WO2020121546A1 - 活性型肝星細胞の脱活性化方法 - Google Patents

活性型肝星細胞の脱活性化方法 Download PDF

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WO2020121546A1
WO2020121546A1 PCT/JP2019/017361 JP2019017361W WO2020121546A1 WO 2020121546 A1 WO2020121546 A1 WO 2020121546A1 JP 2019017361 W JP2019017361 W JP 2019017361W WO 2020121546 A1 WO2020121546 A1 WO 2020121546A1
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WO
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tcf21
gene
hepatic stellate
liver
protein
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PCT/JP2019/017361
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豊 稲垣
泰博 中野
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学校法人東海大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for deactivating activated hepatic stellate cells.
  • Organ fibrosis is a condition in which extracellular matrix components such as collagen are excessively deposited in tissues as represented by liver cirrhosis, resulting in organ dysfunction.
  • stellate cells are the main collagen-producing cells, and when inflammation occurs in the liver, they are activated and transformed into myofibroblast-like activated stellate cells that excessively produce collagen.
  • the col1a1 gene encoding the ⁇ 1 chain of type I collagen, which is a typical extracellular matrix component expressed in fibrotic tissue upon activation of hepatic stellate cells, and ⁇ smooth muscle actin, a marker of myofibroblasts
  • the expression of the Acta2 gene which encodes for, is increased.
  • expression of the Col1a1 gene and Acta2 gene was decreased in about half of the activated stellate cells, resulting in quiescent stellate cells. It was clarified that it was deactivated to a similar trait (Non-Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 9 rat rats with liver cirrhosis-dependent liver cancer, administration of autotaxin inhibitors and LPAR1 inhibitors suppressed the expression of Col1a1 gene and Acta2 gene in hepatic stellate cells, improved liver fibrosis, and It has been reported that the number of cancer nodules was also significantly reduced.
  • Tcf21 is a protein that regulates the development of the kidney and has been suggested to be involved in diabetic nephropathy and renal fibrosis (Non-Patent Document 10). In addition, it is known that deficiency of Tcf21 suppresses fibrosis after drug-induced myocardial injury (Non-Patent Document 11).
  • the object of the present invention is to provide a method for deactivating activated hepatic stellate cells. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver failure, a pharmaceutical composition for liver antifibrosis, and a pharmaceutical composition for improving liver function.
  • the present inventors have discovered that the above problems can be solved by introducing the Tcf21 gene into activated hepatic stellate cells, and arrived at the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the present invention provides a method for deactivating activated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells.
  • the present invention also provides a method for producing deactivated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells.
  • the production method includes a step of measuring the expression level of the Col1a1 gene, Acta2 gene, or Gfap gene in the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein have been introduced.
  • the present invention also provides a method for screening deactivated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells.
  • the screening method includes a step of measuring the expression level of the Col1a1 gene, Acta2 gene, or Gfap gene in the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein have been introduced.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein for the prevention or treatment of hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or liver failure based on any of these diseases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for liver antifibrosis, which comprises the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for improving liver function, which comprises the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein.
  • a method for deactivating activated hepatic stellate cells can be provided.
  • a method for producing deactivated hepatic stellate cells a method for screening deactivated hepatic stellate cells, and a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be used for prevention or treatment of liver failure, anti-fibrosis of liver, and improvement of liver function.
  • the graph which shows the relative expression level of Tcf21 gene, Col1a1 gene, Acta2 gene, and Gfap gene with respect to a non-introduced cell (Control) in the Tcf21 gene introduction cell concerning one mode of the present invention.
  • a section image of a liver tissue section after staining with Sirius red fast green photograph as a substitute for a drawing
  • liver tissue of a Tcf21 gene-transfected mouse relative to non-transfected mouse liver tissue
  • Sirius The graph which shows the result of having calculated the relative area of the red staining positive (azuki) part.
  • 3 is a graph showing the relative expression levels of the Col1a1 gene, Acta2 gene, and Gfap gene in the liver tissue of a Tcf21 gene-transfected mouse with respect to the non-transfected mouse liver tissue (Control) according to one embodiment of the present invention.
  • 3 is a graph showing Alanine transaminase (ALT) values and Aspartate transaminase (AST) values in serum of AAV6-Tcf21-administered mice and non-administered mice (Control) according to one embodiment of the present invention.
  • ALT Alanine transaminase
  • AST Aspartate transaminase
  • a section image of a liver tissue section after oil red o staining (drawing substitute photograph), and liver tissue of a Tcf21 gene-transfected mouse, to a non-transfected mouse liver tissue (Control), an oil -A graph showing the results of calculating the relative area of the red-o (red) staining positive portion.
  • 3 is a graph showing the relative expression levels of the Col1a1 gene and Acta2 gene in the liver tissue of a Tcf21 gene-transfected mouse relative to the liver tissue of a non-transfected mouse (Control) according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a section image (a photograph as a substitute for a drawing) after staining with human anti-Tcf21 antibody, anti-Vimentin antibody, and DAPI in a normal human liver tissue and a cirrhotic tissue according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. According to one embodiment of the present invention, relative expression level of the Col1a1 gene and Acta2 gene (vertical axis) relative to non-expressing cells (Control) in cells forcibly expressing a gene involved in hepatic stellate cell differentiation (horizontal axis) A graph showing.
  • Hepatic stellate cells are one of the non-parenchymal cells that make up the liver, and are vitamin A-storing cells that exist in the sinusoidal space (Dysse's space). When hepatitis becomes chronic, hepatic stellate cells are activated to release vitamin A and transform into ⁇ -smooth muscle actin-positive myofibroblast-like cells to produce excess collagen fibers. As a result, liver fibrosis progresses, and cirrhosis occurs when left untreated. The accumulation of collagen fibers can be confirmed by, for example, Sirius red/Fast green staining.
  • the present invention is based on the fact that the introduction of the Tcf21 gene into activated hepatic stellate cells deactivates the hepatic stellate cells and suppresses fibrosis.
  • the introduction of the Tcf21 gene into activated hepatic stellate cells is based on the fact that prevention or treatment of liver disease, antifibrosis of liver, or improvement of liver function can be achieved.
  • the deactivated hepatic stellate cells have a trait similar to that of stationary hepatic stellate cells.
  • the expression level of the Col1a1 gene is smaller when the hepatic stellate cell is in the deactivated state (close to the stationary phase) than when it is in the activated state.
  • the expression amount of the Acta2 gene is small, the expression amount of the Glial fibrillary acidic protein (Gfap) gene is large, and the expression amount of the Tcf21 gene is preferably large. That is, deactivation is identified by any one or more of the reduction of the expression level of the Col1a1 gene, the reduction of the expression level of the Acta2 gene, and the increase of the expression level of the Gfap gene due to the introduction of the Tcf21 gene. it can.
  • the expression level of the Tcf21 gene in the deactivated hepatic stellate cell is preferably 10 when the expression level in the activated hepatic stellate cell is 1, when a cell population of 1 ⁇ 10 5 cells or more is targeted. Or more, more preferably 50 or more, still more preferably 100 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is 1,000 or less, for example.
  • the expression level of the Col1a1 gene in deactivated hepatic stellate cells when targeting a cell population of 1 ⁇ 10 5 or more cells, the expression level in activated hepatic stellate cells is 1, preferably 0.8 or less. , More preferably 0.7 or less, still more preferably 0.6 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the expression level of the Acta2 gene in the deactivated hepatic stellate cells is preferably 0.8 or less when the expression level in the activated hepatic stellate cells is set to 1 when targeting a cell population of 1 ⁇ 10 5 cells or more. , More preferably 0.7 or less, still more preferably 0.6 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the expression level of the Gfap gene in the deactivated hepatic stellate cells when targeting a cell population of 1 ⁇ 10 5 cells or more, the expression level in the activated hepatic stellate cells is 1, and preferably 1.5 or more. , More preferably 2 or more, still more preferably 2.5 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is 20 or less, for example.
  • the cell size is smaller when the hepatic stellate cells are in the deactivated state than when they are in the activated state, based on the cell population level. .. That is, the deactivated hepatic stellate cells can be identified by reducing the average cell size on a cell population level basis. The reduction in average cell size can be identified by measuring the average area of hepatic stellate cells observed under a microscope.
  • the average cell area of deactivated hepatic stellate cells when targeting a cell population of 1 ⁇ 10 4 or more cells, the average cell area of activated hepatic stellate cells is 1, preferably 0.8 or less. , More preferably 0.7 or less, still more preferably 0.6 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the liver tissue is The area of fibrosis shown by Sirius red staining positive (adzuki color) when stained with Fast Green is small. That is, deactivation can be identified by a reduction in the fibrotic area positive for Sirius red staining.
  • the area of the Sirius red staining positive part in the fibrotic liver tissue in which the hepatic stellate cells are not deactivated is 1 and the hepatic star
  • the area of the liver tissue in which the cells are deactivated is preferably 0.7 or less, more preferably 0.6 or less, and further preferably 0.5 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the activated hepatic stellate cells are preferable.
  • a known molecular biology method such as preparing an expression vector or an adeno-associated virus containing the Tcf21 gene, introducing it into activated hepatic stellate cells and forcibly expressing it Can be used.
  • the Tcf21 gene to be introduced into activated hepatic stellate cells varies depending on the animal species. For example, SEQ ID NO: 1 (NCBIaccessionNo.: NC_000076.6) in the case of mouse and SEQ ID NO: 4 (NCBIaccession in human). No.: NG_032121.1). As long as the Tcf21 gene has one or more of decreasing the expression level of the Col1a1 gene, decreasing the expression level of the Acta2 gene, and increasing the expression level of the Gfap gene, SEQ ID NO: 1 or 4 is used. DNAs that hybridize under stringent conditions with DNAs having complementary sequences to the base sequences described are included.
  • the stringent conditions include, for example, conditions of washing under the conditions of 0.1 ⁇ SDS, 0.1 ⁇ SSC and 68° C.
  • the method for measuring the expression of the Tcf21 gene, the Col1a1 gene, the Acta2 gene, the Gfap gene and their gene products is not particularly limited, and examples thereof include a method of measuring the expression level of a known mRNA or protein.
  • the expression level of mRNA can be examined by, for example, RT-PCR method, quantitative PCR method, microarray method, or Northern blot method.
  • the expression level of the gene product protein can be examined by, for example, Western blotting, ELISA, or the like.
  • the nucleotide sequence of the coding region of the Tcf21 gene is, for example, SEQ ID NO: 2 (NCBIaccessionNo.: NM_011545.2) in the case of mouse and SEQ ID NO: 5 (NCBI accessionNo.: NM_198392.2) in the case of human.
  • SEQ ID NO: 2 NCBIaccessionNo.: NM_011545.2
  • SEQ ID NO: 5 NCBI accessionNo.: NM_198392.2
  • Examples include the cDNA sequences described (sequences corresponding to the sequences obtained by removing the untranslated region from the transcript (mRNA) of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, respectively). It is possible to design or obtain primers and probes for expression analysis.
  • the base sequence may have 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 98% or more identity (homology) with the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 5.
  • the primer, the probe and the like have 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity (homology) with the complementary sequence of the base sequence as long as it can specifically bind to the base sequence. May be included.
  • the anti-Tcf21 protein antibody used for Western blotting, ELISA, etc. a commercially available antibody can be used, and in the case of mouse, the Tcf21 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (NP_035675.1).
  • an antibody prepared by using the amino acid sequence of a part thereof, in the case of human being, the Tcf21 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (NP_938206.1) or a part of the amino acid sequence thereof as an immunogen may be used. it can.
  • the Tcf21 protein has a function of reducing the expression level of the Col1a1 gene, a function of decreasing the expression level of the Acta2 gene, or a function of increasing the expression level of the Gfap gene, it is a sequence It may have 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more identity (homology) with the amino acid sequence of No. 3 or 6.
  • the antibody or the like has an amino acid sequence having 80% or more, preferably 85% or more, and more preferably 90% or more identity (homology) with the amino acid sequence, as long as it can specifically bind to the amino acid sequence, or A part thereof may be prepared as an immunogen.
  • activated hepatic stellate cells are prepared by preparing a Tcf21 protein and removing the activated hepatic stellate cells using a known molecular biology technique such as introduction into activated hepatic stellate cells using liposomes or exosomes. It can also be activated.
  • the Tcf21 protein may be introduced into activated hepatic stellate cells when the Tcf21 gene is not introduced into activated hepatic stellate cells, or when the Tcf21 gene is introduced into activated hepatic stellate cells. May be done. In the latter case, the Tcf21 protein may be introduced before or after the Tcf21 gene is introduced.
  • the Tcf21 protein to be introduced into activated hepatic stellate cells is not limited as long as it can deactivate activated hepatic stellate cells.
  • SEQ ID NO: 3 for mouse SEQ ID NO: for human
  • the Tcf21 protein having the amino acid sequence represented by 6 can be mentioned.
  • any one or more of decreasing the expression level of Col1a1 gene, decreasing the expression level of Acta2 gene and increasing the expression level of Gfap gene can be used as long as it is SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 3.
  • It may be a protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more identity (homology) with the amino acid sequence of 6.
  • the Tcf21 protein may be modified.
  • the modification include amidation, addition of a lipid chain (aliphatic acylation (palmitoylation, myristoylation, etc.), prenylation (farnesylation, geranylgeranylation, etc.), phosphorylation (serine residue, threonine residue, Examples thereof include, but are not limited to, phosphorylation at tyrosine residue and the like), acetylation, addition of sugar chain (N-glycosylation, O-glycosylation) and the like.
  • the Tcf21 protein may have an amino acid sequence added so that it can be selectively delivered to the liver or hepatic stellate cells.
  • an amino acid sequence include the amino acid sequences described in Nature Communications 3:951 doi: 10.1038/ncomms1952.2012 Kondo E and the like.
  • a recombinant expression vector can be constructed using the DNA encoding the Tcf21 gene, introduced into a host for expression, purified, and produced. Any known molecular biology method can be used.
  • One embodiment of the present invention is a method for deactivating activated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells.
  • the active hepatic stellate cell of the present invention may be an active hepatic stellate cell in a state that has not been collected in the target liver, or may be an active hepatic stellate cell immediately after being collected from the target liver, It may be a primary culture cell or a culture cell line of activated hepatic stellate cells.
  • the marker gene for activated hepatic stellate cells for example, genes involved in fibrosis such as Col1a1 gene and Acta2 gene can be used.
  • genes involved in fibrosis such as Col1a1 gene and Acta2 gene can be used.
  • genes that are highly expressed in quiescent stellate cells such as Tcf21 gene and Gfap gene can be used.
  • the subject is not particularly limited as long as it has hepatic stellate cells, for example, mammals such as humans, mice, rats, dogs, cats, rabbits, cows, horses, goats, sheep and pigs, and chickens and the like. Examples include birds.
  • a mammal such as human, mouse, dog, cat, cow, horse, pig, etc., more preferably human, mouse, dog, cat, etc., further preferably human or mouse, most preferably human. Is. Further, the age and sex (male or female) of the individual does not matter.
  • primary culture cells or cultured cell lines of activated hepatic stellate cells also include cells in which resting hepatic stellate cells have been activated for testing.
  • primary culture activated hepatic stellate cells that were activated by culturing quiescent stellate cells on a culture dish, or cultured activated hepatic stellate cells that were forced to express a marker gene for active hepatic stellate cells Examples include hepatic stellate cell lines.
  • a marker gene of activated hepatic stellate cells is incorporated into a plasmid or a viral vector for introducing into mammalian cells, and the cells are obtained by transfection into cells by a usual method such as lipofection. Cells and the like. Transfection may be transient or stable.
  • the amount of Tcf21 gene and/or Tcf21 protein introduced may be the amount of the activated hepatic stellate cells immediately after being collected from the target liver. Also, in the case of targeting primary culture activated hepatic stellate cells or cultured activated hepatic stellate cell lines, the transfer amount usually used for gene transfer or protein transfer to cells may be used. In the case of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells in the target liver that have not been collected, the pharmaceutical composition described below is considered to be equivalent to the pharmaceutical composition described below. The description of the object is incorporated.
  • Deactivated hepatic stellate cells can be produced by the above-described method for deactivating activated hepatic stellate cells. Therefore, another embodiment of the present invention is a method for producing deactivated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells. Further, when the active hepatic stellate cells are the active hepatic stellate cells in the target liver that have not been collected, after introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein, a part thereof or All may be removed in vitro.
  • the production method preferably includes a step of measuring the expression level of the Col1a1 gene, Acta2 gene, or Gfap gene in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein has been introduced. It is also preferable to include a step of measuring the expression level of the Tcf21 gene in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 gene has been introduced. In addition, a step of measuring the amount of Tcf21 protein in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 protein has been introduced may be included.
  • the expression level of the Tcf21 gene, the Col1a1 gene, the Acta2 gene, or the Gfap gene in the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or the Tcf21 protein have been introduced and the method for measuring the expression level are as described above.
  • the expression level of the Tcf21 protein can also be examined by Western blotting, ELISA, etc., as described above.
  • the production method preferably includes a step of measuring an average cell area in hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein has been introduced.
  • the average cell area in hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein has been introduced is as described above.
  • the production method includes a step of staining liver tissue with Sirius red fast green after the step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein. Further, it is preferable that the production method includes a step of measuring a fibrotic area positive for Sirius red staining after the staining step.
  • the sirius red fast green staining and the sirius red staining-positive fibrotic area in the liver tissue in which the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein have been introduced are present are as described above.
  • Another aspect of the present invention is a method for screening deactivated hepatic stellate cells, which comprises a step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein into activated hepatic stellate cells.
  • the deactivated hepatic stellate cell screened by the present method may be a cell that is a candidate for the deactivated hepatic stellate cell.
  • the active hepatic stellate cells are the active hepatic stellate cells in the target liver that have not been collected, after introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein, a part thereof or All may be removed in vitro.
  • the screening method preferably includes the step of measuring the expression level of the Col1a1 gene, the Acta2 gene, or the Gfap gene in the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein have been introduced. It is also preferable to include a step of measuring the expression level of the Tcf21 gene in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 gene has been introduced. In addition, a step of measuring the amount of Tcf21 protein in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 protein has been introduced may be included.
  • the expression level of the Tcf21 gene, the Col1a1 gene, the Acta2 gene, or the Gfap gene in the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or the Tcf21 protein have been introduced and the method for measuring the expression level are as described above.
  • the expression level of Tcf21 protein is also as described above.
  • the screening method preferably includes a step of measuring an average cell area in the hepatic stellate cell into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein has been introduced.
  • the average cell area in hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein has been introduced is as described above.
  • the screening method preferably includes a step of staining liver tissue with Sirius red fast green after the step of introducing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein. Further, the screening method preferably includes a step of measuring a fibrotic area positive for Sirius red staining after the staining step.
  • the sirius red fast green staining and the sirius red staining-positive fibrotic area in the liver tissue in which the hepatic stellate cells into which the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein have been introduced are present are as described above.
  • a known cell selection method can be used for the selection of the deactivated hepatic stellate cells. For example, a method in which a reporter gene that expresses a fluorescent protein is ligated to a vector containing the Tcf21 gene, and after introduction into cells, the fluorescence intensity thereof is used as an index to select deactivated hepatic stellate cells can be mentioned. In addition, a method may be mentioned in which a Tcf21 protein fused with a fluorescent protein is introduced into cells and then the deactivated hepatic stellate cells are selected using the fluorescence intensity as an index. As a specific example of a method for selecting deactivated hepatic stellate cells using fluorescence intensity as an index, the FACS technique and the like can be mentioned.
  • the present invention provides, in another aspect, a pharmaceutical composition containing the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein (hereinafter sometimes referred to as “pharmaceutical composition of the present invention”).
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating liver failure based on hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or any of these diseases and a pharmaceutical composition for liver antifibrosis.
  • a pharmaceutical composition for improving liver function include viral hepatitis, drug-induced hepatitis, autoimmune hepatitis, alcoholic hepatitis, or non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein.
  • the Tcf21 gene in this embodiment the previously mentioned embodiment of the Tcf21 gene is used, and specific embodiments include an expression vector containing the Tcf21 gene and an adeno-associated virus.
  • the specific embodiment of the Tcf21 protein the aforementioned embodiment of the Tcf21 protein is incorporated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is usually used by formulating a liquid or solid pharmaceutical carrier that is physiologically acceptable.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and specific examples thereof include solutions, suspensions, emulsions and injections. Further, upon formulation, addition of an excipient, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, a stabilizer, a flavoring agent, a diluent, a surfactant, a solvent for injection, etc. which are usually used as a formulation carrier. Agents, liposomes, exosomes, etc. as means for delivery to target cells can be used.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected depending on the dosage form, usage, target age, sex, body weight, type of disease, degree of disease, symptom, administration route, administration schedule, dosage form and the like.
  • the amount to be administered as the Tcf21 gene is, for example, an amount converted into the amount of adeno-associated virus genome in terms of body weight ratio, preferably 1 ⁇ 10 10 viral genome/kg or more, more preferably 1 ⁇ 10 11 viral genome/kg. Or more, more preferably 1 ⁇ 10 12 viral genome/kg or more, while preferably 1 ⁇ 10 16 viral genome/kg or less, more preferably 1 ⁇ 10 15 viral genome/kg or less, further preferably 1 ⁇ 10 14 viral genome/kg or less.
  • the amount when administered as Tcf21 protein is, for example, preferably 0.1 mg/kg or more, more preferably 1 mg/kg or more, still more preferably 10 mg/kg or more in terms of body weight ratio, while preferably 1,000 mg/kg or less, more preferably 500 mg/kg or less, still more preferably 100 mg/kg or less.
  • the route of administration may be, but is not limited to, oral administration, rectal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, peripheral vein injection, hepatic artery injection, intraperitoneal injection and the like.
  • the administration timing of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and the administration timing can be appropriately selected according to the method for preventing or treating the target disease. It may also be administered prophylactically or used for maintenance therapy.
  • the dosage form is preferably determined according to the dosage form, the age and sex of the patient, other conditions, the degree of symptoms of the patient, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered once a day or divided into a plurality of times, or may be administered once every several days or weeks. Furthermore, irregular administration may be performed while evaluating the therapeutic effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an antifibrotic action on the liver, it can be used as a pharmaceutical composition for antifibrotic action on the liver and is preferably prevented or treated by antifibrotic action on the liver. It can be used for the prevention or treatment of the resulting disease. Both “treatments” also include the control and improvement of disease progression. Specific examples of its application include liver failure due to hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or any of these diseases. The liver failure may be acute liver failure or chronic liver failure. Specific examples of hepatitis include viral hepatitis, drug-induced hepatitis, autoimmune hepatitis, alcoholic hepatitis, or non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention has been administered has a smaller value of ALT or AST in serum, which is an index of liver function, than the subject to which it has not been administered. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for improving liver function.
  • the ALT of the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention has been administered is preferably 0.7 or less, more preferably 0.6 or less, still more preferably 0.5 or less, with 1 being the ALT of the subject not administered.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the AST of the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered is preferably 0.7 or less, more preferably 0.6 or less, still more preferably 0.5 or less, where 1 is the AST of the subject not administered.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • a subject to which the pharmaceutical composition of the present invention was administered has a smaller area of positive oil red o staining than a subject not administered.
  • Oil red o is used as a staining reagent for histologically detecting adipocytes and triglycerides, and the staining area is the amount of triglycerides accumulated in hepatocytes in non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) or liver failure based thereon.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered, it is preferably 0.6 or less, more preferably 0.5 or less, still more preferably 0.4 or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is 0.1 or more, for example.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone, or other pharmaceutical composition or medicament, for preventing or treating a disease which can be prevented or treated by antifibrosis of the liver or improvement of liver function. You may use together with a pharmaceutical composition or a pharmaceutical.
  • Another aspect of the present invention is the use of the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein in the manufacture of a pharmaceutical composition for liver antifibrosis or a pharmaceutical composition for improving liver function.
  • Another aspect of the present invention is the use of the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein for antifibrosis of the liver or improvement of liver function.
  • Another aspect of the present invention is a Tcf21 gene and/or Tcf21 protein used for antifibrosis of liver or improvement of liver function.
  • another embodiment of the present invention is the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein used for the prevention or treatment of diseases that can be prevented or treated by antifibrosis of the liver or improvement of liver function.
  • another embodiment of the present invention comprises the administration of the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein, a liver anti-fibrotic pharmaceutical composition or a liver function improving pharmaceutical composition to an application subject, wherein It is a fibrosis method. Further, another embodiment of the present invention comprises the step of administering the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein, the pharmaceutical composition for liver antifibrosis or the pharmaceutical composition for improving liver function to an application subject, to antifibrotic liver. Alternatively, it is a method for preventing or treating a disease that can be prevented or treated by improving liver function.
  • another aspect of the present invention is the Tcf21 gene in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver failure based on hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or any of these diseases. And/or use of the Tcf21 protein. Further, another aspect of the present invention is a Tcf21 gene and/or Tcf21 protein used for the prevention or treatment of liver failure based on hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or any of these diseases. Is.
  • another aspect of the present invention is a step of administering the Tcf21 gene and/or Tcf21 protein to an application subject, or hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer according to one aspect of the present invention, or any of these.
  • Liver which includes the step of administering a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of liver failure based on any of these diseases to the subject, hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis, or liver cancer, or liver based on any of these diseases.
  • a method for preventing or treating deficiency is a method for preventing or treating deficiency.
  • Example 1 Isolation of hepatic stellate cells
  • Somnopentyl (Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.) (75 ⁇ L) was intraperitoneally administered under deep anesthesia to open the abdomen to expose the portal vein.
  • Surfloflash 22G (Terumo) was inserted into the portal vein, and the cannula tube was connected there.
  • a peristaltic pump (ATTO)
  • the following perfusates 1 to 3 were sequentially sent at 50 mL per flow rate of 6 mL/min to digest the liver.
  • GBSS buffer Calcium-free Gey's balanced salt solutions buffer
  • GBSS buffer Calcium-free Gey's balanced salt solutions buffer
  • EGTA Dojindo
  • Perfusate 2 Prolongase E 30 in GBSS buffer 100 mL Solution in which mg (Millipore) is dissolved
  • Perfusion solution 3 Solution in which 20 mg of Collagenase (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) is dissolved in 100 mL of GBSS buffer.
  • the cell suspension that was made into single cells by these operations was collected in a 50 mL tube (Corning) while being washed with GBSS buffer, and centrifuged at 4°C for 5 minutes at 2,500 rpm. The supernatant was removed with an aspirator, and the cell pellet was suspended in a mixed solution of 50 mL of GBSS buffer and 20 ⁇ L of DNase solution until the pellet was completely broken, and centrifuged at 4°C for 5 minutes at 2,500 rpm for 5 minutes. The same operation was repeated twice.
  • the cells obtained were suspended and suspended in GBSS buffer so that the total volume was 7 mL, and this cell suspension was lysed with GBSS buffer in a 15 mL tube (Corning) with 30% Nycodenz AG. (Proteogenix) solution was mixed with 3 mL. On this solution, 2 mL of 8.8% Nycodenz AG solution was gently overlaid so as to form a layer, and 3 mL of GBSS buffer solution was overlaid in the same manner. This was centrifuged at 4° C. at 3,300 rpm for 15 minutes. After centrifugation, hepatic stellate cells arranged at the interface between Nycodenz AG solution and GBSS buffer were collected using a 1 mL pipette. The obtained hepatic stellate cells were seeded on a 60 mm dish containing 5 mL of the culture medium at 3.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 .
  • Hepatic stellate cells were cultured at 37° C. under a 5% carbon dioxide concentration.
  • the culture solution was prepared by dissolving 4.75 g of Dulbecco's modified Eagle medium (Nissui) powder in 500 mL of pure water and then sterilizing under high pressure steam.
  • the culture supernatant was removed by an aspirator, 2 mL of TrypLExpress (Invitrogen) was added to this, and the mixture was allowed to undergo an enzymatic reaction while stirring for 10 minutes at room temperature, and adhered cells were detached from the bottom of the dish. This was collected in a 15 mL tube and centrifuged at 4°C for 5 minutes at 2,500 rpm. The supernatant was removed by an aspirator, and the cell pellet was resuspended by stirring well in the culture medium, seeded on a new dish and cultured. Two days after this passage treatment, the above passage operation was repeated to activate the hepatic stellate cells.
  • TrypLExpress Invitrogen
  • AAV6 capable of overexpressing Tcf21 in activated hepatic stellate cells was prepared as follows using adeno-associated virus 6 (hereinafter, AAV6) of AAVpro Helper Free System (Takara Bio).
  • AAV6 adeno-associated virus 6
  • PAAV-CMV-Tcf21-IRES- was incorporated into the pAAV-CMV vector included in the same system by incorporating the Tcf21 cDNA prepared from adult mouse hepatic stellate cells and pMYs-IRES-GFP retrovirus vector-derived IRES-GFP. GFP was made.
  • pAAV-CMV-IRES-GFP containing only IRES-GFP was simultaneously prepared.
  • Tcf21 cDNA was synthesized using the oligo DNA described below as a primer.
  • ⁇ Tcf21-Forward primer ATGTCCACTGGCTCCCTCAGCGATGTAGAA (NCBI accession No. NM_011545.2) (SEQ ID NO: 7)
  • ⁇ Tcf21-Reverse primer TCAGGATGCTGTAGTTCCACACAAG (same as above) (SEQ ID NO: 8)
  • AAVpro 293T Cell Line (Takara Bio) was subcultured and expanded, and finally 40 mm 100 mm collagen-coated dishes (AGC technograss) were inoculated.
  • PRC6 vector, pHelper vector, pAAV-CMV-Tcf21-IRES-GFP vector or control pAAV-CMV-IRES-GFP vector included in AAVproHelper Free System are mixed in Opti-MEM (Gibco) and PEI Max ( Polysciences) was added to prepare vector plasmid liposomes.
  • This liposome was added to the medium of AAVpro293T Cell Line and cultured at 37°C. After 72 hours, remove the infected cells from the dish using a cell scraper, collect in a 50 mL tube, centrifuge at 1,000 rpm for 5 minutes at 4°C to remove the medium, and use the AAVpro Purification Kit (Takara Bio). The adeno-associated virus of interest was purified from infected cells. The concentration of the purified adeno-associated virus was calculated as the amount of virus genome contained in the purified solution using the AAV qPCR rapid titer measurement kit (Takara Bio) and StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems).
  • AAV6 produced based on the pAAV-CMV-Tcf21-IRES-GFP vector was referred to as AAV6-Tcf21, and AAV6 produced based on the control pAAV-CMV-IRES-GFP vector.
  • AAV6-control was designated as AAV6-control and was used in the following experiment.
  • the virus mixture prepared by the above method was adjusted to 25,000 virus genome/cell and AAV6-Tcf21 or AAV6-control prepared above was added to the cell culture medium. 96 hours later, the medium in the dish was removed by suction with an aspirator, washed with phosphate buffered saline and removed by suction, and the Buffer RLT plus (2-mercaptoethanol (BioRad)) included in the RNeasy plus mini kit (Qiagen) was removed. 350 ⁇ L was sprinkled onto the lysed cells and the lysed cells were collected in a 1.5 mL tube.
  • RNA concentration in the aqueous solution was measured using a NanoDrop ultratrace spectrometer (Thermo Fisher Scientific).
  • RNA for each RNA sample was added to an 8-tube (Nippon Genetics) and diluted with pure water to a volume of 6 ⁇ L. This was incubated at 65°C for 5 minutes and then rapidly cooled on ice.
  • 2 ⁇ L of 4 x DN Master Mix (gDNA Remover added) included in ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Toyobo) was added, and after gently stirring, incubated at 37°C for 5 minutes.
  • 2 ⁇ L of 5 ⁇ RT Master Mix II was added, lightly agitated to homogenize, and then reacted at 37°C for 15 minutes, 50°C for 5 minutes, and 98°C for 5 minutes to synthesize cDNA. ..
  • This reverse transcription reaction was performed using Takara PCR Thermal cycler (Takara Bio).
  • the cDNA obtained by the above method was mixed with SYBR Green real-time PCR master mix (Applied Biosystems) and oligo DNA primers for amplifying each target gene described below and added to a 96-well plate (Applied Biosystems).
  • SYBR Green real-time PCR master mix Applied Biosystems
  • oligo DNA primers for amplifying each target gene described below were added to a 96-well plate (Applied Biosystems).
  • the primers of the Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) gene described below were used.
  • ⁇ Tcf21-Forward primer, GGCTCCAACTGCGAGAACGGGT NCBI accession No.
  • a PCR reaction was performed on the sample in the 96-well plate by repeating a cycle of reacting at 95°C for 1 second and 60°C for 20 seconds using the StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) 40 times.
  • the relative expression level of each gene was measured based on the Gapdh gene expression level.
  • the Mann-Whitney Utest was used for the significance test between groups.
  • Example 2 Preparation of experimental liver fibrosis mouse
  • Six-week-old male C57Bl/6J mice (CLEA Japan, Inc.) were used.
  • Carbon tetrachloride (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and olive oil were mixed at a volume ratio of 1:3, and a 4-fold diluted solution was subcutaneously injected every 3 days to the back of the mouse at 1 mL/kg body weight. Fibrosis was created.
  • Example 2 preparation of adeno-associated virus and administration to liver fibrosis mice
  • the same operation as in Example 1 was performed to prepare AAV6-Tcf21 and AAV6-control.
  • Twenty-four hours after the administration of the adeno-associated virus the 21st administration of carbon tetrachloride was performed, and further 4 administrations of carbon tetrachloride were performed (total administration number: 25 times, 75 days).
  • liver tissue collection and liver tissue collection 72 hours after the 25th administration of carbon tetrachloride, the mice were subjected to laparotomy under anesthesia with isoflurane, and blood was collected from the inferior vena cava and liver tissues were collected.
  • the collected liver tissue was cut into small pieces and fixed in a 10% formalin solution in which formalin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with pure water for 16 hours. After that, the tissue is transferred to an embedding cassette (MURAZUMI) and, using an automatic fixed embedding device (Sakura Finetech Japan), it is immersed in 100% ethanol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) at room temperature for 2 hours with stirring.
  • MURAZUMI an embedding cassette
  • the liver tissue was dehydrated by repeating immersion in 100% ethanol for a total of 7 times. Next, transfer to xylene (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) and similarly soak for 2 hours with stirring, which is repeated 3 times in total, and then heat to 65°C to liquefy histoprep 568/paraffin (Fujifilm Wako Pure Chemicals). It was soaked for 2 hours with stirring in Kojunkaku Co., Ltd. to allow paraffin to permeate the liver tissue. Paraffin blocks were prepared using Tissue Tech TEC Plus Cryo Console (Sakura Fine Tech Japan).
  • FIG. 2 A photograph of liver tissue stained with Sirius red and fast green is shown on the left side of FIG.
  • AAV6-Tcf21-administered mice (the right photograph in the tissue photograph of FIG. 2) showed azuki bean color in comparison with the control mouse (the left photograph of the tissue photograph of FIG. 2) which was administered AAV6-control.
  • the accumulation of collagen fibers visualized in Fig. 2 was significantly suppressed (p ⁇ 0.01) (graph on the right in Fig. 2), and suppression of liver fibrosis by Tcf21 treatment was observed.
  • Example 3 Purification of liver tissue RNA
  • a part of the liver tissue collected in Example 2 above was collected in a 1.5 mL tube, and Buffer RLT plus (2-mercaptoethanol (BioRad) included in the RNeasy plus mini kit was adjusted to 1% thereof. Addition) 350 ⁇ L was added, and the tissue was disrupted and suspended in the solution using a homogenizer. Next, the same operation as in Example 1 was performed to purify total RNA.
  • RNA sample 500 ng was added to an 8-tube (Nippon Genetics) and diluted with pure water so that the liquid volume was 6 ⁇ L. Thereafter, the same operation as in Example 1 was performed to synthesize cDNA. The same operation as in Example 1 was performed to perform a quantitative analysis of gene expression. Statistical significance test was performed using Mann-Whitney U test.
  • Example 4 (Serum separation) The mouse blood collected in Example 2 above was allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then centrifuged at 4° C. at 3,000 rpm for 15 minutes using a cooling centrifuge (Eppendorf). The obtained supernatant was transferred to a new tube and stored at -30°C until measurement.
  • Example 5 Preparation of experimental non-alcoholic steatohepatitis mouse
  • Eight-week-old male C57Bl/6J mice (CLEA Japan, Inc.) were used.
  • a choline/methionine deficient feed (Oriental yeast) was fed for 8 weeks to prepare nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis.
  • Example 2 preparation of adeno-associated virus and administration to liver fibrosis mice
  • the same operation as in Example 1 was performed to prepare AAV6-Tcf21 and AAV6-control. After feeding a choline/methionine-deficient diet for 6 weeks, 3 ⁇ 10 11 adeno-associated virus genome/mouse was intraperitoneally administered under anesthesia with isoflurane. After administration of the adeno-associated virus, choline/methionine-deficient diet was fed for another 2 weeks (total feeding period was 8 weeks).
  • liver tissue Mice fed choline/methionine deficient diet for 8 weeks were subjected to laparotomy under isoflurane anesthesia, and blood was collected from the inferior vena cava and liver tissues were collected. The collected liver tissue was cut into small pieces, and fixed in a 4% paraformaldehyde solution in which paraformaldehyde (Millipore) was dissolved in phosphate buffered saline for 16 hours.
  • tissue transfer the tissue to a 10% sucrose solution prepared by dissolving sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) in phosphate buffered saline, stir in ice for 4 hours, then transfer to a further 20% sucrose solution and then in ice. Stir for hours.
  • the tissue was transferred to Clio-malt (Sakura Finetech Japan), the container was filled with OCT compound (Sakura Finetech Japan), and frozen at -80°C to prepare a tissue block.
  • the above block was sliced with Cryostat CM3050S (Leica) to a thickness of 6 ⁇ m, attached to New Silane II slide glass (Muto Chemical Co., Ltd.), air-dried at room temperature for 20 minutes, and a tissue section was prepared. It was made.
  • Example 2 Using the method described in Example 2, the stained and encapsulated liver tissue section was observed with an optical microscope and photographed. For each sample, the area of the oil-red-o staining positive (red) portion was calculated using ImageJ (National Institutes of Health) for images taken with 5 or more fields of view using a 10 ⁇ objective lens. Statistical significance tests were performed using the method described in Example 2.
  • Example 6 Purification of liver tissue RNA
  • Example 7 Preparation of human liver tissue section
  • a tissue section was prepared from the excised tissue of a patient who underwent hepatectomy for hepatocellular carcinoma with liver cirrhosis or liver metastasis of colorectal cancer by the same procedure as in Example 2.
  • TCF21 protein in human liver tissue Deparaffinization was performed by immersing the above tissue section in xylene for 3 minutes three times and then immersing it in 100% ethanol for three minutes three times. This tissue section was autoclaved at 110° C. for 10 minutes using Target retrieval solution (Dako) to activate the antigen. Non-specific reaction blocking reagent (Dako) was added dropwise to the tissue section, reacted at room temperature for 10 minutes to block, and Rabbit polyclonal anti-TCF21 antibody (Novus Biologicals) and mouse monoclonal anti-Vimentin antibody (Dako) were used as primary antibodies. The reaction was carried out at room temperature for 2 hours.
  • Dako Target retrieval solution
  • FIG. 7 shows a photograph of liver tissue subjected to fluorescent immunostaining.
  • Expression of TCF21 (red) in the non-tumor part of liver metastasis of colorectal cancer (normal liver tissue) was observed in the cell nucleus of hepatic stellate cells showing Vimentin positive (green) (arrows in FIGS. 7A and 7B).
  • the expression of Tcf21 was abolished in the non-tumor part (fibrotic liver tissue) of hepatocellular carcinoma with liver cirrhosis (FIGS. 7C and 7D). From these results, it was demonstrated that TCF21 expression was also attenuated in human liver tissues with the progress of fibrosis, that is, Tcf21 was useful as a specific marker of quiescent hepatic stellate cells.
  • Example 1 (Isolation and activation induction of hepatic stellate cells) Hepatic stellate cells were isolated by the same procedure as in Example 1. The isolated hepatic stellate cells were seeded in a 24-well plate at 3.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 . After inoculation, the cells were cultured for 5 days at 37° C. under a concentration of 5% carbon dioxide to activate hepatic stellate cells.
  • Cebpb-Forward primer ATGCACCGCCTGCTGGCCTGGGACG (NCBI accession No. NM_009883.4) (SEQ ID NO: 19) Cebpb-Reverse primer, CTAGCAGTGGCCCGCCGAGGCCAGC (same as above) (SEQ ID NO: 20) Epas1-Forward primer, ATGACAGCTGACAAGGAGAAAAAAA (NCBI accession No. NM_010137.3) (SEQ ID NO: 21) Epas1-Reverse primer, TCAGGTGGCCTGGTCCAGAGCTCTG (same as above) (SEQ ID NO: 22) Fosb-Forward primer, ATGTTTCAAGCTTTTCCCGGAGACT (NCBI accession No.
  • Nfib-Reverse primer Nfib-Reverse primer
  • TCAGTTGCTTGTCTCCGCTTGAAGG Nfib-Reverse primer
  • ATGGACTCCAAAGAATCCTTAGCTC NCBI accession No. NM_001361209.1
  • Nr3c1-Reverse primer TCATTTCTGATGAAACAGAAGCTTTTTG (same as above)
  • SEQ ID NO: 38 Ppara-Forward primer, ATGGTGGACACAGAGAGCCCCATCT (NCBI accession No.
  • the culture medium of hepatic stellate cells was replaced with a new culture medium, and the liposomes prepared by the above method were added to each, and the cells were cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was replaced with a new culture medium, and the culture was further continued for 24 hours.
  • the present invention is useful as a technique for preventing or treating liver diseases, a technique for liver antifibrosis, and a technique for improving liver function.

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Abstract

本発明は、活性型肝星細胞の脱活性化方法の提供を課題とし、該課題を、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、活性型肝星細胞の脱活性化方法で解決する。

Description

活性型肝星細胞の脱活性化方法
　本発明は、活性型肝星細胞の脱活性化方法に関する。
　臓器線維症とは、肝硬変に代表されるように、コラーゲンをはじめとする細胞外マトリックス成分が組織に過剰沈着し、臓器の機能不全をきたした病態である。肝臓においては星細胞が主たるコラーゲン産生細胞とされ、肝臓に炎症が起きると活性化して、コラーゲンを過剰に産生する筋線維芽細胞様の活性型星細胞に形質転換する。
　これまでの肝線維症に対する抗線維化治療の研究において、炎症の抑制、星細胞の活性化（筋線維芽細胞様細胞への形質転換）の阻害、活性型星細胞によるコラーゲン産生の抑制、さらには分泌されて肝組織に沈着したコラーゲン線維の分解など、数多くの試みがなされてきた。また、肝星細胞の活性化を制御する様々な転写調節因子が同定され(非特許論文１～６)、ビタミンＡの投与が肝星細胞の活性化を阻害するという報告もなされた（非特許文献７）が、いずれも未だ臨床応用には至っていない。
　肝星細胞の活性化に伴って、線維化組織に発現する代表的な細胞外マトリックス成分であるI型コラーゲンのα1鎖をコードするCol1a1遺伝子、および筋線維芽細胞のマーカーであるα平滑筋アクチンをコードするActa2遺伝子の発現が増加する。一方で、四塩化炭素の反復投与により作製した肝硬変モデルマウスでは、四塩化炭素の投与を中止すると約半数の活性型星細胞においてCol1a1遺伝子およびActa2遺伝子の発現が低下して、静止期星細胞に類似した形質に脱活性化することが明らかにされた（非特許文献８）。また、肝硬変依存性肝がんのモデルラットにおいて、オートタキシン阻害剤およびLPAR1阻害剤の投与により、肝星細胞におけるCol1a1遺伝子およびActa2遺伝子の発現が抑制され、肝臓の線維化は改善し、肝がん結節の数も有意に減少したことが報告されている（非特許文献９）。
　一方で、転写調節因子Tcf21の存在が知られている。Tcf21は、腎臓の発生を制御するタンパク質であって、糖尿病性腎症や腎臓の線維化に関与することが示唆されている（非特許文献１０）。また、Tcf21を欠損すると、薬剤性心筋傷害後の線維症が抑制されることが知られている（非特許文献１１）。
J. Biol. Chem. 2017 292;46:18961-18972. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 101;47:16549-16554. Hepatology. 2014 59;6:2358-2370. J. Biol. Chem. 2004 279;12:11392-11401. Dev. Biol. 2007 312;1:157-170. Lab. Invest. 2005 85;11:1368-1380. Lab. Invest. 1985 52;2:182-194. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109;24:9448-9453. Cancer Cell. 2016 30;6:879-890. "科学研究費助成事業　研究成果報告書"、［ｏｎｌｉｎｅ］、"研究課題名（和文）ポドサイトの転写因子Tcf21の機能解析を通じた慢性腎臓病の機序解明"、［平成３０年１１月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://kaken.nii.ac.jp/file/KAKENHI-PROJECT-26461214/26461214seika.pdf#search=%27Tcf21+%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%27＞ "第８２回日本循環器学会学術集会"、［ｏｎｌｉｎｅ］、演題ＰＪ００８－３、"Transcription Factor Tcf21 Regulates Fibrosis after Isoproterenol-induced Cardiac Injury"、［平成３０年１１月１２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.micenavi.jp/jcs2018/search/detail_program/id:2657＞
　本発明は、活性型肝星細胞の脱活性化方法の提供を課題とする。また、本発明は、肝不全の予防又は治療のための医薬組成物、肝臓の抗線維化用医薬組成物、及び肝機能改善用医薬組成物の提供を課題とする。
　本発明者らは、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子を導入することで上記課題が解決できることを発見し、本発明に到達した。
　本発明は下記の通りである。
　本発明は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、活性型肝星細胞の脱活性化方法を提供する。
　また、本発明は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞の製造方法を提供する。
　前記製造方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含むことを好ましい態様としている。
　また、本発明は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞のスクリーニング方法を提供する。
　前記スクリーニング方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含むことを好ましい態様としている。
　また、本発明は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物を提供する。
　また、本発明は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝臓の抗線維化用医薬組成物を提供する。
　また、本発明は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝機能改善用医薬組成物を提供する。
　本発明によれば、活性型肝星細胞の脱活性化方法を提供することができる。また、併せて、脱活性型肝星細胞の製造方法、及び脱活性型肝星細胞のスクリーニング方法、並びに医薬組成物を提供することができる。該医薬組成物は、肝不全の予防又は治療の用途、肝臓の抗線維化の用途、及び肝機能改善の用途に用いることができる。
本発明の一態様に係る、Tcf21遺伝子導入細胞における、非導入細胞（Control）に対する、Tcf21遺伝子、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、Gfap遺伝子の相対的発現量を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、肝組織切片をシリウスレッド・ファーストグリーン染色した後の切片画像（図面代用写真）と、Tcf21遺伝子導入マウスの肝組織における、非導入マウス肝組織（Control）に対する、シリウスレッド染色陽性（アズキ色）部分の相対的面積を算出した結果を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、Tcf21遺伝子導入マウスの肝組織における、非導入マウス肝組織（Control）に対する、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、Gfap遺伝子の相対的発現量を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、AAV6-Tcf21投与マウスと非投与マウス（Control）における、血清中のAlanine transaminase (ALT)値およびAspartate transaminase (AST)値を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、肝組織切片をオイル・レッド・オー染色した後の切片画像（図面代用写真）と、Tcf21遺伝子導入マウスの肝組織における、非導入マウス肝組織（Control）に対する、オイル・レッド・オー（赤色）染色陽性部分の相対的面積を算出した結果を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、Tcf21遺伝子導入マウスの肝組織における、非導入マウス肝組織（Control）に対する、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子の相対的発現量を示すグラフ。 本発明の一態様に係る、ヒトの正常肝組織と肝硬変組織とにおける、抗Tcf21抗体、抗Vimentin抗体、及びDAPIによる染色後の切片画像（図面代用写真）。 本発明の一態様に係る、肝星細胞の分化に関わる遺伝子（横軸）を強制発現させた細胞における、非発現細胞（Control）に対する、Col1a1遺伝子及びActa2遺伝子の相対的発現量（縦軸）を示すグラフ。
　肝星細胞とは、肝臓を構成する非実質細胞の一つで、類洞周囲腔（ディッセ腔）に存在するビタミンＡ貯蔵細胞である。肝炎が慢性化すると肝星細胞が活性化し、ビタミンＡを放出し、α平滑筋アクチン陽性の筋線維芽細胞様の細胞に形質転換して、過剰のコラーゲン線維を産生する。その結果、肝臓の線維化が進行し、放置すると肝硬変となる。コラーゲン線維の蓄積は、例えば、シリウスレッド・ファーストグリーン染色などにより確認できる。
　本発明は、活性型肝星細胞へのTcf21遺伝子の導入により、肝星細胞が脱活性化して線維化が抑制されることに基づいてなされたものである。また、活性型肝星細胞へのTcf21遺伝子の導入により、肝疾患の予防若しくは治療、肝臓の抗線維化、又は肝機能の改善ができることに基づいてなされたものである。活性型肝星細胞へのTcf21遺伝子の導入により、該肝星細胞が脱活性化し、線維化が抑制される。好ましくは、活性型肝星細胞内においてTcf21の発現量が増加することによるものであり、脱活性化した肝星細胞は、静止期肝星細胞に類似した形質を有するようになる。
　肝星細胞の脱活性化の具体的態様としては、肝星細胞が活性化状態にある場合よりも脱活性化状態にある（静止期に近い）場合の方が、Col1a1遺伝子の発現量が小さく、Acta2遺伝子の発現量が小さく、Glial fibrillary acidic protein (Gfap)遺伝子の発現量が大きく、好ましくは、Tcf21遺伝子の発現量が大きい。すなわち、脱活性化は、Tcf21遺伝子の導入により、Col1a1遺伝子の発現量が小さくなること、Acta2遺伝子の発現量が小さくなること、Gfap遺伝子の発現量が大きくなることのうちいずれか一以上により同定できる。
　このとき、脱活性型肝星細胞におけるTcf21遺伝子の発現量は、細胞数1×105個以上の細胞集団を対象としたときに、活性型肝星細胞における発現量を1として、好ましくは10以上、より好ましくは50以上、さらに好ましくは100以上である。一方で、上限は特に制限されないが、例えば、1,000以下である。
　また、脱活性型肝星細胞におけるCol1a1遺伝子の発現量は、細胞数1×105個以上の細胞集団を対象としたときに、活性型肝星細胞における発現量を1として、好ましくは0.8以下、より好ましくは0.7以下、さらに好ましくは0.6以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　また、脱活性型肝星細胞におけるActa2遺伝子の発現量は、細胞数1×105個以上の細胞集団を対象としたときに、活性型肝星細胞における発現量を1として、好ましくは0.8以下、より好ましくは0.7以下、さらに好ましくは0.6以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　また、脱活性型肝星細胞におけるGfap遺伝子の発現量は、細胞数1×105個以上の細胞集団を対象としたときに、活性型肝星細胞における発現量を1として、好ましくは1.5以上、より好ましくは2以上、さらに好ましくは2.5以上である。一方で、上限は特に制限されないが、例えば、20以下である。
　活性型肝星細胞の脱活性化の他の具体的態様としては、肝星細胞が活性化状態にある場合よりも脱活性化状態にある場合の方が、細胞集団レベル基準で細胞サイズが小さい。すなわち、脱活性型肝星細胞は、細胞集団レベル基準で平均細胞サイズが小さくなることで同定できる。平均細胞サイズが小さくなることは、顕微鏡下で観察される肝星細胞の平均面積を測定することで同定できる。
　このとき、脱活性型肝星細胞の平均細胞面積は、細胞数1×104個以上の細胞集団を対象としたときに、活性型肝星細胞の平均細胞面積を1として、好ましくは0.8以下、より好ましくは0.7以下、さらに好ましくは0.6以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　肝組織における活性型肝星細胞の脱活性化の具体的態様としては、肝星細胞が活性化状態にある場合よりも脱活性化状態にある場合の方が、例えば、肝組織をシリウスレッド・ファーストグリーン染色した際にシリウスレッド染色陽性（アズキ色）で示される線維化面積が小さい。すなわち、脱活性化は、シリウスレッド染色陽性の線維化面積が小さくなることで同定できる。
　このとき、例えば、測定する肝組織の総面積を10 mm2以上としたときに、肝星細胞が脱活性化をしていない線維肝組織におけるシリウスレッド染色陽性部分の面積を1として、肝星細胞が脱活性化をした肝組織における該面積が、好ましくは0.7以下、より好ましくは0.6以下、さらに好ましくは0.5以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　活性型肝星細胞に転写制御因子Tcf21をコードする遺伝子又は転写制御因子Tcf21（本明細書では、「Tcf21タンパク質」と記載することがある。）を導入するため、好ましくは、活性型肝星細胞において発現量や存在量を増加させるためには、Tcf21遺伝子を含む、発現ベクターやアデノ随伴ウイルスなどを作製し、活性型肝星細胞に導入して強制発現させるなどの公知の分子生物学的手法を用いることができる。
　活性型肝星細胞に導入されるTcf21遺伝子としては、動物種によって異なり、例えばマウスの場合には配列番号１（NCBI accession No.: NC_000076.6）、ヒトの場合には配列番号４（NCBI accession No.: NG_032121.1）に記載する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。Tcf21遺伝子には、Col1a1遺伝子の発現量を減少させること、Acta2遺伝子の発現量を減少させること、Gfap遺伝子の発現量を増加させることのうちいずれか一以上である限り、配列番号１あるいは４に記載する塩基配列と相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６８℃の条件で洗浄する条件が挙げられる。
　Tcf21遺伝子、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、Gfap遺伝子や、それらの遺伝子産物の発現を測定する方法としては、いずれも特に限定されないが、例えば公知のｍＲＮＡやタンパク質の発現量を測定する方法が挙げられる。
　ｍＲＮＡの発現量は、例えばＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法で調べることができる。
　また遺伝子産物であるタンパク質の発現量は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどで調べることができる。
　Tcf21遺伝子のコード領域の塩基配列としては、例えばマウスの場合には配列番号２(NCBI accession No.: NM_011545.2）、ヒトの場合には配列番号５(NCBI accession No.: NM_198392.2）に記載するｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１、配列番号４に記載する塩基配列の転写産物（ｍＲＮＡ）から非翻訳領域を除いた配列に相当する配列）が挙げられ、この配列等を利用して遺伝子発現解析用のプライマーやプローブ等を設計又は取得することができる。前記塩基配列は、配列番号２あるいは５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性（相同性）を有するものであってよい。また、前記プライマーやプローブ等は、前記塩基配列と特異的に結合できる限り、前記塩基配列の相補配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性（相同性）を有するものであってよい。
　また、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等に用いる抗Tcf21タンパク質抗体としては、市販の抗体を用いることもできるし、マウスの場合には配列番号３(NP_035675.1)で表されるアミノ酸配列からなるTcf21タンパク質もしくはその一部のアミノ酸配列を、ヒトの場合には配列番号６(NP_938206.1)で表されるアミノ酸配列からなるTcf21タンパク質もしくはその一部のアミノ酸配列を免疫原として作製した抗体を用いることもできる。該Tcf21タンパク質は、Col1a1遺伝子の発現量を減少させる機能、Acta2遺伝子の発現量を減少させる機能、Gfap遺伝子の発現量を増加させる機能のうちいずれか一以上の機能を有するタンパク質である限り、配列番号３あるいは６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性（相同性）を有するものであってよい。また、前記抗体等は、前記アミノ酸配列と特異的に結合できる限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列もしくはその一部を免疫原として作製したものであってよい。
　また、活性型肝星細胞は、Tcf21タンパク質を準備し、リポソームやエクソソーム等を利用して活性型肝星細胞に導入するなどの公知の分子生物学的手法を用いて活性型肝星細胞を脱活性化することもできる。活性型肝星細胞へのTcf21タンパク質の導入は、活性型肝星細胞へのTcf21遺伝子の導入がされない場合にされてもよいし、活性型肝星細胞へのTcf21遺伝子の導入がされる場合にされてもよい。後者の場合は、Tcf21タンパク質の導入は、Tcf21遺伝子の導入前にされてもよいし、導入後にされてもよい。
　活性型肝星細胞に導入されるTcf21タンパク質としては、活性型肝星細胞を脱活性化できる限り制限されないが、動物種によって、例えばマウスの場合には配列番号３、ヒトの場合には配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるTcf21タンパク質が挙げられる。Tcf21タンパク質には、Col1a1遺伝子の発現量を減少させること、Acta2遺伝子の発現量を減少させること、Gfap遺伝子の発現量を増加させることのうちいずれか一以上である限り、配列番号３や配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　また、Tcf21タンパク質は修飾されていてもよい。該修飾としては、アミド化、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎ－グリコシル化、Ｏ－グリコシル化）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　また、Tcf21タンパク質には、肝臓や肝星細胞に選択的に運ばれるためのアミノ酸配列が付加されていてもよい。例えば、このようなアミノ酸配列として、Nature Communications 3:951 doi: 10.1038/ncomms1952.2012 Kondo E等に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　Tcf21タンパク質の製造方法としては、例えば、前記Tcf21遺伝子をコードするＤＮＡを用いて組換え発現ベクターを構築し、宿主に導入して発現させ、精製して製造することができる。いずれも公知の分子生物学的手法を用いることができる。
　本発明の一態様は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、活性型肝星細胞の脱活性化方法である。
　本発明の活性型肝星細胞としては、対象の肝臓中にあって採取されていない状態の活性型肝星細胞でもよいし、対象の肝臓から採取した直後の活性型肝星細胞でもよいし、活性型肝星細胞の初代培養細胞もしくは培養細胞株でもよい。活性型肝星細胞のマーカー遺伝子としては、例えばCol1a1遺伝子やActa2遺伝子などの線維化に関与する遺伝子を用いることができる。脱活性型肝星細胞のマーカー遺伝子としては、例えばTcf21遺伝子やGfap遺伝子などの静止期星細胞で高発現する遺伝子を用いることができる。
　対象としては、肝星細胞を有する対象であれば特に制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物や、ニワトリ等の鳥類などが挙げられる。好ましくはヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳動物であり、より好ましくはヒト、マウス、イヌ、又はネコ等であり、さらに好ましくはヒト又はマウスであり、最も好ましくはヒトである。また、個体の年齢、性別（雄又は雌）は問わない。
　また、活性型肝星細胞の初代培養細胞もしくは培養細胞株には、試験等のために静止期肝星細胞を活性化した細胞も含まれる。例えば、静止期星細胞を培養皿上で培養することで活性化させた初代培養活性型肝星細胞や、静止期肝星細胞に活性型肝星細胞のマーカー遺伝子を強制発現させた培養活性型肝星細胞株などが挙げられる。後者の作製方法としては、例えば、活性型肝星細胞のマーカー遺伝子を哺乳類細胞に導入するためのプラスミドやウイルスベクターなどに組み込み、リポフェクション等の通常の方法にて、細胞にトランスフェクションして得られた細胞等が挙げられる。トランスフェクションは一過的でも安定的でもよい。
　活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程における、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の導入量は、対象の肝臓から採取した直後の活性型肝星細胞を対象にする場合も、初代培養活性型肝星細胞や培養活性型肝星細胞株を対象にする場合も、細胞への遺伝子導入やタンパク質導入において通常用いられる導入量であってよい。
　尚、対象の肝臓中にあって採取されていない状態の活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する場合には、後述する医薬組成物と等価であるとして、後述する医薬組成物の説明を援用する。
　上記した活性型肝星細胞の脱活性化方法によって、脱活性型肝星細胞を製造することができる。そのため、本発明の他の一態様は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞の製造方法である。
　また、活性型肝星細胞が対象の肝臓中にあって採取されていない状態の活性型肝星細胞である場合には、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入した後に、適宜、その一部又は全部が生体外に摘出されてもよい。
　前記製造方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。尚、前記Tcf21遺伝子が導入された肝星細胞において、Tcf21遺伝子の発現量を測定する工程を含むことも好ましい。また、Tcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Tcf21タンパク質の量を測定する工程を含んでも構わない。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞における、Tcf21遺伝子、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量及びその測定方法については、既出の通りである。また、Tcf21タンパク質の発現量についても、既出の通り、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどで調べることができる。
　前記製造方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、平均細胞面積を測定する工程を含むことが好ましい。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞における、平均細胞面積については、既出の通りである。
　また、前記製造方法は、該Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の導入工程の後に、肝組織をシリウスレッド・ファーストグリーン染色する工程を含むことが好ましい。
　また、前記製造方法は、該染色工程の後に、シリウスレッド染色陽性の線維化面積を測定する工程を含むことが好ましい。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞が存在する肝組織における、シリウスレッド・ファーストグリーン染色、及び、シリウスレッド染色陽性の線維化面積については、既出の通りである。
　本発明の他の一態様は、活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞のスクリーニング方法である。本方法によってスクリーニングされる脱活性型肝星細胞は、脱活性型肝星細胞の候補となる細胞であってもよい。
　また、活性型肝星細胞が対象の肝臓中にあって採取されていない状態の活性型肝星細胞である場合には、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入した後に、適宜、その一部又は全部が生体外に摘出されてもよい。
　前記スクリーニング方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。尚、前記Tcf21遺伝子が導入された肝星細胞において、Tcf21遺伝子の発現量を測定する工程を含むことも好ましい。また、Tcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Tcf21タンパク質の量を測定する工程を含んでも構わない。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞における、Tcf21遺伝子、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量及びその測定方法については、既出の通りである。また、Tcf21タンパク質の発現量についても、既出の通りである。
　前記スクリーニング方法は、前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、平均細胞面積を測定する工程を含むことが好ましい。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞における、平均細胞面積については、既出の通りである。
　また、前記スクリーニング方法は、該Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の導入工程の後に、肝組織をシリウスレッド・ファーストグリーン染色する工程を含むことが好ましい。
　また、前記スクリーニング方法は、該染色工程の後に、シリウスレッド染色陽性の線維化面積を測定する工程を含むことが好ましい。
　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞が存在する肝組織における、シリウスレッド・ファーストグリーン染色、及び、シリウスレッド染色陽性の線維化面積については、既出の通りである。
　脱活性型肝星細胞の選別は、公知の細胞選別法を用いていることができる。例えば、Tcf21遺伝子を含むベクターに、蛍光タンパク質を発現するレポーター遺伝子を連結し、細胞への導入後にその蛍光強度を指標にして、脱活性型肝星細胞を選別する方法等が挙げられる。また、蛍光タンパクが融合されたTcf21タンパク質を細胞へ導入した後、その蛍光強度を指標にして、脱活性型肝星細胞を選別する方法等が挙げられる。いずれも、蛍光強度を指標にして脱活性型肝星細胞を選別する方法の具体例としては、ＦＡＣＳ技術等が挙げられる。
　本発明は、他の一態様として、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と記載することがある。）を提供する。その具体的態様として、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物、肝臓の抗線維化用医薬組成物、肝機能改善用医薬組成物が挙げられる。肝炎の具体例としては、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎、アルコール性肝炎、若しくは非アルコール性脂肪肝炎（NASH）が挙げられる。
　本発明の医薬組成物はTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含有する。本態様におけるTcf21遺伝子としては既出のTcf21遺伝子の態様を援用するが、具体的態様としては、Tcf21遺伝子を含む発現ベクターやアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
　Tcf21タンパク質の具体的態様についても既出のTcf21タンパク質の態様を援用する。
　本発明の医薬組成物は、通常、生理的に許容される液体又は固体の製剤担体を配合し製剤化して使用される。
　本発明の医薬組成物の剤形は特に制限されず、具体的には、液剤、懸濁剤、乳剤、及び注射剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤や、標的細胞への伝達手段としてのリポソームやエクソソーム等を使用することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、剤形、用法、対象の年齢、性別、体重、疾患の種類、疾患の程度、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態などにより適宜選択できる。
　Tcf21遺伝子として投与する場合の量としては、例えば、体重比でアデノ随伴ウイルスゲノム量に換算した量で、好ましくは1×1010ウイルスゲノム／ｋｇ以上、より好ましくは1×1011ウイルスゲノム／ｋｇ以上、さらに好ましくは1×1012ウイルスゲノム／ｋｇ以上であり、一方で、好ましくは1×1016ウイルスゲノム／ｋｇ以下、より好ましくは1×1015ウイルスゲノム／ｋｇ以下、さらに好ましくは1×1014ウイルスゲノム／ｋｇ以下である。
　Tcf21タンパク質として投与する場合の量としては、例えば、体重比で好ましくは0.1 mg/kg以上、より好ましくは1 mg/kg以上、さらに好ましくは10 mg/kg以上であり、一方で、好ましくは1,000 mg/kg以下、より好ましくは500 mg/kg以下、さらに好ましくは100 mg/kg以下である。
　投与経路としては、経口投与や直腸内注入、注射の場合には皮下注射、筋肉内注射、末梢静脈注射、肝動脈内注射、腹腔内注射等が考えられるが、必ずしもこれらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患の予防方法又は治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。なお、本発明の医薬組成物は、いずれの場合も１日１回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に１回の投与としてもよい。さらに、治療効果を評価しながらの不定期投与でもよい。
　本発明の医薬組成物は、肝臓の抗線維化作用を有しているため、肝臓の抗線維化用医薬組成物として使用することができ、好ましくは、肝臓の抗線維化によって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療に使用することができる。いずれの「治療」にも、病勢の進展抑制や改善も含まれる。その適用として具体的には、例えば、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全が挙げられる。肝不全は、急性の肝不全でもよいし、慢性の肝不全でもよい。肝炎の具体例としては、ウイルス性肝炎、薬剤性肝炎、自己免疫性肝炎、アルコール性肝炎、若しくは非アルコール性脂肪肝炎（NASH）が挙げられる。
　また、本発明の医薬組成物が投与された対象は、投与されなかった対象に比べて、肝機能の指標である、血清中のALTやASTの値が小さい。したがって、本発明の医薬組成物は、肝機能改善用医薬組成物として有用である。
　このとき、本発明の医薬組成物が投与された対象のALTは、投与されなかった対象のALTを1として、好ましくは0.7以下、より好ましくは0.6以下、さらに好ましくは0.5以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　また、本発明の医薬組成物が投与された対象のASTは、投与されなかった対象のASTを1として、好ましくは0.7以下、より好ましくは0.6以下、さらに好ましくは0.5以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　また、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に罹患した対象において、本発明の医薬組成物が投与された対象では、投与されなかった対象に比べて、オイル・レッド・オー染色陽性の面積が小さい。オイル・レッド・オーは、脂肪細胞と中性脂肪を組織学的に検出する染色試薬として用いられ、その染色面積は非アルコール性脂肪肝炎（NASH）では肝細胞内に蓄積した中性脂肪の量、すなわち肝不全を引き起こしうる肝細胞傷害の程度を反映している。したがって、本発明の医薬組成物は、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）又はそれに基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物として有用である。
　このとき、例えば、測定する肝組織の総面積を10 mm2以上としたときに、本発明の医薬組成物が投与されなかった対象における肝組織におけるオイル・レッド・オー染色陽性部分の面積を1として、本発明の医薬組成物が投与された対象における肝組織におけるオイル・レッド・オー染色陽性部分の面積が、好ましくは0.6以下、より好ましくは0.5以下、さらに好ましくは0.4以下である。一方で、下限は特に制限されないが、例えば、0.1以上である。
　本発明の医薬組成物は、単独で投与してもよいし、他の医薬組成物又は医薬、例えば、肝臓の抗線維化や肝臓機能改善によって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療のための医薬組成物又は医薬と併用してもよい。
　本発明の他の態様は、肝臓の抗線維化用医薬組成物又は肝臓機能改善用医薬組成物の製造における、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の使用である。
　また、本発明の他の態様は、肝臓の抗線維化又は肝臓機能改善のための、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の使用である。
　また、本発明の他の態様は、肝臓の抗線維化又は肝臓機能改善に用いられる、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質である。
　また、本発明の他の態様は、肝臓の抗線維化又は肝臓機能改善によって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療に用いられる、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質である。
　また、本発明の他の態様は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質、肝臓の抗線維化用医薬組成物又は肝臓機能改善用医薬組成物を適用対象に投与する段階を含む、対象の肝臓の抗線維化方法である。
　また、本発明の他の態様は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質、肝臓の抗線維化用医薬組成物又は肝臓機能改善用医薬組成物を適用対象に投与する段階を含む、肝臓の抗線維化又は肝臓機能改善によって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療方法である。
　また、本発明の他の態様は、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物の製造における、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質の使用である。
　また、本発明の他の態様は、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のために用いられるTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質である。
　また、本発明の他の態様は、Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を適用対象に投与する段階、又は本発明の一態様に係る肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物を適用対象に投与する段階を含む、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防方法又は治療方法である。
　以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（肝星細胞の単離）
　8か月齢の雄性C57Bl/6Jマウス（日本クレア）を用いた。ソムノペンチル（共立製薬）75 μLの腹腔内投与により深麻酔下におき、開腹して門脈を露出させた。次に、サーフローフラッシュ22G（テルモ）を門脈へ挿入し、そこにカニューラチューブを接続した。ペリスタポンプ（ATTO）を用いて以下の灌流液１～３を順に50 mLずつ流速6 mL/分で送液し、肝臓を消化させた。
・灌流液１：カルシウム無添加のGey's balanced salt solutions buffer（以下、GBSS緩衝液）100 mLにEGTA（同仁化学）を20 mg溶解させた溶液
・灌流液２：GBSS緩衝液 100 mLにPronase E 30 mg（Millipore）を溶解させた溶液
・灌流液３：GBSS緩衝液 100 mLにCollagenase 20 mg（富士フイルム和光純薬工業）を溶解させた溶液
　消化された肝臓を手術用ハサミで細切した上で、GBSS緩衝液 20 mLにPronase E 20 mgおよびCollagenase 20 mgを溶解後にDNase（Worthington Biochemical）水溶液（10 mg/mL）20 μLを添加した溶液中に加え、37℃で8分間の追加消化をした。
　これらの操作によって単細胞化した細胞懸濁液を、GBSS緩衝液で洗浄しながら50 mLチューブ（Corning）に回収し、4℃で2,500 rpm, 5分間遠心した。この上清をアスピレーターで除き、細胞のペレットをGBSS緩衝液 50 mLおよびDNase水溶液20 μLの混合液中でペレットが完全に崩れるまで懸濁し、4℃で2,500 rpm, 5分間遠心した。同様の操作を2回繰り返した。
　次に、得られた細胞をGBSS緩衝液で全量が7 mLになるようメスアップおよび懸濁し、この細胞懸濁液を15 mLチューブ（Corning）中で、GBSS緩衝液で溶解した30% Nycodenz AG（Proteogenix）溶液 3 mLと混合した。この液上に8.8% Nycodenz AG溶液 2 mLを層状になるようにゆるやかに重層し、さらにGBSS緩衝液を同様に3 mL重層した。これを4℃で3,300 rpm, 15分間遠心した。遠心後、Nycodenz AG溶液とGBSS緩衝液の境界面に配置する肝星細胞を1 mLピペットを用いて回収した。得られた肝星細胞を、3.5×104 cells/cm2となるように培養液5 mLを加えた60 mmディッシュに播種した。
（肝星細胞の培養と活性化誘導）
　肝星細胞を37℃、5%二酸化炭素濃度下で培養した。培養液は、ダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ）の粉末4.75 gを純水500 mLに溶解後に高圧蒸気滅菌した培地に、重炭酸ナトリウム溶液（Gibco）10 mL、L-glutamine（Gibco） 10 mL、非必須アミノ酸（Gibco）5 mL、ウシ胎児血清（Gibco）50 mL、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Gibco）5 mLを混合して作製した。
　培養開始後7日目に培養上清をアスピレーターによって除き、ここにTrypLExpress（Invitrogen） 2 mLを加え、常温で10分間攪拌させながら酵素反応させ、接着している細胞をディッシュ底面より剥離した。これを15 mLチューブに回収して、4℃で2,500 rpm, 5分間遠心した。この上清をアスピレーターで除去し、細胞ペレットを培養液中でよく攪拌させることで再懸濁し、新しいディッシュに播種して培養した。この継代処理を行った２日後に上記の継代操作を繰り返して、肝星細胞を活性化させた。
（アデノ随伴ウイルスの作製）
　AAVpro Helper Free System（タカラバイオ）のアデノ随伴ウイルス６（以下、AAV6）を用いて、Tcf21を活性型肝星細胞において過剰発現できるAAV6を以下の通り作製した。同Systemに同梱されているpAAV-CMVベクターに、成体マウスの肝星細胞より作製したTcf21 cDNAおよびpMYs-IRES-GFPレトロウイルスベクター由来のIRES-GFPを組込み、pAAV-CMV-Tcf21-IRES-GFPを作製した。対照ベクターとして、IRES-GFPのみを組込んだpAAV-CMV-IRES-GFPを同時に作製した。Tcf21 cDNAの合成は、以下に記載するオリゴDNAをプライマーとして用いて行った。
・Tcf21-Forward primer, ATGTCCACTGGCTCCCTCAGCGATGTAGAA（NCBI accession No. NM_011545.2）（配列番号７）
・Tcf21-Reverse primer, TCAGGATGCTGTAGTTCCACACAAG（同上）（配列番号８）
　AAVpro 293T Cell Line（タカラバイオ）を継代・拡大培養し、最終的に100 mmコラーゲンコートディッシュ（AGCテクノグラス）40枚に播種した。AAVpro Helper Free Systemに同梱のpRC6ベクター、pHelperベクター、pAAV-CMV-Tcf21-IRES-GFPベクターもしくは対照のpAAV-CMV-IRES-GFPベクターをOpti-MEM（Gibco）中で混合し、PEI Max（Polysciences）を加えてベクタープラスミドリポソームを作製した。
　このリポソームをAAVpro 293T Cell Lineの培地中に加え、37℃で培養した。72時間後にセルスクレイパーを用いて感染細胞をディッシュからはがし、50 mLチューブに回収した上で、4℃で1,000 rpm, 5分間遠心することで培地を取り除き、AAVpro Purification Kit （タカラバイオ）を用いて感染細胞から目的のアデノ随伴ウイルスを精製した。精製したアデノ随伴ウイルスの濃度を、AAV qPCR迅速タイタ－測定キット（タカラバイオ）およびStepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて、精製液中に含まれるウイルスゲノム量として算出した。
　このように作製したAAV6について、pAAV-CMV-Tcf21-IRES-GFPベクターをもとに作製したAAV6をAAV6-Tcf21と呼称し、対照のpAAV-CMV-IRES-GFPベクターをもとに作製したAAV6をAAV6-controlと呼称して、以下の実験に供した。
（活性型肝星細胞に対するTcf21の過剰発現）
　培養開始から2日後、上記の方法により作製したAAV6-Tcf21もしくはAAV6-controlを25,000 ウイルスゲノム／細胞となるようにウイルス混合液を調整し、細胞培養液中に添加した。
　96時間後にディッシュ中の培地をアスピレーターで吸引除去し、リン酸緩衝食塩水で洗浄・吸引除去し、RNeasy plus mini kit（キアゲン）に同梱されているBuffer RLT plus（2-メルカプトエタノール（BioRad）を1%になるよう添加）350 μLをふりかけて、溶解した細胞を1.5 mLチューブに回収した。
（細胞RNAの精製および逆転写反応）
　上記の方法により回収した細胞サンプルから、RNeasy plus mini kit（キアゲン）を用いてtotal RNAを精製した。水溶液中のRNA濃度を、NanoDrop超微量分光計（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。
　各RNAサンプルあたり50 ngのRNAを8連チューブ（日本ジェネティクス）に加え、液量が6 μLとなるように純水で希釈した。これを65℃で5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これにReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（東洋紡）に同梱の4×DN Master Mix (gDNA Remover添加済み)を2 μL加え、軽く攪拌した後、37℃で5分間インキュベートした。次に5×RT Master Mix IIを2 μL加え、軽く攪拌して均一にした後、37℃で15分間、50℃で5分間、98℃で5分間反応させることで、cDNAの合成を行った。この逆転写反応は、Takara PCR Thermal cycler（タカラバイオ）を用いて行った。
（定量PCR）
　上記の方法により得られたcDNAに、SYBR Green リアルタイム PCR マスターミックス（Applied Biosystems）、および以下に記載する各目的遺伝子を増幅するオリゴDNAプライマーを混合し、96ウェルプレート（Applied Biosystems）に加えた。各目的遺伝子の相対的発現量を計測するために、以下に記載するGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh)遺伝子のプライマーを使用した。
・Tcf21-Forward primer, GGCTCCAACTGCGAGAACGGGT（NCBI accession No. NM_011545.2）（配列番号９）
・Tcf21-Reverse primer, CACCATAAAGGGCCACGTCAGG（同上）（配列番号10）
・Col1a1-Forward primer, CATGTTCAGCTTTGTGGACCT（NCBI accession No. NM_007742.4）（配列番号11）
・Col1a1-Reverse primer, GCAGCTGACTTCAGGGATGT（同上）（配列番号12）
・Acta2-Forward primer, ATCCGATAGAACACGGCATC（NCBI accession No. NM_007392.3）（配列番号13）
・Acta2-Reverse primer, GCCACACGAAGCTCGTTATAG（同上）（配列番号14）
・Gfap-Forward primer, TGAGGCAGAAGCTCCAAGATG（NCBI accession No. NM_001131020.1）（配列番号15）
・Gfap-Reverse primer, CTCCAGCGATTCAACCTTTCT（同上）（配列番号16）
・Gapdh-Forward primer, GCTACACTGAGGACCAGGTTGT（NCBI accession No. NM_001289726.1）（配列番号17）
・Gapdh-Reverse primer: TCATACCAGGAAATGAGCTTGA（同上）（配列番号18）
　この96ウェルプレート中のサンプルに対して、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）を用いて、95℃で1秒間、60℃で20秒間反応させるサイクルを40回繰り返すことでPCR反応を行った。Gapdhの遺伝子発現量を基準として、それぞれの遺伝子の相対的な発現量を計測した。群間の有意差検定には、Mann-Whitney U testを用いた。
（結果）
　各遺伝子の相対的発現量を、図１に示す。AAV6-Tcf21を感染させた肝星細胞では、Tcf21遺伝子の著しい発現誘導（p < 0.01）とともに、肝線維化マーカー分子であるCol1a1（p = 0.02）および活性型星細胞のマーカー分子であるActa2（p = 0.02）の遺伝子発現量が、いずれもAAV6-controlを感染させた細胞と比較して有意に抑制されていた。一方、静止期星細胞のマーカー分子であるGfap遺伝子の発現は、AAV6-Tcf21を感染させた肝星細胞ではAAV6-controlを感染させた細胞と比較して有意に上昇しており（p = 0.02）、これらの結果からTcf21の強制発現による培養活性型星細胞の脱活性化が示された。
〔実施例２〕
（実験的肝線維症マウスの作製）
　6週齢の雄性C57Bl/6Jマウス（日本クレア） を用いた。四塩化炭素（富士フイルム和光純薬）とオリーブ油を1:3の容積比で混合した4倍希釈液を、1 mL/kg 体重となるようにマウスの背部に３日毎に皮下注射して、肝線維症を作製した。
（アデノ随伴ウイルスの作製と肝線維症マウスへの投与）
　実施例１と同様の操作を行い、AAV6-Tcf21およびAAV6-controlを作製した。
　四塩化炭素投与を20回（60日間）投与した後、20回目の投与から48時間後に、アデノ随伴ウイルス 3×1011ウイルスゲノム／匹をイソフルラン麻酔下で腹腔内に投与した。アデノ随伴ウイルスを投与した24時間後に21回目の四塩化炭素を投与し、さらに4回の四塩化炭素投与を行った（総投与回数は25回、75日間）。
（採血と肝組織の採取）
　25回目の四塩化炭素投与の72時間後、マウスをイソフルラン麻酔下で開腹し、下大静脈からの採血と肝組織の採取を行った。
　採取した肝組織を細切し、ホルマリン（富士フイルム和光純薬）を純水で希釈した10%ホルマリン液中で16時間固定した。その後、組織を包埋カセット（MURAZUMI）に移し、自動固定包埋装置（サクラファインテックジャパン）を用いて、常温下で100%エタノール（富士フイルム和光純薬）に攪拌しながら2時間浸し、新たな100%エタノールへ浸すことを計7回繰り返すことで、肝組織を脱水した。次に、キシレン（富士フイルム和光純薬）に移し、同様に攪拌しながら2時間浸すことを計3回繰り返した後、65℃に熱することで液体化したヒストプレップ568・パラフィン（富士フイルム和光純薬）に攪拌しながら2時間浸して、肝組織にパラフィンを浸透させた。ティシュー・テックＴＥＣ プラス クライオ・コンソール（サクラファインテックジャパン）を用いて、パラフィンブロックを作製した。
　上記のパラフィンブロックを滑走式ミクロトーム（大和光機工業）により2 μmの厚みに薄切し、これをNewシランIIスライドグラス（武藤化学株式会社）に貼り付け、65℃で30分間静置することで乾燥させ、組織切片を作製した。
（シリウスレッド・ファーストグリーン染色）
　上記の組織切片をキシレンに3分間浸すことを3回繰り返し、次に100%エタノールに3分間浸すことを3回繰り返すことで、脱パラフィンを行った。
　Direct Red 80（Sigma）を飽和ピクリン酸（富士フイルム和光純薬）によって0.5％になるように溶解し、このシリウスレッド染色液を脱パラフィンした組織切片上に乗せて、室温で5分間静置し、コラーゲン線維をアズキ色に染色した。この組織切片を30秒間水洗した後、純水によって溶解した0.1％ Fast green（Sigma）溶液を組織上に乗せて、室温で5分間静置し、組織全体を緑色に染色した。30秒間水洗した後、100%エタノールに1分間浸すことを3回繰り返し、次にキシレンに1分間浸すことを4回繰り返した上で、マリノールを用いてカバーグラスで封入した。
　染色・封入した肝組織切片を、光学顕微鏡BX63（オリンパス）を用いて観察・撮影した。各サンプルについて、4倍の対物レンズを用いて4視野以上撮影した撮影画像を、ImageJ（米国国立衛生研究所）を用いてシリウスレッド染色陽性（アズキ色）部分の面積を算出した。統計学的な有意差検定を、Mann-Whitney U testを用いて行った。
（結果）
　シリウスレッド・ファーストグリーン染色を行った肝組織写真を、図２の左側に示す。AAV6-Tcf21を投与したマウス（図２の組織写真のうち右の写真）では、AAV6-controlの投与を行った対照マウス（図２の組織写真のうち左の写真）と比較して、アズキ色で描出されるコラーゲン線維の蓄積が有意に抑制されており（p < 0.01）（図２のうち右のグラフ）、Tcf21治療による肝線維化の抑制が認められた。
〔実施例３〕
（肝組織RNAの精製）
　上記の実施例２で採取した肝組織の一部を1.5 mLチューブに回収し、そこにRNeasy plus mini kitに同梱されているBuffer RLT plus（2-メルカプトエタノール（BioRad）を1%になるよう添加）350 μLを加え、ホモジナイザーを用いて組織を溶液中で破砕・懸濁した。次に、実施例１と同様の操作を行い、total RNAを精製した。
（逆転写反応と定量PCR）
　各RNAサンプルから500 ngのRNAを8連チューブ（日本ジェネティクス）に加え、液量が6 μLとなるように純水で希釈した。以下、実施例１と同様の操作を行って、cDNAの合成を行った。
　実施例１と同様の操作を行い、遺伝子発現の定量解析を行った。統計学的な有意差検定を、Mann-Whitney U testを用いて行った。
（結果）
　各遺伝子の相対的発現量を、図３に示す。AAV6-Tcf21を投与したマウスでは、Col1a1（p = 0.038）およびActa2（p < 0.01）の遺伝子発現量が、いずれもAAV6-controlの投与を行った対照マウスと比較して有意に抑制されていた。一方、Gfap遺伝子の発現は、AAV6-Tcf21を投与したマウスではAAV6-controlの投与を行った対照マウスと比較して有意に上昇しており（p = 0.011）、これらの結果からTcf21治療による活性型星細胞の脱活性化が示された。
〔実施例４〕
（血清分離）
　上記の実施例２で採取したマウス血液を、室温で20分間静置後、冷却遠心機（Eppendorf）を用いて4℃で3,000 rpm, 15分間の遠心を行った。得られた上清を新たなチューブに移し、測定時まで-30℃で保存した。
（血清ALTおよびASTの測定）
　各血清8μLを用いて、血清中のALTおよびAST濃度をスポットケムEZ（アークレイ）およびその専用試験紙（スポットケムIIGOT, スポットケムIIGPT）を用いて計測した。得られた測定値について、統計学的な有意差検定をMann-Whitney U testを用いて行った。
（結果）
　両群マウスの血清ALTおよびAST値を、図４に示す。AAV6-Tcf21を投与したマウスの血清ALTおよびAST値は、AAV6-controlの投与を行った対照マウスと比較していずれも有意に抑制されていた（p < 0.01）。これらの結果から、Tcf21治療による肝機能の改善が示された。
〔実施例５〕
（実験的非アルコール性脂肪性肝炎マウスの作製）
　８週齢の雄性C57Bl/6Jマウス（日本クレア）を用いた。コリン・メチオニン欠乏飼料（オリエンタル酵母）を８週間給餌し、非アルコール性脂肪性肝炎ならびに肝線維症を作製した。
（アデノ随伴ウイルスの作製と肝線維症マウスへの投与）
　実施例１と同様の操作を行い、AAV6-Tcf21およびAAV6-controlを作製した。コリン・メチオニン欠乏飼料を６週間給餌した後、アデノ随伴ウイルス 3×1011 ウイルスゲノム／匹をイソフルラン麻酔下で腹腔内に投与した。アデノ随伴ウイルスを投与した後も、コリン・メチオニン欠乏飼料をさらに２週間給餌した（総給餌期間としては８週間）。
（肝組織の採取）
　コリン・メチオニン欠乏飼料を８週間給餌したマウスをイソフルラン麻酔下で開腹し、下大静脈からの採血と肝組織の採取を行った。
　採取した肝組織を細切し、パラホルムアルデヒド（ミリポア）をリン酸緩衝食塩水にて溶解した4%パラホルムアルデヒド液中で16時間固定した。その後、スクロース（富士フイルム和光純薬）をリン酸緩衝食塩水にて溶解した10%スクロース溶液に組織を移し、氷中で4時間攪拌し、その後さらに20%スクロース溶液に移し、氷中で4時間攪拌した。その組織をクリオモルト（サクラファインテックジャパン）に移し、OCTコンパウンド（サクラファインテックジャパン）で容器内を満たし、-80℃にて凍結することで組織ブロックを作製した。次に、上記のブロックをクリオスタットCM3050S（ライカ）により6 μmの厚みに薄切し、これをNewシランIIスライドグラス（武藤化学株式会社）に貼り付け、室温で20分間風乾させ、組織切片を作製した。
（オイル・レッド・オー染色）
　上記の組織切片を純水に2分間浸すことを2回繰り返して洗浄し、その後60%イソプロピルアルコール（富士フイルム和光純薬）に浸した。次に、Oil Red O（ミリポア）0.6 gをイソプロピルアルコール（富士フイルム和光純薬）60 mLに溶解後に純水40 mLを加えたオイル・レッド・オー染色液に浸し、37℃下で10分間インキュベーションした。その後60%イソプロピルアルコールに浸し洗浄し、さらに純水にて洗浄した。
　ヘマトキシリン水和物（メルク）4.5 g、酢酸（富士フイルム和光純薬）22.5 mL、ヨウ素酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬）0.9 g、硫酸アンモニウムアルミニウム12水和物（富士フイルム和光純薬）225 gを全量3 Lになるように純水に溶解し、このヘマトキシリン染色液を組織切片上に乗せて、室温で3分間静置し、10分間水洗し、細胞核を青藍色に染色した。この組織切片をMount-Quick Aqueous（大道産業）を用いてカバーグラスで封入した。
　実施例２に記載した方法を用いて、染色・封入した肝組織切片の光学顕微鏡観察と撮影を行った。各サンプルについて、10倍の対物レンズを用いて5視野以上撮影した撮影画像を、ImageJ（米国国立衛生研究所）を用いてオイル・レッド・オー染色陽性（赤色）部分の面積を算出した。統計学的な有意差検定を、実施例２に記載した方法を用いて行った。
（結果）
　オイル・レッド・オー染色を行った肝組織写真を、図５の左側に示す。AAV6-controlを投与した対照マウス（図５の組織写真のうち左の写真）では、オイル・レッド・オーによって赤色で描出される大きな脂肪滴をもつ肝細胞が多数認められる一方で、AAV6-Tcf21の投与を行ったマウス（図５の組織写真のうち右の写真）ではオイル・レッド・オーによって脂肪滴の数と大きさが顕著に減少しており、統計学的にも有意に抑制されていた（p < 0.01）（図５のうち右のグラフ）。これらの結果から、Tcf21治療による非アルコール性脂肪性肝炎の進展抑制が示された。
〔実施例６〕
（肝組織RNAの精製）
　上記の実施例５で採取した肝組織の一部を1.5 mLチューブに回収し、実施例３と同様の操作を行い、total RNAを精製した。
（逆転写反応と定量PCR）
　各RNAサンプルに対して実施例３と同様の操作を行い、cDNAの合成と遺伝子発現の定量解析を行った。統計学的な有意差検定を、Mann-Whitney U testを用いて行った。
（結果）
　各遺伝子の相対的発現量を、図６に示す。AAV6-Tcf21を投与したマウスでは、Col1a1（p = 0.016）およびActa2（p = 0.032）の遺伝子発現量が、いずれもAAV6-controlの投与を行った対照マウスと比較して有意に抑制されていた。これらの結果から、Tcf21治療による星細胞の活性阻害が示された。
〔実施例７〕
（ヒト肝組織切片の作製）
　東海大学医学部付属病院において、肝硬変を合併した肝細胞癌、もしくは大腸癌の肝転移により肝切除術を受けた患者の摘出組織から、実施例２と同様の操作を行い、組織切片を作製した。
（ヒト肝組織におけるTCF21タンパク質の検出）
　上記の組織切片をキシレンに3分間浸すことを3回繰り返し、次に100%エタノールに3分間浸すことを3回繰り返すことで、脱パラフィンを行った。この組織切片に対して、Target retrieval solution（Dako）を用いて110℃で10分間のオートクレーブ処理を行い、抗原を賦活化した。その組織切片に非特異反応ブロッキング試薬（Dako）を滴下し、室温で10分間反応させブロッキングした後、一次抗体としてRabbit polyclonal anti-TCF21抗体（Novus Biologicals）およびmouse monoclonal anti-Vimentin抗体（Dako）を室温で２時間反応させた。その後、リン酸緩衝食塩水にて洗浄し、二次抗体としてヒストファイン・シンプルステイン・マウスMAX-PO(R)（ニチレイバイオサイエンス）およびGoat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647（invitrogen）を室温下で20分間反応させた。これをリン酸緩衝食塩水にて洗浄し、TSA Plus Fluorescein System（PerkinElmer）を室温下で2分間反応させた。その後、Fluoro-KEEPER Antifade Reagent with DAPI（ナカライテスク）を用いてカバーグラスで封入した。染色・封入した肝組織切片を、蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）を用いて観察・撮影した。
（結果）
　蛍光免疫染色を行った肝組織写真を図７に示す。大腸癌肝転移の非腫瘍部（正常肝組織）におけるTCF21の発現（赤色）は、Vimentin陽性（緑色）を示す肝星細胞の細胞核に認められた（図７Ａおよび図７Ｂ、矢印）。これに対して、肝硬変を伴った肝細胞癌の非腫瘍部（線維肝組織）においてはTcf21の発現が消失していた（図７Ｃおよび図７Ｄ）。これらの結果から、ヒトの肝組織においても線維化進展に伴いTCF21の発現が減弱すること、すなわちTcf21が静止期肝星細胞の特異的マーカーとして有用であることが示された。
〔比較例１〕
（肝星細胞の単離と活性化誘導）
　実施例１と同様の操作により肝星細胞を単離した。単離した肝星細胞を、24ウェルプレートに3.5×104 cells/cm2になるように播種した。
　播種後から5日間、37℃、5%二酸化炭素濃度下で培養し、肝星細胞を活性化させた。
（遺伝子発現プラスミドの作製）
　肝星細胞の分化に関わると考えられるCebpb, Epas1, Fosb, Heyl, Irf1, Junb, Klf15, Mbd1, Nfib, Nr3c1, Ppara, Rxra, Socs3, Tcf21, Gata4, Lhx2の各cDNAを、以下に記載する各目的遺伝子を増幅するオリゴDNAプライマーを用いて、成体マウスの肝星細胞より合成した。これをpcDNA3ベクター（Invitrogen）に組込んで、それぞれの遺伝子発現プラスミドを作製した。
Cebpb-Forward primer, ATGCACCGCCTGCTGGCCTGGGACG（NCBI accession No. NM_009883.4）（配列番号19）
Cebpb-Reverse primer, CTAGCAGTGGCCCGCCGAGGCCAGC（同上）（配列番号20）
Epas1-Forward primer, ATGACAGCTGACAAGGAGAAAAAAA（NCBI accession No. NM_010137.3）（配列番号21）
Epas1-Reverse primer, TCAGGTGGCCTGGTCCAGAGCTCTG（同上）（配列番号22）
Fosb-Forward primer, ATGTTTCAAGCTTTTCCCGGAGACT（NCBI accession No. NM_008036.2）（配列番号23）
Fosb-Reverse primer, TTACAGAGCAAGAAGGGAGGGCGAG（同上）（配列番号24）
Heyl-Forward primer, ATGAAGCGGCCCAGGGCGCCCAGTG（NCBI accession No. NM_013905.3）（配列番号25）
Heyl-Reverse primer, TCAGAAAGCCCCAATTTCAGTGATT（同上）（配列番号26）
Irf1-Forward primer, ATGCCAATCACTCGAATGCGGATGA（NCBI accession No. NM_008390.2）（配列番号27）
Irf1-Reverse primer, CTATGGTGCACAAGGAATGGCCTGA（同上）（配列番号28）
Junb-Forward primer, ATGTGCACGAAAATGGAACAGCCTT（NCBI accession No. NM_008416.3）（配列番号29）
Junb-Reverse primer, TCAGAAGGCGTGTCCCTTGACCCCT（同上）（配列番号30）
Klf15-Forward primer, ATGGTGGACCACCTGCTTCCAGTGG（NCBI accession No. NM_023184.4）（配列番号31）
Klf15-Reverse primer, TCAGTTGATGGCGCGTACTGCGCGG（同上）（配列番号32）
Mbd1-Forward primer, ATGGCTGAGTCCTGGCAGGACTGCC（NCBI accession No. NM_013594.3）（配列番号33）
Mbd1-Reverse primer, CTACAAAACTTCTTCTTTCAACTGCAGC（同上）（配列番号34）
Nfib-Forward primer, ATGATGTATTCTCCCATCTGTCTCA（NCBI accession No. NM_001113209.2）（配列番号35）
Nfib-Reverse primer, TCAGTTGCTTGTCTCCGCTTGAAGG（同上）（配列番号36）
Nr3c1-Forward primer, ATGGACTCCAAAGAATCCTTAGCTC（NCBI accession No. NM_001361209.1）（配列番号37）
Nr3c1-Reverse primer, TCATTTCTGATGAAACAGAAGCTTTTTG（同上）（配列番号38）
Ppara-Forward primer, ATGGTGGACACAGAGAGCCCCATCT（NCBI accession No. NM_011144.6）（配列番号39）
Ppara-Reverse primer, TCAGTACATGTCTCTGTAGATCTCTTGC（同上）（配列番号40）
Rxra-Forward primer, ATGGACACCAAACATTTCCTGCCGC（NCBI accession No. NM_011305.3）（配列番号41）
Rxra-Reverse primer, CTAGGTGGCTTGATGTGGTGCCTCC（同上）（配列番号42）
Socs3-Forward primer, ATGGTCACCCACAGCAAGTTTCCCG（NCBI accession No. NM_007707.3）（配列番号43）
Socs3-Reverse primer, TTAAAGTGGAGCATCATACTGATCCAGG（同上）（配列番号44）
Tcf21-Forward primer, ATGTCCACTGGCTCCCTCAGCGATGTAGAA（NCBI accession No. NM_011545.2）（配列番号７）
Tcf21-Reverse primer, TCAGGATGCTGTAGTTCCACACAAG（同上）（配列番号８）
Gata4-Forward primer, ATGTACCAAAGCCTG（NCBI accession No. NM_001310610.1）（配列番号45）
Gata4-Reverse primer, TTACGCGGTGATTATGTCCCCATGAC（同上）（配列番号46）
Lhx2-Forward primer, ATGCTGTTCCACAGTC（NCBI accession No. NM_010710.4）（配列番号47）
Lhx2-Reverse primer, TTAGAAAAGGTTGGTAAGAGTCG（同上）（配列番号48）
　対照プラスミドとしてcDNAを組み込んでいないpcDNA3ベクターを用い、これをControlと表記した。
（活性型肝星細胞への遺伝子導入）
　１ウェル当たりの培養活性型星細胞に対して、発現プラスミド 500 ng、Lipofectamine 3000（Invitrogen）に同梱のP3000を0.75 μL、ならびに混合したときの液量が25 μLとなるようにOpti-MEM（Gibco）を用いて調整したものを1.5 mLチューブ内で用意した。
　別の1.5 mLチューブ中で、Opti-MEM 23.5 μL、Lipofectamine 3000を1.5 μLを混合し、先のプラスミド混合液と合わせて室温で15分静置することで、ベクタープラスミドリポソームを作製した。
　肝星細胞の培養液を新しい培養液に交換し、上記の方法により作製したリポソームをそれぞれ加えて、24時間の細胞培養を行った。
　24時間後に新たな培養液に交換し、さらに24時間の培養を行った。
（遺伝子発現解析）
　実施例１に記載したプライマーセットを用いて同様の操作を行い、Col1a1およびActa2遺伝子の発現を定量解析した。統計学的な有意差検定を、Mann-Whitney U testを用いて行った。
（結果）
　各遺伝子を過剰発現した際の線維化マーカー遺伝子の発現変動を、図８に示す。Col1a1の遺伝子発現は、対照のpcDNA3 (Control) と比較して、Nr3c1, Ppara, Tcf21, Gata4, Lhx2の過剰発現により有意に抑制され（*: p < 0.05, **: p < 0.01）、なかでもTcf21の抑制効果が最も顕著であった。また、Acta2遺伝子の発現もNr3c1, Tcf21, Gata4の発現ベクターのトランスフェクションによって有意に減少し（*: p < 0.05, **: p < 0.01）、Col1a1遺伝子と同様にTcf21が最も顕著な発現抑制効果を示した。これらの結果から、比較検討を行った全16種類の転写因子の中で、Tcf21が最も強い肝線維化抑制効果を示すことが明らかになった。
　本発明は、肝疾患の予防又は治療のための技術、肝臓の抗線維化のための技術、肝機能改善のための技術に有用である。

Claims (8)

  1. 　活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、活性型肝星細胞の脱活性化方法。
  2. 　活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞の製造方法。
  3. 　前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　活性型肝星細胞にTcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を導入する工程を含む、脱活性型肝星細胞のスクリーニング方法。
  5. 　前記Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質が導入された肝星細胞において、Col1a1遺伝子、Acta2遺伝子、又はGfap遺伝子の発現量を測定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは肝がん、又はこれらのいずれかの疾患に基づく肝不全の予防又は治療のための医薬組成物。
  7. 　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝臓の抗線維化用医薬組成物。
  8. 　Tcf21遺伝子及び／又はTcf21タンパク質を含む、肝機能改善用医薬組成物。
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