CN115068612B - Drd2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，主要涉及DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用。在一个实施方案中，所述DRD2抑制剂为氟奋乃静(Flu)及其药学上可接受的盐。

Description

DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的 应用

优先权申请

本申请要求2021年08月18日提交的中国发明专利申请【CN2021109490082】、名称为“DRD2抑制剂在治疗肝脏纤维化中的应用”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。

技术领域

本发明属于生物医药领域，主要涉及DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用。

背景技术

纤维化(Fibrosis)可以发生于多种器官，是许多常见的慢性炎症性、免疫介导的代谢性疾病的最终病理结果以及这些疾病发病率和死亡率的主要原因。多种有害刺激(包括毒素、传染性病原体、自身免疫反应和机械应激)能够诱导纤维化细胞反应。纤维化会影响身体的所有组织，如果不加以控制，会导致器官衰竭和死亡。

纤维化是组织遭受损伤后，以保护组织器官的相对完整性的修复反应。为了响应组织损伤，源自多种来源的肌成纤维细胞(包括常驻成纤维细胞、间充质细胞、循环成纤维细胞以及其他细胞类型的转分化)可通过重塑细胞外环境来启动伤口愈合反应，以恢复组织完整性并促进实质细胞的替换。通常，当组织愈合时，这种促纤维化程序被关闭。然而，持续的损伤和损害会导致这一过程的失调，导致细胞外基质(ECM)蛋白(包括胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白)在病理上的过度沉积，并伴随着肌成纤维细胞活性的上调，造成巨噬细胞(和单核细胞)和免疫细胞浸润的慢性炎症环境。而这种“过度沉积”，虽然修复了损伤，但不具备器官实质细胞的结构和功能，反而会引起器官的纤维化和功能障碍。

肝脏拥有使受损的肝脏组织再生的独特能力。然而，慢性或过度的肝脏损伤经常引起功能障碍/失调的修复和明显的瘢痕反应，导致过度的瘢痕形成和纤维化。肝脏纤维化经常导致肝硬化和肝衰竭，且也是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等肝病的病理学特征。肝脏纤维化涉及实质肝细胞和非实质细胞(NPCs)之间的动态相互作用，NPCs包括免疫细胞、肝星状细胞(HSCs)和肝窦内皮细胞(ECs)。肝脏再生和纤维化之间的平衡可能受肝脏微环境的“环境特异性(context-specific)”机制调制。

发明内容

本发明提供了DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用。

在一个实施方案中，所述DRD2抑制剂为氟奋乃静(Flu)及其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，所述肝脏纤维化有关的疾病由慢性肝脏损伤引起。

在一个实施方案中，所述肝脏纤维化有关的疾病包括非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、先天性肝纤维化、非酒精性脂肪肝病、胆汁淤积性肝病、酒精性肝炎、病毒性肝炎中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述肝脏纤维化有关的疾病的症状包括肝脏巨噬细胞中Yes相关蛋白(YAP)水平增加。

在一个实施方案中，所述肝脏纤维化有关的疾病的症状包括以下分子中的一种或多种的水平增加：α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管细胞粘附因子1(VCAM-1)、胶原Ⅰ、Yes相关蛋白(YAP)、磷酸化YAP、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝脏羟脯氨酸。

在一个实施方案中，所述药物用于选择性靶向所述肝脏巨噬细胞中的所述Yes相关蛋白(YAP)通路。

在一个实施方案中，所述药物用于上调I型干扰素反应。

在一个实施方案中，所述药物用于减轻以下症状中的一种或多种：肝脏纤维化、肝脏损伤和肝内脂质沉积。

在一个实施方案中，所述药物用于促进肝细胞增殖和/或促进肝脏再生。

在一个实施方案中，所述药物用于逆转所述肝脏纤维化。

如本文所使用，“DRD2抑制剂”是指降低或消除多巴胺D2受体活性的物质。DRD2抑制剂可以是化合物，例如吩噻嗪类药物、氯氮平类药物。所述DRD2抑制剂可以是氟奋乃静(Fluphenazine，一种吩噻嗪类的哌嗪衍生物)及其药学上可接受的盐，例如盐酸氟奋乃静、氟奋乃静庚酸盐、氟奋乃静癸酸盐等。所述DRD2抑制剂可以是多肽或蛋白质，例如靶向多巴胺D2受体的抗体。所述DRD2抑制剂还可以是能够降低或消除多巴胺D2受体表达的基因编辑工具。在本发明中，“DRD2抑制剂”和“DRD2拮抗剂”、“DRD2抑制”和“DRD2拮抗”表示相同含义。

如本文所使用，“慢性肝脏损伤”是指由感染、暴露于药物或有毒化合物、酒精、食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、自身免性疫过程、遗传缺陷或其他因素对肝脏造成的慢性受损。慢性肝脏损伤可能导致肝脏纤维化和肝硬化。

如本文所使用，“与肝脏纤维化有关的疾病”是指以慢性肝脏损伤和纤维化为特征的一类疾病。示例性的“与肝脏纤维化有关的疾病”包括自身免疫性肝炎、先天性肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、胆汁淤积性肝病、酒精性肝炎、病毒性肝炎。

如本文所使用，“降低”、“减少”、“减轻”、“阻断”和“抑制”通常都意味着减少有统计学意义的量，例如，相对于参比水平减少在大约10％至大约100％之间的任意量。

如本文所使用，“增加”、“提高”、“增强”、“活化”、“上调”和“诱导”通常都意味着增加有统计学意义的量，例如，相对于参比水平增加在大约10％至大约100％之间的任意量或相对于参比水平大约2倍及以上的增加。

如本文所使用，“肝脏再生”是肝脏受损或被部分切除后，肝脏中剩余的肝细胞通过增殖生长出与受损或切除前形态和/或功能上相同的结构的修复过程。

如本文所使用，“促进”是指所描述对象在既有水平的进一步提高，所述既有水平包括数量水平、表达水平、功能水平、能力水平中的一种或多种。

如本文所使用，“逆转纤维化”是指将呈纤维化状态的器官向再生方向转变，包括降低纤维化的水平、降低纤维化引起的症状的严重程度、增强再生能力等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了在人类肝硬化肝脏和小鼠纤维化肝脏的巨噬细胞中，YAP水平增加；

图2示出了髓系特异性YAP的删除，通过刺激I型干扰素信号减轻肝脏纤维化；

图3示出了scRNA-Seq分析确定CCl₄诱导的慢性损伤后，由YAP的髓系特异性删除引起的变化的细胞群；

图4示出了YAP缺陷的巨噬细胞和内皮细胞之间的串扰的确定；

图5示出了G蛋白偶联受体(GPCR)配体库筛选确定靶向巨噬细胞促纤维生成的YAP的多巴胺受体DRD2拮抗剂；

图6示出了DRD2拮抗剂和Drd2的髓系特异性删除减轻肝脏纤维化；

图7示出了选择性靶向巨噬细胞中的促纤维化的DRD2-YAP1轴，通过刺激I型干扰素信号减轻肝脏纤维化；

图8示出了DRD2拮抗剂减轻小型猪NASH模型的肝脏纤维化；

图9示出了F4/80⁺细胞相对于可视(visual)肝细胞的百分比(与图1相关)；

图10示出了如图1B所示的注射次数中，YAP(绿色)、F4/80(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光或α-SMA和天狼星红染色；

图11示出了Yap1的髓系特异性删除的敲除效率(与图2相关)；

图12示出了在所示注射次数的F4/80(A)或Desmin(绿色)(B)的免疫荧光染色(其中IFN-β(红色)和DAPI(蓝色)，与图2I相关)；

图13示出了在CCl₄诱导的损伤后，IFN-β处理保护了肝功能(与图2相关)；

图14示出了F4/80(绿色)或CD31(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光显示，与WT小鼠相比，4次CCl₄注射后的Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏切片中巨噬细胞或内皮细胞的数量减少(与图3相关)；

图15示出了WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠中不同细胞群的频率的比较(与图3相关)；

图16示出了小提琴图显示内皮细胞亚群中内皮细胞标记物Cdh5和Pecam1的表达(与图3相关)；

图17示出了热图显示内皮细胞亚群中差异表达的转录本(与图3相关)；

图18示出了CCl₄注射3次后，来自对照或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏切片的CTGF或VCAM1(绿色)、CD31(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光和定量(与图4相关)；

图19示出了免疫荧光显示，在CCl₄注射1次后，被F4/80标记的巨噬细胞主要与窦内皮细胞(LYVE-1)聚集(比例尺，50μm；与图4相关)；

图20示出了DRD2、F4/80(巨噬细胞)和HNF-4α(肝细胞)的免疫荧光表明，在所示CCl₄注射后，DRD2在巨噬细胞中被选择性诱导，而不是在肝细胞中(比例尺，100μm；与图5相关)；

图21示出了DRD2和YAP的免疫荧光表明，在所示CCl₄注射次数，这些蛋白大量地共表达并且其分别的表达水平的变化是相互关联的(比例尺，100μm；与图5相关)；

图22示出了在CCl₄诱导的慢性肝脏纤维化模型中，Flu处理后测量的体重(与图6相关)；

图23示出了Drd2髓系特异性删除的敲除效率(与图6相关)；

图24示出了抗-IFNAR1处理或对照小鼠中IFIT1、OAS2、MX1、ISG15和IFIT3的mRNA表达的qRT-PCR分析(与图7相关)；

图25示出了YAP和F4/80的免疫荧光表明，抗-IFNAR1处理不影响YAP水平(与图7相关)；

图26示出了IFNAR1信号的抗体阻断逆转了髓系特异性DRD2或YAP缺陷小鼠中增强的肝脏再生(与图7相关)；

图27示出了VCAM1(绿色)和CD31(红色)的免疫荧光表明，IFNAR1信号的抗体阻断逆转了髓系特异性DRD2或YAP缺陷的小鼠中被抑制的VCAM1(比例尺，100μm；与图7相关)；

图28示出了在由西方饮食(WD)和化学损伤诱导的小型猪NASH模型中，在Flu处理后，从第0次至第58次CCl₄注射次数测量的体重(n＝2-4只小型猪/组；与图8相关)；

图29示出了人类对照和肝硬化切片的病理检查(与图1相关)；

图30示出了IFN-β处理在肝脏纤维化(修复)期间或之后的明显作用(与图2相关)；

图31示出了本发明实施例的总结示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

附图详细说明

图1：(A)在“人类”对照和肝硬化肝脏切片中，YAP(绿色)、F4/80(红色)和DAPI(蓝色：细胞核)的免疫荧光染色。比例尺，100μm。数据被量化(n＝5个样本/组)。(B,C)在所示的CCl₄注射后，小鼠肝脏切片上的YAP(绿色)和F4/80(红色)的免疫荧光，以及α-SMA的免疫组化和天狼星红染色被显示和量化(n＝4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(D)对照组或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型的小鼠肝脏切片中，YAP(绿色)和F4/80(红色)的免疫荧光和定量(n＝4只小鼠/组)。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图2：(A-C)在遭受慢性CCl₄损伤(7次重复注射CCl₄)的野生型(WT)或Yap1^{fl/ fl}Lyz2-Cre⁺小鼠的肝脏切片上，进行天狼星红和Masson染色、α-SMA和胶原I的免疫荧光染色以及羟脯氨酸和胶原I的测定(n＝3只小鼠/组)。比例尺，100μm。(D,E,F)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型的WT或Yap1fl/flLyz2-Cre⁺小鼠的天狼星红和H&E染色、α-SMA和胶原蛋白I的免疫荧光染色以及羟脯氨酸测定(n＝3或4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(G,H)对来自4次重复CCl₄注射后的WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏的CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞的RNA测序数据的GO富集分析和热图。FPKM(Fragments Per Kilobase ofexon model per Millionmapped fragments)，每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments。(I)在重复CCl₄注射后，WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏中IFN-β蛋白的ELISA检测(n＝3或4只小鼠/组)。(J)在所示CCl₄注射次数，IFNβ⁺F4/80⁺或IFNβ⁺Desmin(结蛋白)⁺双阳性细胞相对于IFNβ⁺细胞的量化(n＝4只小鼠/组)。(K)在所示的CCl₄注射次数，WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏中IFNβ和F4/80的免疫荧光染色(n＝4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(L,M)有或没有IFN-β处理，在慢性CCl₄诱导的损伤模型的小鼠肝脏中，天狼星红染色或α-SMA和胶原I的免疫印迹分析(n＝3或4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(N)Yap的髓系特异性删除，通过上调巨噬细胞中抗纤维化的I型干扰素减轻肝脏纤维化。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图3：(A)在4次CCl₄注射后，从小鼠肝脏中分离的肝脏非实质细胞(NPCs)并对其进行scRNA-Seq。从标记基因的表达推断出细胞系并注释：B cell，B细胞；T cell，T细胞；Mono，单核细胞；Neu，中性粒细胞；EC，内皮细胞；DC，树突状细胞；MP，巨噬细胞；Hepa，肝细胞；HSC，肝星状细胞。(B)对照组或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠中不同细胞群的频率的比较。(C)基于配体/受体原理，对细胞-细胞相互作用的预测和评分(scoring)。(D,E)小提琴图显示肝内巨噬细胞或EC亚群中Pecam1和Cdh5中，系特异性(lineage-specific)标记物Adgre1、Clec4f、Macro和Trem2的表达。(F,G)热图显示，在EC1亚群中优先富集(preferentiallyenriched)的基因，包括Ctgf和Vcam1。(H)骨髓细胞中Yap1的删除阻断了Ctgf⁺Vcam1⁺EC亚群的产生。(I,J)HSCs中所示的标记基因波形蛋白(Vimentin)和Tgfb1的表达谱。

图4：(A)来自公共数据库(http://www.livercellatlas.mvm.ed.ac.uk.)的健康和肝硬化人类肝脏的Ctgf⁺Vcam1⁺ECs的频率的量化。(B-D)对照和肝硬化人类肝脏切片(n＝5个样本/组)中以及来自CCl₄注射1次后的WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠肝脏切片(n＝4只小鼠/组)中，CTGF或VCAM1(绿色)、CD31(红色)的免疫荧光染色和量化。比例尺，100μm。(E)免疫荧光显示，VCAM1或CTGF主要与窦内皮标记物(LYVE-1)共定位。比例尺，100μm。(F-H)IFN-β处理抑制了HUVECs和CCl₄1次注射后的小鼠肝脏切片中CTGF和VCAM1的mRNA表达(n＝4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(I)EMOA细胞与对照组或YAP基因敲减的Raw264.7细胞共培养2天(左)，或与从CCl₄注射1次后的WT或Yap1^fl/flLyz2-Cre+小鼠分离的巨噬细胞共培养2天(右)。同时还对上述细胞用IgG或抗-IFNAR1抗体处理。分析EMOA细胞中CTGF和VCAM1的mRNA表达。显示的数据是3个独立实验的代表。(J)来自慢性CCl₄损伤后的对照组或K-7174处理的小鼠的肝脏切片上的α-SMA和胶原I的免疫荧光染色、天狼星红和Masson染色(n＝4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(K)骨髓细胞中YAP的破坏，诱导抗纤维化的I型IFN的表达(其阻断内皮细胞中促纤维化的CTGF和VCAM1的表达)。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图5：(A)基于8×GTIIC-luc报告基因活性的筛选策略示意图。(B)在Raw264.7或HepG2细胞中进行用于Flu处理的萤光素酶测定。(C)在从WT小鼠分离的肝细胞和巨噬细胞中DRD2表达的Westernblot分析。(D)免疫荧光表明，DRD2选择性地在巨噬细胞中高度表达(F4/80)，而不是在肝细胞中(HNF-4α)，并与YAP的变化水平相关。比例尺，100μm。(E,F,G,H)Flu诱导了Raw264.7细胞(E,G)或腹膜巨噬细胞(F,H)的YAP磷酸化和上调的干扰素β1(Ifnb1)。(I,J)Raw264.7细胞中内源性DRD2的基因敲减，造成YAP及其上游效应物(effector)LATS1/2的磷酸化，以及在200ng/ml LPS(左)或水泡性口炎病毒(VSV，MOI＝1)(右)刺激6小时后的Ifnb1 mRNA水平的上调。(K)结合GPCR化合物库筛选平台和基于YAP的细胞报告(cell reporter)，确定了选择性阻断“巨噬细胞”而非“肝细胞”的Hippo/YAP信号的DRD2拮抗剂Flu。展示的数据是3个独立实验的代表。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。n.s.，非显著；MOI，感染复数；shRNA，短发夹RNA。

图6：(A)对照和肝硬化人类肝脏切片中DRD2(绿色)和F4/80(红色)的免疫荧光(n＝5个样本/组)。比例尺，100μm。(B-E)在CCl₄慢性损伤后，有或没有Flu处理(B,C)或在WT或Drd2^fl/flLyz2-Cre+小鼠(D,E)的天狼星红、Masson以及α-SMA和胶原I的免疫荧光染色，和ALT或AST活性(n＝3或5只小鼠/组)。比例尺，200μm。**p<0.01。(F-J)Drd2的髓系删除，缓和了胆管结扎(BDL)(F,J)和NASH(H-J)模型中的肝脏纤维化，通过天狼星红和H&E、α-SMA和胶原I的免疫荧光染色、ALT和AST活性以及羟脯氨酸的测定进行评估(n＝3-4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(K)DRD2的药理学抑制或髓系特异性Drd2删除减轻肝脏纤维化。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图7：(A,B)对来自4次CCl₄注射后的WT或Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠的CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺肝脏巨噬细胞的RNA测序数据的KEGG富集通路分析和散点图。FC，倍数变化。(C,D)在CCl₄注射1次或3次后，髓系特异性DRD2的缺陷上调IFN-β的表达并抑制CTGF和VCAM1的表达(n＝4只小鼠/组)。比例尺，100μm。(E)Ki67染色评估7次CCl₄注射后的WT、Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺和Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠的肝细胞增殖(n＝3只小鼠/组)。比例尺，50μm。(F-J)IFNAR1信号的抗体阻断，逆转了髓系特异性DRD2或YAP缺陷小鼠中肝纤维化的减轻(n＝3或4小鼠/组)。在7次CCl₄注射后和用抗-IFNAR1抗体或同型IgG对照处理后，检测来自所示小鼠组别的肝脏切片上天狼星红和Masson染色(F,G)、肝脏羟脯氨酸(H)和VCAM1和Ki67表达(I,J)。比例尺，100μm。(K)选择性靶向巨噬细胞中促纤维化的DRD2-YAP，通过促进抗纤维化的I型IFN的产生以减轻肝脏纤维化，这可以通过I型干扰素信号的抗体阻断被逆转。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图8：(A)总结了评估DRD2拮抗剂Flu在由西方饮食和化学损伤诱导的小型猪NASH模型中的功效的实验方式的示意图。(B-D)Flu阻断小型猪NASH模型的肝脏纤维化(n＝3只小型猪/组)。在小型猪肝脏切片上天狼星红、油红O、H&E染色(B)和αSMA和胶原I的免疫荧光染色(C)和羟脯氨酸测定(D)。比例尺，200μm。(E)在小型猪肝脏切片上进行Ki67染色以评估NASH模型中肝细胞的增殖。比例尺，50μm。所有结果以平均值±S.D.表示。*p<0.05；**p<0.01。

图9：如图1A所示的对照和肝硬化人肝脏切片中，数据被量化为F4/80⁺细胞相对于可视(visual)肝细胞的百分比。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图11：(A)野生型(WT)和Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺BMDMs中YAP mRNA的qRT-PCR分析。(B)野生型和Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺BMDMs中YAP表达的免疫印迹分析。

图13：测量了所示小鼠组血清中的ALT活性(n＝3或4只小鼠/组)。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图14：n＝4只小鼠/组。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图18：n＝4只小鼠/组。比例尺，100μm。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。。

图22：n＝4只小鼠/组。所有结果显示为平均值±S.D.。

图23：(A)WT和Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺BMDMs中DRD2 mRNA的qRT-PCR分析。(B)WT和Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺BMDMs中DRD2表达的免疫印迹分析。

图24：结果显示抗-IFNAR1处理成功抑制了IFN-β信号(n＝3或4只小鼠/组)。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图25：n＝3或4只小鼠/组。比例尺，100μm。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图26：在CCl₄慢性损伤后，有或没有IFNAR1信号的抗体阻断，进行Ki67染色以评估WT、Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺或Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠的肝细胞增殖。比例尺，50μm。

图29：(A)H&E染色显示肝硬化肝脏切片中假小叶的形成。(B,C)免疫荧光染色显示，肝硬化肝脏切片中α-SMA和I型胶原表达明显增高(n＝5个样本/组)。比例尺，100μm。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01。

图30：IFNβ-CCl₄(1-4)(A)或IFNβ-CCl₄(4-7)模型(B)中的天狼星红染色、α-SMA或I型胶原表达被量化。IFNβ-CCl₄(1-4)模型评估IFN-β在CCl₄慢性损伤早期阶段(四次注射)对肝脏纤维化的影响。IFNβ-CCl₄(4-7)模型评估IFN-β在CCl₄慢性损伤晚期阶段(四至七次注射)的肝修脏复的影响(n＝4只小鼠/组)。比例尺:100μm。所有结果显示为平均值±S.D.。*p<0.05；**p<0.01；n.s.，非显著。

实施例一：材料与方法

人类受试者：来自5个高临床纤维化等级(F3-F4)的肝硬化患者和5个非肝硬化患者的肝脏活检样本获取自四川大学华西医院肝胆科。该队列的临床信息汇总于表1。取自肝硬化或对照组患者的肝脏分离块(hepatic explant)，部分用4％多聚甲醛固定(用于组织化学分析)和部分用OCT包埋(用于免疫荧光分析)。

表1患者的基本信息

/>

备注：TBIL，总胆红素；DBIL，直接胆红素；IBIL，间接胆红素；AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；ALP，碱性磷酸酶；GGT，谷氨酰转肽酶。F0或F4，人类肝脏纤维化的不同病理等级。

小鼠模型：小鼠被保持在无特定病原体(SPF)环境中。Yap1^fl/fl小鼠(库存号032192，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)和Drd2 ^fl/fl小鼠(库存号020631，JacksonLaboratory)与Lyz2-Cre转基因杂交，以分别获得Yap1^fl/fl-Lyz2-Cre⁺和Drd2^fl/fl-Lyz2-Cre⁺小鼠。使用以tail DNA作为模板的聚合酶链式反应(PCR)对小鼠基因分型。为了诱导肝脏损伤和纤维化，如前所述[参考文献S1]，将CCl₄(Sigma-Aldrich)溶解在玉米油(Sigma-Aldrich)中以得到40％(0.64g/ml)的浓度，并且向小鼠腹膜内注射1.6g/kg的CCl₄，每3天1次，持续7次，来诱导肝脏纤维化；或用玉米油作为对照，较少地诱导肝脏损伤。在最后一次注射的2天后，小鼠被处死用于分析。在一些实验中，肝纤维化还由胆管结扎(BDL)造成的肝外胆汁淤积[参考文献S1]或由西方饮食(WD)和化学损伤[参考文献S2]诱导的NASH模型诱导出。为了进行BDL，通过吸入器，用异氟烷麻醉小鼠。对照组接受了由暴露但不结扎组成的假手术。在手术后20天，小鼠被分析。为了生成NASH模型[参考文献S2]，小鼠被喂养含有21.1％脂肪、41％蔗糖和1.25％胆固醇(w/w)的西方饮食和含有23.1g/L d-果糖和18.9g/Ld-葡萄糖的高糖溶液，持续20周，并用0.32g/kg的CCl₄处理，腹膜注射，每周1次。对于治疗方法，在CCl₄慢性损伤期间，向小鼠腹膜注射Flu(MCE，目录HY-A0081，1mg/kg)、IFN-β蛋白(Sino Biological，目录50708-MCCH，20ug/kg)、K-7174(25mg/kg)或抗小鼠IFNAR-1抗体(BioLegend，MAR1-5A3，5mg/kg)。在所示时间点，小鼠被处死且全肝组织被收集，用于纤维发生的分析。

表2本发明使用的抗体的信息

/>

小型猪模型：巴马小型猪购自成都达硕生物科技有限公司，并在成都达硕实验动物中心饲养。每只小猪单独地处于单个笼子里。雄性小型猪用于NASH研究[参考文献S2-S4]。小型猪被喂养高脂肪饲料(含有2％胆固醇和30％脂肪[w/w])和高糖水(2.31％果糖和1.89％葡萄糖)，并每3天注射溶解于玉米油的20％CCl₄(0.25ml/kg)。处理组每3天注射Flu(0.11mg/kg，5％二甲亚砜(DMSO))，而对照组则注射相同体积的正常生理盐水(含有5％DMSO)。实验持续了6个月，并且取肝脏组织活检组织来检验Flu的治疗效果。

细胞：RAW264.7细胞、HEK293T细胞和HepG2细胞培养于补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(目录号10099-141)(GIBCO，USA)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)(GIBCO，USA)，37℃，5％CO2的湿润培养箱。EMOA(小鼠血管内皮瘤细胞)在原代内皮细胞培养系统(PriMed-iCell-002)中培养。小鼠腹膜巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)的分离[参考文献S5]：在注射硫乙醇酸盐(thioglycolate)后4天，腹膜巨噬细胞从小鼠中收获并培养于补充有10％FBS的DMEM。BMDMs从胫骨和股骨中分离，并且细胞培养于有10％FBS、谷氨酰胺和30％L929上清液的DMEM，37℃，持续7天。

GPCR蛋白化合物文库筛选：对于在HEK293T细胞中的筛选实验，GPCR/G蛋白化合物文库(489个溶解于DMSO的化合物，10mM)获自MCE(MedChemExpress Inc.)。YAP/TAZ反应的启动子的序列先前已被描述，并被克隆到pGL3-basic载体中，以构建8×GTIIC-Luc报告(reporter)[参考文献S6]。将有8×GTIIC-Luc报告或PGL3-启动子(作为用于转染效率归一化的参考)的质粒转染到HEK293T细胞。24小时后，细胞被接种在空白的透明底96孔板上并培养过夜。随后，将药物从文库库存板(library stockplates)(在DMSO中10mM)转移到含有10μM细胞的板。在另一个24小时孵育后，96孔板中的细胞被裂解并被测试萤光素酶活性。根据Bright-Glo萤光素酶检测系统(Promega)的流程，检测发光(luminescence)。用相似的程序进行在HepG2细胞中的实验。对于在Raw264.7细胞中的实验，8×GTIIC-Luc序列被克隆到pEZX-LvGA01慢病毒载体(GeneCopoeia)中，以构建Lv-8×GTIIC-Luc报告(包含2个报告基因：用于测试YAP反应的启动子的Gaussia萤光素酶(Gluc)和根据转染效率作为参考来归一化的分泌型碱性磷酸酶(SEAP))。慢病毒微粒和稳定细胞系的筛选如前制备。根据Secrete-Pair^TMDual Luminescence检测试剂盒(GeneCopoeia)的流程，检测发光。

内源性DRD2或YAP的沉默：基于pGLVU6/Puro载体(Shanghai GenePharma)，构建了靶向小鼠DRD2的shRNA重组慢病毒。本发明使用的shRNA序列信息如下：NC，5'-TTCTCCGAACGTGTGTCACGTTTC-3'(SEQ ID NO:1)；shDRD2-1，5'-CCACTACAACTATGCCAT-3'(SEQ ID NO:2)，shDRD2-2，5'-GACCAGAATGAGTGTATCATT-3'(SEQ ID NO:3)，shDRD2-3，5'-CAGGATTCACTGTGACATCTT-3'(SEQ ID NO:4)；shYAP-1，5'-CCACCAAGCTAGATAAAGAAA-3'(SEQID NO:5)，shYAP-2，5'-GCGGTTGAAACAACAGGAATT-3'(SEQ ID NO:6)，shYAP-3，5'-CTGGTCAAAGATACTTCTTAA-3'(SEQ ID NO:7)。通过使用lipofectamine 6000转染试剂(Biyotime，中国)，将含有shRNA序列的LV2质粒和编码骨架结构的辅助质粒(pMD2.G和pSPAX2)共同转染到HEK293T细胞。48小时后，收集上清液并通过0.22μM膜过滤。将上清液按1：4的比例稀释，并然后与Raw 264.7细胞在37℃、5μg/ml聚凝胺孵育48小时。对于细胞系中的稳定的基因敲减，在转导后的起初48小时，感染的细胞在含有5μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen)的选择培养基中培养，并且在培养的大约1周后，获得稳定的基因敲减。所有基因敲减的细胞系通过Western blot分析证实。用200ng/ml LPS或水泡性口炎病毒(MOI＝1)刺激DRD2-基因敲减和Raw264.7细胞6小时，并通过qRT-PCR检测IFNb1转录本。

体外Transwell共培养：实验如前所述进行[参考文献S7]。EMOA细胞被接种在100μL原代内皮细胞培养系统中的Transwell-24小室的上室(Corning，孔径0.4μm和直径6.5mm)，并被允许在37℃和5％CO2下附着1小时。去除培养基，并用100μL共培养培养基(含有添加10％FBS的DMEM(Raw264.7)或PRIM1640(分离出的肝脏巨噬细胞)与原代内皮细胞培养系统的比例为1：1)替换，以支持细胞存活。将含有EMOA细胞的Transwell小室转移到已接种巨噬细胞的孔中(每个表型n＝3)。在下室和上室中分别加入额外的共培养培养基。2天后，将Transwell小室转移到干净的24孔板。EMOA细胞在小室中，用500μL TRIzol被直接裂解，并接受qRT-PCR分析。

小鼠肝脏巨噬细胞和肝细胞的分离和分析：用剪刀将肝脏组织切细碎，并用2mg/ml胶原酶A和DNase处理，如前所述(有一些修改)[参考文献S8]。使用18G注射器将细胞间接触破坏，随后过滤细胞悬液并离心。然后，用DPBS洗涤细胞沉淀一次并用红细胞裂解试剂处理，并洗涤细胞、离心并在DPBS中重悬。对于流式细胞仪分析和分选，在CD45⁺、CD11b⁺和F4/80⁺的抗体染色之前，将细胞封闭于10％正常山羊血清中10分钟，4℃。流式细胞术在FACSAria II细胞分选机(BD Biosciences)上进行，并用FlowJo软件分析数据。收集来自特定群的单细胞，用于随后的RNA测序分析。对于小鼠肝细胞或肝脏巨噬细胞的分离，将小鼠肝脏的细胞悬液以50g离心2分钟。沉淀主要包含肝细胞，上清悬液主要包括非实质细胞(NPCs)。NPCs被离心和通过1-2mL的MACS缓冲液(Miltenyi，130-091-221)洗涤，以及被离心并重悬于90μL MACS缓冲液。然后，将NPCs与抗-F4/80磁珠(Miltenyi，130-110-443)孵育，并在震荡下4℃孵育15分钟。F4/80⁺细胞被抗-F4/80磁珠标记并使用LS MACS柱(Miltenyi，130-042-401)和分离器被收集。用3mL MACS缓冲液洗涤柱三次，以去除过多珠子和未被标记的细胞。将柱从磁场中移除后，磁性保留的F4/80⁺细胞作为被选择的细胞被洗脱。

小鼠免疫染色(IF)、组织学和生物化学检测：实验以如前所述进行，有一些修改[参考文献S9]。收集血清并储存在-70℃，用于由华西海圻医药科技(WCFP)的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的测定。肝脏被切为四部分，用于以下各种分析：(1)保存在10％福尔马林，用于组织学检测；(2)在–80℃中冷冻，用于羟脯氨酸检测；(3)OCT包埋和冷冻切片；和(4)立即用于蛋白质和RNA分离。对于免疫组化(IHC)，将肝脏组织固定在10％中性缓冲的福尔马林中，在石蜡中包埋并切成4μm厚的切片。将载玻片脱蜡和水化。通过在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中加热10分钟并冷却2小时，随后用PBS冲洗来进行抗原修复。然后将样本在3％过氧化氢中孵育以阻断内源性过氧化物酶，并在10％绵羊血清室温中封闭30分钟和与一抗4℃孵育过夜。两步通用抗兔/小鼠免疫组化试剂盒(ZSGB-BIO)被用于可视化蛋白质。对于免疫荧光染色，将肝脏组织在OCT化合物中冷冻，并切成6μm厚的切片和用10％中性缓冲的福尔马林固定。固定后，室温下在10％绵羊血清中封闭载玻片30分钟，紧接着与一抗4℃孵育过夜并用二抗孵育1小时。样本用DAPI染色并密封。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测量小鼠肝脏中IFN-β的浓度。用剪刀将肝脏组织剪碎，并用PBS(1ml PBS/0.5g肝脏)在4℃以持续轻轻倾斜洗涤10分钟。混合物以1500rpm离心10分钟，且上清液用ELISA试剂盒评估。

RNA定量和测序：按照标准流程，用TRIzol试剂分离总的细胞RNA。以QuantiTectSYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen，德国)、使用AppliedBiosystems 7500实时热循环仪(Applied Biosystems，USA)进行一步法qRT-PCR。本发明使用的RT-PCR引物序列见表3。用ΔΔCT方法测定靶基因和GAPDH转录本水平。按照标准流程，用TRIzol试剂分离由流式细胞仪分选的小鼠肝脏巨噬细胞的总的细胞RNA，并送至北京基因组研究所(BGI)以RNA测序分析。转录组文库用BGISEQ-500RS RNA-Seq(定量)构建。用HISAT2(2.1.0版)将测序的读长(Sequenced reads)与小鼠(Mus musculus)参考基因组(GRCm38.p5)比对[参考文献S10]，并使用HTSeq-count(0.9.1版)将比对的读长(aligned reads)量化以获得mRNA表达[参考文献S11]。DESeq2(R/Bioconductor包)被用于确定样本间的差异表达基因[参考文献S12]。通路富集分析和基因本体论(Gene Ontology)分析使用KOBAS 3.0(可在线查阅：http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)进行。

表3所使用的用于小鼠细胞的全部RT-PCR引物

单细胞RNA测序和分析：根据广州基迪奥生物科技有限公司的流程，将NPCs装载到GemCode仪器(10×Genomics)，以生成单细胞乳液中凝胶珠粒(Gel Bead in emulsion，GEMs)。简要地，将含有GEMs的PCR管放置在PCR仪器上，以产生cDNA。根据10×Genomics单细胞3'文库构建V3流程，将反转录得到的35μL cDNA添加至65μL cDNA扩增混合物中，以扩增cDNA。使用高灵敏度DNA检测试剂盒(Agilent Technologies)进行文库质量检测。最后，ABIStep One Plus实时PCR系统(Life Technologies)用于定量和池化(pooling)，并按照illuminaNovaseq的PE150模式进行测序。总的来说，来自野生型NPCs的5269个细胞通过了>1000个转录本的质控阈值，并且来自Yap1fl/fl-Lyz2-Cre+NPCs的4731个细胞通过。所有的数据集由R 3.6.1Seurat包分析与处理[S8]。

免疫印迹法(WB)：对于免疫印迹分析，细胞于含有50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mMNaCl、1％Nonidet P-40、0.1％SDS、2mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物(Roche，瑞士)的IB缓冲液中裂解。裂解物的蛋白浓度用分光光度计测定。蛋白质通过SDS-PAGE解析并转移到硝酸纤维素膜(Millipore，USA)。膜用溶于Tris缓冲盐溶液的5％脱脂乳粉溶液4℃封闭过夜。然后，膜用特异的一抗印迹1小时，并用含有0.1％吐温-20(v/v)的Tris缓冲盐溶液洗涤3次，持续5分钟。随后与辣根过氧化物酶共轭的二抗孵育45分钟，并用含有0.1％吐温20(v/v)的Tris缓冲盐溶液洗涤5次，持续5分钟。使用Clarity Western ECL底物(Bio-rad,USA)的化学发光，蛋白质被可视化并通过ImageJ软件被量化。

统计学分析：数据分析由GraphPad Prism 6软件进行。数据以平均值±S.D.表示。两组间差异的统计学分析采用双尾学生t检验进行，以及多组间的比较采用单因素方差分析和随后的Dunnett检验进行。小于0.05和0.01的p值分别被认为是显著和非常显著，并将其表示为p<0.05＝*；p<0.01＝**。

实施例二：在人肝硬化肝脏和小鼠纤维化肝脏的巨噬细胞中，YAP水平增加

为了分析肝硬化的患者中巨噬细胞的YAP表达，对来自非肝硬化或肝硬化患者的人类肝脏样本进行了YAP和F4/80免疫荧光染色。观察到，在人肝硬化肝脏样本中，YAP表达显著增加。特别地，肝硬化期间所诱导出的YAP表达被发现与F4/80⁺巨噬细胞部分地共定位(colocalized)(图1A，图29A-29C，图9)。为了阐明YAP在调制肝脏修复的作用，使用了一种慢性肝脏纤维化模型，其中肝脏纤维化通过重复的腹膜内注射四氯化碳(CCl₄)损伤被诱导出[参考文献2]。肝脏纤维化是通过α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫组化和天狼星红的形态测定分析来评估的。在1到4次CCl₄注射的早期阶段，α-SMA和天狼星红逐渐增强，在4次CCl₄注射后，肝脏纤维化是明显的(图1B)，这与[参考文献2]报道的一致。免疫荧光染色显示，作为在急性损伤中，YAP蛋白在肝脏中的表达在CCl₄的1次注射后显著增加，并且此后在慢性损伤中下降。巨噬细胞的YAP水平在1到4次CCl₄注射中逐渐增加并在其后保持稳定(图1B-1C，图10)。此外，在饮食和化学诱导的小鼠NASH模型[参考文献S2]中，与对照组相比，巨噬细胞YAP水平也增加(图1D)。总的来说，这些数据表明，巨噬细胞YAP在有纤维化的人类和小鼠的肝脏中增加，这使发明人探索巨噬细胞中YAP表达可能为肝脏纤维化的促成因素的可能性。

实施例三：髓系特异性(Myeloid-specific)YAP缺陷减轻小鼠肝脏纤维化和NASH模型的肝脏纤维化

为了研究巨噬细胞YAP蛋白在肝脏修复中的功能，实验人员利用了髓系特异性Yap1基因敲除小鼠(Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠)，Yap1删除的效率通过定量PCR和Westernblot证实(图11A-11B)。Masson's和天狼星红染色显示，Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠展示出在慢性CCl₄损伤后显著降低的肝脏纤维化(图2A)。与对照组小鼠相比，Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠的肝脏中α-SMA)、胶原I及羟脯氨酸的量也降低了(图2B-2C)。类似地，在小鼠NASH模型中[参考文献S2]，Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠显示出降低的肝脏纤维化(图2D-2F)。这些结果表明，Yap的髓系特异性删除阻碍慢性肝脏损伤或NASH后的肝脏纤维化。

实施例四：慢性肝脏损伤后，巨噬细胞中YAP的基因删除(genetic deletion)激活I型干扰素信号

为了进一步描述巨噬细胞YAP的促纤维化功能，在4次CCl₄注射后，从髓系Yap1缺陷小鼠或对照组小鼠分离出CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞并对其进行RNA测序分析。鉴定出416个差异表达基因(P<0.05，倍数变化截止值(fold change cut-off)>1.5)。基因本体论(GO)富集分析揭示了六个主要富集通路，包括“伤口愈合”和“对干扰素β(IFN-β)的反应”(图2G)。I类干扰素信号相关的基因在Yap1缺陷的巨噬细胞中上调，包括Ifnb1、Ifi27I2a、Ifi44、Isg15等(图2H)。IFN-β蛋白主要由巨噬细胞产生，并在CCl₄诱导的慢性损伤的早期阶段，IFN-β蛋白在髓系Yap1删除的小鼠的肝脏中增加，但在之后的阶段(在此期间，由结蛋白标记的HSCs是IFN-β蛋白的重要来源)没有增加(图2I-2K，图12A-12B)。免疫荧光染色显示，在CCl₄的1或3次注射后，肝脏IFN-β蛋白表达在骨髓Yap1删除的巨噬细胞显著增加(图2K)。用IFN-β处理，减轻了慢性CCl₄损伤后的肝脏纤维化，证实其抗纤维化功能(图2L-2M，图13)。有趣的是，IFN-β主要在CCl₄诱导的慢性损伤早期阶段发挥这种活性，而不是在纤维化已经发生后(图30A-30B)。这些数据意味着Yap的髓系特异性删除激活I型干扰素信号并阻止肝脏纤维化，特别在起始阶段(图2N)。

实施例五：单细胞分析确定了由巨噬细胞YAP缺陷引起的变化的细胞群

随后在单细胞水平上破解了巨噬细胞YAP的促纤维化作用。对4次CCl₄注射后的来自Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠或对照组小鼠的肝脏NPCs进行了单细胞RNA测序(scRNA-Seq)分析，并在9个细胞系中确定了21个群(图3A)。NPCs的统一流形逼近与投影(UMAP)分析揭示，巨噬细胞和EC群的频率在Yap1^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠中最显著地降低(其通过免疫荧光染色证实)(图3A-3B，图14，图15)。此外，基于配体/受体原理的细胞串扰的预测也表明，巨噬细胞和ECs之间的高水平的相互作用的可能性(图3C)。用于巨噬细胞的特定标记物(Adgre1、Clec4f、Macro和Trem2)和EC(Pecam1和Cdh5)被确定(图3D-3E)。ECs的单细胞t分布随机邻域嵌入(tSNE)分析揭示了5个细胞亚群，其中EC亚群1(EC1)显示了促纤维化基因Ctgf和Vcam1的更高表达(图3F-H，图16，图17)。因此，发明人决定关注确定巨噬细胞和EC群之间的串扰。另外，在髓系特异性Yap删除后，其他细胞类型(包括HSCs)也受到影响(图3I-3J)。

实施例六：YAP缺陷的巨噬细胞和内皮细胞之间的串扰影响肝脏纤维化

分析了公开的肝脏驻留细胞(liver-resident)的scRNA-Seq数据集[参考文献S8]，并且发现CTGF⁺VCAM1⁺内皮细胞亚群在人肝硬化肝脏中是增加的(图4A)。对来自非肝硬化或肝硬化患者的人类肝脏样本进行了CTGF或VCAM1与内皮标记物CD31的共染色。在肝硬化肝脏样本中，CD31⁺ECs中CTGF和VCAM1的表达显著增加(图4B-4C)。在CCl₄损伤的小鼠模型中，在1或3次CCl₄注射后，内皮细胞CTGF和VCAM1高度上调，其被髓系特异性Yap1删除逆转(图4D，图18)。免疫荧光染色显示，1次CCl₄注射后，巨噬细胞主要与由LYVE-1(淋巴管内皮细胞受体1)标记的CTGF⁺VCAM1⁺窦内皮细胞聚集(图4E，图19)。

接下来研究了干扰素反应是否抑制CTGF⁺VCAM1⁺内皮细胞亚群的出现。用IFN-β处理人类原代内皮细胞HUVECs，并检验CTGF和VCAM1的表达。体外实验显示IFN-β蛋白减轻CTGF和VCAM1在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上的表达(图4F)。在体内，1次CCl₄注射后，IFN-β处理下调了在ECs上CTGF和VCAM1的表达(图4G-4H)。为了证实巨噬细胞-内皮细胞的串扰，将Raw264.7或分离的肝脏巨噬细胞与小鼠血管内皮瘤内皮(EMOA)细胞共培养。在EMOA细胞与YAP基因敲减的Raw264.7细胞或分离的YAP缺陷的肝脏巨噬细胞共培养后，EMOA细胞中CTGF和VCAM1的表达被抑制；IFNAR1信号的抗体阻断逆转了这种抑制(图4I)。多个出版物表明，结缔组织生长因子(CTGF)的基因敲减或删除被证明可以减轻肝脏纤维化的形成[参考文献33-35]。且K-7174(一种VCAM1阻断剂(blocker))被发现，减轻慢性CCl₄损伤后的肝脏纤维化(图4J)。因此，本发明的数据意味着YAP缺陷的巨噬细胞和内皮细胞之间的串扰影响肝脏纤维化(图4K)。

实施例七：高通量GPCR配体库筛选确定选择性拮抗巨噬细胞中促纤维化的YAP的化合物

发明人用GPCR蛋白化合物库进行了筛选试验并发现盐酸氟奋乃静(Fluphenazinedihydrochloride，Flu)(一种经典的多巴胺受体D2(DRD2)拮抗剂，其能够有效地靶向和阻断多巴胺受体D2，以实现治疗用途)，是降低YAP活性的最有力的化合物之一(图5A)。此外，Flu降低了巨噬细胞Raw264.7中YAP反应的信号，但在肝细胞HepG2中没有(图5B)。分离自小鼠肝脏巨噬细胞或肝细胞中的蛋白的Westernblotting证实，DRD2在巨噬细胞中选择性高度表达(图5C)。免疫荧光染色表明，在CCl₄损伤后，DRD2在巨噬细胞中被选择性诱导，并与YAP的变化水平相关(图5D，图20，图21)。在Raw264.7细胞和腹膜巨噬细胞(图5E和图5F)中，Flu处理增加了YAP磷酸化(Ser127)、抑制了YAP活性，以及促进了Ifnb1表达(图5G-5H)。在Raw264.7中，DRD2的基因敲减(knockdown)增强了YAP和LATS1/2激酶的磷酸化(图5I)，以及增强了基于LPS(脂多糖)或VSV(水泡性口炎病毒)暴露的IFNb1的表达(图5J)。这些数据表明，拮抗DRD2可以调制巨噬细胞的YAP活性并上调I型干扰素的信号(图5K)。

实施例八：DRD2拮抗或髓系特异性Drd2删除减轻肝脏纤维化

通过分析来自非肝硬化或肝硬化患者的人类肝脏样本，观察到，在肝硬化样本中，与F4/80⁺巨噬细胞共定位的DRD2表达有显著增加(图6A)。在体内，DRD2拮抗剂Flu的作用在CCl₄诱导的慢性损伤的模型中评估。Flu处理有一些副作用并导致小鼠体重下降(图22)。与对照组相比，经Flu处理组表现出已建立的(established)肝脏纤维化的逆转(经Flu处理的小鼠的肝脏中α-SMA和胶原I区域被消除)，并减轻肝脏损伤(ALT和AST水平都降低)(图6B和6C)。用髓系特异性Drd2敲除小鼠(Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺)进一步研究了巨噬细胞DRD2的促纤维化作用(图23A-23B)。在重复注射CCl₄后，Drd2^fl/flLyz2-Cre⁺小鼠表现出缓和的肝脏纤维化和减轻的肝损伤(图6D，图6E)。在胆汁淤积性损伤[参考文献2]和NASH的小鼠模型二者(胆管结扎(BDL)被用来引起胆汁淤积性损伤，而小鼠NASH表型是通过西方饮食喂养和随后的化学损伤产生的)中，小鼠巨噬细胞中DRD2的删除消除肝脏纤维化并减轻肝脏损伤(图6F-J)。在所有3个检测的模型中减轻的肝脏纤维化表明，在各种病理学情况下，靶向DRD2有潜力阻断肝脏纤维化(图6K)。

实施例九：靶向巨噬细胞中DRD2-YAP轴，通过刺激I型IFN反应来抑制纤维化

进一步探讨了巨噬细胞DRD2的促纤维化作用下的分子机制。对分离的来自4次CCl₄注射后的髓系Drd2缺陷小鼠或对照组小鼠的巨噬细胞进行RNA测序；KEGG富集通路分析显示，Hippo/YAP信号与巨噬细胞中的DRD2功能有显著关联(图7A)。此外，在缺乏髓系DRD2或YAP的小鼠二者中，I型干扰素信号相关的基因是上调的，包括Ifnb1、Ifi27I2a、Ifi44和Isg15(图7B)。免疫荧光染色显示，在1次或3次CCl₄的注射后，髓系Drd2的删除上调了IFN-β表达，并在CCl₄诱导的慢性损伤后，抑制ECs的CTGF或VCAM1，以及增强了肝细胞的增殖(图7C-E)。I型干扰素通过由IFNAR1和IFNAR2组成的共同受体发挥作用。为了建立DRD2-YAP和I型IFN信号之间的上位关系，在骨髓特异性删除Drd2或Yap1的小鼠中检测IFNAR1中和抗体(MAR1-5A3)或相应的Ig G同型对照(图7F)。用IFNAR1中和抗体的处理，成功地抑制了I型干扰素信号下游的基因，包括Ifit1、Oas2、Mx1、Isg15和Ifit3(图24)，且肝脏YAP水平未受影响(图25)。IFNAR1中和抗体的这种处理逆转了在髓系Drd2和Yap1缺陷小鼠的CCl₄诱导的慢性损伤期间观察到的肝脏纤维化的减轻、内皮VCAM1表达的上调和增强的肝细胞增殖(图7G-J，图26，图27)。这些结果共同表明，髓系特异性删除Drd2或Yap1，通过诱发I型IFN信号，促进肝脏再生而不是纤维化(图7K)。

实施例十：Flu在大型动物NASH模型中的治疗效果

然后在大型动物NASH模型中检测Flu的治疗效果。由于小型猪在损伤后发展肝脏脂肪变性和纤维化，其被用于肝脏纤维化的临床前研究[参考文献39-40]。小型猪的NASH是用高脂肪、高糖饮食和CCl₄的重复腹膜注射6个月诱导出的。治疗组接受腹腔注射Flu(0.11mg/kg)(图8A)。Flu处理对体重没有明显影响(图28)。组织学上，与对照组相比，经Flu处理组表现出肝脏纤维化的较低程度，且肝脏切片的油红O染色显示，经Flu处理组具有较少的脂质沉积(图8B)。在经Flu处理组的肝脏中，α-SMA和胶原I的沉积以及肝脏羟脯氨酸量都降低(图8C-8D)。此外，Flu处理显著促进NASH小型猪肝脏的肝细胞增殖(图8E)。这些来自临床相关的大型动物模型的数据，支持DRD2拮抗用于流行疾病(如NASH)中刺激肝脏再生(而不是纤维化)的治疗价值。

总结：

本发明发现，在有肝脏纤维化的人类和小鼠的肝脏中，巨噬细胞的YAP水平都增加，并通过一系列实验证明，肝脏巨噬细胞DRD2的遗传学和药理学靶向都可以减轻肝脏纤维化。

本发明还发现，在肝脏巨噬细胞中特异性存在促纤维化的多巴胺受体D2(DRD2)-YAP轴，以及在肝脏损伤起始后，巨噬细胞通过调制DRD2/YAP/IFN信号轴的抗纤维化功能。肝脏巨噬细胞中DRD2或YAP1基因的特异性缺乏(也可以理解为肝脏巨噬细胞中YAP通路的遗传学靶向)，提高了I型干扰素(IFN)反应，并减轻了肝脏纤维化中促纤维化的CTGF(结缔组织生长因子)⁺VCAM1(血管细胞粘附因子1)⁺内皮细胞亚群，即改善了肝脏纤维化。巨噬细胞中的YAP-IFN信号至少部分地通过调节表现出促纤维化的分子表型的上述内皮细胞亚群来影响肝脏纤维化。可以想象，这种内皮细胞亚群可能通过VCAM1进一步募集促纤维化的免疫细胞或刺激CTGF依赖的成纤维细胞激活。基于此，本发明实验提示，靶向肝脏巨噬细胞DRD2的药物可能是潜在的治疗肝脏纤维化的药物。

本发明发现，YAP在巨噬细胞中的促纤维化功能可能是由多巴胺受体D2(DRD2)引发的。通过向能够概括人类病理学的大型动物(小型猪)NASH模型施用多巴胺受体D2(DRD2)拮抗剂(也可以理解为肝脏巨噬细胞中YAP通路的药理学靶向)，发现其能够选择性阻断巨噬细胞(而不是肝细胞)中的YAP并选择性抑制YAP依赖的巨噬细胞的促纤维化功能。这种DRD2拮抗剂(优选为Flu)在大型动物(小型猪)NASH临床前模型中表现出有效地阻断纤维化、恢复肝的结构、促进肝脏再生。据报道，DRD2拮抗剂目前实际上用于阻断肿瘤细胞的骨、脑和肺转移以及治疗精神分裂症等涉及中枢神经系统的疾病。因此，本发明的DRD2拮抗剂阻断肝脏纤维化的效果，提供了对涉及其治疗效果和用途的额外见解。

综上所述，本发明涉及的DRD2拮抗(药理学和遗传学靶向巨噬细胞中的DRD2)，通过YAP通路引发I型干扰素信号，选择性地靶向肝脏巨噬细胞，有效地促进肝脏再生并避开纤维化，甚至逆转纤维化(如图31所总结)。且上述DRD2拮抗的抗纤维化作用在啮齿类和大型动物模型中都得到了证明。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

参考文献

1.GurtnerGC,et al.Woundrepairandregeneration.Nature 2008；453(7193):314-21.

2.Ding BS,et al.Divergent angiocrine signals from vascular nichebalance liver regeneration and fibrosis.Nature 2014；505(7481):97-102.

3.Wynn TA,Ramalingam TR.Mechanisms offibrosis:therapeutic translationfor fibrotic disease.Nature medicine2012；18(7):1028-40.

4.Kordes C,Haussinger D.Hepatic stem cell niches.The Journal ofclinical investigation2013；123(5):1874-80.

5.Ramachandran P,Iredale JP.Macrophages:central regulators of hepaticfibrogenesis and fibrosis resolution.Journal ofhepatology 2012；56(6):1417-9.

6.Moroni F,et al.Safety profile of autologous macrophage therapy forliver cirrhosis.Nature medicine2019；25(10):1560-5.

7.DuffieldJS,et al.Selective depletion ofmacrophages revealsdistinct,opposing roles during liver injury andrepair.TheJournal ofclinicalinvestigation2005；115(1):56-65.

8.Tacke F.Targeting hepatic macrophages to treat liverdiseases.Journal of hepatology2017；66(6):1300-12.

9.Schuppan D,et al.Determinants offibrosis progression and regressionin NASH.Journal ofhepatology2018；68(2):238-50.

10.Melgar-Lesmes P,Edelman ER.Monocyte-endothelial cell interactionsin the regulation of vascular sprouting andliverregeneration inmouse.Journalofhepatology 2015；63(4):917-25.

11.Matsuda M,et al.Oncostatin M causes liver fibrosis by regulatingcooperation between hepatic stellate cells andmacrophagesinmice.Hepatology2018；67(1):296-312.

12.Cai B,et al.Macrophage MerTK Promotes Liver Fibrosis inNonalcoholic Steatohepatitis.Cell Metab2020；31(2):406-21e7.

13.Pepe-Mooney BJ,et al.Single-Cell Analysis ofthe Liver EpitheliumReveals Dynamic Heterogeneity andanEssential Role forYAP inHomeostasisandRegeneration.Cell Stem Cell 2019；25(1):23-38e8.

14.Li W,Yang L,et al.AHomeostaticArid1a-Dependent PermissiveChromatin State Licenses Hepatocyte Responsiveness to Liver-Injury-AssociatedYAP Signaling.Cell Stem Cell 2019；25(1):54-68e5.

15.Verboven E,et al.Regeneration Defects inYap and Taz Mutant MouseLiversAre Causedby Bile Duct Disruption andCholestasis.Gastroenterology2021；160(3):847-62.

16.Hyun J,et al.Dysregulation ofthe ESRP2-NF2-YAP/TAZ axis promoteshepatobiliary carcinogenesis innon-alcoholic fatty liver disease.Journalofhepatology2021；doi:10.1016/j.jhep.2021.04.033.

17.Mooring M,et al.Hepatocyte Stress Increases Expression ofYes-AssociatedProtein andTranscriptional Coactivator With PDZ-Binding Motif inHepatocytes to Promote Parenchymal Inflammation and Fibrosis.Hepatology 2019；71(5):1813-1830.

18.Zhang C,et al.Oroxylin A prevents angiogenesis of LSECs in liverfibrosis via inhibition of YAP/HIF-1alpha signaling.Journalofcellularbiochemistry2018；119(2):2258-68.

19.HaakAJ,et al.Selective YAP/TAZ inhibition in fibroblasts viadopamine receptor D1 agonism reverses fibrosis.Science translational medicine2019；11(516).

20.Fan F,et al.Pharmacological targeting of kinases MST1 and MST2augments tissue repair and regeneration.Science translational medicine 2016；8(352):352ra108.

21.Wang X,et al.Hepatocyte TAZ/WWTR1 Promotes Inflammation andFibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis.Cell Metab 2016；24(6):848-62.

22.Van Soldt BJ,et al.Yap and its subcellular localization havedistinct compartment-specific roles in the developing lung.Development 2019；146(9).

23.Yu FX,et al.Regulation of the Hippo-YAP pathway by G-protein-coupled receptor signaling.Cell 2012；150(4):780-91.

24.Insel PA,et al.GPCR expression in tissues and cells:are theoptimal receptors being used as drug targets？Britishjournal ofpharmacology2012；165(6):1613-6.

25.Tsuchida T,et al.A simple diet-and chemical-induced murine NASHmodel with rapid progression of steatohepatitis,fibrosis and livercancer.Journal ofhepatology 2018；69(2):385-95.

26.Malecova B,et al.Dynamics of cellular states of fibro-adipogenicprogenitors during myogenesis and muscular dystrophy.Nature communications2018；9(1):3670.

27.Agassandian M,et al.VCAM-1 is a TGF-beta1 inducible geneupregulated in idiopathic pulmonary fibrosis.Cellular signalling 2015；27(12):2467-73.

28.Rachfal AW,Brigstock DR.Connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)in hepatic fibrosis.Hepatology research:the officialjournal ofthe JapanSociety ofHepatology 2003；26(1):1-9.

29.Minutti CM,et al.Local amplifiers of IL-4Ralpha-mediatedmacrophage activation promote repair in lung and liver.Science 2017；356(6342):1076-80.

30.Puengel T,Tacke F.Repair macrophages in acute liver failure.Gut2018；67(2):202-3.

31.Cao Z,et al.Targeting the vascular and perivascular niches as aregenerative therapy for lung and liver fibrosis.Science translationalmedicine 2017；9(405).

32.Ramachandran P,et al.Resolving the fibrotic niche ofhuman livercirrhosis at single-cell level.Nature 2019；575(7783):512-8.

33.George J,Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connective tissuegrowth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis inrats.Gene Ther 2007；14(10):790-803.

34.Li G,et al.Inhibition ofconnective tissue growth factor bysiRNAprevents liver fibrosis in rats.J Gene Med 2006；8(7):889-900.

35.Pi L,et al.Connective tissue growth factor and integrinalphavbeta6:a new pair ofregulators critical for ductular reaction andbiliaryfibrosis in mice.Hepatology 2015；61(2):678-91.

36.Umetani M,et al.A novel cell adhesion inhibitor,K-7174,reduces theendothelial VCAM-1 induction by inflammatory cytokines,acting through theregulation of GATA.Biochemical and biophysical research communications 2000；272(2):370-4.

37.Zhao B,et al.The Hippo-YAP pathway in organ size control andtumorigenesis:an updated version.Genes&development 2010；24(9):862-74.

38.Pestka S,et al.Interferons,interferon-like cytokines,and theirreceptors.Immunol Rev 2004；202:8-32.39.Lee L,et al.Nutritional model ofsteatohepatitis and metabolic syndrome in the Ossabaw miniatureswine.Hepatology 2009；50(1):56-67.

40.Liang T,et al.Liver injury and fibrosis induced by dietarychallenge in the Ossabaw miniature Swine.PloS one 2015；10(5):e0124173.

41.Jiao S,et al.Targeting IRF3 as a YAP agonist therapy againstgastric cancer.The Journal of experimental medicine 2018；215(2):699-718.

42.Wang S,et al.YAP antagonizes innate antiviral immunity and istargeted for lysosomal degradation through IKKvarepsilon-mediatedphosphorylation.Nature immunology 2017；18(7):733-43.

43.Petrasek J,et al.Interferon regulatory factor 3 and type Iinterferons are protective in alcoholic liver injury in mice by wayofcrosstalk ofparenchymal and myeloid cells.Hepatology 2011；53(2):649-60.

44.Roh YS,et al.Toll-like receptor 7-mediated type I interferonsignaling prevents cholestasis-and hepatotoxin-induced liverfibrosis.Hepatology 2014；60(1):237-49.

45.Inagaki Y,et al.Interferon alfa down-regulates collagen genetranscription and suppresses experimental hepatic fibrosis in mice.Hepatology2003；38(4):890-9.

46.Torres-Rosas R,et al.Dopamine mediates vagal modulation of theimmune system by electroacupuncture.Nature medicine 2014；20(3):291-5.

47.Yan Y,et al.Dopamine controls systemic inflammation throughinhibition of NLRP3 inflammasome.Cell 2015；160(1-2):62-73.

48.Xu F,et al.Repositioning antipsychotic fluphenazine hydrochloridefor treating triple negative breast cancer with brain metastases and lungmetastases.Am J Cancer Res 2019；9(3):459-78.

49.Liu S,et al.Osteocyte-Driven Downregulation of Snail RestrainsEffects of Drd2 Inhibitors on Mammary Tumor Cells.Cancer research 2018；78(14):3865-76.

S1.Ding BS,et al.Divergent angiocrine signals from vascular nichebalance liver regeneration and fibrosis.Nature 2014；505:97-102.

S2.Tsuchida T,et al.A simple diet-and chemical-induced murine NASHmodel with rapid progression of steatohepatitis,fibrosis and liver cancer.JHepatol 2018；69:385-395.

S3.Lee L,et al.Nutritional model of steatohepatitis and metabolicsyndrome in the Ossabaw miniature swine.Hepatology 2009；50:56-67.

S4.Liang T,et al.Liver injury and fibrosis induced by dietarychallenge in the Ossabaw miniature Swine.PLoS One 2015；10:e0124173.

S5.Wang S,et al.YAP antagonizes innate antiviral immunity and istargeted for lysosomal degradation through IKKvarepsilon-mediatedphosphorylation.Nat Immunol 2017；18:733-743.

S6.Dupont S,et al.Role ofYAP/TAZ in mechanotransduction.Nature 2011；474:179-183.

S7.Graney PL,et al.Macrophages of diverse phenotypes drivevascularization of engineered tissues.Sci Adv 2020；6:eaay6391.

S8.Ramachandran P,et al.Resolving the fibrotic niche of human livercirrhosis at single-cell level.Nature 2019；575:512-518.

S9.Hyun J,et al.Dysregulation of the ESRP2-NF2-YAP/TAZ axis promoteshepatobiliary carcinogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.J Hepatol2021.

S10.Kim D,et al.HISAT:a fast spliced aligner with low memoryrequirements.Nat Methods 2015；12:357-360.

S11.Anders S,et al.HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.Bioinformatics 2015；31:166-169.

S12.Love MI,et al.Moderated estimation of fold change and dispersionfor RNA-seq data with DESeq2.Genome Biol 2014；15:550.

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西第二医院

<120> DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用

<150> CN2021109490082

<151> 2021-08-18

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 1

ttctccgaac gtgtgtcacg tttc 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 2

ccactacaac tatgccat 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 3

gaccagaatg agtgtatcat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 4

caggattcac tgtgacatct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 5

ccaccaagct agataaagaa a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 6

gcggttgaaa caacaggaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 7

ctggtcaaag atacttctta a 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 8

ctgagatgtc acttcacatg gaa 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 9

gtgcatcccc aatgggttct 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 10

ggaccgtgct gcgacttat 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 11

acccatcatc tttgcccac 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 12

gaccataggg gtcttgacca a 21

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 13

agacttgctc tttctgaaaa gcc 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 14

ggtgtccgtg actaactcca t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 15

tggaaagggt aagaccgtcc t 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 16

cctacataaa gcacctagat ggc 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 17

atgtgatagt agatccaggc gt 22

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 18

gtgccgcctg gagaaacct 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 19

tgaagtcgca ggagacaacc 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 20

gcgttcctgc tgtgcttct 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 21

tcttctgcat cttctccgtc a 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 22

cttgtggaaa tgtgcccgaa ac 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 23

tgtgcctggc ggatggtgta 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 24

tctccacccg agttaccaat g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artifical Sequence）

<400> 25

aatgttttcc tccaggtcag c 21

Claims (10)

1.DRD2抑制剂在制备治疗与肝脏纤维化有关的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述DRD2抑制剂为氟奋乃静（Flu）及其药学上可接受的盐；所述肝脏纤维化有关的疾病由慢性肝脏损伤引起。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化有关的疾病包括非酒精性脂肪性肝炎。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化有关的疾病包括自身免疫性肝炎、先天性肝纤维化、非酒精性脂肪肝病、胆汁淤积性肝病、酒精性肝炎、病毒性肝炎中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化有关的疾病的症状包括肝脏巨噬细胞中Yes相关蛋白（YAP）水平增加。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝脏纤维化有关的疾病的症状包括以下分子中的一种或多种的水平增加：α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）、血管细胞粘附因子1（VCAM-1）、胶原Ⅰ、Yes相关蛋白（YAP）、磷酸化YAP、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肝脏羟脯氨酸。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物用于选择性靶向所述肝脏巨噬细胞中的所述Yes相关蛋白（YAP）通路。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物用于上调I型干扰素反应。

8.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物用于减轻以下症状中的一种或多种：肝脏纤维化、肝脏损伤和肝内脂质沉积。

9.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物用于促进肝细胞增殖和/或促进肝脏再生。

10.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物用于逆转所述肝脏纤维化。

Images