CN116648510A - 用于受调控基因治疗的病毒载体和核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及体细胞基因治疗的领域。本发明提供了这样的核酸构建体，其包含编码治疗性蛋白的转基因、四环素应答适体酶序列和反向末端重复序列(ITR)。核酸构建体可以病毒载体的形式，特别是腺相关病毒(AAV)载体的形式转移至有需要的受试者。Tet应答适体酶序列允许转基因在受试者中的严格控制表达，由此避免毒副作用。核酸构建体和包含其的病毒载体特别可用于增生性疾病如癌症的治疗。

Description

用于受调控基因治疗的病毒载体和核酸
发明领域
本发明一般涉及体细胞基因治疗领域。本发明提供了核酸构建体，其包含编码治疗性蛋白的转基因、四环素(Tet)应答适体酶序列和反向末端重复序列(ITR)。可以将核酸构建体以病毒载体，特别是腺相关病毒(AAV)载体的形式转移至需要编码的治疗性蛋白的受试者。Tet应答适体酶序列允许转基因在受试者中严格受控的表达，从而避免治疗性蛋白的毒副作用。核酸构建体和包含其的病毒载体特别可用于治疗增生性疾病，如癌症。
发明背景
使用重组第一代腺相关病毒(AAV)载体的临床试验通过实现重要的里程碑，例如第一个市场批准的基于AAV的疗法，已经为基因治疗的进一步发展做出了重大贡献(Russell等人2017；Jiang等人2018；Kumar等人2016)。同时，这些试验鉴定了载体元件，所述载体元件的优化例如通过工程化载体衣壳和启动子/增强子元件有可能进一步提高功效、组织特异性和安全性(Grimm & Büning，2017；Sarcar等人2019)。将下一代基因治疗扩展到遗传性罕见疾病领域之外来治疗获得性疾病和更大的患者群体的愿望进一步加强了各个方法。为了解决潜在的安全问题并考虑患者疾病生物学和治疗反应的自然变异性，基因治疗载体的特别理想的特征将是允许控制和精确诱导基因表达的系统。
具体而言，设想患者能够通过暂时摄入小分子药物来开启AAV递送治疗剂的表达。这种基于AAV的治疗系统如图1所示。从概念上讲，这样的系统将允许根据个体患者的需要微调表达水平，改善具有狭窄治疗窗口的转基因的安全性概况，或提供安全开关以减轻针对外来治疗蛋白的不想要的免疫反应的风险。
高度期望实现可控的基因表达，如最近已经研究的不同基于蛋白的系统证明了这一点，包括作为最先进方法的不稳定结构域和诱导型启动子(Santiago等人2018；Barrett等人2018)。这些转录控制系统，包括Rheoswitch系统、米非司酮(Mifepristone)和经典的Tet-ON/OFF启动子系统，都有共同的缺点：需要表达DNA结合蛋白，这些蛋白在被其同源配体激活后能够进行转录(Chiocca等人，2019；Wang等人，2004；Gonzalez-Aparicio等人，2011；Vanrell等人，2011；Das等人，2016)。这些DNA结合蛋白通过代表T细胞表位而携带免疫原性风险。尝试通过工程化没有HLA0201(最常见的人类HLA血清型)的某些T细胞表位的版本来解决Tet启动子控制系统的这个问题，揭示如果这即使是可能的-因为蛋白仍然必须保持与Tet阻遏物和四环素两者的特异性结合-仍然会有具有其他血清型的其他人，其可能仍会呈现来自所得蛋白的表位，因为对这种外来蛋白没有免疫耐受性(Ginhoux等人，2004)。这些数据显示，为了实现基因治疗技术的全部潜力，需要具有宽动态范围的遗传开关，其控制转基因表达而不需要需要额外的蛋白成分。
在该背景下，所谓的人工核糖开关(riboswitch)已经被描述为基因表达控制系统的有吸引力的建造模块，其独立于共表达的调节蛋白或融合的不稳定蛋白结构域起功能。人工核糖开关(或适体酶)是配体结合RNA适体和核酶的DNA可编码融合体，其能够通过条件性mRNA自切割来控制信使RNA(mRNA)的完整性。如图1所示，当置于表达构建体的5′-或3′-非翻译区(UTR)时，自催化核酶自切割分别导致5′-帽或3′-poly(A)尾丢失，由此诱导mRNA降解和基因表达的关闭。核酶切割的变构控制是通过将核酶融合到适体结构域来实现的，其结构重排在其同源配体结合后改变了全局核糖开关结构。这阻止其自切割的能力，由此实现基因表达(“ON-开关”类型)。天然存在的细菌、植物或病毒衍生的核糖开关通过聚合酶、核糖体或剪接活性的空间位阻响应细胞信号来控制内源基因表达(Berens等人2015)。因此，工程化核糖开关代表了合成生物学的主要实例，即治疗应用的天然发生机制的优化和重新利用(& Fussenegger，2013；Kitada等人，2018)。
使用茶碱、四环素(Tet)、鸟嘌呤或蛋白应答锤头或基于丁型肝炎病毒(HDV)的核糖开关，细胞培养中的主要功能性已得到证实，仍然主要使用OFF-开关(Kumar等人2009；Ketzer等人2012；Ketzer等人2014；Nomura等人(2013)；Wei & Smolke，2015；Bloom等人2015；Kennedy等人2014)。相反，对动物中核糖开关功能的探索却很少。小鼠中的一项早期研究显示RNA结合化合物对核酶的直接(即非变构)抑制作用(Yen等人2004)。另一项证明了移植到小鼠体内后离体操纵细胞中核糖开关介导的转基因调节(Chen等人2010)。在病毒载体的背景下，先前显示装配有鸟嘌呤-HDV开关的重组AAV载体在没有外源性鸟嘌呤的情况下允许在小鼠中实现稳健的基因表达，所述重组AAV载体能够在体外有条件地关闭多种基因的表达(Strobel等人2015b)。此外，一项近期研究证明在小鼠的腓肠肌中，AAV介导的报告基因表达具有大约七倍的Tet-核糖开关介导的下调(Zhong等人2016)。还报道了通过使用空间阻断反义寡核苷酸导致转基因表达的ON方式，在工程化AAV递送的适体酶的背景下对自切割活性的严格调节(Zhong等人，2020)。然而，与小分子配体相比，反义寡核苷酸的生物利用度差阻碍了这种方法的通用性。
尽管配体诱导的基因表达抑制原则上可能作为安全开关得到应用，例如在溶瘤治疗中，但对于许多治疗应用而言更具吸引力的选择是仅响应配体诱导治疗性基因表达的能力。然而，迄今为止唯一可用的基于病毒载体和ON-核糖开关的研究取得了非常有限的效果，即在小鼠眼中至多诱导了两倍的GFP表达(Reid等人2018)，但与体内基线水平相比，只有3×-L2Bulge18tc核糖开关证明GFP表达显著增加(2倍)(p＜0.05，配对检验)。WO2018/165536描述了K19在细胞培养中的作用，参见图10和可能错误地参考了图9B-D而不是图10B-D的[0137]。
总而言之，需要临床适用的诱导系统来满足高效、非免疫原性、小型和转基因非依赖性的期望标准。优选地，该系统应提供涵盖广泛范围的治疗性蛋白表达的表达诱导，即理想地0-100％的常规、无核糖开关构建体。此外，它应该可以通过配体剂量调整来微调表达水平。最后，它应该允许重复的ON和OFF切换。
发明概述
本发明提供了核酸构建体和病毒载体，其包含转基因和允许转基因受控表达的四环素应答适体酶。四环素应答适体酶优选是先前Beilstein等人2015描述的适体酶“K19”。适体酶包含四环素适体(Berens等人2001)和来自曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的全长锤头状核酶N79(Yen等人2004)。已在本文中发现，当用于表达盒并由病毒载体如AAV载体递送时，K19适体酶通过在动物体内提供或收回四环素而有效地控制和剂量依赖性地诱导AAV介导的转基因表达。
在本发明之前，Tet应答适体酶在真核生物中的治疗应用性受到以下因素的阻碍：(a)缺乏足够的表达诱导来覆盖广泛范围的治疗性蛋白表达，即理想地0-100％的常规、无核糖开关构建体；(b)缺乏配体剂量依赖性来微调体内治疗性蛋白表达水平，和(c)不确定这种方法是否也允许重复的ON和OFF切换。本发明已克服了这些障碍。
如下所述，K19 Tet核糖开关的功能性在本文中首先在不同细胞培养物中的AAV载体表达盒的背景下建立，探索不同设计的效力和可诱导性的时间顺序方面。在对Tet进行体内药代动力学(PK)研究后，通过双体类型的肝脏限制性工具抗体和普遍表达的细胞荧光素酶的同时AAV介导分泌，研究了小鼠的肝脏、肺、肌肉和心脏中的核糖开关性能。令人惊讶地发现，K19核糖开关构建体通过施用或收回Tet治疗以剂量依赖性和高度动态的方式重复诱导报告抗体表达。K19 Tet RNA开关构建体随后用治疗相关的单链IL-12基因进行测试，能够表达完全生物活性的IL-12。体外Tet诱导的IL-12水平和背景水平与鼠和人类单链IL-12相当。令人惊讶的是，Tet诱导的IL-12水平范围和系统渗漏与体内观察到的报告基因数据相似。在全身递送亲肝AAV后的肝脏靶向后，单次Tet应用诱导的IL-12血浆水平在24小时内增加并降至基线。可在第一次攻击后9天通过Tet再攻击重复IL-12诱导，并产生具有临床意义的细胞因子水平而无毒性。在幼稚小鼠中单独组的药代动力学(PK)和安全性实验中，我们成功地滴定了AAV载体剂量，使得连续五天每天两次Tet应用导致安全和持续的可诱导IL-12表达。相反，在未接受Tet的载体剂量匹配动物中检测不到IL-12。然后应用相同的治疗方案来研究肝细胞癌(HCC)模型中局部和可诱导IL-12免疫疗法的药代动力学和药效动力学(PK/PD)。我们在荷瘤小鼠和幼稚小鼠中观察到可诱导IL-12的可比较PK，并记录了几乎完全的缓解，这与肿瘤结节中的T细胞流入相符合。
因此，本发明的核酸构建体和病毒载体允许通过在核糖开关背景下调整Tet配体的剂量来微调体内治疗性蛋白的表达水平。此外，在AAV介导的基因递送之后，适体酶介导的对转基因表达的控制能够重复，即动态的ON-OFF切换。这使得本发明的核酸构建体和病毒载体特别适用于临床环境，因为该系统可以重复开启直到肿瘤完全缓解，以及在肿瘤复发的情况下，甚至在系统递送后几个月也是如此。
附图简述
图1显示了适体酶核糖开关作为基因治疗的基因表达控制系统的作用模式。左图：当在表达构建体的3′-UTR中编码时，核糖开关自切割导致poly(A)尾丢失，其触发mRNA降解，由此阻止蛋白翻译(OFF状态)。在通过其适体结构域结合同源配体后，核糖开关会发生构象变化，其阻止自切割活性。因此，mRNA保持完整并被翻译成蛋白(ON状态)。右图：患者接受重组AAV基因治疗载体，该载体编码受核糖开关控制的目的治疗基因(GOI)。在没有核糖开关配体的情况下，由于核糖开关自切割活性，表达被关闭或降低到基础水平。在摄入表达诱导药物后，基因表达被暂时诱导。通过调整药物剂量，可以微调表达水平，例如，根据个体患者的需要增加治疗性表达(如所示)或降低表达水平以减轻与狭窄的治疗窗口相关的风险或靶向治疗性蛋白的免疫反应。
图2显示了K19核糖开关功能在细胞系统中的评估。(a)eGFP表达构建体的示意图设计，所述构建体在5′-或3′-非翻译区(UTR)内的不同位置携带四环素(Tet)应答核糖开关。(b)在加入Tet后24小时通过直接荧光测量评估的用(a)中所示的表达构建体转染的HEK-293细胞中，eGFP表达的Tet剂量依赖性诱导。还通过(c)荧光显微镜和成像以及(d)用于选定构建体的蛋白印迹评估了调节。(e)HEK-293细胞中sNLuc表达的Tet剂量依赖性诱导。inact＝无活性、非裂解核酶对照；act＝活性核酶。Vinc＝纽蛋白(vinculin)。N＝3次生物学重复。代表性图像显示在(c)中。均值±SD。
图3显示了细胞系统中K19核糖开关动力学的数据。(a)用携带活性或无活性K19开关的质粒转染HEK-293细胞，并在加入50μM Tet以诱导eGFP表达之前温育24小时。随着时间的推移，通过qPCR在mRNA水平上以及通过直接GFP荧光检测和蛋白印迹监测诱导。(b)在用携带活性K19核糖开关的sNLuc表达质粒转染HEK-293细胞后24小时，用不含Tet或含有Tet的培养基替换培养基，并在细胞上清液中测量sNLuc诱导。通过qPCR进一步监测表达变化长达8小时(虚线)。(c)在Tet存在下转染和生长后24小时，将培养基更换为不含Tet或含有Tet的培养基，并在上清液中并通过qPCR在mRNA水平上测量sNLuc的相对减少(虚线)。inact＝无活性、非裂解核酶对照；act＝活性核酶。Vinc＝纽蛋白。N＝3次生物学重复(b，c)。(a)显示了三次相似研究中一项代表性的实验，其具有N＝3个样本重复。均值±SD。**p＜0.01；***p＜0.001。
图4总结了通过HPLC-MS/MS测量的四环素24小时药代动力学的结果。(a)小鼠通过腹膜内(i.p.)施用接受54mg/kg Tet-HCl，并随时间测量Tet血浆浓度。插图：对数刻度和计算的Tet消除半衰期。(b)腹膜内施用54mg/kg Tet后2小时测定Tet血浆和组织暴露。(c)中描绘了相对于血浆暴露的组织暴露水平。(d)基于来自(a)的24小时PK数据，每天三次(8小时间隔)腹膜内给药100mg/kg Tet的PK非参数建模。实线：均值，点划线(dotted lines)：SD；虚线：7μM(＝近似谷水平)。N＝3只动物；均值±SD。
图5显示了来自确定小鼠肝脏、心脏、肌肉和肺中K19核糖开关功能性的结果。(a)AAV载体表达盒设计和实验设置。小鼠以每个载体5x1010vg/小鼠的剂量接受介导肝脏导向抗FITC scFv抗体(aFITC)表达的AAV9和编码细胞普遍表达的纳米荧光素酶(cNLuc)的AAV9的混合物。在指定的时间点进行100mg/kg Tet或媒介物处理和血液(B)血浆取样，其中血浆总是在Tet施用前立即取样。在研究结束时制备组织(T)裂解物。(b)添加Tet后24小时，转染的HepG2细胞中aFITC和cNLuc表达的Tet剂量依赖性诱导。(c)与媒介物处理相比，随着时间的推移在血浆样品中重复Tet给药后测量的aFITC表达诱导。(d)在研究结束时测量的肝酶AST、ALT和GLDH的血浆活性。(e)在研究结束时获得的组织裂解物中测量的cNLuc报告子表达的Tet依赖性诱导。(f)在用递增量的CMV-或LP1-aFITC质粒构建体转染并用50μM Tet进行条件刺激的HepG2细胞中的aFITC表达。描绘了Tet刺激后表达的倍数变化。以虚线框标记的数据在(g)中并排比较。inact＝无活性、非裂解核酶对照；act＝活性核酶。N＝3次生物学重复(b)；N＝8只动物(c、d、e)，除了未经处理的动物(N＝5)；N＝6次重复(f、g)。平均值±SD(b、d、e、f、g)或SEM(c)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，如所示或相对于媒介物。
图6描述了来自评估K19核糖开关诱导的表达水平相对于常规构建体的结果。(a)AAV载体表达盒设计和实验设置。(b)小鼠接受5x1010vg的AAV9-LP1-aFITC载体，其携带或不携带K19核糖开关。静脉内施用AAV后两周，小鼠接受单次100mg/kg剂量的Tet(箭头)，并在24小时的时间范围内测量aFITC血浆水平。显示了绝对aFITC水平和相对于媒介物处理的表达倍数变化。n＝4只动物/组。均值±SEM；*p＜0.05，***p＜0.001，如所示或相对于媒介物。
图7说明小鼠中剂量依赖性、重复诱导和PK/PD关系的结果。(a)AAV载体表达盒设计和实验设置。小鼠接受5x1010vg的AAV9-LP1-aFITC载体，其含有或缺少K19核糖开关。在AAV施用和基线取样后两周，施用Tet(3、10、30、90mg/kg)或媒介物，并随时间的推移测量血液(B)血浆样品中的aFITC表达。第一次Tet处理后一周，小鼠接受第二次剂量以重新诱导表达。在Tet处理的时间点，在Tet施用前立即进行血浆采样。(b)随着时间的推移在血浆样品中测量aFITC表达诱导，其描述为相对于无核糖开关的对照构建体的表达(上图)和相对于媒介物处理检测到的平均表达的表达倍数变化(下图)。(c)在研究结束时在肝组织中检测的相对于媒介物处理(左图)和相应的AAV载体基因组(右图)的基于qPCR的aFITC mRNA表达的测量。(d)在研究结束时测量的肝酶AST、ALT和GLDH的血浆活性。(e)随着时间推移的总Tet血浆浓度。(f)依据施用后4小时检测的Tet血浆暴露的Tet施用后8小时核糖开关诱导的aFITC表达。使用GraphPad Prism生成三参数“激动剂相对于应答(Agonist vs.response)”曲线拟合。LLOQ＝定量的下限。箭头描绘Tet施用的时间点。N＝8只动物/组，未经处理的动物除外(N＝5)。均值±SD(c、d)或SEM(b)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，如所示或相对于媒介物。
图8显示了在活性(mIL-12_switch_active)或无活性核糖开关(mIL-12_switch_inactive)的控制下用携带鼠类IL-12(mIL-12)序列的AAV9转导的人肝细胞系(Hep G2)中mIL-12的体外诱导。用四环素刺激后，活性开关诱导mIL-12产量增加6.4倍，达到由无活性开关介导的组成型活性表达水平的19％。N＝3次生物学重复。均值±SD。
图9给出了体内mIL12表达研究设计的概述。总共23只雌性C57Bl/6小鼠通过静脉内施用接受了NaCl或5x109或5x1010或5x1011个载体基因组(vg)的AAV9载体，该载体携带在肝脏特异性LP1启动子控制下具有无活性开关的构建体，(mIL-12_switch_inactive)。每天监测动物的体重以计算体重减轻。在实验结束时，收集血浆和肝脏样品用于测量全身IL-12水平和免疫细胞流入肝脏的组织学分析。
图10描述了mIL-12表达研究期间动物体重的变化，以每组平均值给出。由于体重减轻，实验不得不在不同的时间点停止；即第4组为第7天(接受5x1011vg)，第3组为第9天(接受5x1010vg)和第1组(媒介物)和第2组(接受5x1009vg)的其余动物为第11天。
图11显示表达研究中获得的mIL-12水平与施用载体的剂量成比例增加。在施用AAV9载体mIL-12_switch_inactive后测量血浆中鼠IL-12的水平。在研究结束时(第7、9、11天)收集血液，并在图中显示血液采样的各个日期。通过穿刺麻醉动物的球后窦收集血浆，并通过电化学发光多重测定法测量鼠IL-12。数据以均值±SD呈现。
图12给出了四环素诱导的mIL-12体内时程研究的设计的概述。总共25只雌性C57Bl/6小鼠接受NaCl(第1组)、5x109载体基因组(vg)的mIL-12_switch_inactive载体(第2组)、5x109vg的mIL-12_switch_active载体(第3组)、5x109vg mIL12_switch_active载体+10mg/kg四环素或5x109vg mIL-12_switch_active载体+30mg/kg四环素。各AAV9载体在第0天静脉内施用，四环素给药两次；在第5天和第14天，两个四环素应用时间点都标记为t＝0h。每天监测动物的体重以计算体重减轻。在第14天，即第二次四环素施用后8小时处死动物。在实验结束时，收集血浆和肝组织样品用于测量鼠IL-12水平和分析肝组织中的载体基因组。
图13描绘了(a)在研究结束时收集的血浆中测量的四环素水平和(b)在从匀浆肝组织中提取并通过qPCR定量的DNA中测量的病毒基因组。数据以均值±SD呈现。****p＜0.001，如所示。
图14说明了所处理的动物体重发育的纵向变化。仅用5x109AAV9_LP1_muIL12_inactive载体的处理，诱导IL-12的恒定表达，导致体重减轻。在第11天，三只动物不得不从研究中排除，因为它们显示最低的体重。因此，第2组在实验过程中显示体重持续下降，但是，由于排除了体重最低的三只动物，这在第11天后第2组的曲线中没有反映出来。
图15显示通过电化学发光多重测定测量在血浆中测量的四环素诱导的IL-12p70表达的时间依赖性诱导。(a)用5x109AAV9_LP1_muIL12_switch_inactive载体(具有组成型表达IL-12的无活性开关的载体)处理的第2组，随着时间推移显示IL-12持续增加。(b)描绘了在实验的最后一天，第14天，第二次四环素施用后8小时所有组的IL-12水平。水平显示，与未接受四环素的第3组相比，用30mg/kg四环素激活开关诱导IL-12增加4.7倍。(c)施用四环素后与时间点相关的IL-12水平，以mIL12相对于时间的倍数变化给出。*p＜0.05，***p＜0.001，相对于所示组。数据以均值±SD呈现。
图16说明了不同剂量的AAV9诱导mIL-12未经调节的表达的作用。(a)体内mIL-12表达研究的设计。小鼠接受5x1011或5x1010或5x109载体基因组(vg)的AAV9载体、或缓冲液的静脉注射，所述AAV9载体携带具有在肝脏特异性LP1启动子的控制下无活性K19开关的鼠IL-12构建体。(b)每天监测动物以计算体重变化。(c)在每组实验结束时，收集血浆样品用于测量IL-12水平。由于体重减轻，实验不得不在不同的时间点停止；即第4组为第7天(接受5x1011vg)，第3组为第9天(接受5x1010vg)，第1组(对照缓冲液)和第2组(接受5x109vg)的其余动物为第11天。在研究结束时(第7、9、11天)通过穿刺麻醉动物的球后窦收集血液，并通过电化学发光多重测定法测量IL-12。数据以均值±SD呈现。n＝6只动物/组。
图17描述了Tet诱导的mIL-12表达的PK研究。(a)小鼠接受5x109载体基因组的AAV9-LP1-mIL-12-inactive-switch、AAV9-LP1-mIL-12-switch+30mg/kg Tet、AAV9-LP1-mIL-12-switch+10mg/kg Tet、AAV9-LP1-mIL-12-switch+0mg/kg Tet或缓冲液。在第0天静脉内施用各AAV9载体。Tet给药两次：第5天和第14天，Tet应用时间点t＝0h。在第14天，即Tet施用后8小时将动物安乐死。在实验结束时，收集血浆和肝组织样品用于测量鼠IL-12水平和分析肝组织中的载体基因组。(b)在从匀浆肝组织中提取的DNA中测量病毒基因组，并通过qPCR定量。(c)在研究结束时测定Tet血浆浓度。(d)通过电化学发光多重测定法测量血浆中IL-12表达的Tet依赖性诱导。IL-12的水平与Tet施用后的时间点相关，以IL-12与没有Tet的IL-12水平相比的倍数变化给出。(e)在第14天，即实验的最后一天，在Tet再次攻击后8小时时所有组的IL-12。与接受相同载体剂量但未接受Tet的组相比，使用30mg/kg Tet的诱导诱导了IL-12增加4.7倍。(f)接受5x109vg AAV9-LP1-mIL-12-inactive-switch的小鼠中的IL-12PK在第2天显示IL-12表达快速开始，其到第14天达到平台期。n＝5只动物/组。
图18描述了确定PK和安全性的剂量探索研究。(a)AAV载体表达盒设计和实验设置；在实验开始时，所有小鼠都接受了5x109vg的AAV9-LP1-mIL-12-switch_inactive(*)、5x109vg、5x108vg、5x107的AAV9-LP1_mIL-12_switch_active、5x109vg的AAV9-LP1-aFITC-switch-active或盐水缓冲液的静脉内应用。从第7天到第11天，指定组(+Tet)每天两次静脉内给予30mg/kg的Tet。在第7、11、14天和实验的最后一天第21天收集血液(B)。(b)经处理动物体重发展的纵向变化。在(c)第7天、(d)第9天和(e)第14天的IL-12测量。在研究结束时测量的肝酶(f)AST、(g)ALT和(h)GLDH的血浆活性。n＝4-5只动物/组。(i)第14天血浆中IFNγ水平的测量。LLOD＝检测下限，+＝动物在采血前被安乐死，或由于道德原因没有采集样品。
图19描述了荷瘤小鼠的剂量探索研究。(a)AAV载体表达盒设计和实验设置。在实验开始时所有小鼠均通过脾内应用接受Hepa1-6肿瘤细胞。在第2天，所有小鼠都接受5x109vg的AAV9-LP1-mIL-12-inactive-switch、5x109vg或5x108vg的AAV9-LP1-mIL-12-switch、缓冲液或5x109vg的AAV9-LP1-aFITC-switch(作为AAV对照)的静脉内应用。从第7天到第11天，在指定组(+Tet)中每天两次腹膜内给予30mg/kg的Tet。在第7、11、14天和第18天(实验的最后一天)收集血液(B)。(b)在从匀浆肝组织中提取的DNA中测量病毒基因组，并通过ddPCR进行定量。(c)实验过程中IL-12的水平。显示了接受5x108vg的AAV9-LP1-IL-12-switch的两组在有和没有Tet诱导的情况下的倍数增加。(d)在实验的最后一天评估的荧光素酶信号的全身图像，以及荧光素酶活性的定量分析。(e)第18天动物的肝脏重量。在研究结束时测量的肝酶(f)AST、(g)ALT和(h)GLDH的血浆活性。n＝4-12只动物/组。
图20描绘了来自图19中所示实验的荷瘤小鼠的肝脏的免疫组织化学染色。(a)所有动物的苏木精(细胞核)和CD45染色的肝切片的代表性图像以及CD45+肝面积的定量。(b)所有动物的苏木精和伊红(H&E)染色肝切片的代表性图像和肝肿瘤区域的定量。N＝11-12只动物/组，比例尺代表500μm，所有图片都是在相同的放大倍数下拍摄的。
图21说明了体外人IL-12的Tet依赖性诱导。用LP1启动子驱动的人IL-12(hIL-12)表达质粒转染HEK293，该质粒具有活性或无活性核糖开关(pLP1-hIL-12-switch或pLP1-hIL-12-inactive-switch)。添加Tet后，对于pLP1-hIL-12-switch，IL-12的产量增加了5.6倍，并达到pLP1-hIL-12-inactive-switch组成型活性表达水平的25％。N＝3个生物学重复，均值表示为±SD。
图22显示了人和小鼠IL-12构建体的生物活性。该实验是用p35-接头-p40和p40-接头-p35方向的IL-12进行的。用小鼠IL-12或人IL-12表达质粒转染HEK293细胞，并在HEK-BlueTM IL-12细胞上测试上清液。可以证实，单链IL-12的p40-接头-p35和p35-接头-p40方向都会产生生物活性IL-12。
图23显示了所用质粒的子序列，特别是ITR之间的区域。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及核酸构建体，其包含(i)编码一种或多种治疗性蛋白的转基因，(ii)至少一个四环素应答适体酶序列，和(iii)反向末端重复序列(ITR)。核酸构建体可包含RNA或DNA或由其组成。优选地，核酸构建体将包含DNA或由DNA组成。该构建体可以是线性或环状形式，例如质粒的形式。在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含单链或双链DNA或由其组成。在特别优选的实施方案中，本发明的核酸构建体由单链DNA组成。
本发明的核酸构建体包含编码一种或多种治疗性蛋白的转基因。如本文所用，治疗性蛋白包括在施用后对患有疾病或病况的患者发挥治疗益处的所有类型的蛋白。治疗性蛋白包括在其翻译后立即具有活性的蛋白，以及首先以无活性形式产生并在被蛋白酶或肽酶切割后被激活的蛋白，例如产生的具有信号肽的蛋白。优选地，转基因编码哺乳动物蛋白，更优选人类蛋白。该蛋白具有治疗活性，这意味着它向受试者的递送有效地降低或抑制了疾病或病理状况的严重性。优选地，治疗活性蛋白是这样的蛋白，其在受试者中的组成型表达会导致毒性或其他显著副作用，因此需要严格控制表达。由蛋白表达引起的毒性和其他显著副作用可能包括由强烈和持续激活免疫反应引起的严重病况，包括恶病质、发烧、发冷、疲劳、关节痛(arthromyalgia)和/或头痛。
在本发明的优选实施方案中，转基因编码一种或多种免疫调节蛋白。本公开意义上的免疫调节蛋白包括但不限于抗体，例如易普利姆玛或抗PD1抗体、抗体片段、细胞因子，例如白细胞介素、干扰素、淋巴因子，以及肿瘤坏死因子(TNF)/肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的促炎和促凋亡成员。还包括T细胞接合剂、免疫检查点抑制剂、激动剂，例如上述任意抗CD137、抗CD28或抗CD40组合。在优选的实施方案中，由转基因编码的免疫调节蛋白是选自IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-23、IL-27和IL-33的白细胞介素。特别优选的是，本发明构建体中的免疫调节蛋白是IL-12，优选人IL-12。
已知IL-12在调节先天性和适应性免疫反应中起重要作用。除了诱导有效的抗癌作用外，它还与其他几种细胞因子协同作用用于增加的免疫调节活性。IL-12的基因转移将避免因暴露于大剂量的重组细胞因子蛋白而引起的安全问题。如果编码IL-12的基因被局部递送，则有可能在所需组织中达到有益的浓度，同时减少全身暴露，从而减少毒性(Berraondo等人，2018；Chiocca等人，2019)。使用具有组织嗜性的基因穿梭物的矢量化IL-12递送使得能够全身传递，然后局部产生IL-12，并以旁分泌方式吸引和激活T细胞。IFNγ通过改变肿瘤微环境传递IL-12的有益抗肿瘤作用。然而，IFNγ也是IL-12毒性作用的主要介质，并且随着时间的推移，会启动免疫调节机制，例如PD-L1和IDO-1表达，其介导对免疫疗法的适应性抵抗(Berraondo等人，2018)。因此，遗传编码的、可调节的IL-12表达是非常有益的，因为它也间接控制从自然杀伤细胞释放IFNγ的水平。
天然IL-12是异二聚体蛋白，其由一个p35亚基(α链)和一个p40亚基(β链)组成。这两个亚基通过二硫键共价连接，并形成具有生物活性的70kDa二聚体。已经通过使用内部核糖体进入位点(IRES)的双顺反子表达或通过单独表达两个亚基来实现产生活性IL-12所需的α和β链的同时表达。然而，IRES策略导致各个亚基的不相等表达，导致对显示抑制性p70信号传递的p40同源二聚体偏向。此外，需要所有必要顺式作用模块的两个完整表达盒超出了AAV的包装限制。因此，出于研究目的，优选在小鼠中表达与mIL-12.p40.Δp35相同的生物活性单链鼠IL-12融合蛋白序列，如Lieschke等人所述(以下为mIL-12)。在该构建体中，p40亚基通过(Gly-Ser)接头连接至前22个氨基酸缺失的p35亚基。也已报道，具有p40-G6S-p35构象的类似人IL-12融合蛋白具有高体外生物活性(Lieschke等人，1997；Zhang等人，2011)。为了在人类细胞中使用，例如在细胞组织或人类个体中，可以使用并且在本文中优选人类来源的相应蛋白(表示为“hIL-12”，参见例如SEQ ID No.6)。人IL-12对小鼠细胞没有交叉反应。因此，mIL-12用于下述小鼠实验(对于成熟序列参见SEQ ID No.12，具有信号肽的前体序列由Seq ID NO：11编码，对于质粒中位于ITR侧翼的区域参见SEQ ID NO：29)。人IL-12可以相应地用于人组织，作为在人组织中起作用的单链IL-12的实例。术语单链IL-12应意指IL-12异二聚体的功能由一个融合蛋白实现。
在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码单链IL-12的转基因。优选的是，对于单链IL-12，满足条件(A)至(AAAAA)中的一个或多个：
(A)单链IL-12显示与以下的至少80％的序列同一性
i.在SEQ ID No.1的长度上的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或
ii.在SEQ ID No.2的长度上的SEQ ID No.2的氨基酸序列，或
iii.在SEQ ID No.3的长度上的SEQ ID No.3的氨基酸序列，或
iv.在SEQ ID No.4的长度上的SEQ ID No.4的氨基酸序列，或
v.在SEQ ID No.5的长度上的SEQ ID No.5的氨基酸序列，或
vi.在SEQ ID No.6的长度上的SEQ ID No.6的氨基酸序列，或
vii.在SEQ ID No 34的长度上的SEQ ID No 34的氨基酸序列，或
viii.在SEQ ID No 35的长度上的SEQ ID No 35的氨基酸序列，或
ix.在SEQ ID No 36的长度上的SEQ ID No 36的氨基酸序列，或
x.在SEQ ID No 37的长度上的SEQ ID No 37的氨基酸序列，或
xi.在SEQ ID No 38的长度上的SEQ ID No 38的氨基酸序列，或
xii.在SEQ ID No 39的长度上的SEQ ID No 39的氨基酸序列，或
xiii.在SEQ ID No 40的长度上的SEQ ID No 40的氨基酸序列，或
xiv.在SEQ ID No 41的长度上的SEQ ID No 41的氨基酸序列。
(AA)单链IL-12显示与以下的至少90％的序列同一性
i.在SEQ ID No.1的长度上的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或
ii.在SEQ ID No.2的长度上的SEQ ID No.2的氨基酸序列，或
iii.在SEQ ID No.3的长度上的SEQ ID No.3的氨基酸序列，或
iv.在SEQ ID No.4的长度上的SEQ ID No.4的氨基酸序列，或
v.在SEQ ID No.5的长度上的SEQ ID No.5的氨基酸序列，或
vi.在SEQ ID No.6的长度上的SEQ ID No.6的氨基酸序列。
vii.在SEQ ID No 34的长度上的SEQ ID No 34的氨基酸序列，或
viii.在SEQ ID No 35的长度上的SEQ ID No 35的氨基酸序列，或
ix.在SEQ ID No 36的长度上的SEQ ID No 36的氨基酸序列，或
x.在SEQ ID No 37的长度上的SEQ ID No 37的氨基酸序列，或
xi.在SEQ ID No 38的长度上的SEQ ID No 38的氨基酸序列，或
xii.在SEQ ID No 39的长度上的SEQ ID No 39的氨基酸序列，或
xiii.在SEQ ID No 40的长度上的SEQ ID No 40的氨基酸序列，或
xiv.在SEQ ID No 41的长度上的SEQ ID No 41的氨基酸序列。
(AAA)单链IL-12显示与以下的至少95％的序列同一性
i.在SEQ ID No.1的长度上的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或
ii.在SEQ ID No.2的长度上的SEQ ID No.2的氨基酸序列，或
iii.在SEQ ID No.3的长度上的SEQ ID No.3的氨基酸序列，或
iv.在SEQ ID No.4的长度上的SEQ ID No.4的氨基酸序列，或
v.在SEQ ID No.5的长度上的SEQ ID No.5的氨基酸序列，或
vi.在SEQ ID No.6的长度上的SEQ ID No.6的氨基酸序列，或
vii.在SEQ ID No 34的长度上的SEQ ID No 34的氨基酸序列，或
viii.在SEQ ID No 35的长度上的SEQ ID No 35的氨基酸序列，或
ix.在SEQ ID No 36的长度上的SEQ ID No 36的氨基酸序列，或
x.在SEQ ID No 37的长度上的SEQ ID No 37的氨基酸序列，或
xi.在SEQ ID No 38的长度上的SEQ ID No 38的氨基酸序列，或
xii.在SEQ ID No 39的长度上的SEQ ID No 39的氨基酸序列，或
xiii.在SEQ ID No 40的长度上的SEQ ID No 40的氨基酸序列，或
xiv.在SEQ ID No 41的长度上的SEQ ID No 41的氨基酸序列。
(AAAA)单链IL-12显示与以下的至少98％的序列同一性
i.在SEQ ID No.1的长度上的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或
ii.在SEQ ID No.2的长度上的SEQ ID No.2的氨基酸序列，或
iii.在SEQ ID No.3的长度上的SEQ ID No.3的氨基酸序列，或
iv.在SEQ ID No.4的长度上的SEQ ID No.4的氨基酸序列，或
v.在SEQ ID No.5的长度上的SEQ ID No.5的氨基酸序列，或
vi.在SEQ ID No.6的长度上的SEQ ID No.6的氨基酸序列。
vii.在SEQ ID No 34的长度上的SEQ ID No 34的氨基酸序列，或
viii.在SEQ ID No 35的长度上的SEQ ID No 35的氨基酸序列，或
ix.在SEQ ID No 36的长度上的SEQ ID No 36的氨基酸序列，或
x.在SEQ ID No 37的长度上的SEQ ID No 37的氨基酸序列，或
xi.在SEQ ID No 38的长度上的SEQ ID No 38的氨基酸序列，或
xii.在SEQ ID No 39的长度上的SEQ ID No 39的氨基酸序列，或
xiii.在SEQ ID No 40的长度上的SEQ ID No 40的氨基酸序列，或
xiv.在SEQ ID No 41的长度上的SEQ ID No 41的氨基酸序列。
(AAAAA)单链IL-12显示与以下的100％序列同一性
i.在SEQ ID No.1的长度上的SEQ ID No.1的氨基酸序列，或
ii.在SEQ ID No.2的长度上的SEQ ID No.2的氨基酸序列，或
iii.在SEQ ID No.3的长度上的SEQ ID No.3的氨基酸序列，或
iv.在SEQ ID No.4的长度上的SEQ ID No.4的氨基酸序列，或
v.在SEQ ID No.5的长度上的SEQ ID No.5的氨基酸序列，或
vi.在SEQ ID No.6的长度上的SEQ ID No.6的氨基酸序列。
vii.在SEQ ID No 34的长度上的SEQ ID No 34的氨基酸序列，或
viii.在SEQ ID No 35的长度上的SEQ ID No 35的氨基酸序列，或
ix.在SEQ ID No 36的长度上的SEQ ID No 36的氨基酸序列，或
x.在SEQ ID No 37的长度上的SEQ ID No 37的氨基酸序列，或
xi.在SEQ ID No 38的长度上的SEQ ID No 38的氨基酸序列，或
xii.在SEQ ID No 39的长度上的SEQ ID No 39的氨基酸序列，或
xiii.在SEQ ID No 40的长度上的SEQ ID No 40的氨基酸序列，或
xiv.在SEQ ID No 41的长度上的SEQ ID No 41的氨基酸序列。
对于(A)至(AAAAA)的每种情况，优选的是单链IL-12对在(iii)或(iv)中指定的参考序列显示所述同一性水平。更优选地，单链IL-12分别在SEQ ID 3和4的全长上对根据SEQID No.3的序列和根据SEQ ID No.4的序列显示所述同一性水平。
优选地，单链IL-12包含选自SEQ ID No.1、2、3、4、5和6的一个或多个序列。更优选地，人单链IL-12包含根据SEQ ID No.3的序列和根据SEQ ID No.4的序列。最优选地，单链IL-12包含SEQ ID No.3的序列和SEQ ID No.4的序列，其中SEQ ID No.3的序列之后是SEQID No.4的序列，参见例如SEQ ID No.1、2、5、6，任选地由接头序列，例如(G4S)3(即GGGGSGGGGSGGGGS)或G4S(即GGGGS)或G6s(即GGGGGGS)分开(参见例如SEQ ID No.1、2、5、6、34、35、36、37、38、39、40或41)。为了允许或促进分泌，由核酸构建体的转基因编码的单链人IL-12蛋白[其包含编码一种或多种治疗性蛋白的转基因、至少一个四环素应答适体酶序列和反向末端重复序列(ITR)]应优选包含N端信号序列，例如真实信号序列(例如SEQ IDNo.2、6中的SEQ ID No.33)或源自不同分泌蛋白的信号序列(参见例如由序列SEQ IDNo.13编码的氨基酸序列)或具有相同功能以允许被信号肽酶切割的人工信号序列。这样的单链IL-12蛋白是本领域已知的，参见EP 3 211 000 B1(其中称为SEQ ID No.6的序列)和US 10,646,549 B2(其中称为SEQ ID No.48的序列)。在另一个优选的实施方案中，单链IL-12包含SEQ ID No.75的序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码单链IL-12的转基因，该单链IL-12包含SEQ ID No.3的序列、SEQ ID No.4的序列、SEQ ID No.3的序列和SEQ IDNo.4的序列之间的接头序列，以及提供单链IL-12分泌的N端信号序列。
如本文所用，在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“百分比同一性”是指当比较和比对以获得最大对应时，长度相同和/或具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或多个序列或子序列。
为了确定百分比同一性，比对序列用于最佳比较目的(例如，可以在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被在第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数目(重叠位置)X100)。在一些实施方案中，被比较的两个序列在适当时在序列内引入空位后长度相同(例如，排除延伸超出被比较序列的额外序列)。
术语“在SEQ ID No.X的长度上具有与SEQ ID No.X的氨基酸序列的％序列同一性”是指比对应覆盖SEQ ID No.X的序列(参考序列)的全长。如果下面提到的算法不提供参考序列与测试序列的整个长度的比对，而是仅在所述参考序列的子序列上进行比对，则在测试序列上没有相同对应物的参考序列中的氨基酸残基被计算为不匹配。然后调整由所述算法给出的百分比同一性分数：如果该算法在L个氨基酸的比对长度上产生K个相同的氨基酸，则产生K/L*100的百分比同一性，如果该数目高于L，则术语L被替换为参考序列的氨基酸数目。例如，如果测试序列在N-末端比参考序列SEQ ID No.2少一个氨基酸(但除此差异外其他方面相同)，则百分比同一性为517/518*100％≈99.8％。反之，这同样适用于核酸序列。
两个序列之间百分比同一性或百分比相似性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，其在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中被修改。这种算法被整合到Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序。可以使用NBLAST程序，评分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与编码目的蛋白的核酸同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白搜索，以获得与目的蛋白同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，可以如Altschul等人1997，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402中所述使用带空位BLAST。或者，PSI-Blast可用于执行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(同上)。当使用BLAST、带空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)。这种算法被整合到ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12，空位罚分4。用于序列分析的其他算法在本领域中是已知的并且包括如Torellis和Robotti，1994，Comput.Appl.Biosci.10：3-5中所述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-8中描述的FASTA。在FASTA中，ktup是控制选项，其设置搜索的灵敏度和速度。如果ktup＝2，则通过查看比对的残基对找到被比较的两个序列中的相似区域；如果ktup＝1，则检查单个比对的氨基酸。对于蛋白序列，ktup可以设置为2或1，或对于DNA序列，可以设置为1到6。如果未指定ktup，则蛋白的默认值为2，DNA的默认值为6。或者，可以使用CLUSTAL W算法进行蛋白序列比对，如Higgins等人，1996，Methods Enzymol.266：383-402所述。
例如通过使用以下链接：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins&PROGRAM＝blastp&BLAST_PROGRAMS＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&DATABASE＝n/a&QUERY＝&SUBJECTS＝可以容易地产生比对。
为了计算百分比同一性的目的，在通过产生最高同一性得分的提及算法产生的可能比对中选择测试序列和参考序列(分别选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)之间的比对。
单链IL-12蛋白在根据实施例(1.14)的测定中优选表现出与市售生物活性人IL-12的活性处于相同数量级或更好的免疫刺激活性，所述生物活性人IL-12由通过二硫键连接的两个亚基组成并具有通常在100至400pg/mL的浓度下观察到的已知半数最大活性(Gately等人，1995)。
表1：
此表显示文中提到的序列。如与序列表不一致，表中所示序列为真实序列。
对于解释参见表3。
本发明的核酸构建体还包含一个或多个四环素应答适体酶序列。如本文所用，术语“适体酶序列”包括RNA，即适体酶序列本身，和编码这种RNA的DNA。如本文所用的适体酶是指组合了核酶和适体功能的RNA分子。适体酶通常包含彼此融合的第一和第二RNA序列。第一RNA序列具有核酶活性，即它催化RNA分子的切割。优选地，第一RNA序列催化自切割反应，这意味着它在适体酶的核酶部分内提供分子内RNA切割。适体酶的第二个RNA序列具有适体功能性，即由于稳定的三维结构，它能够结合靶分子。融合具有核酶活性的第一RNA序列和具有适体功能性的第二RNA序列，使得第一RNA序列的核酶活性受到第二RNA序列与其同源配体结合的影响。以这种方式，适体酶可以通过条件性mRNA自切割来控制信使RNA(mRNA)的完整性。
根据本发明，适体酶是四环素应答性的，这意味着适体酶的适体序列特异性结合四环素并通过三维结构的变化对这种结合作出反应。通过改变适体序列的结构，核酶序列的活性受到调节，即增加或减少。在优选的实施方案中，经适体酶的四环素结合减少了，并优选完全阻止了核酶对RNA的切割，由此通过mRNA稳定提供本发明的核酸构建体的增加表达。
因此，至少一个四环素应答适体酶优选在四环素结合后诱导或增强转基因的表达。在特别优选的实施方案中，本发明的DNA构建体的表达水平在存在有效量的四环素的情况下是不存在四环素的情况下的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍或至少14倍。更具体地说，优选的是，本发明的核酸构建体在递送至测试受试者后，相比于在向所述受试者施用每kg体重30mg四环素后8小时的基线水平，导致至少4倍、优选至少6倍、至少8倍或至少9倍的转基因表达水平。测试受试者是人、非人灵长类动物或小鼠，优选小鼠。
在优选的实施方案中，核酸构建体包含编码单链IL-12，优选人单链IL-12的转基因，包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列的至少一个四环素应答适体酶序列，和源自AAV2的ITR，例如根据Seq ID 8、43、44、49的序列。该构建体优选地还包含肝特异性启动子LP1，例如根据SEQ ID NO：42或72的序列。核酸构建体优选包含SEQ ID NO：29、30、31、46、47、50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中列出的任何序列，或任何这些的互补序列。核酸构建体可以是双链的。
在本发明的核酸构建体中，至少一个四环素应答适体酶可位于转基因的5′或3′。然而，优选至少一个四环素应答适体酶位于转基因的3′，例如转基因的3′UTR区。本发明的核酸构建体还可以包含多于一个四环素应答适体酶，例如这些适体酶中的2、3、4或5个。如果构建体包含两个四环素应答适体酶，则优选它们均位于转基因的3′，例如3′UTR区。这种排列在本文中称为3′3′构建体。
在特别优选的实施方案中，四环素应答适体酶是先前由Beilstein等人2015描述的适体酶“K19”。适体酶包含四环素适体(Berens等人2001)和曼氏血吸虫的全长锤头状核酶N79(Yen等人2004)。适体酶K19的序列在本文SEQ ID NO：10中提供。编码适体酶K19的相应DNA序列在SEQ ID NO：9中提供。因此，在本发明的一个实施方案中，四环素应答适体酶序列包含任何SEQ ID NOs：9或10中列出的序列或由其组成。
核酸构建体进一步包含反向末端重复(ITR)序列。ITR通常包含第一上游核苷酸序列，其随后是第二下游核苷酸序列，该第二下游核苷酸序列是第一上游核苷酸序列的反向互补序列。第一上游和第二下游核苷酸序列之间的插入核苷酸序列(如果有的话)可以是任何长度。ITR序列天然存在于AAV和逆转录病毒的基因组中，其中它们参与将核酸包装到病毒衣壳中。优选地，本发明的核酸构建体的ITR序列包含在转基因和适体酶的侧翼，这意味着转基因和适体酶位于ITR序列之间。优选位于转基因和适体酶侧翼的两个ITR序列的长度各为约140-145bp。在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体中的ITR序列来源于腺伴随病毒，优选来源于AAV2、AAV8或AAV9。特别优选的是，ITR序列包含SEQ ID NO：8中列出的ITR序列或由其组成。
ITR序列通常具有130到145个核苷酸之间的长度。其中至少一个可能要短得多(Zhou，Tian等人，2017)。优选位于转基因和适体酶侧翼的两个ITR序列的长度各为约145bp。在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体中的ITR序列来源于腺相关病毒，优选来源于AAV2(Wilmott等人，2019；Samulski等人，1983；Zhou等人，2017)。特别优选的是，ITR序列包含SEQ ID NO：8、43、49、50中所示的ITR序列或由其组成。据了解，ITR必须以某种方式排列以展示其功能：对于根据Wilmott等人，2019的AAV2野生型ITR序列，优选以下设置：
(ITR右3`-下游)
5`aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa`3(Seq ID 48)
Revcomp：(ITR左5`-上游)
5`ttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct′3(Seq ID 43)
在科学文献中，ITR右3`-下游显示的视图更为常见。
包含转基因、四环素应答适体酶和ITR的构建体原则上可以具有任何大小。优选地，其大小使得它可以被包装到病毒载体的衣壳中。考虑到手头的病毒载体的包装容量，技术人员将能够容易地选择大小。例如，如果核酸构建体，例如单链DNA，将与AAV载体组合使用，则构建体的大小应低于4.7kb，这是有效包装到AAV载体中的最大大小。在本发明的优选实施方案中，核酸构建体的大小在0.5kb至4.5kb之间，例如0.75kb至4.0kb之间、1.0kb至3.5kb之间、1.5kb至3.0kb之间、或2.0kb至2.5kb之间。在特别优选的实施方案中，核酸构建体是具有0.5kb至4.5kb、0.75kb至4.0kb、1.0kb至3.5kb、1.5kb至3.0kb或2.0kb至2.5kb大小的DNA分子。
核酸构建体还可包含驱动一种或多种转基因表达的启动子。将根据构建体的预期用途和转基因表达的推定位点来选择启动子。例如，当需要在肝中表达转基因时，将选择在肝组织中具有高活性的启动子，例如肝特异性启动子LP1。同样，如果转基因要在肿瘤组织中表达，将使用肿瘤特异性启动子，例如甲胎蛋白(AFP)启动子。因此，在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含肝特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
如本文所用，肝特异性启动子包括LP1启动子、转甲状腺素蛋白(TTR)启动子、A1AT启动子和甲状腺素结合球蛋白(TPG)启动子(Greig等人，2017)、杂合肝特异性启动子(HLP)、人甲状腺素结合球蛋白(TBG)、转甲状腺素蛋白(TTR)、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子并组合有肝特异性载脂蛋白E(ApoE)增强子、合成肝特异性启动子(Okuyama等人，1996；Cabrera-Pérez等人2019；EP2698163A1，WO2020104424)。肿瘤特异性启动子包括甲胎蛋白(AFP)启动子(Shi，等人2004)，CEA启动子(Cao等人1998；Lan等人1997)和Muc1启动子(Chen等人1995；Tai等人1999)和hTERT启动子(Quante等人2005)。细胞模型中人端粒酶的差异转录调节代表食管鳞状细胞癌发生中的重要遗传改变，Carcinogenesis 26卷第11号第1879-1889页)。在甚至更优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含选自人巨细胞病毒(CMV)启动子、肝特异性启动子LP1、肿瘤特异性甲胎蛋白(AFP)启动子，和人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的启动子。
作为进一步的组分，本发明的核酸构建体可以包含poly(A)信号。poly(A)信号是由RNA切割复合物识别的序列基序，RNA切割复合物是在转录过程结束时切割mRNA的多蛋白复合物。在随后的步骤中，在酶聚腺苷酸聚合酶催化的反应中，将一磷酸腺苷残基尾添加到mRNA的3′端。由此产生的poly(A)尾参与mRNA的核输出、翻译和稳定性。Poly(A)信号是技术人员众所周知的。大多数人多腺苷酸化信号含有序列AAUAAA。因此，在优选的实施方案中，本发明的核酸构建体包含序列AAUAAA。在又一个优选的实施方案中，核酸构建体包含如所述的合成poly(A)信号(Levitt等人，1989)。在又一个优选的实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO：7中描述的SV40 poly(A)信号。
优选地，本发明的核酸构建体是包含转基因表达盒的DNA构建体。表达盒包含可操作地连接至编码治疗性蛋白的转基因的启动子、编码转基因上游或下游的适体酶的序列、多腺苷酸化信号和3′和5′端的ITR序列。
另一方面，本发明涉及包含启动子、编码一种或多种治疗性蛋白的转基因和至少一个四环素应答适体酶序列的转基因表达盒。启动子优选是肝特异性启动子，例如如上所述的肝特异性LP1启动子，或肿瘤特异性启动子。肝特异性LP1启动子可包含内含子，参见Seq ID 42。Seq ID 72中显示了没有SV40内含子的实例。
优选地，转基因表达盒将包含DNA或由其组成。表达盒可以是线性或环状形式，例如质粒形式。在优选的实施方案中，本发明的转基因表达盒包含单链或双链DNA或由其组成。在特别优选的实施方案中，本发明的转基因表达盒由单链DNA组成。
转基因表达盒可以进一步包含poly(A)信号，例如如上所述的SV40 poly(A)信号。因此，在优选的实施方案中，本发明的转基因表达盒包含序列AAUAAA。在又一个优选的实施方案中，转基因表达盒包含合成的poly(A)信号。在又一个优选的实施方案中，转基因表达盒包含SEQ ID NO：7中描述的SV40 poly(A)信号。
转基因表达盒包含编码一种或多种免疫调节蛋白的转基因。如上所述，免疫调节蛋白包括但不限于抗体，例如易普利姆玛或抗PD1抗体、抗体片段、细胞因子，例如白细胞介素、干扰素、淋巴因子，以及肿瘤坏死因子(TNF)/肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的促炎和促凋亡成员。免疫调节蛋白还包括，但不限于T细胞接合剂、免疫检查点抑制剂、激动剂，例如上述任意抗CD137、抗CD28或抗CD40组合。在优选的实施方案中，由转基因编码的免疫调节蛋白是选自IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-23、IL-27和IL-33的白细胞介素。特别优选的是，本发明转基因表达盒中的免疫调节蛋白是IL-12，优选人IL-12。优选地，单链IL-12包含选自SEQ ID No.1-6或34至41的一个或多个序列。可以在下面的表4中发现更多的实例。
本发明的转基因表达盒包含至少一个四环素应答适体酶序列。如上文所述，至少一个四环素应答适体酶可位于转基因的5′或3′。然而，优选的是，至少一个四环素应答适体酶位于转基因的3′，例如转基因的3′UTR区。本发明的转基因表达盒还可以包含多于一个四环素应答适体酶，例如这些适体酶中的2、3、4或5个。特别优选的是，四环素应答适体酶包含SEQ ID NOs：9或10中任意所示的序列或由其组成。
至少一个四环素应答适体酶序列优选在四环素结合后诱导或增强转基因的表达。在特别优选的实施方案中，本发明的DNA构建体的表达水平在存在有效量的四环素的情况下是不存在四环素的情况下的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍或至少14倍。更具体地说，优选的是，本发明的转基因表达盒在递送至测试受试者后，相比于在向所述受试者施用每kg体重30mg四环素后8小时的基线水平，导致至少4倍、优选至少6倍、至少8倍或至少9倍的转基因表达水平。受试者优选为小鼠。
在优选的实施方案中，本发明提供这样的转基因表达盒，其包含编码单链IL-12，优选人单链IL-12的转基因，包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的序列的至少一个四环素应答适体酶序列，和来源于AAV2的ITR。所述表达盒优选地还包含肝特异性启动子LP1。该表达盒优选包含SEQ ID NO：29、30、31、46、47、50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中列出的任何序列，其没有侧翼ITR，优选SEQ ID NO：73或74中列出的任何序列。
另一方面，本发明涉及包含衣壳和包装的核酸的病毒载体，其中包装的核酸包含如上文定义的核酸构建体或转基因表达盒，优选DNA构建体。可以根据要转导的组织来选择病毒载体。可根据本发明使用的病毒载体的非限制性实例包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV载体)和副粘病毒载体。其中，特别优选AAV载体，尤其是具有AAV-2、AAV-8或AAV-9血清型的那些载体。病毒载体可包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白已被调节以包括提供选择性结合至靶组织，例如肝组织或肺组织的氨基酸序列(参见例如WO 2015/018860)。
本发明的核酸构建体或转基因表达盒特别用于治疗癌症疾病，特别是肝癌。全身注射后，本发明的核酸构建体或转基因表达盒局部例如通过使用靶向选定的癌变器官(例如肝脏)的组织嗜性AAV递送可调节的转基因表达盒，诱导癌变器官中治疗性蛋白的局部表达，随后激活T细胞和其他免疫细胞，并消除肿瘤。可以应用核酸构建体或转基因表达盒来消除原发性肿瘤以及位于提供有调节表达盒的癌变器官中的继发性肿瘤(即转移瘤)。通过所述系统在局部引发的T细胞和其他免疫细胞可以随血流迁移到身体的远处部位，并针对位于癌变器官外的癌病变诱导远端抗肿瘤反应，所述癌变器官已经提供有核酸构建体或转基因表达盒。
已知的是，许多癌症患者不是死于其原发性肿瘤，而是死于因那些原发性肿瘤引起的转移(Dillekas等人，2019)。转移的形成是一个复杂的过程，其取决于原发肿瘤的循环和靶器官的特性，例如其抑制免疫系统的倾向。几种肿瘤类型经常转移到肝，包括结肠直肠癌(Valderrama-等人，2017)、肺癌和黑色素瘤。例如，肝转移的形成与癌症患者的免疫治疗效力下降相关(Yu等人，2021)。由于肝转移的位置、其大小、肝转移的数量、残留的正常肝和额外的肝病，这些患者中有85％不适合手术(Jemal等人，2002)，这代表了非常高医疗需求。因此，本发明的核酸构建体或转基因表达盒通过为这些患者提供治疗选择而代表了重要贡献。
对于存在于肝中的癌症的治疗，肝细胞代表了理想的靶细胞群，以便转导它们以在肿瘤附近释放IL-12。AAV载体在180多项临床试验(Paulk，2020)中具有记录的出色的安全性和效力概况，并且由于其天然的嗜肝性而被广泛用于全身性肝基因递送(Wang等人，2019)。像这样，封装IL-12基因的AAV载体与用于可切换(toggleable)控制的核糖开关盒组合，将代表肝癌的可调节IL-12基因治疗的理想平台。
另一方面，本发明涉及如上文定义的核酸构建体或转基因表达盒或如上文定义的病毒载体，其用于药物中。具体而言，考虑核酸构建体、转基因表达盒和病毒载体，其用于治疗增生性疾病，例如纤维化或癌症疾病的方法中。可以通过本发明的核酸构建体、转基因表达盒和病毒载体治疗的癌症疾病包括肝癌、脑癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肛门癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌、外阴癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、口咽癌、喉癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌。在本发明特别优选的实施方案中，核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体用于治疗或预防肝癌，例如肝细胞癌(HCC)或胆管癌的方法中。在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体用于治疗结肠直肠癌。
根据本发明特别优选的是，本发明的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体用于治疗具有位于肝中的一种或多种癌症病变的患者。病变可能由原发性肝癌或继发性肝癌引起。如本文所用，继发性肝癌被理解为指由非肝肿瘤的原发性肿瘤引起的肝中的转移。
如果将本发明的核酸构建体或转基因表达盒以病毒载体的形式施用于受试者，优选的是，病毒载体以对应于1.0x1010至1.0x1014vg/kg(每kg体重的病毒基因组)范围内的病毒剂量的量施用，虽然更优选1.0x1011至1.0x1012vg/kg的范围，并且仍然更优选5.0x1011至5.0x1012vg/kg的范围，并且仍然更优选1.0x1012至5.0x1011的范围。最优选约2.5x1012vg/kg的病毒剂量。可以根据一种或多种转基因的表达强度来调整要施用的病毒载体，例如根据本发明的AAV载体的量。
在另一方面中，本发明提供包含如上文所定义的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体的细胞。
在又一方面中，本发明提供药物组合物，其包含如上文所定义的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体以及药学上可接受的载体或稀释剂的组合。
在又一方面中，本发明提供治疗增生性疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如上文所定义的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体。优选地，待治疗的增生性疾病是纤维化或癌症疾病。已在本文别处讨论了可通过本发明的核酸构建体、转基因表达盒和病毒载体治疗的癌症疾病。特别优选肝癌的治疗。
在又一方面中，本发明涉及本发明的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体在制备用于治疗增生性疾病，例如癌症疾病的药物中的用途。
实施例
1.材料和方法
1.1表达构建体
使用基于CMV或LP1启动子和增强型GFP(eGFP)转基因以及SV40 poly(A)信号的可用构建体克隆核糖开关或对照质粒构建体。为了包装到重组AAV载体中，所有质粒都配备了AAV2 ITR。应用于体内实验的所有AAV在左侧ITR中均有11nt缺失(参见SEQ ID NO：46和类似构建体)。细胞和分泌的纳米荧光素酶基因来源于购自Promega的pNL1.1和pNL1.3载体。抗FITC串联scFv构建体是基于已发表的序列构建的(Vaughan等人1996)并在Lifetechnologies合成。K19核糖开关序列来源于Beilstein(Beilstein等人2015)并克隆到侧接(CAAA)3间隔序列的报告构建体中。编码鼠或人单链IL-12的序列来源于公开的序列mIL-12.p40.L.Δp35(Lieschke等人，1997)。然后通过PCR引入人IgG信号肽并克隆到pCR-TOPOP3.3中。编码信号肽和单链IL-12的连续序列的限制酶介导的亚克隆取代了各AAV质粒中的报告基因。
1.2细胞测定
HEK293H和HepG2细胞在DMEM+GlutaMAX+10％FCS中于37℃下培养。在转染前24小时使用Lipofectamine-3000试剂盒，每孔用35ng DNA、0.07μL P3000、0.15μLLipofectamine-3000和10μL Opti-MEM接种30,000个HEK293细胞/96-孔。根据生长区域制备预混液并扩大规模以获得更大的培养形式。HepG2的转染优化导致使用70ng DNA、0.14μLP3000和0.15μL Lipofectamine-3000/96孔接种和转染的50,000个细胞。10,000.除非另有说明，转染后1-2小时将四环素(Tet-HCl，Sigma-Aldrich)添加到细胞中，并在转导的情况下同时添加AAV。Tet以光保护的一次性使用的等分试样保存为水中的冷冻2mM储备溶液，并在加入细胞(每96孔10μL)之前在水中连续稀释。
1.3重组AAV载体的产生
AAV在瞬时转染的HEK293细胞中产生，并通过所述的qPCR进行定量(Strobel等人，2015a)。简而言之，HEK293H细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM+GlutaMAX培养基中培养。转染前三天，将细胞接种于15cm的组织培养板中，以在转染当天达到70-80％的汇合度。对于转染，将每cm2培养区域0.5μg总DNA与1/10培养体积的300mM CaCl2以及AAV产生所需的所有质粒以等摩尔比例混合。质粒构建体如下：编码AAV cap基因的一个质粒(Strobel等人，2015a)；AAV顺式质粒，其含有侧翼为ITR的表达盒；pHelper质粒(无AAV Helper系统，Agilent)。然后将质粒CaCl2混合物逐滴添加到等体积的2x HBS缓冲液(50mM HEPES、280mMNaCl、1.5mM Na2HPO4)中，在室温下孵育2分钟并添加到细胞中。孵育5-6小时后，将培养基更换为新鲜培养基。转染的细胞在37℃下生长总共72小时。通过添加EDTA至6.25mM的终浓度来分离细胞，并通过在室温下以1000xg离心10分钟进行沉淀。然后将细胞重悬于裂解缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、2mM MgCl2，pH 8.5)中。
基本上如前所述纯化AAV载体(Strobel等人，2015a)：对于基于碘克沙醇梯度的纯化，将从多达40个板中收获的细胞溶解在8mL裂解缓冲液中。然后使用液氮和37℃水浴通过三个冷冻/解冻循环裂解细胞。对于每个最初转染的板，将100单位Benzonase核酸酶(Merck)添加到混合物中并在37℃下孵育1小时。在2500xg下沉淀细胞碎片15分钟后，将上清液转移到39mL Beckman Coulter Quick-Seal管中，并通过在细胞裂解物下面分层在PBS-MK(1x PBS、1mM MgCl2、2.5mM KCl)中稀释的8mL 15％、6mL 25％、8mL 4％和5mL 58％的碘克沙醇溶液制备碘克沙醇(OptiPrep，Sigma Aldrich)不连续梯度。之前已将NaCl以1M的终浓度添加到15％相中。已经在15％和25％碘克沙醇溶液中每mL添加1.5μL 0.5％酚红，并在58％相中添加0.5μL，以便更容易区分梯度内的相边界。在70Ti转子中以63000rpm和18℃离心2小时后，在底部对管进行穿孔。然后丢弃前5毫升(对应于58％相)，并收集后面的3.5mL，其含有AAV载体颗粒。将PBS添加到AAV级分中以达到15mL的总体积，并使用MWCO为100kDa的Merck Millipore Amicon Ultra-15离心过滤单元进行超滤/浓缩。浓缩至约1mL后，将渗余物补足至15mL并再次浓缩。这个过程总共重复三次。甘油以10％的终浓度添加到制剂中。使用Merck Millipore Ultrafree-CL过滤管进行无菌过滤后，将AAV产品等分并储存在-80℃下。
1.4 AAV体内实验
9-12周龄体重19-21g的C57BL/6小鼠购自Charles River实验室。AAV在PBS中稀释至所需浓度，并在光异氟烷麻醉下以每只小鼠100μL的体积施用至尾静脉。为了制备100mg/kg四环素溶液，将20mg四环素-HCl溶解在400μL 25％2-羟丙基β-环糊精溶液(HP-β-CD，Sigma Aldrich)+600μL PBS中并通过添加35μL 1M NaOH调整至约pH 6。对于较低剂量，该溶液在PBS+HP-β-CD中连续稀释。在腹膜内施用之前立即制备Tet溶液(每只小鼠200μL)。在各时间点上，通过刺穿隐静脉取样20μL血液，并使用K3-EDTA Microvette POCT 20μL毛细管微管(Sarstedt)收集，然后离心。血浆用于定量抗FITC和四环素测量。在最后一次抽血时，制备额外的血清样本用于评估肝酶。目的器官被解剖并快速冷冻在液氮中用于DNA/RNA提取或蛋白组织裂解物的制备。对于荷瘤小鼠中的实验，将表达荧光素酶的Hepa1-6肿瘤细胞(50μL PBS中的1.0x106个细胞)在麻醉下注射到每只小鼠的脾中，并允许其通过脾静脉迁移到肝中5分钟。此后切除脾。小鼠在手术前1-2小时和手术后24小时接受皮下止痛药美洛昔康(Meloxicam)(1.0mg/kg，在10.0ml/kg中)。监测体重和肿瘤生长。使用带有CCD相机的Lumina III生物发光成像系统(Perkin Elmer)通过体内生物发光测定肿瘤体积。为此，在麻醉前8分钟腹膜内注射在蒸馏水(aqua dest.)中的150mg/kg(7.5mL/kg)D-荧光素。注射后10分钟测量光发射。根据当天通过体内生物发光成像测量的肿瘤大小，将荷瘤小鼠进行区组随机化。对于区组随机化，使用了单个区组内强大的自动随机数生成(MS-Excel 2016)。
1.5报告蛋白评估
使用带有MiniMax 300成像单元的Molecular Devices SpextraMax i3x，通过荧光显微镜或直接荧光检测评估eGFP表达。根据制造商的说明，使用Promega Nano-Glo荧光素酶测定法进行纳米荧光素酶测量。如果需要，在评估之前确定适当的样品稀释度。下文进一步提供了抗FITC ELISA设置和测量的详细说明。
1.6抗FITC蛋白的表达与纯化(ELISA标准)
使用如为AAV生产所述的磷酸钙方法，每15-cm培养皿使用30μg CMV-aFITC表达质粒转染HEK293细胞。转染后48小时，收集培养上清液并以400×g离心5分钟。然后将45mL上清液与60μL抗V5珠混合，并按照说明使用“V5标记蛋白纯化试剂盒Ver.2”(3317，MBL)进行纯化。蛋白洗脱后，通过超滤去除V5洗脱肽。因此，将40μL蛋白洗脱液添加到PBS预平衡的Vivaspin 500柱(VS0101，Sartorius)中，并使用PBS填充至500μL。在以15000×g离心约2分钟以达到50μL的截留体积后，再次添加PBS至500μL并再次离心。这个过程总共重复三次。渗余物回收后，将抗FITC蛋白等分并冷冻于-20℃。使用在280nm处的NanoDrop-One测量和基于57kDa的蛋白大小和116,240M-1cm-1的摩尔消光系数的计算来确定蛋白浓度。
1.7抗FITC ELISA
标准MSD板(L15XA-1)涂有30μL BSA-FITC(A23015，Molecular Probes)，并在PBS中以750rpm摇动5分钟稀释至0.25μg/mL。在4℃孵育过夜(或在室温(RT)下孵育1小时)后，使用300μL/孔洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween-20)将板洗涤三次。然后添加150μL封闭溶液(PBS中的3％Blocker A(R93BA-2，MSD))并在750rpm和RT下孵育1小时。洗涤3次后，每孔加入25μL每一样品、标准品(稀释于PBS中的1％Blocker A)或空白，并在750rpm和室温下孵育1小时。将检测抗体(生物素化兔抗V5，ab18617，Abcam)在PBS中的1％Blocker A中稀释至1μg/mL，将SULFO标签标记的链霉亲和素(streptavidin)(R32AD-5，MSD)在PBS中的1％Blocker A中稀释至0.5μg/mL。洗涤板3次后，将25μL抗体和链霉亲和素稀释液同时添加到每个孔中，并在750rpm和RT下孵育1小时。三个洗涤步骤后，每孔加入150μL/孔在水中稀释的2X Read Buffer T(R92TC-2，MSD)。然后使用MSD Sector Imager 600读取板。
1.8 IL-12、IFNγELISA
根据制造商的说明，使用小鼠IL-12p70或促炎组1小鼠试剂盒(K152ARB，K15048D，MSD)分析IL-12和IFNγ的表达。所提供的IL12p70的最低标准被视为检测下限(LLOD)。
1.9蛋白组织裂解液的制备
使用Precellys-24匀浆器和陶瓷(KT03961-1-009.2，VWR)或金属珠管(KT03961-1-001.2)以6000rpm将速冻组织样品在100μL MSD裂解缓冲液(R60TX-2)中匀浆30秒。匀浆立即置于冰上，然后添加额外的900μL裂解缓冲液。然后进行第二轮匀浆。样品再次在冰上冷却并以20,000×g离心10分钟。回收700μL上清液，并使用BCA测定法(Promega)测定蛋白浓度。匀浆储存在-80℃。
1.10 DNA和RNA分离
组织样品在解剖后立即快速冷冻。对于DNA和RNA分离，使用Precellys-24匀浆器和陶瓷珠管(KT03961-1-009.2，VWR)在900μL RLT缓冲液(79216，Qiagen)中以6000rpm将样品匀浆30秒。之后，将样品立即置于冰上。然后将350μL苯酚-氯仿-异戊醇(77617，SigmaAldrich)添加到Phase Lock凝胶管中的700μL匀浆中，并摇动混合。在16000×g下离心5分钟后，加入350μL氯仿-异戊醇(25666，Sigma-Aldrich)并再次摇动混合物。在RT下孵育3分钟并以12000×g离心5分钟后，收集上层(水)相并移液至置于干冰上的深孔板中。处理所有样品后，按照说明，包括可选的“柱上DNase消化”步骤，使用AllPrep DNA/RNA 96试剂盒(80311，Qiagen)纯化DNA和RNA。通过沉淀细胞从细胞培养物中分离RNA，然后在350μL RLT缓冲液中裂解并使用RNeasy迷你试剂盒(74104，Qiagen)进行纯化。
1.11基因表达和AAV载体基因组分析(qPCR和ddPCR)
对于基因表达分析，使用高容量cDNA RT试剂盒(4368814，Thermo Fisher)按照说明将等量的RNA逆转录为cDNA。使用QuantiFast Probe RT-PCR试剂盒(204456，Qiagen)和特异性结合K19核糖开关序列或抗FITC基因的引物建立qRT-PCR反应。将表达针对RNA聚合酶II看家基因表达进行归一化。使用提取的DNA进行ddPCR或qPCR检测AAV载体基因组。对于qPCR，通过连续稀释各表达质粒生成标准曲线。qPCR运行在Applied Biosystems ViiA 7实时PCR系统上进行。对于ddPCR，应用了Automated Droplet Generator、QX200 DropletDigital PCR System和QX200 Droplet Reader(所有Bio-rad)。
1.12药代动力学和暴露测量
在购自Janvier Labs的12周龄(体重约30克)雄性C57BL/6小鼠中研究了四环素的药代动力学。以10mL/kg的施用体积和54mg/kg的剂量腹膜内施用Tet溶液。Tet溶液含有10％2-羟丙基β-环糊精并调节至pH 6。通过将隐静脉穿刺到涂有K3-EDTA的小瓶中进行系列血液采样。每个采样时间点收集20μL血液的最大体积。通过离心制备血浆样品。对于组织分布，第3天在相同动物中按上述方法进行腹膜内施用。在Tet施用后两小时处死小鼠，随后收集大脑、肝、肾、心脏、肺、双眼、一块腿部肌肉和血液样品。记录组织重量并在生物分析前将所有样品储存在-20℃。用乙腈沉淀血浆蛋白。将组织样品转移到Precellys小瓶中，加入三份乙腈/甲醇(1∶1)和一份水用于匀浆步骤。在生物分析前所有样品进行离心。通过高效液相色谱联用串联质谱法测定化合物浓度。
1.13 AST、ALT和GLDH酶活性的评估
使用Konelab PRIME 60和来自Thermo Scientific的测试试剂盒(遵循KonelabChemistry Information Manual 12A/2003，March 2003)以及340nm处的分光光度评估进行所有测量。天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性通过酶促速率法测量(Schumann等人2002a)，但没有吡哆醛-5′-磷酸盐用于AST激活。通过基于IFCC方法的酶促速率法测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性(Schumann等人2002b)，但不添加吡哆醛-5′-磷酸盐。在340nm处通过分光光度法测量NADH的去除。使用Roche Diagnostics提供的试剂盒，通过酶促速率法测量谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性。
1.14 IL-12体外生物活性报告基因检测
如Gately等人，1995所述，采用生物测定依据植物血凝素(PHA)激活的人淋巴母细胞的增殖来测量人或小鼠IL-12生物活性。
基本方案1：IL-12活性的抗体捕获生物测定。
简而言之，该功能测定基于IL-12刺激PHA激活的T淋巴母细胞(“PHA母细胞”)增殖的能力。在此测定中，已与固定化抗IL-12抗体结合的IL-12刺激PHA激活的人淋巴母细胞的增殖。通过吸附到EIA(酶免疫测定)板的孔中的抗人IL-12或抗小鼠IL-12抗体，从含有IL-12的培养液或血清中捕获人或小鼠IL-12。然后将测试液从孔中洗掉，并用PHA激活的人淋巴母细胞悬浮液代替。测量响应捕获的IL-12的淋巴母细胞增殖。由通过二硫键连接的两个亚基组成的市售的生物活性人IL-12重组蛋白(例如Thermo Fisher Scientific；Cat.#PHCl 124)用作标准。
作为替代方案，也可以使用商业化IL-12生物测定(Promega GmbH；Cat.#J3042)。这是基于生物发光细胞的测定，其被设计用于测量IL-12刺激或抑制，并根据制造商的说明进行。简而言之，IL-12生物测定由遗传改造的人类细胞系组成，所述细胞系表达由反应元件(RE)驱动的荧光素酶报告基因。当IL-12与IL-12R结合时，它会转导细胞内信号，从而导致发光。使用Bio-GloTM荧光素酶测定系统(Cat.#G7940，G7941)和标准光度计检测和定量生物发光信号。
作为另一种替代方案，HEK-BlueTM测定可用于显示IL-12的体外生物活性。HEK-BlueTM IL-12细胞(InvivoGen，#hkb-il12)被设计用于检测具有生物活性的人和鼠IL-12。基于人胚肾HEK293的细胞系表达人类IL-12受体基因和IL-12信号通路基因进入细胞系，以及STAT4诱导型SEAP报告基因。细胞表面配体结合触发激活STAT-4的信号级联和报告蛋白分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的产生。可以根据制造商的说明使用QUANTI-BlueTM溶液检测上清液中的SEAP。为了显示从表达质粒、AAV质粒或AAV载体表达的IL-12的体外生物活性，培养细胞，用质粒转染或用AAV载体转导，并根据制造商信息进行报告测定。
1.15统计学
使用GraphPad Prism V7.03进行统计学计算。图2b，e：双向ANOVA，通过Dunnett检验控制多重检验(MT)。图3a、b、c、5c：双向ANOVA，考虑匹配设计(时间)，Sidak氏MT检验。图5d、e、g、7c、d：单向ANOVA，Tukey氏MT检验。6b、7b：双向ANOVA，考虑匹配设计(时间)，Tukey氏MT检验。P值是基于双尾检验得出的，假设数据呈正态分布。
1.16组织学和免疫组织化学
大鼠肝脏组织样品在4％PFA中固定并用石蜡包埋(福尔马林固定并用石蜡包埋，FFPE)。Super frost plus载玻片上的3μm厚FFPE组织切片通过二甲苯和分级乙醇的改变连续传递来脱石蜡和再水化，用于H&E和免疫组织化学染色。
H&E染色根据标准方案进行(Romeis，Mikroskopische Technik；Hrsg.P.Urban und Schwarzenberg；München，Wien，Baltimore；19.Auflage；2015；第201页；ISBN：978-3-642-55189-5)。
对于免疫组织化学，通过将切片在Leica Bond酶溶液(Bond酶预处理试剂盒，Cat#35607)中孵育5分钟来进行抗原修复。将切片与抗CD45抗体(abcam，ab10558，兔多克隆抗体)孵育。用Leica Primary Antibody Diluent(AR9352；Leica Biosystems，Nussloch，Germany)稀释抗体(1∶400)，并在室温下孵育30分钟。Bond Polymer Refine Detection(Cat# 37072)用于检测(3，3′二氨基联苯胺作为色原，DAB)和复染(苏木精)。在自动化Leica IHC Bond-III平台(Leica Biosystems，Nussloch，Germany)上进行染色。使用ZeissAxioImager M2显微镜和ZEN幻灯片扫描软件(Zeiss，Oberkochen，Germany)对样品进行显微评估。
1.17图像分析
使用图像处理软件HALO 3.1计算肿瘤大小。使用来自背景、健康和癌变组织的16个样品区域训练基于DenseNET(Huang等人，2017)的分类器。
对于定量分析，使用Axio Scan.Z1全幻灯片扫描仪(Carl Zeiss MicroscopyGmbH，Jena，Germany)在明场照明下使用20x物镜(0.22μm/px)扫描肝脏的抗CD45染色切片。使用具有CytoNuclear v2.0.9模块(Indica Labs，Corrales，NM，USA)的图像处理软件HALO3.1计算抗CD45阳性细胞的百分比。然后细胞计数分析仅限于“正常”组织，其使用内置分类器(QC Slide)在预处理步骤中进行分割。分析模块使用颜色反卷积来分离苏木精和DAB的信号。手动优化苏木精图像中的细胞检测参数和细胞质中阳性DAB染色强度的阈值。强染色和中等染色的DAB阳性细胞的总百分比用于定量分析。
2.结果
为了评估K19适体酶在AAV载体背景中的功能性，将K19克隆到含有AAV2反向末端重复序列(ITR)和CMV启动子驱动的eGFP基因的质粒中。K19位于相对于eGFP基因的5′上游、3′下游或两个位置(图2a)。在转染HEK293细胞并随后添加增加剂量的四环素(Tet)后24小时，测量了eGFP荧光(图2b)并成像(图2c)。然而5′-设计导致eGFP信号普遍下降但缺乏可调节性，这可能是由于核糖体进入受阻和开关序列(switch sequence)中的人工起始密码子导致翻译改变，相对于组成型、无适体酶的对照构建体，3′-设计允许剂量依赖性诱导eGFP从没有Tet时的14％到存在Tet时的36％。携带催化失活K19开关的额外对照质粒表达稳定水平的约90％的组成型信号。有趣的是，5′3′-构建体整合了5′-和3′-设计的特征，但是在整体降低表达水平上，它显示出与3′-构建体相似的切换行为。基于功能性3′-设计，进一步探索了串联构建体，其中两个K19适体酶串联放置(3′3′)，这允许在整体降低的表达水平上的类似有效的表达对照，即从～5％到19％。这一发现与之前针对其他开关获得的结果一致(Ketzer等人2012；Beilstein等人2015)。所有结果均通过Western印迹确认(图2d)。除了eGFP之外，还使用额外的转基因(即分泌型纳米荧光素酶(sNLuc))确认了成功的调节，其证实了使用3′-设计成功实现了约三倍的剂量依赖性诱导，并且使用3′3′-串联构建体总体上减少了信号(图2e)，因此没有进一步考虑这一点。同样，细胞内NLuc变体(cNLuc)被开关成功调节，尽管效力较低，这可能是报告蛋白在细胞内积累的结果，导致更高的背景信号(图2e)。
为了加深对时间基因表达调节的观察，进行了聚焦mRNA的动力学实验。因此，设计了跨越适体酶自切割位点的qPCR探针，允许直接评估eGFP mRNA切割。用含有活性或无活性K19开关的质粒转染HEK293细胞后24小时，更换培养基，采集基线样品并将Tet添加到所有剩余培养物中，然后在几个时间点裂解以获得RNA和蛋白用于基因表达分析。在mRNA水平上从添加Tet后15分钟观察到轻微但稳定增加的eGFP表达诱导，并在四小时后观察到完全诱导(图3b)。这与分别在添加Tet后2小时和4小时后直接eGFP荧光信号和蛋白的增加相平行。为了证实这些结果，随着时间的推移，还探索了Tet介导的sNLuc调节。因此，在HEK293转染和孵育24小时后，将培养基更换为不含Tet或含有Tet的培养基，并在细胞上清液中检测sNLuc。与eGFP数据类似，添加后2小时检测Tet诱导的sNLuc增加，其在约4-8小时达到饱和(图3c)。此外，当Tet从先前在Tet存在下生长的细胞中收回时，观察到sNLuc表达的相对减少，因此证明了可逆性(图3d)。虽然我们的测定聚焦在功能性核糖开关下游效应(即蛋白输出)，其还受到连续从头转录、mRNA降解以及蛋白翻译、稳定性和周转(turnover)的影响，但实际核酶切割率可以从使用裸RNA的分析中获得，如先前对K19进行的那样(Beilstein等人2015)。
由于K19适体酶的四环素适体结构域特异性结合Tet而不是多西环素(Doxycycline)，因此准备在小鼠中评估核糖开关系统包括Tet药代动力学(PK)研究，其临床前体内数据很少。腹膜内施用54mg/kg后，测量30分钟时血浆峰值浓度为42μM，8小时时残留水平为3.3μM，对应于约2.8小时的半衰期(图4a)。此外，在施用Tet后2小时测定多种小鼠器官的暴露情况，揭示血浆中的总浓度为16.4μM，肺中为5.7μM，肌肉中为7.8μM，心脏中为8.0μM，肾中为27.2μM，肝中为149μM(图4b、c)。在大脑(0.42μM)和眼睛(0.88μM)中只检测到很少的暴露。为了估计通过多次施用Tet可以达到哪些血浆浓度，进行了PK非参数建模。建模方法建议每天3次(8小时间隔)腹膜内施用100mg/kg Tet将导致约7μM的血浆谷水平(图4d)。
接下来，对可选报告蛋白进行了测试，这些蛋白理想情况下将允许以多重化方式测量体内的切换性能和动力学。我们决定使用在肝特异性LP1启动子(Nathwani 2006)的控制下的分泌型抗异硫氰酸荧光素(aFITC)串联单链可变片段(scFv)抗体(Vaughan等人1996；Honegger等人2005)和CMV启动子表达的非分泌型纳米荧光素酶(cNLuc)和克隆的适当的表达构建体和对照(图5a)。对于抗FITC scFv分析，我们首先建立了MSD ELISA测定，其在优化涂布和检测抗体浓度后，允许在0.1pM灵敏度下进行可靠的抗FITC scFv测量。正如预期的那样，肝细胞细胞系HepG2中的功能性评估证明，两种构建体都允许Tet依赖性基因表达诱导，而使用对照构建体时表达保持不变(图5b)。
以前的研究已经在小鼠的肌肉和眼睛中测试了适体酶设计，然而，使用了任一OFF设计(Zhong等人2016)或ON设计产生非常轻微的作用(Reid等人2018)。此外，迄今为止尚未研究跨不同器官的适体酶功能性。因此，本文设计了实验来以同步方式探索跨器官的ON-开关效力和功能性。具体而言，利用了静脉内施用后重组AAV9的广泛转导模式的优势(Zincarelli等人，2008)，通过测量其在血浆中的水平，同时表达1)在肝、肺、心脏和肌肉组织中细胞内表达的cNLuc和2)转录肝脏靶向、分泌的aFITC抗体并研究其调节。因此，将AAV9-CMV-cNLuc-K19(介导普遍表达)和AAV9-LP1-aFITC-K19(介导肝特异性表达)的混合物施用于小鼠(每只动物总共1x1011vg，每组N＝8只动物)。AAV施用后两周，以8小时的间隔施用总共四次100mg/kg剂量的Tet，以诱导从适体酶构建体表达(参见图5a中的方案)。在诱导前和诱导后的多个时间点抽血，并在最后一次Tet剂量后8小时制备用于cNLuc蛋白分析的组织裂解物。分析第一抗FITC抗体血浆水平。在第7天(均值＝0.86nM，标准偏差(SD)＝0.37)和第14天(0.72nM，SD＝0.18)，所有AAV处理动物中的基线表达相似，表明已经达到AAV介导表达的稳定期(图5c)。有趣的是，在施用单剂量100mg/kg Tet后，适体酶构建体强烈诱导抗FITC表达水平，在4小时达到38％诱导，在给药后8小时达到峰值诱导水平(＝100％)，这分别对应于在4小时和8小时相对于平均媒介物对照值的5.8倍和前所未有的15.1倍增加(图5c)。虽然强诱导是由第一个Tet剂量介导的，但以下三次施用没有进一步增强表达。相反，观察到绝对aFITC水平的降低和不太明显的表达诱导(6.3至11.5倍)。在最后一次Tet剂量后8小时测量的升高的AST、肝特异性ALT和肝线粒体衍生的GLDH血浆活性表明Tet特异性诱导的肝损伤，解释了这一观察结果(图5d)。虽然Tet介导的肝酶升高是众所周知的副作用(Choi等人2015)，在本研究中在Tet处理动物中未观察到其他毒性迹象。
除了aFITC的有效诱导外，还观察到由CMV启动子驱动的cNLuc细胞内表达的成功调节。在肝中，通过测量组织裂解物中的荧光素酶活性观察到Tet处理后3.3倍的增加(图5e)。此外，表达在心脏、肌肉和肺中分别被诱导了4.1倍、2倍和1.3倍。虽然使用LP1介导的抗FITC抗体(15.1倍)和CMV驱动的cNLuc表达(3.3倍)在肝中观察到的基因表达诱导差异可能在于这一事实，即抗FITC scFv被分泌并因此不断被清除，而cNLuc在细胞中积累，我们也将启动子强度视为影响因素。因此，评估了HepG2细胞中LP1和CMV启动子构建体的切换效率。结果显示，虽然CMV启动子强度总体上是LP1的5到15倍(中值：10.3倍差异)，但在Tet刺激后观察到类似的抗FITC表达诱导(范围：3.2-6.5倍，均值CMV：4.4倍，均值LP1：4.1倍)，这不依赖于所表达的转录物的量(图5f)。此外，当比较导致相同基线转录输出的质粒水平时，CMV和LP1构建体之间的开关效率无法区分(图5g)。这些结果提示，观察到的体内差异是由于使用细胞内报告基因相对于分泌报告基因，并且在很大程度上不依赖于使用的启动子。
尽管受阻于诱导时，基线cNLuc表达早已经进行了两周，导致细胞内积累和不太明显的诱导这一事实，但我们的结果清楚地证明，通过核糖开关的基因表达诱导在小鼠的不同器官中是可行的。在这方面的另一个有趣发现是，肝中的总Tet暴露是心脏和肌肉中的暴露的约18倍，但尽管如此，CMV启动子驱动的细胞内cNLuc表达由开关类似地诱导(在肝脏、心脏和肌肉中分别为3.3-、4.1-和2倍)。鉴于AAV9转导效率在肝和心脏中相似(Zincarelli等人2008)，这些结果可能提示心脏表达可能受到核糖开关的特别好的调节，这可能是由于更高的转录和/或mRNA降解活性。虽然需要系统的后续研究来证明这一特定假设，但我们的数据支持这样的普遍假设，即核糖开关控制的基因调节的效力可能部分取决于细胞环境。
在体内环境中证明了Tet开关的功能性后，我们检查了Tet诱导的表达水平与介导组成型表达的常规无核糖开关构建体相比如何。因此，我们在简单的后续实验中重新评估了表达诱导，包括AAV9-LP1-aFITC对照载体和单一Tet引发剂(100mg/kg)以在小鼠中诱导表达(图6a，N＝4只动物/组)。结果显示，核糖开关将转基因表达抑制至组成型对照水平的3.1％，而最大的13.2倍诱导在Tet施用后8小时达到40.1％(图6b)。表达水平在诱导后12小时降至半数最大水平，并在24小时返回基线，很好地证明了配体清除后的可逆性。因此，我们的结果证明了将基因表达暂时诱导到相关维度水平的能力，如组成型对照构建体所定义的那样。
核糖开关载体的一个预期特征是通过调整配体的剂量微调体内表达水平的潜力，但这一点迄今为止尚未得到证实。此外，适体酶原则上应该允许重复，即动态ON-OFF切换，但到目前为止，这方面也还没有在动物中得到实验证明。因此，我们最终研究了四种不同(3、10、30、90mg/kg)单剂量Tet施用(N＝8只动物/组)对报告基因表达诱导的程度和动力学，并进一步探讨了第一次诱导后一周重新刺激表达的可能性。药代动力学(PK)测量进一步能够研究相关的PK/PD关系。对于这个实验，我们再次以2.5x1012vg/kg的之前使用载体剂量使用AAV9-LP1-aFITC载体(图7a)，值得注意的是，这等于在临床中基于AAV的肝指向的血友病B的试验中使用的最大剂量(Manno等人2006；Nathwani等人2011；Nathwani等人2014)。结果显示，重组AAV施用后两周(＝图7b中的t0h)，接受核糖开关载体的动物中的抗FITC抗体表达被抑制至无核糖开关对照构建体水平(设置为100％)的2.5％(图7b)。然而，在增加Tet剂量(3、10、30、90mg/kg)的单次施用后，抗FITC表达被分别迅速诱导至对照的约12％、16％、28％和30％的剂量依赖性峰值表达水平。在3、10和30mg/kg的情况下，在施用后4小时达到最大值，而90mg/kg剂量时仅在8小时达到最大表达。此外，转基因诱导的持续时间也是剂量依赖性的，在较低剂量下恢复到基线发生地更快。然而，在所有情况下，表达最迟在Tet施用后24小时大部分恢复到基线水平。
为了确保完全清除Tet并模拟具有所需表达关闭的无处理阶段，证明持久的核糖开关活性(比较图1)，在重新施用Tet之前等待一周。正如预期的那样，到第21天，转基因表达已完全恢复到基线，显示出与一周前相同的抑制，即对照水平的2.8％(图7b)。重要的是，在重新施用后，表达以与之前所见相同的剂量依赖性方式被诱导，在最高配体剂量下达到对照水平的34％的最大值(即14.7倍诱导)(图7b)。四环素剂量依赖性表达诱导最终也在mRNA水平上得到验证，并且在所有AAV处理的动物中检测到类似的AAV载体基因组计数，具有不影响数据解释的微小波动(图7c)。尽管如此，将mRNA水平标准化为相应的载体基因组进一步减少了组内波动。
与使用多次给药的先前实验相反(图5d)，在当前实验中，血清肝酶活化仅在最高Tet剂量下适度增加(图7d)。事实上，AST、ALT和GLDH的血清活性比多次给药时低4、11和38倍。因此，抗FITC峰值和对照表达水平以及诱导程度在整个实验过程中保持稳定，表明耐受性良好。
药代动力学和药效动力学(PD)测量最终允许Tet血浆水平(图7e)和观察到的aFITC表达诱导(图7b)之间的相关性评估。对于在t4h测量的Tet水平和在t8h的表达诱导(图7f)，观察到最佳非线性三参数拟合(R2＝0.8776)，表明由于细胞内Tet摄取、从头抗FITCmRNA和蛋白合成以及周转引起的时间延迟。总之，我们的结果为在小鼠中以剂量依赖性和高度动态的方式通过配体控制的核糖开关控制病毒载体介导的基因表达的可能性提供了重要证据。
在报告基因背景下的概念成功证明后，报告基因接下来被编码鼠单链IL-12的IL-12基因取代，并包装为AAV9。用携带肝特异性LP1启动子的活性K19-IL-12载体转导HepG2细胞揭示上清液中IL-12背景水平为3％，在最高Tet剂量下诱导6.4倍(图8)。图8中的实验是在p40-接头-p35方向上使用IL-12进行的。在图22中，我们用小鼠和人IL-12构建体的表达质粒(pOptiVEC，Thermo Fisher Scientific)转染HEK293细胞，并可以确认单链IL-12的p40-接头-p35和p35-接头-p40方向产生具有生物活性的IL-12(图22)。
成功的体外生物效能数据是剂量发现研究的基础，该研究使用携带组成型mIL-12无活性构建体的AAV9以三种不同剂量(5x109、5x1010、5x1011vg)静脉递送给幼稚C57Bl/6小鼠(图9)。由于持续的肝细胞来源的转基因表达导致循环中高IL-12的预期副作用，体重减轻被监测为主要终点。在所有AAV.IL-12组中均出现体重的剂量依赖性快速下降，其导致低、中和高剂量动物的生命期分别在第7天、第9天和第11天终止(图10)。相反，媒介物对照组体重增加。在生命期的最后一天收集的处理组的血浆中IL-12水平显示出剂量依赖性，在低剂量组中为48ng/mL(图11)。基线IL-12水平低于对照组的检测阈值。总之，诸如体重减轻等副作用可以解释为病理循环水平IL-12水平所导致，所述IL-12水平源自肝细胞。选择低载体剂量用于所有载体，指定所述载体用于评估幼稚小鼠中Tet诱导的IL-12表达的PD研究(n＝5/组)。研究设计(图12)包括接受AAV9.LP1_mIL12_switch_active的三组小鼠，并在AAV递送后5天和14天用盐水、Tet(10mg/kg)或Tet 30mg/kg)的两次攻击。对照组不接受载体或接受组成型AAV9.mIL-12_switch_inactive且不接受Tet。在第14天Tet再次攻击后8小时，血浆中的Tet浓度在10mg和30mg Tet组中测定为100nM和750nM(图13a)。AAV处理组肝中的转导效率被确定为在各组之间相似(图13b)。持续14天的体重监测揭示仅在组成型AAV9.mIL-12_switch_inactive组中有所下降(图14)，用该载体再现了之前的结果(图10)。同样，该组中的IL-12血浆水平被确定为50ng/mL，表明这些持续的IL-12量是不耐受的(图15a)。该组血浆中IL-12水平的时间进程早在载体递送后第2天就显示出大量的细胞因子量(图15b)。这种快速动力学表明，即使使用单链AAV载体基因组进行基因治疗在快速侵袭性HCC模型中也是可行的。给予Tet应答AAV9.LP1_mIL12_switch_active载体的动物中的血浆IL-12水平显示Tet剂量依赖性诱导。30mg/mL Tet在8小时后比背景水平诱导了几乎11倍(第5天，0小时)(图15c)。在快速启动(fast on-kinetic)后，IL-12水平在24小时后恢复到基线。虽然第14天的Tet-再次攻击以4.7倍略低水平诱导IL-12，但绝对IL-12浓度的范围在2-3ng/mL之间。该水平在预期的治疗窗口内很好，并且没有明显的副作用迹象。此外，去除Tet实际上消除了可检测的IL-12表达。
下面的图16-17包括在前面的图9-15中也呈现的图表。这些图表的描述方式略有不同，但基于同一组数据。
在图16中显示了剂量探索研究，该研究使用携带组成型mIL-12-K19无活性构建体的AAV9以三种不同剂量(5x109、5x1010、5x1011vg)经静脉内向幼稚C57BL/6小鼠递送。通过使用LP1启动子，转基因表达被限制在肝中(图16a)。由于持续的肝细胞来源的转基因表达导致循环中高IL-12的预期副作用，体重减轻被监测为主要终点。所有AAV.IL-12组均出现体重的剂量依赖性快速下降，导致低、中和高剂量动物的生命期分别在第7天、第9天和第11天终止(图16b)。相反，缓冲液对照组的体重增加了。在生命期的最后一天收集的处理组血浆中的IL-12水平显示出剂量依赖性，在低剂量组中为48ng/mL(图16c)。基线IL-12水平低于对照中的检测阈值。总之，诸如体重减轻等副作用可以解释为由源自肝细胞的循环水平IL-12水平引起的毒性所导致。
选择低载体剂量用于所有载体，指定所述载体用于评估幼稚小鼠中Tet诱导的IL-12表达的PD研究(n＝5/组)。研究设计(图17a)包括接受AAV9.LP1-mIL-12-switch和在AAV递送后5天和14天使用缓冲液Tet(10mg/kg)或Tet 30mg/kg)的两次攻击的三组小鼠。对照组不接受载体或接受组成型AAV9.mIL-12-inactive-switch_且不接受Tet。AAV处理组的肝中的转导效率被确定为在各组之间相似(图17b)。在第14天Tet再次攻击后8小时，血浆中的Tet浓度在10mg和30mg Tet组中被确定为100nM和750nM(图17c)。用Tet应答AAV9.LP1-mIL-12-switch载体给药的动物中的血浆IL-12水平显示出Tet剂量依赖性诱导(图17d)。30mg/mL Tet在8小时后比背景水平诱导了几乎11倍(第5天，0小时)。在快速启动后，IL-12水平在24小时后恢复到基线。虽然第14天的Tet-再次攻击以4.7倍略低水平诱导IL-12，但绝对IL-12浓度的范围在2-3ng/mL之间。该水平在预期的治疗窗口内很好，并且没有明显的副作用迹象。此外，去除Tet实际上消除了可检测的IL-12表达。同样，该组中的IL-12血浆水平被确定为50ng/mL，表明这些持续的IL-12量是不耐受的(图17e)。早在载体递送后第2天，该组血浆中IL-12水平的时间进程就显示出大量的细胞因子量(图17f)。AAV介导的转基因表达的这种快速动力学表明，即使使用单链AAV载体基因组进行基因治疗在快速侵袭性HCC模型中也是可行的。表达水平在第2天和第14天稳定期之间增加。该观察结果解释了在接受不含Tet的IL-12活性载体的动物中观察到的背景IL-12水平的轻微升高(图17d，e)。
然后我们进行了全面的剂量探索研究，以确定使用持续Tet攻击的Tet开关控制的IL-12表达的PK和安全性(图18a)。研究设计需要以5x107-5x1010vg/小鼠的剂量递送AAV9-LP1-mIL-12-switch载体。每组的一半动物连续5天每天两次经历Tet应用，而另一半则不接受Tet。本研究的目的是确定载体剂量，该剂量允许在Tet攻击期间血浆中相关IL-12水平的Tet依赖性持续诱导，但在实验结束前恢复到低背景水平或无背景水平。次要终点是监测潜在的体重减轻和肝酶作为毒性的度量。事实上，我们观察到除两个最高AAV9-LP1-mIL-12-switch剂量组和无活性开关组外，所有组的纵向体重发展都是正常的，这表明大多数组的IL-12水平和通常Tet是良好耐受的(图18b)。IL-12水平显示出载体剂量依赖性(图18c、d)。重要的是，在5x108vg组活性开关组中，IL-12水平在最后一次Tet暴露后3天恢复到背景(图18e)并显示正常水平的肝酶(图18f、g、h)。重要的是，5x108vg活性开关组显示出升高水平的IFNγ，其是IL-12诱导的T细胞活化的关键效应物(图18i)。总之，基于没有体重减轻，5x109vg的AAV9-LP1-mIL-12-switch_剂量被确定为最大耐受剂量，而5x108vg的剂量具有最佳的PD和安全性。然后在使用HCC小鼠模型的PD研究中指定这些剂量。研究设计(图19a)是从剂量探索研究中采用的。两组小鼠接受剂量为5x108vg的AAV9-LP1-mIL-12-switch_，一组接受Tet，另一组未接受。以5x109vg和Tet施用相同的载体。剂量匹配组接受了基准载体AAV9-LP1-mIL-12_-inactive-switch，以便可能实现缓解，即使根据我们之前的研究预计会有不利影响。在研究结束时，我们证实了所有载体处理组的剂量依赖性转导效率(图19b)。与剂量匹配的对照组相比，Tet诱导的IL-12调节的范围在Tet治疗方案开始时为9.8倍，并在最终攻击后降至背景水平(图19c)。IL-12背景水平通常高于无肿瘤小鼠，表明肿瘤模型中内源性IL-12产生增加。全身成像用于定量来自移植的Hepa1-6细胞的荧光素酶信号强度作为肿瘤大小的相关性(图19d)。值得注意的是，基准无活性开关组和高剂量活性开关组都显示出减少肿瘤大小的益处，但也通过失去动物反映出毒性。事实上，观察到似乎显示出IL-12应答的缓解。在研究结束时评估的肝重量与成像数据一致(图19e)。进行了肝酶测量但没有结论(图19f、g、h)，表明在该疾病模型中需要药物耐受性的其他标准。记录的体重发展也是如此，但是被大量的肿瘤生长所混淆，大量的肿瘤生长掩盖了体重减轻并因此掩盖了毒性(未显示)。重要的是，IL-12免疫疗法与CD45+细胞归巢到肿瘤结节和肝中肿瘤面积的减少并行，表明成功实现了将冷肿瘤变热的概念(图20a、b)。
此外，我们在HEK293细胞中显示，K19核糖开关通过以药物剂量依赖性方式诱导人IL-12(5.6倍)来响应Tet(图21)，与6.4倍AAV介导的Tet诱导的mIL-12表达相当，如图8所示。
最后，使用HEK-BlueTM IL-12细胞，我们显示了包含在HEK293细胞上清液中的人单链IL-12的生物活性，已经用编码人单链IL-12的质粒转染了所述HEK293细胞(图22)。该生物测定揭示了鼠和人类IL-12之间的生物活性相当。此外，生物活性不依赖于单链hIL-12蛋白中p35和p40的顺序。
总之，这些数据表明，使用AAV血清型、载体剂量、Tet给药方案和靶器官的合理组合，可以以时空方式严格控制IL-12基因治疗，以获得安全且有效的免疫调节效果。IL-12数据证实了通过在核糖开关环境中调整配体剂量来微调体内治疗性蛋白表达水平的可能性。此外，适体酶介导的对IL-12表达的控制实现能够重复的、即动态ON-OFF切换。
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表2：
此表显示文中提到的FASTA格式的序列。如与序列表不一致，以表中序列为准。
>SV40 poly(A)(SEQ ID.No.7)
>AAV2 ITR(SEQ ID.No.8)
>K19核糖开关DNA(描述于Beilstein等人，2014)(SEQ ID No.9)
>K19核糖开关RNA(SEQ ID.No.10)
>编码功能性mIL-12单链的核苷酸序列(人IgG信号肽，p40亚基，(Gly4Ser)3接头，p35亚基(SEQ ID No.11)
>没有信号肽的功能性mIL-12单链(p40亚基，(Gly4Ser)3接头，p35亚基)的蛋白序列(SEQ ID.No.12)
>人IgG信号肽(SEQ ID No.13)
>鼠IL-12β链(p40亚基)(SEQ ID No.14)
>鼠IL-12α链(p35亚基)(SEQ ID No.15)
>(Gly4Ser)3接头(SEQ ID No.16)
引物序列
>K19-核糖开关FW(SEQ ID No.17)
>K19-核糖开关RV(SEQ ID No.18)
>K19-核糖开关探针(SEQ ID No.19)
>抗FITC基因FW(SEQ ID No.20)
>抗FITC基因RV(SEQ ID No.21)
>抗FITC基因探针(SEQ ID No.22)
>polr2a FW(SEQ ID No.23)
>polr2a RV(SEQ ID No.24)
>polr2a探针(SEQ ID No.25)
>POLR2A FW(SEQ ID No.26)
>POLR2A RV(SEQ ID No.27)
>POLR2A探针(SEQ ID No.28)
质粒子序列(ITR之间的区域)参见图23
>pAAV.LP1-mIL-12-3’-核糖开关(SEQ ID No.29)
>pAAV.LP1-aFITC-3’-核糖开关(SEQ ID No.30)
>pAAV.CMV-cNluc-3’-核糖开关(SEQ ID No.31)
>pAAV.CMV-GFP-3’-核糖开关(SEQ ID No.32)
>hIL-12第一方向，额外接头(SEQ ID No.34-35)，参见表1
>hIL-12第二方向(SEQ ID No.36-41)，参见表1
>LP1-启动子/SV40-内含子(SEQ ID No.42
>WT AAV2 ITR(SEQ ID No.43)
>AAV ITRΔC(SEQ ID No.44)
>K19核糖开关-无活性DNA(SEQ ID No.45)
>pAAV.LP1-mIL-12-3’-核糖开关(SEQ ID No.46)-通过确证性测序确证的Seq ID29的序列，其在左ITR具有11nt缺失
>pAAV.LP1-mIL-12-3’-核糖开关(SEQ ID No.47)-Seq ID 29的序列，但是wtAAV2 ITR序列代替了Seq ID 29中显示的那些
>AAV.LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.50)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；在ITR中携带4nt缺失
>AAV.LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.51)信号肽，IL12 p35-(G4S)3-p40；在ITR中携带4nt缺失
>人-免疫球蛋白-信号-序列(Seq ID No.52)
>信号-序列-p35-p40-huIL12(Seq ID No.53)
>p35-p40-huIL12(在信号序列切割后)(Seq ID No.54)
>信号-序列-p35-p40-huIL12-GS_接头(Seq ID No.55)
>p35-p40-huIL12-GS_接头(在信号序列切割后)(Seq ID No.56)
>AAV.LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.57)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；AAV2-WT ITR
>pAAV.LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.58)；信号肽，IL12 p35-(G4S)3-p40；AAV2-WT ITR
>AAV.LP1_SV40-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.59)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；AAV2-WT ITR
>pAAV.LP1_SV40-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.60)：信号肽，IL12 p35-(G4S)3-p40；AAV2-WT ITR
>AAV.LP1_SV40-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.61)：信号肽，IL12p40-(G4S)3-p35；在ITR中携带4nt缺失
>pAAV.LP1_SV40-hIL-12-3’核糖开关(SEQ ID No.62)；信号肽，IL12p35(G4S)3p40；在ITR中携带4nt缺失
>AAV.LP1_SV40-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.63)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；在左ITR中携带11nt和4nt缺失，在右ITR中携带4nt缺失
>AAV.LP1_SV40-hIL-12-3’核糖开关(SEQ ID No.64)；信号肽，IL12 p35(G4S)3p40；在左ITR中携带11nt和4nt缺失，在右ITR中携带4nt缺失
>AAV.LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.65)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；在左ITR中携带11nt和4nt缺失，在右ITR中携带4nt缺失
>AAV.LP1-hIL-12-3’核糖开关(SEQ ID No.66)；信号肽，IL12 p35(G4S)3p40；在左ITR中携带11nt和4nt缺失，在右ITR中携带4nt缺失
人CEA启动子(Seq ID No.67)
人Muc1启动子(Seq ID No.68)
人AFP启动子(Seq ID No.69)
GenBank：AAN03857.1衣壳蛋白腺相关病毒8，AAV8 VP1序列(SEQ ID No.70)
GenBank：AF513852.1 AAV8 VP1衣壳CDS序列(序列ID No.71)
>没有SV40内含子的LP1启动子(Seq ID 72)
>LP1-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.73)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；表达盒
>LP1_SV40-hIL-12-3’-核糖开关(Seq ID No.74)：信号肽，IL12 p40-(G4S)3-p35；表达盒
>单链人IL12-具有SEQ ID NO：52的SP，长接头(Seq ID No.75)
表3：
表4：
可选的人单链IL12序列可选自a.1到a.20：

Claims (63)

1.核酸构建体，其包含编码一种或多种治疗性蛋白的转基因、至少一个四环素应答适体酶序列和反向末端重复序列(ITR)。
2.根据权利要求1的核酸构建体，其进一步包含启动子，例如肝特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
3.根据权利要求1或2的核酸构建体，其中所述启动子选自人巨细胞病毒(CMV)启动子、肝特异性启动子LP1、肿瘤特异性甲胎蛋白(AFP)启动子、人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、CEA启动子和Muc1启动子。
4.根据权利要求1-3中任一项的核酸构建体，其进一步包含poly(A)信号，例如SV40poly(A)信号。
5.根据权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含单链DNA。
6.根据权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含双链DNA。
7.根据权利要求1-6中任一项的核酸构建体，其中所述ITR位于所述转基因和适体酶序列的侧翼。
8.根据权利要求7的核酸构建体，其中所述ITR来源于AAV2。
9.根据权利要求1-8中任一项的核酸构建体，其包含转基因表达盒，所述转基因表达盒包含启动子、编码治疗性蛋白的转基因、多腺苷酸化信号和ITR。
10.根据权利要求1-9中任一项的核酸构建体，其中所述转基因编码其组成型表达导致毒副作用的蛋白。
11.根据权利要求10的核酸构建体，其中所述毒副作用包括由免疫应答的强烈和持续激活引起的严重病况，例如恶病质、发烧、发冷、疲劳、关节痛和/或头痛。
12.根据权利要求1-9中任一项的核酸构建体，其中所述转基因编码一种或多种免疫调节蛋白。
13.根据权利要求12的核酸构建体，其中所述免疫调节蛋白选自白细胞介素、干扰素、抗体、抗体片段和TNF/TNFR超家族的促炎或促凋亡成员。
14.根据权利要求13的核酸构建体，其中所述免疫调节蛋白是选自IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-23、IL-27和IL-33的白细胞介素。
15.根据权利要求14的核酸构建体，其中所述白细胞介素是单链IL-12，优选包含选自SEQ ID No.1-6的一个或多个序列的单链IL-12。
16.根据权利要求1-15中任一项的核酸构建体，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列位于所述转基因的3′。
17.根据权利要求1-16中任一项的核酸构建体，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列在四环素结合后诱导或增强所述转基因的表达。
18.根据权利要求1-17中任一项的核酸构建体，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列包含SEQ ID NO：9的序列。
19.根据权利要求1-18中任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含多于一个四环素应答适体酶序列。
20.根据权利要求1-19中任一项的核酸构建体，其中所述构建体是质粒。
21.根据权利要求1-20中任一项的核酸构建体，其中所述构建体包含编码单链IL-12的转基因、包含SEQ ID NO：9的序列的至少一个四环素应答适体酶序列、源自AAV2的ITR，和任选地肝特异性启动子LP1。
22.根据权利要求21的核酸构建体，其包含SEQ ID NO：50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中列出的任何序列或其互补序列或其双链形式。
23.根据权利要求1-22中任一项的核酸构建体，其中本发明的核酸构建体在递送至测试受试者后导致与在向所述受试者施用30mg四环素/kg体重后8小时的基线水平相比至少4倍，优选至少6倍、至少8倍、或至少9倍的转基因表达水平，其中所述测试受试者优选是小鼠。
24.转基因表达盒，其包含启动子、编码一种或多种治疗性蛋白的转基因和至少一个四环素应答适体酶序列。
25.根据权利要求24的转基因表达盒，其中所述启动子是肝特异性启动子或肿瘤特异性启动子。
26.根据权利要求24-25中任一项的转基因表达盒，其进一步包含poly(A)信号，例如SV40 poly(A)信号。
27.根据权利要求24-26中任一项的转基因表达盒，其中所述构建体包含单链DNA或双链DNA。
28.根据权利要求24-27中任一项的转基因表达盒，其中所述转基因编码一种或多种免疫调节蛋白。
29.根据权利要求28的转基因表达盒，其中所述免疫调节蛋白选自白细胞介素、干扰素、抗体、抗体片段和TNF/TNFR超家族的促炎或促凋亡成员。
30.根据权利要求29的转基因表达盒，其中所述免疫调节蛋白是选自IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-23、IL-27和IL-33的白细胞介素。
31.根据权利要求30的转基因表达盒，其中所述白细胞介素是单链IL-12，优选包含选自SEQ ID No.1-6的一个或多个序列的单链IL-12。
32.根据权利要求24-31中任一项的转基因表达盒，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列位于所述转基因的3′。
33.根据权利要求24-32中任一项的转基因表达盒，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列在四环素结合后诱导或增强所述转基因的表达。
34.根据权利要求24-33中任一项的转基因表达盒，其中所述至少一个四环素应答适体酶序列包含SEQ ID NO：9的序列。
35.根据权利要求24-34中任一项的转基因表达盒，其中所述盒包含多于一个四环素应答适体酶序列。
36.根据权利要求24-35中任一项的转基因表达盒，其中所述构建体包含编码单链IL-12的转基因、包含SEQ ID NO：9的序列的至少一个四环素应答适体酶序列，和任选地肝特异性启动子LP1。
37.包含衣壳和包装的核酸的病毒载体，其中所述包装的核酸包含根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体或根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒。
38.根据权利要求37的病毒载体，其中所述载体是重组AAV载体。
39.根据权利要求38的病毒载体，其中所述载体是具有AAV-2、AAV-8或AAV-9血清型的重组AAV载体。
40.根据权利要求37-39中任一项的病毒载体，其中所述衣壳包含提供与靶组织、例如肝组织选择性结合的氨基酸序列。
41.根据权利要求37-40中任一项的病毒载体，其中所述载体是具有AAV-8血清型的重组AAV载体。
42.根据权利要求41的病毒载体，其中所述载体包含权利要求21的核酸构建体或权利要求36的转基因表达盒。
43.具有AAV-8血清型的病毒载体，其包含SEQ ID NO：50、51、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中列出的任何序列或其互补序列或其双链形式。
44.根据权利要求43的病毒载体，其包含SEQ ID NO：57和59中列出的任何序列。
45.根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体，其用于药物中。
46.根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体，其用于治疗增生性疾病的方法中。
47.权利要求46的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中所述增生性疾病是纤维化或癌症疾病。
48.权利要求47的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中所述癌症疾病选自肝癌、脑癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肛门癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌、外阴癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、口咽癌、喉癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
49.权利要求48的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中所述癌症疾病是肝癌。
50.权利要求49的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)、胆管癌、肝血管肉瘤或肝的神经内分泌癌。
51.权利要求48的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中所述癌症疾病是结肠直肠癌。
52.权利要求47-51中任一项的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中待治疗的患者具有位于肝脏中的一个或多个癌症病变。
53.权利要求47-51中任一项的用于方法中的核酸构建体、转基因表达盒或病毒载体，其中待治疗的患者具有一个或多个肝转移。
54.细胞，其包含根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体。
55.药物组合物，其包含根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂。
56.治疗增生性疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-35中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体。
57.根据权利要求56的方法，其中所述增生性疾病是纤维化或癌症疾病。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述癌症疾病选自肝癌、脑癌、胰腺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、肛门癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌、外阴癌、皮肤癌、泌尿生殖系统癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、口咽癌、喉癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
59.根据权利要求58的方法，其中所述癌症疾病是肝癌。
60.根据权利要求59的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)或胆管癌。
61.根据权利要求56-60中任一项的方法，其中待治疗的患者具有位于肝脏的一个或多个癌症病变。
62.根据权利要求1-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24-36中任一项的转基因表达盒或根据权利要求37-44中任一项的病毒载体在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。
63.根据权利要求62的用途，其中所述增生性疾病是纤维化或癌症疾病，优选肝癌。
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