JP5688229B2 - 肝保護作用を有するタンパク質、肝障害予防・保護用化合物のスクリーニング方法 - Google Patents
肝保護作用を有するタンパク質、肝障害予防・保護用化合物のスクリーニング方法 Download PDFInfo
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APAPは広く一般に用いられている解熱鎮痛薬であり、前述のように薬物誘導性肝障害において最も研究されている薬物である。DICは非ステロイド性消炎鎮痛薬の一種であり、その作用機序は主としてアラキドン酸代謝におけるシクロオキシゲナーゼの活性を阻害することにより、炎症、疼痛等に関与するプロスタグランジンの合成を阻害するものと考えられている。しかし、一部の患者に重篤な肝障害を引き起こすことが報告され、げっ歯類を用いた検討においても肝障害を引き起こすことが知られている (非特許文献20、21、22)。
[1]被検物質による哺乳動物細胞におけるMmd2発現レベルの変化を指標として用いることを含む、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性を有する薬物の候補物質のスクリーニング方法。
[2]以下の工程を含む、[1]記載のスクリーニング方法:
(1)被検物質をMmd2の発現を測定可能な哺乳動物細胞へ接触させること;
(2)該哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを測定すること;
(3)被検物質を接触させた哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを、被検物質を接触させない哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルと比較すること;及び
(4)比較の結果得られたMmd2発現レベルの変化を、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性と相関付けること。
[3]以下の工程を更に含む、[2]記載のスクリーニング方法:
(5−1)Mmd2発現レベルを上昇させた被検物質を、肝障害を予防又は治療する活性を有する薬物の候補物質として選択すること。
[4]以下の工程を更に含む、[2]記載のスクリーニング方法:
(5−2)Mmd2発現レベルを減少させた被検物質を、肝障害を増悪する活性を有する薬物の候補物質として選択すること。
[5]肝障害が化学物質に起因する肝障害である、[1]記載のスクリーニング方法。
[6]Mmd2ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肝障害の予防又は治療剤。
[7]以下の工程を含む、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性の判定方法:
(1)哺乳動物から分離された肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを測定すること;及び
(2)測定の結果得られた肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性と相関付けること。
[8]Mmd2ポリペプチドを特異的に認識する抗体、或いは該ポリペプチドをコードする核酸を特異的に検出する核酸プローブ又は核酸プライマーを含む、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性を判定するための試薬。
[9]Mmd2に対するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現し得る発現ベクターの投与、或いは染色体DNA上のMmd2遺伝子の改変により、肝臓におけるMmd2ポリペプチド発現レベルを、前記投与又は改変を施さない対照非ヒト哺乳動物と比較して低下させた非ヒト哺乳動物に、肝障害を誘導する化学物質又は肝炎ウイルスを投与することにより、該非ヒト哺乳動物における肝障害を誘導することを含む、肝障害の非ヒト哺乳動物モデルの製造方法。
後述の実施例に示すように、Mmd2は肝臓に対して保護的に作用し、Mmd2の発現を抑制することにより、肝障害が増悪する。従って、本発明は、被検物質による哺乳動物細胞におけるMmd2発現レベルの変化を指標として用いることを含む、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性を有する薬物の候補物質のスクリーニング方法を提供するものである。本発明のスクリーニング方法においては、哺乳動物細胞におけるMmd2発現レベルを上昇させた被検物質が、肝障害を予防又は治療する活性を有する薬物の候補物質として選択され、逆に哺乳動物細胞におけるMmd2発現レベルを減少させた被検物質が、肝障害を増悪する活性を有する薬物の候補物質として選択される。
(1)被検物質をMmd2の発現を測定可能な哺乳動物細胞へ接触させること;
(2)該哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを測定すること;
(3)被検物質を接触させた哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを、被検物質を接触させない哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルと比較すること;及び
(4)比較の結果得られたMmd2発現レベルの変化を、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性と相関付けること。
[ヒトMmd2]
ヌクレオチド配列(mRNA又はcDNA配列):アクセッション番号 NM_198403(バージョンNM_198403.3)(配列番号1)
アミノ酸配列:アクセッション番号 NP_940685(バージョンNP_940685.3)(配列番号2)
[チンパンジーMmd2]
ヌクレオチド配列(mRNA又はcDNA配列):アクセッション番号 XM_527649(バージョンXM_527649.2)(配列番号3)
アミノ酸配列:アクセッション番号 XP_527649(バージョンXP_527649.2)(配列番号4)
[マウスMmd2]
ヌクレオチド配列(mRNA又はcDNA配列):アクセッション番号 NM_175217(バージョンNM_175217.6)(配列番号5)
アミノ酸配列:アクセッション番号 NP_780426(バージョンNP_780426.1)(配列番号6)
(1’)非ヒト哺乳動物に対して肝障害を誘導すること;
(2’)肝障害の誘導の前又は後に、当該非ヒト哺乳動物に候補物質を投与すること;
(3’)該非ヒト哺乳動物における肝障害の程度を評価すること;
(4’)候補物質を投与した非ヒト哺乳動物における肝障害の程度を、候補物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における肝障害の程度と比較すること。
後述の実施例に示すように、Mmd2は肝臓に対して保護的に作用する。従って、本発明は、Mmd2ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肝障害の予防又は治療剤を提供する。
後述の実施例に示す通り、Mmd2に対するsiRNAの投与により、肝臓におけるMmd2の発現量を抑制したマウスにおいて、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性が増大する。また、ERαノックアウトマウスにおいてもやはり肝臓におけるMmd2の発現量が低下し、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性が増大する。また、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性が高いヒトにおいては、該感受性が低いマウスと比較して肝臓におけるMmd2の発現量が低い。従って、本発明は、以下の工程を含む、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性の判定方法を提供するものである:
(1)哺乳動物から分離された肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを測定すること;及び
(2)測定の結果得られた肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性と相関付けること。
例えば、本発明の試薬がMmd2ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含むものであれば、免疫学的手法によりMmd2発現レベルを測定することにより、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性を判定することができる。この場合、本発明の試薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
後述の実施例に示す通り、Mmd2に対するsiRNAの投与により、肝臓におけるMmd2の発現量を抑制したマウスは、肝障害を引き起こしやすく、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性が増大している。従って、本発明は、Mmd2に対するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現し得る発現ベクターの投与、或いは染色体DNA上のMmd2遺伝子の改変により、肝臓におけるMmd2ポリペプチド発現レベルを、前記投与又は改変を施さない対照非ヒト哺乳動物と比較して低下させた非ヒト哺乳動物に、肝障害を誘導する化学物質又は肝炎ウイルスを投与することにより、該非ヒト哺乳動物における肝障害を誘導することを含む、肝障害の非ヒト哺乳動物モデルの製造方法を提供するものである。
(A)Mmd2をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む1本鎖又は2本鎖のRNA、及び
(B)Mmd2をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と投与対象の哺乳動物(例えばマウス等のげっ歯類)の細胞内でハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりMmd2のRNA干渉を誘導する1本鎖又は2本鎖のRNA
を挙げることができる。
(A)Mmd2をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
(B)Mmd2をコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内でハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でMmd2ポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることが出来る。
(a)相同組み換えによりMmd2遺伝子の対立遺伝子のうちの一方を欠損した胚性幹細胞を得ること;
(b)該胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;
(c)該キメラ胚を非ヒト哺乳動物に移植し、キメラ非ヒト哺乳動物を得る工程;
(d)該キメラ非ヒト哺乳動物を交配させ、Mmd2遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。
1−1.実験材料および試薬
ヒト肝16サンプルはHuman and Animal Bridging Research Organization (Chiba, Japan) より購入し、9サンプルは岩手医科大学 (Morioka, Japan) より提供された。ドナー情報は表1にまとめた。ヒト肝癌由来HuH-7細胞、HLE細胞およびヒト胎児腎由来HEK293細胞は、大日本住友製薬 (Osaka, Japan) から購入した。ヒト肝癌由来HepG2細胞はRiken Gene Bank (Tsukuba, Japan) より購入した。ヒト肝由来Fa2N4細胞およびMFETM Plating Medium Fは日本農産工業(Yokohama, Japan) より購入した。ヒト乳腺由来MCF-7細胞、マウス線維芽由来NIH/3T3細胞およびマウス副腎皮質由来Y-1細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC) より購入した。マウス肝癌由来Hepa1-6細胞およびMM45LTi細胞は金沢大学医学部第一内科より提供された。マウスマクロファージ由来J774A.1細胞は金沢大学薬学部生体防御応答学研究室より提供された。マウスマクロファージ由来RAW-264.7細胞は金沢大学病院薬剤部研究室より提供された。DMEM培地は日水製薬 (Tokyo, Japan) より、ウシ胎児血清 (FBS)、リポフェクタミンRNAi MAXおよびアガロースはインビトロジェン (Melbourne, Australia) より、ReverTra Aceは東洋紡 (Osaka, Japan) より購入した。DICはSigma-Aldrich (St. Louis, MO) より、Cell Counting Kit-8は同仁化学研究所(Kumamoto, Japan)より、SYBR(R)Premix Ex TaqTM、RNA isoとランダムヘキサマーは宝酒造(Kyoto, Japan) より購入した。プライマーは北海道システムサイエンス (Sapporo, Japan) に、siRNAはB-Bridge (Mountain view, CA) に合成を依頼した。アセトアミノフェン(APAP)、ブロモベンゼン(BB)、チオアセタミド(TA)、タモキシフェン(TAM)及びエストロゲン(EE2)は和光純薬工業(Osaka, Japan)より購入した。ICI182,780 (ICI) はTOCRIS bioscience (Ellisville, MO) より、RALはToronto Research Chemicals (North York, CA) より購入した。電気泳動はBIO CRAFT (Tokyo, Japan) のBE-560型泳動槽とPA-055型泳動槽を用いた。10 cmプレート、96ウェルプレートはBecton Dickinson Labware(Flanklin Lakes, NJ)より、6ウェルプレートはNunclonΔTM Surface (Roskilde, Denmark) より購入した。セルスクレイパーはイワキ (Tokyo, Japan) より購入した。AteloGeneTMSystemic Useは高研 (Tokyo, Japan) より購入した。その他の試薬は和光純薬工業等の特級または生化学用のものを用いた。以下に本試験で使用した試薬の組成を示した。必要のあるものはオートクレーブ(121℃、20分間または40分間)等の滅菌処理を行った。
塩化ナトリウムの最終濃度が0.9%になるように精製水を加えた。その後、121℃、20分間オートクレーブを行った。
DEPC処理精製水
DEPCの最終濃度が0.1%になるように精製水に加え、37℃で2時間加温した。
その後、121℃、40分間オートクレーブを行った。
10 × PBS
塩化ナトリウム80 g、塩化カリウム2 g、リン酸水素二ナトリウム (12水和物) 29 g、リン酸水素二カリウム2 gに精製水を加え、全量を1 Lとした後、121℃で20分間オートクレーブを行った。使用前に適宜希釈した。
ICRマウス (雄性および雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にEE2 (100 μg/kg in saline, i.p.)、TAM (1 mg/kg in saline, i.p.)、RAL (3 mg/kg in saline, i.p.) またはICI (1 mg/kg in saline, i.p.) を5日間連続投与し、最終投与12時間後にTA (200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3〜5匹のマウスを使用した。TA投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にTAM (1 mg/kg in saline, i.p.) を5日間連続投与し、その後APAP (400 mg/kg in 80% 1,2-propanediol with 0.15% KCl, i.p.)、BB (2.5mmol/kg in corn oil,i.p.)、DIC (200 mg/kg in saline, i.p.) またはTA (200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3匹のマウスを使用した。APAPおよびDICは投与6時間後に、BBおよびTAは投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
マウス下行大静脈より血液を採取し、7,000 rpm (3,000 g)、4℃で15分間遠心分離した後、血清約400 μLをサンプルチューブに採取した。AST、ALTおよびT-Bil値は、血清10 μLを富士ドライケムSDスライドに点着させ、富士フィルム (Tokyo, Japan) のDRI-CHEM 4000Vを用いて測定した。
ヒト肝サンプルを用いる検討は金沢大学および岩手医科大学のヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理委員会の承認を得た上で行った。マウスまたはヒト肝 50 mg に対して RNA iso 1 mLを加えた。氷冷下、ガラスホモジナイザーでホモジナイズし、1.5 mLチューブに分注後、室温で5分間放置した。0.2 mLのクロロホルム溶液を加えて15秒間激しく攪拌し、再度室温で5分間放置した。15,000 rpm (12,000 g)、4℃にて15分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、0.5 mLのイソプロパノールを加え、室温で10分間放置した。15,000 rpm (12,000 g)、4℃にて10分間遠心分離し、沈殿を70%エタノールで洗浄した。この沈殿を乾燥させた後、DEPC処理精製水に溶解させ、260 nmにおける吸光度を測定することにより定量した。
DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析は、北海道システムサイエンス(Sapporo, Japan) に依頼した。使用したアジレントアレイはWhole Mouse Genome Oligoであり、マウス全遺伝子を解析した。遺伝子発現はAgilent Technologies Microarray Scannerを用いて5 μmの解像度でスキャンした。スキャンの結果得られた数値化データを、GeneSpringにインポートし、ノーマライゼーションを行い、各シグナル値やフラグ情報を集めた解析用データを作成した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にTA (0, 50, 200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3匹のマウスを使用した。TA投与後24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にTA (200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3匹のマウスを使用した。TA投与後0, 3, 6, 12, 24および48時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
1−5により得られたtotal RNAから以下の方法によりcDNAを合成した。Total RNA 10 μg、ランダムヘキサマー (150 ng/μL) 1 μLにDEPC処理精製水を加えて全量を23 μLとした。70℃水浴中で10分間反応後、氷冷した。さらに、5 × 逆転写反応用緩衝液8 μL、2.5 M dNTP 8 μL、ReverTraAce (100 units/μL) 1 μLを加えて全量を40 μLとし、30℃で10分間、42℃で1時間、98℃で10分間、サーマルサイクラーを用いて反応させた。得られたcDNAから以下の方法によりPCRを行った。cDNA溶液を1 μL、2 × SGI溶液を10 μL、10 μM フォワードプライマーおよびリバースプライマーを0.8 μL、ROX溶液を0.3 μL、滅菌水 7.1 μLを加えて全量を20 μLとした。Stratagene (La Jolla, CA) のMx3000PTMを用いて、95℃で3分間、94℃で4秒間、64℃で20秒間を45サイクルで反応を行った。45サイクル終了後、60℃から95℃まで、1℃ /minを上昇させて融解曲線の測定を行った。PCRに用いたプライマーの配列を表2に示す。
ERα KOマウス (雌性、6週齢 30〜35 g、系統C57BL/6N) にTAMを5日間連続投与 (1 mg/kg in saline, i.p.) し、最終投与12時間後にTA (200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3匹のマウスを使用した。TA投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
HuH-7細胞、HLE細胞、HepG2細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞、Hepa1-6細胞、J774A.1細胞、MM45LTi細胞、NIH/3T3細胞、RAW-264.7細胞およびY-1細胞は10% FBSを含むDMEMを用いて10 cmシャーレで培養した。継代時、培地をアスピレート除去した後1 × PBS溶液4 mLをシャーレに加え、培地を5 mL入れておいた50 mLのチューブにシャーレより剥離した細胞を移し、4,000 rpm (1,000 g)、4℃で5分間遠心分離した。得られた沈殿を再度培地に懸濁してシャーレに播種し、5 % CO2存在下37℃で培養した。
HuH-7細胞、HLE細胞、HepG2細胞、Fa2N4細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞およびHepa1-6細胞を96ウェルプレートに各ウェル20,000個となるよう播種し、5 % CO2存在下37℃で24時間培養した。その後、TA濃度が0, 1, 10, 100 μM, 1, 10 mMになるよう加え、24時間処置した。
同仁化学研究所のCell counting kit-8を用い、以下の方法でMTTアッセイを行った。TA溶液を24時間処理した種々の細胞株に、CCK-8溶液を各ウェル10 μLずつ加えた。溶液添加1時間後における450 nmの吸光度をBiotrak II Plate readerを用いて測定した。
1ウェルあたりLipofectamine RNAiMAX 2.5 μL、20 μM Mmd2 StealthTM RNAiまたは20 μM rSOD2 StealthTM RNAi 1.5 μLに無血清培地を加え全量を4 mLとし、6ウェルプレートにアプライした。20分間静置させた後に、J774A.1細胞 (6×105 cells/well) またはY-1細胞 (4×105cells/well) を播種した。siMmd2の配列としては、
#1 CAGAAAACCAAAUAUGCAA(配列番号29),
#2 CCACACAGUCUCAUGGAAA(配列番号30),
#3 GCUAUGUGGUGAUGGGUUU(配列番号31),
#4 GAUCAAAGCAACAUGGGAA(配列番号32), 及び
#5 GCAGGGAGACCAAGGCAUA(配列番号33)
を用いた。
RNA isoを用いてtotal RNAを調製した。6ウェルプレートで培養したそれぞれの細胞株にRNA iso 500 μLを加えてピペッティングにより懸濁した後、室温で5分間放置した。100 μLのクロロホルム溶液を加え、15秒間激しく撹拌し、再度室温で5分間放置した。15,000 rpm (12,000 g)、4℃にて15分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、250 μLのイソプロパノールを加え、室温で5分間放置した。15,000 rpm (12,000 g)、4℃にて10分間遠心分離し、沈殿を75%エタノールで洗浄した。この沈殿を乾燥させた後、15,000 rpm (12,000 g)、4℃にて10分間遠心分離し、DEPC処理精製水に溶解させた。60℃の水浴で10分間インキュベートした後、260 nmにおける吸光度を測定することにより定量した。
siRNAのマウスin vivoへの導入はAteloGeneTMを用いて行った。AteloGeneTM 600 μLに等量の40 μMに調製したsiRNA溶液を加え、4 rpm、4℃で20分間回転混和した。その後、10,000 rpm (7,000 g)、4℃にて1分間遠心分離することで脱泡処理した。AteloGeneTM/siRNA複合体を尾静脈より投与 (200 μL/body) し、投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓、脾臓および腎臓を採取した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にTAMを4日間連続投与 (1 mg/kg in saline, i.p.) し、投与12時間後にAteloGeneTM/siRNA複合体を静脈内投与した。投与12時間後にTAM (1 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群3匹のマウスを使用した。TAM投与12時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にTAMを4日間連続投与 (1 mg/kg in saline, i.p.) し、投与12時間後にAteloGeneTM/siRNA複合体を静脈内投与した。投与12時間後にTAM (1 mg/kg in saline, i.p.) を投与し、さらにその12時間後にTA (200 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群6匹のマウスを使用した。TA投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
ICRマウス (雌性、6週齢 20〜25 g; 日本SLC) にAteloGeneTM/siRNA複合体を静脈内投与した。投与24時間後にTA (100 mg/kg in saline, i.p.) を投与した。各群5匹のマウスを使用した。TA投与24時間後に下行大静脈より採血を行った後、肝臓を採取した。
本実施例における動物実験については、全て金沢大学動物実験指針に従って行った。
2−1.EE2、TAM、RALおよびICI前投与によるTA誘導性肝障害への影響
1−2の方法によってEE2、TAM、RALおよびICI前投与によるTA誘導性肝障害への影響を6週齢雌性ICRマウスを用いて検討した。TA投与によりNone treatment (NT) と比べて血漿ALTおよびAST値の有意な上昇が認められた。EE2、TAM、RAL前投与によりTA単独投与群と比べて、血漿ALTおよびAST値の有意な減少が認められた (図1A及び1B)。ICI前投与ではTA単独投与群と比べて、血漿ALTおよびAST値の有意な減少は認められなかった。Total bilirubin (T-Bil) についてはいずれの群においても変動は認められなかった (図1C)。TAM投与により最も肝障害性の軽減が認められた。また、EE2前投与のTA投与群では血漿が黄色を示し、肝胆汁うっ滞の関与が考えられた。肝組織染色の検討においてもTA誘導性の肝障害が認められ、TAM前投与によりTA誘導性の肝障害の軽減が認められた (図2)。TAM投与のみでは血漿パラメータ (図1A、B及びC) の上昇は認められず、肝組織染色 (図2) においても肝障害は認められなかった。
TA以外の化合物でも同様にTAMによる肝保護作用が認められるか検討するため、TAM前投与によるAPAP、BB、DICおよびTA誘導性肝障害への影響について1−3に述べた方法で検討した (図3)。APAP投与において、TAM前投与により血漿ALTおよびAST値の有意な減少が認められた。また、血漿AST値がALT値よりも高値を示した。BB投与において、TAM前投与により血漿ALTおよびAST値の有意な減少が認められた。DIC投与では、TAM前投与により血漿ALTの有意な減少が認められた。血漿AST値がALT値よりも高値を示し、AST値のTAM前投与による減少は認められなかった。TA投与では図1と同様にTAM前投与により血漿ALTおよびAST値の有意な減少が認められた。全ての化合物において対照群と比べて、TAM前投与群において肝障害の軽減が認められた。TAMによる肝障害性の軽減はTA特異的ではなく、APAPやDICなどの薬物およびBBなどの毒物においても認められた。
薬物誘導性肝障害に対するTAMによる肝保護作用の原因因子を解明するために、2-6に述べた方法に従いDNAマイクロアレイによる解析を行った。DNAマイクロアレイはNT、TAM単独投与、ICI単独投与、RAL単独投与、TA単独投与、TA+TAM投与、TA+ICI投与およびTA+RAL投与群のサンプルを用いて解析を行った。2−1で述べたように、EE2投与群のサンプルは血漿の色が黄色を示したため、TAMおよびRALとは別の因子が関わると考え、DNAマイクロアレイ解析は行わなかった。TA単独投与では4,846、TAM前投与群では2,269、ICI前投与群では2,354およびRAL前投与群では3,025の遺伝子がNTと比べて2倍以上上昇した (図4)。また、TA単独投与群を対照とした場合、TAM前投与群では3,732、ICI前投与群では2,783およびRAL前投与群では4,731遺伝子が2倍以上上昇した。TAMおよびRAL前投与群においてTA誘導性の肝障害性が軽減し、ICI前投与群では軽減が認められなかったことから、TAMおよびRAL前投与群のみで上昇した遺伝子を選択した。TAM単独投与およびRAL単独投与で2倍以上上昇し、ICIでは0.5〜2倍の変動幅の遺伝子は380個であった。その中でもTAMおよびRAL単独投与いずれか、もしくはともに5倍以上上昇した遺伝子としてGrowth differentiation factor 9 (Gdf9)、Monocyte to macrophage differentiation-associated 2 (Mmd2)、Matrix metallopeptidase 9 (Mmp9) およびPhosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class Nが候補に挙がった (表3)。また、TAM単独投与およびRAL単独投与でともに2.5倍以上上昇し、ICIでほとんど変動が認められない (変動幅0.90〜1.10倍) 遺伝子として上記に挙げたMmp9およびPign以外にArginase 2 (Arg2) およびHematopoietic cell transcript 1 (Hemt1) の2つが挙げられた (表3)。TA単独投与を対照とした場合、TAM投与およびRAL投与で2倍以上上昇し、ICIでは0.5〜2倍の変動幅の遺伝子として907遺伝子あったが、表3で挙げた遺伝子と共通するものとして唯一Mmd2が挙がった。
Arginase 2 (Arg2)、Growth differentiation factor 9 (Gdf9)、Hematopoietic cell transcript 1 (Hemt1)、Mmd2、Matrix metallopeptidase 9 (Mmp9) およびphosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class N (Pign) におけるTA投与量依存的なmRNA発現量変動を1−7および1−9の方法に述べた方法で検討した。血漿ALT値についても併せて測定した。6週齢ICR雌性マウスにおいて、TA投与量依存的な血漿ALT値の上昇が認められた (図5A)。Arg2 mRNAおよびGdf9 mRNAにおいて、TA投与量依存的な上昇が認められ、Mmd2 mRNAにおいてはTA投与量依存的な減少が認められた (図5B)。Hemt1 mRNAにおいてTA投与10 mg/kgでは変動が認められなかったが、50および200 mg/kg投与では顕著な上昇が認められた。しかし、TA投与量依存性は認められなかった。Mmp9 mRNAではTA投与10および50 mg/kgでは変動は認められなかったが、200 mg/kg投与では顕著に上昇した。しかし、TA投与量依存性は認められなかった。Pign mRNAにおいてはTA投与10および50 mg/kgでは変動は認められなかったが、200 mg/kg投与では僅かに減少した。しかし、TA投与量依存性は認められなかった。
Arg2、Gdf9、Hemt1、Mmd2、Mmp9およびPignにおけるTA投与時間依存的な血漿ALT値およびmRNA発現量変動を1−8および1−9に述べた方法に従って検討した。TA投与時間依存的な血漿ALT値の上昇が認められ、投与後24時間で最大となり、48時間では減少した。TA投与0, 3, 6, 12および24時間後において、TA単独投与群に比べて、TA+TAM群でALT値の有意な減少が認められた (図6A)。TA投与48時間後では有意ではないものの減少傾向が認められた。Arg2 mRNAにおいて、TA単独投与ではTA投与24時間後で最大となり、48時間後で減少した。TA+TAM群ではTA投与48時間後まで上昇し続けた。Gdf9 mRNAにおいて、TA単独投与ではTA投与3時間後で上昇し、24時間後まで同程度であり、48時間後で減少した。TA+TAM群ではTA投与24時間後で最大となり、48時間後で減少した。Hemt1 mRNAにおいて、TA単独投与ではTA投与24時間後まで上昇し続け、48時間後ではわずかに減少した。TA+TAM群ではTA投与48時間後まで上昇し続けた。Mmd2 mRNAにおいて、TA単独投与では時間依存的な減少が認められた。TA+TAM群ではTA投与3時間後で最大となり、その後減少した。Mmp9 mRNAにおいて、TA単独投与群では、TA投与6時間および24時間でピークとなった。TA+TAM群ではTA投与12時間後までは変動が認められなかったが、24時間後で上昇し、48時間後ではさらに上昇した。Pign mRNAにおいて、TA単独投与ではTA投与後24時間まで減少し、48時間後では上昇した。TA単独投与群と比べて、TA+TAM群で全ての時間において発現上昇が認められたのはMmd2のみであった。
Arg2、Gdf9、Hemt1、Mmd2、Mmp9およびPignにおける4種の肝障害誘導化合物投与によるmRNA発現量変動を検討した (図7)。Arg2 mRNAにおいて、TAMおよびRAL前投与において発現の有意な上昇が認められ、ICI前投与では発現の上昇が認められなかった。また、APAP+TAMおよびTA+TAM群では対照群と比べて発現の変動は認められなかったが、BB+TAM群では発現の有意な減少が認められ、DIC+TAM群では発現の有意な上昇が認められた。Gdf9 mRNAにおいて、RAL前投与において発現の有意な上昇が認められ、TAMおよびICI前投与では発現の上昇が認められなかった。また、APAP+TAMおよびBB+TAM群では対照群と比べて発現の有意な減少が認められたが、DIC+TAM群では発現の変動は認められず、TA+TAM群では発現の有意な上昇が認められた。Hemt1 mRNAにおいて、RAL前投与において発現の上昇が認められたが、TAMおよびICI前投与で発現の上昇が認められなかった。また、APAP+TAMおよびDIC+TAM群では対照群と比べて発現の変動が認められなかったが、BB+TAMおよびTA+TAM群では発現の有意な減少が認められた。Mmd2 mRNAにおいて、TAMおよびRAL前投与において顕著な発現の上昇が認められた。ICI前投与では発現の上昇は認められなかった。また、APAP+TAM、BB+TAM、DIC+TAMおよびTA+TAM群において発現の有意な上昇が認められた。Mmp9 mRNAにおいて、RAL前投与において発現の上昇が認められたが、TAMおよびICI前投与では発現の変動が認められなかった。また、APAP+TAM およびBB+TAM群では発現変動は認められず、DIC+TAM群では対照群と比べて発現の有意な上昇が認められ、TA+TAM群では発現の有意な減少が認められた。Pign mRNAにおいて、TAMおよびRAL前投与において発現の上昇が認められなかった。ICI前投与でも発現の上昇が認められなかった。また、APAP+TAM投与では対照群と比べて発現変動が認められず、BB+TAM、DIC+TAMおよびTA+TAM群では発現の有意な上昇が認められた。DNAマイクロアレイ解析の結果より、TAMおよびRAL単独投与において全ての遺伝子で上昇が認められると考えられたが、Gdf9、Hemt1、Mmp9およびPign mRNAでは上昇が認められず、再現が得られなかった。Arg2およびMmd2 mRNAにおいては上昇が認められ、再現が得られた (図7)。
ERα KOマウスにおけるTAM前投与によるTA誘導性肝障害への影響を1−10に述べた方法に従い検討した (図8)。野生型マウスにおいて、ICRマウスと同様にTA投与により顕著なALT値の上昇が認められた。また、TAM前投与により、TA単独投与群と比べて血漿ALT値の有意な減少が認められた (図8)。一方、ERα KOマウスにおいてはTAMによる肝保護作用は認められなかった。また、ERα KOマウスにおいて野生型に比べて血漿ALTおよびAST値が有意に高かった。これよりTAMによるTA誘導性肝障害の軽減はERαを介することが示唆された。
TAMはERαを介して様々な生態反応に関与していることが知られているため、Arg2、Gdf9、Hemt1、Mmd2、Mmp9およびPign mRNAのERα KOマウスにおける変動を検討した (図9)。Arg2 mRNAにおいて、TAM前投与により有意な上昇が認められ、ERα KOマウスにおいて上昇は認められなかった。Gdf9 mRNAにおいて、TAM前投与により有意な上昇が認められ、ERα KOマウスにおいても有意な上昇が認められた。Hemt1 mRNAにおいてはいずれの群においても検出されなかった。Mmd2 mRNAにおいて、TAM前投与により有意な上昇が認められ、ERα KOマウスにおいては上昇が認められなかった。また、ERα KOマウスにおいてMmd2 mRNAの発現量が野生型に比べて1/10程度であった。Mmp9 mRNAにおいて、TAM前投与により上昇は認められず、ERα KOマウスにおいて有意な上昇が認められた。Pign mRNAにおいてはいずれの群においても変動は認められなかった。これより、Arg2およびMmd2がERαを介して上昇されることが示唆された。2−4、2−5、2−6、2−7および2−8の結果より、Mmd2を肝保護遺伝子の第一候補とし、更に詳細な検討を行った。
Mmd2がTAMによる肝保護に関与しているか検討を行うにあたり、in vitroでの系を構築することとした。In vitro系でこれまでのin vivo系と同様にTA誘導性の肝障害がTAMにより軽減されれば、遺伝子発現調節による解析が容易であると考えた。最初に、1−12および1−13の方法に従いHuH-7、HLE、CYP2E1発現アデノウイルス感染HepG2 (HepG2/AdCYP2E1)、Fa2N4、CYP2E1安定発現HEK293 (HEK293/CYP2E1 stable)、MCF-7およびHepa1-6細胞株を用いて、TAの細胞障害性をMTTアッセイを用いて検討した。いずれの細胞株においてもTA処置による細胞生存率の減少は認められなかった (図10)。TA処置濃度をより高濃度で行い細胞障害を惹起させ検討を進めていくことは困難と考え、in vitro系の検討は保留とし、in vivoで検討を進めていくこととした。
in vivoでMmd2の肝保護の関与を検討するために、Mmd2に対するsiRNA (siMmd2) をマウスに投与することとした。in vivoでのノックダウンを検討するにあたり、in vitroでノックダウン効率のよいsiMmd2を選択することとした。最初に、Mmd2 mRNAが発現している細胞株を選択するために、J774A.1、RAW264.7、NIH/3T3、MM45LTi、Hepa1-6およびY-1細胞株の6種のマウス由来細胞株を用いた。J774A.1およびY-1細胞においてMmd2 mRNAの発現が認められた (図11)。RAW264.7、NIH/3T3、MM45LTiおよびHepa1-6細胞においてはMmd2 mRNAの発現は認められなかった。J774A.1およびY-1細胞ともにMmd2 mRNA発現量は検出限界値であったことから、1種の細胞株を用いてノックダウン効率の良いsiMmd2を選択することは信憑性に欠けると考え、両細胞株を用いることとした。
J774A.1およびY-1細胞に5種類のsiMmd2 (#1〜#5) を1−14に述べた方法に従い処置した。J774A.1細胞において、#5siMmd2処置によってのみMmd2 mRNAの濃度依存的かつ有意な減少が認められた (図12A)。Y-1細胞においては#1siMmd2および#5siMmd2処置によりMmd2 mRNAの濃度依存的かつ有意な減少が認められた (図12B)。両細胞株において、lipofectamine (lipo) 単独処置およびsiScramble (siScr) 処置において、Mmd2 mRNAの変動は認められなかった。#5siMmd2処置において両細胞株でノックダウンが認められたことから、in vivoでは#5siMmd2 (以下siMmd2) を投与することとした。また、siMmd2の対照としてsiScrを用いることとした。
siRNAを未修飾で投与を行った場合、ヌクレアーゼにより速やかに分解されることが知られている。そこで1−16に述べた方法に従って、siRNA輸送媒体として知られるアテロコラーゲンを用いた検討を行った。マウスは6週齢雌性ICRを用いた。NTと比べてsiMmd2投与マウスにおいて、肝Mmd2 mRNAの約70%の減少が認められた (図13A)。アテロコラーゲン単独投与群 (Atelo) およびsiScr投与群においては肝Mmd2 mRNAの変動は認められなかった。siMmd2投与群において、若干ではあるが血漿ALT値の有意な上昇が認められ、血漿ASTおよびT-Bil値の変動は認められなかった (図13B)。腎臓および脾臓においてはMmd2 mRNA発現が認められず、ノックダウンを確認することはできなかった。
TAM前投与におけるMmd2ノックダウンによるMmd2mRNAへの変動について1-17に述べた方法に従って検討した。マウスは6週齢雌性ICRを用いた。NTと比べてTAM+siScr投与マウスにおいて、Mmd2 mRNAの約20倍の上昇が認められた (図14A)。また、血漿ALTおよびAST値は有意な減少が認められ、血漿T-Bil値の変動は認められなかった (図14B)。TAM+siMmd2投与マウスにおいてはTAM+siScr投与マウスと比べて約70%のMmd2 mRNAの減少が認められた。TAM+siScr投与マウスで認められた血漿ALTおよびAST値の減少はTAM+siMmd2投与マウスでは認められなかった。
TAM前投与におけるMmd2ノックダウンによるTA投与の影響を1−18に述べた方法に従って検討した。マウスは6週齢雌性ICRを用いた。TA+TAM+siMmd2投与マウスにおいて、TA+TAM+siScr投与マウスに比べて血漿ALTおよびAST値の有意な上昇が認められた (図15B)。血漿T-Bil値に変動は認められなかった。また、TA+TAM+siMmd2投与群において、TA+TAM+siScr投与マウスに比べてMmd2 mRNAの有意な減少が認められた (図15A)。siMmd2投与により、TAMによる肝保護作用の抑制が認められた。
TAM未投与におけるMmd2ノックダウンによるTA投与の影響を1−19に述べた方法に従って検討した。マウスは6週齢雌性ICRを用いた。TA+siMmd2投与マウスにおいて、TA+siScr投与マウスに比べて血漿ALTおよびAST値の有意な上昇が認められた (図16B)。血漿T-Bil値に変動は認められなかった。siMmd2投与により、TA誘導性肝障害の増大が認められた。また、TA+siMmd2投与群において、TA+siScr投与マウスに比べてMmd2 mRNAの有意な減少が認められた (図16A)。NTと比べてTA+siScr投与群でMmd2 mRNAの有意な減少が認められたが、図5、6及び7と同様の結果であり、再現が得られた。2−14及び2−15の結果より、Mmd2が肝保護遺伝子であることが示唆された。
続いて、Mmd2による肝保護作用がどのような機序で起こっているか検討した。Mmd2がERαを介して誘導されることが図9で示されたことから、ERαを介し、かつ肝保護遺伝子として報告のあるeNOSおよびAregのmRNA発現量を測定した。野生型マウスにおいて、TAM前投与によりeNOS mRNAはNTと比べて有意に減少した (図17A)。ERα KOマウスでは減少は認められなかった。またsiMmd2投与によりeNOS mRNAの変動は認められなかった (図17B)。これより、eNOS mRNAの減少がERαを介することが示唆されたが、eNOSが減少したことからTAMによる肝保護にeNOSが関与しているとは考えにくい。また、siMmd2投与により変動が認められないことから、Mmd2がeNOSに関与する可能性は低いと考えられた。よってTAMによる肝保護作用にeNOSは関与しない可能性が示唆された。
25種のヒト肝臓サンプルを用いて、ヒトにおける肝臓中のMMD2 mRNA発現量を1−9に述べた方法に従って検討した。ヒト肝臓においてもMMD2 mRNAの発現が認められたが (図19)、その発現量は非常に少なく検出限界に近い値であった。また、MMD2 mRNAの最も低い検体を1としたとき、ヒト25検体の平均値は約24であり、マウス3匹の平均値は約23,000であった。マウス肝臓に比べて1/1000程度であった。ヒト肝臓中のMMD2 mRNAには約188倍の個体差が認められた。
Claims (8)
- 被検物質による哺乳動物細胞におけるMmd2発現レベルの変化を指標として用いることを含む、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性を有する薬物の候補物質のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、請求項1記載のスクリーニング方法:
(1)被検物質をMmd2の発現を測定可能な哺乳動物細胞へ接触させること;
(2)該哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを測定すること;
(3)被検物質を接触させた哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルを、被検物質を接触させない哺乳動物細胞におけるMmd2の発現レベルと比較すること;及び
(4)比較の結果得られたMmd2発現レベルの変化を、肝障害を予防又は治療、或いは増悪する活性と相関付けること。 - 以下の工程を更に含む、請求項2記載のスクリーニング方法:
(5−1)Mmd2発現レベルを上昇させた被検物質を、肝障害を予防又は治療する活性を有する薬物の候補物質として選択すること。 - 以下の工程を更に含む、請求項2記載のスクリーニング方法:
(5−2)Mmd2発現レベルを減少させた被検物質を、肝障害を増悪する活性を有する薬物の候補物質として選択すること。 - 肝障害が化学物質に起因する肝障害である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性の判定方法:
(1)哺乳動物から分離された肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを測定すること;及び
(2)測定の結果得られた肝臓組織におけるMmd2の発現レベルを、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性と相関付けること。 - Mmd2ポリペプチドを特異的に認識する抗体、或いは該ポリペプチドをコードする核酸を特異的に検出する核酸プローブ又は核酸プライマーを含む、肝障害を誘導する化学物質に対する感受性を判定するための試薬。
- Mmd2に対するRNA干渉誘導性RNA若しくはアンチセンス核酸又はこれらの核酸を発現し得る発現ベクターの投与、或いは染色体DNA上のMmd2遺伝子の改変により、肝臓におけるMmd2ポリペプチド発現レベルを、前記投与又は改変を施さない対照非ヒト哺乳動物と比較して低下させた非ヒト哺乳動物に、肝障害を誘導する化学物質又は肝炎ウイルスを投与することにより、該非ヒト哺乳動物における肝障害を誘導することを含む、肝障害の非ヒト哺乳動物モデルの製造方法。
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