CN118064372B - 卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞 - Google Patents
卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞。本发明的消化液是包括如下浓度的组分的水溶液：LiberaseTM 0.03‑0.05mg/mL、Dispase 3‑5U/mL、Ca2+ 0.7‑0.9μM、Mg2+ 0.5‑0.7μM、6%‑10% v/v Hepes缓冲液、70%‑80% v/v DMEM培养基、1%‑4% v/v 100×青霉素‑链霉素溶液。该消化液能够更好地保持细胞的状态，使得后续细胞培养中细胞生长更快，传代更加稳定。本发明的技术方案有利于卡波西样血管内皮瘤细胞在实验研究中的广泛应用，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞。
背景技术
卡波西样血管内皮瘤（kaposiform hemangioendothelioma, KHE）是一类主要发生于儿童的交界性血管肿瘤，根据目前的研究报道，其发病率约为0.07/10万。约42%-71%的卡波西样血管内皮瘤会伴发卡梅现象，表现为严重的血小板减少合并消耗性凝血功能异常和溶血性贫血。卡梅现象发生后，如不恰当治疗，卡波西样血管内皮瘤患儿的病死率可高达12%-24%，死亡原因包括出血、器官衰竭、侵犯和（或）压迫重要结构、脓毒症。
作为一种罕见的血管肿瘤，目前对于卡波西样血管内皮瘤的发生发展知之甚少。究其原因，主要是由于目前缺乏合适的研究模型。既往对于卡波西样血管内皮瘤的研究，往往使用小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA）进行体内体外实验。但是，作为非人源的血管内皮瘤细胞，EOMA细胞本身与卡波西样血管内皮瘤就具有不同点，给研究带来了许多不确定因素，使得许多实验不具备足够说服力。此外，也有研究者使用婴幼儿血管瘤内皮瘤细胞进行实验。然而，婴幼儿血管瘤作为儿童最常见的血管肿瘤，属于良性肿瘤，且具有自发消退的趋势，这和卡波西样血管内皮瘤的生长特征（浸润性生长，不会自发消退）是截然不同的。
因此，使用卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行相关实验研究是一种更好的选择。然而，现有的卡波西样血管内皮瘤原代细胞的分离提取技术仍然存在一些不足。现有的卡波西样血管内皮瘤细胞分离培养技术中，采用Ⅰ型胶原酶对卡波西样血管内皮瘤进行消化，而后提取原代细胞。内皮细胞较脆弱，使用Ⅰ型胶原酶消化后，卡波西样血管内皮瘤原代细胞状态较差，生长缓慢，且提取之后细胞的标记物与卡波西样血管内皮瘤瘤体有一定差别（D2-40染色为阴性）。这影响了卡波西样血管内皮瘤细胞相关实验的顺利进行。因此，本领域亟需开发新的用于卡波西样血管内皮瘤的消化试剂，从而顺利分离和培养出状态更好的卡波西样血管内皮瘤原代细胞。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供卡波西样血管内皮瘤消化液及其用途、消化方法、原代细胞培养方法和原代细胞。
本发明还提供一种卡波西样血管内皮瘤消化液，它是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM0.03-0.05mg/mL、
Dispase 3-5U/mL、
Ca2+0.7-0.9μM、
Mg2+0.5-0.7μM、
6%-10% v/v Hepes缓冲液 、
70%-80% v/v DMEM培养基、
1%-4% v/v 100×青霉素-链霉素溶液。
优选的，它是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM0.0417mg/mL、
Dispase 4.17U/mL、
Ca2+0.826μM、
Mg2+0.676μM、
8.3% v/v Hepes缓冲液、
72.5% v/v DMEM培养基、
2.5% v/v 100×青霉素-链霉素溶液。
优选的，所述Ca2+是通过用钙盐配制溶液而形成的，所述钙盐选自CaCl2或CaSO4中的至少一种；
所述Mg2+是通过用镁盐配制溶液而形成的，所述镁盐选自MgSO4或MgCl2中的至少一种。
本发明还提供上述卡波西样血管内皮瘤消化液在消化卡波西样血管内皮瘤中的用途。
本发明还提供一种卡波西样血管内皮瘤消化方法，包括如下步骤：将卡波西样血管内皮瘤切碎，用上述卡波西样血管内皮瘤消化液进行消化，分离得到细胞悬液。
优选的，所述卡波西样血管内皮瘤消化液和所述卡波西样血管内皮瘤的用量比例为（3-8）mL：1g。
本发明还提供一种卡波西样血管内皮瘤原代细胞培养方法，包括如下步骤：
步骤1，按照上述卡波西样血管内皮瘤消化方法得到卡波西样血管内皮瘤的细胞悬液；
步骤2，裂解红细胞并清洗后，将细胞接种至EGM-2完全培养基进行培养。
本发明还提供上述卡波西样血管内皮瘤原代细胞培养方法培养得到的卡波西样血管内皮瘤原代细胞。
本发明中，所述“100×青霉素-链霉素溶液”含有青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL。
本发明的技术方案实现了如下有益效果:
1、基于卡波西样血管内皮瘤细胞的特点，优化了其消化液的配方，通过将LiberaseTM和Dispase联合使用，实现了提取获得状态良好的卡波西样血管内皮瘤细胞的目的。解决了现有技术中，消化后的卡波西样血管内皮瘤细胞状态不佳，难以培养原代细胞的困难。
2、本发明根据卡波西样血管内皮瘤细胞的生长需求，在原代细胞的培养中，优选EGM-2完全培养基，能够取得更好的培养效果。
总之，本发明能够消化获得状态更好的卡波西样血管内皮瘤细胞，降低细胞的培养难度，有利于卡波西样血管内皮瘤细胞在相关疾病和药物研究中的使用，具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行原代培养第6天的显微观察示意图。
图2为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行原代培养第10天的显微观察示意图。
图3为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行CD31免疫荧光染色（左: DAPI; 中: CD31; 右: 合并）观察示意图。
图4为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行CD34免疫荧光染色（左: DAPI; 中: CD34; 右: 合并）观察示意图。
图5为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行D2-40免疫荧光染色（左: DAPI; 中: D2-40; 右: 合并）观察示意图。
图6为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行PROX-1免疫荧光染色（左: DAPI; 中: PROX-1; 右: 合并）观察示意图。
图7为本发明实施例2中卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行LYVE-1免疫荧光染色（左: DAPI; 中: LYVE-1; 右: 合并）观察示意图。
图8为实验例1中对比组1的卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行原代培养第10天的显微观察示意图。
图9为实验例1中对比组2的卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行原代培养第10天的显微观察示意图。
图10为实验例1中对比组3的卡波西样血管内皮瘤原代细胞进行原代培养第10天的显微观察示意图。
图11为实验例1中四种不同消化液获取的卡波西样血管内皮瘤原代细胞在培养10天后的细胞数量比较（胰酶消化后计数）。
图12为实验例1中四种不同消化液获取的卡波西样血管内皮瘤原代细胞倍增时间比较。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，未具体说明的试剂和原料均为市售品。
实施例1 卡波西样血管内皮瘤消化液
本实施例的卡波西样血管内皮瘤消化液是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM（Roche） 0.0417mg/mL、
Dispase（Roche）4.17U/mL、
Ca2+0.826 μM、
Mg2+0.676 μM、
8.3% v/v Hepes缓冲液（Solarbio）、
72.5% v/v DMEM培养基（上海源培）、
2.5% v/v 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL）（Pricella）。
其配制过程如下：
1、10× Ca2+/Mg2+溶液配制（50 mL）
使用无菌ddH2O溶解92.7 mg CaCl2·2H2O（0.495 mmol）和0.1 g MgSO4·7H2O（0.406 mmol），至最终体积为50 mL；完全溶解后使用0.2 μm过滤器过滤。
2、收集液配制
取43.5 mL DMEM培养基、5 mL 10× Ca2+/Mg2+溶液和1.5 mL 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL），混匀后使用0.2 μm过滤器过滤。
3、LiberaseTM原液配制
5 mg冻干LiberaseTM溶于10 mL无菌ddH2O（冰上重悬），过滤（0.2μm）。
4、Dispase原液配制
1 g Dispase溶于20 mL Hepes 缓冲液（冰上重悬），过滤（0.2 μm）。得到的原液中Dispase浓度为50 U/mL。
5、卡波西样血管内皮瘤消化液配制
5 mL 收集液、0.5 mL LiberaseTM原液（0.5 mg/mL）；0.5 mL Dispase原液（50 U/mL），混匀。
实施例2卡波西样血管内皮瘤消化液
本实施例的卡波西样血管内皮瘤消化液是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM（Roche） 0.03mg/mL、
Dispase（Roche）5U/mL、
Ca2+0.7 μM、
Mg2+0.7 μM、
6% v/v Hepes缓冲液（Solarbio）、
80% v/v DMEM培养基（上海源培）、
1% v/v 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL）（Pricella）。
其配制过程与实施例1相同。
实施例3卡波西样血管内皮瘤消化液
本实施例的卡波西样血管内皮瘤消化液是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM（Roche） 0.05mg/mL、
Dispase（Roche）3U/mL、
Ca2+0.9 μM、
Mg2+0.5 μM、
10% v/v Hepes缓冲液（Solarbio）、
70% v/v DMEM培养基（上海源培）、
4% v/v 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL）（Pricella）。
其配制过程与实施例1相同。
实施例4 卡波西样血管内皮瘤的消化和原代细胞的培养
本实施例采用实施例1提供的卡波西样血管内皮瘤消化液进行消化，并进一步进行原代细胞的培养，具体步骤如下：
1、取新鲜采集的卡波西样血管内皮瘤组织样本，在无菌条件下，用含青霉素、链霉素的0.9％NaCl或者PBS清洗，直至血污去除干净，并使用无菌手术刀和镊子将内部柔软的卡波西样血管内皮瘤组织与外部粗糙的表皮分开。
2、用无菌一次性手术刀将卡波西样血管内皮瘤组织切成约2 mm3大小的组织块。
3、将切碎的卡波西样血管内皮瘤组织转移到分离管C管中（美天旎），并用移液管轻柔地将组织与新鲜制作的终消化缓冲液混合。每克卡波西样血管内皮瘤组织使用5mL的消化液（实施例1提供的卡波西样血管内皮瘤消化液）。
6、室温条件下，使用美天旎单细胞悬液制备仪， 消化1小时。
7、将消化的组织混合液通过100 μm的无菌细胞滤网过滤，得到细胞悬液。
8、在1000 rpm，室温（RT）下离心细胞悬浮液5分钟。
9、小心地吸出上清液，使用红细胞裂解液（LEAGENE, CS0001）2 mL裂解红细胞1分钟，然后1000 rpm，室温（RT）下离心5分钟，弃上清，得到卡波西样血管内皮瘤细胞。
10、再用EGM-2完全培养基3 mL重悬细胞，在1000 rpm，室温（RT）下离心细胞悬浮液5分钟，重复使用EGM-2完全培养基清洗细胞2次。
11、小心地吸出上清液，使用3 mL EGM-2完全培养基重悬细胞，种于6 cm皿中。
12、每天显微镜下观察，待细胞达到80%-90%汇合度时，进行细胞传代。
13、细胞达到一定数量后，使用CD31磁珠抗体分选出卡波西样血管内皮瘤细胞。
按照上述方法进行卡波西样血管内皮瘤细胞的培养过程和结果如图1-7所示，可以看到，按照本实施例方法获得的卡波西样血管内皮瘤原代细胞状态良好，能够顺利进行细胞培养，能够稳定传代，可满足相关研究对卡波西样血管内皮瘤细胞的使用需求。
下面通过实验对本发明的技术方案做进一步的说明。
实验例1 不同消化液配方的使用效果比较
一、实验方法
1、实验组设置
本实验例中包括：
实验组：使用实施例1的卡波西样血管内皮瘤消化液，按照实施例4记载的方法和条件进行消化和细胞培养；
对比组1：使用仅含有LiberaseTM的消化液，按照实施例2记载的方法和条件进行消化和细胞培养；其中，仅含有LiberaseTM的消化液配方为：
LiberaseTM（Roche） 0.0417mg/mL、
Ca2+0.826μM、
Mg2+0.676μM、
8.3% v/v Hepes缓冲液（Solarbio）、
72.5% v/v DMEM培养基（上海源培）、
2.5% v/v 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL）（Pricella）。
对比组2：使用仅含有Dispase的消化液，按照实施例2记载的方法和条件进行消化和细胞培养；其中，仅含有Dispase的消化液配方为：
Dispase 4.17 U/mL、
Ca2+0.826 μM、
Mg2+0.676 μM、
8.3% v/v Hepes缓冲液（Solarbio）、
72.5% v/v DMEM培养基（上海源培）、
2.5% v/v 100×青霉素-链霉素溶液（青霉素G钠盐10 kU/mL、硫酸链霉素10 mg/mL）（Pricella）。
对比组3：使用仅含有Ⅰ型胶原酶的消化液，按照实施例2记载的方法和条件进行消化和细胞培养；其中，仅含有Ⅰ型胶原酶的消化液配方为：
Ⅰ型胶原酶 2.5mg/mL（Yeasen）、
Hank’s平衡盐溶液（Gibco）。
2、实验操作
在培养原代细胞10天后，使用胰酶消化计数，然后按照1.5×105个细胞接种到6cm皿中，培养72小时后，再次消化计数，根据倍增时间计算公式计算不同消化方法提取原代细胞的倍增时间。倍增时间计算公式为：
T=t×[lg2/(lgNt-lgN0)]，
其中t为培养时间、Nt为培养时间终止时的细胞数量，N0为细胞的接种量。
二、实验结果
四种不同消化液获取的卡波西样血管内皮瘤原代细胞在培养10天后的细胞纤维图像如图2、图8-10所示，细胞数量（胰酶消化后计数）和倍增时间的对比如图11和图12所示。从实验结果中可以看到，与单独使用LiberaseTM、Dispase或Ⅰ型胶原酶相比，采用实施例1的消化液获取的卡波西样血管内皮瘤原代内皮细胞状态更好，数量更多，倍增时间更短。
因此，本发明提供的消化液能够在消化过程中能够更好地保持卡波西样血管内皮瘤细胞的状态，更有利于后续的培养和传代。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了一种用于卡波西样血管内皮瘤的消化液，该消化液能够在消化卡波西样血管内皮瘤的同时，保持细胞的状态，使得后续细胞培养中细胞生长更快，传代更加稳定。本发明的技术方案有利于卡波西样血管内皮瘤细胞在实验研究中的广泛应用，具有重要的应用价值。
Claims (6)
1.一种卡波西样血管内皮瘤消化液，其特征在于，它是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM 0.03-0.05mg/mL、
Dispase 3-5U/mL、
Ca2+ 0.7-0.9μM、
Mg2+ 0.5-0.7μM、
6%-10% v/v Hepes缓冲液 、
70%-80% v/v DMEM培养基、
1%-4% v/v 100×青霉素-链霉素溶液。
2.按照权利要求1所述的卡波西样血管内皮瘤消化液，其特征在于，它是包括如下浓度的组分的水溶液：
LiberaseTM 0.0417mg/mL、
Dispase 4.17U/mL、
Ca2+ 0.826μM、
Mg2+ 0.676μM、
8.3% v/v Hepes缓冲液、
72.5% v/v DMEM培养基、
2.5% v/v 100×青霉素-链霉素溶液。
3.按照权利要求1或2所述的卡波西样血管内皮瘤消化液，其特征在于：所述Ca2+是通过用钙盐配制溶液而形成的，所述钙盐选自CaCl2或CaSO4中的至少一种；
所述Mg2+是通过用镁盐配制溶液而形成的，所述镁盐选自MgSO4或MgCl2中的至少一种。
4.权利要求1-3任一项所述卡波西样血管内皮瘤消化液在消化卡波西样血管内皮瘤中的用途。
5.一种卡波西样血管内皮瘤消化方法，其特征在于，包括如下步骤：将卡波西样血管内皮瘤切碎，用权利要求1-3任一项所述卡波西样血管内皮瘤消化液进行消化，分离得到细胞悬液。
6.按照权利要求5所述的卡波西样血管内皮瘤消化方法，其特征在于：所述卡波西样血管内皮瘤消化液和所述卡波西样血管内皮瘤的用量比例为（3-8）mL：1g。
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