CN107921131A

CN107921131A - Pd‑l1(“程序性死亡配体1”)抗体

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Publication number: CN107921131A
Application number: CN201680048919.5A
Authority: CN
Inventors: 李义文; D.L.路德维希; V.莫尔肯欣; 沈鞠群; M.D.斯纳维利
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-08-24
Filing date: 2016-08-18
Publication date: 2018-04-17
Also published as: JP2018531219A; CL2018000454A1; ECSP18013690A; US10214586B2; MX2018002170A; BR112018001506A2; PE20180604A1; DOP2018000045A; TN2018000044A1; EP3341020A1; IL256922A; AU2016313404B2; US20170058033A1; CA2994425C; CO2018002009A2; CR20180048A; US20190144544A1; KR20180030899A; WO2017034916A1; PH12018500394A1

Abstract

本发明涉及结合人类程序性细胞死亡1配体1(PD‑L1)的抗体，其可用于单独和与化疗和其他癌症治疗剂组合治疗实体和血液肿瘤。所述抗体具有特定可变链序列。根据实验结果，它们表现出转变成更好体内活性的优异结合速率和优异的针对肿瘤细胞的T细胞反应。

Description

PD-L1(“程序性死亡配体1”)抗体

本发明涉及医药领域。更具体地，本发明涉及这样的抗体，所述抗体结合人类程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)，并且可用于单独和与化疗和其他癌症治疗剂组合以治疗实体和血液肿瘤。

肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的检测和排除。免疫核查点途径用于维持自身耐受性和控制T细胞活化，但癌细胞可使用所述途径以抑制抗肿瘤反应且防止其破坏。

PD-L1/人类程序性细胞死亡1(PD-1)途径为一种此类免疫核查点。人类PD-1发现于T细胞上，且PD-L1与PD-1的结合抑制T细胞增殖和细胞因子产生。PD-1/PD-L1抑制轴已被肿瘤征服，其作为天然选择性过程的一部分，其在抗肿瘤免疫反应的情形下形成肿瘤演进。PD-L1也结合B7-1(CD80)；B7-1为T细胞活化的另一负调节子。相应地，PD-L1由多种肿瘤类型异常表达，且已发现肿瘤细胞上的PD-L1的表达增加与许多癌症的更差预后相关。作为免疫活化和促炎性细胞因子产生的结果，PD-L1表达在免疫和其他细胞中的肿瘤微环境中也受到上调，进一步促成T细胞免疫抑制环境的建立。阻断PD-L1可促进肿瘤反应T细胞的再活化，恢复其有效检测和杀死肿瘤细胞的能力。

针对人类PD-L1的人类IgG1抗体MPDL3280A已显示阻断与PD-1和B7-1的结合，且已在人类临床试验中进行测试(Herbst等人, Nature (2014) 515:563; Cha等人, Seminarsin Oncology (2015) 42(3):484；和美国专利申请2010/0203056)。针对人类PD-L1的人类IgG1抗体MEDI4736已显示阻断与PD-1和B7-1的结合，且已在人类临床试验中进行测试(Ibrahim等人，Seminars in Oncology (2015) 42(3):474；和美国专利申请2013/0034559)。

仍需要提供结合人类PD-L1且中和PD-L1与PD-1和B7-1相互作用的替代抗体。具体而言，仍需要提供以更有利属性(诸如更好的结合速率)结合的PD-L1抗体。较快结合至靶标对于治疗性抗体而言可转变成更好的体内活性。另外，仍需要提供更好增强针对肿瘤的T细胞反应的PD-L1抗体，如通过对肿瘤尺寸的影响、通过CD3阳性T细胞的浸润水平和通过在体内模型中呈CD8阳性的T细胞的百分比所测量。

在已建立的肿瘤模型和未建立的肿瘤模型中，相比于某些现有技术抗体，本发明的某些抗体介导针对肿瘤的增强的T细胞反应，如通过肿瘤尺寸所测量。相比于某些现有技术抗体，本发明的某些抗体在模型中介导针对肿瘤的增强的T细胞反应，如通过CD3阳性T细胞浸润所测量。

相应地，在一些实施方案中，本发明提供结合人类PD-L1(SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，且其中所述LCVR包含分别由氨基酸序列SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 5)、YGNSNRPS (SEQ ID NO: 6)和QSYDSSLSGSV (SEQ ID NO: 7)组成的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其中所述HCVR包含分别由氨基酸序列KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2)、GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 3)和ARSPDYSPYYYYGMDV (SEQ ID NO: 4)组成的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，本发明提供包含轻链(LC)和重链(HC)的抗体，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR具有SEQ ID NO:9中给出的氨基酸序列，且所述HCVR具有SEQ ID NO: 8中给出的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供抗体，其中所述LC具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且所述HC具有SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供包含两条轻链和两条重链的抗体，其中各轻链具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且各重链具有SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明提供抗体，其中重链之一与轻链之一形成链间二硫键，且另一重链与另一轻链形成链间二硫键，且重链之一与另一重链形成两个链间二硫键。

在另一个实施方案中，本发明提供抗体，其中所述抗体被糖基化。

在一个实施方案中，本发明提供包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含：编码具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列；和编码具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供产生包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链的抗体的方法，其包括在使得表达抗体的条件下培养本发明的哺乳动物细胞，且回收表达的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供通过本发明方法产生的抗体。

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本发明的抗体，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为黑色素瘤。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为肺癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为头颈癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为胰腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为胃癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为肾癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为前列腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为乳腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为食道癌。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为软组织肉瘤。在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，其中所述癌症为肝细胞癌。

在另一个实施方案中，这些方法包括施用有效量的本发明的抗体且同时、分开或依次组合施用一种或多种抗肿瘤剂。所述抗肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗、necitumumab、奥拉单抗(olaratumab)、高伦替布(galunisertib)、阿贝力布(abemaciclib)、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾瑞布林、紫杉醇、用于可注射悬浮液的紫杉醇蛋白结合的颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔单抗。

在另一个实施方案中，这些方法包括施用有效量的本发明化合物且同时、分开或依次组合施用一种或多种免疫肿瘤学药剂。免疫肿瘤学药剂的非限制性实例包括：纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、pidilizumab、派姆单抗(pembrolizumab)、曲美单抗(tremelimumab)、优瑞路单抗(urelumab)、利瑞路单抗(lirilumab)、阿特唑单抗(atezolizumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。

在一个实施方案中，本发明提供用于疗法中的本发明的抗体。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为黑色素瘤。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为肺癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为头颈癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为结肠直肠癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为胰腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为胃癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中癌症为肾癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为前列腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为乳腺癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为食道癌。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为软组织肉瘤。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的本发明的抗体，其中所述癌症为肝细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供用于与一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或依次组合的本发明的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供用于与一种或多种选自以下的抗肿瘤剂同时、分开或依次组合以治疗癌症的本发明的抗体：雷莫芦单抗、necitumumab、奥拉单抗、高伦替布、阿贝力布、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾瑞布林、紫杉醇、用于可注射悬浮液的紫杉醇蛋白结合的颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)和西妥昔单抗。

在另一个实施方案中，本发明提供用于与一种或多种免疫肿瘤学药剂同时、分开或依次组合的本发明的抗体。在另一个实施方案中，本发明提供用于与一种或多种选自以下的免疫肿瘤学药剂同时、分开或依次组合以治疗癌症的本发明的抗体：纳武单抗、伊匹单抗、pidilizumab、派姆单抗、曲美单抗、优瑞路单抗、利瑞路单抗、阿特唑单抗和德瓦鲁单抗。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途。在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途，其中所述药剂与一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或依次施用。在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途，其中所述药剂与一种或多种选自以下的抗肿瘤剂同时、分开或依次施用：雷莫芦单抗、necitumumab、奥拉单抗、高伦替布、阿贝力布、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体多柔比星、多西他赛、环磷酰胺和多柔比星、诺维本、艾瑞布林、紫杉醇、用于可注射悬浮液的紫杉醇蛋白结合的颗粒、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)和西妥昔单抗。

在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途，其中所述药剂与一种或多种免疫肿瘤学药剂同时、分开或依次施用。在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于制造用于治疗癌症的药剂的用途，其中所述药剂与一种或多种选自以下的免疫肿瘤学药剂同时、分开或依次施用以治疗癌症：纳武单抗、伊匹单抗、pidilizumab、派姆单抗、曲美单抗、优瑞路单抗、利瑞路单抗、阿特唑单抗和德瓦鲁单抗。

本发明的抗体是工程改造的非天然存在的多肽复合物。本发明的DNA分子是非天然存在的DNA分子，其包含编码具有本发明的抗体中的多肽之一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。

本发明的抗体是IgG型抗体且具有经由链内和链间二硫键交联的“重”链和“轻”链。各重链由N末端HCVR和重链恒定区(“HCCR”)构成。各轻链由LCVR和轻链恒定区(“LCCR”)构成。当在某些生物系统中表达时，具有天然人Fc序列的抗体在Fc区中被糖基化。通常，糖基化发生于抗体的Fc区中的高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖通常附接至天冬酰胺。抗体同样可在其他位置处被糖基化。

任选地，本发明的某些抗体含有来源于人类IgG₁的Fc部分。众所周知IgG1结合至Fc-γ受体家族(FcγR)的蛋白以及C1q。与这些受体的相互作用可诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，任选地，本发明的某些抗体为缺乏Fc效应子功能的完全人类单克隆抗体(IgG1，λ，无Fc)。为了获得无Fc的IgG1抗体，必需在其IgG1 Fc区的CH2区域内选择性诱变残基。将氨基酸取代L234A、L235E和G237A引入IgG1 Fc中以减少与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII的结合，且引入取代A330S和P331S以减少C1q介导的补体结合。

为了减少当在人类中给药时对免疫反应的潜在诱导，某些氨基酸可能需要回复突变以匹配抗体种系序列。本发明的某些抗体在可变重链中含有E1Q和S94R突变且在可变轻链中含有T76S和A80S突变。

HCVR和LCVR区可进一步细分成间插有更保守区(称为框架区("FR"))的超变区(称为互补决定区("CDR"))。各HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR称为"HCDR1、HCDR2和HCDR3"且轻链的三个CDR称为"LCDR1、LCDR2和LCDR3"。CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。目前存在三种用于序列划定的抗体CDR指定系统。KabatCDR定义(Kabat等人, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))基于抗体序列可变性。Chothia CDR定义(Chothia等人, “Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917(1987)；Al-Lazikani等人, “Standard conformations for the canonical structuresof immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学。除HCDR1和HCDR2外，Chothia CDR定义与Kabat CDR定义是相同的。North CDR定义(North等人, “A New Clustering of Antibody CDR LoopConformations”, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类。出于本发明的目的，使用North CDR定义。

可通过使编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子来将编码HCVR区的分离DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。可例如通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。

可通过使编码LCVR的DNA可操作连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子来将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗体而言，轻链恒定区为λ恒定区。

在序列已可操作连接至表达控制序列之后，将在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体将含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。

本发明的抗体可容易在哺乳动物细胞(诸如CHO、NS0、HEK293或COS细胞)中产生。使用本领域众所周知的技术培养宿主细胞。

可通过众所周知方法将含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽的多核苷酸和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。

可采用各种蛋白纯化方法，且此类方法是本领域已知的，且描述于，例如，Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)。

在本发明的另一个实施方案中，以分离形式提供抗体或编码其的核酸。如本文所使用，术语“分离”是指不含或基本上不含发现于细胞环境中的任何其他大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所使用的“基本上不含”意指目标蛋白、肽或核酸包含大于80%(以摩尔计)、优选地大于90%和更优选地大于95%的存在的大分子物质。

本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径(例如，皮下和静脉内)施用。本发明的抗体可单独与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于患者。本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法制备(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(2012), A. Loyd等人, PharmaceuticalPress)且包含如本文所公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

术语“治疗(treating或treat或treatment)”是指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减轻或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重度。

除非另外指明，如本文提及抗体对人PD-L1的亲和力所使用的“结合”意指小于约1x 10^-6M、优选地小于约1 x 10^-9 M的K_D，如通过本领域已知的常用方法(包括通过基本上如本文所述在37℃下使用表面等离振子共振(SPR)生物传感器)所测定。

“有效量”意指本发明的抗体或包含本发明的抗体的药物组合物针对组织、系统、动物、哺乳动物或人诱发的研究者、医师或其他临床医师寻求的生物或医学反应或期望治疗效应的量。抗体的有效量可根据因素而变化，所述因素诸如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及抗体在个体内诱发期望反应的能力。有效量也是治疗有益效应胜过抗体的任何毒性或有害效应的量。

通过下列非限制性实施例来进一步说明本发明。

实施例1：抗体表达和纯化

抗体A的重链和轻链的可变区的多肽、完整重链和轻链氨基酸序列和编码其的核苷酸序列列于下文标题为"氨基酸和核苷酸序列"的部分中。此外，抗体A的轻链、重链、轻链可变区和重链可变区的SEQ ID NO显示于表1中。

可基本上如下所述制备并纯化本发明的抗体(包括但不限于抗体A)。可用用于分泌抗体的表达系统使用最佳预定HC：LC载体比率或编码HC和LC两者的单一载体系统瞬时或稳定转染适当宿主细胞(诸如HEK 293或CHO)。可使用许多常用技术中的任一者纯化其中已分泌抗体的经澄清培养基。例如，可将培养基便利地施加至已用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)(用于Fab片段)。可洗涤该柱以去除非特异性结合组分。可例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液(pH 7)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))洗脱结合抗体。可诸如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后可合并。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可使用常用技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可通过常用技术(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换、多态或羟基磷灰石色谱)有效去除可溶性聚集物和多聚体。抗体在这些色谱步骤之后的纯度大于95%。产物可立即在-70℃下冷冻或可冻干。

表1: SEQ ID NO

	抗体A
		HCVR	8
LCVR	9
		重链	10
轻链	11

测定

体内活性-WINN测定

可用Winn测定来测试本发明的抗体的体内免疫调节活性。在Winn测定中，将人类肿瘤细胞和人类免疫细胞(同种异体)一起同时注射至免疫缺陷小鼠中，且然后随后用免疫调节剂给药。可评估免疫调节剂在模型中延迟或阻断肿瘤生长的能力。测量肿瘤体积以确定免疫调节剂在测定中的作用且确定针对肿瘤的免疫反应是否增强。

如本文所用，2.14H9OPT是利用来自美国专利申请2013/0034559的重链和轻链序列的人类IgG1 PD-L1抗体。如本文所用，S70是利用来自美国专利申请2010/0203056的重链和轻链序列的人类IgG1 PD-L1抗体。对于2.14H9OPT和S70两者，使重链与含有位于L234A、L235E、G237A、A330S和P331S的残基变化的人类IgG1恒定区的可变区融合，以使与Fc γ受体和补体级联有关的效应子功能沉默。对于2.14H9OPT和S70两者，重组蛋白表达于哺乳动物细胞中且通过标准ProA纯化方法纯化。

本发明的抗体对针对同种异体抗原的免疫反应增强可在NCI-H292人类NSCLC异种移植模型中进行测试。第0天，将2×10⁶个H292细胞，或2×10⁶个H292细胞和1×10⁶个人类PBMC于HBSS(0.2ml总体积)中的混合物皮下植入来自Jackson Laboratories的NSG小鼠(7周龄，雌性，8-10只小鼠的组中)的侧腹中。在第1天开始，通过腹膜内(i.p.)注射10mg/kg抗体(每周一次)来处理小鼠。监测动物健康和行为(包括整饰(grooming)和步行)，每周至少两次。

测量体重和肿瘤体积，一周两次。在第36天从所有组收集肿瘤样本。使用兔抗小鼠CD3抗体(与人类交叉反应，Abcam)对肿瘤样品进行免疫组织化学(IHC)染色，随后用二级HRP缀合的抗兔IgG(Dako)染色。

在细胞植入后的第4天开始，每周两次使用电子卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积(mm³)=π/6 *长度*宽度²。抗肿瘤功效表示为T/C比率(以百分比计)且如下文所概述进行计算：

如果几何平均值的△T>0，则通过式100△T/△C计算%T/C。△T=药物处理组在研究最后一日时的平均肿瘤体积 - 药物处理组在初始给药日时的平均肿瘤体积；△C=对照组在研究最后一日时的平均肿瘤体积 - 对照组在初始给药日时的平均肿瘤体积。另外，如果△T<0，则使用式=100×△T/T_初始计算%回归。肿瘤不可测量的动物被视为完全反应者(CR)且具有>50%消退的肿瘤为部分反应者(PR)。

用时间和处理的双向重复测量变异分析，使用SAS软件(版本9.2)中的MIXED程序分析直至第35天的肿瘤体积数据。所分析的反应为肿瘤体积的对数转换。对数转换为使跨越时间和处理组的变异相等所必需。重复测量模型的相关结构为空间幂。针对各时间点，进行处理组与对照组的预定义成对比较。

也可通过使用针对CD3染色测量CD3阳性T细胞的存在和用Aperio扫描范围进行分析，来分析来自模型的肿瘤切片中的CD3阳性T细胞浸润。IHC核图像分析宏在使用者所选择的那些区域中对个别细胞的目标色原检测核染色并定量其强度。由活肿瘤面积得到三至五个注释并用于调整参数，直至算法结果产生一致的细胞鉴定。然后保存宏且放入载片用于分析。通过Aperio软件将% CD3阳性细胞计算为细胞总数的百分比。

肿瘤体积

在基本上如该测定中所述进行的实验中，以10mg/kg给药(qw，ip)的抗体A被良好耐受，如通过体重和临床观察结果所监测。当向免疫缺陷动物中不添加免疫细胞作为实验对照组(植入肺癌细胞系H292、但不植入PBMC的小鼠)时，相比于用人类IgG的处理，用10mg/kg给药(qw，ip)的抗体A或2.14H9OPT的处理对H-292肿瘤生长无影响。

当向免疫缺陷动物中添加免疫细胞和测试抗体时，抗体A产生的结果显著优于对照IgG，而2.14H9OPT则不是如此。用NCI-H292肿瘤和PBMC共植入且给药10mg/kg(qw)的抗体A的小鼠产生35%的T/C，其显著不同于对照IgG处理的小鼠(p=0.006)。用NCI-H292肿瘤和PBMC共植入、给药10mg/kg(qw，ip)的2.14H9OPT的小鼠产生54%的T/C，其相比于用人类IgG处理没有显著性差异(P=0.102)。

CD3阳性T细胞浸润

在基本上如该测定中所述进行的实验中，通过IHC测定，用肺肿瘤系H292和人类PBMC对小鼠的共植入(作为对照组)导致肿瘤中存在的人类CD3 T细胞增加10%，如植入后第36天所测量；而仅植入H292细胞的动物具有CD3 T细胞的3%增加。用PBMC和抗体A处理(以10mg/kg给药，qw，i.p.)导致人类CD3 T细胞增加13%；PBMC+抗体A处理组相比于PBMC+IgG对照组的统计显著性具有0.021的p值。相比于用H292细胞和人类PBMC共植入的用IgG处理的对照组，用PBMC和2.14H9OPT处理(以10mg/kg给药，qw，i.p.)未增加%人类CD3 T细胞浸润(对于2.14H9OPT，CD3 T细胞增加9%，相比之下，对于对照组，CD3 T细胞增加10%)。

用PBMC人源化的NSG小鼠中建立的人类肿瘤异种移植模型

可在NCI-H827人类NSCLC异种移植模型中测试本发明的抗体的功效，以评估延迟或破坏模型中的已建立的肿瘤的能力。在第0天，将1×10⁷个H827细胞皮下植入NSG小鼠(7周龄，雌性，每组10只小鼠)的侧腹中。建立人类异种移植肿瘤后，在第34天向小鼠输注(静脉内(i.v.))5×10⁶个人类PBMC。在第35天开始，向小鼠每周腹膜内(i.p.)给药10mg/kg(3次总剂量)人类IgG或PD-L1抗体。监测动物健康和行为(包括整饰和步行)，每周至少两次。测量体重和肿瘤体积，一周两次。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，相比于用人类IgG处理，用抗体A处理显著抑制人源化NSG小鼠中的肿瘤生长(表2)。

表2：NCI-H827人类NSCLC异种移植模型中的肿瘤体积(mm³)

本发明的抗体的功效也可通过测量NCI-H292人类NSCLC异种移植模型中针对同种异体抗原的免疫反应来测试。

在第0天，将2×10⁶个H292细胞皮下植入NSG小鼠(7周龄，雌性，每组10只小鼠)的侧腹中。建立肿瘤后，在第17天向小鼠输注(静脉内(i.v.))10×10⁶个人类PBMC。在第18天开始，向小鼠腹膜内(i.p.s)给药10mg/kg抗体，每周3次(3次总剂量)。监测动物健康和行为(包括整饰和步行)，每周至少两次。测量体重和肿瘤体积，一周两次。在第32-36天，处死小鼠并使用TruCount^TM管分析血液中的外周T细胞移植以评价对人类T细胞区室的外周移植的影响，以及T细胞亚群的耗竭表型。

在基本上如该测定中所述针对每组两只小鼠进行的实验中，相比于人类IgG处理组，用抗体A处理的荷瘤小鼠显示改变的CD4：CD8比率偏向CD8区室(表3；对于抗体A，T细胞的63%为CD8，相比之下，IgG对照为47%)。就绝对的外周T细胞计数(CD4计数+CD8计数)而言，抗体A处理组与IgG处理组无显著不同，但的确显示外周T细胞计数高于2.14H9OPT处理组(对于hIgG，43×10³个细胞/μl血液，对于抗体A，45×10³个细胞/μl血液，且对于2.14H9OPT，10×10³个细胞/μl血液)。

当监测T细胞活化时，T细胞上的PD-1水平可视为耗竭的T细胞的标志。PD-1+ T细胞的数目少于对照组，表明用PD-L1抗体的T细胞活化较多。在用每组两只小鼠的该研究中，相比于IgG处理组(53% PD-1+)，看到抗体A处理组(15% PD-1+)和2.14H9OPT处理组(32%PD-1+)中的T细胞上的PD-1表达减少。

表3：抗体A处理对H292人类NSCLC异种移植模型中的外周T细胞移植的影响

混合淋巴细胞反应

本发明的抗体阻断PD-L1信号的功能可通过测量细胞因子在T细胞活化期间的释放来评价。如果用本发明的抗体处理促进T细胞活化，则预期某些细胞因子(诸如IFN-γ)的水平增加。

用MACS珠粒(Miltennyi)从获自健康供体的新鲜人类PBMC(AllCells)分离CD14⁺单核细胞。通过将这些单核细胞在12ml完全RPMI-1640培养基中、在1000IU/ml hGM-CSF和500IU/ml hIL-4存在的情况下培养4天来产生不成熟的树突状细胞(DC)。通过负向选择(Milteny)从不同健康供体的新鲜人类PBMC(AllCells)中纯化CD4⁺ T细胞。然后将两种类型的细胞混合于具有100μl完全AIM-V培养基的96孔板的个别孔中，其中每孔含有1×10⁵个CD4⁺ T细胞和4×10³个不成熟DC(E：T=25：1)。6份重复地添加100μl含有2nM人类IgG1或人类PD-L1抗体的完全AIM-V培养基。在37℃、在5% CO₂孵育2天之后，收集上清液并用ELISA试剂盒(R&D Biosystems)测量人类IFN-γ。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A、S70或2.14H9OPT的添加各自以剂量依赖性方式增强T淋巴细胞产生IFN-γ。在最高测试浓度(33.3nM)下，相比于3.05倍(S70)和4.51倍(2.14H9OPT)，抗体A增加5.71倍。

表4：相比于IgG对照的IFN-γ分泌倍数变化

抗体的重链优势

以3.7Å和3.2Å分辨率，针对两种各别晶体解析抗体A/hPD-L1共复合物的结构。当分析时，每一者均显示抗体A的HCDR3区域直接接触hPD-L1，而抗体A的LCDR3偏离表位。抗体A的轻链的CDR与任一hPD-L1结构域的接触不显著。在6Å截止值内，抗体A的互补位由十八个重链残基和仅七个轻链残基构成。PD-L1/PD-1结合位点氨基酸已报导于Lin等人(2008) PNAS105(8)：3011-3016中。抗体A的可变轻链在PD-L1上的接触点不是参与PD-L1/PD-1相互作用的氨基酸。

为了证实在晶体结构中所见的抗体A的重链优势，对于其中抗体A的重链与置换抗体A的轻链的无关轻链配对的抗体测量对结合的影响。通过ELISA，一种配对产生的抗体与PD-L1的结合与抗体 A相当；该抗体含有这样的轻链，其中在可变轻链CDR中的抗体A互补位氨基酸无一是保守的。该结果表明，抗体A与PD-L1的结合几乎完全由重链介导。可分析抗体A的热力学特征，以评估重链优势是否正面影响PD-L1的结合。

去卷积抗体A的热力学特征

抗体与靶标的优先结合可在开发治疗性抗体是关键的。快速识别和结合靶标的抗体是治疗性抗体的所需特征。抗体重链的结合优势可意味着在结合之前需要发生的构型变化较小。

为了评估抗体A的重链优势会产生所需结合特征的可能性，对PD-L1阻断的热力学特征进行去卷积。对抗体A、S70和2.14H9OPT的Fab完成热力学研究。

将抗体A Fab、S70 Fab和2.14H9OPT Fab的重链和轻链克隆入GS载体中。根据制造商说明书，在悬浮摇瓶培养物中培养人类293-Freestyle细胞(Invitrogen Corp.,Carlsbad, CA)并用GS载体转染。简言之，允许未切割的质粒DNA和293 fectin复合25分钟。将HEK 293细胞再悬浮于新鲜培养基中(涡旋以移除结块)且随后与DNA/fectin复合物合并，然后在37℃孵育。在6天之后收获经调理的上清液，且测定蛋白表达。利用CaptureSelect^TM IgG-CH1亲和基质(Thermo Fisher Scientific)试剂盒从HEK 293表达上清液纯化所有Fabs。

通过表面等离振子共振(SPR)进行Fabs的结合。人类PD-L1单体作为配体于传感器芯片表面上的胺偶联固定在25℃进行。抗体A-Fab、S70-Fab和2.14H9OPT-Fab各自用作分析物，且注射于人类PDL-1单体固定的传感器芯片表面上。所有样品分析物均以3倍连续稀释(抗体A的起始浓度为3nM且S70和2.14H9OPT的起始浓度均为9nM)、6个完全稀释液(在中间浓度和零点具有一次一式两份)中运行。在运行缓冲液HBS-EP (0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005% v/v表面活性剂P20)中制备样品梯度。在四种不同温度下重复结合实验：20℃、25℃、37℃和42℃。在整个动力学实验中，对于所有三种Fab，流速维持在30μl/min且结合/接触时间维持在180秒。S70-Fab的解离时间为600秒且抗体A-Fab和2.14H9OPT-Fab的解离时间为420秒。解离之后，0.75M NaCl、25mM NaOH溶液再生固定的hPD-L1，且然后用运行缓冲液使表面稳定化30秒。2.14H9OPT-Fab、S70-Fab和抗体A-Fab的再生接触时间连续地为18秒、24秒和30秒。使用Biacore T200评价软件(版本3.0)分析结合动力学。将数据针对空白流动室参照，并将数据拟合至1：1 Langmuir结合模型。

使用范特霍夫图(Van't Hoff plots)分析hPD-L1单体与抗体A、S70和2.14H9OPT的Fab的相互作用。稳态、结合和解离是所分析的三种结合相。利用MATLAB用于线性回归分析。所有三种Fab在所有三种结合相中的线性回归拟合优度的R²量度为≥0.97。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，LSMeans Student氏T证明所有线性图的斜率与彼此统计学不同，但2.14H9OPT-Fab和抗体A-Fab的解离相线性图除外。

对于结合，抗体A-Fab/hPD-L1相互作用在所有复合物中具有最有利的结合相。△S_on是结合量度；△S_on值越负，则相互作用越有利。抗体A具有-26.0的△S_on值，而S70和2.14H9OPT分别具有-11.7和-19.4的△S_on值。该数据证明在这些条件下，抗体A与PD-L1的结合相互作用比S70和2.14H9OPT更有利。

结合动力学和亲和力

使用表面等离振子共振(Biacore)，测定本发明的抗体针对人类PD-L1的动力学和平衡解离常数(K_D)。

本发明的抗体作为配体于传感器芯片表面上的固定在25℃进行。可溶性人类PD-L1-Fc融合蛋白(且在一些情况下，食蟹猴PD-L1-Fc融合蛋白)作为分析物以范围为0.0123nM-9nM的浓度注射。分析在37℃进行。各样品的接触时间在30μl/min下为180秒。解离时间为240-1500秒。用0.95M NaCl/25mM NaOH，以30μl/min将固定表面再生18秒，且然后稳定化30秒。使用Biacore T200评价软件(版本3.0)分析结合动力学。将数据针对空白流动室参照，并将数据拟合至1：1结合模型。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A以82pM的K_D结合至人类PD-L1。

表5：通过SPR的抗体A的结合

ELISA分析：抗体A结合至重组PD-L1

可用ELISA测定来测量本发明的抗体结合人类PD-L1的能力。对于PD-L1结合测定，96孔板(Nunc)在4℃用人类PD-L1-Fc (R&D Systems)包被过夜。孔用封闭缓冲液(含有5%脱脂奶粉的PBS)封闭2小时。孔用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤三次。然后添加抗PD-L1抗体或对照IgG (100ul)并在室温下孵育1小时。洗涤之后，将板与100μl山羊抗人类IgG F(ab')2-HRP缀合物(Jackson Immuno Research)一起在室温下孵育1小时。洗涤板且然后与100μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺一起孵育。在微量板读取器上读取450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism 6软件计算半最大有效浓度(EC50)。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A以0.11nM的EC50结合至人类PD-L1。在所有三种温度条件(4℃、25℃和40℃)下4周之后，抗体A保留其结合活性。抗体A针对PD-L1显示与S70和2.14H9OPT类似的结合活性。

流式细胞术分析：抗体A结合至细胞表面PD-L1

本发明的抗体结合至细胞表面表达的人类PD-L1的能力可用流式细胞术测定进行测量。将MDA-MB 231细胞(PD-L1阳性人类乳腺癌细胞系)于200μl染色缓冲液中以每孔1.5×10⁵个细胞添加至96孔U形底板中并在4℃孵育30分钟。将板以1200rpm离心5分钟且移除上清液。添加100μl抗体-生物素(从10ug/ml开始，以1：4连续稀释)。评价总共6个连续稀释度。在4℃孵育30分钟之后，细胞用DPBS洗涤两次。添加100μl含有5μl链霉抗生物素蛋白-PE的检测缓冲液。在4℃孵育30多分钟，将板离心并用DPBS洗涤两次。将细胞再悬浮于200μlDPBS中用于FACS分析。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A以剂量依赖性方式结合至MDA-MB231细胞上的细胞表面PD-L1，其中EC50为0.14nM。

ELISA分析：抗体A阻断PD-L1与PD-1的相互作用

本发明的抗体阻断PD-L1结合至PD-1的能力可在ELISA测定中进行测量。对于受体-配体阻断测定，将不同量的抗PD-L1抗体或对照IgG与固定量的生物素化PD-L1-Fc融合蛋白(100ng/孔)混合并在室温下孵育1小时。将混合物转移至预包被有PD-1-Fc (1μg/ml)的96孔板且然后在室温下再孵育1小时。洗涤之后，添加链霉抗生物素蛋白HRP缀合物，且读取450nm处的吸光度。IC50代表PD-L1与PD-1的结合抑制50%所必需的抗体浓度。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A以0.95nM的IC50阻断PD-L1与PD-1的相互作用。在所有三种温度条件(4℃、25℃和40℃)下4周之后，抗体A保留其阻断活性。抗体A证明阻断PD-L1与PD-1相互作用的能力与S70和2.14H9OPT类似。

ELISA分析：抗体A阻断PD-L1与B7-1的相互作用

人类PD-L1也结合至B7-1。本发明的抗体阻断PD-L1结合至B7-1的能力可在ELISA测定中进行测量。PD-L1/B7-1阻断测定的程序类似于PD-L1/PD-1阻断测定，除了板包被有1μg/ml B7-1-Fc (R&D Systems)。PD-L1与PD-1的结合抑制50%所必需的抗体浓度(IC50)使用GraphPad prism 6软件计算。

在基本上如该测定中所述进行的实验中，抗体A以2.4nM的IC50阻断PD-L1与B7-1的相互作用。抗体A显示阻断PD-L1与B7-1受体相互作用的能力与S70和2.14H9OPT类似。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> PD-L1(“程序性死亡配体1”)抗体

<130> X20754

<150> 62/209056

<151> 2015-08-24

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Ala Arg Ser Pro Asp Tyr Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 5

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 7

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val

1 5 10

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asp Tyr Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 9

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Ile Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 10

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Asp Tyr Ser Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 11

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 11

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Ile Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser

210 215

<210> 12

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 12

caggtccagc tggtccagtc aggggccgag gtcaaaaagc cagggtcatc tgtcaaagtg 60

tcttgtaagg catccggggg cacattttcc agctacgcta tctcctgggt gagacaggca 120

ccagggcagg gtctggagtg gatgggcgga atcattccca tcttcgggac cgccaactac 180

gctcagaagt ttcagggaag ggtcactatt accgccgaca aaagcacatc tactgcttat 240

atggagctgt ctagtctgag gtctgaagat accgcagtgt actattgcgc ccggagtccc 300

gactatagcc cttactatta ctatggcatg gatgtctggg gccagggaac cacagtgaca 360

gtctcatccg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420

acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480

acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660

gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc 720

gagggggcac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt atgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca agactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccatcctc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggaggaga tgaccaagaa ccaagtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctatt ccaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggcaaa 1359

<210> 13

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 13

cagtccgtcc tgacacagcc accctcagcc tctggcaccc ctgggcagcg agtgacaatc 60

tcttgttctg ggagttcctc aaatattggt agtaacaccg tgaattggta ccagcagctg 120

cccggcacag cacctaagct gctgatctat ggaaactcaa ataggccatc cggagtcccc 180

gaccggttct ctggtagtaa atcaggcact tccgccagcc tggctattag cgggctgcag 240

tctgaggacg aagccgatta ctattgccag tcttacgatt ccagcctgtc tggaagtgtg 300

tttggcggag ggatcaagct gaccgtcctg ggccagccta aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctgcag aatgctct 648

Claims

1.结合人类PD-L1(SEQ ID NO: 1)的抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，且其中所述LCVR包含分别由氨基酸序列SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 5)、YGNSNRPS (SEQ ID NO: 6)和QSYDSSLSGSV(SEQ ID NO: 7)组成的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其中所述HCVR包含分别由氨基酸序列KASGGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2)、GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 3)和ARSPDYSPYYYYGMDV (SEQ ID NO: 4)组成的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。

2.抗体，其包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述轻链包含轻链可变区(LCVR)且所述重链包含重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR具有SEQ ID NO: 9中给出的氨基酸序列，且所述HCVR具有SEQ ID NO: 8中给出的氨基酸序列。

3.权利要求2的抗体，其中所述LC具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且所述HC具有SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列。

4.权利要求3的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中各轻链具有SEQ ID NO: 11中给出的氨基酸序列，且各重链具有SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列。

5.权利要求4的抗体，其中所述重链之一与所述轻链之一形成链间二硫键，且另一重链与另一轻链形成链间二硫键，且所述重链之一与另一重链形成两个链间二硫键。

6.权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述抗体被糖基化。

7.包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含编码具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和编码具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的轻链和具有SEQ IDNO: 10的氨基酸序列的重链的抗体。

8.产生包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链的抗体的方法，其包括在使得表达所述抗体的条件下培养权利要求7的哺乳动物细胞，和回收表达的抗体。

9.抗体，其通过权利要求8的方法产生。

10.药物组合物，其包含权利要求1-6或9中任一项的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

11.治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的权利要求1-6或9中任一项的抗体。

12.权利要求11的方法，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。

13.权利要求11或12的方法，其进一步包括与一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或依次组合施用。

14.权利要求1-6或9中任一项的抗体，其用于疗法中。

15.权利要求1-6或9中任一项的抗体，其用于治疗癌症。

16.权利要求15的所用抗体，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。

17.权利要求1-6或9中任一项的抗体，其用于与一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或依次组合以治疗癌症。

18.权利要求17的所用抗体，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、软组织肉瘤或肝细胞癌。