビニルシュードウリジンTP;2,2’-アンヒドロ-ウリジンTP;2’-ブロモ-デオキシウリジンTP;2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP;2’-OMe-5-Me-UTP;2’-OMe-シュード-UTP;2’-a-エチニルウリジンTP;2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP;2’-b-エチニルウリジンTP;2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP;2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP;2-メトキシ-4-チオ-ウリジン;2-メトキシウリジン;2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP;3-アルキル-シュード-UTP;4’-アジドウリジンTP;4’-炭素環式ウリジンTP;4’-エチニルウリジンTP;5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP;5-(2-フラニル)ウリジンTP;5-シアノウリジンTP;5-ジメチルアミノウリジンTP;5’-ホモ-ウリジンTP;5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP;5-フェニルエチニルウリジンTP;5-トリジュウテロメチル-6-ジュウテロウリジンTP;5-トリフルオロメチル-ウリジンTP;5-ビニルアラウリジンTP;6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP;6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP;6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP;6-(置換-フェニル)-シュード-UTP;6-アミノ-シュード-UTP;6-アジド-シュード-UTP;6-ブロモ-シュード-UTP;6-ブチル-シュード-UTP;6-クロロ-シュード-UTP;6-シアノ-シュード-UTP;6-ジメチルアミノ-シュード-UTP;6-エトキシ-シュード-UTP;6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP;6-エチル-シュード-UTP;6-フルオロ-シュード-UTP;6-ホルミル-シュード-UTP;6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP;6-ヒドロキシ-シュード-UTP;6-ヨード-シュード-UTP;6-イソ-プロピル-シュード-UTP;6-メトキシ-シュード-UTP;6-メチルアミノ-シュード-UTP;6-メチル-シュード-UTP;6-フェニル-シュード-UTP;6-フェニル-シュード-UTP;6-プロピル-シュード-UTP;6-tert-ブチル-シュード-UTP;6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP;6-トリフルオロメチル-シュード-UTP;アルファ-チオ-シュード-UTP;シュードウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP;シュードウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP;シュードウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸;シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル;シュード-UTP-N1-3-プロピオン酸;シュード-UTP-N1-4-ブタン酸;シュード-UTP-N1-5-ペンタン酸;シュード-UTP-N1-6-ヘキサン酸;シュード-UTP-N1-7-ヘプタン酸;シュード-UTP-N1-メチル-p-安息香酸;シュード-UTP-N1-p-安息香酸;ワイブトシン;ヒドロキシワイブトシン;イソワイオシン;ペルオキシワイブトシン;不十分修飾ヒドロキシワイブトシン;4-デメチルワイオシン;2,6-(ジアミノ)プリン;1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン;2(アミノ)プリン;2,4,5-(トリメチル)フェニル;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-シチジン;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-アデニン;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-ウリジン;2’-アミノ-2’-デオキシリボース;2-アミノ-6-クロロ-プリン;2-アザ-イノシニル;2’-アジド-2’-デオキシリボース;2’フルオロ-2’-デオキシリボース;2’-フルオロ修飾塩基;2’-O-メチル-リボース;2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル;2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル;2-ピリジノン;3ニトロピロール;3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル;3-(メチル)イソカルボスチリリル;4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール;4-(メチル)ベンゾイミダゾール;4-(メチル)インドリル;4,6-(ジメチル)インドリル;5ニトロインドール;5置換ピリミジン;5-(メチル)イソカルボスチリリル;5-ニトロインドール;6-(アザ)ピリミジン;6-(アゾ)チミン;6-(メチル)-7-(アザ)インドリル;6-クロロ-プリン;6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アザ)インドリル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)フェノキサジン-1-イル(phenoxazinl-yl);7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(プロピニル)イソカルボスチリリル;7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル;7-デアザ-イノシニル;7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;9-(メチル)-イミジゾピリジニル;アミノインドリル;アントラセニル;ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ジフルオロトリル;ヒポキサンチン;イミジゾピリジニル;イノシニル;イソカルボスチリリル;イソグアニシン;N2-置換プリン;N6-メチル-2-アミノ-プリン;N6-置換プリン;N-アルキル化誘導体;ナフタレニル(napthalenyl);ニトロベンゾイミダゾリル;ニトロイミダゾリル;ニトロインダゾリル;ニトロピラゾリル;ヌブラリン;O6-置換プリン;O-アルキル化誘導体;オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;オキソホルマイシンTP;パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ペンタセニル;フェナントラセニル;フェニル;プロピニル-7-(アザ)インドリル;ピレニル;ピリドピリミジン-3-
イル;ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル;ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ピロロピリミジニル;ピロロピリジニル;スチルベンジル;置換1,2,4-トリアゾール;テトラセニル;ツベルシジン;キサンチン;キサントシン-5’-TP;2-チオ-ゼブラリン;5-アザ-2-チオ-ゼブラリン;7-デアザ-2-アミノ-プリン;ピリジン-4-オンリボヌクレオシド;2-アミノ-リボシド-TP;ホルマイシンA TP;ホルマイシンB TP;ピロロシンTP;2’-OH-アラ-アデノシンTP;2’-OH-アラ-シチジンTP;2’-OH-アラ-ウリジンTP;2’-OH-アラ-グアノシンTP;5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP;およびN6-(19-アミノ-ペンタオキサノナデシル)アデノシンTP
’-アジドグアノシンTP;4’-炭素環式グアノシンTP;4’-エチニルグアノシンTP;5’-ホモ-グアノシンTP;8-ブロモ-グアノシンTP;9-デアザグアノシンTP;N2-イソブチル-グアノシンTP;1-メチルイノシン;イノシン;1,2’-O-ジメチルイノシン;2’-O-メチルイノシン;7-メチルイノシン;2’-O-メチルイノシン;エポキシクエオシン;ガラクトシル-クエオシン;マンノシルクエオシン;クエオシン;アリアミノ-チミジン;アザチミジン;デアザチミジン;デオキシ-チミジン;2’-O-メチルウリジン;2-チオウリジン;3-メチルウリジン;5-カルボキシメチルウリジン;5-ヒドロキシウリジン;5-メチルウリジン;5-タウリノメチル-2-チオウリジン;5-タウリノメチルウリジン;ジヒドロウリジン;シュードウリジン;(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン;1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)シュードウリジン;1-メチルシュードウリジン;1-メチル-シュードウリジン;2’-O-メチルウリジン;2’-O-メチルシュードウリジン;2’-O-メチルウリジン;2-チオ-2’-O-メチルウリジン;3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン;3,2’-O-ジメチルウリジン;3-メチル-シュード-ウリジンTP;4-チオウリジン;5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン;5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル;5,2’-O-ジメチルウリジン;5,6-ジヒドロ-ウリジン;5-アミノメチル-2-チオウリジン;5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;5-カルバモイルメチルウリジン;5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;5-カルバモイルメチルウリジンTP;5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン;5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;5-メトキシカルボニルメチルウリジン;5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン;5-メチル-2-チオウリジン;5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;5-メチルアミノメチルウリジン;5-メチルジヒドロウリジン;5-オキシ酢酸-ウリジンTP;5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP;N1-メチル-シュード-ウリジン;ウリジン5-オキシ酢酸;ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP;5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP;5-プロピニルウラシル;α-チオ-ウリジン;1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル;1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル;1(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル;1置換2(チオ)-シュードウラシル;1置換2,4-(ジチオ)シュードウラシル;1置換4(チオ)シュードウラシル;1置換シュードウラシル;1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル;1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジンTP;1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP;1-メチル-シュード-UTP;2(チオ)シュードウラシル;2’デオキシウリジン;2’フルオロウリジン;2-(チオ)ウラシル;2,4-(ジチオ)シュードウラシル;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-グアノシン;2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP;2’-アジド-2’-デオキシ-UTP;2’-アジド-デオキシウリジンTP;2’-O-メチルシュードウリジン;2’デオキシウリジン;2’フルオロウリジン;2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP;2-メチルシュードウリジン;3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル;4(チオ)シュードウラシル;4-(チオ)シュードウラシル;4-(チオ)ウラシル;4-チオウラシル;5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル;5(2-アミノプロピル)ウラシル;5(アミノアルキル)ウラシル;5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル;5(グアニジニウムアルキル)ウラシル;5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル;5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル;5(メチル)2(チオ)ウラシル;5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル;5(メチル)4(チオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル;5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル;5(プロピニル)ウラシル;5(トリフルオロメチル)ウラシル;5-(2-アミノプロピル)ウラシル;5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル;5-(アルキル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル;5-(アルキル)-4(チオ)シュードウラシル;5-(アルキル)シュードウラシル;5-(アルキル)ウラシル;5-(アルキニル)ウラシル;5-(アリルアミノ)ウラシル;5-(シアノアルキル)ウラシル;5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル;5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル;5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル;5-(ハロ)ウラシル;5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル;5-(メトキシ)ウラシル;5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル;5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル;5-(メチル)2(チオ)ウラシル;5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル;5-(メチル)4(チオ)ウラシル;5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル;5-(メチル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル;5-(メチル)-4(チオ)シュードウラシル;5-(メチル)シュードウラシル;5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル;5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル;5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル;5-(プロピニル)ウラシル;5-(トリフルオロメチル)ウラシル;5-アミノアリル-ウリジン;5-ブロモ-ウリジン;5-ヨード-ウリジン;5-ウラシル;6(アゾ)ウラシル;6-(アゾ)ウラシル;6-アザ-ウリジン;アリアミノ-ウラシル;アザウラシル;デアザウラシル;N3(メチル)ウラシル;シュード-UTP-1-2-エタン酸;シュードウラシル;4-チオ-シュード-UTP;1-カルボキシメチル-シュードウリジン;1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン;1-プロピニル-ウリジン;1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン;1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン;1-タウリノメチル-シュードウリジン;2-メトキシ-4-チオ-シュードウリジン;2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン;2-チオ-1-メチル-シュードウリジン;2-チオ-5-アザ-ウリジン;2-チオ-ジヒドロシュードウリジン;2-チオ-ジヒドロウリジン;2-チオ-シュードウリジン;4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン;4-メトキシ-シュードウリジン;4-チオ-1-メチル-シュードウリジン;4-チオ-シュードウリジン;5-アザ-ウリジン;ジヒドロシュードウリジン;(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP;(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP;(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP;(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP;(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP;1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP;1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)シュードウリジンTP;1-(2,2-ジエトキシエチル)シュードウリジンTP;1-(2,4,6-トリメチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)シュード-UTP;1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)シュード-UTP;1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)シュード-UTP;1-(2-アミノ-エチル)シュード-UTP;1-(2-ヒドロキシエチル)シュードウリジンTP;1-(2-メトキシエチル)シュードウリジンTP;1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(3,4-ジメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP;1-(3-アミノ-プロピル)シュード-UTP;1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)シュードウリジンTP;1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-ブチル)シュード-UTP;1-(4-アミノ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-アジドベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ブロモベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-クロロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-フルオロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ヨードベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メタンスルホニルベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メトキシ-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-メトキシ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-メチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-メチル-ベンジル)シュード-UTP;1-(4-ニトロベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-ニトロ-ベンジル)シュード-UTP;1(4-ニトロ-フェニル)シュード-UTP;1-(4-チオメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP;1-(4-トリフルオロメチルベンジル)シュードウリジンTP;1-(5-アミノ-ペンチル)シュード-UTP;1-(6-アミノ-ヘキシル)シュード-UTP;1,6-ジメチル-シュード-UTP;1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]シュードウリジンTP;1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}シュードウリジンTP;1-アセチルシュードウリジンTP;1-アルキル-6-(1-プロピニル)-シュード-UTP;1-アルキル-6-(2-プロピニル)-シュード-UTP;1-アルキル-6-アリル-シュード-UTP;1-アルキル-6-エチニル-シュード-UTP;1-アルキル-6-ホモアリル-シュード-UTP;1-アルキル-6-ビニル-シュード-UTP;1-アリルシュードウリジンTP;1-アミノメチル-シュード-UTP;1-ベンゾイルシュードウリジンTP;1-ベンジルオキシメチルシュードウリジンTP;1-ベンジル-シュード-UTP;1-ビオチニル-PEG2-シュードウリジンTP;1-ビオチニルシュードウリジンTP;1-ブチル-シュード-UTP;1-シアノメチルシュードウ
リジンTP;1-シクロブチルメチル-シュード-UTP;1-シクロブチル-シュード-UTP;1-シクロヘプチルメチル-シュード-UTP;1-シクロヘプチル-シュード-UTP;1-シクロヘキシルメチル-シュード-UTP;1-シクロヘキシル-シュード-UTP;1-シクロオクチルメチル-シュード-UTP;1-シクロオクチル-シュード-UTP;1-シクロペンチルメチル-シュード-UTP;1-シクロペンチル-シュード-UTP;1-シクロプロピルメチル-シュード-UTP;1-シクロプロピル-シュード-UTP;1-エチル-シュード-UTP;1-ヘキシル-シュード-UTP;1-ホモアリルシュードウリジンTP;1-ヒドロキシメチルシュードウリジンTP;1-イソ-プロピル-シュード-UTP;1-Me-2-チオ-シュード-UTP;1-Me-4-チオ-シュード-UTP;1-Me-アルファ-チオ-シュード-UTP;1-メタンスルホニルメチルシュードウリジンTP;1-メトキシメチルシュードウリジンTP;1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)シュード-UTP;1-メチル-6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP;1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP;1-メチル-6-(置換フェニル)シュード-UTP;1-メチル-6-アミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-アジド-シュード-UTP;1-メチル-6-ブロモ-シュード-UTP;1-メチル-6-ブチル-シュード-UTP;1-メチル-6-クロロ-シュード-UTP;1-メチル-6-シアノ-シュード-UTP;1-メチル-6-ジメチルアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-エトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP;1-メチル-6-エチル-シュード-UTP;1-メチル-6-フルオロ-シュード-UTP;1-メチル-6-ホルミル-シュード-UTP;1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-ヒドロキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-ヨード-シュード-UTP;1-メチル-6-イソ-プロピル-シュード-UTP;1-メチル-6-メトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-メチルアミノ-シュード-UTP;1-メチル-6-フェニル-シュード-UTP;1-メチル-6-プロピル-シュード-UTP;1-メチル-6-tert-ブチル-シュード-UTP;1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP;1-メチル-6-トリフルオロメチル-シュード-UTP;1-モルホリノメチルシュードウリジンTP;1-ペンチル-シュード-UTP;1-フェニル-シュード-UTP;1-ピバロイルシュードウリジンTP;1-プロパルギルシュードウリジンTP;1-プロピル-シュード-UTP;1-プロピニル-シュードウリジン;1-p-トリル-シュード-UTP;1-tert-ブチル-シュード-UTP;1-チオメトキシメチルシュードウリジンTP;1-チオモルホリノメチルシュードウリジンTP;1-トリフルオロアセチルシュードウリジンTP;1-トリフルオロメチル-シュード-UTP;1-ビニルシュードウリジンTP;2,2’-アンヒドロ-ウリジンTP;2’-ブロモ-デオキシウリジンTP;2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP;2’-OMe-5-Me-UTP;2’-OMe-シュード-UTP;2’-a-エチニルウリジンTP;2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP;2’-b-エチニルウリジンTP;2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP;2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP;2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP;2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP;2-メトキシ-4-チオ-ウリジン;2-メトキシウリジン;2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP;3-アルキル-シュード-UTP;4’-アジドウリジンTP;4’-炭素環式ウリジンTP;4’-エチニルウリジンTP;5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP;5-(2-フラニル)ウリジンTP;5-シアノウリジンTP;5-ジメチルアミノウリジンTP;5’-ホモ-ウリジンTP;5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP;5-フェニルエチニルウリジンTP;5-トリジュウテロメチル-6-ジュウテロウリジンTP;5-トリフルオロメチル-ウリジンTP;5-ビニルアラウリジンTP;6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP;6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP;6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP;6-(置換-フェニル)-シュード-UTP;6-アミノ-シュード-UTP;6-アジド-シュード-UTP;6-ブロモ-シュード-UTP;6-ブチル-シュード-UTP;6-クロロ-シュード-UTP;6-シアノ-シュード-UTP;6-ジメチルアミノ-シュード-UTP;6-エトキシ-シュード-UTP;6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP;6-エチル-シュード-UTP;6-フルオロ-シュード-UTP;6-ホルミル-シュード-UTP;6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP;6-ヒドロキシ-シュード-UTP;6-ヨード-シュード-UTP;6-イソ-プロピル-シュード-UTP;6-メトキシ-シュード-UTP;6-メチルアミノ-シュード-UTP;6-メチル-シュード-UTP;6-フェニル-シュード-UTP;6-フェニル-シュード-UTP;6-プロピル-シュード-UTP;6-tert-ブチル-シュード-UTP;6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP;6-トリフルオロメチル-シュード-UTP;アルファ-チオ-シュード-UTP;シュードウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP;シュードウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP;シュードウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸;シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸;シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル;シュード-UTP-N1-3-プロピオン酸;シュード-UTP-N1-4-ブタン酸;シュード-UTP-N1-5-ペンタン酸;シュード-UTP-N1-6-ヘキサン酸;シュード-UTP-N1-7-ヘプタン酸;シュード-UTP-N1-メチル-p-安息香酸;シュード-UTP-N1-p-安息香酸;ワイブトシン;ヒドロキシワイブトシン;イソワイオシン;ペルオキシワイブトシン;不十分修飾ヒドロキシワイブトシン;4-デメチルワイオシン;2,6-(ジアミノ)プリン;1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン;2(アミノ)プリン;2,4,5-(トリメチル)フェニル;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-シチジン;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-アデニン;2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルオロ-ウリジン;2’-アミノ-2’-デオキシリボース;2-アミノ-6-クロロ-プリン;2-アザ-イノシニル;2’-アジド-2’-デオキシリボース;2’フルオロ-2’-デオキシリボース;2’-フルオロ修飾塩基;2’-O-メチル-リボース;2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル;2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル;2-ピリジノン;3ニトロピロール;3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル;3-(メチル)イソカルボスチリリル;4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール;4-(メチル)ベンゾイミダゾール;4-(メチル)インドリル;4,6-(ジメチル)インドリル;5ニトロインドール;5置換ピリミジン;5-(メチル)イソカルボスチリリル;5-ニトロインドール;6-(アザ)ピリミジン;6-(アゾ)チミン;6-(メチル)-7-(アザ)インドリル;6-クロロ-プリン;6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(アザ)インドリル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)フェノキサジン-1-イル(phenoxazinl-yl);7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル;7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;7-(プロピニル)イソカルボスチリリル;7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル;7-デアザ-イノシニル;7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル;7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル;9-(メチル)-イミジゾピリジニル;アミノインドリル;アントラセニル;ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ジフルオロトリル;ヒポキサンチン;イミジゾピリジニル;イノシニル;イソカルボスチリリル;イソグアニシン;N2-置換プリン;N6-メチル-2-アミノ-プリン;N6-置換プリン;N-アルキル化誘導体;ナフタレニル(napthalenyl);ニトロベンゾイミダゾリル;ニトロイミダゾリル;ニトロインダゾリル;ニトロピラゾリル;ヌブラリン;O6-置換プリン;O-アルキル化誘導体;オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;オキソホルマイシンTP;パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ペンタセニル;フェナントラセニル;フェニル;プロピニル-7-(アザ)インドリル;ピレニル;ピリドピリミジン-3-
イル;ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル;ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル;ピロロピリミジニル;ピロロピリジニル;スチルベンジル;置換1,2,4-トリアゾール;テトラセニル;ツベルシジン;キサンチン;キサントシン-5’-TP;2-チオ-ゼブラリン;5-アザ-2-チオ-ゼブラリン;7-デアザ-2-アミノ-プリン;ピリジン-4-オンリボヌクレオシド;2-アミノ-リボシド-TP;ホルマイシンA TP;ホルマイシンB TP;ピロロシンTP;2’-OH-アラ-アデノシンTP;2’-OH-アラ-シチジンTP;2’-OH-アラ-ウリジンTP;2’-OH-アラ-グアノシンTP;5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP;およびN6-(19-アミノ-ペンタオキサノナデシル)アデノシンTP
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多く)の組合せを含む。
一部の実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン(ψ)、N1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、2-チオウリジン(s2U)、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、2’-O-メチルウリジン、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、α-チオ-グアノシン、α-チオ-アデノシン、5-シアノウリジン、4’-チオウリジン 7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、および2,6-ジアミノプリン、(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、2,8-ジメチルアデノシン、2-ゲラニルチオウリジン、2-リシジン、2-セレノウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-5,6-ジヒドロウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジン、3-メチルシュードウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)-2’-O-メチルウリジンメチルエステル、5-アミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-アミノメチル-2-セレノウリジン、5-アミノメチルウリジン、5-カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、5-カルバモイルメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-シアノメチルウリジン、5-ヒドロキシシチジン、5-メチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、7-アミノカルボキシプロピル-デメチルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、8-メチルアデノシン、N4,N4-ジメチルシチジン、N6-ホルミルアデノシン、N6-ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環状N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル-クエオシン、メチル化不十分修飾ヒドロキシワイブトシン、N4,N4,2’-O-トリメチルシチジン、ゲラニル化5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、ゲラニル化5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、Q塩基、preQ0塩基、preQ1塩基、およびこれらの2つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多く)の組合せを含む。1つの特定の実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、N1-メチルシュードウリジンである。
(i)塩基修飾
(i)塩基修飾
ある特定の実施形態では、化学的修飾は、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)の核酸塩基におけるものである。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基を含む。
一部の実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基は、シュードウラシル(ψ)、N1-メチルシュードウラシル(m1ψ)、2-チオウラシル(s2U)、4’-チオウラシル、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウラシル、2-チオ-1-メチル-シュードウラシル、2-チオ-5-アザ-ウラシル、2-チオ-ジヒドロシュードウラシル、2-チオ-ジヒドロウラシル、2-チオ-シュードウラシル、4-メトキシ-2-チオ-シュードウラシル、4-メトキシ-シュードウラシル、4-チオ-1-メチル-シュードウラシル、4-チオ-シュードウラシル、5-アザ-ウラシル、ジヒドロシュードウラシル、5-メチルウラシル、5-メトキシウラシル、2’-O-メチルウラシル、1-メチル-シュードウラシル(m1ψ)、5-メトキシ-ウラシル(mo5U)、5-メチル-シトシン(m5C)、α-チオ-グアニン、α-チオ-アデニン、5-シアノウラシル、4’-チオウラシル、7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデニン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデニン(m6A)、および2,6-ジアミノプリン、(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアニン、7-シアノ-7-デアザ-グアニン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアニン(preQ1)、7-メチル-グアニン(m7G)、1-メチル-グアニン(m1G)、8-オキソ-グアニン、7-メチル-8-オキソ-グアニン、およびこれらの2つまたはそれよりも多くの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の核酸塩基は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、化学的に修飾された核酸塩基は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のアデニンは、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のシトシンは、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド中のグアニンは、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、修飾された核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多く)の組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)における修飾された核酸塩基は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、シュードウリジン(ψ)、α-チオ-グアノシン、およびα-チオ-アデノシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾された核酸塩基のうちの少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多く)の組合せを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、シュードウリジン(ψ)および5-メチル-シチジン(m5C)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)および5-メチル-シチジン(m5C)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、2-チオウリジン(s2U)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、2-チオウリジンおよび5-メチル-シチジン(m5C)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、メトキシウリジン(mo5U)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)および5-メチル-シチジン(m5C)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、2’-O-メチルウリジンを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、2’-O-メチルウリジンおよび5-メチル-シチジン(m5C)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)および5-メチル-シチジン(m5C)を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、5-メチル-シチジン(m5C)で一様に修飾され得、これは、mRNA配列におけるすべてのシトシン残基が、5-メチル-シチジン(m5C)で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
一部の実施形態では、オープンリーディングフレームにおける化学的に修飾されるヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。修飾されたシトシンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、N4-アセチル-シチジン(ac4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、2-チオ-5-メチル-シチジンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウリジンである。修飾されたウリジンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、5-シアノウリジンまたは4’-チオウリジンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデニン(m6A)、および2,6-ジアミノプリンが挙げられる。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。修飾されたグアニンを有する核酸塩基およびヌクレオシドの例としては、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシンが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)における核酸塩基が修飾されたヌクレオチドは、5-メトキシウリジンである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、修飾された核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多く)の組合せを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチド)におけるある種類の核酸塩基(例えば、ウラシル)のうちの少なくとも95%が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするmRNAポリヌクレオチド)におけるウラシルのうちの少なくとも95%が、5-メトキシウラシルである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、5-メトキシウリジン(5mo5U)および5-メチル-シチジン(m5C)を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、RNAポリヌクレオチド、例えば、mRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾に関しては、一様に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体を通じて修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、5-メトキシウリジンで一様に修飾され得、これは、mRNA配列における実質的にすべてのウリジン残基が、5-メトキシウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について、上記に記載されるもののうちのいずれかなど、修飾された残基との置換えによって、一様に修飾され得る。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたシトシンである。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたウラシルである。修飾されたウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドは、5-メトキシウラシルを含む。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたアデニンである。
一部の実施形態では、修飾された核酸塩基は、修飾されたグアニンである。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中の核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの組合せは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%だけ化学的に修飾されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に開示されるサブユニットおよび異種ポリペプチドリンカーを含め、ヌクレオシドの間に任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物において有用なそのようなリンカーとしては、骨格修飾を含め、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない:3’-アルキレンホスホネート、3’-アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、-CH2-NH-CH2-、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレン(メチルイミノ)、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、-N(CH3)-CH2-CH2-、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、PNA、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシドおよびスルホン骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミデート。
(ii)糖修飾
(ii)糖修飾
ポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載されるRNAまたはmRNA)に組み込むことができる修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、構成ブロック分子)は、リボ核酸の糖に修飾され得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)が、修飾され得るか、またはいくつかの異なる置換基で置き換えられ得る。2’位における例示的な置換基としては、H、ハロ、任意に置換されるC1~6アルキル;任意に置換されるC1~6アルコキシ;任意に置換されるC6~10アリールオキシ;任意に置換されるC3~8シクロアルキル;任意に置換されるC3~8シクロアルコキシ;任意に置換されるC6~10アリールオキシ;任意に置換されるC6~10アリール-C1~6アルコキシ;任意に置換されるC1~12(ヘテロシクリル)オキシ;糖(例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載される任意のもの);ポリエチレングリコール(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR、ここで、Rは、Hまたは任意に置換されるアルキルであり、nは、0~20(例えば、0~4、0~8、0~10、0~16、1~4、1~8、1~10、1~16、1~20、2~4、2~8、2~10、2~16、2~20、4~8、4~10、4~16、および4~20)の整数である;2’-ヒドロキシルが、C1~6アルキレンまたはC1~6ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の4’-炭素に結合されている、「ロックド」核酸(LNA)、ここで、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含む;本明細書に定義されるアミノアルキル;本明細書に定義されるアミノアルコキシ;本明細書に定義されるアミノ;ならびに本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、RNAは、酸素を有する5員環である、糖基リボースを含む。例示的で非限定的な修飾されたヌクレオチドとしては、リボースにおける酸素の置換え(例えば、S、Se、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンでの);二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置き換えるため);リボースの環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタン4員環を形成するため);リボースの環拡大(例えば、ホスホロアミデート骨格も有する、例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびモルホリノのための、追加の炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成するため);多環式形態(例えば、トリシクロ;および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸(GNA)(例えば、R-GNAまたはS-GNA、リボースが、ホスホジエステル結合に結合したグリコール単位によって置き換えられる)、トレオース核酸(TNA、リボースが、α-L-トレオフラノシル-(3’→2’)で置き換えられる)、およびペプチド核酸(PNA、2-アミノ-エチル-グリシン結合が、リボースおよびホスホジエステル骨格を置き換える)が挙げられる。糖基はまた、リボースにおける対応する炭素のものとは逆の立体化学構造を有する、1つまたは複数の炭素を含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公開第WO2013052523号および同第WO2014093924号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(iii)修飾の組合せ
(iii)修飾の組合せ
本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Aポリペプチド、IL12Bポリペプチド、ならびに/あるいはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチド、またはそれらの機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組合せを含み得る。これらの組合せは、本明細書に記載される任意の1つまたは複数の修飾を含み得る。
修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドの組合せの例は、以下の表5に提供される。修飾されたヌクレオチドの組合せを使用して、本開示のポリヌクレオチドを形成することができる。別途示されない限り、修飾されたヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの天然のヌクレオチドを、完全に置換してもよい。非限定的な例として、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例では、天然のヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される修飾されたヌクレオシドのうちの少なくとも1つで、部分的に(例えば、約0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99.9%)置換され得るかまたは置き換えられ得る。塩基/糖またはリンカーの任意の組合せが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得、そのような修飾は、国際特許公開第WO2013052523号および同第WO2014093924号、ならびに米国公開第US20130115272号および同第US20150307542号に教示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
13.非翻訳領域(UTR)
13.非翻訳領域(UTR)
非翻訳領域(UTR)は、翻訳されない、開始コドンの前(5’UTR)および終止コドンの後(3’UTR)のポリヌクレオチドの核酸区画である。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12AとIL12Bとの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、本開示のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、さらに、UTR(例えば、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはこれらの組合せ)を含む。
UTRは、ポリヌクレオチドのコーディング領域に相同であっても異種であってもよい。一部の実施形態では、UTRは、IL12ポリペプチドをコードするORFに相同である。一部の実施形態では、UTRは、IL12ポリペプチドをコードするORFに対して異種である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの5’UTRまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つまたはそれよりも多くの3’UTRまたはその機能的断片を含み、これらのそれぞれは、同じかまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、配列最適化される。
一部の実施形態では、5’UTRもしくはその機能的断片、3’UTRもしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せは、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。
UTRは、制御上の役割、例えば、増大または減少した安定性、局在化、および/または翻訳効率を提供する、特徴を有し得る。UTRを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、1つまたは複数の制御上の特徴は、日常的な方法を使用して測定することができる。一部の実施形態では、5’UTRまたは3’UTRの機能的断片は、それぞれ、全長5’または3’UTRの1つまたは複数の制御上の特徴を含む。
天然の5’UTRは、翻訳開始において役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが、多数の遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に公知である、コザック配列のようなものを特徴としている。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGG(配列番号232)を有し、ここで、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流にあるプリン(アデニンまたはグアニン)であり、これには、別の「G」が続く。5’UTRはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することも公知である。
特定の標的器官の豊富に発現される遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性およびタンパク質産生を増強することができる。例えば、肝臓に発現されるmRNA、例えば、アルブミン、血清アミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第VIII因子の5’UTRの導入により、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、その組織における発現を改善するために他の組織特異的mRNAに由来する5’UTRを使用することが、筋肉(例えば、MyoD、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン)、内皮細胞(例えば、Tie-1、CD36)、ミエロイド細胞(例えば、C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)、白血球(例えば、CD45、CD18)、脂肪組織(例えば、CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)、ならびに肺上皮細胞(例えば、SP-A/B/C/D)に可能である。
一部の実施形態では、UTRは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有している転写産物のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、特定の細胞、組織において、または発達中の何らかの時点で、発現される、タンパク質のファミリーに属し得る(すなわち、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する)。遺伝子またはmRNAのいずれかに由来するUTRを、同じかまたは異なるタンパク質のファミリーの任意の他のUTRと交換して、新しいポリヌクレオチドを作製することができる。
一部の実施形態では、5’UTRおよび3’UTRは、異種であり得る。一部の実施形態では、5’UTRは、3’UTRとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、3’UTRは、5’UTRとは異なる種に由来し得る。
共同所有の国際特許出願第PCT/US2014/021522号(公開第WO/2014/164253号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ORFに隣接する領域として利用することができる例示的なUTRの一覧を提供する。
本出願の例示的なUTRとしては、グロビン、例えば、α-またはβ-グロビン(例えば、Xenopus、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン);強力なコザック翻訳開始シグナル;CYBA(例えば、ヒトシトクロムb-245 αポリペプチド);アルブミン(例えば、ヒトアルブミン7);HSD17B4(水酸化ステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ);ウイルス(例えば、タバコエッチ病ウイルス(TEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、CMV最初期1(IE1))、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス)、シンドビスウイルス、またはPAVオオムギ黄化萎縮ウイルス);熱ショックタンパク質(例えば、hsp70);翻訳開始因子(例えば、elF4G);グルコース輸送体(例えば、hGLUT1(ヒトグルコース輸送体1));アクチン(例えば、ヒトαまたはβアクチン);GAPDH;チューブリン;ヒストン;クエン酸回路酵素;トポイソメラーゼ(例えば、5’TOPモチーフ(オリゴピリミジントラクト)を欠くTOP遺伝子の5’UTR);リボソームタンパク質大型32(L32);リボソームタンパク質(例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、rps9など);ATPシンターゼ(例えば、ATP5A1またはミトコンドリアH+-ATPシンターゼのβサブユニット);成長ホルモンe(例えば、ウシ(bGH)またはヒト(hGH));伸長因子(例えば、伸長因子1 α1(EEF1A1));マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD);筋細胞エンハンサー因子2A(MEF2A);β-F1-ATPase、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF);コラーゲン(例えば、I型コラーゲンアルファ2(Col1A2)、I型コラーゲンアルファ1(Col1A1)、VI型コラーゲンアルファ2(Col6A2)、VI型コラーゲンアルファ1(Col6A1));リボフォリン(例えば、リボフォリンI(RPNI));低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(例えば、LRP1);カルジオトロフィン様サイトカイン因子(例えば、Nnt1);カルレティキュリン(Calr);プロコラーゲン-リジン、2-オキソグルタレート5-ジオキシゲナーゼ1(Plod1);ならびにヌクレオバインディン(例えば、Nucb1)の核酸配列に由来する1つまたは複数の5’UTRおよび/または3’UTRが挙げられるが、これらに限定されない。
他の例示的な5’および3’UTRとしては、Karikoら、Mol. Ther.、2008年、16巻(11号)、1833~1840頁;Karikoら、Mol. Ther.、2012年、20巻(5号)、948~953頁;Karikoら、Nucleic Acids Res.、2011年、39巻(21号):e142頁;Strongら、Gene Therapy、1997年、4巻、624~627頁;Hanssonら、J. Biol. Chem.、2015年、290巻(9号)、5661~5672頁;Yuら、Vaccine、2007年、25巻(10号)、1701~1711頁;Cafriら、Mol. Ther.、2015年、23巻(8号)、1391~1400頁;Andriesら、Mol. Pharm.、2012年、9巻(8号)、2136~2145頁;Crowleyら、Gene Ther.、2015年6月30日、doi:10.1038/gt.2015.68;Ramunasら、FASEB
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一部の実施形態では、5’UTRは、β-グロビン5’UTR;強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する5’UTR;シトクロムb-245 αポリペプチド(CYBA)5’UTR;水酸化ステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ(HSD17B4)5’UTR;タバコエッチ病ウイルス(TEV)5’UTR;ベネズエラウマ脳炎ウイルス(TEEV)5’UTR;非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス(RV)RNAの5’近位オープンリーディングフレーム;デング熱ウイルス(DEN)5’UTR;熱ショックタンパク質70(Hsp70)5’UTR;eIF4G 5’UTR;GLUT1 5’UTR;これらの機能的断片およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、3’UTRは、β-グロビン3’UTR;CYBA 3’UTR;アルブミン3’UTR;成長ホルモン(GH)3’UTR;VEEV 3’UTR;B型肝炎ウイルス(HBV)3’UTR;α-グロビン3’UTR;DEN 3’UTR;PAVオオムギ黄化萎縮ウイルス(BYDV-PAV)3’UTR;伸長因子1 α1(EEF1A1)3’UTR;マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)3’UTR;ミトコンドリアH(+)-ATPシンターゼのβサブユニット(β-mRNA)3’UTR;GLUT1 3’UTR;MEF2A 3’UTR;β-F1-ATPase 3’UTR;これらの機能的断片およびこれらの組合せからなる群から選択される。
他の例示的なUTRとしては、WO2014/164253に開示されているUTRのうちの1つまたは複数(UTRの任意の組合せを含む)が挙げられるがこれらに限定されず、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国仮出願第61/775,509号の表21および米国仮出願第61/829,372号の表22には、5’UTRおよび3’UTRの開始部位および終了部位の一覧が示されており、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表21では、それぞれの5’UTR(5’-UTR-005から5’-UTR 68511)は、その天然または野生型(相同)転写産物と比べた、その開始部位および終了部位により特定される(ENST、ENSEMBLデータベースにおいて使用される識別子)。
任意の遺伝子またはmRNAに由来する野生型UTRが、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。一部の実施形態では、UTRは、例えば、ORFに対するUTRの配向もしくは位置を変更することによって、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然のUTRに対して変化させて、バリアントUTRを産生することができる。一部の実施形態では、5’または3’UTRのバリアント、例えば、野生型UTRの変異体、または1つもしくは複数のヌクレオチドがUTRの末端に付加されたかもしくはそこから除去されたバリアントが、利用され得る。
加えて、1つまたは複数の合成UTRを、1つまたは複数の非合成UTRと組み合わせて使用してもよい。例えば、MandalおよびRossi、Nat. Protoc.、2013年、8巻(3号)、568~82頁(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、ならびにwww.addgene.org/Derrick_Rossi/(最終アクセス2016年4月16日)で入手可能な配列を参照されたい。UTRまたはその部分は、それらが選択された転写産物と同じ配向で配置されてもよく、または配向もしくは位置を変化させてもよい。したがって、5’および/または3’UTRは、逆転されるか、短くされるか、延長されるか、または1つもしくは複数の他の5’UTRもしくは3’UTRと組み合わされてもよい。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のUTR、例えば、二重、三重、または四重の5’UTRまたは3’UTRを含む。例えば、二重UTRは、直列または実質的に直列のいずれかで、同じUTRの2つのコピーを含む。例えば、二重ベータ-グロビン3’UTRを、使用することができる(US2010/0129877を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ある特定の実施形態では、本開示の5’UTRおよび/または3’UTR配列は、本明細書に開示の5’UTR配列のいずれかを含む5’UTR配列および/または本明細書に開示の3’UTR配列のいずれかを含む3’UTR配列、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、3’UTR配列は、3’UTRの機能を破壊することなく、1または複数のmiRNA結合部位、例えば、miR-122結合部位、またはその中の任意の他の異種ヌクレオチド配列を含む。miRNA結合部位を含む3’UTR配列のいくつかの例を、表6に列挙する。一部の実施形態では、3’UTR配列は、配列番号238~240からなる群から選択される配列に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3’UTR配列は、配列番号238に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3’UTR配列は、配列番号239に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3’UTR配列は、配列番号240に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
本開示のポリヌクレオチドは、特徴の組合せを含み得る。例えば、ORFには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む5’UTRおよび/またはポリ-A尾部の鋳型付加のためのオリゴ(dT)配列を含む3’UTRが、隣接していてもよい。5’UTRは、同じおよび/または異なるUTRに由来する第1のポリヌクレオチド断片および第2のポリヌクレオチド断片を含み得る(例えば、US2010/0293625を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
パターン型UTRを有することもまた、本開示の範囲内である。本明細書において使用されるとき、「パターン型UTR」には、反復または交互のパターン、例えば、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABC、または1回、2回、もしくは3回を上回って反復されるこれらのバリアントが含まれる。これらのパターンにおいて、それぞれの文字A、B、またはCは、異なるUTR核酸配列を表す。
他の非UTR配列を、本開示のポリヌクレオチド内の領域または部分領域として使用してもよい。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分が、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列の組込みにより、タンパク質の産生ならびにポリヌクレオチドの発現レベルを増大させることができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、UTRの代わりまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位(IRES)を含む(例えば、Yakubovら、Biochem. Biophys. Res. Commun.、2010年、394巻(1号)、189~193頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、それぞれ、非構造的タンパク質をコードする風疹ウイルス(RV)RNAの5’近位オープンリーディングフレームを含む、RVゲノムRNAの5’および/または3’末端と関連する5’および/または3’配列、またはその欠失誘導体を含む(例えば、Pogueら、J. Virol.、67巻(12号)、7106~7117頁を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。ウイルスキャプシド配列はまた、翻訳エンハンサー、例えば、キャプシド配列の5’部分として使用され得る(例えば、Sjobergら、Biotechnology (NY)、1994年、12巻(11号)、1127~1131頁ならびにFrolovおよびSchlesinger J. Virol.1996年、70巻(2号)、1182~1190頁に記載されるセムリキ森林ウイルスおよびシンドビスウイルスキャプシドRNA、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、5’UTR配列の代わりにIRESを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ORFおよびウイルスキャプシド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成5’UTRを、非合成3’UTRと組み合わせて含む。
一部の実施形態では、UTRはまた、少なくとも1つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、1つの翻訳エンハンサーエレメント、または複数の翻訳エンハンサーエレメント(集合的に、「TEE」、これは、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増大させる核酸配列を指す)を含み得る。非限定的な例として、TEEとしては、US2009/0226470(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるもの、および当技術分野において公知のその他のものが挙げられる。非限定的な例として、TEEは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置してもよい。一部の実施形態では、5’UTRは、TEEを含む。
一態様では、TEEは、核酸の翻訳活性、例えば、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を促進し得る、UTR内の保存されたエレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含め、14種にわたって示されている。例えば、Panekら、「An evolutionary conserved pattern of 18S rRNA sequence complementarity to mRNA
5’UTRs and its implications for eukaryotic gene translation regulation」、Nucleic
Acids Research、2013年、doi:10.1093/nar/gkt548を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
5’UTRs and its implications for eukaryotic gene translation regulation」、Nucleic
Acids Research、2013年、doi:10.1093/nar/gkt548を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
1つの非限定的な例では、TEEは、Gtxホメオドメインタンパク質の5’リーダーにおけるTEE配列を含む。Chappellら、PNAS、2004年、101巻、9590~9594頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
他の非限定的な例において、TEEは、US2009/0226470、US2013/0177581、およびWO2009/075886の配列番号1~35;WO2012/009644の配列番号1~5および7~645;ならびにWO1999/024595、US6310197、およびUS6849405の配列番号1の配列のうちの1つもしくは複数を有するTEEを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、TEEは、内部リボソーム進入部位(IRES)、HCV-IRES、またはIRES要素であり、例えば、これらに限定されないが、US7468275、US2007/0048776、US2011/0124100、WO2007/025008、およびWO2001/055369に記載されるもの;このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。IRES要素として、Chappellら、PNAS 2004 101:9590-9594、Zhouら、PNAS 2005 102:6273-6278、US2007/0048776、US2011/0124100、およびWO2007/025008によって記載されるようなGtx配列(例えば、Gtx9-nt、Gtx8-nt、Gtx7-nt)が挙げられ得るが、これらに限定されず、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」とは、本明細書において提供されるおよび/または当技術分野において公知のTEE(例えば、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、US2009/0226470、US2007/0048776、US2011/0124100、US2009/0093049、US2013/0177581、WO2009/075886、WO2007/025008、WO2012/009644、WO2001/055371、WO1999/024595、EP2610341A1、およびEP2610340A1を参照のこと、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)またはそれらのバリアント、ホモログ、もしくは機能的誘導体のうちの1つまたは複数を含むポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、TEEの1つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるTEEは、1つまたは複数の配列セグメント中に編成され得る。配列セグメントは、本明細書において提供されるTEEのうちの1つまたは複数を保有してよく、それぞれのTEEは、1つまたは複数のコピーで存在している。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、それらは、同種であっても異種であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書において提供される同一または異なる種類のTEE、同一または異なる数のそれぞれのTEEのコピー、ならびに/またはそれぞれの配列セグメント内で同一もしくは異なる編成のTEEを保有し得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、WO1999/024595、WO2001/055371、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、US2009/0226470、US2011/0124100、US2007/0048776、US2009/0093049、またはUS2013/0177581に開示される少なくとも1つのTEEまたはその部分を含み、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、US2009/0226470、US2007/0048776、US2013/0177581、US2011/0124100、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、Chappellら、PNAS 2004 101:9590-9594、Zhouら、PNAS 2005 102:6273-6278、ならびにWellensiekら、「Genome-wide profiling of humcap-independent translation-enhancing elements」、Nature Methods 2013、DOI:10.1038/NMETH.2522の補遺の表1および補遺の表2に開示されるTEEに少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%同一であるTEEを含み、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、US2009/0226470、US2007/0048776、US2013/0177581、US2011/0124100、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、Chappellら、PNAS 2004 101:9590-9594、Zhouら、PNAS 2005 102:6273-6278、ならびにWellensiekら、「Genome-wide profiling of humcap-independent translation-enhancing elements」、Nature Methods 2013、DOI:10.1038/NMETH.2522の補遺の表1および補遺の表2に開示されるTEE配列の5~30ヌクレオチド断片、5~25ヌクレオチド断片、5~20ヌクレオチド断片、5~15ヌクレオチド断片、または5~10ヌクレオチド断片(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドの断片)から選択されるTEEを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、US7456273、US7183395、US2009/0093049、およびWO2001/055371のいずれかに記載されている転写制御エレメントであるTEEを含み、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。転写制御エレメントは、US7456273、US7183395、US2009/0093049、およびWO2001/055371に記載されている方法などであるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法によって特定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも1つのTEEを含む5’UTRおよび/または3’UTRは、モノシストロニック配列、例えば、限定されないが、ベクター系または核酸ベクターに組み込まれ得る。非限定的な例として、ベクター系および核酸ベクターとして、US7456273、US7183395、US2007/0048776、US2009/0093049、US2011/0124100、WO2007/025008、およびWO2001/055371に記載されるものが挙げられ得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、本明細書に記載のTEEまたはその部分を含む。一部の実施形態では、3’UTR中のTEEは、5’UTRに位置するTEEと同じであってもよいし、異なっていてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55または60より多くのTEE配列を含み得る。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRは、1~60、1~55、1~50、1~45、1~40、1~35、1~30、1~25、1~20、1~15、1~10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1つのTEE配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチドの5’UTRにおけるTEE配列は、同じまたは異なるTEE配列であり得る。本開示のポリヌクレオチドの5’UTRにおける異なるTEE配列の組合せには、異なるTEE配列のうちのいずれかの1より多くのコピーが組み込まれた組合せが含まれ得る。TEE配列は、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABC、または1回、2回、3回、もしくは3回を上回って反復されるこれらのバリアントなどのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、それぞれの文字A、B、またはCは、異なるTEEヌクレオチド配列を表す。
一部の実施形態では、TEEは、US2007/0048776、US2011/0124100、WO2007/025008、WO2012/009644に記載される方法によって特定することができ、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、5’UTRおよび/または3’UTRは、2つのTEE配列を分離するためのスペーサーを含む。非限定的な例としては、スペーサーは、15ヌクレオチドのスペーサーおよび/または当技術分野において公知のその他のスペーサーであり得る。他の非限定な例として、5’UTRおよび/または3’UTRは、5’UTRおよび/または3’UTRにおいて、それぞれ、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、または10回より多く反復されるTEE配列-スペーサーモジュールを含む。一部の実施形態では、5’UTRおよび/または3’UTRは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回反復されるTEE配列-スペーサーモジュールを含む。
一部の実施形態では、2つのTEE配列を分離するスペーサーは、本開示のポリヌクレオチドの翻訳を制御することができる、当技術分野において公知の他の配列、例えば、本明細書に記載されるmiR配列(例えば、miR結合部位およびmiRシード)を含み得る。非限定的な例として、2つのTEE配列を分離するために使用されるそれぞれのスペーサーは、異なるmiR配列またはmiR配列の構成要素(例えば、miRシード配列)を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、miRおよび/またはTEE配列を含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドへのmiR配列および/またはTEE配列の組込みにより、ステムループ領域の形状を変化させることができ、これにより、翻訳を増大および/または減少させることができる。例えば、Keddeら、Nature Cell Biology、2010年、12巻(10号)、1014~20頁を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
14.マイクロRNA(miRNA)結合部位
14.マイクロRNA(miRNA)結合部位
センサー配列としては、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列および/もしくはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬受容体として作用するように操作された人工的結合部位、ならびにこれらの組合せが挙げられる。センサー配列の非限定的な例は、米国公開第2014/0200261号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む本開示のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、センサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、センサー配列は、miRNA結合部位である。
miRNAは、19~25ヌクレオチドの長さの非コーディングRNAであり、ポリヌクレオチドに結合し、遺伝子発現を、安定性を低減させることまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって、下方制御する。miRNA配列は、「シード」領域、すなわち、成熟miRNAの2~8位の領域内の配列を含む。miRNAシードは、成熟miRNAの2~8または2~7位を含み得る。一部の実施形態では、miRNAシードは、7ヌクレオチド(例えば、成熟miRNAのヌクレオチド2~8)を含み得、ここで、対応するmiRNA結合部位におけるシード相補的部位は、miRNA 1位に対向するアデノシン(A)が隣接している。一部の実施形態では、miRNAシードは、6ヌクレオチド(例えば、成熟miRNAのヌクレオチド2~7)を含み得、ここで、対応するmiRNA結合部位におけるシード相補的部位は、miRNA 1位に対向するアデノシン(A)が隣接している。例えば、Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell.、2007年7月6日、27巻(1号)、91~105頁を参照されたい。標的細胞または組織のmiRNAプロファイリングを行って、細胞または組織におけるmiRNAの存在または不在を判定することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、1つまたは複数のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNAシードを含む。そのような配列は、米国公開第US2005/0261218号および米国公開第US2005/0059005号において教示されているものなど、任意の公知のマイクロRNAに対応し得、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用されるとき、「マイクロRNA(miRNAまたはmiR)結合部位」という用語は、miRNAと相互作用または会合または結合するのに十分な、miRNAのすべてまたは領域に対する相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、DNA内、または5’UTRおよび/もしくは3’UTRを含めたRNA転写産物内の配列を指す。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするORFを含む、本開示のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))の5’UTRおよび/または3’UTRは、miRNA結合部位を含む。
miRNAに対して十分な相補性を有するmiRNA結合部位とは、miRNAに媒介されるポリヌクレオチドの制御、例えば、miRNAに媒介されるポリヌクレオチドの転写抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、miRNAに対して十分な相補性を有するmiRNA結合部位とは、miRNAに媒介されるポリヌクレオチドの分解、例えば、miRNAに先導されるRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に媒介されるmRNAの切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。miRNA結合部位は、例えば、19~25ヌクレオチドのmiRNA配列、19~23ヌクレオチドのmiRNA配列、または22ヌクレオチドのmiRNA配列に対して相補性を有し得る。miRNA結合部位は、miRNAの一部分にのみ、例えば、天然に存在するmiRNA配列の全長の1、2、3、または4ヌクレオチド未満の一部分にのみ、相補的であってもよい。所望される制御が、mRNA分解である場合には、十分または完全な相補性(例えば、天然に存在するmiRNAの長さのすべてまたは有意な部分にわたる、十分な相補性または完全な相補性)が、好ましい。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列との相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列との相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列との完全な相補性を有するが、1つ、2つ、または3つのヌクレオチド置換、末端付加、および/または短縮を除く。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAと同じ長さである。他の実施形態では、miRNA結合部位は、5’末端、3’末端、またはその両方において、対応するmiRNAよりも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロRNA結合部位は、5’末端、3’末端、またはその両方において、対応するマイクロRNAよりも2ヌクレオチド短い。対応するmiRNAよりも短いmiRNA結合部位は、依然として、miRNA結合部位のうちの1つもしくは複数を組み込むmRNAを分解すること、またはmRNAの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、ダイサーを含有する活性なRISCの一部である対応する成熟miRNAに結合する。別の実施形態では、miRNA結合部位がRISC内の対応するmiRNAに結合することにより、miRNA結合部位を含有するmRNAが分解されるか、またはmRNAが翻訳されるのが予防される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、miRNAに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAとは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個のミスマッチを有する。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、それぞれ、対応するmiRNAの少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、または少なくとも約21の連続したヌクレオチドに対して相補的な、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、または少なくとも約21の連続したヌクレオチドを有する。
本開示のポリヌクレオチドに1つまたは複数のmiRNA結合部位を操作することにより、ポリヌクレオチドは、分解の標的となるか翻訳が低減され得るが、ただし、問題のmiRNAが利用可能であることを条件とする。これにより、ポリヌクレオチドを送達したときの標的外作用が低減され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達することを意図していなかったにもかかわらずそこに到達してしまった場合でも、miRNAの1つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの5’UTRおよび/または3’UTRに操作しておけば、組織または細胞において豊富なmiRNAにより、目的の遺伝子の発現を阻害することが可能である。
逆に、miRNA結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増大させるために、それらが天然に存在しているポリヌクレオチド配列から除去してもよい。例えば、特定のmiRNAの結合部位を、ポリヌクレオチドから除去して、そのmiRNAを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性mRNA治療薬を、正常細胞および/またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、5’UTRおよび/または3’UTRに少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性mRNA治療薬を、正常細胞および/またはがん性細胞などであるがこれらに限定されない特定の細胞に指向するために、5’-UTRおよび/または3’-UTRに、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多いmiRNA結合部位を含み得る。
複数の組織における発現の制御は、1つまたは複数のmiRNA結合部位の導入または除去を通じて達成することができる。miRNA結合部位を除去するかまたは挿入するかの決定は、疾患におけるmiRNA発現パターンおよび/またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。miRNA、miRNA結合部位、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割の特定が、報告されている(例えば、Bonauerら、Curr Drug Targets、2010年、11巻、943~949頁;AnandおよびCheresh、Curr Opin Hematol、2011年、18巻、171~176頁;ContrerasおよびRao、Leukemia、2012年、26巻、404~413頁(2011年12月20日、doi:10.1038/leu.2011.356);Bartel、Cell、2009年、136巻、215~233頁;Landgrafら、Cell、2007年、129巻、1401~1414頁;GentnerおよびNaldini、Tissue Antigens.、2012年、80巻、393~403頁およびその中のすべての参考文献;これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
miRNAおよびmiRNA結合部位は、米国公開第2014/0200261号、同第2005/0261218号、および同第2005/0059005号に記載されている非限定的な例を含め、任意の公知の配列に対応し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
miRNAが、mRNAを制御し、それによってタンパク質の発現を制御することが公知である組織の例としては、肝臓(miR-122)、筋肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮細胞(miR-17-92、miR-126)、ミエロイド細胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪組織(let-7、miR-30c)、心臓(miR-1d、miR-149)、腎臓(miR-192、miR-194、miR-204)、および肺上皮細胞(let-7、miR-133、miR-126)が挙げられるがこれらに限定されない。
一部のマイクロRNA、例えば、miR-122は、正常組織において豊富であるが、がんまたは腫瘍組織においてははるかに低いレベルで存在する。したがって、マイクロRNA標的配列(すなわち、マイクロRNA結合部位)を、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、3’UTRなどの領域または他の領域)に操作することにより、正常組織(マイクロRNAが豊富である)における分解または翻訳の低減のために有効に分子を標的とし、同時に、がんまたは腫瘍組織(マイクロRNAがはるかに低いレベルで存在する)における高いレベルの翻訳を提供することができる。これにより、本開示の方法および組成物に、腫瘍標的化アプローチが提供される。
本開示に有用であり得るmiRNA結合部位のさらなる例として、免疫細胞特異的miRNAが挙げられ、これには、これらに限定されないが、hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p,miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p,miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p,、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p、およびmiR-99b-5pが挙げられる。さらに、新規のmiRNAは、マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびマイクロトーム(microtome)分析(例えば、Jima DDら、Blood、2010、116:e118-e127;Vaz Cら、BMC Genomics、2010、11,288、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。)によって免疫細胞において特定することができる。
肝臓において発現されることが公知であるmiRNAとして、miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p、およびmiR-939-5pが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的miRNA結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
肺において発現されることが公知であるmiRNAとして、let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p、およびmiR-381-5pが挙げられるが、これらに限定されない。任意の肺特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて肺におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的miRNA結合部位は、単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
心臓において発現されることが公知であるmiRNAとして、miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p、およびmiR-92b-5pが挙げられるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて心臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的miRNA結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
神経系において発現されることが公知であるmiRNAとして、miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p,miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p,miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p、およびmiR-9-5pが挙げられるが、これらに限定されない。神経系において富化されるmiRNAとして、これらに限定されないが、miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922を含むニューロンにおいて特異的に発現されるもの、ならびにこれらに限定されないが、miR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p、およびmiR-657を含むグリア細胞において特異的に発現されるものがさらに上げられる。任意のCNS特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて神経系におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的miRNA結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
膵臓において発現されることが公知であるmiRNAとして、miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p、およびmiR-944が挙げられるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的miRNA結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
腎臓において発現されることが公知であるmiRNAとして、miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p、およびmiR-562が挙げられるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的miRNA結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
筋肉において発現されることが公知であるmiRNAとして、let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p、およびmiR-25-5pが挙げられるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて筋肉におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的miRNA結合部位単独で、または本開示のポリヌクレオチド免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作することができる。
miRNAは、また、異なる種類の細胞、例えば、これらに限定されないが、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞において、差示的に発現される。
内皮細胞において発現されることが公知であるmiRNAとして、let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p、およびmiR-92b-5pが挙げられるが、これらに限定されない。多数の新規なmiRNAが、ディープシークエンシング分析から内皮細胞において発見されている(例えば、Voellenkle Cら、RNA、2012、18、472-484、その全体が参照として本明細書に組み込まれる)。任意の内皮細胞特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
上皮細胞において発現されることが公知であるmiRNAとして、呼吸線毛上皮細胞において特異的なlet-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802およびmiR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、miR-449b-5p、肺上皮細胞において特異的なlet-7ファミリー、miR-133a、miR-133b、miR-126、腎臓上皮細胞において特異的なmiR-382-3p、miR-382-5p、および角膜上皮細胞において特異的なmiR-762が挙げられるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的miRNAからのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドに導入されまたはから除去されて上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
加えて、広範なmiRNA群が、胚性幹細胞において豊富であり、幹細胞の自己再生ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、および筋肉細胞などの様々な細胞系統の発生および/または分化を調節している(例えば、Kuppusamy KTら、Curr.Mol Med、2013、13(5)、757-764;Vidigal JAおよびVentura A、Semin Cancer Biol.2012、22(5-6)、428-436;Goff LAら、PLoS One、2009、4:e7192;Morin RDら、Genome Res,2008,18、610-621;Yoo JKら、Stem Cells Dev.2012、21(11)、2049-2057、これらのそれぞれは、その全体が参考として本明細書に組み込まれる)。胚性幹細胞において豊富なmiRNAとして、let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p,miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941,miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3pおよびmiR-99b-5pが挙げられるが、これらに限定されない。多くの予測される新規なmiRNAは、ヒト胚性幹細胞においてディープシークエンシングによって発見されている(例えば、Morin RDら、Genome Res,2008,18、610-621;Goff LAら、PLoS One、2009、4:e7192;Bar Mら、Stem細胞、2008、26、2496-2505、このそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。)。
一実施形態では、胚性幹細胞の発生および/もしくは分化を調節するため、変性状態(例えば、変性疾患)における幹細胞の老化を阻害するため、または疾患状態における幹細胞(例えば、がん幹細胞)の老化およびアポトーシスを刺激するために、胚性幹細胞に特異的なmiRNAの結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRに含まれてもよく、またはそこから除去されてもよい。
多くのmiRNA発現に関する研究は、様々ながん細胞/組織および他の疾患におけるmiRNAの差次的発現をプロファイリングするために行われている。一部のmiRNAは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、miRNAは、がん細胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294);がん幹細胞(US2012/0053224);膵臓がんおよび疾患(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210);喘息および炎症(US8415096);前立腺がん(US2013/0053264号);肝細胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538);肺がん細胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357);皮膚T細胞性リンパ腫(WO2013/011378);結腸直腸がん細胞(WO2011/0281756、WO2011/076142);がん陽性リンパ節(WO2009/100430、US2009/0263803);上咽頭癌(EP2112235);慢性閉塞性肺疾患(US2012/0264626、US2013/0053263);甲状腺がん(WO2013/066678);卵巣がん細胞(US2012/0309645、WO2011/095623);乳がん細胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病およびリンパ腫(WO2008/073915、US2009/0092974号、同第US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)において、差次的に発現される。
非限定的な例として、ある特定のがんおよび/または腫瘍細胞において過剰発現されるmiRNAのmiRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRから除去され、がん細胞において過剰発現されるmiRNAによって抑制されていた発現を回復させ、それによって、対応する生物学的機能、例えば、転写の刺激および/または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、ならびに細胞死を緩和することができる。miRNAの発現が上方制御されていない正常な細胞および組織は、影響を受けない。
miRNAはまた、血管新生など、複雑な生物学的プロセスを制御し得る(例えば、miR-132)(AnandおよびCheresh、Curr Opin Hematol、2011年、18巻、171~176頁)。本開示のポリヌクレオチドでは、そのようなプロセスに関与するmiRNA結合部位は、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的プロセスに合わせてポリヌクレオチドの発現を調整するために、除去または導入され得る。この文脈において、本開示のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
一部の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、miRNA(例えば、miR-122)に対して完全に相補的であり、それによって、miRNA結合部位に融合したmRNAを分解する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAに対して完全に相補的ではない。ある特定の実施形態では、miRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、対応するmiRNA(例えば、miR-122)と同じ長さである。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、またはその両方において、対応するマイクロRNA(例えば、22ヌクレオチドを有するmiR-122)よりも1ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より2ヌクレオチド短い。なお他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より3ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より4ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より5ヌクレオチド短い。一部の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端、3’末端、または両方において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より6ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より7ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より8ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より9ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より10ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より11ヌクレオチド短い。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、5’末端または3’末端において対応するマイクロRNA(例えば、miR-122)より12ヌクレオチド短い。対応するmiRNAよりも短いmiRNA結合部位は、依然として、miRNA結合部位のうちの1つもしくは複数を組み込むmRNAを分解すること、またはmRNAの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、miRNA(例えば、miR-122)を含むRISC複合体が、マイクロRNA結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、miRNA(例えば、miR-122)に対する十分な相補性を有する。他の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、miRNA(例えば、miR-122)を含むRISC複合体が、マイクロRNA結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、マイクロRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、miRNA(例えば、miR-122)を含むRISC複合体が、マイクロRNA結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。一実施形態では、miRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、対応するmiRNA(例えば、miR-122)から1個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから2個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから3個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから4個のミスマッチを有する。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから5個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから6個のミスマッチを有する。ある特定の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから7個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから8個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから9個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから10個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから11個のミスマッチを有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAから12個のミスマッチを有する。
ある特定の実施形態では、miRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、対応するmiRNA(例えば、miR-122)の少なくとも約10の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約10の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約11の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約11の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約12の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約12の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約13の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約13の連続したヌクレオチド、または対応するmiRNAの少なくとも約14の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約14の連続したヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAの少なくとも約15の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約15の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約16の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約16の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約17の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約17の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約18の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約18の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約19の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約19の連続したヌクレオチド、対応するmiRNAの少なくとも約20の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約20の連続したヌクレオチド、または対応するmiRNAの少なくとも約21の連続したヌクレオチドに相補的な少なくとも約21の連続したヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12BとIL12Aとの融合ポリペプチド、ならびに少なくとも1のmiR-122結合部位、少なくとも2のmiR-122結合部位、少なくとも3のmiR-122結合部位、少なくとも4のmiR-122結合部位、または少なくとも5のmiR-122結合部位をコードするmRNAを含む。一態様では、miRNA結合部位は、miR-122に結合するか、またはmiR-122に相補的である。別の態様では、miRNA結合部位は、miR-122-3pまたはmiR-122-5pに結合する。特定の態様では、miRNA結合部位は、配列番号52または54に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは100%同一であるヌクレオチド配列を含み、miRNA結合部位はmiR-122に結合する。特定の態様では、miRNA結合部位は、配列番号52または54に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、miRNA結合部位は、miR-122に結合する。別の特定の態様では、miRNA結合部位は、配列番号54に少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一であるヌクレオチド配列を含み、ここで、miRNA結合部位は、miR-122に結合する。これらの配列を、以下の表7に示す。
一部の実施形態では、miRNA結合部位(例えば、miR-122結合部位)は、ポリヌクレオチドの任意の位置(例えば、3’UTR)において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入が、対応するmiRNA(例えば、miR-122)の不在下において、機能的IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、miRNA(例えば、miR-122)の存在下においては、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入およびmiRNA結合部位の対応するmiRNAへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。一実施形態では、miRNA結合部位は、ポリヌクレオチドの3’UTRに挿入される。
ある特定の実施形態では、miRNA結合部位は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12BとIL12A融合とのポリペプチドをコードするmRNAの終止コドンから少なくとも約30ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、miRNA結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12BとIL12Aとの融合ポリペプチドをコードするmRNAの終止コドンから少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約35ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約45ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約55ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約65ヌクレオチド、少なくとも約70ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、少なくとも約80ヌクレオチド、少なくとも約85ヌクレオチド、少なくとも約90ヌクレオチド、少なくとも約95ヌクレオチド、または少なくとも約100ヌクレオチド内の下流に挿入される。他の実施形態では、miRNA結合部位は、ポリヌクレオチド、例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12BとIL12Aとの融合ポリペプチドをコードするmRNAの終止コドンから約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、約20ヌクレオチド~約90ヌクレオチド、約30ヌクレオチド~約80ヌクレオチド、約40ヌクレオチド~約70ヌクレオチド、約50ヌクレオチド~約60ヌクレオチド、約45ヌクレオチド~約65ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、本明細書に開示されるIL12ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、本明細書に開示される膜ドメインをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、本明細書に開示される異種ポリペプチドをコードする核酸配列中の終止コドンの下流に挿入される。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置(例えば、5’UTRおよび/または3’UTR)において、本開示のポリヌクレオチドに挿入される。一部の実施形態では、5’UTRは、miRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、3’UTRは、miRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、5’UTRおよび3’UTRは、miRNA結合部位を含む。ポリヌクレオチドにおける挿入部位は、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入が、対応するmiRNAの不在下において、機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、ポリヌクレオチドのいずれの場所であってもよく、miRNAの存在下においては、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入およびmiRNA結合部位の対応するmiRNAへの結合は、ポリヌクレオチドを分解することまたはポリヌクレオチドの翻訳を予防することが可能である。
一部の実施形態では、miRNA結合部位は、ORFを含む本開示のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから少なくとも約30ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約35ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約45ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約55ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約65ヌクレオチド、少なくとも約70ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、少なくとも約80ヌクレオチド、少なくとも約85ヌクレオチド、少なくとも約90ヌクレオチド、少なくとも約95ヌクレオチド、または少なくとも約100ヌクレオチド内の下流に挿入される。一部の実施形態では、miRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、約20ヌクレオチド~約90ヌクレオチド、約30ヌクレオチド~約80ヌクレオチド、約40ヌクレオチド~約70ヌクレオチド、約50ヌクレオチド~約60ヌクレオチド、約45ヌクレオチド~約65ヌクレオチド内の下流に挿入される。
miRNA遺伝子制御は、周囲配列の種、配列の種類(例えば、異種、相同、外因性、内因性、もしくは人工的)、周囲配列における制御エレメント、ならびに/または周囲配列における構造エレメントなどであるがこれらに限定されない、miRNAの周囲の配列によって、影響を受け得る。miRNAは、5’UTRおよび/または3’UTRによって影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト3’UTRは、同じ配列型のヒト3’UTRと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するmiRNA配列の制御効果を増大させ得る。
一実施形態では、5’UTRの他の制御エレメントおよび/または構造エレメントは、miRNAに媒介される遺伝子制御に影響を及ぼし得る。制御エレメントおよび/または構造エレメントの1つの例は、5’UTRにおける構造化IRES(内部リボソーム進入部位)であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。EIF4A2が、5’-UTRにおけるこの二次構造化エレメントに結合することが、miRNAに媒介される遺伝子発現には必要である(Meijer HAら、Science、2013年、340巻、82~85頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。本開示のポリヌクレオチドは、マイクロRNAに媒介される遺伝子制御を増強するために、構造化5’UTRをさらに含み得る。
少なくとも1つのmiRNA結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRに操作され得る。この文脈において、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、またはそれよりも多いmiRNA結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRに操作されてもよい。例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、2、または1のmiRNA結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRに操作されてもよい。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるmiRNA結合部位は、同じであってもよく、または異なるmiRNA部位であってもよい。本開示のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるmiRNA結合部位の組合せには、異なるmiRNA部位のうちのいずれかの1つより多くのコピーが組み込まれる組合せが含まれ得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれるmiRNA結合部位は、体内で同じ組織を標的としてもよく、または異なる組織を標的としてもよい。非限定的な例として、組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なmiRNA結合部位を、本開示のポリヌクレオチドの3’-UTRに導入することを通じて、特定の細胞型(例えば、肝細胞、ミエロイド細胞、内皮細胞、がん細胞など)における発現の程度を低減させることができる。
一実施形態では、miRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドの3’UTRの5’末端付近、3’UTRの5’末端と3’末端とのほぼ中間、ならびに/または3’UTRの3’末端付近に、操作され得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端付近および3’UTRの5’末端と3’末端とのほぼ中間に、操作され得る。別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの3’末端付近および3’UTRの5’末端と3’末端とのほぼ中間に、操作され得る。さらに別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端付近および3’UTRの3’末端付近に、操作され得る。
別の実施形態では、3’UTRは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のmiRNA結合部位を含み得る。miRNA結合部位は、miRNA、miRNAシード配列、および/またはシード配列に隣接するmiRNA配列に相補的であり得る。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞型において発現される1つより多くのmiRNA部位を含むように操作され得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、対象の肝臓および腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御するために、miR-192およびmiR-122を含むように操作され得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、同じ組織に対する1つより多くのmiRNA部位を含むように操作されてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと関連する治療域および/または差次的発現を、miRNA結合部位により変化させることができる。例えば、死のシグナルを提供するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がん細胞のmiRNAシグネチャーによって、がん細胞においてより高度に発現するように設計することができる。がん細胞が、特定のmiRNAをより低いレベルで発現する場合には、そのmiRNA(または複数のmiRNA)の結合部位をコードするポリヌクレオチドを、より高度に発現させることになる。したがって、死のシグナルを提供するポリペプチドは、がん細胞において、細胞死を誘発または誘導する。同じmiRNAをより高度な発現で保有する近傍の非がん細胞は、コードされる死のシグナルによって受ける影響は低いであろうが、これは、ポリヌクレオチドが、3’UTRにおいてコードされる結合部位または「センサー」へのmiRNAの結合の作用に起因して、より低いレベルで発現されるためである。逆に、細胞生存または細胞保護のシグナルを、がんを含有する組織および非がん性細胞に送達することもでき、その場合、miRNAは、がん細胞においてより高い発現を有し、その結果、がん細胞に対しては生存シグナルがより低くなり、正常な細胞に対しては生存シグナルがより高くなる。本明細書に記載されるmiRNA結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計し、投与することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも1つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって、調節することができる。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を組み込み、ポリヌクレオチドを、本明細書に記載される脂質のうちのいずれかを含め、カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、組織または細胞を標的とすることができる。
本開示のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるmiRNAの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件における発現をより標的化するように操作することができる。組織特異的miRNA結合部位の導入を通じて、本開示のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞において、または生物学的条件の文脈で、タンパク質発現が最適となるように設計することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のmiRNAシード配列に100%の同一性を有するか、またはmiRNAシード配列に100%よりも低い同一性を有するかのいずれかである、miRNA結合部位を組み込むように設計することができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、公知のmiRNAシード配列に、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するmiNRA結合部位を組み込むように設計され得る。miRNAシード配列は、miRNA結合親和性を減少させ、したがってポリヌクレオチドの下方調節の低減をもたらすように、部分的に変異していてもよい。本質的には、miRNA結合部位とmiRNAシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度は、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力をより細かく調整するためのレオスタットとして作用し得る。加えて、miRNA結合部位の非シード領域における変異もまた、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力に影響を及ぼし得る。
一実施形態では、miRNA配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
別の実施形態では、miRNAシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得、miRNA結合部位は、ステムループの5’または3’ステムに組み込まれ得る。
一実施形態では、翻訳エンハンサーエレメント(TEE)は、ステムループのステムの5’末端に組み込まれ得、miRNAシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態では、TEEは、ステムループのステムの5’末端に組み込まれ得、miRNAシードは、ステムループのステムに組み込まれ得、miRNA結合部位は、ステムの3’末端またはステムループの後の配列に組み込まれ得る。miRNAシードおよびmiRNA結合部位は、同じおよび/または異なるmiRNA配列に対するものであり得る。
一実施形態では、miRNA配列および/またはTEE配列の組込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これにより、翻訳が増大および/または減少し得る。(例えば、Keddeら、「A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221 and
miR-22 accessibility.」Nature Cell Biology.、2010年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
miR-22 accessibility.」Nature Cell Biology.、2010年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’-UTRは、少なくとも1つのmiRNA配列を含み得る。miRNA配列は、19もしくは22ヌクレオチド配列および/またはシードなしのmiRNA配列であり得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、5’UTRにおけるmiRNA配列を使用して、本明細書に記載される本開示のポリヌクレオチドを安定させることができる。
別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの5’UTRにおけるmiRNA配列を使用して、翻訳開始の部位、例えば、限定されないが、開始コドンのアクセス性を減少させることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMatsudaら、PLoS One.、2010年、11巻(5号):e15057頁を参照されたく、これは、第1の開始コドン(AUG)へのアクセス性を減少させるために、開始コドンの周辺(AUGコドンのAを+1として、-4から+37)にアンチセンスロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチドおよびエクソン-ジャンクション複合体(EJC)を使用していた。Matsudaは、LNAまたはEJCを用いて開始コドンの周辺の配列を変化させることによって、ポリヌクレオチドの効率、長さ、および構造安定性が影響を受けることを示した。本開示のポリヌクレオチドは、翻訳開始の部位へのアクセス性を減少させるために、翻訳開始の部位の付近に、Matsudaらによって記載されているLNAまたはEJC配列ではなく、miRNA配列を含み得る。翻訳開始の部位は、miRNA配列の前、後、またはその内部であってもよい。非限定的な例として、翻訳開始の部位は、シード配列または結合部位などのmiRNA配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始の部位は、例えば、シード配列またはmir-122結合部位などのmiR-122配列内に位置してもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも1つのmiRNAを含み得る。非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、肝臓における目的のコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも1つのmiR-122結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも1つのmiR-142-3p結合部位、miR-142-3pシード配列、シードを有さないmiR-142-3p結合部位、miR-142-5p結合部位、miR-142-5pシード配列、シードを有さないmiR-142-5p結合部位、miR-146結合部位、miR-146シード配列、および/またはシード配列を有さないmiR-146結合部位を含み得る。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、免疫細胞においてmRNA治療薬を選択的に分解して、治療薬送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制するために、3’UTRに少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、本開示のポリヌクレオチドを、抗原提示細胞においてより不安定になるようにすることができる。これらのmiRNAの非限定的な例としては、mir-122-5pまたはmir-122-3pが挙げられる。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、RNA結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域に、少なくとも1つのmiRNA配列を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、(i)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント)をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)、ならびに(ii)miRNA結合部位(例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位)を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列、ならびに本明細書に開示されるmiRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位を含む。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列は、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列における1種類の核酸塩基(例えば、ウラシル)の少なくとも95%が、修飾された核酸塩基である。一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするウラシル修飾された配列におけるウラシルの少なくとも95%が、5-メトキシウリジンである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにmiRNA結合部位を含むポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のうちのいずれか、または化合物1~232のうちのいずれかとともに製剤化される。
15.3’UTRおよびAUリッチエレメント
15.3’UTRおよびAUリッチエレメント
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、本開示のIL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。
3’-UTRは、翻訳終止コドンのすぐ後にあり、転写後に遺伝子発現に影響を及ぼす制御性領域を含有することが多い、mRNAの区画である。3’-UTR内の制御性領域は、mRNAのポリアデニル化、転写効率、局在化、および安定性に影響を及ぼし得る。一実施形態では、本開示に有用な3’-UTRは、制御性タンパク質またはマイクロRNAの結合部位を含む。一部の実施形態では、3’-UTRは、サイレンサー領域を有し、この領域は、リプレッサータンパク質に結合し、mRNAの発現を阻害する。他の実施形態では、3’-UTRは、AUリッチエレメントを含む。タンパク質は、AREに結合して、局在化様式で転写産物の安定性もしくは崩壊速度に影響を及ぼすか、または翻訳開始に影響を及ぼす。他の実施形態では、3’-UTRは、ポリ(A)尾部と呼ばれる数百のアデニン残基のmRNA転写産物の末端への付加を誘導する、配列AAUAAAを含む。
天然または野生型の3’UTRは、そこに埋め込まれたアデノシンおよびウリジンのストレッチを有することが公知である。これらのAUリッチシグネチャーは、高い代謝回転率を有する遺伝子において、特に顕著である。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AUリッチエレメント(ARE)は、3つのクラスに分類することができる(Chenら、1995年):クラスIのAREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数の分散されたコピーを含有する。C-MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2つまたはそれよりも多い重複するUUAUUUA(U/A)(U/A)ノナマーを有する。この種類のAREを含有する分子としては、GM-CSFおよびTNF-aが挙げられる。クラスIIIのAREは、あまりはっきりと定義されていない。これらのUリッチ領域は、AUUUAモチーフを含有しない。c-Junおよびミオゲニンが、このクラスの2つの十分に研究されている例である。AREに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを脱安定化することが公知であるが、ELAVファミリーのメンバー、最も注目すべきことにはHuRは、mRNAの安定性を増大させることが実証されている。HuRは、3つすべてのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を、核酸分子の3’UTRに操作することにより、in vivoにおいて、HuRの結合、したがってメッセージの安定化につながるであろう。
3’UTRのAUリッチエレメント(ARE)の導入、除去、または修飾を使用して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチドを操作する場合、AREの1つまたは複数のコピーを導入して、本開示のポリヌクレオチドの安定性を低くし、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳を削減し、産生を減少させることができる。同様に、AREを特定し、除去または変異させて、細胞内の安定性を増大させ、それによって、結果として得られるタンパク質の翻訳および産生を増大させることができる。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、本開示のポリヌクレオチドを使用して、タンパク質産生を、トランスフェクション後の様々な時点においてアッセイすることができる。例えば、細胞に、異なるARE操作分子をトランスフェクトし、ELISAキットを関連するタンパク質に使用することによって、トランスフェクションの6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、および7日後に、産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドに有用な3’UTRは、本出願において示されているものから選択される3’UTRを含む。
ある特定の実施形態では、本開示に有用な3’UTR配列は、本明細書に列挙される3’UTR配列およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列に少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または約100%同一なヌクレオチド配列を含む。
16.5’キャップを有する領域
16.5’キャップを有する領域
本開示はまた、5’キャップならびに本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
天然のmRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を増大させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合するが、このCBPは、CBPとポリ(A)結合タンパク質との会合により成熟な環状mRNA種を形成することを通じて、細胞におけるmRNAの安定性および翻訳の適合性を担う。キャップは、さらに、mRNAスプライシングの間、5’近位のイントロンの除去を補助する。
内因性mRNA分子は、5’末端がキャッピングされ、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5’末端転写センスヌクレオチドとの間で5’-ppp-5’-三リン酸結合を生成し得る。この5’-グアニル酸キャップは、次に、メチル化されて、N7-メチル-グアニル酸残基を生成してもよい。mRNAの5’末端の末端および/または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で、2’-O-メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を通じた5’キャップ除去は、分解のために、核酸分子、例えば、mRNA分子を標的としてもよい。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、キャップ部分を組み込む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、キャップ除去を予防し、したがって、mRNA半減期を増大させる、非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、5’-ppp-5’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾されたヌクレオチドを、このキャッピング反応の際に使用してもよい。例えば、New England Biolabs(Ipswich、MA)から入手したワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の指示に従ってα-チオ-グアノシンヌクレオチドとともに使用して、5’-ppp-5’キャップにホスホロチオエート結合を作製してもよい。α-メチル-ホスホネートおよびセレノ-ホスフェートヌクレオチドなど、追加の修飾されたグアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
追加の修飾としては、糖環の2’-ヒドロキシル基におけるポリヌクレオチドの5’末端および/または5’末端前のヌクレオチドのリボース糖の2’-O-メチル化(上述)が挙げられるが、これに限定されない。複数の異なる5’キャップ構造を使用して、mRNA分子としての機能を果たすポリヌクレオチドなどの核酸分子の5’キャップを生成してもよい。本明細書において、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称される、キャップ類似体は、キャップ機能は保持しているが、それらの化学構造が、天然の(すなわち、内因性、野生型、または生理学的)5’キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的(すなわち、非酵素的)または酵素的に合成され得る、および/または本開示のポリヌクレオチドに連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体(ARCA)キャップは、5’-5’-三リン酸基によって連結された2つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、N7メチル基ならびに3’-O-メチル基を含有する(すなわち、N7,3’-O-ジメチル-グアノシン-5’-三リン酸-5’-グアノシン(m7G-3’mppp-G、これは、3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)Gとも表記することができる))。他方の未修飾のグアニンの3’-O原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの5’末端のヌクレオチドに連結されるようになる。N7-および3’-O-メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップは、mCAPであり、これは、ARCAに類似であるが、グアノシンに2’-O-メチル基を有する(すなわち、N7,2’-O-ジメチル-グアノシン-5’-三リン酸-5’-グアノシン、m7Gm-ppp-G)。
一部の実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるリン酸位置において、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾されてもよく、例えば、米国特許第US8,519,110号に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体があり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当技術分野において公知および/または本明細書に記載されるキャップ類似体のN7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態である。キャップ類似体のN7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、N7-(4-クロロフェノキシエチル)-G(5’)ppp(5’)GおよびN7-(4-クロロフェノキシエチル)-m3’-OG(5’)ppp(5’)Gキャップ類似体が挙げられる(例えば、Koreら、Bioorganic & Medicinal Chemistry、2013年、21巻、4570~4574頁に記載されている様々なキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。別の実施形態では、本開示のキャップ類似体は、4-クロロ/ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時のキャッピングを可能にするが、in vitro転写反応においては、転写産物の最大20%が、キャッピングされないまま残り得る。これは、キャップ類似体と内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性5’キャップ構造との構造上の相違と同様に、翻訳の適合性の低減および細胞安定性の低減をもたらし得る。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)はまた、より真正な5’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、製造後に(IVTまたは化学合成に関係なく)キャッピングすることもできる。本明細書において使用されるとき、「より真正な」という語句は、構造的または機能的に、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣した特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、従来技術の合成の特徴もしくは類似体などと比較して、内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能および/もしくは構造をより良好に表しているか、または1つもしくは複数の点に関して、対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な特徴よりも性能が優れている。本開示のより真正な5’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野において公知の合成5’キャップ構造(または野生型、天然、もしくは生理学的な5’キャップ構造)と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の増大、5’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低減、および/または5’キャップ除去の低減を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え2’-O-メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間にカノニカル5’-5’-三リン酸結合を作製することができ、ここで、キャップグアニンは、N7メチル化を含有し、mRNAの5’末端ヌクレオチドは、2’-O-メチルを含有する。そのような構造は、キャップ1構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野において公知の他の5’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳の適合性および細胞の安定性、ならびに細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低減をもたらす。キャップ構造としては、7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(キャップ0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(キャップ1)、および7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(キャップ2)が挙げられるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、キメラポリヌクレオチドを製造後にキャッピングすることが、より効率的であり得るが、これは、キメラポリヌクレオチドのほぼ100%を、キャッピングすることができるためである。これは、キャップ類似体を、in vitro転写反応の過程で、キメラポリヌクレオチドに連結させた場合の約80%とは対照的である。
本開示によると、5’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本開示によると、5’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、および2-アジド-グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、5’末端キャップ構造は、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、キャップ2、キャップ4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体である。
17.ポリ-A尾部
17.ポリ-A尾部
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリ-A尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリ-A尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ-A尾部は、デス-3’ヒドロキシル尾部を含む。
RNAプロセシングの間に、長いアデニンヌクレオチドの鎖(ポリ-A尾部)が、安定性を増大させるために、ポリヌクレオチド、例えば、mRNA分子に付加され得る。転写の直後に、転写産物の3’末端が切断されて、3’ヒドロキシルが遊離し得る。次いで、ポリ-Aポリメラーゼが、アデニンヌクレオチドの鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と称されるこのプロセスにより、例えば、およそ80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、または250残基の長さを含め、およそ80~およそ250残基の長さであり得る、ポリ-A尾部が付加される。
ポリA尾部はまた、構築物が核外に輸送された後に付加されてもよい。
本開示によると、ポリA尾部の末端基は、安定化のために組み込まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、デス-3’ヒドロキシル尾部を含み得る。これらはまた、Junjie Liらによって教示される構造的部分または2’-Oメチル修飾を含み得る(Current Biology、15巻、1501~1507頁、2005年8月23日、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンmRNAを含む、代替的なポリA尾部構造を有する転写産物をコードするように設計されてもよい。Norburyによると、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンmRNAにおいて検出されている。これらのmRNAの代謝回転は、染色体DNA複製の完了または阻害後の可能性として毒性であるヒストン蓄積の予防に重要であると考えられる。これらのmRNAは、3’ポリ(A)尾部の欠如によって区別され、その機能は、安定したステム-ループ構造およびその同族ステム-ループ結合タンパク質(SLBP)が代わりに担う;後者は、ポリアデニル化mRNAのPABPのものと同じ機能を行う」(Norbury、「Cytoplasmic RNA: a case of the tail wagging the dog」、Nature Reviews Molecular Cell Biology; AOP、2013年8月29日オンライン刊行、doi:10.1038/nrm3645)、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ユニークなポリA尾部の長さは、本開示のポリヌクレオチドにある特定の利点を提供する。一般に、ポリA尾部の長さは、存在する場合、30ヌクレオチド長より長い。他の実施形態では、ポリA尾部は、35ヌクレオチド長より長い(例えば、少なくともまたは約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000ヌクレオチドより長い)。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約30~約3,000ヌクレオチド(例えば、30~50、30~100、30~250、30~500、30~750、30~1,000、30~1,500、30~2,000、30~2,500、50~100、50~250、50~500、50~750、50~1,000、50~1,500、50~2,000、50~2,500、50~3,000、100~500、100~750、100~1,000、100~1,500、100~2,000、100~2,500、100~3,000、500~750、500~1,000、500~1,500、500~2,000、500~2,500、500~3,000、1,000~1,500、1,000~2,000、1,000~2,500、1,000~3,000、1,500~2,000、1,500~2,500、1,500~3,000、2,000~3,000、2,000~2,500、および2,500~3,000)を含む。
一部の実施形態では、ポリ-A尾部は、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して、設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づき得るか、またはポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さに基づき得る。
この文脈において、ポリ-A尾部は、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%長くてもよい。ポリ-A尾部はまた、それが属するポリヌクレオチドの画分として設計してもよい。この文脈において、ポリ-A尾部は、構築物の全長、構築物の領域、または構築物の全長からポリ-A尾部を差し引いたものの10、20、30、40、50、60、70、80、または90%、またはそれよりも長くてもよい。さらに、ポリ-A結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの結合部位の操作およびコンジュゲーションにより、発現を増強してもよい。
加えて、ポリ-A尾部の3’末端において修飾されたヌクレオチドを使用して、複数の異なるポリヌクレオチドを、PABP(ポリ-A結合タンパク質)を介して3’末端を通じて一緒に連結してもよい。トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、タンパク質産生を、ELISAによって、トランスフェクションの12時間後、24時間後、48時間後、72時間後、および7日後にアッセイすることができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリA-Gカルテット領域を含むように設計される。Gカルテットは、4つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイであり、DNAおよびRNAの両方においてGリッチ配列によって形成することができる。この実施形態では、Gカルテットは、ポリ-A尾部の末端に組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドを、様々な時点において、安定性、タンパク質産生、および半減期を含む他のパラメーターについてアッセイする。ポリA-Gカルテットが、120ヌクレオチドのポリ-A尾部を単独で使用した場合に確認されるタンパク質産生の少なくとも75%に相当する、mRNAからのタンパク質産生をもたらすことが見出されている。18.開始コドン領域
本開示はまた、開始コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似であるか、または同様の機能を果たす領域を有し得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンAUGではないコドンで開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUGなどであるがこれらに限定されない代替的な開始コドンで開始され得る(Touriolら、Biology
of the Cell、95巻、(2003年)、169~178頁およびMatsuda and Mauro PLoS ONE、2010年、5巻、11頁を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
of the Cell、95巻、(2003年)、169~178頁およびMatsuda and Mauro PLoS ONE、2010年、5巻、11頁を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンACGで開始される。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンCTGまたはCUGで開始される。さらに別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンGTGまたはGUGで開始される。
翻訳を開始するコドン、例えば、限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、および/または構造に影響を及ぼすことが公知である。(例えば、Matsuda and Mauro PLoS ONE、2010年、5巻、11頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ、および/または構造を変化させることができる。
一部の実施形態では、マスキングされた開始コドンまたは代替的な開始コドンにおける翻訳開始の確率を低減するようにコドンをマスキングまたは遮蔽するために、マスキング剤が、開始コドンまたは代替的な開始コドンの付近で使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸(LNA)ポリヌクレオチドおよびエクソン-ジャンクション複合体(EJC)が挙げられる(例えば、マスキング剤LNAポリヌクレオチドおよびEJCについて記載しているMatsudaおよびMauro(PLoS ONE、2010年、5巻、11号)を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
別の実施形態では、翻訳が、代替的な開始コドンで開始される可能性を増大させるために、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングすることができる。一部の実施形態では、翻訳が、マスキングした開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始される機会を増大させるために、マスキング剤を使用して、第1の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスキングしてもよい。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、miR結合部位の完璧な相補体内に位置し得る。miR結合部位の完璧な相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ、および/または構造の調節を補助し得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、miRNA結合部位の完璧な相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替的な開始コドンは、第1のヌクレオチド、第2のヌクレオチド、第3のヌクレオチド、第4のヌクレオチド、第5のヌクレオチド、第6のヌクレオチド、第7のヌクレオチド、第8のヌクレオチド、第9のヌクレオチド、第10のヌクレオチド、第11のヌクレオチド、第12のヌクレオチド、第13のヌクレオチド、第14のヌクレオチド、第15のヌクレオチド、第16のヌクレオチド、第17のヌクレオチド、第18のヌクレオチド、第19のヌクレオチド、第20のヌクレオチド、または第21のヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を、開始コドンではないコドンで開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンは、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの次のコドンまたは下流の開始コドンもしくは代替的な開始コドンで開始され得る。非限定的な実施例では、翻訳を、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで開始させるために、開始コドンATGまたはAUGが、ポリヌクレオチド配列の最初の3つのヌクレオチドとして、除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、および/またはポリヌクレオチドの構造を調節するためまたはその調節を試みるために、下流の開始コドンおよび/または代替的な開始コドンのための少なくとも1つのマスキング剤を、さらに含んでもよい。
19.終止コドン領域
19.終止コドン領域
本開示はまた、終止コドン領域ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)の前に、少なくとも2の終止コドンを含み得る。終止コドンは、DNAの場合にはTGA、TAA、およびTAGから、またはRNAの場合にはUGA、UAA、およびUAGから選択され得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、DNAの場合の終止コドンTGAまたはRNAの場合の終止コドンUGA、および1の追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、TAAまたはUAAであり得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、3の連続した終止コドン、4の終止コドン、またはそれよりも多い終止コドンを含む。
20.挿入および置換
20.挿入および置換
本開示はまた、挿入および/または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドも含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの5’UTRは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも1つの領域および/またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域および/またはストリングは、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8ヌクレオチドを含み得るがこれらに限定されず、ヌクレオチドは、天然および/または非天然であり得る。非限定的な例として、ヌクレオチドの群は、5~8のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および/またはそれらの組合せを含み得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの5’UTRは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのうちのいずれか、および/またはそれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、2つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも2つの領域および/またはストリングの挿入によって置き換えられ得る。例えば、5’UTRは、5~8のアデニン塩基を挿入し、続いて、5~8のシトシン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。別の例では、5’UTRは、5~8のシトシン塩基を挿入し、続いて、5~8のアデニン塩基を挿入することによって、置き換えることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に、少なくとも1つの置換および/または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも1つの置換および/または挿入は、転写開始部位のすぐ下流の領域において(例えば、+1から+6であるがこれらに限定されない)少なくとも1つの核酸を置換することによって、転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流におけるヌクレオチドの領域に対する変更は、開始速度に影響を及ぼし得、見かけのヌクレオチド三リン酸(NTP)反応定数値を増大させ得、初期転写を硬化する転写複合体からの短い転写産物の解離を増大させ得る(Briebaら、Biochemistry(2002年)41巻、5144~5149頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。少なくとも1つのヌクレオシドの修飾、置換、および/または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、または少なくとも13のグアニン塩基の置換を含み得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域に、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例としては、その領域のヌクレオチドが、GGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4のアデニンヌクレオチドによって置換され得る(配列番号233)。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、GGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4のシトシン塩基によって置換され得る(配列番号234)。別の非限定的な例では、その領域のヌクレオチドが、GGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4のチミンおよび/または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る(配列番号235)。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に、少なくとも1つの置換および/または挿入を含み得る。明確さの目的で、当業者であれば、開始コドンは、タンパク質コーディング領域の最初のコドンであり、一方で、転写開始部位は、転写が開始される部位であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、または少なくとも8つの置換および/または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流にある1つ、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つの位置で、挿入または置換され得る。挿入および/または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基(例えば、すべてのAもしくはすべてのCもしくはすべてのTもしくはすべてのG)、2つの異なる塩基(例えば、AおよびC、AおよびT、もしくはCおよびT)、3つの異なる塩基(例えば、A、C、およびT、もしくはA、C、およびT)、または少なくとも4つの異なる塩基であり得る。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドにおけるコード領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載されるヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチドにおけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前の領域に、1つのグアニン塩基が残るように設計され得る(Esveltら、Nature、(2011年)、472巻(7344号)、499~503頁を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。非限定的な例として、少なくとも5のヌクレオチドが、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流である1つの位置に挿入され得、この少なくとも5のヌクレオチドは、同じ塩基の種類であり得る。
21.IL12ポリペプチドをコードするmRNAを含むポリヌクレオチド
21.IL12ポリペプチドをコードするmRNAを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’末端から3’末端に、
(i)上記に提供される5’キャップ、
(ii)5’UTR、例えば、上記に提供される配列、
(iii)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるIL12をコードする配列最適化された核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)3’UTR、例えば、上記に提供される配列、および
(vi)上記に提供されるポリ-A尾部
を含む。
(i)上記に提供される5’キャップ、
(ii)5’UTR、例えば、上記に提供される配列、
(iii)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるIL12をコードする配列最適化された核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)3’UTR、例えば、上記に提供される配列、および
(vi)上記に提供されるポリ-A尾部
を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miRNA-142に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。一部の実施形態では、5’UTRは、miRNA結合部位を含む。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型IL12(例えば、アイソフォーム1、2、3、または4)のタンパク質配列に、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
22.ポリヌクレオチドを作製する方法
22.ポリヌクレオチドを作製する方法
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド)またはその相補体を作製するための方法を提供する。
一部の態様では、本明細書に開示され、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、in vitro転写を使用して、構築することができる。他の態様では、本明細書に開示され、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して、化学合成によって構築することができる。
他の態様では、本明細書に開示され、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、宿主細胞を使用することによって、作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、IVT、化学合成、宿主細胞発現、または当技術分野において公知の任意の他の方法の1つまたは複数の組合せによって、作製される。他の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、in vitro哺乳動物細胞である。
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはこれらの組合せは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然に存在するヌクレオシドを完全または部分的に置き換えることができ、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)に組み込むことができる。結果として得られるポリヌクレオチド、例えば、mRNAを、次いで、タンパク質を産生するおよび/または治療的転帰をもたらすそれらの能力について、試験してもよい。
a.in vitro転写/酵素的合成
a.in vitro転写/酵素的合成
本明細書に開示される本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、in vitro転写(IVT)系を使用して、転写され得る。この系は、典型的に、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、RNase阻害剤、およびポリメラーゼを含む。NTPは、天然および非天然の(修飾された)NTPを含め、本明細書に記載されるものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、および変異体ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。米国公開第US20130259923号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意の数のRNAポリメラーゼまたはバリアントを、本開示のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。RNAポリメラーゼは、RNAポリメラーゼ配列のアミノ酸の挿入または欠失によって修飾され得る。非限定的な例として、RNAポリメラーゼは、未修飾のRNAポリメラーゼと比較して、2’-修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の増大を呈するように修飾され得る(国際公開第WO2008078180号および米国特許第8,101,385号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
バリアントは、RNAポリメラーゼを進化させること、RNAポリメラーゼのアミノ酸および/もしくは核酸配列を最適化させること、ならびに/または当技術分野において公知の他の方法を使用することによって、得ることができる。非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼのバリアントは、Esveltら(Nature、472巻、499~503頁(2011年)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)によって設定された連続した指向型進化系を使用して、進化させることができ、ここで、T7 RNAポリメラーゼのクローンは、93位のリシンとスレオニンとの置換(K93T)、I4M、A7T、E63V、V64D、A65E、D66Y、T76N、C125R、S128R、A136T、N165S、G175R、H176L、Y178H、F182L、L196F、G198V、D208Y、E222K、S228A、Q239R、T243N、G259D、M267I、G280C、H300R、D351A、A354S、E356D、L360P、A383V、Y385C、D388Y、S397R、M401T、N410S、K450R、P451T、G452V、E484A、H523L、H524N、G542V、E565K、K577E、K577M、N601S、S684Y、L699I、K713E、N748D、Q754R、E775K、A827V、D851NまたはL864Fなどあるがこれらに限定されない、少なくとも1つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼのバリアントは、米国公開第20100120024号および同第20070117112号に記載されるように、少なくとも1つの変異をコードし得、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。RNAポリメラーゼのバリアントとしては、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、欠失バリアント、および/または共有結合誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントのRNAポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。これを行う際、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドに由来する配列変化の部位または領域を含有するように修飾され得る。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素的方法によって行うことができる。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖において、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。現在公知のDNAポリメラーゼは、アミノ酸配列比較および結晶構造分析に基づいて、様々なファミリーに分類され得る。DNAポリメラーゼI(pol I)またはAポリメラーゼのファミリーは、E.coliのクレノウ断片、Bacillus DNAポリメラーゼI、Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ、ならびにT7 RNAおよびDNAポリメラーゼを含め、これらのファミリーの中でも、最も研究されている。別の大きなファミリーは、DNAポリメラーゼα(pol α)またはBポリメラーゼファミリーであり、すべての真核生物複製DNAポリメラーゼならびにファージT4およびRB69由来のポリメラーゼを含む。類似の触媒機構を用いるが、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、基質類似体組込み効率、プライマー伸長の程度および速度、DNA合成の様式、エクソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感度が異なる。
DNAポリメラーゼはまた、反応温度、pH、ならびに鋳型およびプライマーの濃度など、それらが必要とする最適な反応条件に基づいて、選択される。しばしば、所望されるDNA断片のサイズおよび合成効率を達成するために、1つより多くのDNAポリメラーゼの組合せが、用いられる。例えば、Chengらは、pHを増大させ、グリセロールおよびジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少させ、伸長時間を増大させ、クローニングされたインサートおよびヒトゲノムDNAから長い標的を有効に増幅するために、3’から5’のエクソヌクレアーゼ活性を有する二次熱安定性DNAポリメラーゼを利用する。(Chengら、PNAS、91巻、5695~5699頁(1994年)、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。バクテリオファージT3、T7、およびSP6に由来するRNAポリメラーゼは、生物化学研究および生物物理学研究のためのRNAを調製するために、広く使用されている。RNAポリメラーゼ、キャッピング酵素、およびポリ-Aポリメラーゼは、同時係属中の国際公開第WO2014028429号に開示されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一態様では、本開示のポリヌクレオチドの合成において使用することができるRNAポリメラーゼは、Syn5 RNAポリメラーゼである。(Zhuら、Nucleic Acids Research、2013年、doi:10.1093/nar/gkt1193を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。Syn5 RNAポリメラーゼは、近年、Zhuらによって、海洋性シアノファージSyn5から特徴付けられ、ここでは、プロモーター配列も特定された(Zhuら、Nucleic Acids Research、2013年を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。Zhuらは、Syn5 RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼと比較して、より広い範囲の温度および塩分濃度において、RNA合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターにおける開始ヌクレオチドの要件が、Syn5 RNAポリメラーゼでは、T7 RNAポリメラーゼと比較して低いストリンジェンシーであることが見出され、Syn5 RNAポリメラーゼがRNA合成に有望となった。
一態様では、Syn5 RNAポリメラーゼを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定的な例として、Syn5 RNAポリメラーゼは、正確な3’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成において使用することができる。
一態様では、Syn5プロモーターは、ポリヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的な例として、Syn5プロモーターは、Zhuら(Nucleic Acids Research、2013年)によって記載されている5’-ATTGGGCACCCGTAAGGG-3’(配列番号47)であり得る。
一態様では、Syn5 RNAポリメラーゼは、本明細書に記載されるおよび/または当技術分野において公知である、少なくとも1つの化学的修飾を含むポリヌクレオチドの合成において使用することができる(例えば、Zhuら、Nucleic Acids Research、2013年に記載されているシュード-UTPおよび5Me-CTPの組込みを参照されたい)。
一態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、Zhuら(Nucleic Acids Research、2013年)によって記載されている修正および改善された精製手順を使用して精製されたSyn5 RNAポリメラーゼを使用して合成することができる。
遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として作用する標的遺伝子の酵素的増幅に基づいている。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究のため、ならびに他の研究上の必要性のために、ポリヌクレオチドまたは核酸の少量の試料から、標的遺伝子の複数のコピーを生成する必要がある。そのような方法は、本開示のポリヌクレオチドの製造において適用することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標的遺伝子の高速増幅、ならびにゲノムマッピングおよびシーケンシングにおいて、広範な用途を有する。DNAの合成のための重要な構成要素は、鋳型としての標的DNA分子、標的DNA鎖の末端に相補的なプライマー、構成ブロックとしてのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、およびDNAポリメラーゼを含む。PCRが、変性、アニーリング、および伸長のステップを進む際、新しく産生されたDNA分子は、次の複製サークルの鋳型として作用することができ、標的DNAの指数関数的増幅が達成される。PCRは、変性およびアニーリングのための加熱および冷却のサイクルを必要とする。基本的なPCRの変化形としては、非対称PCR(Innisら、PNAS、85巻、9436~9440頁(1988年))、インバースPCR(Ochmanら、Genetics、120巻(3号)、621~623頁(1988年))、逆転写PCR(RT-PCR)(Freemanら、BioTechniques、26巻(1号)、112~22頁、124~5頁(1999年)、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、などである)が挙げられる。RT-PCRでは、一本鎖RNAが、所望される標的であり、逆転写酵素によって、まず二本鎖のDNAに変換される。
様々な等温in vitro核酸増幅技法が、PCRの代替法または補足法として開発されている。例えば、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)は、制限酵素がニックを形成する能力に基づく(Walkerら、PNAS、89巻、392~396頁(1992年)、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))。制限酵素認識配列が、アニーリングされたプライマー配列に挿入される。プライマーは、DNAポリメラーゼおよびdNTPによって伸長されて、二本鎖が形成される。二本鎖のうちの一方の鎖のみが、制限酵素によって切断される。それぞれの一本鎖が、次いで、後続の合成のための鋳型として利用可能となる。SDAは、PCRの複雑な温度管理サイクルを必要としない。
転写媒介増幅(TMA)とも呼ばれる核酸配列に基づく増幅(NASBA)もまた、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、RNAse H、およびT7 RNAポリメラーゼの組合せを利用する等温増幅法である。(Compton, Nature、350巻、91~92頁(1991年))、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標的RNAが、鋳型として使用され、逆転写酵素が、その相補的なDNA鎖を合成する。RNAse Hは、RNA鋳型を加水分解し、DNAポリメラーゼがRNA標的に相補的な第1のDNA鎖に相補的なDNA鎖を合成するための空間を作り、DNA二本鎖が形成される。T7 RNAポリメラーゼは、このDNA二本鎖の相補的なRNA鎖を連続して生成する。これらのRNA鎖が、新しいDNA合成サイクルの鋳型として作用し、結果として、標的遺伝子の増幅が生じる。
ローリングサークル増幅(RCA)は、一本鎖の環状ポリヌクレオチドを増幅し、多数回の等温酵素合成を伴い、ここで、Ф29 DNAポリメラーゼが、ポリヌクレオチド環を連続して何周もすることによって、プライマーを伸長し、その配列を何度も複製する。したがって、環状鋳型の線形コピーが達成される。次いで、プライマーが、この線形コピーにアニーリングされ得、その相補的な鎖が合成され得る。Lizardiら、Nature Genetics、19巻、225~232頁(1998年)を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一本鎖の環状DNAもまた、RNAポリメラーゼの存在下において、RNA合成の鋳型としての機能を果たし得る。(Daubendiekら、JACS、117巻、7818~7819頁(1995年)、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。インバース高速cDNA末端増幅(RACE)RCAは、Polidorosらによって説明されている。メッセンジャーRNA(mRNA)が、cDNAに逆転写された後、RNAse H処置によって、cDNAが分離される。次いで、cDNAが、CircLigaseによって環状化され、環状DNAとなる。結果として得られる環状DNAの増幅は、RCAによって達成される。(Polidorosら、BioTechniques、41巻、35~42頁(2006年)、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
前述の方法のいずれも、本開示のポリヌクレオチドの1つまたは複数の領域を製造するのに利用することができる。
リガーゼによるポリヌクレオチドまたは核酸のアセンブリも、広く使用される。DNAまたはRNAリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を通じて、ポリヌクレオチド鎖の5’末端および3’末端の分子間ライゲーションを促進する。リガーゼ連鎖反応(LCR)は、2つの隣接するポリヌクレオチドプローブが、ハイブリダイズして標的遺伝子の1本の鎖となり、リガーゼによって互いに結合されるという原理に基づく、有望な診断技法である。標的遺伝子が存在していないか、または標的遺伝子に単一ヌクレオチド多型(SNP)などのミスマッチが存在する場合、プローブはライゲーションできない。(Wiedmannら、PCR Methods and Application、3巻(4号)、s51~s64頁(1994年)、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。LCRを、様々な増幅技法と組み合わせて、検出の感度を増大させるか、またはポリヌクレオチドおよび核酸の合成において使用する場合には産物の量を増大させることができる。
核酸のライブラリー調製キットは、現在、複数が市販されている。これらは、少量の核酸試料を、下流適用のためにインデックスされたライブラリーに変換するための酵素および緩衝液を含む。例えば、DNA断片を、末端調製、ライゲーション、サイズ選択、クリーンアップ、PCR増幅、および最終クリーンアップのために、NEWENGLAND BIOLABS(登録商標)によるNEBNEXT(登録商標)ULTRA(商標)DNAライブラリー調製キットに入れてもよい。
増幅技法の改善のために、継続的な開発が続いている。例えば、Asadaらの米国特許第8,367,328号は、DNAポリメラーゼによるDNA合成反応の効率性を増大させるために、反応エンハンサーを利用することを教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。反応エンハンサーは、酸性物質または酸性物質のカチオン性複合体を含む。Kitabayashiらの米国特許第7,384,739号は、酵素的DNA合成を促進するカルボン酸イオン供給物質について教示しており、ここで、カルボン酸イオン供給物質は、シュウ酸、マロン酸、シュウ酸のエステル、マロン酸のエステル、マロン酸の塩、およびマレイン酸のエステルから選択され、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Sobekらの米国特許第7,378,262号は、DNA増幅の忠実性を増大させるための酵素組成物を開示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この組成物は、3’エクソヌクレアーゼ活性を有するがポリメラーゼ活性を有さない1つの酵素、およびポリメラーゼである別の酵素を含む。これらの酵素のいずれも、熱安定性であり、低温では不活性となるように可逆的に修飾される。
Gettsらの米国特許第7,550,264号は、cDNA分子の3’末端にオリゴデオキシヌクレオチド尾部を結合させ、RNAポリメラーゼを使用してRNA転写を開始することによって行われる、複数回のセンスRNA分子の合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Rohayemの米国特許公開第2013/0183718号は、一本鎖DNA鋳型に対してRNAポリメラーゼ活性を示す、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)によるRNA合成について教示しており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非標準的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、Bennerの米国特許第6,617,106号に開示されているように、非標準的なヌクレオチドを含む鋳型を、鋳型のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの混合物と接触させることによる、酵素的重合を用いて合成することができ、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
b.化学的合成
b.化学的合成
標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、例えば、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を合成することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含有する単一のDNAまたはRNAオリゴマーを、合成することができる。他の態様では、所望されるポリペプチドの部分をコードする複数の小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、それらをライゲーションしてもよい。一部の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的アセンブリのための5’または3’オーバーハングを含有する。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、当技術分野において公知の化学的合成方法および可能な核酸塩基置換を使用して、化学的に合成することができる。例えば、国際公開第WO2014093924号、同第WO2013052523号、同第WO2013039857号、同第WO2012135805号、同第WO2013151671号、米国公開第US20130115272号、または米国特許第US8999380号もしくは同第US8710200号を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
c.IL12をコードするポリヌクレオチドの精製
c.IL12をコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の精製には、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証、および品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野において公知の方法、例えば、限定されないが、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics、Danvers、MA)、ポリ-Tビーズ、LNA(商標)オリゴ-T捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc.、Vedbaek、Denmark)、またはHPLCに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)によって、行うことができる。
「精製ポリヌクレオチド」など、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「精製された」という用語は、少なくとも1つの混入物質から分離されたものを指す。本明細書において使用されるとき、「混入物質」は、別の物質を、不適合、不純、または低品質にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、それが本来見出されるものとは異なる形態もしくは環境、または処置もしくは精製方法に供される前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境で、存在する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の精製は、不純物を除去し、これにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること、例えば、サイトカイン活性を低減することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、カラムクロマトグラフィー(例えば、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)、または(LCMS))を使用して、投与の前に精製される。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー(例えば、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC、疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)、または(LCMS))を使用して精製された本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、異なる精製方法によって精製された同じ本開示のポリヌクレオチドにより得られる発現レベルと比較して、コードされるIL12タンパク質の発現の増大を提示する。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー(例えば、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)、または(LCMS))により精製されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の点変異のうちの1つまたは複数を含む、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞においてIL12タンパク質発現レベルを、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるIL12タンパク質の発現レベルに対して、例えば、10~100%、すなわち、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%だけ増大させる。
一部の実施形態では、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において機能的IL12タンパク質発現レベルを、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞におけるIL12タンパク質の機能的発現レベルに対して、例えば、10~100%、すなわち、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%だけ増大させる。
一部の実施形態では、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入されたとき、これらの細胞において検出可能なIL12活性を、RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入される前、または非RP-HPLC精製ポリヌクレオチドが細胞に導入された後の細胞における機能的IL12の活性レベルに対して、例えば、10~100%、すなわち、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは少なくとも約100%だけ増大させる。
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約80%の純度、少なくとも約85%の純度、少なくとも約90%の純度、少なくとも約95%の純度、少なくとも約96%の純度、少なくとも約97%の純度、少なくとも約98%の純度、少なくとも約99%の純度、または約100%の純度である。
品質保証および/または品質管理チェックは、ゲル電気泳動、UV吸光、または分析的HPLCなどであるがこれらに限定されない方法を使用して、行うことができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素PCRを含むがこれに限定されない方法によって、シーケンシングされ得る。
d.IL12をコードするポリヌクレオチドの発現の定量化
d.IL12をコードするポリヌクレオチドの発現の定量化
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、それらの発現産物、ならびに分解産物および代謝産物は、当技術分野において公知の方法によって定量化することができる。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、エクソソームにおいて、または1つもしくは複数の体液に由来する場合に、定量化することができる。本明細書において使用されるとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、喀痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または射精前液、汗、排泄物、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、粥状液、乳糜液、胆汁、間質液、経血、膿汁、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、大便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸飲液、胞胚腔液、ならびに臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から採取してもよい。
エクソソーム定量化方法では、2mL以下の試料を対象から得、エクソソームを、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって、単離する。分析において、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、短縮、または変化であり得る。レベルを、1つもしくは複数の臨床表現型、またはヒト疾患バイオマーカーに関するアッセイと、相関させることが有利である。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、qRT-PCR、リアルタイムPCR、PCR、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組合せを使用して行うことができ、一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)方法などの免疫組織化学法を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、差次的遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組合せによって単離してもよい。
これらの方法は、試験者に、残っているポリヌクレオチドまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルを、リアルタイムでモニタリングする能力をもたらす。本開示のポリヌクレオチドは、構造的または化学的修飾に起因して内因性の形態とは異なるため、これが可能である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、紫外線可視分光法(UV/Vis)などであるがこれに限定されない方法を使用して、定量化することができる。UV/Vis分光計の非限定的な例は、NANODROP(登録商標)分光計(ThermoFisher、Waltham、MA)である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、適正なサイズであり得るかを判定し、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを調べるために、分析してもよい。ポリヌクレオチドの分解は、限定されないが、アガロースゲル電気泳動、HPLCに基づく精製方法、例えば、限定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP-HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC-HPLC)、液体クロマトグラフィー-質量分析(LCMS)、キャピラリー電気泳動(CE)、およびキャピラリーゲル電気泳動(CGE)などの方法によって、調べることができる。
23.医薬組成物および製剤
23.医薬組成物および製剤
本開示は、上述のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、医薬組成物および製剤を提供する。一部の実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物または製剤は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする、本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対して有意な配列同一性を有するポリヌクレオチド(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含有し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、miRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位をさらに含む。
医薬組成物または製剤は、任意選択で、1つまたは複数の追加の活性な物質、例えば、治療的および/または予防的に活性な物質を含んでもよい。本開示の医薬組成物または製剤は、滅菌および/または発熱物質不含であり得る。医薬剤の製剤化および/または製造における一般的な検討項目は、例えば、Remington: The Science
and Practice of Pharmacy、第21版、Lippincott Williams & Wilkins、2005年(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は、概して、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
and Practice of Pharmacy、第21版、Lippincott Williams & Wilkins、2005年(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は、概して、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載される製剤および医薬組成物は、薬理学の分野において公知であるかまたは今後開発される、任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要に応じておよび/または望ましい場合には、生成物を所望される単回または複数回投薬単位に分割、成形、および/またはパッケージングするステップを含む。
本開示による医薬組成物または製剤は、バルクで、単回の単位用量として、および/または複数の単回単位用量として、調製、パッケージング、および/または販売され得る。本明細書において使用されるとき、「単位用量」とは、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および/またはそのような投薬量の便宜的な割合、例えば、そのような投薬量の半分または3分の1などに等しい。
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および/または任意の追加の成分の相対的な量は、処置を受ける対象の同一性、サイズ、および/または状態に応じて、さらには組成物を投与しようとする経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、0.1%~99%(重量/重量)の活性成分を含み得る。例として、組成物は、0.1%~100%、例えば、0.5~50%、1~30%、5~80%、または少なくとも80%(重量/重量)の活性成分を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および製剤は、少なくとも1つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの本開示のポリヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物または製剤は、1つより多くの種類のポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、組成物または製剤は、線形形態および環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチドおよびIVTポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、IVTポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、および環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書において提供される医薬組成物および製剤の説明は、主として、ヒトへの投与に好適な医薬組成物および製剤を対象としているが、当業者であれば、そのような組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を様々な動物への投与に好適なものにするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物または製剤の修正形が、十分に理解され、通常の技能の獣医学薬理学者であれば、必要だとしても単に通常の実験によって、そのような修正形を設計および/または実行することができる。医薬組成物または製剤の投与が企図される対象としては、ヒトおよび/もしくは他の霊長類;商業関連の哺乳動物、例えば、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および/もしくはラットを含む、哺乳動物;ならびに/または商業関連の鳥類、例えば、家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、および/もしくはシチメンチョウを含む鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む、医薬製剤を提供する。本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、(1)安定性を増大させるため、(2)細胞のトランスフェクションを増大させるため、(3)持続放出もしくは遅延放出を可能にするため(例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から)、(4)生体分布を変化させるため(例えば、ポリヌクレオチドの標的を特定の組織もしくは細胞型とするため)、(5)in vivoでコードされるタンパク質の翻訳を増大させるため、ならびに/または(6)in vivoでコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させるために、1つまたは複数の賦形剤を使用して、製剤化してもよい。一部の実施形態では、医薬製剤は、送達剤(例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のうちのいずれかまたは化合物1~232のうちのいずれか)をさらに含む。
薬学的に許容される賦形剤としては、本明細書において使用されるとき、所望される特定の剤形に好適な、ありとあらゆる溶媒、分散媒、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁補助剤、希釈剤、造粒剤および/もしくは分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗微生物剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、緩衝液、キレート剤、凍結保護剤(cyoprotectant)、ならびに/または増量剤が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である(Remington:
The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro (Lippincott, Williams &
Wilkins、Baltimore、MD、2006年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))。
The Science and Practice of Pharmacy、第21版、A. R. Gennaro (Lippincott, Williams &
Wilkins、Baltimore、MD、2006年を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトールなど、および/またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な造粒剤および/または分散剤としては、デンプン、アルファ化デンプン、または微晶質デンプン、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ(ビニル-ピロリドン)、(ピロビドン)、架橋型ポリ(ビニル-ピロリドン)(クロスポビドン)、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム(クロスカルメロース)、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(VEEGUM(登録商標))、ラウリル硫酸ナトリウムなど、および/またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な界面活性剤および/または乳化剤としては、天然の乳化剤(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス(chondrux)、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート[TWEEN(登録商標)80]、ソルビタンモノパルミテート[SPAN(登録商標)40]、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、PLUORINC(登録商標)F 68、POLOXAMER(登録商標)188など、ならびに/またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖(例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール)、アミノ酸(例えば、グリシン)、天然および合成のガム(例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム)、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
酸化は、mRNA、特に、液体mRNA製剤の、潜在的な分解経路である。酸化を予防するために、酸化防止剤を製剤に添加してもよい。例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチルヒドロキシアニソール、m-クレゾール、メチオニン、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウムなど、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な抗微生物剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な保存剤としては、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、ベータ-カロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)など、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のpHは、安定性を改善するために、pH5~pH8に維持される。pHを調節するための例示的な緩衝液としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン(もしくはヒスチジン-HCl)、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなど、および/またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、水添植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウムなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、凍結する際に本明細書に記載されるポリヌクレオチドを安定化するための凍結保護剤(cyroprotectant)を含有し得る。例示的な凍結保護剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロースなど、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物または製剤は、「薬学的に洗練された」固形物をもたらし、長期(例えば、36ヶ月間)の保管期間の間、凍結乾燥されたポリヌクレオチドを安定させるために、凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に増量剤を含有してもよい。本開示の例示的な増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微細小胞、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、およびこれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。
24.送達剤
a.脂質化合物
24.送達剤
a.脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。具体的には、本出願は、
(a)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
(b)送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
(a)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
(b)送達剤を含む、医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示の送達剤は、2016年9月16日に出願され、国際公開第WO2017/049245号として公開された、国際出願第PCT/US2016/052352号に開示されている任意の1つまたは複数の化合物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、送達剤は、式(I)を有する化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR,および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択される。
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR,および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択される。
一部の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものを含み、ここで、アルキルおよびアルケニル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものを含み、ここで、アルキルおよびアルケニル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
一部の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが、1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではないか、または(ii)nが、1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではないものを含む。
別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)ORならびにN、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ(=O)、OH、アミノおよびC1~3アルキルから選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)ORならびにN、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ(=O)、OH、アミノおよびC1~3アルキルから選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、ならびにN、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ(=O)、OH、アミノおよびC1~3アルキルから選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、ならびにN、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ(=O)、OH、アミノおよびC1~3アルキルから選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、および-C(=NR9)N(R)2,から選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、Qが5~14員複素環であり、かつ(i)R4が、nが1または2である-(CH2)nQであるか、または(ii)R4が、nが1である-(CH2)nCHQRであるか、または(iii)R4が-CHQRおよび-CQ(R)2である場合、Qは5~14員ヘテロアリールまたは8~14員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、および-C(=NR9)N(R)2,から選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、Qが5~14員複素環であり、かつ(i)R4が、nが1または2である-(CH2)nQであるか、または(ii)R4が、nが1である-(CH2)nCHQRであるか、または(iii)R4が-CHQRおよび-CQ(R)2である場合、Qは5~14員ヘテロアリールまたは8~14員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、Qが5~14員複素環であり、かつ(i)R4が、nが1または2である-(CH2)nQであるか、または(ii)R4が、nが1である-(CH2)nCHQRであるか、または(iii)R4が-CHQRおよび-CQ(R)2である場合、Qは5~14員ヘテロアリールまたは8~14員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、Qが5~14員複素環であり、かつ(i)R4が、nが1または2である-(CH2)nQであるか、または(ii)R4が、nが1である-(CH2)nCHQRであるか、または(iii)R4が-CHQRおよび-CQ(R)2である場合、Qは5~14員ヘテロアリールまたは8~14員ヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、および-C(=NR9)N(R)2から選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、および-C(=NR9)N(R)2から選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3-6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、OおよびSから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
なお別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに別の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、-N(R)2であり、各nは、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC1~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択されるものまたはその塩もしくは立体異性体を含む。
ある特定の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IA)のもの、
を含み、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
を含み、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IA)のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(II)のもの、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(II)のもの、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、式(IIa)、(IIb)、(IIc)、または(IIe)の化合物は、R4を含み、これは、-(CH2)nQおよび-(CH2)nCHQRから選択され、ここで、Q、R、およびnは、上記に定義される通りである。
一部の実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、および複素環からなる群から選択され、ここで、Rは上記に定義される通りである。一部の態様では、nは、1または2である。一部の実施形態では、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2である。
一部の実施形態では、式(I)の化合物は、式(IId)のもの、
またはその塩であり、式中、R2およびR3は、独立して、C5~14アルキルおよびC5~14アルケニルからなる群から選択され、nは、2、3、および4から選択され、R’、R”、R5、R6、およびmは、上記に定義される通りである。
またはその塩であり、式中、R2およびR3は、独立して、C5~14アルキルおよびC5~14アルケニルからなる群から選択され、nは、2、3、および4から選択され、R’、R”、R5、R6、およびmは、上記に定義される通りである。
式(IId)の化合物の一部の態様では、R2は、C8アルキルである。式(IId)の化合物の一部の態様では、R3は、C5~C9アルキルである。式(IId)の化合物の一部の態様では、mは、5、7、または9である。式(IId)の化合物の一部の態様では、各R5は、Hである。式(IId)の化合物の一部の態様では、各R6は、Hである。
別の態様では、本出願は、(1)式(I)を有する化合物、(2)任意選択で、補助脂質(例えば、リン脂質)、(3)任意選択で、構造脂質(例えば、ステロール)、(4)任意選択で、脂質コンジュゲート(例えば、PEG脂質)、および(5)任意選択で、第四級アミン化合物を含む、脂質組成物(例えば、脂質ナノ粒子(LNP))を提供する。例示的な実施形態では、脂質組成物(例えば、LNP)は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BおよびIL12Aの両方のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中に封入されたポリヌクレオチドを、さらに含む。
本明細書において使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、1個または複数の炭素原子(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれよりも多い炭素原子)を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
「C1~14アルキル」という表記法は、1~14個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、2個またはそれよりも多い炭素原子(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、またはそれよりも多い炭素原子)および少なくとも1つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
「C2~14アルケニル」という表記法は、2~14個の炭素原子および少なくとも1つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多い二重結合を含み得る。例えば、C18アルケニルは、1つまたは複数の二重結合を含み得る。2つの二重結合を含むC18アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の1つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味する。環は、3、4、5、6,7、8、9、10、11、12、13、14、または15員環であり得る。
「C3~6炭素環」という表記法は、3~6個の炭素原子を有する単一の環を含む、炭素環を意味する。炭素環は、1つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る(例えば、アリール基)。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、および1,2-ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「複素環」または「複素環式基」という用語は、1つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味し、少なくとも1つの環が少なくとも1つのヘテロ原子を含む。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12員環であり得る。複素環は、1つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る(例えば、ヘテロアリール基)。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、およびイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択で置換され得る。
本明細書において使用されるとき、「生体分解性基」は、対象における脂質のより迅速な代謝を促進し得る基である。生体分解性基は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるとき、「アリール基」とは、1つまたは複数の芳香環を含む、炭素環式基である。例示的なアリール基としては、フェニルおよびナフチル基が挙げられる
本明細書において使用されるとき、「ヘテロアリール基」とは、1つまたは複数の芳香環を含む、複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、およびチアゾリルが挙げられる。アリールおよびヘテロアリール基のいずれも、任意選択で置換され得る。例えば、MおよびM’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる非限定的な群から選択することができる。本明細書の式において、MおよびM’は、独立して、上述の生体分解性基の一覧から選択され得る。
アルキル、アルケニル、およびシクリル(例えば、カルボシクリルおよびヘテロシクリル)基は、別途指定されない限り、任意選択で置換され得る。任意選択の置換基は、ハロゲン原子(例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基)、カルボン酸(例えば、-C(O)OH)、アルコール(例えば、ヒドロキシル、-OH)、エステル(例えば、-C(O)ORまたは-OC(O)R)、アルデヒド(例えば、-C(O)H)、カルボニル(例えば、-C(O)R、代替的にはC=Oと表される)、ハロゲン化アシル(例えば、-C(O)X、Xは、臭化物、フッ化物、塩化物、およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物)、カーボネート(例えば、-OC(O)OR)、アルコキシ(例えば、-OR)、アセタール(例えば、-C(OR)2R”“、ここで、各ORは、同じであっても異なってもよいアルコキシ基であり、R”“は、アルキルまたはアルケニル基である)、ホスフェート(例えば、P(O)4
3-)、チオール(例えば、-SH)、スルホキシド(例えば、-S(O)R)、スルフィン酸(例えば、-S(O)OH)、スルホン酸(例えば、-S(O)2OH)、チアール(例えば、-C(S)H)、スルフェート(例えば、S(O)4
2-)、スルホニル(例えば、-S(O)2-)、アミド(例えば、-C(O)NR2、または-N(R)C(O)R)、アジド(例えば、-N3)、ニトロ(例えば、-NO2)、シアノ(例えば、-CN)、イソシアノ(例えば、-NC)、アシルオキシ(例えば、-OC(O)R)、アミノ(例えば、-NR2、-NRH、または-NH2)、カルバモイル(例えば、-OC(O)NR2、-OC(O)NRH、または-OC(O)NH2)、スルホンアミド(例えば、-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H、または-N(H)S(O)2H)、アルキル基、アルケニル基、およびシクリル(例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル)基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
前述のもののいずれにおいても、Rは、本明細書において定義される通り、アルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書において定義される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの置換基でさらに置換されてもよい。例えば、C1~6アルキル基は、本明細書に記載される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの置換基でさらに置換されてもよい。
式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、および(IIe)のうちのいずれか1つの化合物は、適宜、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、Qは、C3~6炭素環、N、O、S、およびPから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員芳香族または非芳香族の複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択される。
他の実施形態では、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、O、およびSから選択される1個もしくは複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR、ならびにN、O、およびSから選択される1個もしくは複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロシクロアルキルであって、オキソ(=O)、OH、アミノ、およびC1~3アルキルから選択される1つもしくは複数の置換基で置換されているヘテロシクロアルキルから選択され、各nは、独立に、1、2、3、4、および5から選択される。
他の実施形態では、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、O、およびSから選択される1個もしくは複数のヘテロ原子を有する5~14員複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立に、1、2、3、4、および5から選択され、Qが5~14員複素環であり、かつ(i)R4が、nが1または2である-(CH2)nQであるか、または(ii)R4が、nが1である-(CH2)nCHQRであるか、または(iii)R4が-CHQRおよび-CQ(R)2である場合、Qは、5~14員ヘテロアリールまたは8~14員ヘテロシクロアルキルのいずれかである。
他の実施形態では、R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、C3~6炭素環、N、O、およびSから選択される1個もしくは複数のヘテロ原子を有する5~14員ヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立に、1、2、3、4、および5から選択される。
別の実施形態では、R4は、非置換C1~4アルキル、例えば、非置換メチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物を提供し、ここで、R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、nは、3、4、および5から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物を提供し、ここで、R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、および-CQ(R)2からなる群から選択され、ここで、Qは、-N(R)2であり、nは、1、2、3、4、および5から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物を提供し、ここで、R2およびR3は、独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、ここで、Qは、-N(R)2であり、nは、3、4、および5から選択される。
ある特定の実施形態では、R2およびR3は独立して、C2~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
一部の実施形態では、R1は、C5~20アルキルおよびC5~20アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態では、R1は、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、R1は、-R*YR”および-YR”から選択される。一部の実施形態では、Yは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、R*は、C8アルキルまたはC8アルケニルである。ある特定の実施形態では、R”は、C3~12アルキルである。例えば、R”は、C3アルキルであり得る。例えば、R”は、C4~8アルキル(例えば、C4、C5、C6、C7、またはC8アルキル)であり得る。
一部の実施形態では、R1は、C5~20アルキルである。一部の実施形態では、R1は、C6アルキルである。一部の実施形態では、R1は、C8アルキルである。他の実施形態では、R1は、C9アルキルである。ある特定の実施形態では、R1は、C14アルキルである。他の実施形態では、R1は、C18アルキルである。
一部の実施形態では、R1は、C5~20アルケニルである。ある特定の実施形態では、R1は、C18アルケニルである。一部の実施形態では、R1は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、R1は、分岐鎖である(例えば、デカン-2-イル、ウンデカン-3-イル、ドデカン-4-イル、トリデカン-5-イル、テトラデカン-6-イル、2-メチルウンデカン-3-イル、2-メチルデカン-2-イル、3-メチルウンデカン-3-イル、4-メチルドデカン-4-イル、またはヘプタデカ-9-イル)。ある特定の実施形態では、R1は、
である。
である。
ある特定の実施形態では、R1は、非置換C5~20アルキルまたはC5~20アルケニルである。ある特定の実施形態では、R’は、置換C5~20アルキルまたはC5~20アルケニル(例えば、1-シクロプロピルノニルなど、C3~6炭素環で置換されたもの)である。
他の実施形態では、R1は、-R”M’R’である。
一部の実施形態では、R’は、-R*YR”および-YR”から選択される。一部の実施形態では、Yは、C3~8シクロアルキルである。一部の実施形態では、Yは、C6~10アリールである。一部の実施形態では、Yは、シクロプロピル基である。一部の実施形態では、Yは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、R*は、C1アルキルである。
一部の実施形態では、R”は、C3~12アルキルおよびC3~12アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、Yに隣接するR”は、C1アルキルである。一部の実施形態では、Yに隣接するR”は、C4~9アルキル(例えば、C4、C5、C6、C7またはC8またはC9アルキル)である。
一部の実施形態では、R’は、C4アルキルおよびC4アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、R’は、C5アルキルおよびC5アルケニルから選択される。一部の実施形態では、R’は、C6アルキルおよびC6アルケニルから選択される。一部の実施形態では、R’は、C7アルキルおよびC7アルケニルから選択される。一部の実施形態では、R’は、C9アルキルおよびC9アルケニルから選択される。
他の実施形態では、R’は、C11アルキルおよびC11アルケニルから選択される。他の実施形態では、R’は、C12アルキル、C12アルケニル、C13アルキル、C13アルケニル、C14アルキル、C14アルケニル、C15アルキル、C15アルケニル、C16アルキル、C16アルケニル、C17アルキル、C17アルケニル、C18アルキル、およびC18アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、R’は、分岐鎖である(例えば、デカン-2-イル、ウンデカン-3-イル、ドデカン-4-イル、トリデカン-5-イル、テトラデカン-6-イル、2-メチルウンデカン-3-イル、2-メチルデカン-2-イル、3-メチルウンデカン-3-イル、4-メチルドデカン-4-イル、またはヘプタデカ-9-イル)。ある特定の実施形態では、R’は、
である。
である。
ある特定の実施形態では、R’は、非置換C1~18アルキルである。ある特定の実施形態では、R’は、置換C1~18アルキル(例えば、1-シクロプロピルノニルなど、C3~6炭素環で置換されたC1~15アルキル)である。
一部の実施形態では、R”は、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択される。一部の実施形態では、R”は、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、C6アルキル、C7アルキル、またはC8アルキルである。一部の実施形態では、R”は、C9アルキル、C10アルキル、C11アルキル、C12アルキル、C13アルキル、またはC14アルキルである。
一部の実施形態では、M’は、-C(O)O-である。一部の実施形態では、M’は、-OC(O)-である。
他の実施形態では、M’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、M’は、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、Mは、-C(O)O-である。一部の実施形態では、Mは、-OC(O)-である。一部の実施形態では、Mは、-C(O)N(R’)-である。一部の実施形態では、Mは、-P(O)(OR’)O-である。
他の実施形態では、Mは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Mは、フェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、Mは、M’と同じである。他の実施形態では、Mは、M’とは異なる。
一部の実施形態では、各R5は、Hである。ある特定のそのような実施形態では、各R6も、Hである。
一部の実施形態では、R7は、Hである。他の実施形態では、R7は、C1~3アルキル(例えば、メチル、エチル、プロピル、またはi-プロピル)である。
一部の実施形態では、R2およびR3は、独立して、C5~14アルキルまたはC5~14アルケニルである。
一部の実施形態では、R2およびR3は同じである。一部の実施形態では、R2およびR3は、C8アルキルである。ある特定の実施形態では、R2およびR3は、C2アルキルである。他の実施形態では、R2およびR3は、C3アルキルである。一部の実施形態では、R2およびR3は、C4アルキルである。ある特定の実施形態では、R2およびR3は、C5アルキルである。他の実施形態では、R2およびR3は、C6アルキルである。一部の実施形態では、R2およびR3は、C7アルキルである。
他の実施形態では、R2およびR3は異なる。ある特定の実施形態では、R2は、C8アルキルである。一部の実施形態では、R3は、C1~7(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、またはC7アルキル)またはC9アルキルである。
一部の実施形態では、R7およびR3は、Hである。
ある特定の実施形態では、R2は、Hである。
一部の実施形態では、mは、5、7、または9である。
一部の実施形態では、R4は、-(CH2)nQおよび-(CH2)nCHQRから選択される。
一部の実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-C(R)N(R)2C(O)OR、炭素環、および複素環からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Qは、-OHである。
ある特定の実施形態では、Qは、置換または非置換5~10員ヘテロアリールであり、例えば、Qは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、2-アミノ-1,9-ジヒドロ-6H-プリン-6-オン-9-イル(もしくはグアニン-9-イル)、アデニン-9-イル、シトシン-1-イル、またはウラシル-1-イルである。ある特定の実施形態では、Qは、例えばオキソ(=O)、OH、アミノ、およびC1~3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換された、置換5~14員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Qは、4-メチルピペラジニル、4-(4-メトキシベンジル)ピペラジニル、またはイソインドリン-2-イル-1,3-ジオンである。
ある特定の実施形態では、Qは、非置換または置換C6~10アリール(フェニルなど)またはC3~6シクロアルキルである。
一部の実施形態では、nは、1である。他の実施形態では、nは、2である。さらなる実施形態では、nは、3である。ある特定の実施形態では、nは、4である。例えば、R4は、-(CH2)2OHであり得る。例えば、R4は、-(CH2)3OHであり得る。例えば、R4は、-(CH2)4OHであり得る。例えば、R4は、ベンジルであり得る。例えば、R4は、4-メトキシベンジルであり得る。
一部の実施形態では、R4は、C3~6炭素環である。一部の実施形態では、R4は、C3~6シクロアルキルである。例えば、R4は、例えば、OH、ハロ、C1~6アルキルなどで任意選択で置換されたシクロヘキシルであり得る。例えば、R4は、2-ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
一部の実施形態では、Rは、Hである。
一部の実施形態では、Rは、非置換C1~3アルキルまたは非置換C2~3アルケニルである。例えば、R4は、-CH2CH(OH)CH3または-CH2CH(OH)CH2CH3であり得る。
一部の実施形態では、Rは、置換C1~3アルキル、例えば、CH2OHである。例えば、R4は、-CH2CH(OH)CH2OHであり得る。
一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、N、O、S、およびPから選択される1個または複数のヘテロ原子を有する5~14員芳香族または非芳香族複素環を形成する。一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである、任意選択で置換されるC3~20炭素環(例えば、C3~18炭素環、C3~15炭素環、C3~12炭素環、またはC3~10炭素環)を形成する。一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、C3~6炭素環を形成する。他の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、C6炭素環、例えば、シクロヘキシルまたはフェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはC3~6炭素環は、1つまたは複数のアルキル基で置換される(例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において)。例えば、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、1つまたは複数のC5アルキル置換を有するシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、R2およびR3によって形成された複素環またはC3~6炭素環は、炭素環式基で置換される。例えば、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されたシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、C7~15炭素環、例えば、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基を形成する。
一部の実施形態では、R4は、-(CH2)nQおよび-(CH2)nCHQRから選択される。一部の実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、および複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Qは、イミダゾール、ピリミジン、およびプリンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。一部の実施形態では、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、C3~6炭素環、例えば、フェニル基を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはC3~6炭素環は、1つまたは複数のアルキル基で置換される(例えば、同じ環原子または隣接もしくは非隣接の環原子において)。例えば、R2およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、1つまたは複数のC5アルキル置換を有するフェニル基を形成し得る。
他の実施形態では、式(I)の化合物は、化合物1~化合物147、またはそれらの塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
本明細書に開示される脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下において、プロトン化され得る。例えば、式(I)による脂質の中心アミン部分は、典型的に、アミノ部分のpKaよりも低いpHではプロトン化され(すなわち、正に荷電する)、pKaよりも高いpHでは実質的に荷電されない。そのような脂質は、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
1つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、化合物18である。
一部の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約1モル%~99モル%の範囲である。
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99モル%である。
一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約30モル%~約70モル%、約35モル%~約65モル%、約40モル%~約60モル%、および約45モル%~約55モル%の範囲である。
1つの特定の実施形態では、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約50モル%である。
本明細書に開示されるイオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物に加えて、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、追加の成分、例えば、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、PEG脂質、およびこれらの任意の組合せを含み得る。
他の態様では、脂質ナノ粒子は、約20~60%のイオン化可能アミノ脂質:5~25%のリン脂質:25~55%のステロール;および0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約20~60%の化合物18:5~25%のリン脂質:25~55%のコレステロール;および0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約50%のイオン化可能アミノ脂質:約10%のリン脂質:約38.5%のコレステロール;および約1.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約50%の化合物18:約10%のリン脂質:約38.5%のコレステロール;および約1.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約49.83%のイオン化可能アミノ脂質:約9.83%のリン脂質:約30.33%のコレステロール;および約2.0%のPEG修飾脂質のモル比を含む。他の態様では、脂質ナノ粒子担体は、約49.83%の化合物18:約9.83%のリン脂質:約30.33%のコレステロール;および約2.0%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
b.脂質組成物中の追加の成分
(i)リン脂質
b.脂質組成物中の追加の成分
(i)リン脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のリン脂質、例えば、1つまたは複数の飽和または(ポリ)不飽和リン脂質またはそれらの組合せを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および1つまたは複数の脂肪酸部分を含む。例えば、リン脂質は、式(VII)による脂質であり得、
Rpは、リン脂質部分を表し、R1およびR2は、同じであっても異なってもよい、不飽和ありまたはなしの脂肪酸部分を表す。
Rpは、リン脂質部分を表し、R1およびR2は、同じであっても異なってもよい、不飽和ありまたはなしの脂肪酸部分を表す。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、2-リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ-リノール酸、エルカ酸、フィタン酸(phytanoic acid)、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサンエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜(例えば、細胞膜または細胞内膜)の1つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物(例えば、LNP)の1つまたは複数の要素(例えば、治療剤)が、膜を通過することを可能にし得、例えば、1つまたは複数の要素の標的組織(例えば、腫瘍組織)への送達を可能にし得る。
分岐化、酸化、環化、およびアルキンを含む修飾および置換を有する天然の種を含む、非天然のリン脂質の種もまた、企図される。例えば、リン脂質は、1つまたは複数のアルキン(例えば、1つまたは複数の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基)で官能化され得るかまたはそれに架橋し得る。適切な反応条件下において、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅に触媒される環状付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化すること、またはナノ粒子組成物を、有用な成分、例えば、標的化もしくは画像化部分(例えば、色素)にコンジュゲートすることに有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される腫瘍内送達のための医薬組成物は、1つより多くのリン脂質を含んでもよい。1つより多くのリン脂質が使用される場合、そのようなリン脂質は、同じリン脂質クラス(例えば、MSPCおよびDSPC)、または異なるクラス(例えば、MSPCおよびMSPE)に属し得る。
リン脂質は、対称型または非対称型のものであり得る。本明細書において使用されるとき、「対称リン脂質」という用語には、一致する脂肪酸部分を有するグリセロリン脂質、ならび変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、同等の数の炭素原子を含む、スフィンゴ脂質が含まれる。本明細書において使用されるとき、「非対称リン脂質」という用語には、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分(例えば、異なる数の炭素原子および/または不飽和(例えば、二重結合)を有する脂肪酸部分)を有するグリセロリン脂質、ならびに変動する脂肪酸部分およびスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が、類似しない数の炭素原子を含む(例えば、変動する脂肪酸部分が、炭化水素鎖よりも少なくとも2個多い炭素原子を含むか、炭化水素鎖よりも少なくとも2個少ない炭素原子を含む)、スフィンゴ脂質が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも1つの対称リン脂質を含む。対称リン脂質は、
1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(03:0 PC)、
1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(04:0 PC)、
1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(05:0 PC)、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(06:0 PC)、
1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(07:0 PC)、
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(08:0 PC)、
1,2-ジノナノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(09:0 PC)、
1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(10:0 PC)、
1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(11:0 PC、DUPC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(12:0 PC)、
1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(13:0 PC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0 PC、DMPC)、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0 PC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0 PC、DPPC)、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(4ME 16:0 PC)、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(17:0 PC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 PC、DSPC)、
1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(19:0 PC)、
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:0 PC)、
1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(21:0 PC)、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:0 PC)、
1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(23:0 PC)、
1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:0 PC)、
1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:1(Δ9-Cis)PC)、
1,2-ジミリステライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:1(Δ9-Cis)PC)、
1,2-ジパルミテライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジペトロセレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ6-Cis)PC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ9-Cis)PC、DOPC)、
1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:2(Cis)PC、DLPC)、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:3(Cis)PC、DLnPC)、
1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:1(Cis)PC)、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:4(Cis)PC、DAPC)、
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:1(Cis)PC)、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:6(Cis)PC、DHAPC)、
1,2-ジネルボノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:1(Cis)PC)、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(06:0 PE)、
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(08:0 PE)、
1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(10:0 PE)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(12:0 PE)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(14:0 PE)、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(15:0
PE)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0 PE)、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(4ME 16:0 PE)、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(17:0
PE)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0 PE、DSPE)、
1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:1
PE)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1(Δ9-Cis)PE、DOPE)、
1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1(Δ9-Trans)PE)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:2 PE、DLPE)、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:3 PE、DLnPE)、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(20:4 PE、DAPE)、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(22:6 PE、DHAPE)、
1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 ジエーテルPC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
1,2-ジプロピオニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(03:0 PC)、
1,2-ジブチリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(04:0 PC)、
1,2-ジペンタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(05:0 PC)、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(06:0 PC)、
1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(07:0 PC)、
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(08:0 PC)、
1,2-ジノナノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(09:0 PC)、
1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(10:0 PC)、
1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(11:0 PC、DUPC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(12:0 PC)、
1,2-ジトリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(13:0 PC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0 PC、DMPC)、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0 PC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0 PC、DPPC)、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(4ME 16:0 PC)、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(17:0 PC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 PC、DSPC)、
1,2-ジノナデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(19:0 PC)、
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:0 PC)、
1,2-ジヘンアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(21:0 PC)、1,2-ジベヘノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:0 PC)、
1,2-ジトリコサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(23:0 PC)、
1,2-ジリグノセロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:0 PC)、
1,2-ジミリストレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:1(Δ9-Cis)PC)、
1,2-ジミリステライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:1(Δ9-Cis)PC)、
1,2-ジパルミテライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジペトロセレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ6-Cis)PC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ9-Cis)PC、DOPC)、
1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1(Δ9-Trans)PC)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:2(Cis)PC、DLPC)、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:3(Cis)PC、DLnPC)、
1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:1(Cis)PC)、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:4(Cis)PC、DAPC)、
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:1(Cis)PC)、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:6(Cis)PC、DHAPC)、
1,2-ジネルボノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:1(Cis)PC)、
1,2-ジヘキサノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(06:0 PE)、
1,2-ジオクタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(08:0 PE)、
1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(10:0 PE)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(12:0 PE)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(14:0 PE)、
1,2-ジペンタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(15:0
PE)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0 PE)、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(4ME 16:0 PE)、
1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(17:0
PE)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0 PE、DSPE)、
1,2-ジパルミトレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:1
PE)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1(Δ9-Cis)PE、DOPE)、
1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1(Δ9-Trans)PE)、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:2 PE、DLPE)、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:3 PE、DLnPE)、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(20:4 PE、DAPE)、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(22:6 PE、DHAPE)、
1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 ジエーテルPC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0 Diether PC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME 16:0 PE、DSPE、DLPE,DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択される少なくとも1つの対称リン脂質を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも1つの非対称リン脂質を含む。非対称リン脂質は、
1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-16:0 PC、MPPC)、
1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-18:0 PC、MSPC)、
1-パルミトイル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-02:0 PC)、
1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-14:0 PC、PMPC)、
1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:0 PC、PSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:1 PC、POPC)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:2 PC、PLPC)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-20:4 PC)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-22:6 PC)、
1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-14:0 PC、SMPC)、
1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-16:0 PC、SPPC)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:1 PC、SOPC)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:2 PC)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-20:4 PC)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-22:6 PC)、
1-オレオイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-14:0 PC、OMPC)、
1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-16:0 PC、OPPC)、
1-オレオイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-18:0 PC、OSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:1 PE、POPE)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:2 PE)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-20:4 PE)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-22:6 PE)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:1 PE)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:2 PE)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-20:4 PE)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-22:6 PE)、
1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-16:0 PC、MPPC)、
1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-18:0 PC、MSPC)、
1-パルミトイル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-02:0 PC)、
1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-14:0 PC、PMPC)、
1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:0 PC、PSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:1 PC、POPC)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:2 PC、PLPC)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-20:4 PC)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-22:6 PC)、
1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-14:0 PC、SMPC)、
1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-16:0 PC、SPPC)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:1 PC、SOPC)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:2 PC)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-20:4 PC)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-22:6 PC)、
1-オレオイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-14:0 PC、OMPC)、
1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-16:0 PC、OPPC)、
1-オレオイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-18:0 PC、OSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:1 PE、POPE)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:2 PE)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-20:4 PE)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-22:6 PE)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:1 PE)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:2 PE)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-20:4 PE)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-22:6 PE)、
1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
脂質組成物において有用な非対称脂質はまた、リゾ脂質であってもよい。リゾ脂質は、1-ヘキサノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(06:0 Lyso PC)、
1-ヘプタノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(07:0 Lyso PC)、
1-オクタノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(08:0 Lyso PC)、
1-ノナノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(09:0 Lyso PC)、
1-デカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(10:0 Lyso PC)、
1-ウンデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(11:0 Lyso PC)、
1-ラウロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(12:0 Lyso PC)、
1-トリデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(13:0 Lyso PC)、
1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0 Lyso PC)、
1-ペンタデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0
Lyso PC)、
1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0 Lyso PC)、
1-ヘプタデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(17:0
Lyso PC)、
1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 Lyso PC)、
1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1 Lyso PC)、
1-ノナデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(19:0 Lyso PC)、
1-アラキドイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:0 Lyso PC)、
1-ベヘノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:0 Lyso PC)、
1-リグノセロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:0 Lyso PC)、
1-ヘキサコサノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(26:0
Lyso PC)、
1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(14:0 Lyso PE)、
1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0 Lyso PE)、
1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0 Lyso PE)、
1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1 Lyso PE)、
1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16 Lyso PC)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
1-ヘプタノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(07:0 Lyso PC)、
1-オクタノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(08:0 Lyso PC)、
1-ノナノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(09:0 Lyso PC)、
1-デカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(10:0 Lyso PC)、
1-ウンデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(11:0 Lyso PC)、
1-ラウロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(12:0 Lyso PC)、
1-トリデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(13:0 Lyso PC)、
1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0 Lyso PC)、
1-ペンタデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(15:0
Lyso PC)、
1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0 Lyso PC)、
1-ヘプタデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(17:0
Lyso PC)、
1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 Lyso PC)、
1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1 Lyso PC)、
1-ノナデカノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(19:0 Lyso PC)、
1-アラキドイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(20:0 Lyso PC)、
1-ベヘノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(22:0 Lyso PC)、
1-リグノセロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(24:0 Lyso PC)、
1-ヘキサコサノイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(26:0
Lyso PC)、
1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(14:0 Lyso PE)、
1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0 Lyso PE)、
1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0 Lyso PE)、
1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:1 Lyso PE)、
1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16 Lyso PC)、およびこれらの任意の組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、MPPC、MSPC、PMPC、PSPC、SMPC、SPPC、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つの非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、非対称リン脂質は、1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MSPC)である。特定の実施形態では、非対称リン脂質は、2017年4月13日に出願された国際出願第PCT/US17/27492号に開示されている1つまたは複数のリン脂質であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、1つもしくは複数の対称リン脂質、1つもしくは複数の非対称リン脂質、またはこれらの組合せを含有し得る。複数のリン脂質が存在する場合、それらは、等モル比または非等モル比で存在し得る。
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、脂質組成物中、約1モル%~約20モル%、約5モル%~約20モル%、約10モル%~約20モル%、約15モル%~約20モル%、約1モル%~約15モル%、約5モル%~約15モル%、約10モル%~約15モル%、約5モル%~約10モル%の範囲の総量のリン脂質(例えば、MSPC)を含む。一実施形態では、リン脂質の量は、脂質組成物中、約8モル%~約15モル%である。一実施形態では、リン脂質(例えば、MSPC)の量は、脂質組成物中、約10モル%である。
一部の態様では、特定のリン脂質(例えば、MSPC)の量は、脂質組成物中、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20モル%である。
(ii)第四級アミン化合物
(ii)第四級アミン化合物
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)を含み得る。「第四級アミン化合物」という用語は、1つまたは複数の第四級アミン基(例えば、トリアルキルアミノ基)を有し、永続的に正の電荷を有し、塩の形態で存在する、化合物を含んで使用される。例えば、1つまたは複数の第四級アミン基は、脂質またはポリマー(例えば、PEG)で存在し得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、(1)第四級アミン基、ならびに(2)(i)直鎖もしくは分岐鎖で飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖、および(ii)任意選択で、第四級アミン基と炭化水素鎖との間にエーテル、エステル、カルボニル、もしくはケタール結合を含む、少なくとも1つの疎水性尾部基を含む。一部の実施形態では、第四級アミン基は、トリメチルアンモニウム基であり得る。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、2つの同一な炭化水素鎖を含む。一部の実施形態では、第四級アミン化合物は、2つの異なる炭化水素鎖を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、少なくとも1つの第四級アミン化合物を含む。第四級アミン化合物は、
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、
N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、
1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、
2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、
N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、
N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、
N-(1,2-ジオレオイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、
N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLePC)、
1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DSTAP)、
1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DPTAP)、
1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DLTAP)、
1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DMTAP)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSePC)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMePC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOePC)、
1,2-ジ-(9Z-テトラデセノイル)-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、
およびこれらの任意の組合せからなる非限定群から選択され得る。
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、
N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、
1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、
2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、
N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、
N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、
N-(1,2-ジオレオイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、
N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLePC)、
1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DSTAP)、
1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DPTAP)、
1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DLTAP)、
1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DMTAP)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSePC)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMePC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOePC)、
1,2-ジ-(9Z-テトラデセノイル)-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、
およびこれらの任意の組合せからなる非限定群から選択され得る。
一実施形態では、第四級アミン化合物は、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)である。
第四級アミン化合物は、US2013/0245107 A1、US2014/0363493 A1、US8,158,601、WO2015/123264 A1、およびWO2015/148247 A1に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約0.01モル%~約20モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約0.5モル%~約20モル%、約0.5モル%~約15モル%、約0.5モル%~約10モル%、約1モル%~約20モル%、約1モル%~約15モル%、約1モル%~約10モル%、約2モル%~約20モル%、約2モル%~約15モル%、約2モル%~約10モル%、約3モル%~約20モル%、約3モル%~約15モル%、約3モル%~約10モル%、約4モル%~約20モル%、約4モル%~約15モル%、約4モル%~約10モル%、約5モル%~約20モル%、約5モル%~約15モル%、約5モル%~約10モル%、約6モル%~約20モル%、約6モル%~約15モル%、約6モル%~約10モル%、約7モル%~約20モル%、約7モル%~約15モル%、約7モル%~約10モル%、約8モル%~約20モル%、約8モル%~約15モル%、約8モル%~約10モル%、約9モル%~約20モル%、約9モル%~約15モル%、約9モル%~約10モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約5モル%~約10モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約5モル%である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約10モル%である。
一部の実施形態では、第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、本明細書に開示の脂質組成物中の少なくとも約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5または20モル%である。
一部の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式(I)の化合物を含む。一実施形態では、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)対第四級アミン化合物(例えば、DOTA)のモル濃度比は、約100:1~約2.5:1である。一実施形態では、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)対第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)のモル濃度比は、約90:1、約80:1、約70:1、約60:1、約50:1、約40:1、約30:1、約20:1、約15:1、約10:1、約9:1、約8:1、約7:1、約6:1、約5:1、または約2.5:1である。一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)対第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)のモル濃度比は、約10:1である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、2017年4月13日に出願された国際出願第PCT/US2017/027492号に開示されている脂質組成物を含み、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、第四級アミン化合物を含まない。一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、DOTAPを含まない。
(iii)構造脂質
(iii)構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含有する脂質を指す。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ-トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。
一実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質(例えば、ステロール、例えば、コレステロール)の量は、約20モル%~約60モル%、約25モル%~約55モル%、約30モル%~約50モル%、もしくは約35モル%~約45モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、ステロール、例えば、コレステロール)の量は、約25モル%~約30モル%、約30モル%~約35モル%、もしくは約35モル%~約40モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、ステロール、例えば、コレステロール)の量は、約23.5モル%、約28.5モル%、約33.5モル%、もしくは約38.5モル%である。
一部の実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、ステロール、例えば、コレステロール)の量は、少なくとも約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60モル%である。
一部の態様では、開示される腫瘍内送達のための医薬組成物の脂質組成物成分は、コレステロールを含まない。
(iv)ポリエチレングリコール(PEG)脂質
(iv)ポリエチレングリコール(PEG)脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
本明細書において使用されるとき、「PEG脂質」という用語は、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質を指す。PEG脂質の非限定的な例としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、PEG-セラミドコンジュゲート(例えば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミン、およびPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが挙げられる。そのような脂質は、PEG化脂質とも称される。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であり得る。
一部の実施形態では、PEG脂質としては、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロールメトキシポリエチレングリコール(PEG-DMG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)](PEG-DSPE)、PEG-ジステリルグリセロール(PEG-DSG)、PEG-ジパルメトレイル(PEG-dipalmetoleyl)、PEG-ジオレイル、PEG-ジステアリル、PEG-ジアシルグリカミド(PEG-DAG)、PEG-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DPPE)、またはPEG-1,2-ジミリスチルオキシルプロピル-3-アミン(PEG-c-DMA)が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、PEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
一部の実施形態では、PEG脂質の脂質部分には、約C14~約C22、好ましくは、約C14~約C16の長さを有するものが含まれる。一部の実施形態では、PEG部分、例えば、mPEG-NH2は、約1000、2000、5000、10,000、15,000、または20,000ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGである。
一実施形態では、本明細書に記載される脂質ナノ粒子は、非拡散性PEGであるPEG脂質を含み得る。非拡散性PEGの非限定的な例としては、PEG-DSGおよびPEG-DSPEが挙げられる。
PEG脂質は、米国特許第8158601号および国際公開第WO2015/130584号A2に記載されているものなど、当技術分野において公知であり、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、医薬組成物の脂質組成物中のPEG脂質の量は、約0.1モル%~約5モル%、約0.5モル%~約5モル%、約1モル%~約5モル%、約1.5モル%~約5モル%、約2モル%~約5モル%モル%、約0.1モル%~約4モル%、約0.5モル%~約4モル%、約1モル%~約4モル%、約1.5モル%~約4モル%、約2モル%~約4モル%、約0.1モル%~約3モル%、約0.5モル%~約3モル%、約1モル%~約3モル%、約1.5モル%~約3モル%、約2モル%~約3モル%、約0.1モル%~約2モル%、約0.5モル%~約2モル%、約1モル%~約2モル%、約1.5モル%~約2モル%、約0.1モル%~約1.5モル%、約0.5モル%~約1.5モル%、もしくは約1モル%~約1.5モル%の範囲である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のPEG脂質の量は、約1.5モル%である。
一実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のPEG脂質の量は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、または5モル%である。
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、PEG脂質を含まない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物、および非対称リン脂質を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物18およびMSPCを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物18およびDOTAPを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、イオン化可能アミノ脂質、例えば、式(I)の化合物、非対称リン脂質、および第四級アミン化合物を含む。一部の実施形態では、脂質組成物は、化合物18、MSPC、およびDOTAPを含む。
一実施形態では、脂質組成物は、約50モル%の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)、約10モル%のDSPCまたはMSPC、約33.5モル%のコレステロール、約1.5モル%のPEG-DMG、および約5モル%のDOTAPを含む。一実施形態では、脂質組成物は、約50モル%の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)、約10モル%のDSPCまたはMSPC、約28.5モル%のコレステロール、約1.5モル%のPEG-DMG、および約10モル%のDOTAPを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約20~60%のイオン化可能アミノ脂質:5~25%のリン脂質:25~55%のステロール;および0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約20~60%の化合物18:5~25%のリン脂質:25~55%のコレステロール;および0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約50%のイオン化可能アミノ脂質:約10%のリン脂質:約38.5%のコレステロール;および約1.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約50%の化合物18:約10%のリン脂質:約38.5%のコレステロール;および約1.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約49.83%のイオン化可能アミノ脂質:約9.83%のリン脂質:約30.33%のコレステロール;および約2.0%のPEG修飾脂質のモル比を含む。別の態様では、脂質ナノ粒子キャリアは、約49.83%の化合物18:約9.83%のリン脂質:約30.33%のコレステロール;および約2.0%のPEG修飾脂質のモル比を含む。
脂質ナノ粒子の構成成分は、所望の転帰に基づいてポリヌクレオチドの最適な送達のために適合させることができる。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、40~60モル%のイオン化可能アミノ脂質(例えば、式(I)の化合物)、8~16モル%のリン脂質、30~45モル%のコレステロール、1~5モル%のPEG脂質、および任意選択で1~15モル%の第四級アミン化合物を含み得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、45~65モル%のイオン化可能アミノ脂質(例えば、式(I)の化合物)、5~10モル%のリン脂質、25~40モル%のコレステロール、0.5~5モル%のPEG脂質、および任意選択で1~15モル%の第四級アミン化合物を含み得る。
核酸脂質粒子の非限定的な例は、米国特許公開第20140121263号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(v)他のイオン化可能アミノ脂質
(v)他のイオン化可能アミノ脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、式(I)にしたがう脂質に加えて、1つまたは複数のイオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、1つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電していてもよいし、負に荷電していてもよい。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。
イオン化可能脂質は、
3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、
N1-[2-(ジドデシルアミノ)エチル]-N1,N4,N4-トリドデシル-1,4-ピペラジンジエタンアミン(KL22)、
14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、
1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLin-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、
ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、
2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、
1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、
(13Z,165Z)-N,N-ジメチル-3-ノニドコサ-13-16-ジエン-1-アミン(L608)、
2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA)、
(2R)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2R))、および
(2S)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2S))からなる非限定群から選択され得る。これらに加え、イオン化可能アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、
N1-[2-(ジドデシルアミノ)エチル]-N1,N4,N4-トリドデシル-1,4-ピペラジンジエタンアミン(KL22)、
14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、
1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLin-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、
ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、
2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、
1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、
(13Z,165Z)-N,N-ジメチル-3-ノニドコサ-13-16-ジエン-1-アミン(L608)、
2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA)、
(2R)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2R))、および
(2S)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2S))からなる非限定群から選択され得る。これらに加え、イオン化可能アミノ脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
イオン化可能脂質はまた、国際公開第WO2015/199952号A1に開示されている化合物であってもよく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能アミノ脂質としては、
およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
(vi)他の脂質組成物成分
およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
(vi)他の脂質組成物成分
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上述のものに加えて、1つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、1つまたは複数の透過性増強分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性増強分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号に記載されている分子であってもよい。炭水化物は、単糖類(例えば、グルコース)ならびに多糖類(例えば、グリコーゲン、ならびにその誘導体および類似体)を含み得る。脂質組成物は、pH7のクエン酸もしくはリン酸などであるがこれらに限定されない緩衝液、塩、および/または糖を含み得る。塩および/または糖は、等張性のために、本明細書に記載される製剤に含まれ得る。
ポリマーは、本明細書に開示される医薬組成物(例えば、脂質ナノ粒子の形態の医薬組成物)を封入または部分的に封入するために、含まれ得るおよび/または使用され得る。ポリマーは、生体分解性および/または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約10:1~約60:1(重量/重量)であり得る。
一部の実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1または60:1(重量/重量)であり得る。一部の実施形態では、脂質組成物対治療剤をコードするポリヌクレオチドの重量/重量比は、約20:1または約15:1である。
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、1より多くのポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、2つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)を含有し得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1または70:1、あるいはこれらの比の範囲もしくはいずれか、例えば、これらに限定されないが、5:1~約10:1、約5:1~約15:1、約5:1~約20:1、約5:1~約25:1、約5:1~約30:1、約5:1~約35:1、約5:1~約40:1、約5:1~約45:1、約5:1~約50:1、約5:1~約55:1、約5:1~約60:1、約5:1~約70:1、約10:1~約15:1、約10:1~約20:1、約10:1~約25:1、約10:1~約30:1、約10:1~約35:1、約10:1~約40:1、約10:1~約45:1、約10:1~約50:1、約10:1~約55:1、約10:1~約60:1、約10:1~約70:1、約15:1~約20:1、約15:1~約25:1,約15:1~約30:1、約15:1~約35:1、約15:1~約40:1、約15:1~約45:1、約15:1~約50:1、約15:1~約55:1、約15:1~約60:1または約15:1~約70:1の脂質:ポリヌクレオチド重量比のポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、およそ0.1mg/ml~2mg/ml、例えば、これらに限定されないが、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/mlまたは2.0mg/mlより大きな濃度のポリヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドおよび脂質ナノ粒子を含む製剤は、0.15mg/ml~2mg/mlの本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を含み得る。一部の実施形態では、製剤は、10mMのクエン酸緩衝液をさらに含んでもよく、製剤は、追加で、10%重量/重量までのスクロース(例えば、少なくとも1%重量/重量、少なくとも2%重量/重量/、少なくとも3%重量/重量、少なくとも4%重量/重量、少なくとも5%重量/重量、少なくとも6%重量/重量、少なくとも7%重量/重量、少なくとも8%重量/重量、少なくとも9%重量/重量または10%重量/重量)を含んでもよい。
(vii)ナノ粒子組成物
(vii)ナノ粒子組成物
一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される。したがって、本開示はまた、(i)本明細書に記載される式(I)の化合物などの送達剤を含む脂質組成物、ならびに(ii)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ナノ粒子組成物も提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
ナノ粒子組成物は、典型的に、マイクロメートル単位またはそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質小胞)、およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、500nmまたはそれよりも小さい直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物には、例えば、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム、およびリポプレックスが含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、1つまたは複数の脂質二重層を含む、小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水溶性コンパートメントで分離された、2つまたはそれよりも多い同心二重層を含む。脂質二重層は、互いに官能化および/または架橋され得る。脂質二重層は、1つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
本開示のナノ粒子組成物は、式(I)による少なくとも1つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物1~147のうちの1つもしくは複数、または化合物1~342のうちの1つもしくは複数を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、様々な他の成分も含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、式(I)による脂質に加えて、1つまたは複数の他の脂質、例えば、(i)少なくとも1つのリン脂質、(ii)少なくとも1つの第四級アミン化合物、(iii)少なくとも1つの構造脂質、(iv)少なくとも1つのPEG脂質、または(v)これらの任意の組合せを含んでもよい。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)およびリン脂質(例えば、DSPCまたはMSPC)を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)、リン脂質(例えば、DSPCまたはMSPC)、および第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)および第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)およびリン脂質(例えば、DSPCまたはMSPC)からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)、リン脂質(例えば、DSPCまたはMSPC)、および第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26、または48)および第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)からなるか、または本質的にそれからなる、脂質組成物を含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、(1)約50モル%の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48);約10モル%のDSPCまたはMSPC;約33.5モル%のコレステロール;約1.5モル%のPEG-DMG(例えば、PEG2k-DMG);約5モル%のDOTAPを含む脂質組成物;および(2)ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、(1)約50モル%の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48);約10モル%のDSPCまたはMSPC;約28.5モル%のコレステロール;約1.5モル%のPEG-DMG(例えば、PEG2k-DMG);約10モル%のDOTAPを含む脂質組成物;および(2)ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ナノ粒子組成物は、(1)約50モル%の式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48);約10モル%のDSPCまたはMSPC;約23.5モル%のコレステロール;約1.5モル%のPEG-DMG(例えば、PEG2k-DMG);約15モル%のDOTAPを含む脂質組成物;および(2)ポリヌクレオチドを含む。
ナノ粒子組成物は、様々な方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡法(例えば、透過電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡)を使用して、ナノ粒子組成物の形態学およびサイズ分布を試験することができる。動的光散乱法または電位差測定(例えば、電位差滴定)を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒子サイズを判定するためにも利用することができる。Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd、Malvern、Worcestershire、UK)などの機器もまた、ナノ粒子組成物の複数の特徴、例えば、粒子サイズ、多分散性指標、およびゼータ電位を測定するために使用され得る。
本明細書において一般に定義されるように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在しても合成であってもよい。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン類、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、一部の脂質の両親媒性の特性により、水性媒体中で、リポソーム、小胞、または膜の形成がもたらされる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子(LNP)は、イオン化可能脂質を含み得る。本明細書において使用されるとき、「イオン化可能脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、1つまたは複数の荷電した部分を含む脂質を指し得る。一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、正に荷電している場合も負に荷電している場合もある。イオン化可能脂質は、正に荷電してもよく、その場合には、「カチオン性脂質」と称され得る。例えば、イオン化可能分子は、アミン基を含み得、イオン化可能アミノ脂質と称され得る。本明細書において使用されるとき、「荷電した部分」は、正式な電子電荷、例えば、一価(+1または-1)、二価(+2または-2)、三価(+3または-3)などを有する化学的部分である。荷電した部分は、アニオン性(すなわち、負に荷電している)またはカチオン性(すなわち、正に荷電している)であり得る。正に荷電した部分の例としては、アミン基(例えば、第一級、第二級、および/または第三級アミン)、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、ならびにイミジゾリウム(imidizolium)基が挙げられる。特定の実施形態では、荷電した部分は、アミン基を含む。負に荷電した基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電した部分の電荷は、変動し得、一部の事例では、環境条件、例えば、pHの変化により、その部分の電荷が変化し得る、かつ/またはその部分が荷電するかもしくは非荷電になることをもたらし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
「荷電した」または「荷電した部分」という用語は、分子上の「部分的な負の電荷」または「部分的な正の電荷」を指すものではないことを理解されたい。「部分的な負の電荷」および「部分的な正の電荷」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的な負の電荷」は、官能基が、極性を生じる結合を含み、電子密度が結合の1つの原子に引き寄せられ、その原子に部分的な負の電荷をもたらす場合に、生じ得る。当業者であれば、一般に、このようにして極性が生じる結合を認識するであろう。
一部の実施形態では、イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質であり、これは、当技術分野において、「イオン化可能カチオン性脂質」と称される場合がある。一実施形態では、イオン化可能アミノ脂質は、リンカー構造体を介して接続された正に荷電した親水性の頭部および疎水性の尾部を有し得る。
ナノ粒子のサイズは、炎症などであるがこれに限定されない生物学的反応に対抗するのに役立ち得るか、またはポリヌクレオチドの生物学的効果を増大させ得る。
本明細書において使用されるとき、ナノ粒子組成物の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
一実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、および/またはIL12BとIL12Aとの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、約10~約100nm、例えば、これらに限定されないが、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm、約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nmおよび/または約90~約100nmの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化される。
一実施形態では、ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、100nmより大きい、150nmより大きい、200nmより大きい、250nmより大きい、300nmより大きい、350nmより大きい、400nmより大きい、450nmより大きい、500nmより大きい、550nmより大きい、600nmより大きい、650nmより大きい、700nmより大きい、750nmより大きい、800nmより大きい、850nmより大きい、900nmより大きい、950nmより大きいまたは1000nmより大きい直径を有する。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、1μmまたはそれ未満(例えば、1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、またはそれ未満)である。
ナノ粒子組成物は、比較的に均質であり得る。多分散性指標を使用して、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒子サイズ分布を示すことができる。低い多分散性指標(例えば、0.3未満)は、通常、狭い粒子サイズ分布を示す。ナノ粒子組成物は、約0~約0.25、例えば、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、または0.25の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約0.10~約0.20であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を示し得る。正であっても負であっても比較的低い電荷を有するナノ粒子組成物が、一般的に、望ましいが、これは、より高度に荷電した種は、望ましくなく、細胞、組織、および体内の他の要素と、相互作用し得るためである。一部の実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約-10mV~約+20mV、約-10mV~約+15mV、約10mV~約+10mV、約-10mV~約+5mV、約-10mV~約0mV、約-10mV~約-5mV、約-5mV~約+20mV、約-5mV~約+15mV、約-5mV~約+10mV、約-5mV~約+5mV、約-5mV~約0mV、約0mV~約+20mV、約0mV~約+15mV、約0mV~約+10mV、約0mV~約+5mV、約+5mV~約+20mV、約+5mV~約+15mV、または約+5mV~約+10mVであり得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約0mV~約100mV、約0mV~約90mV、約0mV~約80mV、約0mV~約70mV、約0mV~約60mV、約0mV~約50mV、約0mV~約40mV、約0mV~約30mV、約0mV~約20mV、約0mV~約10mV、約10mV~約100mV、約10mV~約90mV、約10mV~約80mV、約10mV~約70mV、約10mV~約60mV、約10mV~約50mV、約10mV~約40mV、約10mV~約30mV、約10mV~約20mV、約20mV~約100mV、約20mV~約90mV、約20mV~約80mV、約20mV~約70mV、約20mV~約60mV、約20mV~約50mV、約20mV~約40mV、約20mV~約30mV、約30mV~約100mV、約30mV~約90mV、約30mV~約80mV、約30mV~約70mV、約30mV~約60mV、約30mV~約50mV、約30mV~約40mV、約40mV~約100mV、約40mV~約90mV、約40mV~約80mV、約40mV~約70mV、約40mV~約60mV、および約40mV~約50mVであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV~約50mV、約15mV~約45mV、約20mV~約40mV、および約25mV~約35mVであり得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV、約20mV、約30mV、約40mV、約50mV、約60mV、約70mV、約80mV、約90mV、および約100mVであり得る。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、提供された最初の量に対して、調製後にナノ粒子組成物に封入されるかまたはそれ以外の方法で会合される、ポリヌクレオチドの量を示す。本明細書において使用されるとき、「封入」は、完全、実質的、または部分的な封止、閉じ込め、包囲、または内包を指し得る。
封入効率は、高いことが望ましい(例えば、100%に近い)。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含有する溶液中のポリヌクレオチドの量を、1つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤でナノ粒子組成物を破壊する前と後で、比較することによって、測定することができる。
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定してもよい。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも50%、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも80%であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも90%であり得る。
本明細書に開示される医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、複数の要因、例えば、ポリヌクレオチドのサイズ、所望される標的および/もしくは用途、またはナノ粒子組成物の他の特性、ならびにポリヌクレオチドの特性に依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物において有用なmRNAの量は、mRNAのサイズ(長さ、または分子量として表される)、配列、および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対的な量はまた、変動し得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物およびポリヌクレオチドの相対的な量は、有効性および耐容性を考慮して最適化することができる。mRNAをポリヌクレオチドとして含む組成物については、N:P比が、有用な測定法としての機能を果たし得る。
ナノ粒子組成物のN:P比は、発現および耐容性の両方を調節するため、低いN:P比および強い発現を有するナノ粒子組成物が、望ましい。N:P比は、ナノ粒子組成物中の脂質対RNAの比に応じて変動する。
一般に、低いN:P比が、好ましい。1つまたは複数のRNA、脂質、およびそれらの量は、約2:1~約30:1、例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1、または30:1のN:P比を提供するように選択され得る。ある特定の実施形態では、N:P比は、約2:1~約8:1であり得る。他の実施形態では、N:P比は、約5:1~約8:1である。ある特定の実施形態では、N:P比は、5:1~6:1である。1つの特定の態様では、N:P比は、約5.67:1である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子を産生する方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示される医薬組成物のうちのいずれかを使用し、当技術分野において公知の脂質ナノ粒子の産生方法に従って、脂質ナノ粒子を産生することを含む。例えば、Wangら、(2015年)「Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles」Adv. Drug Deliv. Rev.、87巻、68~80頁;Silvaら、(2015年)「Delivery Systems for Biopharmaceuticals. Part I: Nanoparticles and Microparticles」、Curr. Pharm. Technol.、16巻、940~954頁;Naseriら、(2015年)「Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application」、Adv. Pharm. Bull.、5巻、305~13頁;Silvaら、(2015年)「Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals」、Curr. Pharm. Biotechnol.、16巻、291~302頁、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。
25.他の送達剤
a.リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
25.他の送達剤
a.リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはこれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、1つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して、ポリヌクレオチドによって誘導されるタンパク質の産生の有効性を改善することができるが、これは、これらの製剤が、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させ得る、かつ/またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させ得るためである。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるためにも使用することができる。
リポソームは、主として、脂質二重層から構成され得、医薬製剤の投与のための送達用ビヒクルとして使用することができる、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものであり得る。多ラメラ小胞(MLV)は、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水溶性コンパートメントで分離された同心二重層系列を含有し得る。小単細胞小胞(SUV)は、直径が50nmよりも小さくあり得、大単ラメラ小胞(LUV)は、直径が50~500nmであり得る。リポソーム設計は、限定されないが、非健常組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシスなどであるがこれに限定されない事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いかまたは高いpH値を含有してもよい。
リポソームの形態は、封止される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封止される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および/もしくは送達中に付随する任意の追加のプロセス、意図される適用に最適な小胞のサイズ、多分散性、および保管寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチごとの再現性および拡張生成性などに依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国公開第US20130177638号、同第US20130177637号、同第US20130177636号、同第US20130177635号、同第US20130177634号、同第US20130177633号、同第US20130183375号、同第US20130183373号、および同第US20130183372号に記載されている方法、装置、およびデバイスによって調製することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第WO2012031046号、同第WO2012031043号、同第WO2012030901号、同第WO2012006378号、および同第WO2013086526号、ならびに米国公開第US20130189351号、同第US20130195969号、および同第US20130202684号に記載されているように、リポソームに封入され得る、および/またはこれは、水溶性コアに格納され得、このコアが、次いで、リポソームに封入されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、カチオン性の水中油型エマルジョンにおいて製剤化されてもよく、ここで、エマルジョン粒子は、油性のコアおよびカチオン性脂質を含み、これらが、ポリヌクレオチドと相互作用し、分子をエマルジョン粒子に係留することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、親水相が分散された連続した疎水相を含む、油中水型エマルジョンにおいて製剤化され得る。例示的なエマルジョンは、国際公開第WO2012006380号および同第WO201087791号に記載されている方法によって作製することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、脂質-ポリカチオン複合体において製剤化され得る。脂質-ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第US20120178702号に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、および/またはポリアルギニン、ならびに国際公開第WO2012013326号または米国公開第US20130142818号に記載されているカチオン性ペプチドなどであるが、これらに限定されない、カチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第WO2013123523号、同第WO2012170930号、同第WO2011127255号、および同第WO2008103276号、ならびに米国公開第US20130171646号に記載されているものなどの脂質ナノ粒子(LNP)において製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的に、1つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、イオン化可能脂質(例えば、イオン化可能アミノ脂質である)。一部の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、および粒子の凝集を低減することができる分子、例えば、PEGまたはPEG修飾脂質を含む、他の成分をさらに含む。
カチオン性脂質およびイオン化可能脂質としては、例えば、国際公開第WO2015199952号、同第WO2015130584号、同第WO2015011633号、および同第WO2012040184号、同第WO2013126803号、同第WO2011153120号、同第WO2011149733号、同第WO2011090965号、同第WO2011043913号、同第WO2011022460号、同第WO2012061259号、同第WO2012054365号、同第WO2012044638号、同第WO2010080724号、同第WO201021865号、同第WO2008103276号、および同第WO2013086373号、米国特許第7,893,302号、同第7,404,969号、同第8,283,333号、および同第8,466,122号、ならびに米国公開第US20110224447号、同第US20120295832号、同第US20150315112号、同第US20100036115号、同第US20120202871号、同第US20130064894号、同第US20130129785号、同第US20130150625号、同第US20130178541号、同第US20130123338号、および同第US20130225836号に記載されているものを挙げることができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、脂質組成物中のカチオン性脂質およびイオン化可能脂質の量は、約0.01モル%~約99モル%の範囲である。
例示的なイオン化可能脂質としては、本明細書に開示される化合物1~147のうちのいずれか1つ、DLin-MC3-DMA(MC3)、DLin-DMA、DLenDMA、DLin-D-DMA、DLin-K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-KC3-DMA、DLin-KC4-DMA、DLin-C2K-DMA、DLin-MP-DMA、DODMA、98N12-5、C12-200、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLinDAP、DLinAP、DLin-EG-DMA、DLin-2-DMAP、KL10、KL22、KL25、オクチル-CLinDMA、オクチル-CLinDMA(2R)、オクチル-CLinDMA(2S)、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なイオン化可能脂質としては、(13Z,16Z)-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン(L608)、(20Z,23Z)-N,N-ジメチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン、(17Z,20Z)-N,N-ジメチル(dimemyl)ヘキサコサ-17,20-ジエン-9-アミン、(16Z,19Z)-N5N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-8-アミン、(13Z,16Z)-N,N-ジメチルドコサ-13,16-ジエン-5-アミン、(12Z,15Z)-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-4-アミン、(14Z,17Z)-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-6-アミン、(15Z,18Z)-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-7-アミン、(18Z,21Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-10-アミン、(15Z,18Z)-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-5-アミン、(14Z,17Z)-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-4-アミン、(19Z,22Z)-N,N-ジメチル(dimeihyl)オクタコサ-19,22-ジエン-9-アミン、(18Z,21Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-8-アミン、(17Z,20Z)-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-7-アミン、(16Z,19Z)-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-6-アミン、(22Z,25Z)-N,N-ジメチルヘントリアコンタ-22,25-ジエン-10-アミン、(21Z,24Z)-N,N-ジメチルトリアコンタ-21,24-ジエン-9-アミン、(18Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-18-エン-10-アミン、(17Z)-N,N-ジメチルヘキサコサ-17-エン-9-アミン、(19Z,22Z)-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-7-アミン、Ν,Ν-ジメチルヘプタコサン-10-アミン、(20Z,23Z)-N-エチル-N-メチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン、1-[(11Z,14Z)-1-ノニルイコサ-11,14-ジエン-1-イル]ピロリジン、(20Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-20-エン-10-アミン、(15Z)-N,N-ジメチルヘプタコサ-(eptacos)-15-エン-10-アミン、(14Z)-N,N-ジメチルノナコサ-14-エン-10-アミン、(17Z)-N,N-ジメチルノナコサ-17-エン-10-アミン、(24Z)-N,N-ジメチルトリトリアコンタ-24-エン-10-アミン、(20Z)-N,N-ジメチルノナコサ-20-エン-10-アミン、(22Z)-N,N-ジメチルヘントリアコンタ-22-エン-10-アミン、(16Z)-N,N-ジメチルペンタコサ-16-エン-8-アミン、(12Z,15Z)-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]エプタデカン-8-アミン、1-[(1S,2R)-2-ヘキシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-21-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘニコサン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-ペンチルシクロ(cycIo)プロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン-10-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン-8-アミン、N,N-ジメチル-[(1R,2S)-2-ウンデシル(undecyI)シクロプロピル]テトラデカン-5-アミン、N,N-ジメチル-3-{7-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン-1-アミン、1-[(1R,2S)-2-ヘプチルシクロプロピル]-N,N-ジメチルオクタデカン-9-アミン、1-[(1S,2R)-2-デシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルペンタデカン-6-アミン、N,N-ジメチル-1-[(1S,2R)-2-オクチルシクロプロピル]ペンタデカン-8-アミン、R-N,N-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、S-N,N-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-{2-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-1-[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)-Ν,Ν-ジメチル-1-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-3-[(5Z)-オクタ-5-エン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、1-{2-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]-1-[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)-1-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、(2S)-1-(ヘプチルオキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、Ν,Ν-ジメチル-1-(ノニルオキシ)-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、Ν,Ν-ジメチル-1-[(9Z)-オクタデカ-9-エン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン;(2S)-N,N-ジメチル-1-[(6Z,9Z,12Z)-オクタデカ-6,9,12-トリエン-1-イルオキシ]-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(ペンチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-(ヘキシルオキシ)-3-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、1-[(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-[(13Z,16Z)-ドコサ-13,16-ジエン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2S)-1-[(13Z、16Z)-ドコサ-13,16-ジエン-1-イルオキシ]-3-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、(2S)-1-[(13Z)-ドコサ-13-エン-1-イルオキシ]-3-(ヘキシルオキシ)-N,N-ジメチルプロパン-2-アミン、1-[(13Z)-ドコサ-13-エン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、1-[(9Z)-ヘキサデカ-9-エン-1-イルオキシ]-N,N-ジメチル-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、(2R)-N,N-ジメチル-H(1-メチル(metoyl)オクチル)オキシ]-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、(2R)-1-[(3,7-ジメチルオクチル)オキシ]-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-2-アミン、Ν,Ν-ジメチル-1-(オクチルオキシ)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン-2-アミン、Ν,Ν-ジメチル-1-{[8-(2-オクチル(oclyl)シクロプロピル)オクチル]オキシ}-3-(オクチルオキシ)プロパン-2-アミン、および(11E,20Z,23Z)-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,2-トリエン-10-アミン、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール(phosphatidy glycerol)、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含む。一部の実施形態では、リン脂質は、DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0ジエーテルPC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME 16:0 PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、リン脂質は、MPPC、MSPC、PMPC、PSPC、SMPC、SPPC、DHAPE、DOPG、およびこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、脂質組成物中のリン脂質(例えば、DSPCおよび/またはMSPC)の量は、約1モル%~約20モル%の範囲である。
構造脂質は、ステロールおよびステロール部分を含有する脂質を含む。一部の実施形態では、構造脂質としては、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ-トコフェロール、およびこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態では、脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロール)の量は、約20モル%~約60モル%の範囲である。
本明細書に記載される第四級アミン化合物としては、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N-(1,2-ジオレオイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLePC)、1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DSTAP)、1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DPTAP)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DLTAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DMTAP)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSePC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMePC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOePC)、1,2-ジ-(9Z-テトラデセノイル)-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1
EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約0.01モル%~約20モル%の範囲である。
EPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、脂質組成物中の第四級アミン化合物(例えば、DOTAP)の量は、約0.01モル%~約20モル%の範囲である。
PEG修飾脂質としては、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、PEG-セラミドコンジュゲート(例えば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミン、およびPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが挙げられる。そのような脂質は、PEG化脂質とも称される。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であり得る。一部の実施形態では、PEG脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロールメトキシポリエチレングリコール(PEG-DMG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)](PEG-DSPE)、PEG-ジステリルグリセロール(PEG-DSG)、PEG-ジパルメトレイル、PEG-ジオレイル、PEG-ジステアリル、PEG-ジアシルグリカミド(PEG-DAG)、PEG-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DPPE)、またはPEG-1,2-ジミリスチルオキシルプロピル-3-アミン(PEG-c-DMA)である。一部の実施形態では、PEG部分は、約1000、2000、5000、10,000、15,000、または20,000ダルトンのサイズを有する。一部の実施形態では、脂質組成物中のPEG脂質の量は、約0.1モル%~約5モル%の範囲である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるLNP製剤は、透過性増強分子をさらに含み得る。非限定的な透過性増強分子は、米国公開第US20050222064号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
LNP製剤は、ホスフェートコンジュゲートをさらに含有し得る。ホスフェートコンジュゲートは、in vivo循環時間を増大させ得る、かつ/またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。ホスフェートコンジュゲートは、例えば、国際公開第WO2013033438号または米国公開第US20130196948号に記載されている方法によって作製することができる。LNP製剤はまた、例えば、米国公開第US20130059360号、同第US20130196948号、および同第US20130072709号に記載されているポリマーコンジュゲート(例えば、水溶性コンジュゲート)も含有し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
LNP製剤は、対象における本開示のナノ粒子の送達を増強するために、コンジュゲートを含み得る。さらに、コンジュゲートは、対象におけるファゴサイトーシスによるナノ粒子のクリアランスを阻害し得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質CD47から設計された「自己」ペプチド(例えば、Rodriguezら、Science、2013年、339巻、971~975頁によって説明されている「自己」粒子、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)であってもよい。Rodriguezらによって示されているように、自己ペプチドは、マクロファージに媒介されるナノ粒子のクリアランスを遅延させ、これにより、ナノ粒子の送達が増強された。
LNP製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、炭水化物担体としては、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型の材料、フィトグリコーゲンコハク酸オクテニル、フィトグリコーゲンベータ-デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンベータ-デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない(例えば、国際公開第WO2012109121号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
LNP製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーでコーティングされ得る。一部の実施形態では、LNPは、米国公開第US20130183244号に記載されているように、PEGコーティングおよび/または中性表面電荷を有するコーティングなどであるがこれらに限定されない、親水性コーティングでコーティングされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
LNP製剤は、米国特許第8,241,670号または国際公開第WO2013110028号に記載されているように、脂質ナノ粒子が粘膜壁を貫入することができるように、粒子の表面特性を変化させるように操作してもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
粘液を貫入するように操作されたLNPは、ポリマー材料(すなわち、ポリマーコア)および/またはポリマー-ビタミンコンジュゲートおよび/またはトリ-ブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ(スチレン)、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。
粘液を貫入するように操作されたLNPはまた、表面改質剤、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)、界面活性剤(例えば、カチオン性界面活性剤、例として、ジメチルジオクタデシル-アンモニウムブロミドなど)、糖または糖誘導体(例えば、シクロデキストリン)、核酸、ポリマー(例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー)、粘液溶解剤(例えば、N-アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ4ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン)、ならびにrhDNaseを含む様々なDNaseを含み得る。
一部の実施形態では、粘液貫入性LNPは、粘膜貫入を増強するコーティングを含む、低浸透圧製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して、低浸透圧であり得る。低浸透圧製剤の非限定的な例は、例えば、国際公開第WO2013110028号に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、限定することなく、ATUPLEXTM系、DACC系、DBTC系、ならびにSilence Therapeutics(London、United Kingdom)からの他のsiRNA-リポプレックス技術、STEMGENT(登録商標)からのSTEMFECTTM(Cambridge、MA)、および核酸のポリエチレンイミン(PEI)もしくはプロタミンに基づく標的化および非標的化送達など、リポプレックスとして製剤化される(Alekuら、Cancer Res.、2008年、68巻、9788~9798頁;Strumbergら、Int J Clin Pharmacol Ther、2012年、50巻、76~78頁;Santelら、Gene Ther、2006年、13巻、1222~1234頁;Santelら、Gene Ther、2006年、13巻、1360~1370頁;Gutbierら、Pulm Pharmacol. Ther.、2010年、23巻、334~344頁;Kaufmannら、Microvasc Res、2010年、80巻、286~293頁、Weideら、J Immunother.、2009年、32巻、498~507頁;Weideら、J Immunother.、2008年、31巻、180~188頁;Pascolo Expert Opin. Biol. Ther.、4巻、1285~1294頁;Fotin-Mleczekら、2011年、J. Immunother.、34巻、1~15頁;Songら、Nature Biotechnol.、2005年、23巻、709~717頁;Peerら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2007年、6巻、104号、4095~4100頁;deFougerolles Hum Gene Ther.、2008年、19巻、125~132頁、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、固体脂質ナノ粒子(SLN)として製剤化され、これは、10~1000nmの平均直径を有する球形であり得る。SLNは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および/または乳化剤で安定化することができる、固体脂質コアマトリックスを有する。例示的なSLNは、国際公開第WO2013105101号に記載されるものであり得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、調節放出および/または標的化送達のために製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「調節放出」は、治療的転帰を実現する特定の放出パターンに適合する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、調節放出および/または標的化送達のために、本明細書に記載されるおよび/または当技術分野において公知の送達剤に封入され得る。本明細書において使用されるとき、「封入する」という用語は、封止、包囲、または内包することを意味する。これは、本開示の化合物の製剤化に関連するため、封入は、実質的か、完全か、または部分的であってもよい。「実質的に封入される」という用語は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9%よりも多く、または99.999%よりも多くが、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。「部分的封入」は、本開示の医薬組成物または化合物のうちの10よりも少ない、10、20、30、40、50、またはそれ未満が、送達剤内に封止、包囲、または内包され得ることを意味する。
有利なことに、封入は、蛍光および/または電子顕微鏡写真を使用して、本開示の医薬組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって、判定することができる。例えば、本開示の医薬組成物または化合物のうちの少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%よりも多くが、送達剤に封入される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、少なくとも1つの調節放出コーティング(例えば、OPADRY(登録商標)、EUDRAGIT RL(登録商標)、EUDRAGIT RS(登録商標)、およびエチルセルロース水性分散液などのセルロース誘導体(AQUACOAT(登録商標)およびSURELEASE(登録商標)))を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの調節放出製剤は、米国公開第US20130130348号に記載されているポリマー系、または米国特許第8,404,222号に記載されているPEGおよび/もしくはPEG関連ポリマー誘導体を含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入され得、本明細書において、「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と称され得る。治療用ナノ粒子は、例えば、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、同第WO2010005721号、同第WO2010005723号、および同第WO2012054923号、ならびに米国公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、同第US20100068285号、同第US20110274759号、同第US20100068286号、同第US20120288541号、同第US20120140790号、同第US20130123351号、および同第US20130230567号、ならびに米国特許第8,206,747号、同第8,293,276号、同第8,318,208号、および同第8,318,211号に記載されている方法によって製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出用に製剤化され得る。本明細書において使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたる放出速度に適合する、医薬組成物または化合物を指す。期間としては、数時間、数日間、数週間、数ヶ月、および数年間が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、国際公開第WO2010075072号、ならびに米国公開第US20100216804号、同第US20110217377号、同第US20120201859号、および同第US20130150295号に開示されているように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、国際公開第WO2008121949号、同第WO2010005726号、同第WO2010005725号、同第WO2011084521号、および同第WO2011084518号、ならびに米国公開第US20100069426号、同第US20120004293号、および同第US20100104655号に記載されているもののように、標的特異的となるように製剤化することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
LNPは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを使用して、調製することができる。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、Microinnova(Allerheiligen bei Wildon、Austria)によって製造されているものを含むがこれに限定されないスリット型インターデジタルマイクロミキサー、および/またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)を挙げることができるが、これらに限定されない(Zhigaltsevetら、「Bottom-up design
and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing」、Langmuir、28巻、3633~40頁(2012年);Belliveauら、「Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA」、Molecular Therapy-Nucleic Acids.、1巻、e37(2012年);Chenら、「Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation」、J. Am. Chem. Soc.、134巻(16号)、6948~51頁(2012年)を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。例示的なマイクロミキサーとしては、Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH、Mainz GermanyからのSlit Interdigital Microstructured Mixer(SIMM-V2)またはStandard Slit Interdigital Micro Mixer(SSIMM)またはCaterpillar(CPMM)またはImpinging-jet(IJMM)が挙げられる。一部の実施形態では、SHMを使用してLNPを作製する方法は、少なくとも2つの入力ストリームを混合することをさらに含み、ここで、混合は、マイクロ構造に誘導されるカオス的移流(microstructure-induced chaotic advection)(MICA)によって生じる。この方法によると、流体ストリームは、交互の流れを引き起こし、流体が互いにフォールディングされる、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れる。この方法はまた、表面の配向が、流体サイクリング中に変化する、流体混合のための表面を含み得る。SHMを使用してLNPを生成する方法には、米国公開第US20040262223号および同第US20120276209号に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing」、Langmuir、28巻、3633~40頁(2012年);Belliveauら、「Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA」、Molecular Therapy-Nucleic Acids.、1巻、e37(2012年);Chenら、「Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation」、J. Am. Chem. Soc.、134巻(16号)、6948~51頁(2012年)を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。例示的なマイクロミキサーとしては、Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH、Mainz GermanyからのSlit Interdigital Microstructured Mixer(SIMM-V2)またはStandard Slit Interdigital Micro Mixer(SSIMM)またはCaterpillar(CPMM)またはImpinging-jet(IJMM)が挙げられる。一部の実施形態では、SHMを使用してLNPを作製する方法は、少なくとも2つの入力ストリームを混合することをさらに含み、ここで、混合は、マイクロ構造に誘導されるカオス的移流(microstructure-induced chaotic advection)(MICA)によって生じる。この方法によると、流体ストリームは、交互の流れを引き起こし、流体が互いにフォールディングされる、ヘリンボーンパターンに存在するチャネルを通って流れる。この方法はまた、表面の配向が、流体サイクリング中に変化する、流体混合のための表面を含み得る。SHMを使用してLNPを生成する方法には、米国公開第US20040262223号および同第US20120276209号に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る(Whitesides, George M.、「The Origins and the Future of Microfluidics」、Nature、442巻、368~373頁(2006年)およびAbrahamら、「Chaotic Mixer for Microchannels」、Science、295巻、647~651頁(2002年)を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Harvard Apparatus(Holliston、MA)またはDolomite Microfluidics(Royston、UK)からのものなどであるがこれらに限定されない、マイクロミキサーチップを使用して、脂質ナノ粒子において製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割および再混合の機構を用いて、2つまたはそれよりも多い流体ストリームの高速混合に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、約1nm~約100nm、例えば、これらに限定されないが、約1nm~約20nm、約1nm~約30nm、約1nm~約40nm、約1nm~約50nm、約1nm~約60nm、約1nm~約70nm、約1nm~約80nm、約1nm~約90nm、約5nm~約100nm、約5nm~約10nm、約5nm~約20nm、約5nm~約30nm、約5nm~約40nm、約5nm~約50nm、約5nm~約60nm、約5nm~約70nm、約5nm~約80nm、約5nm~約90nm、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nmおよび/または約90~約100nmの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、100nmより大きい、150nmより大きい、200nmより大きい、250nmより大きい、300nmより大きい、350nmより大きい、400nmより大きい、450nmより大きい、500nmより大きい、550nmより大きい、600nmより大きい、650nmより大きい、700nmより大きい、750nmより大きい、800nmより大きい、850nmより大きい、900nmより大きい、950nmより大きいまたは1000nmより大きい直径を有し得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、より小さなLNPを使用して送達することができる。そのような粒子は、0.1μm未満から最大100nm、例えば、これらに限定されないが、0.1μm未満、1.0μm未満、5μm未満、10μm未満、15um未満、20um未満、25um未満、30um未満、35um未満、40um未満、50um未満、55um未満、60um未満、65um未満、70um未満、75um未満、80um未満、85um未満、90um未満、95um未満、100um未満、125um未満、150um未満、175um未満、200um未満、225um未満、250um未満、275um未満、300um未満、325um未満、350um未満、375um未満、400um未満、425um未満、450um未満、475um未満、500um未満、525um未満、550um未満、575um未満、600um未満、625um未満、650um未満、675um未満、700um未満、725um未満、750um未満、775um未満、800um未満、825um未満、850um未満、875um未満、900um未満、925um未満、950um未満、または975um未満の直径を含み得る。
本明細書に記載されるナノ粒子およびマイクロ粒子は、マクロファージおよび/または免疫応答を調節するように、幾何形状を操作することができる。幾何形状を操作した粒子は、肺送達などであるがこれに限定されない、標的化送達のための本明細書に記載されるポリヌクレオチドを組み込むように、様々な形状、サイズ、および/または表面電荷を有し得る(例えば、国際公開第WO2013082111号を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。幾何形状を操作した粒子の他の物理的特徴としては、穿孔、傾斜アーム、非対称性および表面の粗さ、細胞および組織との相互作用を変化させ得る電荷を挙げることができるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子は、米国公開第US20130172406号に記載されるものなどであるがこれに限定されない、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、2つまたはそれよりも多いポリマーを含み得るポリマーマトリックス、例えば、限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはこれらの組合せを含み得る。
b.リピドイド
b.リピドイド
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、リピドイドとともに製剤化され得る。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子を、調製することができ、それによって、局所的および/または全身的な投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされるタンパク質の産生によって判断した場合に、ポリヌクレオチドの有効な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むがこれらに限定されない、様々な手段で投与され得る。
リピドイドの合成は、文献に記載されている(Mahonら、Bioconjug. Chem.、2010年、21巻、1448~1454頁;Schroederら、J Intern Med.、2010年、267巻、9~21頁;Akincら、Nat Biotechnol.、2008年、26巻、561~569頁;Loveら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2010年、107巻、1864~1869頁;Siegwartら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2011年、108巻、12996~3001頁を参照されたく、これらのすべては、その全体が本明細書に組み込まれる)。
ペンタ[3-(1-ラウリルアミノプロピオニル)]-トリエチレンテトラミン塩酸塩(TETA-5LAP;98N12-5としても公知である、Murugaiahら、Analytical Biochemistry、401巻、61頁(2010年)を参照されたい)、C12-200(誘導体およびバリアントを含む)、ならびにMD1を含むがこれらに限定されない、異なるリピドイドを用いた製剤を、in vivo活性に関して試験することができる。リピドイド「98N12-5」は、Akincら、Mol Ther.、2009年、17巻、872~879頁によって開示されている。リピドイド「C12-200」は、Loveら、Proc Natl Acad Sci U S
A.、2010年、107巻、1864~1869頁ならびにLiuおよびHuang、Molecular Therapy.、2010年、669~670頁によって開示されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
A.、2010年、107巻、1864~1869頁ならびにLiuおよびHuang、Molecular Therapy.、2010年、669~670頁によって開示されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドにおいて製剤化され得る。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第8,450,298号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている方法によって調製することができる。
リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて、3つもしくは4つ、またはそれよりも多くの成分を含む、粒子を含み得る。リピドイドおよびリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第WO2015051214号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
c.ヒアルロニダーゼ
c.ヒアルロニダーゼ
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、ならびに注射(例えば、筋肉内または皮下注射)のためのヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質壁の構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させ、それによって、組織透過性を増大させる(Frost、Expert Opin. Drug Deliv.、(2007年)4巻、427~440頁)。あるいは、ヒアルロニダーゼを使用して、筋肉内、腫瘍内、または皮下に投与されるポリヌクレオチドに曝露される細胞の数を増大させることができる。
d.ナノ粒子模倣体
d.ナノ粒子模倣体
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ナノ粒子模倣体に封入されるおよび/または吸収される。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞などであるがこれらに限定されない送達機能を有する生物または粒子を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非ビリオン(non-viron)粒子に封入され得る(例えば、国際公開第WO2012006376号ならびに米国公開第US20130171241号および同第US20130195968号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
e.ナノチューブ
e.ナノチューブ
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ロゼットナノチューブ、リンカーを伴うツイン塩基を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブ、および/または単層カーボンナノチューブなどであるがこれらに限定されない、少なくとも1つのナノチューブに付着またはそうでなければ結合した(例えば、静電力、イオン、共有結合、および/または他の力を通じて)、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。ポリヌクレオチドを含むナノチューブおよびナノチューブ製剤は、例えば、国際公開第WO2014152211号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
f.自己アセンブル型ナノ粒子または自己アセンブル型巨大分子
f.自己アセンブル型ナノ粒子または自己アセンブル型巨大分子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達のための自己アセンブル型ナノ粒子または両親媒性巨大分子(AM)での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。AMは、アルキル化糖骨格がポリ(エチレングリコール)に共有結合した、生体適合性の両親媒性ポリマーを含む。水溶液中において、AMは、自己アセンブルしてミセルを形成する。核酸自己アセンブル型ナノ粒子は、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載され、AMおよびAMを形成する方法は、米国公開第US20130217753号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
g.無機ナノ粒子、半導電性ナノ粒子および金属ナノ粒子
g.無機ナノ粒子、半導電性ナノ粒子および金属ナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、無機ナノ粒子、または半導電性材料もしくは金属材料を含む水分散性ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。無機ナノ粒子は、限定されないが、水膨張性であるクレイ物質を含み得る。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子または親水性ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、無機、半導電性、および金属ナノ粒子は、例えば、米国特許第5,585,108号および同第8,257,745号、ならびに米国公開第US20120228565号、同第US20120265001号、および同第US20120283503号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
h.外科用シーラント:ゲルおよびヒドロゲル
h.外科用シーラント:ゲルおよびヒドロゲル
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、外科用シーラントでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。ゲルおよびヒドロゲルなどの外科用シーラントは、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
i.懸濁液製剤
i.懸濁液製剤
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、懸濁液での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。一部の実施形態では、懸濁液は、ポリヌクレオチド、水非混和性油デポー、界面活性剤および/もしくは共界面活性剤、ならびに/または共溶媒を含む。懸濁液は、まず、ポリヌクレオチドの水溶液、および1つまたは複数の界面活性剤を含む油系相を調製し、次いで、2つの相(水相および油系相)を混合することによって、形成することができる。
懸濁液製剤のための例示的な油としては、ゴマ油およびミグリオール(飽和ココナッツ油およびパーム核油由来のカプリル酸およびカプリン脂肪酸のエステル、ならびにグリセリンまたはプロピレングリコールを含む)、トウモロコシ油、ダイズ油、ピーナツ油、ビーズワックス、ならびに/またはパームシード油が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な界面活性剤としては、クレモホール、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール、transcutol、Capmul(登録商標)、labrasol、ミリスチン酸イソプロピル、および/またはSpan 80が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、懸濁液は、エタノール、グリセロール、および/またはプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない共溶媒を含み得る。
一部の実施形態では、懸濁液は、水非混和性デポーからの拡散による周囲環境へのポリヌクレオチドの放出を調節し、続いて、周囲環境(例えば、水性環境)への再可溶化をもたらし得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、注射するとエマルジョンが自発的に形成され(例えば、水相に送達されたときに)、それにより、油相から水相へのポリヌクレオチドの放出のための高い表面積対体積の比がもたらされ得るように、製剤化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ナノエマルジョンにおいて製剤化され、これは、液体疎水性コアが、脂質または界面活性剤の層で包囲またはコーティングされたものを含み得る。例示的なナノエマルジョンおよびそれらの調製は、例えば、米国特許第8,496,945号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
j.カチオンおよびアニオン
j.カチオンおよびアニオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、ならびにカチオンまたはアニオン、例えば、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、およびこれらの組合せを含む。例示的な製剤は、例えば、米国特許第6,265,389号および同第6,555,525号に記載されているように、金属カチオンと複合体を形成したポリマーおよびポリヌクレオチドを含み得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価および一価カチオンの組合せを含有し得る。カチオン性ナノ粒子またはカチオン性ナノ粒子を含む1つもしくは複数のデポーにおけるポリヌクレオチドの送達は、長時間作用するデポーとして作用することおよび/またはヌクレアーゼによる分解の速度を低減することによって、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善することができる。
k.成形ナノ粒子およびマイクロ粒子
k.成形ナノ粒子およびマイクロ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、様々なサイズ、形状、および化学的性質の成形ナノ粒子での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。例えば、ナノ粒子および/またはマイクロ粒子は、LIQUIDA TECHNOLOGIES(登録商標)(Morrisville、NC)によるPRINT(登録商標)技術を使用して、作製することができる(例えば、国際公開第WO2007024323号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、マイクロ粒子において製剤化される。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドのコア、ならびにポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、およびポリ無水物を含むがこれらに限定されない生体適合性および/または生体分解性ポリマーの外皮を含有し得る。マイクロ粒子は、ポリヌクレオチドを吸着するための吸着表面を有し得る。マイクロ粒子は、少なくとも1ミクロン~少なくとも100ミクロン(例えば、少なくとも1ミクロン、少なくとも10ミクロン、少なくとも20ミクロン、少なくとも30ミクロン、少なくとも50ミクロン、少なくとも75ミクロン、少なくとも95ミクロン、および少なくとも100ミクロン)の直径を有し得る。一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、マイクロ粒子およびポリヌクレオチドを含むマイクロエマルジョンである。例示的なマイクロ粒子、マイクロエマルジョン、およびそれらの調製物は、例えば、米国特許第8,460,709号、同第8,309,139号、および同第8,206,749号、米国公開第US20130129830号、同第US2013195923号、および同第US20130195898号、ならびに国際公開第WO2013075068号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
l.ナノジャケットおよびナノリポソーム
l.ナノジャケットおよびナノリポソーム
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、Keystone Nano(State College、PA)によるナノジャケットおよびナノリポソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸を含む体内で天然に見出される材料から作製され、少量のケイ酸もさらに含み得る。ナノジャケットは、5~50nmの範囲のサイズを有し得る。
ナノリポソームは、体内に天然に存在する脂質などであるがこれに限定されない脂質から作製される。ナノリポソームは、60~80nmの範囲のサイズを有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、セラミドナノリポソームなどであるがこれに限定されない、ナノリポソームにおいて製剤化される。
m.細胞またはミニ細胞
m.細胞またはミニ細胞
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ex vivoで細胞にトランスフェクトされ、続いて対象に移植される、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。本明細書に開示されるポリヌクレオチドの細胞に基づく製剤を使用して、細胞へのトランスフェクション(例えば、細胞担体において)を確実にする、ポリヌクレオチドの生体分布を変化させる(例えば、細胞担体の標的を特定の組織もしくは細胞型に定めることによって)、および/またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させることができる。
例示的な細胞としては、赤血球、ウイロソーム、およびエレクトロポレーション細胞が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Godfrinら、Expert Opin Biol Ther.、2012年、12巻、127~133頁;Fangら、Expert Opin Biol Ther.、2012年、12巻、385~389頁;Huら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2011年、108巻、10980~10985頁;Lundら、Pharm Res.、2010年、27巻、400~420頁;Huckriedeら、J Liposome Res.、2007年、17巻、39~47頁;Cusi、Hum Vaccin.、2006年、2巻、1~7頁;de Jongeら、Gene Ther.、2006年、13巻、400~411頁を参照されたく、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ウイルス媒介および非ウイルス媒介技法を含む様々な方法が、当技術分野において公知であり、核酸の細胞への導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移入、マイクロインジェクション、マイクロ発射媒介移入(ナノ粒子)、カチオン性ポリマー媒介移入(DEAE-デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール(PEG)、およびその他)、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第WO2011085231号および同第WO2013116656号、ならびに米国公開第20110171248号に記載されている方法によって合成される、合成ウイルス様粒子(VLP)において送達することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ソノポレーション、すなわち細胞超音波処理の技法は、細胞の原形質膜の透過性を修飾するために、音(例えば、超音波周波数)を使用することである。ソノポレーション法は、in vivoで核酸を送達することが公知である(YoonおよびPark、Expert Opin Drug Deliv.、2010年、7巻、321~330頁;PostemaおよびGilja、Curr Pharm Biotechnol.、2007年、8巻、355~361頁;NewmanおよびBettinger、Gene Ther.、2007年、14巻、465~475頁;米国公開第US20100196983号および同第US20100009424号、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって送達され得る。エレクトロポレーション技法は、in vivoおよび臨床で核酸を送達することが公知である(Andreら、Curr Gene Ther.、2010年、10巻、267~280頁;Chiarellaら、Curr Gene Ther.、2010年、10巻、281~286頁;Hojman、Curr Gene Ther.、2010年、10巻、128~138頁、すべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。エレクトロポレーションデバイスは、これらに限定されないが、BTX(登録商標)Instruments(Holliston、MA)(例えば、AgilePulse In vivo System)およびInovio(Blue Bell、PA)(例えば、Inovio SP-5P筋肉内送達デバイスまたはCELLECTRA(登録商標)3000皮内送達デバイス)を含め、世界中で多くの企業によって販売されている。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、植物細胞、微生物細胞、藻類細胞、および真菌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシの細胞などであるがこれらに限定されない、哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、HeLa、NS0、SP2/0、KEK 293T、Vero、Caco、Caco-2、MDCK、COS-1、COS-7、K562、Jurkat、CHO-K1、DG44、CHOK1SV、CHO-S、Huvec、CV-1、Huh-7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR-90、MCF-7、U-20S、Per.C6、SF9、SF21、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含むがこれらに限定されない、樹立細胞株に由来し得る。
ある特定の実施形態では、細胞は、Chrysosporium細胞、Aspergillus細胞、Trichoderma細胞、Dictyostelium細胞、Candida細胞、Saccharomyces細胞、Schizosaccharomyces細胞、およびPenicillium細胞などであるがこれらに限定されない、真菌細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は、大腸菌細胞、枯草菌細胞、またはBL21細胞などであるがこれらに限定されない、細菌細胞である。本開示の方法によってトランスフェクトされる初代細胞および二次細胞は、様々な組織から得ることができ、培養物中に維持することができるすべての細胞型を含むがこれらに限定されない。初代細胞および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞(例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞)、内皮細胞、膠細胞、神経細胞、血液の形成要素(例えば、リンパ球、骨髄細胞)、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。初代細胞はまた、同じ種のドナーから、または別の種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ)から得ることもできる。
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、細菌性ミニ細胞での本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む。非限定的な例として、細菌性ミニ細胞は、国際公開第WO2013088250号または米国公開第US20130177499号に記載されているものであり得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
n.半固体組成物
n.半固体組成物
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、半固体またはペースト様組成物を形成するために、疎水性マトリックスでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。非限定的な例として、半固体またはペースト様組成物は、国際公開第WO201307604号に記載されている方法によって作製することができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
o.エクソソーム
o.エクソソーム
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、少なくとも1つのポリヌクレオチドをロードし、細胞、組織、および/または生物に送達することができる、エクソソームでの本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、国際公開第WO2013084000号に記載されているように、エクソソームにロードすることができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
p.絹に基づく送達
p.絹に基づく送達
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、絹に基づく送達のために製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。絹に基づく送達系は、絹フィブロイン溶液を、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと接触させることによって、形成することができる。非限定的な例として、持続放出型絹に基づく送達系およびそのような系を作製する方法は、米国公開第US20130177611号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
q.アミノ酸脂質
q.アミノ酸脂質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質を用いた製剤である、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基および1つまたは複数の親油性尾部を含む、親油性化合物である。アミノ酸脂質およびアミノ酸脂質を作製する方法の非限定的な例は、米国特許第8,501,824号に記載されている。アミノ酸脂質製剤は、ポリヌクレオチドに結合しそれを放出する、アミノ酸脂質を含む放出可能な形態で、ポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの放出は、例えば、米国特許第7,098,032号、同第6,897,196号、同第6,426,086号、同第7,138,382号、同第5,563,250号、および同第5,505,931号に記載されるように、酸不安定性リンカーによってもたらされ得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
r.微細小胞
r.微細小胞
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、微細小胞製剤での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。例示的な微細小胞としては、米国公開第US20130209544号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されているものが挙げられる。一部の実施形態では、微細小胞は、国際公開第WO2013119602号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されているARRDC1媒介型微細小胞(ARMM)である。
s.多価電解質間複合体
s.多価電解質間複合体
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、多価電解質間複合体での、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。多価電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが、1つまたは複数のアニオン性分子と複合体を形成すると、形成される。電荷動的ポリマーおよび多価電解質間複合体の非限定的な例、ならびに多価電解質間複合体を作製する方法は、米国特許第8,524,368号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
t.結晶質ポリマー系
t.結晶質ポリマー系
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、結晶質ポリマー系での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。結晶質ポリマー系は、結晶質部分および/または結晶質部分を含む末端単位を有するポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第8,524,259号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
u.ポリマー、生体分解性ナノ粒子、およびコア-シェルナノ粒子
u.ポリマー、生体分解性ナノ粒子、およびコア-シェルナノ粒子
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、ならびに天然および/または合成のポリマーを含む。ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l-リシン)(PLL)、PLLにグラフトされたPEG、カチオン性リポポリマー、生体分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分岐鎖ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾されたポロキサマー、弾性生体分解性ポリマー、生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、多重ブロックコポリマー、ポリ[α-(4-アミノブチル)-L-グリコール酸)(PAGA)、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリシン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L-ラクチド-co-L-リシン)、ポリ(4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル)、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なポリマーとしては、MIRUS(登録商標)Bio(Madison、WI)およびRoche Madison(Madison、WI)からのDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)(Arrowhead Research Corp.、Pasadena、CA)製剤、PHASERX(商標)ポリマー製剤、例えば、限定されないが、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PHASERX(登録商標)、Seattle、WA)、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego、CA)からのVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena、CA)からのシクロデキストリン、デンドリマー、ならびにポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)ポリマー、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation、Pasadena、CA)、およびpH応答性コ-ブロックポリマー、例えば、PHASERX(登録商標)(Seattle、WA)が挙げられる。
ポリマー製剤により、ポリヌクレオチドの持続または遅延放出(例えば、筋肉内または皮下注射後の)が可能となる。ポリヌクレオチドの放出プロファイルの変化により、例えば、長期間にわたって、コードされるタンパク質の翻訳をもたらすことができる。また、ポリマー製剤を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を増大させることもできる。持続放出製剤としては、PLGAマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル(EVAc)、ポロキサマー、GELSITE(登録商標)(Nanotherapeutics,Inc.、Alachua、FL)、HYLENEX(登録商標)(Halozyme Therapeutics、San Diego、CA)、外科用シーラント、例えば、フィブリノーゲンポリマー(Ethicon Inc.、Cornelia、GA)、TISSELL(登録商標)(Baxter International,Inc.、Deerfield、IL)、PEG系シーラント、ならびにCOSEAL(登録商標)(Baxter International,Inc.、Deerfield、IL)を挙げることができるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、修飾されたmRNAは、調整可能な放出速度(例えば、数日間および数週間)を有するPLGAマイクロスフェアを調製し、封入プロセスの間、修飾されたmRNAの完全性を維持しながら、修飾されたmRNAをPLGAマイクロスフェアに封入することによって、PLGAマイクロスフェアにおいて製剤化することができる。EVAcは、前臨床の持続放出型インプラント適用において広く使用されている非生体分解性の生体適合性ポリマーである(例えば、延長放出製品、緑内障のためのピロカルピン眼内インサートであるOcusertまたは持続放出プロゲステロン子宮内避妊器具であるprogestasert;経皮送達系、Testoderm、Duragesic、およびSelegiline;カテーテル)。ポロキサマーF-407 NFは、5℃よりも低い温度では低粘度であり、15℃よりも高い温度では固形ゲルを形成する、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンの親水性の非イオン性界面活性剤トリブロックコポリマーである。
非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国特許第6,177,274号に記載されているように、PLLがグラフトされたPEGのポリマー化合物とともに、製剤化されてもよい。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、PLGA-PEGブロックコポリマー(例えば、米国公開第US20120004293号、ならびに米国特許第8,236,330号および同第8,246,968号を参照されたい)、またはPLGA-PEG-PLGAブロックコポリマー(例えば、米国特許第6,004,573号を参照されたい)などのブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、ポリ(アミン-co-エステル)、またはこれらの組合せなどであるがこれらに限定されない、少なくとも1つのアミン含有ポリマーとともに製剤化されてもよい。例示的なポリアミンポリマーおよび送達剤としてのそれらの使用は、例えば、米国特許第8,460,696号、同第8,236,280号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第6,696,038号、同第6,517,869号、同第6,267,987号、同第6,217,912号、同第6,652,886号、同第8,057,821号、および同第8,444,992号、米国公開第US20030073619号、同第US20040142474号、同第US20100004315号、同第US2012009145号、および同第US20130195920号、ならびに国際公開第WO2006063249号および同第WO2013086322号に記載されているように、生体分解性カチオン性リポポリマー、生体分解性ポリマー、または生体分解性コポリマー、生体分解性ポリエステルコポリマー、生体分解性ポリエステルポリマー、線形生体分解性コポリマー、PAGA、生体分解性架橋型カチオン性多重ブロックコポリマー、またはこれらの組合せにおいて、製剤化されてもよく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第US20130184453号に記載されているように、少なくとも1つのシクロデキストリンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、国際公開第WO2013106072号、同第WO2013106073号、および同第WO2013106086号に記載されているように、少なくとも1つの架橋型カチオン結合ポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、米国公開第US20130231287号に記載されているように、少なくともPEG化アルブミンポリマーにおいて、またはそれとともに、製剤化され得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、および/または他の生体分解性薬剤、例えば、限定されないが、リン酸カルシウムの組合せを使用して、ナノ粒子として製剤化され得る。成分は、送達用のナノ粒子の微調整を可能にするために、コア-シェル、ハイブリッド、および/または積層(layer-by-layer)構造で、組み合わせてもよい(Wangら、Nat Mater.、2006年、5巻、791~796頁;Fullerら、Biomaterials.、2008年、29巻、1526~1532頁;DeKokerら、Adv Drug Deliv Rev.、2011年、63巻、748~761頁;Endresら、Biomaterials.、2011年、32巻、7721~7731頁;Suら、Mol Pharm.、2011年6月6日、8巻(3号)、774~87頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。非限定的な例として、ナノ粒子は、複数のポリマー、例えば、限定されないが、親水性-疎水性ポリマー(例えば、PEG-PLGA)、疎水性ポリマー(例えば、PEG)、および/または親水性ポリマー(国際公開第WO20120225129号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を含み得る。
コア-シェルナノ粒子の使用は、さらに、カチオン性架橋型ナノゲルコアおよび様々なシェルを合成するための高スループットのアプローチに焦点を当てている(Siegwartら、Proc Natl Acad Sci U S A.、2011年、108巻、12996~13001頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内部移行は、ナノ粒子のコア成分およびシェル成分の両方における化学組成を変化させることによって、正確に調節することができる。例えば、コア-シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合した後、siRNAをマウスの肝細胞に効率的に送達することができる。
一部の実施形態では、中間のPLGA層および外側のPEGを含有する中性脂質層を含む、中空脂質コアを、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの送達に使用することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコア、およびコアにあるポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載されるポリマーのいずれかであってよく、当技術分野において公知であり、ポリマーシェアルを使用して、コアにあるポリヌクレオチドを保護することができる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドとともに使用するためのコア-シェルナノ粒子は、米国特許第8,313,777号または国際公開第WO2013124867号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
v.ペプチドおよびタンパク質
v.ペプチドおよびタンパク質
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増大させるため、および/またはポリヌクレオチドの生体分布を変化させるため(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とすることによって)、および/またはコードされるタンパク質の翻訳を増大させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質を用いて製剤化された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む(例えば、国際公開第WO2012110636号および同第WO2013123298号)。一部の実施形態では、ペプチドは、米国公開第US20130129726号、同第US20130137644号、および同第US20130164219号に記載されているものであり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
w.コンジュゲート
w.コンジュゲート
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または一緒になって融合タンパク質を産生する2つのコード領域(例えば、標的化基および治療用タンパク質もしくはペプチドを有する)をコンジュゲートとして含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。コンジュゲートは、ナノ粒子を、組織もしくは生物におけるニューロンに選択的に指向させるか、または血液脳関門を越えるのを補助する、ペプチドであり得る。
コンジュゲートは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、もしくはグロブリン);炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸);または脂質を含む。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L-ラクチド-コ-グリコリド(glycolied))コポリマー、ジビニルエーテル-マレイン酸無水物コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸(ethylacryllic acid))、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの担体としての機能を果たし得る。コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、限定されないが、ポリ(エチレングリコール)にグラフトされ得るポリアミン、ポリリシン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミンを含み得る。例示的なコンジュゲートおよびそれらの調製物は、米国特許第6,586,524号および米国公開第US20130211249号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
コンジュゲートはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、指定された細胞型、例えば、腎臓細胞に結合する抗体を含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインA、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特定の親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。これらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フルクトース、またはアプタマーを含み得る。リガンドは、例えば、リポポリ多糖、またはp38 MAPキナーゼの活性化因子であり得る。
標的化基は、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであり得る。例としては、限定することなく、葉酸、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース-6P、アパタマー(apatamer)、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDL、およびHDLリガンドが挙げられる。特定の実施形態では、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、未修飾であってもよく、または本明細書に開示される修飾のうちの任意の組合せを有してもよい。非限定的な例として、標的化基は、例えば、米国公開第US2013021661012号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されているように、血液-中枢神経系関門を越えた標的化送達のための、グルタチオン受容体(GR)結合性コンジュゲートであり得る。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、相乗的生体分子-ポリマーコンジュゲートであってもよく、これは、より優れた治療的有効性を提供するための長時間作用型連続放出系を含む。相乗的生体分子-ポリマーコンジュゲートは、米国公開第US20130195799号に記載されているものであり得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、国際特許公開第WO2012040524号に記載されているアプタマーコンジュゲートであってもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートは、米国特許第8,507,653号に記載されているアミン含有ポリマーコンジュゲートであってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(登録商標)(PHASERX(登録商標),Inc.、Seattle、WA)にコンジュゲートされ得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、シグナル配列または標的化配列も含み得る、細胞貫入性ポリペプチドに共有結合でコンジュゲートされる。コンジュゲートは、増大した安定性および/または増大した細胞トランスフェクション、および/または変化した生体分布(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とする)を有するように、設計され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、送達を増強する薬剤にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開第WO2011062965号に記載されている、標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーであり得る。一部の実施形態では、薬剤は、例えば、米国特許第6,835,393号および同第7,374,778号に記載されているように、ポリヌクレオチドに共有結合された輸送剤であってもよい。一部の実施形態では、薬剤は、米国特許第7,737,108号および同第8,003,129号に記載されているものなど、膜壁輸送増強剤であってもよい。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
x.小器官
x.小器官
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、長期間持続する治療製剤において目的のコードされるポリペプチドを発現することができる小器官での本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。例示的な小器官および製剤は、国際公開第WO2014152211号に記載されている(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
y.シュードビリオン
y.シュードビリオン
一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、シュードビリオン(例えば、Aura Biosciences、Cambridge、MAによって開発されたシュードビリオン)において本明細書に記載されるポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するために使用されるシュードビリオンは、ウイルス、例えば、限定されないが、例として、米国公開第US20130012450号、同第US20130012566号、同第US21030012426号、および同第US20120207840号、ならびに国際公開第WO2013009717号に記載されているヘルペスおよびパピローマウイルスに由来し得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
シュードビリオンは、米国公開第US20120015899号および同第US20130177587号、ならびに国際公開第WO2010047839号、同第WO2013116656号、同第WO2013106525号、および同第WO2013122262号に記載されている方法によって調製される、ウイルス様粒子(VLP)であり得る。一態様では、VLPは、バクテリオファージMS、Qβ、R17、fr、GA、Sp、MI、I、MXI、NL95、AP205、f2、PP7、ならびに植物ウイルスであるカブクリンクルウイルス(TCV)、トマトブッシースタントウイルス(TBSV)、インゲンマメ南部モザイクウイルス(SBMV)、ならびにソラマメモットルウイルス、ブロムモザイクウイルス、カシア黄輪点ウイルス(Cassia yellow blotch virus)、ササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)、メランドリウム黄斑点ウイルス(Melandrium yellow fleck virus)、およびスプリングビューティ潜在ウイルス(spring beauty latent virus)を含むgenus Bromovirusのメンバーであり得る。別の態様では、VLPは、米国公開第US20130177587号および米国特許第8,506,967号に記載されているように、インフルエンザウイルスに由来し得る。一態様では、VLPは、国際公開第WO2013116656号に記載されているものなど、粒子の脂質膜または外側に係留した、B7-1および/またはB7-2分子を含み得る。一態様では、VLPは、国際公開第WO2012049366号に記載されているVLPなど、ノロウイルス、ロタウイルス、組換えVP6タンパク質、または二重層VP2/VP6に由来し得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、シュードビリオンは、国際公開第WO2010120266号および米国公開第US20120171290号に記載されているヒトパピローマウイルス様粒子であり得る。一部の実施形態では、ウイルス様粒子(VLP)は、自己アセンブル型粒子であってもよい。一態様では、シュードビリオンは、米国公開第US20130116408号および同第US20130115247号、ならびに国際公開第WO2013119877号に記載されている、ビリオン由来のナノ粒子であり得る。これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの製剤およびそれを製剤化するための方法の非限定的な例はまた、国際公開第WO2013090648号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に提供されている。
26.使用のための組成物および製剤
26.使用のための組成物および製剤
本開示のある特定の態様は、上記に開示されているポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む、組成物または製剤を対象とする。
一部の実施形態では、組成物または製剤は、
(i)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント)をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含み(例えば、ウラシルのうちの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、5-メトキシウラシルである)、miRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-122-3pまたはmiR-122-5p結合部位)をさらに含む、ポリヌクレオチド、ならびに
(ii)式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のうちのいずれか(例えば、化合物18、25、26、もしくは48)、または化合物1~232のうちのいずれかを含む、送達剤
を含む。
(i)IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド(例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント)をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含み(例えば、ウラシルのうちの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、5-メトキシウラシルである)、miRNA結合部位、例えば、miR-122に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR-122-3pまたはmiR-122-5p結合部位)をさらに含む、ポリヌクレオチド、ならびに
(ii)式(I)を有する化合物、例えば、化合物1~147のうちのいずれか(例えば、化合物18、25、26、もしくは48)、または化合物1~232のうちのいずれかを含む、送達剤
を含む。
一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上の最小ウラシルまたはチミン含量に対する、ORFのウラシルまたはチミン含量(%UTMまたは%TTM)は、約100%~約150%である。
一部の実施形態では、上述のポリヌクレオチド、組成物、または製剤は、IL12関連疾患、障害、または状態、例えば、がんを処置および/または予防するために使用される。
27.投与の形態
27.投与の形態
上述の本開示のポリヌクレオチド、医薬組成物、および製剤は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらとしては、腸内(腸に)、胃腸内、硬膜外(硬膜に)、経口(口から)、経皮、硬膜上、脳内(大脳に)、側脳室内(脳室内に)、皮膚上(皮膚の上への適用)、皮内(皮膚そのものに)、皮下(皮膚の下に)、鼻内投与(鼻を通じて)、静脈内(静脈の中に)、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内(動脈の中に)、筋肉内(筋肉の中に)、心臓内(心臓の中に)、骨内注入(骨髄の中に)、髄腔内(脊柱管に)、腹腔内(腹膜への注入もしくは注射)、膀胱内注入、硝子体内(眼を通じて)、空洞内注射(病理学的腔に)、腔内(陰茎の基底部に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散)、経粘膜(粘膜を通じた拡散)、経膣、吹送(吸飲)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上)、点耳、耳介(耳にもしくは耳への)、頬内(頬への)、結膜、皮膚、歯科的(1つまたは複数の歯に)、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内(軟骨内部)、尾内(馬尾内部)、脳槽内(小脳延髄槽大槽(cisterna magna cerebellomedularis)内部)、角膜内(角膜内部)、歯冠内、冠内(冠動脈内)、陰茎海綿体内(陰茎の陰核海綿体の膨張性空隙内)、椎間板内(椎間板内部)、導管内(腺導管内部)、十二指腸内(十二指腸内部)、硬膜内(硬膜内部もしくはその下に)、表皮内(表皮へ)、食道内(食道へ)、胃内(胃内部)、歯肉内(歯肉内部)、回腸内(小腸遠位部分内部)、病巣内(局在化した病変部の内部もしくはそこへの直接的な導入)、管腔内(管腔内部)、リンパ管内(リンパ内部)、髄内(骨髄腔内部)、髄膜内(髄膜内部)、眼内(眼内部)、卵巣内(卵巣内部)、心膜内(心膜内部)、胸膜内(胸膜内部)、前立腺内(前立腺腺内部)、肺内(肺もしくはその気管支内部)、副鼻腔内(鼻洞または眼窩周囲洞内部)、脊髄内(脊柱内部)、滑液嚢内(関節の滑液腔内部)、腱内(腱内部)、精巣内(精巣内部)、髄腔内(脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部)、胸郭内(胸郭内部)、小管内(器官の細管内部)、腫瘍内(腫瘍内部)、鼓室内(中耳内部)、血管内(1つまたは複数の血管内部)、脳室内(脳室内部)、イオン注入(可溶性塩イオンが身体の組織に移動する電流を用いて)、灌注(開放創傷部もしくは体腔を浸漬するかもしくは洗い流すため)、喉頭(喉頭に直接的に)、鼻腔胃(鼻を通じて胃内に)、閉塞的包帯技法(後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所投与経路)、眼部(外眼部に)、中咽頭(口および咽頭に直接的に)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器(局所的もしくは全身的な効果のための経口もしくは経鼻吸入により気道内部へ)、眼球後(脳橋背後もしくは眼球背後)、心筋内(心筋に入る)、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性(胎盤を通じてもしくはそれを越えて)、経気管(気管壁を通じて)、経鼓膜(鼓室を越えてまたはそれを通じて)、尿管(尿管へ)、尿道(尿道へ)、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、または脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を越えることを可能にする様式で、投与され得る。特定の実施形態では、ある投与経路のための製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド、またはその機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、裸で細胞に送達され得る。本明細書において使用されるとき、「裸で」とは、トランスフェクションを促進する薬剤なしで、ポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有しない場合がある。裸のポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド、またはその機能的断片、もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド)は、本明細書に記載される方法を使用して、製剤化することができる。製剤は、修飾されていてもよく、および/または未修飾であってもよい、ポリヌクレオチドを含有し得る。製剤は、限定されないが、細胞貫入剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体浸食性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含み得る。製剤化されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞に送達することができる。
組成物はまた、直接的含浸もしくは浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および/または滴下薬によって、組成物をコーティングまたは含浸させた繊維材料もしくは生体分解性材料などの物質を使用して、およびその他を含むがこれらに限定されない、いくつかの手段のうちのいずれかで、器官または組織に直接的に送達するために、製剤化され得る。
本開示は、非経口および注射による投与に好適な形態での、本開示のポリヌクレオチド(例えば、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、ならびに/またはIL12BおよびIL12Aの融合ポリペプチド、またはその機能的断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の送達を包含する。非経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において広く使用されている不活性希釈剤、例えば、例として、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(得に、綿実油、落花生油、トウモロコシ由、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに/または芳香剤などのアジュバントを含み得る。ある特定の実施形態では、非経口投与のために、組成物は、可溶化剤、例えば、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組合せと混合される。
非経口投与のための医薬組成物は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。使用される不活性成分のいずれかが、US Food and Drug Administration(FDA)に認可されていてもよく、どれも認可されていなくてもよい。非経口投与のための医薬組成物において使用するための不活性成分の徹底的ではない一覧には、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および水酸化ナトリウムが含まれる。
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または油質懸濁液は、好適な分散剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を使用して、公知の技術によって製剤化され得る。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口で許容される希釈剤および/または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および/またはエマルジョン、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であり得る。許容されるビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンガー溶液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液を用いることができる。滅菌の固定油が、従来的に、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激な固定油が用いられ得る。脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射用の調製物において使用することができる。滅菌製剤はまた、局所的麻酔剤、保存剤、および緩衝剤などのアジュバントも含み得る。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって滅菌してもよく、および/または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。
注射用製剤は、組織、器官、および/または対象の領域への直接的な注射のためのものであり得る。非限定的な例として、組織、器官、および/または対象に、虚血性領域への心筋内注射によって製剤を直接的に注射してもよい。(例えば、Zangiら、Nature Biotechnology、2013年を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
活性成分の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることが望ましい場合が多い。これは、水溶性が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。そのため、薬物の吸収の速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶のサイズおよび結晶質の形態に依存し得る。あるいは、非経口で投与される薬物形態の吸収の遅延は、薬物を、油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマーに、薬物のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって、作製される。薬物対ポリマーの比、および用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を調節することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が挙げられる。デポー注射製剤は、薬物を、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに封止することによって調製される。
28.キットおよびデバイス
a.キット
28.キットおよびデバイス
a.キット
本開示は、本開示の特許請求されるヌクレオチドを都合良く、および/または効率的に使用するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の処置を実施する、および/または複数の実験を実施するのを可能にするための十分な量および/または数の成分を含むであろう。
一態様では、本開示は、本開示の分子(ポリヌクレオチド)を含むキットを提供する。
前記キットは、翻訳可能領域を含む第1のポリヌクレオチドを含むタンパク質産生のためのものであってもよい。キットは、製剤組成物を形成するためのパッケージングおよび指示ならびに/または送達剤をさらに含んでもよい。送達剤は、生理食塩水、緩衝化溶液、リピドイドまたは本明細書に開示される任意の送達剤を含んでもよい。
一部の実施形態では、緩衝溶液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩および/またはEDTAを含んでもよい。別の実施形態では、緩衝溶液としては、限定されるものではないが、生理食塩水、2mMカルシウムを含む生理食塩水、5%スクロース、2mMカルシウムを含む5%スクロース、5%マンニトール、2mMカルシウムを含む5%マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、2mMカルシウムおよびマンノースを含む塩化ナトリウムが挙げられる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20120258046号を参照されたい)。さらなる実施形態では、緩衝溶液を沈降させるか、または凍結乾燥させることができる。各成分の量を、一貫した、再現可能な、より高い濃度の生理食塩水または単純な緩衝液製剤を可能にするために変化させることができる。また、一定期間にわたって、および/または様々な条件下で、緩衝溶液中の修飾されたRNAの安定性を増大させるために、成分を変化させてもよい。一態様では、本開示は、標的細胞中に導入された場合に翻訳可能領域によってコードされる所望の量のタンパク質を生成するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド;細胞の先天性免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害核酸を含む第2のポリヌクレオチド;ならびにパッケージングおよび指示を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、ならびにパッケージングおよび指示を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を呈する、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、および第1の核酸の翻訳可能領域の翻訳にとって好適な哺乳動物細胞を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
b.デバイス
b.デバイス
本開示は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んでもよいデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定な製剤中に、ヒト患者などの、それを必要とする対象に即時に送達することができる製剤中でポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。
投与のためのデバイスを用いて、本明細書に教示される単回、複数回または分割投薬レジメンに従って本開示のポリヌクレオチドを送達することができる。そのようなデバイスは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2013151666号に教示されている。
細胞、器官および組織への複数回投与のための当技術分野で公知の方法およびデバイスは、本開示の実施形態として本明細書に開示される方法および組成物と一緒に使用するために企図される。これらのものとしては、例えば、複数の針、例えば、管腔またはカテーテルを用いるハイブリッドデバイスならびに熱、電流または放射線により駆動される機構を利用するデバイスを有する方法およびデバイスが挙げられる。
本開示によれば、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書で企図される単回、複数回、または分割用量を送達することができる。そのようなデバイスは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2013151666号に教示されている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、3つの異なる、任意選択で、隣接する部位に、同時に、または60分間以内に、少なくとも3つの針を介して、皮下的または筋肉内的に投与される(例えば、同時に、または60分間以内に、4、5、6、7、8、9、または10の部位への投与)。
c.カテーテルおよび/または管腔を利用する方法およびデバイス
c.カテーテルおよび/または管腔を利用する方法およびデバイス
カテーテルおよび管腔を使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割投薬スケジュールで本開示のポリヌクレオチドを投与することができる。そのような方法およびデバイスは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2013151666号に記載されている。
d.電流を利用する方法およびデバイス
d.電流を利用する方法およびデバイス
電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本明細書に教示される単回、複数回、または分割投薬レジメンに従って本開示のポリヌクレオチドを送達することができる。そのような方法およびデバイスは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第WO2013151666号に記載されている。
29.定義
29.定義
本開示をより容易に理解することができるようにするために、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、別途、本明細書に明示的に提供されない場合を除いて、以下の用語はそれぞれ、以下に記載される意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通して記載される。
本開示は、群の正確に1つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスの中に存在する、中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーの1つより多く、または全部が、所与の生成物またはプロセスの中に存在する、中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」および「the」は、本文が別途明確に記述しない限り、複数の指示対象を含む。用語「a」(または「an」)、ならびに用語「1つまたは複数(one or more)」と「少なくとも1つ(at least one)」は、本明細書では互換的に使用することができる。ある特定の態様では、用語「a」または「an」は、「単一」を意味する。他の態様では、用語「a」または「an」は、「2つまたはそれよりも多い(two or more)」または「複数(multiple)」を含む。
さらに、本明細書で使用される場合、「および/または」は、他のものを含む、または含まない、2つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示と取られるべきである。したがって、本明細書で「Aおよび/またはB」などの語句で使用される場合の用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」「A」(のみ)、および「B」(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」などの語句で使用される場合の用語「および/または」は、以下の態様:A、BおよびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)のそれぞれを包含することが意図される。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology、Juo,Pei-Show、第2版、2002年、CRC Press;The Dictionary of Cell and Molecular Biology、第3版、1999年、Academic Press;およびthe Oxford Dictionary of Biochemistry and
Molecular Biology、改訂版、2000年、Oxford University Pressは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
Molecular Biology、改訂版、2000年、Oxford University Pressは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
態様が、用語「含む(comprising)」と共に本明細書に記載される場合はどこでも、「からなる(consisting of)」および/または「本質的にからなる(consisting essentially of)」に関して記載される別の同様の態様も提供される。
単位、接頭辞、および記号は、そのSysteme International de Unites(SI)に受け入れられる形態で記載される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。値の範囲が記載される場合、その範囲の記載される上限と下限の間の、それぞれの介在する整数値、およびそのそれぞれの分数も、そのような値の間のそれぞれの部分的範囲と共に具体的に開示されると理解されるべきである。任意の範囲の上限および下限は、その範囲に独立に含まれてもよく、またはそれから除外されてもよく、いずれかの限界、いずれでもない限界、または両方の限界が含まれる場合のそれぞれの範囲も、本開示に包含される。ある値が明示的に記載される場合、記載される値とおよそ同じ数量または量である値も、本開示の範囲内にあることが理解されるべきである。組合せが開示される場合、その組合せの要素のそれぞれの部分的組合せも、具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素群が個別に開示される場合、その組合せも開示される。ある開示の任意の要素が、複数の代替物を有すると開示される場合、それぞれの代替物が、単独で、または他の代替物との任意の組合せで除外されるその開示の例も、本明細書に開示される;ある開示の1つより多い要素は、そのような除外を有してもよく、そのような除外を有する要素の全ての組合せが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、その一般的に許容される1文字コードによって記載される。別途指摘しない限り、核酸は、左から右に、5’から3’の方向に書かれる。核酸塩基は、本明細書では、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨されるその一般的に公知の1文字記号によって記載される。したがって、Aはアデニンを表し、Cはシトシンを表し、Gはグアニンを表し、Tはチミンを表し、Uはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書では、その一般的に公知の3文字記号によって、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される1文字記号によって記載される。別途指摘しない限り、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向に書かれる。
約:本明細書および特許請求の範囲を通して数値と共に使用される用語「約」は、当業者が精通し、許容可能な、正確性の区間を指す。一般に、そのような正確性の区間は、±10%である。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別途指摘しない限り、または文脈および当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表現される値は、本文が別途明確に記述しない限り、その範囲の下限の単位の10分の1までの、本開示の異なる実施形態における任意の特定の値または記述される範囲内の部分範囲とみなすことができる。
組合せでの投与:本明細書で使用される場合、用語「組合せでの投与」または「組合せ投与」は、2つまたはそれよりも多い薬剤が、同時に、または患者に対する各薬剤の効果の重複が存在してもよいような間隔の中で対象に投与されることを意味する。一部の実施形態では、それらは互いに約60、30、15、10、5、または1分以内に投与される。一部の実施形態では、薬剤の投与は、組合せ(例えば、相乗的)効果が達成されるように、一緒に十分に近い間隔で行われる。
アミノ酸置換:用語「アミノ酸置換」とは、親配列または参照配列(例えば、野生型IL12配列)中に存在するアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。あるアミノ酸を、例えば、化学的ペプチド合成により、または当技術分野で公知の組換え方法により、親配列または参照配列(例えば、野生型IL12ポリペプチド配列)中で置換することができる。したがって、「X位での置換」に対する参照は、X位に存在するアミノ酸の、代替的なアミノ酸残基による置換を指す。一部の態様では、置換パターンを、スキーマAnY(式中、Aはn位に自然に、または元々存在するアミノ酸に対応する1文字コードであり、Yは置換アミノ酸残基である)に従って記載することができる。他の態様では、置換パターンを、スキーマAn(YZ)(式中、AはX位に自然に、または元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する1文字コードであり、YおよびZは、代替的な置換アミノ酸残基である)に従って記載することができる。
本開示の文脈では、置換(アミノ酸置換を指す場合であっても)は、核酸レベルで行われる、すなわち、あるアミノ酸残基の、代替的なアミノ酸残基による置換は、第1のアミノ酸をコードするコドンを、第2のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって行われる。
動物:本明細書で使用される場合、用語「動物」とは、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、畜牛、霊長類、またはブタ)である。一部の実施形態では、動物としては、限定されるものではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられる。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
およそ:目的の1つまたは複数の値に適用される、本明細書で使用される場合、用語「およそ」とは、記述される参照値と類似する値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」は、別途記述しない限り、または別途文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向(その値を超えるまたはその値未満)に25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満の範囲内にある値の範囲を指す(そのような数が可能な値の100%を超える場合を除く)。
と関連する:疾患に関して本明細書で使用される場合、用語「と関連する」は、問題の症状、測定値、特徴、または状態が、その疾患の診断、発症、存在、または進行を関連することを意味する。関連は、必須ではないが、疾患と原因として関連していてもよい。例えば、がん患者の生活の質の低下を引き起こす症状、後遺症、または任意の効果は、がんと関連すると考えられ、本開示の一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによって処置、改善、または予防することができる。
2つまたはそれよりも多い部分に関して使用される場合、用語「と会合する」、「コンジュゲートする」、「連結する」、「付着する」、および「係留する」は、2つまたはそれよりも多い部分に関して使用される場合、その部分が、直接的に、または連結剤として働く1つもしくは複数の追加の部分を介して、互いに物理的に会合、または接続されて、構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、部分が物理的に会合したままとなるように十分に安定な構造を形成する。「会合」は、厳密に直接的な共有化学結合によるものである必要はない。それはまた、「会合した」実体が物理的に会合したままであるような十分に安定な接続性に基づくイオンもしくは水素結合またはハイブリダイゼーションも示唆してもよい。
二官能性:本明細書で使用される場合、用語「二官能性」とは、少なくとも2つの機能を行うことができる、または維持する任意の物質、分子または部分を指す。この機能は、同じ転帰または異なる転帰に影響してもよい。機能をもたらす構造は、同じであっても、または異なっていてもよい。例えば、本開示の二官能性の修飾されたRNAは、IL12ペプチド(第1の機能)をコードしてもよいが、コードRNAを含むヌクレオシドは、それ自身、RNAの半減期を延長することができる(第2の機能)。この例では、タンパク質欠損症に罹患している対象への二官能性の修飾されたRNAの送達は、疾患または状態を改善または処置することができるペプチドまたはタンパク質分子を生成するだけでなく、長期間にわたって対象中に存在する修飾されたRNA集団を維持するであろう。他の態様では、二官能性の修飾されたmRNAは、例えば、IL12ペプチド(第1の機能)および第1のタンパク質に融合されるか、または第1のタンパク質と同時発現される第2のタンパク質をコードするRNAを含むキメラ分子であってもよい。
生体適合性:本明細書で使用される場合、用語「生体適合性」は、免疫系による傷害、毒性または拒絶のリスクが小さいか、またはリスクがなく、生細胞、組織、器官、または系と適合することを意味する。
生分解性:本明細書で使用される場合、用語「生分解性」は、生物の作用によって無害な生成物に破壊できることを意味する。
生物活性:本明細書で使用される語句「生物活性」とは、生物系および/または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対する生物学的効果を有する物質は、生物活性であると考えられる。特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも生物活性であるか、または生物学的に関連すると考えられる活性を模倣する場合、生物活性であると考えることができる。
キメラ:本明細書で使用される場合、「キメラ」は、2つまたはそれよりも多い、一致しない、または異種である部分または領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BとIL12Aポリペプチドの両方を含む第1の部分と、第2の治療タンパク質(例えば、異なる酵素活性、抗原結合部分、またはIL12の血漿半減期を延長することができる部分、例えば、抗体のFc領域を含むタンパク質)を含む第2の部分(例えば、第1の部分に遺伝的に融合される)とを含んでもよい。
配列最適化:用語「配列最適化」とは、参照核酸配列中の核酸塩基が代替的な核酸塩基と置き換えられ、特性が改善された、例えば、タンパク質発現が改善された、または免疫原性が減少した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
一般に、配列最適化における目標は、参照ヌクレオチド配列によってコードされる同じポリペプチド配列をコードする同義のヌクレオチド配列を生成することである。したがって、参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに関して、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド中にはアミノ酸置換(コドン最適化の結果として)はない。
コドン置換:配列最適化の文脈における用語「コドン置換」または「コドン置き換え」とは、参照核酸配列中に存在するコドンを、別のコドンと置き換えることを指す。コドンを、参照核酸配列中で、例えば、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成により、または組換え方法により置換することができる。したがって、核酸配列(例えば、mRNA)中、または核酸配列(例えば、mRNA)のある特定の領域もしくは部分配列内のある特定の位置での「置換」または「置き換え」に対する参照は、そのような位置または領域のコドンの、代替的なコドンとの置換を指す。
本明細書で使用される場合、用語「コード領域」および「コードする領域」およびその文法的なバリアントは、発現時に、ポリペプチドまたはタンパク質をもたらすポリヌクレオチド中のオープンリーディングフレーム(ORF)を指す。
化合物:本明細書で使用される場合、用語「化合物」は、記載される構造の全ての立体異性体および同位体を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」は、化合物の任意の幾何異性体(例えば、cis-およびtrans-異性体)、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性的に純粋な形態(例えば、幾何異性的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な)および鏡像異性体と立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体を含む、本明細書に記載の化合物の任意かつ全ての立体異性体を包含する。化合物の鏡像異性体と立体異性体の混合物およびそれらを、その成分である鏡像異性体または立体異性体に分解する手段は、周知である。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、核中の中性子数が異なる結果、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体としては、三重水素および重水素が挙げられる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体を、日常的な方法により、溶媒または水分子と組み合わせて調製して、溶媒和物および水和物を形成させることができる。
接触させること:本明細書で使用される場合、用語「接触」は、2つまたはそれよりも多い実体の間の物理的接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞と、ナノ粒子組成物との接触は、哺乳動物細胞とナノ粒子とに、物理的接続を共有させることを意味する。in vivoとex vivoの両方において細胞を外部的実体と接触させる方法は、生物分野で周知である。例えば、ナノ粒子組成物と、哺乳動物内に配置された哺乳動物細胞との接触を、様々な投与経路(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下)により実施することができ、可変量のナノ粒子組成物を含んでもよい。さらに、1つより多い哺乳動物細胞を、ナノ粒子組成物によって接触させることができる。
保存的アミノ酸置換:「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列中のアミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン)を含む。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸で置き換えられる場合、アミノ酸置換は保存的であると考えられる。別の態様では、一続きのアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および/または組成において異なる構造的に類似する一続きのもので保存的に置き換えることができる。
非保存的アミノ酸置換:非保存的アミノ酸置換としては、(i)電気陽性側鎖を有する残基(例えば、Arg、HisもしくはLys)が、電気陰性残基(例えば、GluもしくはAsp)に置換される、もしくはそれにより置換される、(ii)親水性残基(例えば、SerもしくはThr)が、疎水性残基(例えば、Ala、Leu、Ile、PheもしくはVal)に置換される、もしくはそれにより置換される、(iii)システインもしくはプロリンが、他の任意の残基に置換される、もしくはそれにより置換される、または(iv)嵩高い疎水性もしくは芳香族側鎖を有する残基(例えば、Val、His、IleもしくはTrp)が、より小さい側鎖(例えば、AlaもしくはSer)を有するもの、もしくは側鎖を有さないもの(例えば、Gly)に置換される、もしくはそれにより置換されるものが挙げられる。
当業者であれば、他のアミノ酸置換を容易に同定することができる。例えば、アミノ酸アラニンについては、D-アラニン、グリシン、ベータ-アラニン、L-システインおよびD-システインのいずれか1つから置換を取ることができる。リシンについては、置き換えは、D-リシン、アルギニン、D-アルギニン、ホモ-アルギニン、メチオニン、D-メチオニン、オルニチン、またはD-オルニチンのいずれか1つであってもよい。一般に、単離されたポリペプチドの特性の変化を誘導すると予想することができる機能的に重要な領域における置換は、(i)極性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、もしくはアラニンに(もしくは、それらにより)置換される;(ii)システイン残基が、他の任意の残基に(もしくは、それらにより)置換される;(iii)電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸に(もしくは、それらにより)置換される;または(iv)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、そのような側鎖を有さないもの、例えば、グリシンに(もしくは、それらにより)置換されるものである。前記非保存的置換の1つがタンパク質の機能的特性を変化させることができる可能性もまた、タンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置と相関する:一部の非保存的置換は、したがって、生物学的特性に対する効果が小さいか、または効果がない。
保存された:本明細書で使用される場合、用語「保存された」とは、比較される2つもしくはそれよりも多い配列の同じ位置で変化しないまま存在するものである、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列中の他の場所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連する配列間で保存されたものである。
一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに100%同一である場合、「完全に保存された」と言われる。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%同一、約98%同一、または約99%同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに少なくとも30%同一、少なくとも40%同一、少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「高度に保存された」と言われる。一部の実施形態では、2つまたはそれよりも多い配列は、それらが互いに約30%同一、約40%同一、約50%同一、約60%同一、約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%同一、約98%同一、または約99%同一である場合、「高度に保存された」と言われる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの全長に適用してもよいか、またはその一部、領域もしくは特徴に適用してもよい。
調節放出:本明細書で使用される場合、用語「調節放出」とは、治療的転帰をもたらす特定の放出パターンに従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
共有誘導体:用語「共有誘導体」は、ポリペプチドを指す場合、天然または出発タンパク質の、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤による修飾、および/または翻訳後修飾を含む。共有修飾は、伝統的には、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾機構を利用することによって導入される。得られる共有誘導体は、生物活性、イムノアッセイ、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製にとって重要な残基を同定することに向けられたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野における通常の知識の範囲内であり、過度の実験なく実施される。
環状または環化:本明細書で使用される場合、用語「環状」とは、連続ループの存在を指す。環状分子は、環状である必要はなく、サブユニットの破壊されない鎖を形成するためにただ接合されていればよい。本開示の操作されたRNAまたはmRNAなどの環状分子は、単一ユニットもしくはマルチマーであってもよく、または複雑な、もしくはより高次の構造の1つもしくは複数の成分を含んでもよい。
細胞毒性:本明細書で使用される場合、「細胞毒性」とは、細胞(例えば、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞))、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはその組合せを死滅させること、またはそれに対する傷害、毒性、もしくは殺滅効果を引き起こすことを指す。
送達:本明細書で使用される場合、用語「送達」は、実体に目的地を提供することを意味する。例えば、対象へのポリヌクレオチドの送達は、ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を対象に投与すること(例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路による)を含んでもよい。哺乳動物または哺乳動物細胞へのナノ粒子組成物の投与は、1つまたは複数の細胞と、ナノ粒子組成物とを接触させることを含んでもよい。
送達剤:本明細書で使用される場合、「送達剤」とは、少なくとも部分的に、ポリヌクレオチドの標的細胞へのin vivo、in vitro、またはex vivoでの送達を容易にする任意の物質を指す。
不安定化:本明細書で使用される場合、用語「不安定」、「不安定化する」または「不安定化領域」は、出発型、野生型または天然型の同じ領域または分子よりも安定でない領域または分子を意味する。
検出可能標識:本明細書で使用される場合、「検出可能標識」とは、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度などの当技術分野で公知の方法によって容易に検出される別の実体と付着した、組み込まれた、または会合した1つまたは複数のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンなどのリガンド、量子ドットなどが挙げられる。検出可能標識を、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質中の任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質の中にあるか、またはNもしくはC末端に位置してもよい。
ジアステレオマー:本明細書で使用される場合、用語「ジアステレオマー」は、互いの鏡像ではなく、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化すること:本明細書で使用される場合、用語「消化する」とは、より小さい小片または成分にばらばらになることを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質を指す場合、消化はペプチドの生成をもたらす。
遠位:本明細書で使用される場合、用語「遠位」は、中心から遠くにあること、または目的の点もしくは領域から遠くにあることを意味する。
ドメイン:本明細書で使用され、ポリペプチドを指す場合、用語「ドメイン」とは、1つまたは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性(例えば、タンパク質間相互作用のための部位として働く、結合能力)を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投薬レジメン:本明細書で使用される場合、「投薬レジメン」または「投薬レジメン」は、処置、予防、または緩和ケアの投与スケジュールまたは医師により決定されたレジメンである。
有効量:本明細書で使用される場合、薬剤の用語「有効量」は、有益な、または所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、タンパク質欠損(例えば、IL12欠損)を処置する薬剤を投与する状況では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしに観察される症状の重症度と比較して、IL12欠損と関連する症状を改善する、低減する、除去する、または予防するのに十分なPBGFを発現するmRNAの量である。用語「有効量」を、「有効用量」、「治療有効量」または「治療有効用量」と互換的に使用することができる。
鏡像異性体:本明細書で使用される場合、用語「鏡像異性体」とは、少なくとも80%(すなわち、一方の鏡像異性体の少なくとも90%および他方の鏡像異性体の多くても10%)、少なくとも90%、または少なくとも98%の光学純度または鏡像異性過剰(当技術分野で標準的な方法によって決定される)を有する、本開示の化合物のそれぞれ個々の光学的に活性な形態を意味する。
封入する:本明細書で使用される場合、用語「封入する」とは、封止、包囲、または内包することを意味する。
封入効率:本明細書で使用される場合、「封入効率」とは、ナノ粒子組成物の調製において使用されるポリヌクレオチドの初期総量と比較して、ナノ粒子組成物の一部になるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、組成物に最初に提供される合計100mgのポリヌクレオチドのうち、97mgのポリヌクレオチドがナノ粒子組成物中に封入される場合、封入効率は97%として与えることができる。本明細書で使用される場合、「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な同封、閉じ込め、取り囲み、または包み込みを指してもよい。
コードタンパク質切断シグナル:本明細書で使用される場合、「コードタンパク質切断シグナル」とは、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作された:本明細書で使用される場合、本開示の実施形態は、それらが構造的なものであっても、化学的なものであっても、出発点、野生型または天然分子から変化する特徴または特性を有するように設計される場合、「操作される」。
増強された送達:本明細書で使用される場合、用語「増強された送達」は、目的の標的組織(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)への対照ナノ粒子によるポリヌクレオチドの送達のレベルと比較して、目的の標的組織(例えば、哺乳動物の肝臓)へのナノ粒子によるより多くの(例えば、少なくとも1.5倍多くの、少なくとも2倍多くの、少なくとも3倍多くの、少なくとも4倍多くの、少なくとも5倍多くの、少なくとも6倍多くの、少なくとも7倍多くの、少なくとも8倍多くの、少なくとも9倍多くの、少なくとも10倍多くの)ポリペプチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルを、組織中で生成されるタンパク質の量を、前記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を、前記組織の重量と比較すること、組織中で生成されるタンパク質の量を、前記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を、前記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することによって測定することができる。標的組織へのナノ粒子の増強された送達は、処置される対象において決定される必要はなく、動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代用物において決定することができることが理解されるであろう。
エキソソーム:本明細書で使用される場合、「エキソソーム」は、哺乳動物細胞により分泌されるベシクルまたはRNA分解に関与する複合体である。
発現:本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象:(1)DNA配列からのmRNA鋳型の生成(例えば、転写による);(2)mRNA転写物のプロセッシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、および/または3’末端プロセッシングによる);(3)ポリペプチドまたはタンパク質へのmRNAの翻訳;ならびに(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの1つまたは複数を指す。
ex vivo:本明細書で使用される場合、用語「ex vivo」とは、生物(例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織)の外部で起こる事象を指す。ex vivoでの事象は、天然の(例えば、in vivo)環境から最小限に変化した環境中で起こってもよい。
特徴:本明細書で使用される場合、「特徴」とは、特徴、特性、または独特の要素を指す。ポリペプチドを指す場合、「特徴」は、ある分子の異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本開示のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴は、表面発現、部分的コンフォメーション形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはその任意の組合せを含む。
製剤:本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドと、担体、賦形剤、および送達剤の1つまたは複数とを含む。
断片:本明細書で使用される「断片」とは、一部を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、断片は、N末端、および/またはC末端、および/または内部部分配列が欠失した、全長タンパク質(例えば、IL12)の部分配列である。本開示の一部の好ましい態様では、本開示のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的:本明細書で使用される場合、「機能的」生物分子は、それが特徴付けられる特性および/または活性を呈する形態にある生物分子である。したがって、本開示のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的IL12断片を発現することができるポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、IL12の機能的断片とは、断片が、対応する全長タンパク質の生物活性の少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%を保持する、野生型IL12の断片(すなわち、任意のその天然のアイソフォームの断片)、またはその変異体もしくはバリアントを指す。
ヘルパー脂質:本明細書で使用される場合、用語「ヘルパー脂質」とは、脂質部分(脂質層、例えば、脂質二重層への挿入のため)および極性部分(脂質層の表面での生理的溶液との相互作用のため)を含む化合物または分子を指す。典型的には、ヘルパー脂質は、リン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を「補完」し、二重層の融合原性を増大させること、および/または例えば、細胞に送達される核酸の、エンドソーム脱出を容易にするのを助けることである。ヘルパー脂質はまた、LNPの表面にとって重要な構造成分であると考えられる。
相同性:本明細書で使用される場合、用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子および/もしくはRNA分子)間ならびに/またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。一般に、用語「相同性」は、2つの分子間の進化的関係を意味する。したがって、相同である2つの分子は、共通の進化的祖先を有する。本開示の文脈では、相同性という用語は、同一性と類似性の両方を包含する。
一部の実施形態では、ポリマー分子は、分子中のモノマーの少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%が同一である(正確に同じモノマー)または類似する(保存的置換)場合、互いに「相同」であると考えられる。用語「相同」は、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)間の比較を必ず指す。
同一性:本明細書で使用される場合、用語「同一性」とは、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子および/もしくはRNA分子)間、ならびに/またはポリペプチド分子間の全体的なモノマー保存を指す。例えば、2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出を、最適比較目的で2つの配列を整列させることによって実行することができる(例えば、最適なアライメントのために第1および第2の核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、非同一の配列を比較目的で無視することができる)。ある特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第1の配列中の位置が第2の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占められる場合、その分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定を、数的アルゴリズムを使用して達成することができる。DNAおよびRNAを比較する場合、チミン(T)およびウラシル(U)を同等に考えることができる。
好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能であり、タンパク質とヌクレオチド配列の両方のアライメントのためのものである。配列同一性パーセントを決定するための1つの好適なプログラムは、U.S.government’s National Center for Biotechnology Information
BLASTウェブサイト(blast.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能なプログラムのBLASTスイートの一部であるbl2seqである。bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して2つの配列間の比較を実行する。BLASTNは核酸配列を比較するために使用されるが、BLASTPはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Needle、Stretcher、Water、またはバイオインフォマティクスプログラムのEMBOSSスイートの一部であり、www.ebi.ac.uk/Tools/psaでEuropean Bioinformatics Institute(EBI)から入手可能でもあるMatcherである。
BLASTウェブサイト(blast.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能なプログラムのBLASTスイートの一部であるbl2seqである。bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムのいずれかを使用して2つの配列間の比較を実行する。BLASTNは核酸配列を比較するために使用されるが、BLASTPはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、Needle、Stretcher、Water、またはバイオインフォマティクスプログラムのEMBOSSスイートの一部であり、www.ebi.ac.uk/Tools/psaでEuropean Bioinformatics Institute(EBI)から入手可能でもあるMatcherである。
MAFFT、Clustal(ClustalW、ClustalXまたはClustal Omega)、MUSCLEなどの当技術分野で公知の方法を使用して、配列アライメントを行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それ自身の配列同一性パーセントを有してもよい。配列同一性パーセント値は、10分の1単位まで四捨五入されることに留意されたい。例えば、80.11、80.12、80.13、および80.14は、80.1に四捨五入されるが、80.15、80.16、80.17、80.18、および80.19は80.2に四捨五入される。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
ある特定の態様では、第2のアミノ酸配列(または核酸配列)に対する第1のアミノ酸配列(または核酸配列)の同一性百分率「%ID」は、%ID=100×(Y/Z)(式中、Yは第1と第2の配列のアライメント(目視または特定の配列アライメントプログラムによって整列される)において同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基(または核酸塩基)の数であり、Zは第2の配列中の残基の総数である)として算出される。第1の配列の長さが第2の配列よりも長い場合、第2の配列に対する第1の配列の同一性パーセントは、第1の配列に対する第2の配列の同一性パーセントよりも高いであろう。
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの作成は、一次配列データによって専ら駆動されるバイナリー配列間比較に限定されないことを理解できる。また、配列データを、構造データ(例えば、結晶学的タンパク質構造)、機能データ(例えば、変異の位置)、または系統発生データなどの、異種起源に由来するデータと統合することによって、配列アライメントを作成することができることも理解される。異種データを統合して、複数の配列アライメントを作成する好適なプログラムは、www.tcoffee.orgで入手可能であり、あるいは、例えば、EBIから入手可能なT-Coffeeである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的なアライメントを、自動的に、または手動でキュレートすることができることも理解されるであろう。
免疫応答:用語「免疫応答」とは、例えば、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、その破壊、またはそのヒト体内からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓によって生成される可溶性高分子(抗体、サイトカイン、および補体など)の作用を指す。一部の場合、脂質成分と封入された治療剤とを含むナノ粒子の投与は、(i)封入された治療剤(例えば、mRNA)、(ii)そのような封入された治療剤の発現産物(例えば、mRNAによってコードされるポリペプチド)、(iii)ナノ粒子の脂質成分、または(iv)その組合せにより引き起こされ得る、免疫応答を誘発することができる。
炎症応答:「炎症応答」とは、特異的および非特異的防御系を含む免疫応答を指す。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫系反応である。特異的防御系反応の例としては、抗体応答が挙げられる。非特異的防御系反応は、一般的には、免疫記憶を行うことができない白血球、例えば、マクロファージ、好酸球および好中球により媒介される炎症応答である。一部の態様では、免疫応答は、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす、炎症性サイトカインの分泌を含む。
炎症性サイトカイン:用語「炎症性サイトカイン」とは、炎症応答において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン-6(IL-6)、GROαとしても知られるCXCL1(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1、インターフェロン-γ(IFNγ)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターフェロンγ誘導性タンパク質10(IP-10)、または顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)が挙げられる。炎症性サイトカインという用語は、当技術分野で公知の炎症応答と関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-12(IL12)、インターロイキン-13(IL-13)、インターフェロンα(IFN-α)なども含む。
in vitro:本明細書で使用される場合、用語「in vitro」とは、生物(例えば、動物、植物、または微生物)の中よりもむしろ、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などの中で起こる事象を指す。
in vivo:本明細書で使用される場合、用語「in vivo」とは、生物(例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織)の中で起こる事象を指す。
挿入および欠失バリアント:「挿入バリアント」は、ポリペプチドを指す場合、天然または出発配列中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入される1つまたは複数のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接」するとは、アミノ酸のアルファ-カルボキシまたはアルファ-アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。「欠失バリアント」は、ポリペプチドを言う場合、天然または出発アミノ酸配列中の1つまたは複数のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域中の1つまたは複数のアミノ酸が欠失しているであろう。
インタクト:本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈では、用語「インタクト」は、例えば、野生型アミノ酸を変異させること、または置換することではなく、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持することを意味する。逆に、核酸の文脈では、用語「インタクト」は、例えば、野生型核酸塩基を変異させること、または置換することではなく、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持することを意味する。
イオン化可能アミノ脂質:用語「イオン化可能アミノ脂質」は、1、2、3、またはそれよりも多い脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、pH滴定可能アミノ頭部基(例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基)を有する脂質を含む。イオン化可能アミノ脂質は、典型的には、アミノ頭部基のpKaを下回るpHでプロトン化(すなわち、正に荷電)され、pKaより上のpHでは実質的に荷電しない。そのようなイオン化可能アミノ脂質としては、限定されるものではないが、DLin-MC3-DMA(MC3)および(13Z,165Z)-N,N-ジメチル-3-ノニドコサ-13-16-ジエン-1-アミン(L608)が挙げられる。
単離された:本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、それが会合した成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す(自然においても、または実験設定においても)。単離された物質(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)は、それらが単離された物質を参照して変化する純度レベルを有してもよい。単離された物質および/または実体を、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、またはそれよりも多くのそれらが最初に会合していた他の成分から分離することができる。一部の実施形態では、単離された物質は、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%を超えて、または約99%を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、物質が他の成分を実質的に含まない場合、それは「純粋」である。
実質的に単離された:「実質的に単離された」とは、化合物が形成または検出された環境から、それが実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物中で富化された組成物を含んでもよい。実質的な分離は、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、または少なくとも約99重量%の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物を含んでもよい。
「単離された」ポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または本明細書に開示される任意の組成物は、自然には見出されない形態にあるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、それらが最早自然に見出される形態にない程度まで精製されたものを含む。一部の態様では、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体:本明細書で使用される場合、用語「異性体」は、本開示の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示の化合物は、1つまたは複数のキラル中心および/または二重結合を有してもよく、従って、二重結合異性体(すなわち、幾何E/Z異性体)またはジアステレオマー(例えば、鏡像異性体(すなわち、(+)もしくは(-))またはcis/trans異性体)などの、立体異性体として存在してもよい。本開示によれば、本明細書に記載の化学構造、したがって、本開示の化合物は、全ての対応する立体異性体、すなわち、立体的に純粋な形態(例えば、幾何異性的に純粋な、鏡像異性的に純粋な、またはジアステレオマー的に純粋な)と、鏡像異性体と立体異性体の混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本開示の化合物の鏡像異性体と立体異性体の混合物は、典型的には、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化などの周知の方法によって、その成分である鏡像異性体または立体異性体に分解することができる。鏡像異性体と立体異性体とを、周知の非対称性合成方法により、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から取得することもできる。
リンカー:本明細書で使用される場合、「リンカー」(本明細書で呼ばれるようなサブユニットリンカーおよび異種ポリペプチドリンカーを含む)とは、原子、例えば、10~1,000個の原子の群を指し、限定されるものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミンなどの原子または基を含んでもよい。リンカーを、第1の末端で、核酸塩基または糖部分上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドに、また、第2の末端で、ペイロード、例えば、検出可能剤または治療剤に付着させることができる。リンカーは、核酸配列への組込みを妨げないような十分な長さのものであってもよい。リンカーを、ポリヌクレオチドマルチマー(例えば、2つもしくはそれよりも多いキメラポリヌクレオチド分子もしくはIVTポリヌクレオチドの連結により)またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、ならびに本明細書に記載のペイロードを投与するためなどの、任意の有用な目的のために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、限定されるものではないが、それぞれ、本明細書に記載のように、任意選択で置換されていてもよい、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられる。リンカーの例としては、限定されるものではないが、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール)、およびデキストランポリマーならびにその誘導体が挙げられる。他の例としては、限定されるものではないが、例えば、還元剤または光分解を使用して切断することができるジスルフィド結合(-S-S-)またはアゾ結合(-N=N-)などのリンカー内の切断可能部分が挙げられる。選択的に切断可能な結合の非限定例としては、例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、もしくは他の還元剤の使用、および/または光分解により切断することができるアミド結合、ならびに例えば、酸または塩基加水分解により切断することができるエステル結合が挙げられる。
投与方法:本明細書で使用される場合、「投与方法」は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法を含んでもよい。投与方法を、身体の特定の領域または系への送達を標的化する(例えば、特異的に送達する)ように選択することができる。
修飾された:本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本開示の分子の状態または構造の変化を指す。化学的、構造的、および機能的などの多くの方法で分子を修飾することができる。一部の実施形態では、本開示のmRNA分子は、例えば、それが天然のリボヌクレオチド、A、U、GおよびCに関する場合、非天然ヌクレオシドおよび/またはヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、A、C、G、Uリボヌクレオチドの化学構造とは異なるが、「修飾された」とは考えない。
粘液:本明細書で使用される場合、「粘液」とは、粘性であり、ムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物:本明細書で使用される場合、「ナノ粒子組成物」は、1つまたは複数の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、典型的には、マイクロメートル規模またはそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含んでもよい。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質ベシクル)、およびリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、500nmまたはそれ未満の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであってもよい。
天然に存在する:本明細書で使用される場合、「天然に存在する」とは、人工的な補助なしで自然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物:本明細書で使用される場合、「非ヒト脊椎動物」は、野生種および家畜化された種を含む、Homo sapiens以外の全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定されるものではないが、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、畜牛、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤクなどの哺乳動物が挙げられる。
核酸配列:用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、連続する核酸配列を指す。配列は、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNA、例えば、mRNAであってもよい。
用語「核酸」は、その最も広い意味で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および/または物質を含む。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。例示的な本開示の核酸またはポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(β-D-リボ構成を有するLNA、α-L-リボ構成を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)、2’-アミノ官能基を有する2’-アミノ-LNA、および2’-アミノ官能基を有する2’-アミノ-α-LNAを含むLNA)、エチレン核酸(ENA)、シクロヘキセニル核酸(CeNA)またはそのハイブリッドもしくは組合せが挙げられる。
語句「コードするヌクレオチド配列」とは、ポリペプチドをコードする、核酸(例えば、mRNAまたはDNA分子)コード配列を指す。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞中での発現を指令することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルなどの制御エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含んでもよい。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでもよい。
標的外:本明細書で使用される場合、「標的外」とは、任意の1つまたは複数の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図されない効果を指す。
オープンリーディングフレーム:本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」とは、所与の読み枠中に終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結された:本明細書で使用される場合、語句「作動可能に連結された」とは、2つまたはそれよりも多い分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的接続を指す。
任意選択で置換された:本明細書における語句の形態「任意選択で置換されたX」(例えば、任意選択で置換されたアルキル)は、「X(式中、Xは任意選択で置換される)」と等価であることが意図される(例えば、「アルキル(式中、前記アルキルは、任意選択で置換される)」)。特徴「X」(例えば、アルキル)自体が任意選択であることを意味することを意図するものではない。
部分:本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、ポリヌクレオチドの全長未満であるポリヌクレオチドの任意の一部と定義される。
患者:本明細書で使用される場合、「患者」とは、処置を求めることができる、もしくは処置の必要があり得る、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受けるであろう対象、または特定の疾患もしくは状態に関する訓練された専門家によるケアの下にある対象を指す。
薬学的に許容される:語句「薬学的に許容される」とは、適切な医学的判断の範囲内にあり、過剰の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織との接触における使用にとって好適であり、合理的な利益/リスク比と釣り合う、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。
薬学的に許容される賦形剤:語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、患者において実質的に非毒性的および非炎症性である特性を有する、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分(例えば、活性化合物を懸濁または溶解することができるビヒクル)を指す。賦形剤は、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、色素(色)、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤(希釈剤)、フィルム形成剤またはフィルムコーティング、香味料、香料、流動促進剤(流動増強剤)、潤滑剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、および水和水を含んでもよい。例示的な賦形剤としては、限定されるものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(二塩基)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容される塩:本開示はまた、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、親化合物が、存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより(例えば、遊離塩基を、好適な有機酸と反応させることにより)修飾された、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定されるものではないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸または有機酸塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどの、非毒性アンモニウム、第4級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩を、従来の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、水中もしくは有機溶媒中、またはその2つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物と、化学量論量の適切な塩基もしくは酸とを反応させることにより、そのような塩を調製することができる;一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が使用される。好適な塩の一覧は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、1985年、1418頁、Pharmaceutical Salts:
Properties, Selection, and Use、P.H.StahlおよびC.G.Wermuth(編)、Wiley-VCH、2008年、およびBergeら、Journal of Pharmaceutical Science、66巻、1~19頁(1977年)に見出され、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Properties, Selection, and Use、P.H.StahlおよびC.G.Wermuth(編)、Wiley-VCH、2008年、およびBergeら、Journal of Pharmaceutical Science、66巻、1~19頁(1977年)に見出され、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬学的に許容される溶媒和物:本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、好適な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれた本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理的に許容される。例えば、有機溶媒、水、またはその混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈降化により、溶媒和物を調製することができる。好適な溶媒の例は、エタノール、水(例えば、一、二、および三水和物)、N-メチルピロリジノン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N’-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N’-ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMEU)、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2-(1H)-ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2-ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
薬物動態:本明細書で使用される場合、「薬物動態」とは、ある分子または化合物が生体に投与された物質の運命の決定に関わる場合の、その任意の1つまたは複数の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝および排出の程度および速度を含むいくつかの領域に分割される。これは一般的にはADMEと呼ばれ、ここで、(A)吸収は、血液循環に入る物質のプロセスであり、(D)分布は、体液および体組織を介する物質の分散または播種であり、(M)代謝(または生体内変換)は、親化合物の娘代謝物への不可逆的変換であり、ならびに(E)排出(または除去)とは、身体からの物質の除去を指す。稀な事例では、一部の薬物は、体組織に不可逆的に蓄積する。
生理化学的:本明細書で使用される場合、「生理化学的」とは、物理および/または化学特性を意味する、またはそれと関連する。
ポリヌクレオチド:本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体、またはその混合物などの、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸(「RNA」)を含む。それは、例えば、アルキル化により、および/またはキャッピングにより修飾された形態、ならびに修飾されていない型のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、スプライスされていても、スプライスされていなくても、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、tRNA、rRNA、hRNA、siRNAおよびmRNAを含むポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、プリンまたはピリミジン塩基のNまたはC-グリコシドである他の任意の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド性(normucleotidic)骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸「PNA」)およびポリモルホリノポリマー、ならびにポリマーが、DNAおよびRNAにおいて見出されるような、塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するという条件で、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、mRNAを含む。他の態様では、mRNAは、合成mRNAである。一部の態様では、合成mRNAは、少なくとも1つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、ある特定のクラスの全核酸塩基が、非天然核酸塩基で置き換えられている(例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド中の全てのウリジンを、非天然核酸塩基、例えば、5-メトキシウリジンで置き換えることができる)。一部の態様では、ポリヌクレオチド(例えば、合成RNAまたは合成DNA)は、天然核酸塩基のみ、すなわち、合成DNAの場合、A(アデノシン)、G(グアノシン)、C(シチジン)、およびT(チミジン)、または合成RNAの場合、A、C、GおよびU(ウリジン)を含む。
当業者であれば、本明細書に開示されるコドンマップ中のT塩基はDNA中に存在するが、T塩基は対応するRNA中ではU塩基によって置き換えられることを理解できる。例えば、DNA形態、例えば、ベクターまたはin vitro翻訳(IVT)鋳型中の本明細書に開示されるコドンヌクレオチド配列は、対応する転写されるmRNA中ではU塩基として転写されるそのT塩基を有するであろう。これに関して、コドン最適化されたDNA配列(Tを含む)と、その対応するmRNA配列(Uを含む)は両方とも、本開示のコドン最適化されたヌクレオチド配列と考えられる。当業者であれば、1つまたは複数の塩基を非天然塩基で置き換えることにより、同等のコドンマップを作成することができることも理解できる。したがって、例えば、TTCコドン(DNAマップ)は、UUCコドン(RNAマップ)に対応し、順に、ΨΨCコドン(Uがシュードウリジンで置き換えられたRNAマップ)に対応する。
標準的なA-TおよびG-C塩基対は、チミジンのN3-HおよびC4-オキシと、アデノシンの、それぞれ、N1およびC6-NH2との間ならびにシチジンのC2-オキシ、N3およびC4-NH2と、グアノシンの、それぞれ、C2-NH2、N’-HおよびC6-オキシとの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。したがって、例えば、グアノシン(2-アミノ-6-オキシ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)を修飾して、イソグアノシン(2-オキシ-6-アミノ-9-β-D-リボフラノシル-プリン)を形成させることができる。そのような修飾は、最早シトシンと標準的な塩基対を効率的に形成しないヌクレオシド塩基をもたらす。しかしながら、イソシトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-アミノ-4-オキシ-ピリミジン)を形成するシトシン(1-β-D-リボフラノシル-2-オキシ-4-アミノ-ピリミジン)の修飾は、グアノシンと効率的に塩基対形成しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成する修飾されたヌクレオチドをもたらす(Collinsらの米国特許第5,681,702号)。イソシトシンは、Sigma Chemical Co.(St.Louis、Mo.)から入手可能である;イソシチジンは、Switzerら(1993年)Biochemistry
32巻:10489~10496頁およびそこに引用された参考文献によって記載された方法により調製することができ、2’-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Torら、1993年、J.Am.Chem.Soc.115巻:4461~4467頁およびそこに引用された参考文献の方法により調製することができ、ならびにイソグアニンヌクレオチドは、Switzerら、1993年、上掲およびMantschら、1993年、Biochem. 14巻:5593~5601号により記載された方法を使用して、またはCollinsらの米国特許第5,780,610号に記載の方法により調製することができる。2,6-ジアミノピリミジンおよびその相補体(1-メチルピラゾロ-[4,3]ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン)の合成のために、他の非天然塩基対を、Piccirilliら、1990年、Nature 343巻:33~37頁に記載の方法により合成することができる。Leachら(1992年)J.Am.Chem.Soc.114巻:3675~3683頁およびSwitzerら、上掲に記載のものなどの、ユニークな塩基対を形成する他のそのような修飾されたヌクレオチド単位は公知である。
32巻:10489~10496頁およびそこに引用された参考文献によって記載された方法により調製することができ、2’-デオキシ-5-メチル-イソシチジンは、Torら、1993年、J.Am.Chem.Soc.115巻:4461~4467頁およびそこに引用された参考文献の方法により調製することができ、ならびにイソグアニンヌクレオチドは、Switzerら、1993年、上掲およびMantschら、1993年、Biochem. 14巻:5593~5601号により記載された方法を使用して、またはCollinsらの米国特許第5,780,610号に記載の方法により調製することができる。2,6-ジアミノピリミジンおよびその相補体(1-メチルピラゾロ-[4,3]ピリミジン-5,7-(4H,6H)-ジオン)の合成のために、他の非天然塩基対を、Piccirilliら、1990年、Nature 343巻:33~37頁に記載の方法により合成することができる。Leachら(1992年)J.Am.Chem.Soc.114巻:3675~3683頁およびSwitzerら、上掲に記載のものなどの、ユニークな塩基対を形成する他のそのような修飾されたヌクレオチド単位は公知である。
ポリペプチド:用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。この用語はまた、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また、例えば、アミノ酸の1つまたは複数の類似体(例えば、ホモシステイン、オルニチン、p-アセチルフェニルアラニン、D-アミノ酸、およびクレアチンなどの非天然アミノ酸を含む)、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも定義に含まれる。
本明細書で使用される場合、用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。ポリペプチドは、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルトログ、パラログ、断片ならびに前記の他の等価物、バリアント、および類似体を含む。ポリペプチドは、モノマーであってもよく、またはダイマー、トリマーもしくはテトラマーなどの多分子複合体であってもよい。それらはまた、単鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよい。最も一般的には、ジスルフィド連結が多鎖ポリペプチド中に見出される。ポリペプチドという用語はまた、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。一部の実施形態では、「ペプチド」は、50アミノ酸長未満であるか、またはそれと等しい、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長であってもよい。
ポリペプチドバリアント:本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドバリアント」とは、天然または参照配列とはそのアミノ酸配列において異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および/または挿入を有してもよい。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約50%の同一性、少なくとも約60%の同一性、少なくとも約70%の同一性、少なくとも約80%の同一性、少なくとも約90%の同一性、少なくとも約95%の同一性、少なくとも約99%の同一性を有するであろう。一部の実施形態では、それらは、天然または参照配列と少なくとも約80%、または少なくとも約90%同一であろう。
単位薬物あたりのポリペプチド(PUD):本明細書で使用される場合、PUDまたは単位薬物あたりの生成物は、体液中での測定値で除算した、通常はpmol/mL、mmol/mLなどの濃度で定義される、体液または組織中で測定される生成物(ポリペプチドなど)の総日用量、通常、1mg、pg、kgなどの細分された部分と定義される。
予防すること:本明細書で使用される場合、用語「予防すること」とは、感染、疾患、障害および/もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つもしくは複数の症状、特徴、もしくは臨床兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つもしくは複数の症状、特徴、もしくは兆候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;感染、特定の疾患、障害および/もしくは状態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること;ならびに/または感染、疾患、障害、および/もしくは状態と関連する病状を発症するリスクを低下させることを指す。
プロドラッグ:本開示はまた、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用される場合、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化の際に治療薬として作用する物質、分子または実体に関する述語の形式にある任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、いくつかの方法で共有結合または隔離されていてもよく、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後に活性薬物部分を放出する、またはそれに変換される。日常的な操作またはin vivoで、修飾物が親化合物に切断されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することによって、プロドラッグを調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、哺乳動物対象に投与された時、開裂して、それぞれ、遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する任意の基に結合された化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、T. HiguchiおよびV. Stella、「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」、A.C.S. Symposium Seriesの第14巻、ならびにBioreversible Carriers in Drug Design、Edward B. Roche(編)、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、1987年において考察されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
増殖する:本明細書で使用される場合、用語「増殖する」とは、成長する、拡張する、もしくは増大する、または急速な成長、拡張もしくは増大を引き起こすことを意味する。「増殖性」とは、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」とは、増殖特性に対抗する、または増殖特性にとって不適切な特性を有することを意味する。
予防薬:本明細書で使用される場合、「予防薬」とは、疾患の拡散を予防するために使用される治療薬または作用の経過を指す。
予防:本明細書で使用される場合、「予防」とは、健康を維持し、疾患の拡散を予防するために取られる手段を指す。「免疫予防」とは、疾患の拡散を予防するための能動または受動免疫を生成するための手段を指す。
タンパク質切断部位:本明細書で使用される場合、「タンパク質切断部位」とは、アミノ酸鎖の調節された切断を、化学的、酵素的または光化学的手段によって達成することができる部位を指す。
タンパク質切断シグナル:本明細書で使用される場合、「タンパク質切断シグナル」とは、切断のためにポリペプチドに合図する、または印を付ける少なくとも1つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質:本明細書で使用される場合、用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」は、本明細書で提供されるものならびにその断片、変異体、バリアント、および変形を含む。
近位:本明細書で使用される場合、用語「近位」とは、中心または目的の地点もしくは領域により近い位置にあることを意味する。
シュードウリジン:本明細書で使用される場合、シュードウリジン(ψ)とは、ウリジンヌクレオシドのC-グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾体、バリアント、アイソフォームまたは誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体としては、限定されるものではないが、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-シュードウリジン、1-メチルシュードウリジン(m1ψ)、1-メチル-4-チオ-シュードウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、3-メチル-シュードウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、および2’-O-メチル-シュードウリジン(ψm)が挙げられる。
精製された:本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製された」、「精製」は、望ましくない成分、材料汚染、混合物または不完全性から実質的に純粋にする、または清澄化することを意味する。
参照核酸配列:用語「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」とは、配列最適化することができる出発核酸配列(例えば、RNA、例えば、mRNA配列)を指す。一部の実施形態では、参照核酸配列は、野生型核酸配列、その断片またはバリアントである。一部の実施形態では、参照核酸配列は、予め配列最適化された核酸配列である。
反復トランスフェクション:本明細書で使用される場合、用語「反復トランスフェクション」とは、あるポリヌクレオチドによる同じ細胞培養物の複数回のトランスフェクションを指す。細胞培養物を、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回、少なくとも14回、少なくとも15回、少なくとも16回、少なくとも17回、少なくとも18回、少なくとも19回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回、少なくとも40回、少なくとも45回、少なくとも50回またはそれよりも多くトランスフェクトすることができる。
塩:一部の態様では、本明細書に開示される腫瘍内送達のための医薬組成物は、その脂質構成成分の一部の塩を含む。用語「塩」は、任意のアニオン性およびカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定例としては、無機および有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸塩(例えば、ヘミオキサレート)、リン酸塩、ホスホン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酸化物、カルボン酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、亜硫酸水素塩、硫化物、亜硫酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、アクリル酸塩、ポリアクリル酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、イタコン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、チグリン酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、ポリメタクリル酸塩、過塩素酸塩、塩素酸塩、亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩、臭素酸塩、次亜臭素酸塩、ヨウ素酸塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、ヒ酸塩、亜ヒ酸塩、クロム酸塩、重クロム酸塩、シアン化物、シアン酸塩、チオシアン酸塩、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸塩、およびその混合物が挙げられる。
試料:本明細書で使用される場合、用語「試料」または「生物試料」とは、その組織、細胞、または構成部分のサブセット(例えば、限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯血、尿、膣液および精液などの体液)を指す。試料は、全生物または限定されるものではないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、および尿生殖路の外部切片、涙、唾液、ミルク、血液細胞、腫瘍、器官などの、その組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはその画分もしくは一部から調製されたホモジネート、溶解物または抽出物をさらに含んでもよい。試料はさらに、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含有してもよい、栄養培地またはゲルなどの媒体を指す。
シグナル配列:本明細書で使用される語句「シグナル配列」、「シグナルペプチド」および「移行ペプチド」は、互換的に使用され、タンパク質の、ある特定の細胞小器官、細胞区画への輸送もしくは局在化、または細胞外輸送を指令することができる配列を指す。この用語は、シグナル配列ポリペプチドと、シグナル配列をコードする核酸配列との両方を包含する。したがって、核酸の文脈におけるシグナル配列に対する参照は、実際には、シグナル配列ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路:「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用される語句「細胞表面受容体」は、例えば、シグナルを受信し、細胞の形質膜を横断するそのようなシグナルの伝達を行うことができる分子および分子の複合体を含む。
類似性:本明細書で使用される場合、用語「類似性」とは、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子および/もしくはRNA分子)間ならびに/またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの算出を、類似性パーセントの算出が当技術分野で理解されるように保存的置換を考慮に入れることを除いて、同一性パーセントの算出と同じ様式で実行することができる。
単回単位用量:本明細書で使用される場合、「単回単位用量」は、1用量/1回/単一経路/単一接触点、すなわち、1回の投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
分割用量:本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単回単位用量または総日用量の、2つまたはそれよりも多い用量への分割である。
特異的送達:本明細書で使用される場合、用語「特異的送達」、「特異的に送達する」または「特異的に送達すること」は、標的外組織(例えば、哺乳動物脾臓)と比較して、目的の標的組織(例えば、哺乳動物肝臓)へのナノ粒子によるポリヌクレオチドのより多い(例えば、少なくとも1.5倍多い、少なくとも2倍多い、少なくとも3倍多い、少なくとも4倍多い、少なくとも5倍多い、少なくとも6倍多い、少なくとも7倍多い、少なくとも8倍多い、少なくとも9倍多い、少なくとも10倍多い)送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルを、組織中で生成されるタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中のポリヌクレオチドの量を前記組織の重量と比較すること、組織中で生成されるタンパク質の量を前記組織中の総タンパク質の量と比較すること、または組織中のポリヌクレオチドの量を前記組織中の総ポリヌクレオチドの量と比較することにより測定することができる。例えば、腎血管標的については、組織1gあたり1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、または20倍多くのポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して、腎臓に送達される場合、ポリヌクレオチドは、肝臓および脾臓と比較して哺乳動物腎臓に特異的に提供される。標的組織に特異的に送達するナノ粒子の能力は、処置される対象において決定する必要はなく、それを動物モデル(例えば、ラットモデル)などの代用物において決定してもよいことが理解されるであろう。
安定:本明細書で使用される場合、「安定」とは、反応混合物から有用な純度までの単離を生き残るのに十分に強固であり、一部の事例では、有効な治療剤への製剤化を可能にする化合物を指す。
安定化された:本明細書で使用される場合、用語「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」は、安定にすること、または安定になることを意味する。
立体異性体:本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」とは、化合物が有し得る全ての可能な異なる異性体ならびにコンフォメーション形態(例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物)、特に、基本分子構造の全ての可能な立体化学的およびコンフォメーション的異性体、全てのジアステレオマー、鏡像異性体および/または配座異性体を指す。本開示の一部の化合物は、異なる互変異性形態で存在してもよく、後者は全て、本開示の範囲内に含まれる。
対象:「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または療法が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などの家庭用動物、農業用動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物;類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類;イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物;ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物;ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物;クマ、乳牛、ブタ、およびヒツジなどの食用動物;シカおよびキリンなどの有蹄動物;マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類などが挙げられる。ある特定の実施形態では、哺乳動物は、ヒト対象である。他の実施形態では、対象はヒト患者である。特定の実施形態では、対象は処置を必要とするヒト患者である。
実質的に:本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全部の、または全部に近い範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物分野における通常の知識を有する者であれば、生物学的および化学的特徴は稀に、あるとすれば、完了に向かう、および/または完全性に進行するか、または絶対的な結果を達成する、もしくは回避することを理解するであろう。用語「実質的に」は、したがって、多くの生物学的および化学的特徴において固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
実質的に等しい:本明細書で使用される場合、それが用量間の倍数差に関する場合、この用語は、プラス/マイナス2%を意味する。
実質的に同時:本明細書で使用される場合、また、それが複数の用量に関する場合、この用語は、2秒以内を意味する。
罹患している:疾患、障害、および/または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、および/または状態と診断されたか、またはその1つもしくは複数の症状を示す。
罹りやすい:疾患、障害、および/または状態に「罹りやすい」個体は、疾患、障害、および/または状態と診断されていない、および/またはその症状を呈していなくてもよいが、疾患またはその症状を発症する傾向を持つ。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態(例えば、がん)に罹りやすい個体を、以下の1つまたは複数:(1)疾患、障害、および/または状態の発生と関連する遺伝子変異;(2)疾患、障害、および/または状態の発生と関連する遺伝子多型;(3)疾患、障害、および/または状態と関連するタンパク質および/または核酸の発現および/または活性の増大および/または減少;(4)疾患、障害、および/または状態の発生と関連する習慣および/または生活様式;(5)疾患、障害、および/または状態の家族歴;ならびに(6)疾患、障害、および/または状態の発生と関連する微生物への曝露および/または微生物による感染によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害、および/または状態を発症するであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態に罹りやすい個体は、疾患、障害、および/または状態を発症しないであろう。
持続放出:本明細書で使用される場合、用語「持続放出」とは、特定の期間にわたってある放出速度に従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成:用語「合成」とは、人の手によって生成、調製、および/または製造されることを意味する。本開示のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
標的細胞:本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、目的の任意の1つまたは複数の細胞を指す。この細胞を、in vitro、in vivo、in situ、または生物の組織もしくは器官中に見出すことができる。生物は、動物、例えば、哺乳動物、ヒト、対象または患者であってもよい。
標的組織:本明細書で使用される場合、「標的組織」とは、ポリヌクレオチドの送達が所望の生物学的および/または薬理学的効果をもたらす目的の任意の1つまたは複数の組織型を指す。目的の標的組織の例としては、特定の組織、器官、およびその系または群が挙げられる。特定の用途では、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管中の血管内皮(例えば、冠状動脈内もしくは大腿骨内)、または腫瘍組織(例えば、腫瘍内注射による)であってもよい。「標的外組織」とは、コードされたタンパク質の発現が、所望の生物学的および/または薬理学的効果をもたらさない任意の1つまたは複数の組織型を指す。特定の用途では、標的外組織は、肝臓および脾臓を含んでもよい。
標的外組織における治療剤の存在は、(i)拡散による、もしくは血流を介する、末梢組織もしくは遠位標的外組織(例えば、肝臓)への投与部位からのポリヌクレオチドの漏出(例えば、ある特定の組織においてポリペプチドを発現するように意図されたポリヌクレオチドは肝臓に到達し、そのポリペプチドは肝臓中で発現されるであろう);または(ii)拡散による、もしくは血流を介する、末梢組織もしくは遠位標的外組織(例えば、肝臓)へのそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後のポリペプチドの漏出(例えば、ポリヌクレオチドは標的組織においてポリペプチドを発現し、ポリペプチドは末梢組織に拡散するであろう)の結果であり得る。
標的化配列:本明細書で使用される語句「標的化配列」とは、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在化を指令することができる配列を指す。
末端:本明細書で使用される場合、用語「複数の末端」または「末端」は、ポリペプチドを指す場合、ペプチドまたはポリペプチドの先端を指す。そのような先端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位に限定されないだけでなく、末端領域中のさらなるアミノ酸を含んでもよい。本開示のポリペプチドに基づく分子を、N末端(遊離アミノ基(NH2)を有するアミノ酸で終結する)と、C末端(遊離カルボキシル基(COOH)を有するアミノ酸で終結する)との両方を有するものと特徴付けることができる。本開示のタンパク質は、一部の事例では、ジスルフィド結合または非共有力によって一緒になった複数のポリペプチド鎖(マルチマー、オリゴマー)から構成される。これらの種類のタンパク質は、複数のNおよびC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端を、それらが、場合によっては、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドに基づく部分から始まる、またはそれで終わるように修飾することができる。
治療剤:用語「治療剤」とは、対象に投与された場合、治療、診断、および/もしくは予防効果を有する、ならびに/または所望の生物学的および/もしくは薬理学的効果を惹起する薬剤を指す。例えば、一部の実施形態では、IL12Bポリペプチド、IL12Aポリペプチド、またはIL12BとIL12Aポリペプチドの両方をコードするmRNAは、治療剤であり得る。
治療有効量:本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、および/または状態に罹患している、または罹りやすい対象に投与した場合、感染、疾患、障害、および/または状態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、および/またはその発症を遅延させるのに十分なものである、送達される薬剤(例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など)の量を意味する。
治療有効転帰:本明細書で使用される場合、用語「治療有効転帰」は、感染、疾患、障害、および/または状態に罹患している、または罹りやすい対象において、感染、疾患、障害、および/または状態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、および/またはその発症を遅延させるのに十分なものである転帰を意味する。
総日用量:本明細書で使用される場合、「総日用量」は、24時間以内に与えられる、または処方される量である。総日用量を、単回単位用量または分割用量として投与することができる。
転写因子:本明細書で使用される場合、用語「転写因子」とは、例えば、転写の活性化または抑制により、DNAのRNAへの転写を制御するDNA結合タンパク質を指す。一部の転写因子は転写のみの制御を行うが、他のものは他のタンパク質と協調して作用する。一部の転写因子は、ある特定の条件下で転写を活性化することと、抑制することの両方を行うことができる。一般に、転写因子は、特定の標的配列または標的遺伝子の制御領域中の特定のコンセンサス配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子のみ、または他の分子との複合体を形成する標的遺伝子の転写を制御してもよい。
転写:本明細書で使用される場合、用語「転写」とは、外因性核酸を細胞中に導入するための方法を指す。トランスフェクションの方法としては、限定されるものではないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が挙げられる。
トランスフェクション:本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」とは、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが発現される(例えば、mRNA)、またはポリペプチドが細胞機能をモジュレートする(例えば、siRNA、miRNA)細胞中へのポリヌクレオチドの導入を指す。本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳および/またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
処置すること、処置、療法:本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」または「療法」とは、疾患、例えば、急性間欠性ポルフィリン症の1つまたは複数の症状または特徴を部分的または完全に軽減する、改善する、向上させる、緩和する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低下させる、および/またはその発生を低減させることを指す。例えば、急性間欠性ポルフィリン症を「処置すること」は、疾患と関連する症状を軽減すること、患者の生存期間を延長すること(生存率を増大させること)、疾患の重症度を低下させること、疾患の発症を予防すること、または遅延させることなどを指す。疾患、障害、および/または状態と関連する病状を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害、および/もしくは状態の徴候を呈しない対象、ならびに/または疾患、障害、および/もしくは状態の初期徴候のみを呈する対象に、処置を投与することができる。
非修飾:本明細書で使用される場合、「非修飾」とは、いくつかの方法で変化される前の任意の物質、化合物または分子を指す。非修飾は、常にではないが、野生型または天然形態の生体分子を指してもよい。分子は、一連の修飾を受けてもよく、それにより、それぞれの修飾される分子は、その後の修飾のための「非修飾」出発分子として働くことができる。
ウラシル:ウラシルは、RNAの核酸中の4つの核酸塩基のうちの1つであり、文字Uで表される。ウラシルを、β-N1-グリコシド結合によりリボース環、またはより具体的には、リボフラノースに結合させて、ウリジンヌクレオシドを得ることができる。ウリジンヌクレオシドはまた、一般的には、その核酸塩基の1文字コードに従って、すなわち、Uと略される。したがって、本開示の文脈では、ポリヌクレオチド配列中のモノマーがUである場合、そのようなUは、「ウラシル」または「ウリジン」と互換的に指定される。
ウリジン含量:用語「ウリジン含量」または「ウラシル含量」は、互換的であり、ある特定の核酸配列中に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量を、絶対値(配列中のウリジンもしくはウラシルの総数)または相対値(核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンもしくはウラシルの百分率)として表すことができる。
ウリジン修飾配列:用語「ウリジン修飾配列」とは、候補核酸配列のウリジン含量および/またはウリジンパターンに関して、異なる全体的もしくは部分的ウリジン含量(より高いか、もしくはより低いウリジン含量)を有するか、または異なるウリジンパターン(例えば、勾配分布もしくはクラスタリング)を有する配列最適化された核酸(例えば、合成mRNA配列)を指す。本開示の文脈では、用語「ウリジン修飾配列」および「ウラシル修飾配列」は、等価であり、互換的であると考えられる。
「高ウリジンコドン」は、2つまたは3つのウリジンを含むコドンと定義され、「低ウリジンコドン」は1つのウリジンを含むコドンと定義され、「無ウリジンコドン」は、ウリジンを含まないコドンである。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンによる置換、高ウリジンコドンの無ウリジンコドンによる置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンによる置換、低ウリジンコドンの無ウリジンコドンによる置換、無ウリジンコドンの低ウリジンコドンによる置換、無ウリジンコドンの高ウリジンコドンによる置換、およびその組合せを含む。一部の実施形態では、高ウリジンコドンを、別の高ウリジンコドンで置き換えることができる。一部の実施形態では、低ウリジンコドンを、別の低ウリジンコドンで置き換えることができる。一部の実施形態では、無ウリジンコドンを、別の無ウリジンコドンで置き換えることができる。ウリジン修飾配列を、ウリジン富化またはウリジン希薄化することができる。
ウリジン富化:本明細書で使用される場合、用語「ウリジン富化」およびその文法的バリアントは、対応する候補核酸配列のウリジン含量に関して、配列最適化された核酸(例えば、合成mRNA配列)中のウリジン含量(絶対値または百分率値として表される)の増大を指す。ウリジン富化を、候補核酸配列中のコドンを、低ウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン富化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対して)または部分的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して)であってもよい。
ウリジン希薄化:本明細書で使用される場合、用語「ウリジン希薄化」およびその文法的バリアントは、対応する候補核酸配列のウリジン含量に関して、配列最適化された核酸(例えば、合成mRNA配列)中のウリジン含量(絶対値または百分率値として表される)の減少を指す。ウリジン希薄化を、候補核酸配列中のコドンを、低ウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施することができる。ウリジン希薄化は、全体的(すなわち、候補核酸配列の全長に対して)または部分的(すなわち、候補核酸配列の部分配列もしくは領域に対して)であってもよい。
バリアント:本開示で使用されるバリアントという用語は、天然または出発配列(例えば、野生型配列)中の少なくとも1のアミノ酸残基が除去され、同じ位置のその場所に異なるアミノ酸が挿入された天然バリアント(例えば、多型、アイソフォームなど)と、人工バリアントの両方を指す。これらのバリアントを、「置換バリアント」と記載することができる。置換は、分子中のただ1のアミノ酸が置換されている場合、単一であってもよく、または2つもしくはそれよりも多いアミノ酸が同じ分子中で置換されている場合、それらは複数であってもよい。アミノ酸が挿入または欠失される場合、得られるバリアントは、それぞれ、「挿入バリアント」または「欠失バリアント」である。
用語「発明」および「開示」は、例えば、語句「本発明」または「本開示」を記載するか、またはそれにおいて使用される場合、互換的に使用することができる。
30.等価物および範囲
30.等価物および範囲
当業者であれば、日常的な実験を超えないものを使用して、本明細書に記載の本開示による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
特許請求の範囲では、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、それとは反対に指摘されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、1つまたは1つより多いことを意味してもよい。群の1つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、1つの、1つより多い、または全部の群のメンバーが、それとは反対に指摘されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で用いられる、またはさもなければそれと関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、群の正確に1つのメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で用いられる、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。本開示は、1つより多い、または全部の群のメンバーが、所与の生成物またはプロセス中に存在する、その中で使用される、またはさもなければそれと関連する実施形態を含む。
また、用語「含む(comprising)」は、オープンであり、許可であることが意図されるが、追加の要素またはステップの含有を必要としないことにも注意する。用語「含む(comprising)」が本明細書で使用される場合、したがって、用語「からなる(consisting of)」も包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、終点が含まれる。さらに、別途指摘しない限り、または別途文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本文が別途明確に記述しない限り、その範囲の下限の単位の10分の1までの、本開示の異なる実施形態における記述される範囲内の任意の特定の値または部分範囲とみなすことができることが理解されるべきである。
さらに、先行技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施形態は、任意の1つまたは複数の特許請求の範囲から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者には公知であるとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合であっても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態(例えば、任意の核酸またはそれによりコードされるタンパク質;任意の製造方法;任意の使用方法など)は、先行技術の存在と関連するにしても、しないにしても、任意の理由から、任意の1つまたは複数の特許請求の範囲から除外され得る。
全ての引用された供給源、例えば、本明細書で引用される参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、および技術は、引用中に明示的に記述されていない場合であっても、参照により本出願に組み込まれる。引用された供給源と本出願の記述が矛盾する場合、本出願における記述が優先するものとする。
小節および表の見出しは限定を意図するものではない。本開示は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を制限しない、以下の実施例でさらに説明される。
(実施例1)
結腸腺癌(MC38)同系モデルにおけるIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性(静脈内投与)
M38腺癌腫瘍を担持するマウスにおける単回静脈内(IV)用量として投与された、IL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性を評価した。
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
結腸腺癌(MC38)同系モデルにおけるIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性(静脈内投与)
M38腺癌腫瘍を担持するマウスにおける単回静脈内(IV)用量として投与された、IL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性を評価した。
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
野生型マウスIL12ポリペプチド(マウスIL12)およびその3’UTR中のmiRNA結合部位(miR-122)をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(mRNA)を調製した(mIL12_miR122)(以下に記載される配列)。
miR-122結合エレメントを、肝臓からのタンパク質産生を減少させるために組み込んだ。陰性対照mRNA(非翻訳可能型のmRNA)、例えば、NST-FIXも調製した。mRNAを、N1-メチルシュードウリジンで完全に修飾した。両方の修飾されたmRNAを、MC3脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。
B.MC-38結腸腺癌マウスモデル
B.MC-38結腸腺癌マウスモデル
MC-38結腸腺癌腫瘍を、Rosenbergら、Science 233巻:1318~1321頁(1986年)に記載のようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
腫瘍埋込みの11日後、2群の動物に、単回静脈内用量のLNP製剤化IL12修飾されたmRNAを(0.1mg/kg(第4群)または0.05mg/kg(第5群)の用量で)投与した。2群の対照動物を、等価用量の陰性対照mRNA(NST-FIX LNP)(第7群および第8群)、PBS(第1群)、または組換えマウスIL12タンパク質、1μg(第2群)で処置した。
手動のカリパスを使用して、腫瘍体積を測定した。24日目までの平均腫瘍体積(図5)を、立方ミリメートル(mm3)で記録した。
C.結果
C.結果
マウスIL12 mRNAの静脈内投与は、用量依存的な血漿IL12(図2A)およびIFNγ(図2B)レベルならびにIL12およびIFNγ AUC(表8)の増大をもたらし、それぞれ、腹腔内注射による同等量の組換えIL12タンパク質の投与後のこれらのレベルよりも高かった(図2A~2B)。
図3は、第1群(PBS)、第2群(IL12タンパク質)、第7群および第8群(対照NST-FIX、それぞれ、0.1mg/kgおよび0.05mg/kg)と比較した、0.1mg/kg(第4群)および0.05mg/kg(第5群)の用量(逆三角形を有する線で示される)での、脂質ナノ粒子(LNP)中のマウスIL12 mRNAの単回静脈内(IV)用量のロバストな有効性を示す。
図4A~図4Fは、0.1mg/kg(第4群)(図4F)および0.05mg/kg(第5群)(図4E)の用量の脂質ナノ粒子(LNP)中のマウスIL12 mRNA、PBS(第1群)(図4A)、IL12タンパク質(第2群)(図4D)、0.1mg/kgおよび0.05mg/kg(それぞれ、第7群および第8群)の対照NST-FIX(それぞれ、図4Cおよび図4B)の単回静脈内(IV)用量の投与後に見られる平均腫瘍体積および完全奏功(CR)の数を示す。完全奏功(CR)は、図4Eおよび図4Fにのみ示される。図4Eは、6/8のCR(すなわち、75%のCR)が第5群(0.05mg/kgの用量の、脂質ナノ粒子(LNP)中のIL12 mRNA)において見られたことを示す。図4Fは、5/9のCR(すなわち、56%のCR)が、第4群(0.1mg/kgの用量の脂質ナノ粒子(LNP)中のIL12 mRNA)において見られたことを示す。IL12 mRNA群とは別に、他の群ではCRは観察されなかった。
図5は、0.05mg/kgの用量(第5群)および0.1mg/kgの用量(第4群)の脂質ナノ粒子(LNP)中のマウスIL12 mRNAの単回静脈内(IV)用量に由来する腫瘍埋込み後47日目での生存利益を示す。
注目すべきことに、図3~5は、単回IV用量を用いた場合の、薬物動態(PK)、薬力学(PD)、および治療有効性の改善に関する、タンパク質を超える静脈内マウスIL12 mRNAを投与する利点を実証する。
表9は、全身(静脈内)投与を超えるIL12 mRNAの局所(腫瘍内)投与の忍容性の利点を示す。IL12 mRNAを腫瘍内に投与された10匹のマウスのうちの9匹が、IL12 mRNAを静脈内投与された12匹のマウスのうちの3匹と比較して、20日目に生存していた。
(実施例2)
結腸腺癌(MC38)モデルにおけるマウスIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性(腫瘍内投与)
(実施例2)
結腸腺癌(MC38)モデルにおけるマウスIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性(腫瘍内投与)
M38腺癌腫瘍を担持するマウスに腫瘍内投与された、マウスIL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性を評価した。
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
実施例1に記載のmIL12_miR122ポリヌクレオチドを調製した。陰性対照mRNA、NST-FIX mRNAも調製した。両方の修飾されたmRNAを、実施例1に記載のMC3脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。
B.MC-38結腸腺癌マウスモデル
B.MC-38結腸腺癌マウスモデル
MC-38結腸腺癌を、Rosenbergら、Science 233巻:1318~1321頁(1986年)に記載のようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
腫瘍埋込みの11日後、動物に、単回腫瘍内用量のMC3 LNP製剤化マウスIL12修飾されたmRNA(用量あたり4μgのmRNA)を投与した。2群の対照動物を、陰性対照mRNA(NST-FIX LNP)またはPBSの等価用量およびレジメンで処置した。
手動のカリパスを使用して、図6B中の示された時点で腫瘍体積を測定した。24日目までの平均腫瘍体積(図6A)および47日目までの個々の腫瘍体積(図6B)を、立方ミリメートル(mm3)で記録した。試験における終点は、動物の死または1500mm3に達する腫瘍体積であった。
C.結果
C.結果
図6Aは、MC3 LNP製剤化マウスIL12修飾されたmRNAを投与した場合、平均腫瘍体積が減少したことを示す。対照的に、マウスへの対照の修飾されたmRNA(NST-FIX)またはPBSの投与は、24日目まで評価した場合、平均腫瘍体積の減少に対する効果が小さかった。
図6Bは、動物1匹あたり約4μgのMC3 LNP製剤化マウスIL12修飾されたmRNAのマウスへの投与が、対照の修飾されたmRNA(NST-FIX)またはPBSを投与した動物と比較して、一部の動物において個々の腫瘍体積を減少させたことを示す。完全奏功(CR)は、潰瘍のために3匹の動物を除去したが、7匹の動物のうちの3匹(44%)において見られた。これらのデータは、mIL12_miR122ポリヌクレオチドが、in vivoで腫瘍内投与した場合、抗腫瘍有効性を有することを示す。
(実施例3)
B細胞リンパ腫(A20)同系モデルにおけるIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性
(実施例3)
B細胞リンパ腫(A20)同系モデルにおけるIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性
A20 B細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスに腫瘍内投与された、マウスIL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性を評価した。
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
A.IL12修飾されたmRNAおよび対照の調製
miRNA結合部位を含まない(miRless)IL12ポリペプチド(マウスIL12)をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(IL12 miRless)を調製した(以下に記載される配列)。
実施例1に記載のようなmIL12_miR122ポリヌクレオチドを調製した。陰性対照mRNA(NST)も調製した(非翻訳可能型の同じmRNA)(NST IL12_miRless)。全ての修飾されたmRNAを、実施例1に記載されたMC3脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。
B.A20 B細胞リンパ腫腫瘍モデル
B.A20 B細胞リンパ腫腫瘍モデル
A20細胞株を使用するB細胞リンパ腫のマウスモデルは、腫瘍を分析するのに有用である(全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kimら、Journal of Immunology 122巻:549~554頁(1979年);Donnouら、Advances in Hematology 2012:701704頁(2012年))。A20細胞は、BALB/cマウスに由来するB細胞リンパ腫から導出され、典型的には、皮下埋込み体として同系マウス中で増殖する。500,000個のA20細胞を、BALB/cマウスに皮下的に埋め込んで、皮下腫瘍を生成した。腫瘍を、サイズおよび触診可能性についてモニタリングした。
一度、腫瘍が100mm3の平均サイズに達したら、マウスを3群にコホート化した。1つの試験群には、動物1匹あたり5μgのmRNAの用量で、MC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中のmIL12_miRlessを腫瘍内投与した。第2の試験群には、動物1匹あたり5μgのmRNAの用量でMC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中のmIL12_miR122を腫瘍内投与した。対照群には、等価用量の非翻訳対照mRNA(NST)を投与した。動物に、埋込み後10日目まで投与した。結果を、図7A~7Cに示す。
この試験を、埋込み後50日目まで実行した。試験における終点は、動物の死または予め決めておいた2000mm3の腫瘍体積の終点であった。
C.結果
C.結果
図7Aは、5μgの対照NST mRNAで処置した全部で12匹の動物において、腫瘍体積(mm3で測定)が時間と共に増大したことを示す。図7Bは、対照mRNA(NST)を投与された動物と比較して、mIL12_miRlessで処置された一部の動物において、腫瘍体積が時間と共に減少したことを示す。完全奏功(CR)は、12匹の動物のうちの5匹(42%)において見られた。したがって、マウスIL12 mRNAの腫瘍内投与は、A20腫瘍モデルにおいて有効である。
図7Cは、5μgのmIL12-miR122で処置された動物における腫瘍体積の変化を示す(図7C)。完全奏功(CR)は、IL12_miR122群の12匹のマウスのうちの6匹において達成された(図7C)。
図7A~7C中のデータは、mIL12_miRlessおよびmIL12_miR122ポリヌクレオチドが、in vivoで腫瘍内投与した場合、同等の抗腫瘍有効性を有することを示す。
(実施例4)
修飾されたIL12 mRNAの単回および複数回用量のin vivoでの抗腫瘍有効性
(実施例4)
修飾されたIL12 mRNAの単回および複数回用量のin vivoでの抗腫瘍有効性
単回0.5μg用量および複数回用量(0.5μgを7日間で6回)として投与された、修飾されたマウスIL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性を、A20 B細胞リンパ腫腫瘍を担持するBALB/Cマウスにおいて試験した。
A.修飾されたIL12 mRNA
A.修飾されたIL12 mRNA
それぞれ、実施例1および実施例3に記載された、mIL12_miR122ポリヌクレオチドおよびmIL12_miRlessポリヌクレオチドを調製した。一方の群のmIL12_miR122 mRNAを、実施例1に記載のようにMC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。別の群のmIL12_miR122 mRNAを、化合物18に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。
B.投薬
B.投薬
埋込み後10日目に、A20腫瘍を担持する2群のマウス(各群においてn=12)に、MC3に基づくLNP中のIL12 miRlessまたはIL12 miR122-mRNAの形態の単回0.5μg用量のマウスIL12 mRNAを投与した。
また、埋込み後10日目に、A20腫瘍を担持する別の群のマウスに、MC3に基づくLNP中の0.5μgの週用量のIL12 miR122 mRNAを、7日間で6回、腫瘍内投与した。
また、埋込み後10日目に、A20腫瘍を担持する別の群のマウスに、化合物18に基づくLNP中の0.5μgの週用量のIL12 miR122 mRNAを、7日間で6回、腫瘍内投与した。
最後に、埋込みの10日後に、A20腫瘍を担持する別の群のマウス(1群あたりn=12)に、MC3に基づくLNPまたは化合物18に基づくLNP中の0.5μgの週用量の非翻訳陰性対照mRNA(NST)を、7日間で6回、投与した。
C.結果
C.結果
図8A~8Bに示されるように、B細胞リンパ腫腫瘍モデル(A20)におけるin vivoでの抗腫瘍有効性は、A20腫瘍を担持するマウスに、MC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中の0.5μgの単回用量のマウスIL12 mRNAを投与した後に達成された。図8Aは、IL12 miRless(0.5μg)を投与した一部のマウスにおける腫瘍体積の減少および4匹の完全奏功(CR)が達成されたことを示す。図8Bは、IL12 miR122(0.5μg)を投与した一部のマウスにおける腫瘍体積の減少および3匹の完全奏功(CR)が達成されたことを示す。
図8Cに示されるように、in vivoでの抗腫瘍有効性は、単回投与と比較して、MC3に基づくLNP中のIL12 miR122 mRNAの毎週の投薬レジメン(0.5μgのmRNA、7日間で6回)について増強された(図8Bを参照されたい)。図8Cは、0.5μgの週用量のIL12 miR122 mRNAを7日間で6回投与された12匹のA20担持マウスにおいて、5匹のCRが達成されたことを示す。
化合物18 LNP中のIL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性は、腫瘍増殖の遅延により見られるように、MC3 LNP中のIL12 mRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性と比較して増強された(図8D)。図8Dは、化合物18に基づくLNP中の0.5μgのマウスIL12 mRNAを7日間で6回投与された12匹のマウスに関する個々の腫瘍体積を示す。また、完全奏功(CR)は、12匹の動物のうちの5匹において達成された。
図8E~8Fに示されるように、MC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)中の0.5μgの非翻訳陰性対照mRNA(NST)(図8E)および化合物18に基づくLNP中の0.5μgのNST(図8F)の週用量(7日間で6回)を投与されたA20腫瘍を担持するマウスにおいて、腫瘍増殖が観察された。
このデータは、修飾されたマウスIL12 mRNA(miR122とmiRlessの両方)を含むポリヌクレオチドが、低用量(0.5μg)で抗腫瘍有効性を示すことを示す。それはまた、in vivoでの抗腫瘍有効性を、複数回投薬レジメンを用いて潜在的に増強することができることも示す。最後に、このデータは、MC3に基づく、および化合物18に基づくLNP中の0.5μgのIL12 miR122 mRNAを毎週(7日間で6回)腫瘍内投与する場合のin vivoでの抗腫瘍有効性を示す。対照的に、MC3に基づく脂質ナノ粒子(LNP)および化合物18に基づくLNP中の0.5μgの非翻訳陰性対照mRNA(NST)の週用量(7日間で6回)を投与されたA20腫瘍を担持するマウスにおいて、腫瘍増殖が観察された。
(実施例5)
マウスIL12 mRNAの投与後のA20担持マウスの血漿および腫瘍中のIL12 p70、IFNγ、IP10、IL6、GCSF、およびGROαのレベルの分析
(実施例5)
マウスIL12 mRNAの投与後のA20担持マウスの血漿および腫瘍中のIL12 p70、IFNγ、IP10、IL6、GCSF、およびGROαのレベルの分析
埋込み後10日目に、A20腫瘍を担持するマウス群(各群でn=12)に、MC3に基づくLNPもしくは化合物18に基づくLNP中のmiR122 IL12 mRNAの用量(5μg、2.5μg、もしくは0.5μg)、同じ投与量のNSTもしくはIL12タンパク質、またはPBSを投与した。
腫瘍および血漿IL12 p70のレベル、ならびに他のサイトカインのレベルを、前記投与量の投与後6および24時間で決定した。IL12(p70)のレベルを、サンドイッチELISA市販キット(R&D Systems、Minneapolis、MN、USA)を使用して決定した。IFNγ、IP10、IL6、G-CSF、およびGROαのレベルも決定した。
結果:図9A~9Bは、MC3に基づくLNP中の示された用量のマウスIL12 mRNAの、A20腫瘍を担持するマウスへの投与後6時間および24時間での血漿(図9A)および腫瘍(図9B)中のIL12の用量依存的レベルを示す。
図9C~9Dは、MC3に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAと比較した、化合物18に基づくLNP中の示された用量のマウスIL12 mRNAの投与後の血漿および腫瘍中のIL12のレベルの上昇を示す。図9Cは、6時間および24時間での血漿IL12レベルを示す;図9Dは、6時間および24時間での腫瘍IL12レベルを示す。表10は、マウスIL12 mRNA投与後(6時間および24時間)の血漿および腫瘍中のIL12の倍数増大を示す。
図9E~9Fは、A20腫瘍を担持するマウスへのマウスIL12 mRNAの投与後の血漿(図9E)および腫瘍(図9F)中の6時間および24時間でのIFNγのレベルの増大を示す。
図9G~9Hは、A20腫瘍を担持するマウスへのマウスIL12 mRNAの投与後の血漿(図9G)および腫瘍(図9H)中の6時間および24時間でのIP10のレベルの増大を示す。
図9I~9Jは、MC3に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAと比較した、化合物18に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAの投与後の血漿(図9I)および腫瘍(図9J)中の6時間および24時間でのIL6のレベルの低下を示す。
図9K~9Lは、MC3に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAと比較した、化合物18に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAの投与後の血漿(図9K)および腫瘍(図9L)中の6時間および24時間でのG-CSFのレベルの低下を示す。
図9M~9Nは、MC3に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAと比較した、化合物18に基づくLNP中のマウスIL12 mRNAの投与後の血漿(図9M)および腫瘍(図9N)中の6時間および24時間でのGROαのレベルの低下を示す。
本実施例におけるデータは、マウスIL12 mRNAの腫瘍内投与に関する血漿および腫瘍中でのIL12の用量依存的レベルを示す(図9Aおよび9B)。このデータはまた、MC3に基づくLNPと比較した化合物18に基づくLNPに由来する血漿および腫瘍中のIL12レベルの増大(図9Cおよび9D)、ならびにマウスIL12 mRNAの投与に起因する、IFNγおよびIP10レベルの増大(図9E~9H)を示す。最後に、本実施例は、MC3で製剤化されたマウスIL12 mRNAと比較した、化合物18で製剤化されたマウスIL12 mRNAに関する血漿および腫瘍中のIL6、G-CSF、およびGROαのレベルの低下を示す(図9I~9N)。
(実施例6)
皮下A20モデルにおけるIL12_miR122 mRNAの静脈内(IV)投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
A.試験設計
(実施例6)
皮下A20モデルにおけるIL12_miR122 mRNAの静脈内(IV)投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
A.試験設計
500,000個のA20細胞を、BALB/cマウスに皮下的に埋め込んだ。腫瘍平均がおよそ100mm3に達した時、A20腫瘍を担持するマウスを、2つの処置群(N=10)にコホート化した。マウスに、LNPを含有する化合物18 PEG中の0.5mg/kgのマウスmRNAを7日毎(Q7D)にIV投与した。
対照群を、LNP中で製剤化された陰性対照mRNAで処置したが、処置群には、3’UTR中にmiR122結合エレメントを有するマウスIL12 mRNAを含有するLNPを投与した。化合物18を含有するLNPの使用およびmiR122結合エレメントの組込みは、肝臓からの潜在的なタンパク質産生を減らすことを意味していた。
腫瘍体積および体重を、週に2回測定し、2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されるIACUCプロトコールに従って、一般的な臨床観察を行った。
B.有効性データ
B.有効性データ
図10Aにおける適切な陰性対照と比較した、化合物18 PEGを含有するLNP中で製剤化されたマウスIL12 mRNA+miR122結合エレメントの週用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図10Bに示す。投薬日は、垂直の赤色の破線で示され、2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点は水平の黒色の破線で示される。
C.副作用/毒性の評価
C.副作用/毒性の評価
図10Cにおける適切な陰性対照と比較した、化合物18 PEGを含有するLNP中で製剤化されたマウスIL12 mRNA+miR122結合エレメントの週用量で処置されたマウスに由来する個々の体重を、図10Dに示す。
D.結論
D.結論
マウスIL12 mRNAの静脈内投与は、適切な陰性対照(すなわち、開始「NST」コドンを有さないmiR122結合エレメントを有する同一に製剤化されたmRNAのIV処置)と比較して、A20腫瘍の増殖を遅延させた。一般的な臨床観察および体重測定値によってより定量的に決定されたように、0.5mg/kg Q7Dの有効用量が良好に許容された。
(実施例7)
IP MC38モデルにおけるマウスIL12修飾されたmRNAの腹腔内(IP)投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
A.試験設計
(実施例7)
IP MC38モデルにおけるマウスIL12修飾されたmRNAの腹腔内(IP)投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
A.試験設計
腫瘍量を生きている動物においてカリパスによって評価することができない状況で増殖させる場合、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を、MC-38結腸細胞株内に組み込んで、これらの細胞からの生物発光の測定を可能にした。これらの細胞からの光出力は、腫瘍量と相関していた。
500,000個のMC-38ルシフェラーゼ可能化(MC38-luc)細胞を、腹腔への結腸がん転移のモデルとしてこの空間に接種した。生物発光シグナルに基づいてマウスを様々な処置群に割り当て、疾患誘導の7日後に処置を開始した。
マウスを、LNP中で製剤化されたマウスmRNA(50:38.5:10:1.5のモル%のMC3:コレステロール:DSPC:PEG-DMG)の単回腹腔内(IP)用量で処置し、1μgの組換えマウスIL12タンパク質の単回IP用量と比較した。2つの固定用量レベルのmRNA(2μgおよび4μg)の単回用量を、疾患誘導後7日目に投与し、miR122結合エレメントを有する、および有さないマウスIL12 mRNAを、適切な陰性対照(同一に製剤化されたLNP中に封入されたmiR122結合エレメントを有する非開始NST mRNA)と比較して、異なる処置群において評価した。
腫瘍体積および体重を頻繁に測定し、一般的な臨床観察を、適切なIACUCプロトコールに従って行った。
B.有効性データ
B.有効性データ
生物発光(BL)を、腫瘍量の代用物として使用し、図11Aに示されるように疾患誘導後22日目を含む数日で測定した。処置群および用量レベルは、図11Bに示される。マウスに、処置なし、2μgのmIL12_miRless、2μgのmIL12_miR122、2μgのNST_OX40L_122、4μgのmIL12_miRless、4μgのmIL12_miR122、4μgのNST_OX40L_122、および1μgのrmIL12を投与した。全ての処置群においてマウスIL12 mRNAで処置されたマウスは、陰性対照よりも低いBLシグナルを呈した。
C.副作用/毒性の評価:
C.副作用/毒性の評価:
処置は一般に良好に許容され、処置なし群は10%を超える体重減少を呈した(図11B)。
D.結論
D.結論
図11Aおよび11Bに示されるように、両方の固定用量のマウスIL12 mRNAで埋込み後150日まで処置されたマウスは、陰性対照と比較して、腫瘍量の尺度として低いレベルのBLシグナルを呈し、この抑制されたBLレベルは、腹腔内投与されたマウスIL12 mRNAの見かけの生存利益と関連していた。3’UTR内にmiR122結合ドメインを含有するマウスIL12 mRNAは、この制御エレメントを有さないmRNA(miR-less)と類似する有効性を呈した。用いられた有効用量は、一般に良好に許容されると考えられた。
固定用量のマウスIL12 mRNAで処置されたマウスは、陰性対照と比較して、腫瘍量の尺度として低いレベルのBLシグナルを呈し、この抑制されたBLレベルは、腹腔内投与されたマウスIL12 mRNAの見かけの生存利益と関連していた。
(実施例8)
マウスIL12 mRNAの投与後のマウスにおけるIL12およびIFNγレベルの分析
(実施例8)
マウスIL12 mRNAの投与後のマウスにおけるIL12およびIFNγレベルの分析
MC38腫瘍を担持するマウスに、標準的な化合物18に基づくLNP中のマウスmiR122 IL12 mRNAの1つまたは複数の用量を腫瘍内(iTu)投与した。特に、マウスに、LNP中のマウスmiR122 IL12 mRNA(0.05μg、0.5μg、もしくは5.0μg)の単回腫瘍内(iTu)用量、同じレベルのマウスmiR122 IL12 mRNAの複数iTu用量(4×)、または対照としての5.0μgのNSTを投与した。
血漿IL12およびIFNγのレベルを、投与量の投与後24時間で決定した。IL12およびIFNγのレベルを、Luminexに基づく多重パネル(ProcartaPlex Mouse Cytokine & Chemokine Panel 1A 36plex、Affymetrix eBioscience)を使用して決定した。
図17Bは、腫瘍を担持するマウスへのマウスIL12 mRNAの投与後24時間での血漿中のIFNγのレベルの増大を示す。この図面はしたがって、マウスIL12 mRNAの投与が、複数回用量にわたってIFNγ発現を誘導することを示す。
あるいは、癌腫症のモデルとしての腹腔内にMC38結腸腺癌細胞を担持するマウスに、単回固定腹腔内(IP)用量のマウスmiR122 IL12 mRNA(2μgもしくは4μg)、マウスmiRless IL12 mRNA(2μgもしくは4μg)、または組換えIL12タンパク質(rmIL12)(1μg)を、MC38細胞を播種した後7日目に投与した。血漿IL12およびIFNγのレベルを、標準的な技術を使用して投与量の投与後に決定した。
図18A~18Bは、MC38腫瘍を担持するマウスへのマウスIL12 mRNAの腹腔内(IP)投与後の血漿中のIL12(図18A)および血漿中のIFNγ(図18B)のレベルの増大を示す。
これらのデータは、IL-12の腫瘍内と腹腔内の両方の投与が、IFNγの血漿レベルを増大させたことを示す。さらに、MC38腫瘍モデルにおけるIL-12の複数回投薬は、血漿IL-12とIFNγの両方の反復レベルを誘導する。
(実施例9)
A20モデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin
vivoでの抗腫瘍有効性
(実施例9)
A20モデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin
vivoでの抗腫瘍有効性
A20腫瘍細胞を、マウスに皮下的に埋め込んだ。A20腫瘍を担持するマウスを、2つの処置群(N=12)にコホート化した。マウスに、化合物18-LNP中の0.5μgのmRNAを、7日毎(Q7D)にiTuで投与した。
対照群を、同じLNP中で製剤化された陰性対照mRNAで処置したが、処置群には、3’UTR中にmiR122結合部位を有するマウスIL12 mRNA(mIL12-miR122)を含有するLNPを投与した。
腫瘍体積を、A20細胞を埋め込んだ後、90日の経過にわたって測定し、一般的な臨床観察を、2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたIACUCプロトコールに従って行った。
化合物18-LNP中で製剤化されたmIL12-miR122のiTu投薬で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図19Aにおける陰性対照と比較して図19Bに示す。図19Bは、4匹のマウスが90日目までに完全奏功を達成したことを示す。
図19Bに由来する見かけの完全奏功マウス(4/12)に、A20腫瘍細胞を再チャレンジした。再チャレンジしたマウスに由来する個々の腫瘍体積を、図19C中のA20で再チャレンジしたナイーブマウスにおける腫瘍増殖と比較して図19Dに示す。図19Cは、新しく埋め込まれた腫瘍を担持する10匹の対照マウスのうちの9匹が、45日目までにその終点(2000mm3の腫瘍体積)に達したことを示す。しかしながら、図19Dは、A20腫瘍を再チャレンジした図19Bに由来する4匹全部の完全奏功マウスが、60日目までいかなる腫瘍増殖も示さなかったことを示す。これは、mIL12-miR122 mRNA投与が、再チャレンジの際に腫瘍増殖を予防するのに十分なものである免疫記憶応答をマウスに提供したことを示す。
(実施例10)
MC38-SモデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin vivo抗腫瘍有効性
(実施例10)
MC38-SモデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin vivo抗腫瘍有効性
MC38-S細胞を、マウスに埋め込んだ。一般に、MC38-2とも記載されるMC38-Sは、療法に対してより感受性の高い細胞株である。理論によって束縛されるものではないが、この観察の1つの説明は、観察されるCD45+T細胞、CD8+Treg細胞、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、およびDCのレベルの増大、ならびにMC38-S腫瘍がよりゆっくり増殖し、試験したIMTに対してより感受性が高いという観察である。MC38-S腫瘍のこれらの特徴は全て、MC38-R腫瘍(MC38-1またはMC38-Mとも記載される)との比較によるものであり、両方とも有用なモデルである。
MC38-S腫瘍を担持するマウスを、4つの処置群(N=15)にコホート化した。マウスに、化合物-18 LNP中の0.05μg、0.5μg、または5μgのマウスIL12 mRNAをiTu投与した。陰性対照として、マウスに、NST-FIX mRNAをiTu投与したか、または処置しなかった。単回および複数回用量試験において、実験群および対照群のマウスは、同じ投薬レジメンを受けた。
MC38-S細胞を埋め込んだ後、80日の経過にわたって、各群において腫瘍体積および生存を測定し、1500mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたプロトコールに従って一般的な臨床観察を行った。
0.05μgのマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図20Aおよび図21Aに示し、0.5μgのマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図20Bおよび図21Bに示し、5μgの製剤化されたマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図20Cおよび図21Cに示し、図20D中の適切な陰性対照と比較した。1500mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図20Aおよび図21Aは、15匹のマウスのうちの6匹が完全奏功を達成したことを示す。図20B、図21B、図20C、および図21Cは、15匹のマウスのうちの13匹が完全奏功を達成したことを示し、これは、5μgについて見られた同様の応答を考慮すれば、0.5μgの低用量が最大有効応答を示すのに十分なものであり得ることを示している。
0.05μgのマウスIL12 mRNAの2回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図21Dに示し、0.5μgのマウスIL12 mRNAの2回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図21Eに示し、5μgのマウスIL12 mRNAの2回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図21Fに示す。1500mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図21Dは、15匹のマウスのうちの9匹が完全奏功を達成したことを示す。図21Eおよび図21Fは、15匹のマウスのうちの14匹が完全奏功を達成したことを示す。このデータは、一部の腫瘍型において、マウスIL12 mRNAの単回投与が、腫瘍を減少させるか、または除去するのに十分なものである抗腫瘍効果を達成することができることを示す。
用量応答の傾向は、0.05~0.5μgの間の用量レベルで明確であった。閾値は、0.5μg以下のマウスIL12 mRNAで達成されると考えられた。2回用量のIL12 mRNAもまた、単回用量を超えて有益であった。任意の用量のマウスIL12 mRNAを投与された全てのマウスが、生存利益を示した(図22)。したがって、マウスIL12 mRNAの腫瘍内投与は、適切な陰性対照と比較してMC38-S腫瘍の増殖またはサイズを遅延させたか、または減少させ、生存利益を提供した。
(実施例11)
MC38-RモデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin vivo抗腫瘍有効性
(実施例11)
MC38-RモデルにおけるIL12_miR122 mRNAの腫瘍内(iTu)投与のin vivo抗腫瘍有効性
MC38-R細胞を、マウスに埋め込んだ。一般に、MC38-1またはMC38-Mとも呼ばれるMC38-Rは、療法に対してより耐性の高い細胞株である。理論によって束縛されるものではないが、この観察の1つの説明は、観察されるCD45+T細胞、CD8+Treg細胞、およびDC、および「骨髄由来抑制細胞」のマーカーを担持するより多くの細胞のレベルの低下、ならびにMC38-R腫瘍がより速く増殖し、試験した免疫媒介療法に対してより感受性が低いという観察である。MC38-R腫瘍のこれらの特徴は全て、MC38-S腫瘍との比較によるものであり、両方とも有用なモデルである。
MC38-R腫瘍を担持するマウスを、4つの処置群(N=13)にコホート化した。マウスに、化合物-18 LNP中の0.05μg、0.5μg、または5μgのマウスIL12 mRNAをiTu投与した。陰性対照として、マウスに、NST-FIX mRNAをiTu投与したか、または処置しなかった。単回および複数回用量試験において、実験群および対照群のマウスは、同じ投薬レジメンを受けた。
MC38-R細胞を埋め込んだ後、75日の経過にわたって、各群において腫瘍体積および生存を測定した。
0.05μgのマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Aおよび図23Eに示し、LNP中で製剤化された0.5μgのマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Bおよび図23Fに示し、LNP中で製剤化された5μgのマウスIL12 mRNAの単回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Cおよび図23Gに示し、図23D中の適切な陰性対照と比較した。2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図23Aおよび図23Eは、0.05μgのマウスIL12 mRNAの投与後にMC38-R腫瘍を担持するマウスが完全奏功を達成しなかったことを示す。図23Bおよび図23Fは、0.5μgのマウスIL12 mRNAの投与後にMC38-R腫瘍を担持する2匹のマウスが完全奏功を達成したことを示す。図23Cおよび図23Gは、5μgのマウスIL12 mRNAの投与後にMC38-R腫瘍を担持する4匹のマウスが完全奏功を達成したことを示す。
0.05μgのマウスIL12 mRNAの複数回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Hに示し、LNP中で製剤化された0.5μgのマウスIL12 mRNAの2回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Iに示し、LNP中で製剤化された5μgのマウスIL12 mRNAの2回iTu用量で処置されたマウスに由来する個々の腫瘍体積を図23Jに示す。2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点は、水平の黒色の破線で示される。図23H~23Jは、複数回投与が単回投与と同様の有効性を有することを示す。
これらの結果は、抗PD1および抗PD-L1アンタゴニスト抗体などの、他の免疫媒介療法に対するMC38-R腫瘍の耐性が実証されたにもかかわらず、マウスIL12 mRNAを投与されたマウスが、生存利益を示したことを示している(図24)。生存事象は、腫瘍量の終点を含み、処置されたマウスおよび処置されていないマウスにおいて生じた潰瘍/痂皮のため動物を試験から除外した。マウスIL12 mRNAの腫瘍内投与は、適切な陰性対照と比較してMC38-R腫瘍の増殖を遅延させ、生存利益を提供し、一般に、良好に許容された。
腫瘍および血漿IL12 p70のレベル、ならびに他のサイトカインのレベルを、投与量の投与後24時間で決定した。結果は、以前に示されたように、マウスIL12 mRNAの腫瘍内投与に関して、血漿中のIL12の用量依存的レベルを示す。結果はまた、複数回のマウスIL12投薬後、TNFα、IL-10、IL-13、IL-15/15R、IL-27、MIP-1β、MIP-1α、MCP-1、MCP-3、M-CSF、IL-4、およびIL-5の持続的な用量依存的発現も示す(データは示さない)。GM-CSF、IL-18、IL-3、RANTESおよびIL-6は、5μgのマウスIL12投薬後にのみ、発現レベルが上昇した(データは示さない)。
(実施例12)
IL12 mRNA有効性に関与するCD8+T細胞
(実施例12)
IL12 mRNA有効性に関与するCD8+T細胞
IL12 mRNAにより誘導される有効性を媒介する際のCD8+T細胞の役割を評価付けるために、MC38-R細胞をマウスに埋め込み、CD8+T細胞枯渇クローン24.3を使用して、CD8+T細胞を枯渇させ、血液中でCD8+T細胞レベルをモニタリングして、有効性試験の経過にわたって枯渇を確認した。24.3クローンまたは対照抗体を、マウスIL12 mRNAの投与の2日前にマウスに投与した。枯渇または対照抗体を、3日連続で毎日0.5mgにて投与し、3日休んだ後、0.2mgの別の5つの抗体用量を4日毎に投与した。実験を通してフローサイトメトリーを実施して、CD8+T細胞枯渇を確認した。
24.3クローンを使用して、CD8+T細胞を、28日の経過にわたって枯渇させたが、抗体対照はCD8+T細胞を枯渇させなかった(図25)。血液中のCD8+T細胞数は、フローサイトメトリーにより検査された全ての時点で有意に減少し、したがって、有効な枯渇が確認された。
クローン24.3によるCD8+T細胞枯渇後に0.5μgのマウスIL12 mRNAを投与されたマウスは、モックCD8+T細胞枯渇後に0.5μgのマウスIL12 mRNAを投与されたマウス(図26B)と比較して、腫瘍体積の増大を示した(図26D)。同様に、CD8+T細胞枯渇後に0.5μgのマウスIL12 mRNAを投与されたマウスは、モックCD8+T細胞枯渇後に0.5μgのマウスIL12 mRNAを投与されたマウスと比較して、生存不良を示した(図26E)。図26Aは、モックCD8+T細胞枯渇後に陰性対照mRNAで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示し、図26Cは、CD8+T細胞枯渇後に陰性対照mRNAで処置されたマウスにおける腫瘍体積を示す。マウスIL12 mRNA処置は、CD8+T細胞枯渇を用いた場合でも腫瘍増殖のある程度の遅延をもたらすと考えられたが、マウスIL12 mRNA処置およびモック枯渇を用いた場合に観察された明確な生存利益とは対照的に、細胞傷害性T細胞の不在下では完全奏功マウスはいなかった。この結果は、CD8+T細胞が、IL12 mRNA媒介性有効性において必須の役割を果たすことを示している。
(実施例13)
IL12 mRNAの腫瘍内投与後のMC38-RおよびB16F10-AP3腫瘍における免疫浸潤の有意な変化
(実施例13)
IL12 mRNAの腫瘍内投与後のMC38-RおよびB16F10-AP3腫瘍における免疫浸潤の有意な変化
IL12 mRNAによる処置後、MC38-RとB16F10-AP3腫瘍の両方において免疫細胞浸潤の有意な変化が起こった。MC38-R腫瘍を、0.05μgまたは0.5μgのマウスIL12 mRNAで腫瘍内処置したが、B16F10-AP3腫瘍を、0.1μgまたは0.5μgのマウスIL12 mRNAで腫瘍内処置した。
MC38-RとB16F10-AP3モデルの両方において、PDL1発現について陽性に染色する腫瘍内のCD11b+骨髄細胞の百分率は、IL12 mRNA処置後、多くの時点で有意に増大した(図27Aおよび図27B)。
IL12 mRNA処置は、後の時点での、MC38-RとB16F10-AP3マウスモデルの両方における腫瘍内のCD8+T細胞の増大とさらに相関していた。特に、免疫浸潤(CD45+細胞)のうちのCD8+T細胞の割合および腫瘍組織1mgあたりのCD8+陽性細胞の数により証明されるように、T細胞のパーセントは、両方のマウスモデルにおいて0.5μgのマウスIL12 mRNAの投与後7日で統計的に高かった(図28Aおよび図28B)。さらに、免疫浸潤(CD45+細胞)のうちのCD8+T細胞の割合により証明されるように、0.1μgのマウスIL12 mRNAで処置されたB16F10-AP3マウスにおける腫瘍中で、有意により多数のT細胞が観察された(図28B)。CD45陽性細胞のパーセントと、1mgあたりの細胞は両方とも、有益である。7日目で、処置群における腫瘍は、特に、0.1μgおよび0.5μg群について、対照よりも小さい。
CD8+細胞の制御性T(Treg)細胞に対する比(CD8:Treg)の増大は、MC38-R(図29A)とB16F10-AP3(図29B)マウスモデルの両方において見られたが、これは、改善されたエフェクターと抑制因子の比を実証している。特に、0.05μgまたは0.5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたMC38-Rマウスは、陰性対照と比較して、CD8+T細胞のTreg細胞に対する統計的に有意な高い比を呈したが、これは、7日目での腫瘍組織中のCD8+細胞の増大とTreg細胞の減少の両方に起因する(図29A)。同様に、0.1μgまたは0.5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたB16F10-AP3マウスは、陰性対照と比較して、CD8+T細胞のTreg細胞に対する統計的に高い比を呈したが、これは、CD8+細胞の増大に起因する(図29B)。
Tリンパ球およびNK細胞の活性化を示す、CD69の発現は、MC38-RとB16F10-AP3腫瘍の両方において、CD8+T細胞に対して増大した(図30A~30B)。
ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化も、IL-12 mRNAで処置されたMC38-RとB16F10-AP3腫瘍の両方において見られた(図31Aおよび図31B)。
交差提示樹状細胞の増大は、MC38-RとB16F10-AP3腫瘍モデルの両方において観察された。CD103+cDCの増大は、7日目でMC38-R(図32A)とB16F10-AP3腫瘍(図32B)の両方において観察された。さらに、より高いパーセントの活性化CD8+cDCが、B16F10-AP3腫瘍における対照と比較して、それぞれ24時間、72時間、および7日目に、マウスIL12 mRNAによる処置後に流入領域リンパ節において見出された(図32C)。
(実施例14)
MC38-Rモデルにおける、抗PD-L1抗体と組み合わせたIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性
(実施例14)
MC38-Rモデルにおける、抗PD-L1抗体と組み合わせたIL12修飾されたmRNAのin vivoでの抗腫瘍有効性
マウスIL12 mRNAの投与後のPD-L1の発現の増大(上記の実施例11を参照されたい)を考慮して、マウスIL12 mRNAと抗PD-L1抗体との組合せ療法の有効性を試験した。抗PD-L1抗体単剤療法の有効性を評価付けるために、MC38-R腫瘍を担持するマウスに、クローン80から得られたマウス抗PD-L1抗体を投与した。図33Aは、抗体対照の投与後のマウスの腫瘍体積の変化を示す。図33Bは、抗PD-L1抗体の投与後の腫瘍体積の変化を示す。全てのマウスが終点(すなわち、2000mm3の腫瘍)に達したが、これは、抗PD-L1処置に対するこのモデルの非感受性を実証している。
MC38-R腫瘍を担持するマウスに、(i)マウスIL12 mRNAのみ、または(ii)マウスIL12 mRNAとマウス抗PD-L1抗体との組合せを、iTu投与した。mRNAの3つの投与量、すなわち、0.05μg(データは示さない)、0.5μgおよび5μgを試験した。MC38-R細胞を埋め込んだ後、90日の経過にわたって、各群(n=15)において、腫瘍体積および生存を測定し、2000mm3の腫瘍体積の予め決めておいた終点に達するまで、許容されたプロトコールに従って一般的な臨床観察を行った。
図33Cおよび図33Eは、0.5μgのマウスIL12 mRNAとの組合せ療法は、15匹のマウスのうちの6匹において完全奏功をもたらしたが、マウスIL12 mRNAのみの投与後では、15匹のマウスのうちの1匹のみが完全奏功を達成したことを示す。図33Dおよび図33Fは、5μgのマウスIL12 mRNAとの組合せ療法においては、15匹のマウスのうちの11匹が完全奏功を達成したが、マウスIL12 mRNAのみの投与後では、15匹のマウスのうちの5匹のみが完全奏功を達成したことを示す。図33Gは、マウス抗PD-L1抗体のみでは、この試験においてMC38-Rを担持するマウスにおけるいかなる抗腫瘍有効性も有さなかったことを確認するデータを示す。この結果は、マウスIL12 mRNAと、チェックポイント阻害剤、例えば、抗PD-L1抗体との組合せ療法が、そうでなければチェックポイント阻害剤に対して耐性である腫瘍、例えば、MC38-Rにおいて相乗的な有効性を示し得ることを示す。
(実施例15)
抗PD-L1抗体と組み合わせたIL12修飾されたmRNAの腫瘍内投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
(実施例15)
抗PD-L1抗体と組み合わせたIL12修飾されたmRNAの腫瘍内投与のin vivoでの抗腫瘍有効性
MC-38結腸腺癌腫瘍を、Rosenbergら、Science 233巻:1318~1321頁(1986年)に記載されたようにマウスに皮下的に埋め込んだ。
MC38-RまたはB16F10-AP3マウス腫瘍を担持するマウスに、0.05μg、0.5μg、もしくは5μgの用量の単回腫瘍内用量のLNP製剤化マウスIL12修飾されたmRNA(化合物18に基づくLNPと共に製剤化されたmiR122を含むIL12 mRNA)を、単独で、または腹腔内用量の抗PD-L1抗体(クローン80)と組み合わせて投与した。追加用量を、以下に示されるように投与した。
A.結果
A.結果
マウスIL12 mRNAと抗PD-L1抗体(αPD-L1)との組合せ処置の効果を試験するために、MC38-Rマウスを、マウス抗PD-L1抗体のみ(図34A)、0.5μgのマウスIL12 mRNAのみ(図34B)、またはマウス抗PD-L1抗体と0.5μgのマウスIL12 mRNAの両方(図34C)を用いて埋込みの11日後に処置した。抗PD-L1抗体のみを使用する処置は、腫瘍増殖に対する効果はほとんどなく(図34A)、単回用量の0.5μgのマウスIL12 mRNAによる処置は1匹のCRをもたらした(図34B)。マウスIL12 mRNA腫瘍内処置を抗PD-L1投与と組み合わせた場合(6回用量で投与)、CR数の大きな増大が観察された。15匹のマウスのうちの8匹(53%)が、抗PD-L1抗体と組み合わせた0.5μgのマウスIL12 mRNAの単回用量後に完全奏功を呈した(図34C)。
マウスIL12 mRNAと抗PD-L1抗体とを使用する組合せ処置の相乗効果を、免疫学的に不毛であり、また、抗PDL1などのチェックポイント遮断療法に対して耐性であると考えられるB16F10-AP3マウスにおいてさらに観察した。未処置のB16F10-AP3マウス(図35A)および抗PD-L1抗体のみ(図35B)または単回用量の0.5μgのマウスIL12 mRNAのみ(図35C)で処置されたB16F10-AP3はCRをもたらさなかったが、抗PD-L1抗体と組み合わせた単回用量の0.5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたマウス(11、14、18、21、25、および28日目に6回用量で投与)は、15匹のマウスのうち、2匹のCRをもたらした(図35D)。
(実施例16)
遠位腫瘍内へのマウスIL12 mRNA投与後の未照射部位への効果
(実施例16)
遠位腫瘍内へのマウスIL12 mRNA投与後の未照射部位への効果
マウスIL12 mRNA腫瘍内投与の潜在的な未照射部位への効果を調査するために、MC38結腸腺癌腫瘍をマウスの両側に埋め込んだ(MC38-S;図36A)。進行中の試験において、0.5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたMC38-S腫瘍の17/20(図36D)および5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたMC38-S腫瘍の19/20(図36F)は、今までのところ、約50ヶ月後も完全奏功を呈している。さらに、0.5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたマウスにおける遠位腫瘍の3/20(図36E)および5μgのマウスIL12 mRNAで処置されたマウスにおける遠位腫瘍の16/20が、今までのところ、約50ヶ月後も完全奏功を呈している(図36G)。陰性対照に関する結果を、図36Bおよび図36Cに示す。
これらの未照射部位への効果は、進行中の試験において、マウスIL12 mRNA処置を抗PD-L1処置と組み合わせた場合に増幅される。両側にMC38腫瘍を埋め込んだマウスに、単剤療法(図37Cおよび図37E)として、または抗PD-L1抗体と組み合わせて(2週間にわたって週に2回、20mg/kgのIP注射により投与した;図37Dおよび図37F)、0.5μgのマウスIL12 mRNA(図37C~37D)または5μgのマウスIL12 mRNA(図37E~37F)のいずれかを、1つの腫瘍に腫瘍内投与した。今までのところ、0.5μg(図37C)および5μg(図37E)のマウスIL12 mRNAで処置されたマウスにおいて3/20のCRおよび16/20のCRが両側で観察され、抗PD-L1と、0.5μg(図37D)または5μg(図37F)のマウスIL12 mRNAとの組合せで処置されたマウスにおいて8/20のCRおよび20/20のCRが両側で観察された。陰性対照に関する結果を、図37Aおよび図37Bに示す。
(実施例17)
ヒトIL12をコードするコドン最適化されたmRNAの評価付け
(実施例17)
ヒトIL12をコードするコドン最適化されたmRNAの評価付け
実施例1で生成されたmIL12_miR122構築物に加えて、ヒトIL12ポリペプチドをコードする20種のコドン最適化されたmRNA(hIL12AB001~020)を調製した。これらのmRNAはまた、3’UTR中にmiR-122結合部位を有していた。
mRNAを、N1-メチルシュードウリジンで完全に修飾した。修飾されたmRNAを、スクリーニングのためにMC3脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化した。HeLa細胞を、標準的なトランスフェクションプロトコールを使用してトランスフェクトし、トランスフェクションの約22時間後に発現を決定した。発現を、野生型muIL12構築物に由来するものに対して正規化した。試験した多くの構築物は、mIL12_miR122構築物と同等か、またはそれの約2倍までの発現を有していた。
また、HeLa細胞中で高い発現を有する構築物を、MC38細胞、Heb3B細胞およびA20細胞中での発現について試験して、様々な腫瘍細胞株における発現を確認した。
hIL12AB_002、hIL12AB_006およびhIL12AB_021バリアントを、in vivoでの試験のためにさらに選択した。C57Bl6マウスに、A20細胞を皮下的に埋め込んだ(A20腫瘍モデル)。腫瘍を増殖させた後、腫瘍に、LNPに封入されたmRNAを腫瘍内的に注入した。単回腫瘍内用量のmRNAの投与の6および24時間後に、血漿、腫瘍、肝臓および脾臓を収集した(n=6匹/群)。特に、hIL12AB_002およびhIL12AB_006バリアントは、例えば、血漿および腫瘍中で、mIL12_miR122 mRNAと比較して良好な発現を示した。
in vitroおよびin vivoでの集合的スクリーニングに基づいて、hIL12ABをコードする好ましいmRNAとして、hIL12AB_002を選択した(図38)。
他の実施形態
他の実施形態
使用されてきた単語は、限定よりもむしろ説明の単語であり、そのより広い態様における本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の権限の中で変更を加えることができることが理解されるべきである。
本開示は、いくつかの記載された実施形態に関してある程度の長さで、また、ある程度の特定性をもって説明されてきたが、それは、任意のそのような詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供するため、したがって、本開示の意図される範囲を有効に包含するために、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。さらに、節の見出し、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
概要および要約の節ではなく、詳細な説明の節は、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることが理解されるべきである。概要および要約の節は、本発明者(ら)によって企図される、1つまたは複数であるが、全てではない、本開示の例示的実施形態を説明してもよく、したがって、いかなる意味でも本開示および添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
本開示を、特定の機能およびその関係の実施を例示する機能的な構成要素を援用して上記で説明してきた。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の利便性のために本明細書で任意に定義されている。特定の機能およびその関係が適切に実行される限り、別の境界を定義することができる。
特定の実施形態の前記説明は、したがって、他者が、当技術分野の技術の範囲内にある知識を適用することによって、過度の実験なしに、本開示の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態を容易に改変する、および/または様々な用途に適合させることができる、本開示の一般的性質を完全に示すであろう。したがって、そのような適合化および改変は、本明細書に提示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書における表現または用語は、説明のためのものであり、限定のためのものではないことが理解されるべきであり、本明細書の用語または表現は教示および指針の観点から当業者によって解釈されるべきである。
本開示の幅および範囲は、上記の例示的実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されるべきである。
Claims (157)
- 腫瘍のサイズの低減または腫瘍の成長の阻害をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、インターロイキン12 p40サブユニット(「IL12B」)ポリペプチドおよびインターロイキン12 p35サブユニット(「IL12A」)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(「ORF」)を含む、方法。
- 前記対象に、チェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む有効量の組成物、またはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、PD1、PD-L1、CTLA-4、またはこれらの組合せを阻害する、請求項2に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体を含む、請求項2または3に記載の方法。
- 前記抗体が、CTLA-4に特異的に結合する抗CTLA-4抗体またはその抗原結合性断片、PD-1に特異的に結合する抗PD1抗体またはその抗原結合性断片、PD-L1に特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合性断片、およびこれらの組合せである、請求項4に記載の方法。
- 前記抗PD-L1抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブである、請求項5に記載の方法。
- 前記抗CTLA-4抗体が、トレメリムマブまたはイピリムマブである、請求項5に記載の方法。
- 前記抗PD-1抗体が、ニボルマブまたはペンブロリズマブである、請求項5に記載の方法。
- 前記組成物を投与するステップが、前記対象におけるT細胞を活性化する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞の活性化をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法。
- 前記T細胞の活性化が、T細胞増殖を誘導することを含む、請求項9または10に記載の方法。
- 前記T細胞の活性化が、前記腫瘍へのT細胞の浸潤を誘導すること、または腫瘍浸潤T細胞の数を増大させることを含む、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞の活性化が、メモリーT細胞応答を誘導することを含む、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性化されたT細胞が、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはその両方を含む、請求項9から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む組成物もしくはチェックポイント阻害剤ポリペプチドを含む組成物と組み合わせて投与することが、前記腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比を増大させる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍におけるエフェクター対サプレッサーT細胞比を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法。
- 前記エフェクター対サプレッサーT細胞比が、CD8+T細胞:制御性T(Treg)細胞の比である、請求項15または16に記載の方法。
- CD8+:Treg比が、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、または少なくとも150である、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物を投与することが、前記対象における活性化NK細胞の数をさらに増大させる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 活性化ナチュラルキラー(NK)細胞の数を増大させることを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法。
- 活性化NK細胞の数が、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、または少なくとも約10倍増大する、請求項19または20に記載の方法。
- 前記増大した活性化NK細胞が、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、または少なくとも約14日間維持される、請求項19から21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物を投与することが、前記対象の前記腫瘍における交差提示樹状細胞を増大させる、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 交差提示樹状細胞を増大させることを必要とする対象の腫瘍においてそれを行う方法であって、前記対象に、IL-12ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、IL12BポリペプチドおよびIL12AポリペプチドをコードするORFを含む、方法。
- 前記交差提示樹状細胞が、CD103+細胞である、請求項23または24に記載の方法。
- 前記組成物を投与することが、前記対象における遠位腫瘍のサイズを低減するか、または遠位腫瘍の成長を阻害する、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL12Bポリペプチドおよび前記IL12Aポリペプチドが、直接またはリンカーをコードする核酸によって融合されている、請求項1または26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL12Bポリペプチドが、前記IL12Aポリペプチドまたは前記リンカーの5’末端に位置する、請求項27に記載の方法。
- 前記IL12Aポリペプチドが、前記IL12Bポリペプチドまたは前記リンカーの5’末端に位置する、請求項27に記載の方法。
- 前記IL12Bポリペプチドが、配列番号48のアミノ酸23~328に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、IL12B活性を有する、請求項27から29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記IL12Aポリペプチドが、配列番号48のアミノ酸336~532に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、IL12A活性を有する、請求項27から30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項27から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、IL12Bシグナルペプチドである、請求項32に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、配列番号48のアミノ酸1~22に少なくとも約80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項32または33に記載の方法。
- 前記組成物が、リンカーを介してIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたIL12BポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む、請求項27から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、IL12Bシグナルペプチド、IL12Bポリペプチド、リンカー、およびIL12AポリペプチドをコードするORFを含むポリヌクレオチドを含む、請求項27から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーが、Gly/Serリンカーを含む、請求項27から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Gly/Serリンカーが、(GnS)mを含み、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20であり、mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20である、請求項37に記載の方法。
- 前記Gly/Serリンカーが、(GnS)mを含み、ここで、nは6であり、mは1である、請求項38に記載の方法。
- 前記IL12ポリペプチドが、配列番号48に少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1から39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号5~44、236、および237からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項1から40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号236または237に少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項1から41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含むORFを含む、請求項1から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、節XIに列挙されているもののうちのいずれかおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項43または44に記載の方法。
- 前記ORF中の前記ヌクレオシドが、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは約100%だけ化学的に修飾されている、請求項43から45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ORFにおける前記化学的に修飾されたヌクレオシドが、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項43から46のいずれか一項に記載の方法。
- ORF中のウリジンヌクレオシドが、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは約100%だけ化学的に修飾されている、請求項1から47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ORF中のアデノシンヌクレオシドが、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは約100%だけ化学的に修飾されている、請求項1から48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ORF中のシチジンヌクレオシドが、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは約100%だけ化学的に修飾されている、請求項1から49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ORF中のグアノシンヌクレオシドが、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、もしくは約100%だけ化学的に修飾されている、請求項1から50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、miRNA結合部位を含む、請求項1から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記miRNA結合部位が、miR-122結合部位である、請求項52に記載の方法。
- 前記miRNA結合部位が、miR-122-3pまたはmiR-122-5p結合部位である、請求項52または53に記載の方法。
- 前記miRNA結合部位が、aacgccauua ucacacuaaa ua(配列番号51)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、前記miRNA結合部位がmiR-122に結合する、請求項53に記載の方法。
- 前記miRNA結合部位が、uggaguguga caaugguguu ug(配列番号53)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、前記miRNA結合部位がmiR-122に結合する、請求項53に記載の方法。
- 前記miRNA結合部位が、caaacaccau ugucacacuc ca(配列番号54)に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、もしくは約100%同一であるヌクレオチド配列を含み、前記miRNA結合部位がmiR-122に結合する、請求項53に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、5’非翻訳領域(UTR)を含む、請求項43から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’UTRが、表3に列挙される配列に少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一である核酸配列を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、3’非翻訳領域(UTR)を含む、請求項43から59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記3’UTRが、表4Aまたは4Bに列挙される配列に少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%同一である核酸配列を含む、請求項60に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、3’UTR内にmiRNA結合部位を含む、請求項60または61に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、前記miRNA結合部位に融合されたヌクレオチドスペーサー配列を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドスペーサー配列が、少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約70ヌクレオチド、少なくとも約80ヌクレオチド、少なくとも約90ヌクレオチド、または少なくとも約100ヌクレオチドを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、5’末端キャップ構造を含む、請求項43から64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’末端キャップ構造が、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはそれらの類似体である、請求項65に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、3’ポリA尾部を含む、請求項1から66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10のmiRNA結合部位を含む、請求項1から66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化ORFを含む、請求項1から68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、in vitroで転写された(IVT)ポリヌクレオチドである、請求項1から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、環状である、請求項1から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、送達剤とともに製剤化されている、請求項1から71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記送達剤が、リピドイド、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、請求項72に記載の方法。
- 前記送達剤が、脂質ナノ粒子である、請求項73に記載の方法。
- 前記脂質ナノ粒子が、DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂質、アミノアルコール脂質、KL22、およびこれらの組合せからなる群から選択される脂質を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記送達剤が、式(I)を有する化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
R1は、C5~20アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、および-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、-YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、
ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない、請求項70から74のいずれか一項に記載の方法。 - 前記化合物が、式(IA)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、1、2、3、4、または5であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される、請求項76に記載の方法。 - mが、5、7、または9である、請求項75から77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、式(II)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される、請求項76に記載の方法。 - 前記化合物が、化合物1から化合物147、ならびにそれらの塩および立体異性体から選択される、請求項75から79のいずれか一項に記載の方法。
- R4が、-(CH2)nQおよび-(CH2)nCHQRから選択され、ここで、Q、R、およびnは、請求項75または76において上記に定義される通りである、請求項76に記載の方法。
- R2が、C8アルキルである、請求項85に記載の方法。
- R3が、C5アルキル、C6アルキル、C7アルキル、C8アルキル、またはC9アルキルである、請求項85または86に記載の方法。
- mが、5、7、または9である、請求項85から87のいずれか一項に記載の方法。
- 各R5が、Hである、請求項85から88のいずれか一項に記載の方法。
- 各R6が、Hである、請求項89に記載の方法。
- 前記送達剤が、式(I)を有する化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
R1は、C5~30アルキル、C5~20アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R”M’R’からなる群から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、C2~14アルケニル、-R*YR”、-YR”、および-R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2およびR3は、それらに結合する原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3~6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、および非置換C1~6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、複素環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)ORおよび-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4、および5から選択され、
各R5は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
MおよびM’は、独立して、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-(O)-、-C(S)-、-(S)S-、-(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R7は、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
R8は、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1~6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2~6アルケニル、C3~6炭素環および複素環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1~3アルキル、C2~3アルケニル、およびHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1~18アルキル、C2~18アルケニル、-R*YR”、およびHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3~14アルキルおよびC3~14アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1~12アルキルおよびC2~12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3~6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、および13から選択され、
ただし、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2である場合、(i)nが1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qは、-N(R)2ではない、または(ii)nが1もしくは2であるとき、Qは、5、6、もしくは7員ヘテロシクロアルキルではない、請求項72から74のいずれか一項に記載の方法。 - 前記送達剤が、式(IA)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
mは、5、6、7、8、および9から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、もしくは-NHC(O)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される、請求項91に記載の組成物。 - mが、5、7、または9である、請求項91または92に記載の組成物。
- 前記化合物が、式(II)の化合物、
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
lは、1、2、3、4、および5から選択され、
M1は、結合またはM’であり、
R4は、非置換C1~3アルキル、または-(CH2)nQであり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、もしくは-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
MおよびM’は、独立して、-(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリール基、およびヘテロアリール基から選択され、
R2およびR3は、独立して、H、C1~14アルキル、およびC2~14アルケニルからなる群から選択される、請求項92または93に記載の組成物。 - M1が、M’である、請求項92から94のいずれか一項に記載の組成物。
- MおよびM’が、独立して、-C(O)O-または-OC(O)-である、請求項95に記載の組成物。
- lが、1、3、または5である、請求項92から96のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記化合物が、化合物1から化合物232、それらの塩および立体異性体、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項91に記載の組成物。
- 前記送達剤が、リン脂質をさらに含む、請求項72から98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リン脂質が、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DMPC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、
1,2-ジウンデカノイル-sn-グリセロ-ホスホコリン(DUPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0 ジエーテルPC)、
1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、
1-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(C16 Lyso PC)、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(ME 16:0 PE)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、
1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、
1,2-ジリノレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、
1,2-ジアラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)ナトリウム塩(DOPG)、
スフィンゴミエリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項99に記載の方法。 - 前記リン脂質が、1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-16:0 PC、MPPC)、
1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-18:0 PC、MSPC)、
1-パルミトイル-2-アセチル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-02:0 PC)、
1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-14:0 PC、PMPC)、
1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:0 PC、PSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:1 PC、POPC)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-18:2 PC、PLPC)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(16:0-20:4 PC)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(14:0-22:6 PC)、
1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-14:0 PC、SMPC)、
1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-16:0 PC、SPPC)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:1 PC、SOPC)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-18:2 PC)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-20:4 PC)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:0-22:6 PC)、
1-オレオイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-14:0 PC、OMPC)、
1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-16:0 PC、OPPC)、
1-オレオイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(18:1-18:0 PC、OSPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:1 PE、POPE)、
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-18:2 PE)、
1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-20:4 PE)、
1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(16:0-22:6 PE)、
1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:1 PE)、
1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-18:2 PE)、
1-ステアロイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-20:4 PE)、
1-ステアロイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(18:0-22:6 PE)、
1-オレオイル-2-コレステリルヘミスクシノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(OChemsPC)、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項99に記載の方法。 - 前記送達剤が、構造脂質をさらに含む、請求項72から101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ-トコフェロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項102に記載の方法。
- 前記送達剤が、PEG脂質をさらに含む、請求項72から103のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEG脂質が、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
- 前記送達剤が、
3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、
N1-[2-(ジドデシルアミノ)エチル]-N1,N4,N4-トリドデシル-1,4-ピペラジンジエタンアミン(KL22)、
14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、
1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLin-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、
ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、
2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、
1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、
2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA)、
(2R)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2R))、および
(2S)-2-({8-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2S))からなる群から選択されるイオン化可能脂質をさらに含む、請求項72から105のいずれか一項に記載の方法。 - 前記送達剤が、第四級アミン化合物をさらに含む、請求項72から106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第四級アミン化合物が、
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、
N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、
1-[2-(オレオイルオキシ)エチル]-2-オレイル-3-(2-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、
2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA)、
N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、
N-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、
N-(1,2-ジオレオイルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、
N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DLePC)、
1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DSTAP)、
1,2-ジパルミトイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DPTAP)、
1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DLTAP)、
1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DMTAP)、
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSePC)、
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC)、
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMePC)、
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOePC)、
1,2-ジ-(9Z-テトラデセノイル)-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(14:1 EPC)、
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(16:0-18:1 EPC)、
およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項107に記載の方法。 - 前記組成物が、in vivo送達のために製剤化されている、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、筋肉内、皮下、腫瘍内、または皮内送達のために製剤化されている、請求項109に記載の方法。
- 前記組成物が、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内、または埋込み型リザーバーを介して投与される、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与が、がんを処置する、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんが、副腎皮質がん、進行がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、脳のがん、乳がん、小児がん、原発不明のがん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸/直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭がんおよび下咽頭がん、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓がん、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭のがん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、成人軟部組織における肉腫、基底および扁平細胞皮膚がん、黒色腫、小腸がん、胃がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウイルムス腫瘍、がんの処置によって引き起こされる続発性がん、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項112に記載の方法。
- 前記組成物が、ポンプを備えるデバイス、パッチ、薬物リザーバー、短ニードルデバイス、単一ニードルデバイス、多ニードルデバイス、マイクロニードルデバイス、ジェット式注射デバイス、弾道的粉末/粒子送達デバイス、カテーテル、ルーメン、凍結プローブ、カニューレ、マイクロカニューレ、または熱、RFエネルギー、電流を利用するデバイス、あるいはこれらの任意の組合せによって投与される、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有効量が、約0.10mg/kg~約1,000mg/kgである、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトIL12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子であって、前記ポリヌクレオチドが、ヒトIL12Aポリペプチドに作動可能に連結されたヒトIL12BポリペプチドをコードするORFを含む、脂質ナノ粒子。
- 前記IL12Bポリペプチドが、ペプチドリンカーによって、前記IL12Aポリペプチドに作動可能に連結されている、請求項117に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記IL12Bポリペプチドが、前記IL12Aポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの5’末端に位置する、請求項117または118に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記IL12Aポリペプチドが、前記IL12Bポリペプチドまたは前記ペプチドリンカーの5’末端に位置する、請求項117または118に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ペプチドリンカーが、Gly/Serリンカーを含む、請求項117から120のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記Gly/Serリンカーが、(GnS)mを含み、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20であり、mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20である、請求項121に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記Gly/Serリンカーが、(GnS)mを含み、ここで、nは6であり、mは1である、請求項122に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ORFが、シグナルペプチドをコードする、請求項117から123のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記シグナルペプチドが、ヒトIL12Bシグナルペプチドである、請求項124に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ヒトIL12Bポリペプチドが、配列番号48のアミノ酸23~328に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項117から125のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ヒトIL12Aポリペプチドが、配列番号48のアミノ酸336~532に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項117から126のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ヒトIL12Bシグナルペプチドが、配列番号48のアミノ酸1~22に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項117から127のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ヒトIL12ポリペプチドが、配列番号48に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項117から128のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、miRNA結合部位を含む、請求項117から129のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記miRNA結合部位が、miR-122結合部位である、請求項130に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記miRNA結合部位が、miR-122-3pまたはmiR-122-5p結合部位である、請求項131に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記miRNA結合部位が、配列番号54に記載される配列を含むmiR-122-5p結合部位である、請求項132に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、3’UTRを含む、請求項117から133のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記3’UTRが、配列番号240に記載される配列を含む、請求項134に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記miRNA結合部位が、前記3’UTRに位置する、請求項134または135に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、5’UTRを含む、請求項136に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記5’UTRが、配列番号39に記載される配列を含む、請求項137に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、5’末端キャップ構造を含む、請求項117から138のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記5’末端キャップ構造が、Cap0、Cap1、ARCA、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、2-アジドグアノシン、Cap2、Cap4、5’メチルGキャップ、またはこれらの類似体である、請求項139に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、3’ポリA尾部を含む、請求項117から140のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号6に記載される配列を含む、請求項117に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号236または237に記載される配列を含む、請求項117に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシドを含むORFを含む、請求項117から143のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項144に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドが、N1-メチルシュードウリジンである、請求項145に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、約20~60%のイオン化可能アミノ脂質:5~25%のリン脂質:25~55%のステロール;および0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む、請求項117から146のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記脂質ナノ粒子が、約50%のイオン化可能アミノ脂質:10%のリン脂質:38.5%のコレステロール;および1.5%のPEG修飾脂質のモル比を含む、請求項117から147のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
- 前記イオン化可能アミノ脂質が、化合物18である、請求項148に記載の脂質ナノ粒子。
- 個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための医薬の製造における、請求項117から149のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子の使用であって、前記医薬が、前記脂質ナノ粒子および任意選択の薬学的に許容される担体を含み、前記処置が、前記医薬を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することを含む、使用。
- 請求項117から150のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子を含む医薬と、任意選択の薬学的に許容される担体と、前記医薬を、単独でまたはチェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示を含む添付文書とを含む、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のためのキット。
- 個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために第1の医薬および第2の医薬を投与することに関する指示を含む添付文書をさらに含む、請求項151に記載のキット。
- 個体におけるがんの処置またはその進行の遅延に使用するための、請求項117から149のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、任意選択の薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、前記処置が、前記脂質ナノ粒子を第2の組成物と組み合わせて投与することを含み、前記第2の組成物が、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 請求項117から149のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 前記脂質ナノ粒子が、腫瘍内投与のために製剤化されている、請求項154に記載の医薬組成物。
- 請求項154または155に記載の医薬組成物を含む容器と、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のための前記医薬組成物の投与に関する指示を含む添付文書とを含む、キット。
- 前記添付文書が、個体におけるがんの処置またはその進行の遅延のために、前記医薬組成物を、チェックポイント阻害剤ポリペプチドおよび任意選択の薬学的に許容される担体を含む組成物と組み合わせて投与することに関する指示をさらに含む、請求項156に記載のキット。
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