CN115003298A - 用于治疗代谢障碍的药物制剂和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用各种化合物治疗代谢障碍的方法。可以给患有代谢障碍的受试者施用鞘脂样化合物、ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂。将制剂和药物用于配制可以作为药学上有效的盐或以纯的形式施用给个体的治疗剂，包括、但不限于用于口服、静脉内或肌肉内施用的制剂。

Description

用于治疗代谢障碍的药物制剂和方法
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在政府支持下在NIH NCATS ICTS Award No.TR001414下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及用于治疗代谢障碍的制剂和药物和方法以及减轻线粒体断裂的方法。
背景
肥胖和II型糖尿病是可以显著降低期望寿命、降低生活质量和增加健康护理成本的疾病。肥胖和糖尿病的发病率持续逐年上升。根据世界卫生组织，据估计全球13％的成年人在2016年是肥胖的，这一数字自1975年以来几乎翻了三倍。同样，根据美国糖尿病协会，在2002年，在美国1820万人或6.3％的人口患有糖尿病。糖尿病是2000年美国死亡证明上列出的第六大死因。
II型糖尿病以血液中的高葡萄糖水平(即高血糖症)为标志，肥胖以高百分比的储存脂肪为标志。通常，当葡萄糖水平高时，身体会释放胰岛素，将葡萄糖水平降低到健康水平。当身体储存了足够的脂肪时，脂肪细胞会释放瘦素以促进饱腹感和能量消耗。但是，超重个体和II型糖尿病患者最终会对其血液中循环的胰岛素和瘦素水平升高产生抵抗，并且对医学上提供的胰岛素或瘦素没有应答。因此，需要替代药理学手段来治疗代谢障碍，诸如高血糖症和肥胖。
发明内容
在各种实施方案中，鞘脂样分子被用在用于治疗代谢障碍的各种药物制剂中。在各种实施方案中，给患有代谢障碍的个体施用包括一种或多种鞘脂样分子的药物制剂。在各种实施方案中，治疗的代谢障碍包括(但不限于)肥胖、代谢综合征、高血糖症、II型糖尿病、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症(hyperleptinemia)和肝脂肪变性。
在一个实施方案中，治疗障碍或病症。将鞘脂样化合物施用给患有所述障碍或病症的受试者。所述障碍或病症与代谢有关。
在另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是基于具有下式的O-苄基吡咯烷：
Figure BDA0003736472660000021
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯。R2是脂族链(C6-C10)。R3是包含H、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基。R1或R4之一是醇(CH2OH)或H。L是O-CH2。n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
在另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的3-和4-C-芳基吡咯烷：
Figure BDA0003736472660000022
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯。R2是脂族链(C6-C10)。R3是包含H、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基。n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
在另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物893：
Figure BDA0003736472660000031
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物1090：
Figure BDA0003736472660000032
在另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是基于具有下式的、具有连接的杂芳族附带基团的氮杂环：
Figure BDA0003736472660000033
或其药学上可接受的盐。R是任选地被取代的杂芳族部分，诸如任选地被取代的哒嗪、任选地被取代的吡啶、任选地被取代的嘧啶、吩噁嗪或任选地被取代的吩噻嗪。R1是H；烷基，诸如C1-6烷基或C1-4烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等；Ac；Boc；胍部分。R2是包含6-14个碳的脂族链。R3是1、2、3或4个取代基，其中每个取代基独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、N3、NO2和CN。n独立地是1、2、3或4。m独立地是1或2。所述苯基部分可以连接在氮杂环核心的任何可利用位置处。R是具有下式的1,2-哒嗪：
Figure BDA0003736472660000034
R4和R5是独立地选自以下的官能团：烷基，包括甲基；任选地被取代的芳基(即，未被取代的芳基或被取代的芳基)，包括任选地被取代的苯基；和任选地被取代的杂芳基，包括任选地被取代的吡啶和任选地被取代的嘧啶。所述哒嗪部分在哒嗪的位置4或5处连接至氮杂环。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物325：
Figure BDA0003736472660000041
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的2-C-芳基吡咯烷：
Figure BDA0003736472660000042
R1是选自以下的官能团：H、烷基链、OH、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nOR’、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯，其中R’是烷基、烯烃或炔烃。R2是脂族链(C6-C14)。R3是包括氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2、氰基(CN)或其组合的单-、二-、三-或四-芳族取代基。R4是选自以下的官能团：H；烷基，包括甲基(Me)；酯；或酰基。X-是合适酸的阴离子。n是独立地选择的选自1、2或3的整数。m是独立地选择的选自0、1或2的整数。
在再另一个实施方案中，所述障碍或病症是肥胖。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是代谢综合征。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是高血糖症。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是II型糖尿病。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是胰岛素抵抗。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是瘦素抵抗。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是高瘦素血症。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是肝脂肪变性。
在再另一个实施方案中，所述疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用减少所述受试者的食物摄入。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用减少所述受试者中的重量增加。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用降低所述受试者中的多脂症。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用减轻所述受试者中的代谢功能障碍。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用促进所述受试者中的胰岛素敏感性。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用促进所述受试者中的瘦素敏感性。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用改善葡萄糖耐量。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用降低血浆瘦素水平。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用降低血浆胰岛素水平。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用降低神经酰胺水平。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用增加脂联素水平。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用减少体脂。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用使所述受试者中的肝脂肪变性消退。
在再另一个实施方案中，所述鞘脂样化合物的施用使脂肪性肝炎消退。
在再另一个实施方案中，所述治疗与FDA批准的或EMA批准的护理标准(standardof care)组合。
在再另一个实施方案中，所述个体被诊断为患有所述病症或障碍。
在一个实施方案中，减轻线粒体断裂。使生物细胞与鞘脂样化合物接触，其中所述生物细胞正在经历线粒体断裂。
在另一个实施方案中，所述生物细胞与代谢障碍或病症有关。
在另一个实施方案中，使所述生物细胞与所述鞘脂样化合物接触会逆转线粒体断裂。
在另一个实施方案中，减轻线粒体断裂。使生物细胞与ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂接触，其中所述生物细胞正在经历线粒体断裂。
在再另一个实施方案中，所述ARF6拮抗剂是NAV2729、SecinH3、奋乃静或其衍生物。
在另一个实施方案中，所述PIKfyve拮抗剂是YM201636、APY0201、阿匹莫德、晚期内体运输抑制剂EGA或其衍生物。
在再另一个实施方案中，使所述生物细胞与所述ARF6拮抗剂或所述PIKfyve拮抗剂接触会逆转线粒体断裂。
在再另一个实施方案中，治疗一种障碍或病症。将ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂施用给患有障碍或病症的受试者。所述障碍或病症与代谢有关。
附图简述
参考以下附图和数据图将更全面地理解说明书和权利要求，它们作为本发明的示例性实施方案呈现并且不应被解释为本发明的范围的完整叙述。
图1提供了根据各种实施方案利用的用于体外线粒体网络的形态测定分析的策略。用媒介物(左图)或棕榈酸(palmitate)(PA，右图)处理的MEF中柠檬酸合酶染色的代表性图像是来自8个Z-切片的最大强度Z-投影。二元化(binarized)的线粒体网络被分割以标记各个对象。在每个细胞的基础上测量所有柠檬酸合酶阳性对象的宽高比(小管宽度/长度)以及圆度((4×面积)/(π×宽度))。骨架化网络用于量化小管的分支长度。小提琴图显示了在代表性细胞中的所有柠檬酸阳性对象(左)；中心线是中位数，四分位数定义了第25个到第75个百分位数。条形图显示来自代表性图像(中)或来自2个生物学重复的40个细胞(右)的平均值±SEM。
图2提供了根据各种实施方案产生的，用媒介物(水)或SH-BC-893(893，5μM)预处理3h以后，用媒介物(1％BSA+乙醇)或棕榈酸(250μM)处理3h的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的柠檬酸合酶染色。
图3提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。图3也提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了用媒介物(n＝7)、SH-BC-893(5μM，n＝7)、多球壳菌素(myr，10μM，n＝5)或伏马菌素B1(FB1，30μM，n＝3)预处理3h，然后用媒介物(1％BSA+乙醇)或棕榈酸(250μM)处理3h的MEF中的C16:0神经酰胺(C16:0 CER)水平。将MEF用C16:0 CER(100μM，n＝2)处理3h作为阳性对照。
图4提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。将MEF用媒介物(水)或SH-BC-893(5μM)预处理3h，并然后用媒介物(1％的BSA在乙醇中)或棕榈酸(250μM)处理另外3h。然后将细胞固定，针对柠檬酸合酶染色。显示了来自2个生物学重复的20个细胞的各个柠檬酸合酶阳性对象(3,000-8,000个对象)的数据。
图5提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。在用媒介物(水)或SH-BC-893(5μM)预处理3h以后，将MEF用媒介物(乙醇)或C16:0 CER(100μM)处理3h。
图6提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。将MEF用媒介物或893(5μM)预处理3h，然后用媒介物(DMSO)或C2-神经酰胺(50μM)处理另外3h。
图7A提供了根据各种实施方案产生的，使用ImageJ基于每个细胞计算的细胞的DRP1和柠檬酸合酶(CS)的Mander氏重叠系数以及代表性DRP1蛋白质印迹和DRP1水平定量。在用媒介物(水)或SH-BC-893(893，5μM)预处理3h以后，将MEF用媒介物(1％BSA+乙醇)或棕榈酸(250μM)处理3h，并使用共焦免疫荧光显微术评价DRP1和柠檬酸合酶共定位。
图7B提供了根据各种实施方案产生的，用媒介物(水)或NAV-2719(12.5μM)预处理3h以后用媒介物(1％BSA+乙醇)或棕榈酸(250μM)处理3h的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的柠檬酸合酶染色。
图7C提供了根据各种实施方案产生的，用媒介物(水)或YM201636(800nM)预处理3h以后用媒介物(1％BSA+乙醇)或棕榈酸(250μM)处理3h的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的柠檬酸合酶和Drp1染色。
图8提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。在用媒介物(DMSO)、SH-BC-893(893，5μM)预处理1h或mdivi-1(50μM)和M1(5μM)一起预处理24h以后，将MEF用媒介物(乙醇)或C16-CER(100μM)处理3h，并针对柠檬酸合酶染色。
图9提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的A549细胞中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。将A549细胞用媒介物(甲醇)或893(5μM)处理1h或用来氟米特(50μM)处理24h。
图10提供了根据各种实施方案产生的，用ImageJ计算的MEF中的线粒体的宽高比、分支长度和圆度的数据图。将对照lox-stop-lox(LSL)或KRASG12D MEF用893(5μM)处理3h并针对柠檬酸合酶染色。
图11提供了体内线粒体网络的形态测定分析的策略。通过NADH/NADPH自发荧光成像饲喂SD(左图)或HFD(右图)的小鼠的新鲜切除肝脏中的线粒体网络。图像是来自6个Z-切片的最大强度Z-投影。二元化的线粒体网络被分割以标记各个对象。在每个视野的基础上测量宽高比(小管宽度/长度)以及圆度((4×面积)/(π×宽度))。在小提琴图(左)中，中心线是中位数，四分位数定义了第25个到第75个百分位数；显示了来自代表性细胞的数据。条形图显示了来自代表性细胞的平均值±SEM(中间)或代表每个视野平均值；取自每组4只小鼠各自的8-12个视野。应用相同的策略来量化用柠檬酸合酶抗体可视化的下丘脑线粒体，例外是，从每组4只小鼠中的各自评价5个视野。
图12提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了通过管饲法给与120mg/kgSH-BC-893的单剂量以后在小鼠中的血浆药代动力学(n＝3)。
图13提供了根据各种实施方案产生的，小鼠肝脏中的线粒体的宽高比和圆度。在来自小鼠的新鲜切除肝脏中通过共焦显微术评价的NADH/NADPH自发荧光，所述小鼠在ZT8.5通过管饲法用媒介物或120mg/kg SH-BC-893急性处理以后已经消耗SD 22周或HFD26周。将小鼠在ZT13和ZT17.5之间成对处死。
图14提供了根据各种实施方案产生的，小鼠弓状核(ARC)中的线粒体的宽高比和圆度。小鼠在ZT8.5通过管饲法用媒介物或120mg/kg SH-BC-893急性处理以后已经消耗SD22周或HFD 26周。将小鼠按字母顺序在ZT13和ZT17.5之间成对处死。
图15提供了根据各种实施方案产生的，使用单因素方差分析和Tukey氏校正的图16和18-23的p-值表。
图16提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在第49天(箭头)开始在星期一、星期三和星期五饲喂标准饮食并管饲媒介物(SD，n＝10)或饲喂高脂肪饮食(HFD)并管饲媒介物(n＝10)、60mg/kg(n＝9)或120mg/kg(n＝10)SH-BC-893的小鼠的体重。
图17提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了饲喂SD(n＝10)或HFD(n＝40)的小鼠的体重、脂肪质量、瘦质量、作为％脂肪质量或％瘦质量的身体组成。在框图中，中心线是中位数，且框由第25个到第75个百分位数定界，点触线(whisker)代表最小值和最大值。
图18提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图16和17中描述的小鼠在治疗过程中(第49-73天)的体重变化百分比。
图19提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图16和17中描述的小鼠在治疗过程中(第49-73天)的脂肪质量变化百分比和在第73天的脂肪质量。
图20提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图16和17中描述的小鼠在治疗过程中(第49-73天)的瘦质量变化百分比和在第73天的瘦质量。
图21提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了小鼠在治疗过程中(第49-73天)的体重和体重变化百分比，所述小鼠被提供跑轮(在指出的情况下)并在第49天(箭头)开始在星期一、星期三和星期五饲喂标准饮食并管饲媒介物(SD，n＝10)或饲喂高脂肪饮食(HFD)并管饲媒介物(n＝8)或120mg/kg(n＝8)SH-BC-893。
图22提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图21中描述的小鼠在治疗过程中(第49-73天)的脂肪质量变化百分比和在第73天的脂肪质量。
图23提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图21中描述的小鼠在治疗过程中(第49-73天)的瘦质量变化百分比和在第73天的瘦质量。
图24提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了饲喂SD、HFD或HFD+120mg/kg 893持续73天的小鼠的肝脏或四头肌中的神经酰胺水平；在所有组中n＝4。
图25提供了根据各种实施方案产生的蛋白质印迹和对应数据图，其描绘了用C2-神经酰胺(50或100μM)或SH-BC-893(5或10μM)预处理3h的3T3-L1脂肪细胞中的胰岛素刺激的(100nm，持续15min)AKT活化。
图26提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了用媒介物(n＝5)、SH-BC-893(10μM，n＝5)或MK-2206(2μM，n＝4)处理3h以后在3T3-L1脂肪细胞中的胰岛素刺激的2-脱氧葡萄糖摄取。图26进一步提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在用媒介物(n＝4)或893(5(n＝4)或10(n＝3)μM)处理3h以后在小鼠胚胎成纤维细胞中的2-脱氧葡萄糖摄取。
图27提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了处理25天以后在图16中的小鼠的空腹血糖水平。SD+媒介物和HFD+媒介物(n＝6),HFD+60或120mg/kg SH-BC-893(n＝4)。图27进一步提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在这些小鼠中进行的口服葡萄糖耐量试验过程中的血糖水平或曲线下面积(AUC)。
图28提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了饲喂SD(n＝8)10-12周并然后在第1天(第一次暴露)和第3天在ZT8.5用媒介物或120mg/kg SH-BC-893口服处理的小鼠的换气比值(RER)。显示了在108分钟中的4次测量结果的平均值或在深色(ZT12-ZT24)或浅色(ZT0-ZT12)圆圈上的平均值。用箭头或*指示治疗。
图29提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了饲喂HFD(n＝6-7)10-12周并然后在第1天(第一次暴露)和第3天在ZT8.5用媒介物或120mg/kg SH-BC-893口服处理的小鼠的换气比值(RER)。显示了在108分钟中的4次测量结果的平均值或在深色(ZT12-ZT24)或浅色(ZT0-ZT12)圆圈上的平均值。用箭头或*指示治疗。
图30提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在ZT8.5用水(n＝7)或120mg/kg 893(n＝8)处理的用HFD饲喂4周的小鼠的血清中瘦素水平。
图31提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图29中的间接测热法研究过程中的食物摄入，显示为在108min所取的4次测量结果的平均值或从ZT12至ZT24的平均值。给小鼠饲喂SD并用媒介物(n＝6-8)或120mg/kg SH-BC-893(n＝5-8)处理。
图32提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在图30中的间接测热法研究过程中的食物摄入，显示为在108min所取的4次测量结果的平均值或从ZT12至ZT24的平均值。给小鼠饲喂HFD并用媒介物(n＝6-8)或120mg/kg SH-BC-893(n＝5-8)处理。
图33提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了小鼠中从ZT12至ZT24的食物摄入和体重变化，给所述小鼠饲喂SD 10周(n＝8)、HFD 10周(n＝7)或HFD 22周(n＝8)，并通过管饲法用媒介物或120mg/kg SH-BC-893在ZT8.5处理一次。
图34提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在小鼠中在ZT12-ZT24之间的平均RER，给所述小鼠饲喂HFD 22周并然后用媒介物(n＝8)、120mg/kg SH-BC-893(n＝8)处理，或配对饲喂平均量的食品，所述食品在该阶段中被SH-BC-893处理的小鼠(n＝8)吃掉。
图35提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在18周龄小鼠中从ZT8.5至ZT2.5(18h)的食物摄入和体重变化，给所述小鼠饲喂16％千卡的脂肪食物饮食并在ZT11.5用媒介物(盐水)或2mg/kg瘦素腹膜内处理和在ZT8.5通过管饲法用媒介物(水)或120mg/kg SH-BC-893处理；所有组，n＝7。
图36提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在用SH-BC-893处理之前饲喂HFD 24周的野生型C57BL/6J小鼠(n＝8)或饲喂16％千卡的脂肪食物饮食的10周龄ob/ob小鼠(n＝9)的体重。图36进一步提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在单次口服给药媒介物或120mg/kg SH-BC-893以后在饲喂HFD 24周的野生型C57BL/6J小鼠(n＝8)中或在饲喂16％千卡的脂肪食物饮食的10周龄ob/ob小鼠(n＝9)中从ZT8.5至ZT2.5(18h)的食物摄入或体重变化。
图37提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了通过管饲法在星期一、星期三和星期五用媒介物(n＝4)或120mg/kg SH-BC-893(n＝4)处理2周的ob/ob小鼠中的体重或体重变化百分比。
图38提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了通过管饲法在星期一、星期三和星期五用媒介物(n＝4)或120mg/kg SH-BC-893(n＝4)处理2周的ob/ob小鼠中的累积食物摄入。图38进一步提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了通过管饲法在星期一、星期三和星期五用媒介物(n＝4)或120mg/kg SH-BC-893(n＝4)处理2周的ob/ob小鼠中进行的口服葡萄糖耐量试验。在处理开始后14天进行该试验。空心圆圈指示其中某些血糖值超过检测限度(>600mg/dL)并被指定为600mg/dL的值。
图39提供了根据各种实施方案产生的数据图，其描绘了在ZT8.5通过管饲法用媒介物或120mg/kg SH-BC-893处理的12周龄ob/ob小鼠的新鲜切除肝脏中的线粒体的宽高比和圆度。
详细描述
现在转向附图和数据，公开了根据各种实施方案的鞘脂样分子、从这些分子形成的药物和使用这样的治疗剂治疗代谢障碍的方法。在某些实施方案中，将鞘脂样分子用于减轻生物细胞内、特别是与代谢障碍有关的细胞内的线粒体断裂。在某些实施方案中，将鞘脂样分子用在治疗剂中以治疗代谢障碍。在某些实施方案中，治疗剂含有治疗有效剂量的一种或多种鞘脂样分子化合物，其作为药学上有效的盐或以纯的形式存在。在某些实施方案中，给患有代谢障碍的个体施用包含一种或多种鞘脂样分子的治疗剂。在某些实施方案中，用鞘脂样分子靶向的代谢障碍包括(但不限于)肥胖、高血糖症、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和肝脂肪变性。在某些实施方案中，包含一种或多种鞘脂样分子的治疗剂减少受试者的食物摄入，减少重量增加，改善胰岛素敏感性，改善葡萄糖耐量，改善瘦素敏感性，降低血浆瘦素水平，降低血浆胰岛素水平，降低神经酰胺水平，增加脂联素水平，减轻多脂症，减轻代谢功能障碍，减少体脂，使肝脂肪变性消退和/或使脂肪性肝炎消退。各种实施方案利用各种制剂，包括(但不限于)用于口服、静脉内或肌肉内施用的制剂。
治疗剂的各种实施方案可以包含任何适当的鞘脂样分子化合物中的一种或多种。在某些实施方案中，鞘脂样分子是基于O-苄基氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样分子是基于2-、3-和4-C-芳基氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样分子是基于具有杂芳族附带基团的氮杂环。
在某些实施方案中，将ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂用于减轻生物细胞内、特别是与代谢障碍有关的细胞内的线粒体断裂。在某些实施方案中，将ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂用于治疗剂中以治疗代谢障碍。在某些实施方案中，治疗剂含有治疗有效剂量的一种或多种ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂化合物，其作为药学上有效的盐或以纯的形式存在。在某些实施方案中，给患有代谢障碍的个体施用包含一种或多种ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂的治疗剂。在某些实施方案中，用ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂靶向的代谢障碍包括(但不限于)肥胖、高血糖症、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和肝脂肪变性。在某些实施方案中，包含一种或多种ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂的治疗剂减少受试者的食物摄入，减少重量增加，改善胰岛素敏感性，改善葡萄糖耐量，改善瘦素敏感性，降低血浆瘦素水平，降低血浆胰岛素水平，降低神经酰胺水平，增加脂联素水平，减轻多脂症，减轻代谢功能障碍，减少体脂，使肝脂肪变性消退和/或使脂肪性肝炎消退。各种实施方案利用各种制剂，包括(但不限于)用于口服、静脉内或肌肉内施用的制剂。
高脂肪饮食通过如下促成各种代谢疾病：改变线粒体结构，导致断裂，从而降低它们满足体内各种组织/器官的生物能量需求的能力。线粒体断裂已经与对瘦素和胰岛素的应答降低以及促成肥胖的瘦素产量增加相关联。已经发现，鞘脂样化合物，诸如本文所述的那些化合物，抑制和逆转小鼠中以及小鼠和人细胞中的线粒体断裂。进一步表明，鞘脂样化合物在高脂肪饮食小鼠中减少食物摄入，减少重量增加，降低多脂症，减轻代谢功能障碍，使肝脂肪变性消退，降低血浆瘦素水平，降低血浆胰岛素水平，降低神经酰胺水平，和促进胰岛素和瘦素敏感性。基于这些发现并根据各种实施方案，利用鞘脂样分子来治疗与高脂肪饮食有关的代谢障碍、肥胖、高血糖症、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和/或肝脂肪变性。
此外，鞘脂样化合物是细胞溶质酶ADP核糖基化因子6(ARF6)和含有FYVE-型锌指的磷脂酰肌醇激酶(PIKfyve)的拮抗剂，它们参与内体循环和内体与溶酶体的融合(B.T.Finicle,等人,J Cell Sci.131:jcs213314,2018；和S.M.Kim,等人,J ClinInvest.126:4088-4102,2016；其公开内容通过引用并入本文)。ARF6诱导胞吞泡再循环，从而与质膜融合。PIKfyve促进内体-溶酶体融合。已经证实，这些蛋白的抑制剂还抑制并逆转用棕榈酸处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的线粒体断裂。基于这些发现并根据各种实施方案，将ARF6和PIKfyve的拮抗剂用于治疗与高脂肪饮食有关的代谢障碍、肥胖、高血糖症、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和/或肝脂肪变性。
定义
为了本说明书的目的，使用以下定义，除非另有描述。
“药学上可接受的载体或稀释剂”是指适用于施用给动物的任何物质。某些这样的载体使药物组合物能够配制成例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆、混悬剂和锭剂以供受试者口服摄入。在某些实施方案中，药学上可接受的载体或稀释剂是无菌水；无菌盐水；克列莫佛(cremophor)；或无菌缓冲溶液。
“药学上可接受的盐”是指化合物诸如抗病毒化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性并且不对其产生不希望的毒理学作用的盐。
“药物组合物”是指适合用于施用给受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含抗病毒化合物和无菌水溶液。
“前药”是指体外形式的治疗剂，其在身体或其细胞内转化为不同形式。通常，前药在体内的转化通过在细胞或组织中存在的酶(例如内源性或病毒酶)或化学物质的作用和/或生理条件来促进。
“代谢障碍”是指身体代谢的异常，并且包括(但不限于)肥胖、高血糖症、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和肝脂肪变性(例如，非酒精性肝脂肪变性(NASH))。高血糖症表现为血液中的葡萄糖升高，并包括糖尿病前期(pre-diabete)和II型糖尿病的情况。
技术术语
“酰基”是指-R-C＝O基团。
“醇”是指具有与饱和的烷烃样化合物键合的-OH基团的化合物(ROH)。
“烷基”表示当从烷烃除去氢原子时剩余的部分结构。
“烷烃”是指仅含有单键的碳和氢的化合物。
“烯烃”表示含有碳-碳双键的烃，R2C＝CR2。
“炔烃”表示含有碳-碳三键的烃结构。
“烷氧基”表示以键合到氧原子的烷基基团为特征的分子结构的一部分。
“芳基”表示从芳族环衍生出的任何官能团或取代基。
“胺”分子是含有一个或多个与氮原子键合的有机取代基的化合物，RNH2、R2NH或R3N。
“氨基酸”表示在邻近羧基基团的碳原子上具有氨基基团的双官能化合物，RCH(NH2)CO2H。
“叠氮基”表示N3。
“氰基”表示CN。
“酯”是含有-CO2R官能团的化合物。
“醚”表示具有与同一氧原子键合的两个有机取代基的化合物，即，R-O-R’。
“卤素”或“卤”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
“烃”是指完全由元素碳(C)和氢(H)组成的有机化学化合物。
“磷酸酯”、“膦酸酯”或“PO”是指含有元素磷(P)和氧(O)的化合物。
上述分子式中和各处的“R”意在表示任何合适的有机分子。
用于减轻线粒体断裂和治疗代谢障碍的化合物
在某些实施方案中，将各种化合物用于治疗代谢障碍。在某些实施方案中，将各种化合物施用给患有代谢障碍的受试者。受试者包括体内、离体和体外受试者。因此，受试者包括(但不限于)动物、收获的器官组织、类器官和细胞系。动物包括(但不限于)人类和动物模型(例如，小鼠)。在某些实施方案中，细胞系、器官组织和/或类器官衍生自从人或动物模型提取的组织。如本文所讨论的，线粒体断裂促成异常代谢，其存在于患有代谢障碍的受试者中。用于治疗代谢障碍的化合物包括(但不限于)ARF6拮抗剂、PIKfyve拮抗剂和鞘脂样化合物。ARF6拮抗剂包括(但不限于)鞘脂样化合物、NAV2729、SecinH3、奋乃静、及其衍生物。众多ARF6拮抗剂述于文献中且可以用在如本文中所述的某些实施方案中(参见B.T.Finicle,等人,J Cell Sci.131:jcs213314,2018；J.H.Yoo,等人,Cancer Cell.29:889-904,2016；和M.Hafner,等人,Nature.444:941-944,2006；其公开内容通过引用并入本文)。PIKfyve拮抗剂包括(但不限于)鞘脂样化合物、YM201636、APY0201、阿匹莫德、晚期内体运输抑制剂EGA、及其衍生物。众多PIKfyve拮抗剂描述于文献中且可以用在如本文中所述的某些实施方案中(参见S.M.Kim,等人,J Clin Invest.2016；126(11):4088-4102；H.B.Jefferies,等人,EMBO Rep.9:164-170,2008；和X.Cai,等人,Chem Biol.20:912-921,2013；其公开内容通过引用并入)。鞘脂样化合物包括(但不限于)鞘脂、鞘脂样化合物893、鞘脂样化合物1090和鞘脂样化合物325。
在某些实施方案中，以1nM至100μM的浓度利用用于治疗代谢障碍的化合物。在某些实施方案中，以小于1nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM或大于100μM的顺序的浓度利用化合物。
I.鞘脂样化合物
A.基于O-苄基氮杂环的鞘脂样化合物
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是基于O-苄基氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样化合物具有下式：
Figure BDA0003736472660000171
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯；
R2是脂族链(C6-C10)；
R3是包含H、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；
R1或R4之一是醇(CH2OH)或H；
L是O-CH2；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
在O-苄基氮杂环的某些实施方案中，O-苄基基团可以移动至位置4(上面显示)或3(如下面显示)：
Figure BDA0003736472660000181
在某些实施方案中，烷基、CH2OH或(CH2)nOH基团可以添加至位置5。
在某些实施方案中，R1或R4之一是具有1-6个碳的烷基。
应该理解，本文描述的化合物可以作为立体异构体存在，包括磷酸酯、膦酸酯、对映异构体、非对映异构体、顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、溶剂化物(包括水合物)、互变异构体、及其混合物。
在其中化合物是磷酸酯或膦酸酯的许多实施方案中，R1可以是，例如，(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯。
B.基于3-和4-C-芳基氮杂环的鞘脂样化合物
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是基于非对映异构的3-和4-C-芳基氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样化合物具有下式：
Figure BDA0003736472660000191
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯；
R2是脂族链(C6-C14)；
R3是包含氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
在非对映异构的3-和4-C-芳基氮杂环的某些实施方案中，C-芳基基团可以移动至位置3(上面显示)或4(如下面显示)：
Figure BDA0003736472660000192
在某些实施方案中，烷基、CH2OH或(CH2)nOH基团可以添加至位置5。
在某些实施方案中，R2是不饱和烃链。
在某些实施方案中，R1是具有1-6个碳的烷基。
应该理解，本文描述的化合物可以作为立体异构体存在，包括磷酸酯、膦酸酯、对映异构体、非对映异构体、顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、溶剂化物(包括水合物)、互变异构体、及其混合物。
在其中化合物是磷酸酯或膦酸酯的某些实施方案中，R1可以是，例如，(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯。
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是具有下式的化合物893：
Figure BDA0003736472660000201
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是具有下式的化合物1090：
Figure BDA0003736472660000202
C.基于具有杂芳族附带基团的氮杂环的鞘脂样化合物
在某些实施方案中，抗病毒化合物是基于具有连接的杂芳族附带基团的氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样化合物具有下式：
Figure BDA0003736472660000203
或其药学上可接受的盐；
R是任选地被取代的杂芳族部分，诸如任选地被取代的哒嗪、任选地被取代的吡啶、任选地被取代的嘧啶、吩噁嗪或任选地被取代的吩噻嗪。
R1是H；烷基，诸如C1-6烷基或C1-4烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等；Ac；Boc；胍部分。
R2是包含6-14个碳的脂族链。
R3是1、2、3或4个取代基，其中每个取代基独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、N3、NO2和CN。
n独立地是1、2、3或4。
m独立地是1或2。
所述苯基部分可以连接在氮杂环核心的任何可利用位置处。
在某些实施方案中，R2是不饱和烃链。
在某些实施方案中，R2是C6-14烷基、C6-10烷基、C7-9烷基、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27或C14H29。
在某些实施方案中，R3是H。
在某些实施方案中，n是1。在某些实施方案中，n是2。在某些实施方案中，n是3。在某些实施方案中，n是4。
在某些实施方案中，m是1。在某些实施方案中，m是2。
在某些实施方案中，R2和R3取代基可以关于它们的位置在苯基环周围具有不同组合。
在某些实施方案中，R1是具有1-6个碳的烷基。
应该理解，本文描述的化合物可以作为立体异构体存在，包括对映异构体、非对映异构体、顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、溶剂化物(包括水合物)、互变异构体、及其混合物，它们被涵盖在本文所述化合物中。
在某些实施方案中，R是具有下式的1,2-哒嗪：
Figure BDA0003736472660000221
R4和R5是独立地选自以下的官能团：烷基，包括甲基；任选地被取代的芳基(即，未被取代的芳基或被取代的芳基)，包括任选地被取代的苯基；和任选地被取代的杂芳基，包括任选地被取代的吡啶和任选地被取代的嘧啶。
所述哒嗪部分在哒嗪的位置4或5处连接至氮杂环。
在某些实施方案中，如果存在的话，R4和R5的任何取代基独立地是卤素，包括F、烷基、末端炔烃和叠氮基。
在某些实施方案中，R4是C1-6烷基，诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基；未被取代的芳基或被取代的芳基，包括未被取代的苯基或具有1、2、3、4或5个取代基的苯基；未被取代的杂芳基或被取代的杂芳基，包括未被取代的吡啶或具有1、2、3或4个取代基的吡啶、或未被取代的嘧啶或具有1、2或3个取代基的嘧啶。任何取代基可以用在被取代的芳基(例如，被取代的苯基)或被取代的杂芳基(例如，被取代的吡啶或被取代的嘧啶)中。例如，被取代的芳基或被取代的杂芳基的取代基可以独立地是卤素(诸如F、Cl、Br、I)、C1-6烷基(诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基)或X-Ra，其中X是O、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-或-C(＝O)NH-且Ra是C1-6烷基(诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基)、C2-6烯基(诸如-CH＝CH2、-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2等)或C2-6炔基(诸如-CH≡CH2、-CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH2CH2CH≡CH2等)；或叠氮基。
在某些实施方案中，R5是C1-6烷基，诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基；未被取代的芳基或被取代的芳基，包括未被取代的苯基或具有1、2、3、4或5个取代基的苯基；未被取代的杂芳基或被取代的杂芳基，包括未被取代的吡啶或具有1、2、3或4个取代基的吡啶、或未被取代的嘧啶或具有1、2或3个取代基的嘧啶。任何取代基可以用在被取代的芳基(例如，被取代的苯基)或被取代的杂芳基(例如，被取代的吡啶或被取代的嘧啶)中。例如，被取代的芳基或被取代的杂芳基的取代基可以独立地是卤素(诸如F、Cl、Br、I)、C1-6烷基(诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基)或X-Ra，其中X是O、-C(＝O)-、-NHC(＝O)-或-C(＝O)NH-且Ra是C1-6烷基(诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基)、C2-6烯基(诸如-CH＝CH2、-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2等)或C2-6炔基(诸如-CH≡CH2、-CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH2CH≡CH2、-CH2CH2CH2CH2CH≡CH2等)；或叠氮基。
在某些实施方案中，R4和R5是相同的官能团。
在某些实施方案中，R4和R5是不同的官能团。
在某些实施方案中，R4是C1-6烷基，诸如甲基，且R5是任选地被取代的苯基。
在某些实施方案中，R4是C1-6烷基，诸如甲基，且R5是任选地被取代的吡啶。
在某些实施方案中，R4是C1-6烷基，诸如甲基，且R5是任选地被取代的嘧啶。
在某些实施方案中，R4是任选地被取代的吡啶且R5是任选地被取代的吡啶。
在某些实施方案中，R4是任选地被取代的苯基且R5是任选地被取代的苯基。
在某些实施方案中，R4是任选地被取代的苯基且R5是任选地被取代的嘧啶。
在某些实施方案中，R是任选地被取代的吩噁嗪或任选地被取代的吩噻嗪，诸如具有下式的吩噁嗪或吩噻嗪：
Figure BDA0003736472660000241
其可以另外具有在任何可利用的环位置上的取代基。
X选自：O和S。
R通过R的氮连接至氮杂环。
R的取代基可以独立地包括卤素、烷基(例如，C1-6烷基，诸如CH3、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基)、烷氧基(例如，C1-6烷氧基，诸如-OCH3、C2烷氧基、C3烷氧基、C4烷氧基、C5烷氧基或C6烷氧基)、N3、NO2和CN。
应该理解，本文描述的化合物可以作为立体异构体存在，包括磷酸酯、膦酸酯、对映异构体、非对映异构体、顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、溶剂化物(包括水合物)、互变异构体、及其混合物。
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是具有下式的化合物325：
Figure BDA0003736472660000242
D.基于2-C-芳基氮杂环的鞘脂样化合物
在某些实施方案中，鞘脂样化合物是基于非对映异构的2-C-芳基氮杂环。在某些实施方案中，鞘脂样化合物具有下式：
Figure BDA0003736472660000243
R1是选自以下的官能团：H、烷基链、OH、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nOR’、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯，其中R’是烷基、烯烃或炔烃。
R2是脂族链(C6-C14)。
R3是包括氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2、氰基(CN)或其组合的单-、二-、三-或四-芳族取代基。
R4是选自以下的官能团：H；烷基，包括甲基(Me)；酯；或酰基。
X-是合适酸的阴离子。
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
m是独立地选择的选自0、1或2的整数。
所述分子可以包括选自以下的氮杂环取代基的任选官能团：
选自羰基(C＝O)和醇(CHOH)的相对于氮杂环在α、β或γ位置的极性基团；
*从相对于氮杂环的α、β或γ位置向回延伸至氮杂环的N的环状碳链，和
它们的组合。
在某些实施方案中，R1是H、OH、CH2OH、OPO(OH)2。在某些实施方案中，R1是H。在某些实施方案中，R1是OH。在某些实施方案中，R1是CH2OH。在某些实施方案中，R1是OPO(OH)2。
在某些实施方案中，R2是C6-14烷基、C6-10烷基、C7-9烷基、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27或C14H29。在某些实施方案中，R2是C8H17。
在某些实施方案中，R3是H。
在某些实施方案中，n是1。
在某些实施方案中，m是0。在某些实施方案中，m是1。在某些实施方案中，m是2。在某些实施方案中，m是3。
在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是C(＝O)、CH2C(＝O)、C(＝O)CH2、CH2CH2C(＝O)、CH2、CH2CH2、CH2C(OCH3)H或CHOHCH2。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是C(＝O)。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CH2C(＝O)。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是C(＝O)CH2。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CH2CH2C(＝O)。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CH2。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CH2CH2。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CH2C(OCH3)H。在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团是CHOHCH2。
在某些实施方案中，将苯基环连接至氮杂环的连接基团包括从相对于氮杂环的α、β或γ位置向回延伸至氮杂环的N的环状碳链，使得具有连接基团的氮杂环形成任选地被取代的具有下式的二环：
Figure BDA0003736472660000261
在某些实施方案中，R4是H。在某些实施方案中，R4是C1-6烷基，诸如CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C1-3烷基等，C1-6酰基或C1-6酯。在某些实施方案中，R4是甲基。
在再其它实施方案中，R2和R3取代基可以关于它们的位置在苯基环周围具有不同组合。
在再其它实施方案中，R2是不饱和烃链。
在再其它实施方案中，R1是具有1-6个碳的烷基。
应该理解，本文描述的化合物可以作为立体异构体存在，包括磷酸酯、膦酸酯、对映异构体、非对映异构体、顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、溶剂化物(包括水合物)、互变异构体、及其混合物。
E.鞘脂样化合物的药用盐
某些鞘脂样化合物也可以涉及药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”保留了化合物的合乎需要的生物活性，而没有不希望的毒理学效应。盐可以是与合适酸的盐，所述酸包括、但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、苯甲酸、扑酸、海藻酸、甲磺酸、萘磺酸等。并且，掺入的阳离子可以包括铵、钠、钾、锂、锌、铜、钡、铋、钙等；或有机阳离子诸如四烷基铵和三烷基铵阳离子。也有用的是酸性盐和阳离子盐的组合。包括其它酸和/或阳离子的盐，诸如与三氟乙酸、氯乙酸和三氯乙酸的盐。
某些药物组合物
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗代谢障碍的包含一种或多种化合物或其盐的药物组合物。在各种实施方案中，在药物制剂中利用的化合物是鞘脂样分子、ARF6拮抗剂和/或PIKfyve拮抗剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包括合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种化合物。在某些实施方案中，这样的药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种化合物组成。在某些实施方案中，所述无菌盐水是药用级盐水。在某些实施方案中，药物组合物包含无菌水和一种或多种化合物。在某些实施方案中，所述水是药用级水。在某些实施方案中，药物组合物包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)和一种或多种化合物。在某些实施方案中，所述PBS是药用级PBS。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种化合物和一种或多种赋形剂。在某些实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘稠的石蜡、羟基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方案中，将化合物与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括、但不限于施用途径、疾病程度或要施用的剂量。
在某些实施方案中，用于治疗代谢障碍的包含化合物的药物组合物包括所述化合物的任何药学上可接受的盐、反义化合物的酯或这样的酯的盐。在某些实施方案中，包含一种或多种化合物的药物组合物在施用给动物(包括人)后，能够(直接地或间接地)提供生物活性代谢物或其残余物。因此，例如，本公开内容还涉及化合物的药学上可接受的盐、前药、这样的前药的药学上可接受的盐和其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括、但不限于钠盐和钾盐。在某些实施方案中，前药包含一个或多个与化合物连接的缀合物基团，其中所述缀合物基团在体内被内源性核酸酶裂解。
在某些实施方案中，药物组合物包含递送系统。递送系统的例子包括、但不限于脂质体和乳剂。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的那些。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂诸如二甲亚砜(DMSO)。
在某些实施方案中，药物组合物包含共溶剂系统。某些这样的共溶剂系统包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相。在某些实施方案中，将共溶剂系统用于疏水化合物。这样的共溶剂系统的一个非限制性例子是VPD共溶剂系统，它是包含3％w/v的苯甲醇、8％w/v的非极性表面活性剂聚山梨酯80TM和65％w/v的聚乙二醇300的无水乙醇溶液。这样的共溶剂系统的比例可以有很大变化，而不显著改变它们的溶解度和毒性特征。此外，共溶剂组分的身份可能变化：例如，可以使用其它表面活性剂替代聚山梨酯80TM；聚乙二醇的级分大小可以变化；其它生物相容的聚合物可以替代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮；且其它糖或多糖可以替代右旋糖。在某些实施方案中，利用二甲亚砜(DMSO)作为共溶剂。在某些实施方案中，利用克列莫佛(或克列莫佛EL)作为共溶剂。
在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种增加生物利用度的化合物。例如，2-羟丙基-β-环糊精可以用在药物组合物中并可以增加生物利用度。在某些实施方案中，利用DMSO、克列莫佛和2-羟丙基-β-环糊精增加各种鞘脂样化合物的生物利用度。
在某些实施方案中，将药物组合物制备用于口服施用。在某些实施方案中，将药物组合物制备用于含服施用。在某些实施方案中，将药物组合物制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)施用。在某些这样的实施方案中，药物组合物包含载体并配制成水溶液，诸如水或生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。在某些实施方案中，包括其它成分(例如，有助于溶解或用作防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用适当的液体载体、助悬剂等制备可注射混悬剂。某些注射用药物组合物以单位剂型存在，例如在安瓿瓶中或在多次剂量容器中。某些注射用药物组合物是在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂，诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。适用于注射用药物组合物的某些溶剂包括、但不限于亲脂溶剂和脂肪油，诸如芝麻油，合成的脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯，以及脂质体。
在某些实施方案中，作为疗程的一部分，以治疗有效量施用药物组合物。如在该背景下使用的，“治疗”意指改善或预防要治疗的障碍的至少一种症状或提供有益的生理作用。治疗有效量可以是足以阻止、减少、改善或消除对这样的治疗敏感的疾病或病理学状况的症状的量。在某些实施方案中，治疗有效量是足以改善胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐量、改善瘦素敏感性、降低瘦素水平、增加脂联素水平和/或减少体脂的量。
可以确定药物组合物的剂量、毒性和治疗效果，例如，通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序，例如，用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，且它可以被表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用具有毒性副作用的化合物，但应当小心地设计将这样的化合物靶向到受影响的组织部位的递送系统，以便使对未受感染的细胞的潜在损伤最小化，且由此减少副作用。
从细胞培养测定或动物研究获得的数据可以用于制定一系列用于人类的剂量。如果全身提供药物组合物，那么这样的化合物的剂量优选地在包括ED50又几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。根据所用剂型和所用施用途径，剂量可以在此范围内变化。对于在本文所述方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量以实现循环血浆浓度或在待治疗的局部环境内在一定范围内，该范围包括在细胞培养中确定的IC50(即，达到线粒体断裂的半数最大抑制的试验化合物的浓度)。这样的信息可以用来更准确地确定在人类中有用的剂量。例如，通过与质谱法偶联的液相色谱法，可以测量血浆中的水平。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。例如，治疗量是达到期望的治疗效果的量。该量可以与预防有效量相同或不同，预防有效量是预防疾病或疾病症状的发作所必需的量。有效量可以以一次或多次施用、应用或剂量施用。组合物的治疗有效量取决于所选择的组合物。可以每天一次或多次至每周一次或多次施用组合物；包括每隔一天一次。熟练的技术人员会明白，某些因素可能影响有效地治疗受试者所需的剂量和时机，包括、但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所述的药物组合物对受试者的治疗可以包括单次治疗或一系列治疗。例如，可以每天施用若干份分剂量、一个剂量或循环施用化合物以达到期望的治疗结果。可以施用单一的小分子化合物，或者也可以施用各种小分子化合物的组合。
也可能添加改善药物组合物的溶解度的试剂。例如，根据选择的施用途径，可以用一种或多种辅助剂和/或药学上可接受的载体配制药物组合物。对于口服应用，可以添加明胶、矫味剂或包衣材料。一般而言，对于溶液或乳剂，载体可以包括水溶液或醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物可以包括氯化钠和氯化钾，以及其它。此外，静脉内媒介物可以包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂等。
根据各种实施方案可以使用众多包衣剂。在某些实施方案中，包衣剂是在常规延迟释放口服制剂中充当包衣剂的一种，包括用于肠溶包衣的聚合物。例子包括羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯；HPMCP)；羟丙基纤维素(HPC；诸如
Figure BDA0003736472660000311
)；乙基纤维素(诸如
Figure BDA0003736472660000312
)；和甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯(MAA/MMA；诸如
Figure BDA0003736472660000313
)。
在某些实施方案中，药物组合物还包括至少一种崩解剂以及稀释剂。在某些实施方案中，崩解剂是超级崩解剂。稀释剂的一个例子是填充剂诸如多元醇。在许多实施方案中，组合填充剂和崩解剂，例如PEARLITOL
Figure BDA0003736472660000314
它是甘露醇和玉米淀粉(甘露醇/玉米淀粉)的即用型混合物。根据许多实施方案，当与崩解剂或超级崩解剂偶联时，可以使用任何多元醇填充剂。另外的崩解剂包括、但不限于琼脂、碳酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、海藻酸盐、某些硅酸盐和碳酸钠。合适的超级崩解剂包括、但不限于交聚维酮、交联羧甲纤维素钠、AMBERLITE(Rohm和Haas,Philadelphia,Pa.)和淀粉羟乙酸钠。
在某些实施方案中，稀释剂选自甘露醇粉末、喷雾干燥的甘露醇、微晶纤维素、乳糖、磷酸二钙、磷酸三钙、淀粉、预胶化淀粉、可压缩的糖、硅化微晶纤维素和碳酸钙。
在某些实施方案中，药物组合物进一步利用其它组分和赋形剂。例如，甜味剂、矫味剂、缓冲剂和增味剂，以使剂型更可口。甜味剂包括、但不限于果糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、三氯蔗糖、糖精、阿司帕坦、乙酰舒泛钾和纽甜(neotame)。可以包含在本文所述制剂中的常见矫味剂和增味剂包括、但不限于麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。
在某些实施方案中，药物组合物还包括表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自吐温80、月桂基硫酸钠和多库酯钠。
在某些实施方案中，药物组合物进一步利用粘合剂。在某些实施方案中，粘合剂选自聚维酮(PVP)K29/32、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙基纤维素(EC)、玉米淀粉、预胶化淀粉、明胶和糖。
在某些实施方案中，药物组合物还包括润滑剂。在某些实施方案中，润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸钙、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、聚乙二醇4000-6000、滑石粉和山嵛酸甘油酯。
也可能存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。(参见通常，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack,(1980)，其公开内容通过引用并入本文)
治疗模式
在某些实施方案中，作为代谢障碍的疗程的一部分，以治疗有效量施用化合物。如在该背景下使用的，“治疗”意指改善或预防待治疗的代谢障碍的至少一种症状或提供有益的生理作用。例如，症状的改善可以是胰岛素敏感性的改善、葡萄糖耐量的改善、瘦素敏感性的改善、瘦素水平的降低和脂联素水平的增加，以及肝脂肪变性的降低和/或体脂的减少。
许多实施方案涉及治疗个体的代谢障碍。因此，治疗个体的一个实施方案如下：
(i)诊断或确定个体患有代谢障碍
(ii)给所述个体施用鞘脂样化合物、ARF6拮抗剂和/或PIKfyve拮抗剂
在某些实施方案中，待治疗的个体已被诊断为患有代谢障碍。代谢障碍包括(但不限于)肥胖、代谢综合征、高血糖症、II型糖尿病、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和肝脂肪变性(例如，非酒精性肝脂肪变性(NASH))。
治疗有效量可以是足以预防减少、改善或消除对这种治疗敏感的疾病或病理学状况的症状的量，例如胰岛素不敏感性、葡萄糖耐受不良、瘦素不敏感性、高瘦素血症、低血浆脂联素水平、肝脂肪变性和/或肥胖。在某些实施方案中，治疗有效量是足以拮抗线粒体断裂的量。
减轻线粒体断裂的方法
在某些实施方案中，使生物细胞与化合物接触以减轻、预防和/或逆转线粒体断裂。在某些实施方案中，待接触的生物细胞是经历线粒体断裂的细胞。在某些实施方案中，生物细胞与代谢障碍相关，包括(但不限于)肥胖、代谢综合征、高血糖症、II型糖尿病、胰岛素抵抗、瘦素抵抗、高瘦素血症和肝脂肪变性(例如，非酒精性肝脂肪变性(NASH))。
许多实施方案涉及治疗生物细胞以减轻、预防和/或逆转线粒体断裂。因此，治疗生物细胞的一个实施方案如下：
(i)提供经历线粒体断裂的生物细胞
(ii)使所述生物细胞与鞘脂样化合物、ARF6拮抗剂和/或PIKfyve拮抗剂接触
在某些实施方案中，以1nM至100μM之间的浓度利用用于治疗生物细胞的化合物。在某些实施方案中，以小于1nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM或大于100μM的顺序的浓度利用化合物。
示例性实施方案
生物学数据支持前述鞘脂样化合物在多种实施方案中治疗代谢疾病的用途。鞘脂样小分子实施方案的治疗效果源于其在代谢障碍的人和小鼠细胞以及小鼠模型中的初步研究中证实的生物活性。
实施例1：药物样鞘脂通过逆转神经酰胺诱导的线粒体断裂来纠正肥胖
肥胖已成为一种严重的流行病。根据世界卫生组织，据估计全球13％的成年人在2016年是肥胖的，这一数字自1975年以来几乎翻了三倍。更令人担忧的是儿童肥胖的加速流行。在2016年，全球有超过3.4亿5-19岁的儿童是超重或肥胖的；这些儿童中的大多数最终会变成肥胖的成年人。因为肥胖和有关的共存病是可预防的和过早的死亡的主要原因，这些统计数据反映了惊人的社会和经济负担。虽然日益增长的肥胖流行病的驱动因素是多方面的，但高热量、高脂肪的食物的过度消耗显然会促进。这些高热量饮食与环境和遗传因素协同作用以产生一种慢性正能量平衡，其导致过度多脂症。虽然饮食调整和增加锻炼是任何干预计划的不可缺少的部分，但生活方式的改变已被证明不足以解决大多数患者的肥胖。“少吃多动”方案忽略了阻碍一些患者维持负能量平衡的复杂生理学、心理学和遗传因素。虽然减肥手术对许多患者非常有效，但它也是侵入性的，并且可以伴有严重的并发症。因此，对可以补充生活方式干预并帮助个体克服障碍以成功长期重量减轻的医学疗法存在关键的未满足需求。
FDA批准的减肥药仅略微有效，并且经常受到毒性和副作用困扰。对控制饱腹感和代谢的信号，特别是外周组织和复杂神经回路之间的激素交互作用的增加的理解已经确定了几种可能更适合药理学干预的新靶点。激素瘦素的发现是特别令人兴奋的，提供了通过调节瘦素信号传递来治疗肥胖的希望。尽管瘦素的药理学施用在患有瘦素缺乏的罕见患者中显著减少了食物摄入并增加了能量消耗，但瘦素本身作为肥胖治疗剂具有有限的潜力。大多数肥胖个体患有高瘦素血症并抵抗外源性瘦素的作用，这种表型已经追溯到线粒体分裂和融合的平衡中的破坏，其导致线粒体网络断裂(C.A.Galloway和Y.Yoon,Antioxid.Redox Signal.19:415-430,2013；E.Schrepfer和L.Scorrano,Mol.Cell 61:683-694,2016；以及T.Wai和T.Langer,Trends Endocrinol.Metab.27:105-117,2016；其公开内容通过引用并入本文)。克服瘦素抵抗的药剂仍然是一个理想的目标。通过逆转线粒体断裂来恢复瘦素敏感性是一个特别有吸引力的策略，因为胰岛素抵抗和肝脂肪变性也源于过度线粒体分裂(C.A.Galloway,等人,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.307:G632-41,2014；B.M.Filippi,等人,Cell Rep.18:2301-2309,2017；H-F.Jheng,等人,Mol.Cell.Biol.32:309-319,2012；L.Wang,等人,Diabetologia 58:2371-2380,2015；D.Sebastián,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109:5523-5528,2012；其公开内容通过引用并入本文)。预计减少线粒体断裂会降低血浆瘦素水平，有点矛盾的是，这已被证明会改善瘦素敏感性并保护免于饮食诱导的肥胖(S.Zhao,等人,Cell Metab.30:706-719,2019；和G.Mancini,等人,26:2849-2858,2019；其公开内容通过引用并入本文)。总之，医疗设备的库存不足和扩大范围的肥胖流行为开发和试验创新的治疗方案、特别是限制线粒体分裂的药剂提供了强大的动力。
饮食诱导的肥胖造成在增加的C16:0神经酰胺产生的下游线粒体断裂(S.Choi和A.J.Snider,Mediators Inflamm.2015:520618,2015；J.A.Chavez和S.A.Summers,CellMetab.15:585-594,2012；S.A.Summers,B.Chaurasia和W.L.Holland,Nat.Metab.1:1051-1058,2019；P.Hammerschmidt,等人,Cell 177:1536-1552,2019；其公开内容通过引用并入本文)。西方饮食富含饱和脂肪，这导致增加的棕榈酸循环水平，为C16:0神经酰胺合成提供骨架和脂肪酸链。通过删除丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、神经酰胺合酶6(CerS6)或二氢神经酰胺去饱和酶1(DES1)来减少神经酰胺产生，会部分地通过阻止线粒体断裂来保护小鼠免于消耗HFD的负面代谢后果(Z.Li,等人,Mol.Cell.Biol.31:4205-4218,2011；S.M.Turpin,等人,Cell Metab.20:678-686,2014；W.L.Holland,等人,Cell Metab.5:167-179,2007；和B.Chaurasia,等人,Science 365:386-392,2019；其公开内容通过引用并入本文；也参见P.Hammerschmidt,等人,2019，上面引用)。不幸的是，安全地和选择性地靶向这些酶的药物尚不可得。小分子SPT抑制剂多球壳菌素在小鼠中是有效的，但不是可行的治疗剂。鉴于各种神经酰胺异形体的不同结构和所起的信号传递作用，所有六种神经酰胺合酶异形体的总体抑制剂都是差临床候选物。选择性的CerS6抑制剂应当更好地被耐受，并且在HFD饲喂的小鼠中纠正线粒体断裂和代谢功能障碍(S.Raichur,等人,Mol.Metab.21:36-50,2019，其公开内容通过引用并入本文；也参见Hammerschmidt,等人,2019和S.M.Turpin,2014，上面引用)。因为水溶性的、口服可生物利用的合成的鞘脂鞘脂样化合物893在结构上与已建立的CerS抑制剂相关，因此评价了其阻止棕榈酸诱导的C16:0神经酰胺产生和线粒体分裂的能力。鞘脂样化合物893不抑制CerS6，因为它未能阻止C16:0神经酰胺产生(J.Chen,等人,J.Endocrinol.237:43-58,2019；和N.Turner,等人,Nat.Commun.9:3165,2018；其公开内容通过引用并入本文)。但是，它确实提供免于神经酰胺和棕榈酸诱导的线粒体断裂的稳健保护，并因此被评价为HFD饲喂的小鼠的干预剂。
鞘脂样化合物893保护免于神经酰胺诱导的线粒体断裂
消耗HFD的小鼠会经历循环棕榈酸的增加，所述棕榈酸转化为C16:0神经酰胺，从而引发线粒体断裂，其导致肥胖的许多负面代谢后果(M.Schneeberger,等人,Cell 155:172-187,2013；和M.E.Smith,等人,Biochem.J.456:427-439；其公开内容通过引用并入本文；也参见,H-F.Jheng,等人,2012；B.M.Filippi,等人,20107；Hammerschmidt,等人,2019；L.Wang,等人,2015；和D.Sebastián,等人,2012；上面引用)。合成的鞘脂鞘脂样化合物893和抑制神经酰胺合酶的化合物之间的结构相似性提示评价鞘脂样化合物893是否限制棕榈酸暴露的细胞中的神经酰胺产生和线粒体分裂。鼠胚胎成纤维细胞(MEF)具有高度管状的线粒体网络，这简化了增加的线粒体分裂的检测。通过在高分辨率显微镜下检查柠檬酸合成表达来评估线粒体形态。具体来说，评估了线粒体的宽高比、分支长度和圆度(图1)。正如预期的那样，棕榈酸补充增加了C16:0神经酰胺水平并在MEF中产生了显著的线粒体断裂(图2-4)。用SPT抑制剂多球壳菌素或一般神经酰胺合酶抑制剂伏马菌素B1阻断神经酰胺产生会阻止棕榈酸诱导的形态变化，从而维持线粒体小管长度(宽高比和分支长度)并阻止线粒体圆度的增加。与神经酰胺合成的这些抑制剂一样，鞘脂样化合物893在棕榈酸处理的细胞中保留了管状的、分支的线粒体网络(图2-4)。但是，鞘脂样化合物893维持线粒体形态，而不阻断棕榈酸诱导的神经酰胺产生(图3)。实际上，鞘脂样化合物893对线粒体动力学的影响位于神经酰胺产生的下游，因为鞘脂样化合物893也阻断神经酰胺诱导的线粒体断裂(图5和6)。从机制上讲，鞘脂样化合物893阻止介导分裂的GTP酶DRP1响应于棕榈酸向线粒体膜的募集，而不影响DRP1蛋白表达水平(图7A)。鞘脂样化合物893钝化(inactivate)ARF6和PIKfvye。与此一致，NAV-2729(ARF6的一种抑制剂)和YM201636(PIKfyve的一种抑制剂)提供免于棕榈酸诱导的线粒体断裂的部分保护(图7B和7C)。此外，YM201636阻止了DRP1募集。因此，鞘脂样化合物893通过阻断DRP1募集来维持管状线粒体网络，很可能是在ARF6和PIKfyve灭活的下游。总之，合成的鞘脂样化合物893可能通过钝化ARF6和PIKfyve，阻断神经酰胺诱导的DRP1向线粒体募集来阻止在神经酰胺合成下游的棕榈酸诱导的线粒体断裂。
在小鼠中进行的遗传研究提示，阻止线粒体断裂的小分子可能在肥胖患者中具有显著的治疗价值(A.Santoro,等人,Cell Metab.25:647-660,2017，其公开内容通过引用并入本文；也参见L.Wang,等人,2015；D.Sebastián,等人,2012；和M.Schneeberger,等人,2013；上面引用)。Mdivi-1已被广泛用作DRP1GTP酶的抑制剂，并已在肥胖模型中进行了评价。Mdivi-1会减少棕榈酸或神经酰胺处理的C2C12肌管中的ROS产生，适度改善胰岛素抵抗，而不影响ob/ob小鼠中的葡萄糖清除，恢复HFD饲喂的大鼠中胰岛素介导的肝葡萄糖产生的抑制，并减缓db/db小鼠中糖尿病肾病的进展。但是，令人信服的证据表明，mdivi-1在肥胖模型中的有限益处源于线粒体复合物I抑制，而不是DRP1钝化。事实上，来自两个不同供应商的mdivi-1未能阻止C16:0神经酰胺诱导的线粒体断裂，即使在延长的预温育以后或当与小分子线粒体融合启动子M1组合时(图8)。虽然南蛇藤醇使对瘦素敏感并保护免于HFD诱导的肥胖，但它不能保护免于棕榈酸诱导的线粒体分裂，而是作为单一药剂引发严重的线粒体断裂。细胞渗透性肽抑制剂P110阻止DRP1与线粒体外膜上的FIS1相互作用。虽然鞘脂样化合物893仅在1小时后有效，但P110需要延长的预处理以阻止C16:0神经酰胺诱导的线粒体断裂。类风湿性关节炎治疗剂来氟米特是唯一获得FDA批准的被证实促进线粒体融合的药物。与其作用机制即线粒体融合因子MFN1和MFN2的转录诱导一致，来氟米特在24小时而不是1小时的预温育以后阻断了C16:0神经酰胺诱导的线粒体断裂。此外，尽管已经报道来氟米特促进KRAS突变癌细胞中的线粒体融合(M.Yu,等人,JCI Insight.5:e126915,2019,其公开内容通过引用并入本文)，但其作用是背景依赖性的，因为它不会逆转表达致癌KRASG12D的A549肺癌细胞中的线粒体断裂(图9)。相反，鞘脂样化合物893在A549肺癌细胞和KRAS G12D敲入的MEF中迅速纠正了KRAS介导的线粒体分裂(图10)。此外，神经酰胺合酶抑制剂多球壳菌素或伏马菌素B1不会增加A549细胞中的线粒体管状结构，这表明鞘脂样化合物893响应于除神经酰胺以外的信号而对抗线粒体分裂。总之，这些实验表明，鞘脂样化合物893比以前报道的调节线粒体动力学的化合物更有效、更有力和/或更快速地起作用。
鞘脂样化合物893保护免于HFD诱导的线粒体断裂
为了确定鞘脂样化合物893是否也保护免于体内神经酰胺诱导的线粒体断裂，对一组群(cohort)饮食诱导的肥胖小鼠进行了分析。给雄性C57BL/6J小鼠饲喂45％千卡脂肪啮齿动物饮食(HFD)或标准食物饮食(10％千卡脂肪)22-26周。使用NADH/NADPH自发荧光和共焦显微术在来自媒介物或鞘脂样化合物893处理的小鼠的新鲜切除肝脏中对比了线粒体形态。当评价线粒体形态时，光学显微术与电子显微术相比具有两个显著优点：1)线粒体网络的3D结构很明显，和2)可以使用图像分析软件在大量细胞中以自动化和无偏倚方式对线粒体形状进行定量测量(图11)。此外，评价完整的、存活的线粒体的形态会避免由组织处理或冗长的肝细胞分离程序引入的伪像。因为肝线粒体的形态在昼夜周期内变化，将媒介物和鞘脂样化合物893处理的小鼠在ZT13和ZT17之间成对处死，这是预计线粒体在HFD饲喂的小鼠中最大程度破碎的时间范围。基于鞘脂样化合物893的药代动力学(tmax＝4h，t1/2＝10.6h，图12)，在ZT8.5(黑暗期开始前3.5h)对动物进行处理。通过经口管饲法以120mg/kg施用鞘脂样化合物893，这基于先前的研究，其表明该剂量抑制肿瘤生长并减少氨基酸依赖性的mTORC1信号传递，而无毒性，如通过血液化学、全血细胞计数以及肝脏和小肠组织学所评估的(S.M.Kim,等人,J.Clin.Invest.126:4088-4102,2016，其公开内容通过引用并入本文)。长期维持在HFD的小鼠的肝脏中的线粒体比饲喂SD的小鼠的肝脏中的线粒体更大且更呈球形(图13)。在ZT8.5给初治的、HFD饲喂的小鼠施用单次口服剂量的120mg/kg鞘脂样化合物893导致肝线粒体的形态的显著变化，增加其管状(增加的宽高比)并减少它们的圆度以匹配饲喂标准食物的对照。鞘脂样化合物893没有显著改变消耗SD的瘦小鼠的肝线粒体形态。因此，鞘脂样化合物893敏锐地纠正肥胖的、HFD饲喂的小鼠的肝脏中的异常线粒体形态。
阻止肝脏中的线粒体分裂会提高饮食诱导的肥胖小鼠的胰岛素敏感性，而阻断降低食欲的下丘脑POMC神经元中的分裂会通过恢复瘦素敏感性来减少食物摄入(A.Santoro,等人,2017；和M.Schneeberger,等人,2013，上面引用)。为了确定鞘脂样化合物893在下丘脑中是否也有效，在图13中评价的相同小鼠的大脑中评估了线粒体形态。由于移出器官所需的时间增加，通过免疫荧光显微术而不是通过NADH/NADPH自发荧光在固定组织中可视化脑线粒体。与同样HFD饲喂的小鼠的肝脏中的异常线粒体形态一致，柠檬酸合酶染色显示在下丘脑和大脑皮质中的圆形肿胀线粒体(图14)。鞘脂样化合物893逆转了检查的4只动物中的3只的脑中的这些HFD诱导的线粒体形态的变化(图14)。具有断裂的脑线粒体的鞘脂样化合物893处理的动物是最后一只被评价的动物，其表明与结果均一的肝脏相比，脑中的鞘脂样化合物893水平可能更低和/或更快速地下降(图13和14)。总之，口服地施用的鞘脂样化合物893敏锐地逆转病理性的、HFD诱导的多种组织中的线粒体形态的变化，所述变化在维持代谢体内稳态中起关键作用。
蛋白Mfn2在介导线粒体融合中起核心作用。这种蛋白从各种组织中的遗传缺失会导致影响深远的线粒体断裂，这与在饮食诱导的肥胖中观察到的情况相似(G.Mancini,等人,2019，上面引用)。在小鼠模型中，Mfn2从成熟脂肪细胞的缺失足以产生肥胖。脂肪细胞中的这种线粒体断裂导致显著升高的瘦素产生和血浆脂联素的减少，从而导致增加的食物摄入。有趣的是，最近证实降低但不消除肥胖小鼠中的瘦素水平会通过移除瘦素信号传递的反馈抑制来改善对瘦素的应答(S.Zhao,等人,2019，上面引用)。在饮食诱导的鼠肥胖模型中，使用针对瘦素的中和抗体证实了瘦素减少在治疗肥胖中的潜在治疗价值。与其减少体内多个组织中的线粒体断裂的能力一致，893减少了通过体内脂肪细胞的瘦素产生。因此，893代表了一种治疗性地降低肥胖患者中的瘦素水平的策略，以恢复对这种抗肥胖激素的敏感性。
鞘脂样化合物893在消耗HFD的小鼠中恢复正常体重和多脂症
鉴于其在体内纠正HFD诱导的线粒体断裂的能力，鞘脂样化合物893被评价为饮食诱导的肥胖的介入疗法。给六周龄雄性C57BL/6J小鼠饲喂HFD 45天；在整个研究过程中，将一组群的年龄匹配的对照小鼠维持在SD上。45天后，HFD饲喂的小鼠的平均体重为食物饲喂的小鼠的体重的大约130％(图15-17)。使用定量核磁共振成像，脂肪质量占已经消耗HFD45天的小鼠的体重的21％，而在饲喂标准饮食的对照组中，脂肪质量占体重的12％；瘦体重的变化幅度较小(图17)。在此时，HFD饲喂的小鼠被随机指定通过管饲法接受媒介物(水)、60mg/kg或120mg/kg鞘脂样化合物893；用媒介物处理SD小鼠。基于在黑暗周期(ZT12-ZT24)期间小鼠活动增加和口服地施用的鞘脂样化合物893的血浆药代动力学(参见图12)，在星期一、星期三和星期五在ZT8.5处理小鼠。虽然媒介物处理的HFD组如预期的那样继续增加重量，但用60mg/kg或120mg/kg鞘脂样化合物893处理的小鼠表现出剂量依赖性的重量减轻，尽管继续消耗HFD(图16)。在接受120mg/kg鞘脂样化合物893的组中，10天后重量减轻的速率减慢。2周(6剂量鞘脂样化合物893)后，进食HFD并用120mg/kg鞘脂样化合物893处理的小鼠的体重与连续饲喂标准食物饮食的小鼠的体重不再有统计学差异(图15和16)；60mg/kg组不再增加重量，但与食物饲喂的对照不匹配。尽管继续用高剂量的鞘脂样化合物893处理，但一旦体重与SD对照的体重相匹配，重量减轻就会趋于稳定(图16和18)。在鞘脂样化合物893处理的小鼠中大部分剂量依赖性的重量减轻是由于脂肪质量下降，而瘦质量几乎没有变化，表明总体身体组成得到改善(图15、19和20)。用60mg/kg鞘脂样化合物893处理的小鼠以与饲喂标准饮食的小鼠相似的速度增加脂肪质量(图19)，表明该剂量足以阻止由HFD饲喂引起的多脂症。正如之前所报道，当给小鼠每周给药5-7天持续11周时(S.M.Kim,等人,2016，上面引用)，鞘脂样化合物893被良好耐受，并且鞘脂样化合物893处理的小鼠的行为在整个研究过程中是明显正常的。这些结果指示，尽管连续饲喂HFD，鞘脂样化合物893恢复了以前肥胖小鼠的正常多脂症和体重。
锻炼可以减轻营养过度的负面效应。当给小鼠提供跑轮时，小鼠每晚会自愿跑2-10km，减缓通常伴随HFD饲喂的体重和脂肪增加并改善代谢状态。为了测定鞘脂样化合物893对自愿锻炼的影响的基准并确定这些干预措施的有益效果是否是累加性的，单独圈养了16只已经饲喂HFD 7周的雄性C57BL/6J小鼠，提供跑轮，并随机分配以在星期一/星期三/星期五时间表接受媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893。啮齿动物的跑步活动在应激下会下降，并且监测自愿轮式跑步的持续时间和距离也会提供对小鼠的整体健康的全面衡量。在实验过程中，接受媒介物的HFD饲喂的小鼠平均每天跑2.8±0.7km的距离，该值与鞘脂样化合物893处理组(2.8±1.2km)没有显著差异。在媒介物和鞘脂样化合物893处理组中，每天花在跑轮上的平均时间也相当。在给定的一天，各组之间的锻炼活动通常非常匹配，表明每天的活动差异可能与环境中不受控制的变化有关。正如预期的那样，自愿锻炼导致维持在HFD的媒介物处理的小鼠的重量减轻，其在干预的第一周后趋于平稳(图15、21和22)。接受媒介物并配备跑轮的HFD饲喂的小鼠表现出的体重减轻与维持在正常笼养中的鞘脂样化合物893处理的小鼠相似。与单独使用任一种处理观察到的结果相比，提供有跑轮并用鞘脂样化合物893处理的小鼠表现出甚至更大的重量减轻。轮式跑步减少了所有组中的脂肪质量，同时保持了所有组中的瘦质量(图15、22和23)。总之，这些结果证实，鞘脂样化合物893降低多脂症和体重的程度与自愿锻炼相当，并且还与自愿锻炼累加，并证实鞘脂样化合物893对体重的影响与发病率或不适感无关。
鞘脂样化合物893纠正与HFD饲喂相关的代谢缺陷
长期营养过度会导致在肌肉和肝脏中的毒性脂质积累(脂毒性)。过多的肝脏脂质积累最终可以导致肝纤维化和炎症(非酒精性脂肪性肝炎)和癌症。正如预期的那样，维持在HFD的媒介物处理小鼠的肝脏积累过量。引人注目的是，用120mg/kg鞘脂样化合物893的处理消除了HFD饲喂的小鼠中的肝脂肪变性。无偏倚脂质组学分析揭示，在HFD的肝脏中积聚的大多数脂质是三酰基甘油。神经酰胺，特别是肝脏中的C16:0神经酰胺和肌肉中的C18:0神经酰胺，也会随着HFD饲喂而增加，并促进伴随饮食诱导的肥胖的胰岛素抵抗(S.M.Turpin-Nolan,等人,Cell Rep.26:1-10.e7,2019；N.Turner,等人,Diabetologia56:1638-1648,2013；和M.K.Montgomery,等人,Biochim.Biophys.Acta 1861:1828-1839,2016；其公开内容通过引用并入本文；也参见S.M.Turpin,等人,2014；N.Turner,等人,2018；和W.L.Holland,等人,2007；上面引用)。在HFD饲喂的小鼠中观察到肝脏C16:0神经酰胺和肌肉C18:0神经酰胺水平升高的趋势(图21)。用鞘脂样化合物893处理HFD饲喂的小鼠4周，会恢复肝脏中的正常甘油三酯和神经酰胺水平，且肌肉中的神经酰胺水平趋于较低。因此，与表明阻断线粒体分裂可以纠正肝脂肪变性的遗传学研究(L.Wang,等人,2015；和D.Sebastián,等人,2012；上面引用)一致，鞘脂样化合物893逆转了HFD饲喂的小鼠中毒性脂质物种的积累。
胰岛素抵抗是代谢综合征的标志。神经酰胺通过诱导线粒体断裂、但也通过减少AKT磷酸化并因此减少GLUT4易位至质膜来破坏胰岛素依赖性的信号传递。尽管鞘脂样化合物893具有神经酰胺的活化蛋白磷酸酶2A(PP2A)的能力，但鞘脂样化合物893不会降低AKT活性(P.Kubiniok,等人,Mol.Cell Proteomics 18:408-422,2019，其公开内容通过引用并入本文；也参见,S.M.Kim,2016，上面引用)。事实上，神经酰胺(但不是鞘脂样化合物893)干扰了3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的AKT活化(图25)。与该结果一致，AKT抑制剂MK-2206(但不是鞘脂样化合物893)阻碍了脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取(图26)；鞘脂样化合物893减少了成纤维细胞中的组成性葡萄糖摄取，如给定的鞘脂样化合物893的下调GLUT1的能力所预期的(图26)(G.G.Guenther,等人,Oncogene 33:1776-1787,2014，其公开内容通过引用并入本文)。线粒体形态的正常化而没有AKT抑制表明，用鞘脂样化合物893处理可能恢复维持在HFD的小鼠中的胰岛素敏感性。用HFD饲喂12周的媒介物处理的小鼠表现出预期的空腹高血糖症(图27)。但是，每周三天用120mg/kg鞘脂样化合物893处理持续25天，会使HFD饲喂的小鼠中的空腹葡萄糖和葡萄糖处置正常化，如口服葡萄糖耐量试验(OGTT)所证明的(图27)；60mg/kg剂量产生中间效应。总之，与HFD饲喂的小鼠的肝脏中的正常线粒体形态的恢复一致，在4周内12剂量的120mg/kg鞘脂样化合物893完全纠正了与连续HFD饲喂相关的肝脏脂质积累、空腹高血糖症和胰岛素抵抗。
鞘脂样化合物893通过减少食物摄入来增加体脂分解代谢
为了检查鞘脂样化合物893对全身代谢的影响，进行了间接测热法。将雄性C57BL/6J小鼠维持在SD或HFD上10-12周，适应模拟家庭环境的代谢笼，并然后在ZT8.5通过管饲法用媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893处理。产生的CO2量与消耗的O2量之间的比率(换气比值(RER))反映了相对全身燃料底物利用，接近0.7的值表示主要利用脂肪，且1.0的值表示碳水化合物是主要燃料来源。正如预期的那样，相对于SD对照，在HFD饲喂的小鼠中，RER值在光照和黑暗周期均较低，并且底物利用的昼夜波动减弱(图29和30)。用鞘脂样化合物893的处理降低了HFD和SD饲喂的小鼠中的RER。与鞘脂样化合物893的药代动力学性能(参见图12)一致，RER在鞘脂样化合物893处理后24小时恢复到对照值(图28和29)。动物对在第一次处理后48小时给出的用鞘脂样化合物893的第二次处理有类似的应答。与RER的明显降低相反，使用Weir公式计算的能量消耗不受鞘脂样化合物893显著影响。考虑到媒介物和鞘脂样化合物893处理的小鼠等效使用跑轮，通过XY光束中断测量的活动减少趋势可能与食物寻求行为减少有关。总之，间接测热法揭示，鞘脂样化合物893增加了脂肪的利用，而不会显著影响活动或能量消耗。
进行了进一步评估以确定在用鞘脂样化合物893处理的HFD饲喂的小鼠中循环的瘦素水平。给小鼠饲喂HFD 4周，并随机分为具有相同平均重量的两组。在ZT8.5用水(n＝7)或120mg/kg 893(n＝8)给小鼠管饲。对经处理与未经处理的动物成对在ZT15-18之间从隐静脉采集血液，并使用ELISA(CrystalChem,目录号90030)测量血清中的瘦素水平。鞘脂样化合物893处理的动物具有降低的循环瘦素水平(图30)。
如果鞘脂样化合物893处理的动物正在减轻重量但没有消耗更多能量，那么代谢活跃的组织必须可获得更少的卡路里。逆转下丘脑中的线粒体断裂(参见图14)和降低循环瘦素水平(参见图30)应该会抑制食欲。事实上，在代谢笼中的连续监测揭示，鞘脂样化合物893减少了食物摄入(图31和32)。这种趋势在饲喂SD的小鼠中和在HFD维持10-12周的小鼠中都是明显的，尽管这种效果在HFD组中更显著。当在维持在HFD上22周的小鼠中重复这些研究时，食物摄入的抑制和体重减轻似乎增加(图33)。为了确定食物消耗的减少是否足以解释鞘脂样化合物893对RER的抑制，进行了配对饲喂(paired feeding)研究。在ZT12和ZT24之间给未处理的HFD饲喂的小鼠仅提供减少量的鞘脂样化合物893处理的小鼠所吃的食物，导致RER的等效降低(图34)。与该结果一致，通过在ZT12用液体饮食管饲食物饲喂的小鼠来使食物摄入正常化会消除鞘脂样化合物893对RER的影响，所述液体饮食含有瘦的媒介物对照小鼠在ZT12-ZT15消耗的卡路里数目。当在ZT17恢复向固体食物的获取时，再次观察到RER降低的趋势。当在早晨(在ZT2)而不是在下午(在ZT8.5)施用时，鞘脂样化合物893仍然减少食物摄入和RER，尽管在光照阶段没有达到统计显著性，最可能因为当小鼠不活动且食物摄入量低时鞘脂样化合物893水平达到峰值。因此，鞘脂样化合物893处理的小鼠中降低的RER可能源自降低的碳水化合物可用性和增加的对脂肪储存的利用，而不是源自如何代谢饮食组分中的主要变化。
瘦素由脂肪细胞按其甘油三酯含量成比例分泌，当外周能量储存已满且食物消耗应减少时，向中枢神经系统发出信号。在HFD饲喂的小鼠中，多脂症的慢性增加导致循环瘦素的升高，而食物摄入没有伴随减少，这种状态被称为瘦素抵抗。降低血液中的瘦素水平会恢复下丘脑中的瘦素信号传递(S.Zhao,等人,2019，上面引用)。因此，鞘脂样化合物893应当作为瘦素敏化剂起作用。为了试验这个模型，将18周龄瘦雄性C57BL/6J小鼠在ZT8.5用次优剂量的重组瘦素进行腹膜内处理，并在接下来的18小时内测量食物摄入和体重。正如预期的那样，2mg/kg瘦素的外周施用不足以减少这些小鼠中的食物摄入或体重(图35)。与代谢笼研究一致，鞘脂样化合物893处理在维持在标准笼中的食物饲喂的小鼠中产生了减少食物摄入和体重的趋势(图35)。有趣的是，将无效剂量的瘦素与鞘脂样化合物893组合足以产生食物摄入和体重的统计上显著的降低。总之，在鞘脂样化合物893处理的小鼠中食物摄入的减少与下丘脑中线粒体断裂的逆转一致，且部分可能是由于当血浆瘦素水平降低时降低食欲的POMC神经元对瘦素的重新敏化。
线粒体断裂驱动HFD饲喂的小鼠而非瘦素缺陷型小鼠中的代谢功能障碍
为了更严格地评估瘦素在鞘脂样化合物893的抗致胖效应中的作用，测量了瘦素缺陷型ob/ob小鼠对鞘脂样化合物893的应答。正如预期的那样，ob/ob小鼠在UniversityLab Animal Resources提供的标准食物饮食(16％千卡脂肪)下过度进食并变得肥胖。一旦ob/ob动物达到与HFD饲喂24周的C57BL/6J小鼠相当的体重，就将它们用于实验中(图36)。即使在没有瘦素的情况下，鞘脂样化合物893也会减少食物摄入(图36)。但是，鞘脂样化合物893处理的ob/ob小鼠仍然比处理过的野生型、HFD饲喂的对照消耗更多的食物，这提示瘦素在鞘脂样化合物893的降低食欲的作用中发挥作用(图36)。惊人的是，使用鞘脂样化合物893的重复给药未能像在野生型小鼠中那样在ob/ob小鼠中产生重量减轻。虽然在2周内6剂量的120mg/kg鞘脂样化合物893将HFD饲喂的野生型小鼠的体重减少了10％(图16)，但鞘脂样化合物893处理的ob/ob小鼠在相同时间间隔内表现出5％的重量增加(图37)。此外，鞘脂样化合物893的重复给药仅导致ob/ob小鼠的累积食物摄入的适度减少(图38)。鞘脂样化合物893在缺乏瘦素的小鼠中也未能如鞘脂样化合物893在HFD饲喂的野生型小鼠中所做的那样(参见图27)纠正空腹高血糖症或恢复葡萄糖耐量(图38)。总之，鞘脂样化合物893略微减少了食物摄入，但未能像在HFD饲喂的野生型动物中所做的那样在瘦素缺陷型ob/ob小鼠中产生重量减轻或纠正与肥胖相关的代谢缺陷。
这些研究证实，与据报道调节线粒体形态的其它药剂相比，合成的鞘脂样化合物893更有效地、更有力地和/或更快速地响应于神经酰胺和其它信号而阻止线粒体断裂。为了保持其稳健的体外作用和有利的药理学性能，鞘脂样化合物893在单剂量后敏锐地恢复了HFD饲喂的小鼠中的正常线粒体形态，增加了宽高比并降低了圆度(在肝脏和脑线粒体中)。这些对线粒体形状的影响足以解释在消耗HFD并用鞘脂样化合物893处理的小鼠中观察到的一系列有益结果：血浆瘦素减少、食物摄入减少、葡萄糖耐量改善和肝脂肪变性消退。通过删除Mfn2来触发脂肪细胞中的线粒体断裂足以升高瘦素水平、增加食物摄入并诱导肥胖。因此，893可能通过增加白色脂肪细胞中的线粒体管状结构来纠正肥胖小鼠中的高瘦素血症。通过删除DRP1或表达显性负效DRP1突变体来限制肝脏中的线粒体分裂会增加胰岛素敏感性，减少重量增加，并纠正HFD饲喂的小鼠的肝脂肪变性。相反，通过降低线粒体融合因子MFN2的表达来促进肝脏中的线粒体分裂会导致胰岛素抵抗。通过删除DRP1或过表达MFN2来阻断降低食欲的POMC神经元中的线粒体分裂会造成对瘦素敏感并减少食物摄入。相反，通过敲除MFN2促进POMC神经元中的分裂会产生瘦素抵抗和食欲过盛。鞘脂样化合物893减少SD饲喂的小鼠的食物摄入的发现也与公开的研究一致，所述研究表明，从POMC神经元删除DRP1会限制线粒体动力学基本不受干扰的食物饲喂的小鼠的食物摄入。因此，893在脂肪细胞、肝脏、脑和可能的其它代谢组织中对抗线粒体分裂的能力足以解释其在HFD饲喂的小鼠中的有益效果。
鞘脂样化合物893未能在ob/ob小鼠中产生重量减轻或改善葡萄糖处理(glucosehandling)，这提供了有利于线粒体作用机制的额外证据；尽管C16:0神经酰胺水平升高，但这些瘦素缺陷型小鼠具有超管状(hypertubulated)线粒体。这一发现可能通过瘦素缺乏造成的饥饿样状态和饥饿促进线粒体融合的能力来解释。鞘脂样化合物893处理的ob/ob动物中食物摄入的轻度减少必然与瘦素无关，但仍与提出的线粒体作用机制一致。还预计脂肪细胞中的线粒体管状结构会增加脂联素(一种降低食欲的激素)的分泌。此外，线粒体断裂会降低多种组织中的胰岛素敏感性。像瘦素一样，葡萄糖和胰岛素会触发POMC神经元分泌αMSH；抑制线粒体分裂可能会使降低食欲的POMC神经元对胰岛素和/或葡萄糖以及瘦素敏感。尽管在肥胖和糖尿病患者中的研究经常测量线粒体功能而不探究线粒体形态，但增加的线粒体分裂已经与人类以及小鼠中增加的多脂症和代谢功能障碍相关联。对MFN2中的错义突变纯合的患者具有断裂的球形脂肪细胞线粒体和明显的上身脂肪组织过度生长综合征。在II型糖尿病患者的胰腺β细胞中也已经观察到大的圆形线粒体。总之，鞘脂样化合物893的逆转线粒体断裂的能力足以解释其对HFD饲喂的小鼠的体重和代谢的有益影响。
调节线粒体功能的治疗剂受到高度追捧。虽然先前已经报道了改变线粒体形态的药剂，但鞘脂样化合物893在体外更有效、更有力和/或更快速地起作用，并且鞘脂样化合物893完全纠正了HFD饲喂的小鼠中的肥胖和代谢功能障碍。正如其它人所报道并且与我们的发现一致，mdivi-1不会直接钝化哺乳动物DRP1。虽然据报道将mdivi-1与假定的融合启动子M1组合会在T细胞中产生更多的管状线粒体网络，但单独或联合使用的化合物都不能阻止神经酰胺或KRAS诱导的线粒体断裂。与对线粒体动力学的影响的这种缺乏相一致，mdivi-1在肥胖模型中的益处具有有限的范围，并且尚未报道食物摄入的减少。如mdivi-1一样，糖尿病治疗剂二甲双胍是线粒体复合物1抑制剂，并且mdivi-1的益处可能与这种活性有关，而不是与线粒体动力学的变化有关。模拟DRP1中的假定蛋白-蛋白相互作用结构域的肽P110确实阻止了神经酰胺诱导的线粒体断裂，但只有在延长时间的温育之后。尽管已在神经变性疾病的小鼠模型中试验了P110，但没有公开的报告记录在肥胖模型中的活性。即使P110的药代动力学性能证明足以保护免于HFD，考虑到肽药物必须在胃肠外施用并且可能需要长期治疗，口服可生物利用的小分子如鞘脂样化合物893可能具有作为肥胖治疗剂的优越价值。口服活性的、经FDA批准的上调MFN2的抗炎药来氟米特也在体外阻断神经酰胺诱导的线粒体断裂。但是，来氟米特的效力比鞘脂样化合物893低10倍，需要延长预温育时间，而且其效果更依赖于环境(例如图9)。此外，对于mdivi-1，来氟米特在肥胖小鼠中的适度治疗价值可能与对线粒体动力学的影响无关。来氟米特对葡萄糖代谢的影响在ob/ob中比在HFD饲喂的小鼠中更显著，而本文描述的结果清楚地表明，鞘脂样化合物893在HFD饲喂的动物中更有效。来氟米特通过抑制二氢乳清酸脱氢酶上调MFN2，并且其对线粒体形态的影响可以通过尿苷补充(其允许通过补救途径合成嘧啶)来逆转。在肥胖小鼠中，用尿苷补充没有破坏来氟米特对葡萄糖代谢的影响，这表明了另一种作用机制。最后，来氟米特未能如对逆转线粒体断裂的药剂所预测的那样在肥胖小鼠中减少食物摄入或体重。值得注意的是，在用来氟米特处理的肥胖小鼠中没有评估线粒体形态。尽管来氟米特已获得FDA批准，但它可能具有严重的毒性。在14名服用该药的类风湿性关节炎患者中出现致死肝衰竭以后，FDA对来氟米特发出黑框警告，表明具有既往肝病的患者不应服用它。用高剂量的鞘脂样化合物893的慢性治疗在其它方面健康的带有肿瘤的小鼠中没有肝毒性，尽管需要评价鞘脂样化合物893在肝病背景下的毒性。总之，该报告将鞘脂样化合物893定义为迄今为止鉴定的最稳健的线粒体分裂抑制剂，并首次证明线粒体断裂的药理学逆转是非常有效的，解决了高瘦素血症，并且在具有HFD诱导的肥胖的小鼠中被良好耐受。
材料和方法
一般动物程序
根据加州大学欧文分校(University of California,Irvine)的机构动物护理和使用委员会进行所有动物实验。在所有实验中使用雄性小鼠。C57BL/6J小鼠(库存号000664)和ob/ob小鼠(库存号000632)购自Jackson Laboratory，并在开始实验前适应7天。将小鼠以4-5只为一组在20-22℃在12:12h光照-黑暗循环下圈养。笼子包含1/8”的玉米芯垫料(7092A,Envigo,Huntingdon,英国)，其富含约6克棉纤维巢(nestlet)(Ancare Corp.,Bellmore,NY)。除非另外指出，否则可以随意获取食物和水。对于HFD研究，8周龄C57BL/6J雄性被随机分配到45％千卡脂肪饮食(HFD；D12451,Research Diets Inc.,NewBrunswick,NJ)或被设计成关于其它组分匹配D12451的10％千卡脂肪饮食(SD；D12450B,Research Diets Inc)。如所指示的，小鼠维持这些饮食直到22周。ob/ob小鼠被饲喂含有16％千卡脂肪的动物饲养所储存饮食(vivarium stock diet)(2020x,Envigo)。将聚丙烯饲管(20g x 38mm；Instech Laboratories Inc.,Plymouth,PA)用于管饲，并在处理前立即浸入1g/ml蔗糖溶液中以诱导唾液分泌。
重量减轻干预研究
将HFD饲喂的小鼠随机分配到实验组，它们在星期一、星期三和星期五通过经口管饲法接受媒介物(水)或60mg/kg或120mg/kg的鞘脂样化合物893。在整个研究过程中，小鼠都被维持在HFD。以相同的时间表用媒介物处理SD组。组大小最初是n＝10；由于管饲失误而被安乐死的60mg/kg组中的一只动物被排除在分析之外，使该组n＝9。除非另外指出，否则所有处理和测量均在ZT8和ZT10之间进行。在星期一至星期五监测体重和食物消耗。每周使用EchoMRITM身体组成分析仪(EchoMRITMCorp.,新加坡)测定活动物的身体组成。将小鼠安乐死，并在处理后4小时收集组织。如有指示，将小鼠禁食6小时。
自愿笼子跑步
为了监测自愿锻炼，将16只小鼠单独圈养在配备跑轮的居住笼中；最初n＝8。每个240mm轮子都附有一块磁体，并将自行车里程表(Sigma BC509,Sigma Sports,Chicago)用于计数轮子转数和在轮子上跑步所花费的时间。通过方程式(转数x跑轮周长＝距离)计算跑的距离。每周清洁轮子并随机重新分配给每个笼子以控制轮子性能的差异。在鞘脂样化合物893处理组中的两只动物由于管饲失误而被安乐死，并被排除在分析之外，导致n＝6。
血糖测量和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
在ZT10进行血糖试验之前，将小鼠禁食6小时。当将鞘脂样化合物893处理与OGTT组合时，在ZT6处理小鼠。一旦使用手持式血糖仪(Prodigy Diabetes Care,Charlotte,NC)并从尾静脉切口采集一滴血确定基线空腹血糖，则用口服葡萄糖溶液(20％w/v在水中，2g/kg体重)对小鼠进行管饲，并在0、15、30、60和120min在一滴尾静脉血中测量血糖。使用Graphpad Prism软件确定曲线下面积。
间接测热法
使用Phenomaster系统(TSE Systems Inc.,Chesterfield,MO)测量代谢参数。将气候室设置为21℃和50％湿度，12:12h光照-黑暗循环。将小鼠单独圈养在室内并在数据收集前适应48小时。每27分钟测量一次VO2、VCO2和食物摄入。使用公式RER＝VCO2/VO2计算换气比值(RER)。使用方程式EE＝1.44(3.941 x VO2+1.106 x VCO2)计算能量消耗。在图12-14的间接量热研究中，将C57BL/6J小鼠在评价前在HFD或SD上维持10-12周，并且所述小鼠未接受过治疗。使用8个代谢笼在4只媒介物和4只鞘脂样化合物893处理的小鼠的组群中对小鼠进行连续评价。在ZT8.5通过管饲法进行处理，在水中以120mg/kg施用鞘脂样化合物893。为了评价早晨处理的效果，在ZT2将媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893施用给标准饮食的18周龄C57BL/6J雄性。还对18周龄C57BL/6J雄性进行了液体饮食实验；在ZT8.5用鞘脂样化合物893处理小鼠，并在ZT11限制食物获取。以1000千卡/L在milli-Q水中制备液体饲料(AIN-76,BioServ,Flemington,NJ)，并在ZT12用400μL(0.4千卡)的饮食对小鼠进行管饲，其对应于大约3小时的标准食物的随意消耗。对于配对饲喂研究，在维持在HFD上22周的小鼠(31周龄)中监测RER超过12小时；在48h洗脱期(wash-out period)后使用配对饲喂的小鼠，并向它们提供在鞘脂样化合物893处理后24小时内进食的平均食物量(92.5mg或0.4千卡)。
将如下的数据排除在这些分析之外。在一个SD组群(4只媒介物和4只鞘脂样化合物893处理的小鼠)的测量期间，检测到参考CO2系统中的泄漏；对O2和CO2数据进行审查，直到泄漏得到纠正(70-74小时)。饲喂和活动测量没有受到影响，仍然进行了分析。偶尔会在笼子的地板上发现未吃掉的食物，从而无法使用料斗传感器准确监测食物摄入。在这些情况下，对于前24h阶段(对于小鼠8(SD+鞘脂样化合物893)和小鼠8(SD+媒介物)，第2和3天；且对于小鼠8(HFD+鞘脂样化合物893)和小鼠1(HFD+媒介物)，第3天)，审查食物摄入数据。由于小鼠移出料斗而引起的传感器故障也导致排除食物摄入数据(小鼠5(SD+媒介物)第2-4天)。在极少数情况下，会出现无意中咽部施用管饲材料。这些小鼠没有被安乐死，但是将来自这些动物的食物摄入、热量测定和活动数据在该事件(在第3天第二次处理以后的小鼠2(HFD+鞘脂样化合物893)和在第1天第一次给药以后的小鼠5(HFD+鞘脂样化合物893))后从分析中排除1周。
居住笼饲喂研究
在监测食物摄入之前，将小鼠单独圈养并使其适应72小时。通过监测料斗中食物的重量来确定食物消耗。在ZT9进行初始食物和体重测量，并在16小时后进行最终测量，以捕捉发生大部分消耗的活动阶段。对在HFD上维持24周的C57BL/6J小鼠(33周龄)或8周龄的ob/ob小鼠进行居住笼饲喂研究。小鼠在ZT8.5通过管饲法接受媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893。对于涉及瘦素的实验，18周龄的SD饲喂的(16％千卡脂肪,2020x,Envigo)C57BL/6J小鼠在ZT8.5通过管饲法接受媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893。在ZT11.5，通过腹膜内注射递送媒介物(20mM Tris-Cl,pH 8.0)或2mg/kg重组小鼠瘦素(498-OB,R&D Systems,Minneapolis,MN)。将相同的8只小鼠在48小时洗脱期后用于所有处理，并按以下顺序施用处理：媒介物、鞘脂样化合物893、瘦素和瘦素+鞘脂样化合物893。由于在管饲期间无意的咽部施用排除了从一只小鼠收集的所有数据，因此n从8减少到7(图5a-d)。从所有分析中排除了一只在食物饮食中没有增加体重的ob/ob小鼠(体重>20％小于同窝仔畜)。用鞘脂样化合物893处理6天后，一只ob/ob小鼠在Echo MRI期间因不明原因死亡；分析了来自这只小鼠的在死亡前的数据。
脂质组学分析
使用改进的MTBE方法(Matyash等人,2008；Abbott等人,2013)，从肝脏和四头肌组织提取脂质。简而言之，将10mg/ml组织使用用液氮蒸汽保持在4℃以下的珠子匀浆器(1.4mm陶瓷)(具有Cryolys冷却单元的Precellys 24匀浆器，Bertin Technologies,Montigny-le-Bretonneux，法国)在冰冷的150mM乙酸铵中匀浆化。由此，将20μl的匀浆化组织添加到含有MTBE和甲醇(3:1v/v，含0.01％BHT)的玻璃小瓶中，并加入10μl的内部标准品溶液，其含有各10μM的：磷脂酰胆碱(PC)17:0/17:0,磷脂酰乙醇胺(PE)17:0/17:0,磷脂酰丝氨酸(PS)17:0/17:0,磷脂酰甘油(PG)17:0/17:0,溶血磷脂酰胆碱(LPC)17:0,溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)14:0,神经酰胺(Cer)d18:1/17:0,二氢鞘磷脂d18:0/12:0,二酰甘油(DAG)17:0/17:0,D5-三酰甘油(TAG)48:0,和胆固醇酯(CE)22:1。在添加1体积冰冷的150mM乙酸铵之前，将样品在4℃旋转过夜。在离心(2000x g,5min)之前彻底涡旋样品以实现相分离。将上层有机相移至新的小瓶中，并在温和加热(37℃)的氮气流下干燥。将干燥的脂质在氯仿:甲醇:水(60:30:4.5v/v/v)中重构，并保持在-20℃直至分析。
使用Dionex Ultimate 3000 LC泵和配备有加热电喷雾电离(HESI)源的QExactive Plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific)通过液相色谱法-质谱法(LC-MS)分析提取的脂质。在Water ACQUITY C18反相柱(2.1x100mm,1.7μm孔径,Waters Corp.,Milford,MA)上使用二元梯度分离脂质，其中流动相A由乙腈:水(6:4v/v)组成，且B由异丙醇:乙腈(9:1v/v)组成。流动相A和B均含有10mM甲酸铵和0.1％甲酸，流速为0.26ml/min，且柱温箱被加热至60℃。源条件如下：在正离子模式和负离子模式下的喷雾电压分别为4.0和3.5kV，毛细管温度为290℃，S透镜RF为50，且辅助气体加热器温度为250℃。氮气用作源气和碰撞气，鞘气和辅助气流速分别设置为20和5(任意单位)。以全扫描/数据依赖性的MS2模式(全扫描分辨率70,000FWHM，最大离子注射时间50ms，扫描范围m/z 200-1500)采集数据，使用10个最丰富的离子进行碰撞诱导解离，使用1.5Da的隔离窗口和15/27eV的归一化阶梯碰撞能量，以17,500的分辨率检测产物离子。使用提取空白开发了背景离子的排除列表，并在分析之前在正离子模式和负离子模式下进行了质量校准，以确保在全扫描模式下5ppm的质量精度。
使用MS-DIAL分析脂质(Tsugawa等人,2015)。使用1x104cps的最小峰高、5ppm的MS1公差和10ppm的MS2公差以及50％的最小识别分数，在正离子模式和负离子模式检测脂质。将识别的峰与0.5min的保留时间公差对齐。将输出的对齐数据使用统计包R从内部标准中扣除背景并量化。使用具有Tukey事后分析的单因素方差分析来识别组之间的差异，其中统计显著性设定在调整的P<0.05。
靶向代谢物定量
通过Pharmaron Corporation(中国北京)进行鞘脂样化合物893的血浆药代动力学分析。使用(T.Kasumov,等人,Anal.Biochem.401:154-161,2010，其公开内容通过引用并入本文)描述的方法并稍作修改，在细胞中定量C16:0神经酰胺水平。将培养的细胞在PBS中洗涤两次，并刮入250μL的HPLC级水中并快速冷冻直至分析时。在分析当天，将样品解冻，并将等分试样用于蛋白定量。对于小鼠肝脏中的C16:0神经酰胺水平，使用机械探针匀浆器(VWR,Radnor,PA)将25mg组织在1ml冰冷的PBS中匀浆化，量化蛋白水平，并将50μl匀浆物用150μl HPLC级水稀释用于C16:0神经酰胺分析。将50ng在乙醇中制备的C17:0神经酰胺(#22532,Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)添加到200μL解冻的细胞悬浮液或肝匀浆物(作为内部标准品，以控制不同的提取效率)；然后加入750μL冰冷的1:2氯仿/甲醇混合物。将样品声处理30分钟，并通过添加各250μL氯仿和HPLC级水诱导相分离。将样品在4℃离心10分钟，并将较低的脂质相转移到干净的试管中。用额外的500μL氯仿重新萃取剩余的蛋白和水层。将脂质相合并，并然后在真空下干燥。将干燥的提取物在分析前立即在100％乙腈中重构。使用配备有Waters ACQUITY BEH C4柱(Waters Corp.)的Waters Micromass QuattroPremier XE通过超高效液相色谱法串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析样品。将样品从60％流动相A(10mM乙酸铵和0.05％甲酸在水中)开始至98％流动相B(60:40乙腈:异丙醇)在3分钟内以线性梯度分离，保持在98％B中1分钟，然后用60％A平衡柱1分钟。将质谱仪在正离子模式下运行，参数如下：锥电压20V，源温度125℃，去溶剂化温度400℃。MS/MS的离子转换通道对于C16:0神经酰胺为538→264，且对于C17:0神经酰胺为552→264，二者的采样间隔时间都为285ms。将从溶解在乙醇中的C16:0神经酰胺(#860516，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)制备的标准曲线用于定量，并在4.1nM-1,000nM范围内呈线性，其中R2为0.98或更大。
细胞培养
将3T3-L1细胞维持在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中直到被诱导分化。如(M.P.Valley,等人,Anal.Biochem.505:43-50,2016，其公开内容通过引用并入本文)所述并稍作修改，使3T3-L1前脂肪细胞分化。简而言之，使前脂肪细胞生长至汇合。2天后，用含有500μM IBMX(I5879,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、1μM地塞米松(D4902,Sigma-Aldrich)、5μg/mL牛胰岛素(I0516,Sigma-Aldrich)和5μM曲格列酮(50-115-0786,ApexBio)的维持培养基诱导细胞。每2-3天更换一次培养基，持续7天。在诱导后第7天，将培养基更换为维持培养基+5μg/mL牛胰岛素。在诱导后第9天，将培养基更换为维持培养基。在诱导后12-14天，使用成熟的脂肪细胞进行所有实验。于2000年从David Tuveson(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor New York，美国)获得具有和不具有Cre介导的STOP盒缺失的LSL-KrasG12D小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在内部(2015年)使用标准技术从C57BL/6小鼠获得p53flox/flox MEF，并通过Cre重组酶的瞬时表达和p53的缺失使其永生化。在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中培养和维持MEF。将A549细胞在含有10％FBS、1％青霉素-链霉素和1％丙酮酸钠的DMEM中培养。在乙醇中制备100mM的棕榈酸(palmitic acid)(ACROS Organics,目录号AC129702500)的储备溶液。将棕榈酸(palmitate)(250μM)在DMEM中在37℃缀合至1％(w/v)不含脂肪酸的牛血清白蛋白(Sigma,A8806)20分钟。对于所有免疫荧光测定，在处理前12-16小时，将8,000个MEF接种到8室载玻片(Cellvis,目录号C8-1.5H-N)中。将细胞用鞘脂样化合物893(5μM在水中)、多球壳菌素(10μM在甲醇中)、伏马菌素-B1(30μM在DMSO中)或南蛇藤醇(500nM在DMSO中)预处理3小时，然后用BSA-缀合的棕榈酸混合物或单独的BSA处理3小时。在将细胞用C2-神经酰胺(50μM在DMSO中)或C16:0神经酰胺(100μM在乙醇中)处理3小时的情况下，将细胞如指示用鞘脂样化合物893预处理1-3小时，用mdivi-1(50μM在DMSO中)处理1小时或24小时，用M1(5μM在DMSO中)处理24小时，用mdivi-1和M1一起处理24小时，用来氟米特(50μM在甲醇中)处理1小时或24小时，或用P110(1μM在水中)处理1小时或12小时。在固定前将LSL或KRASG12D MEF用鞘脂样化合物893(5μM)处理6h。
蛋白质印迹分析
将成熟脂肪细胞血清饥饿16小时，然后在补充有0.2％无脂肪酸BSA的无血清培养基中用媒介物、神经酰胺(50或100μM)或鞘脂样化合物893(5或10μM)处理3h，此后加入100nM胰岛素保持15分钟。为了确定总DRP1蛋白水平，将100,000个MEF接种到6孔板中16小时，用媒介物或鞘脂样化合物893(5μM)预处理3小时，然后在1％BSA+乙醇或BSA-棕榈酸(250μM)中温育3小时。将细胞用冷PBS洗涤一次，然后在含有cOmpleteTM蛋白酶抑制剂(目录号11697498001,Millipore Sigma,St.Louis,MO)和phosSTOPTM磷酸酶抑制剂(目录号4906837001,Millipore Sigma)的冷RIPA缓冲液(140mM NaCl,10mM Tris pH 8.0,1％Triton X-100,0.1％SDS,1％脱氧胆酸钠)中裂解。将样品在冰上温育10分钟，并通过离心(在4℃、9000x g 10min)除去不溶物。使用PierceTMBCA蛋白测定试剂盒(Thermo-FisherScientific,Waltham,MA)对上清液中的蛋白含量进行定量。在含有50mM DTT的
Figure BDA0003736472660000561
LDS样品缓冲液(NP0007,Invitrogen)中制备等量的蛋白，并在70℃加热10分钟。将蛋白在
Figure BDA0003736472660000562
4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(NP0336,Invitrogen,Carlsbad,CA)上分离，并随后转移到硝酸纤维素膜上。将膜在TBST中的5％BSA中封闭1小时，然后在4℃用一级抗体探测过夜。使用的抗体是1:1,000的兔-抗-AKT pS473(#4058,CellSignaling Technology,Danvers,MA)、1:1,000的兔-抗-AKT(#4685,Cell SignalingTechnology)、1:1,000的兔-抗-DRP1(#8570,Cell Signaling Technology)和1:10,000的小鼠抗-微管蛋白(T8328,Millipore Sigma,St.Louis,MO)。然后将印迹在TBST中洗涤3次，并在TBST中的5％BSA中在800CW-缀合的山羊抗-兔(#926-32211,Li-COR,Lincoln,NB)和680LT-缀合的山羊抗-小鼠(#925-68020,Li-COR)二级抗体(以1:10,000)中温育1小时。将印迹洗涤，然后使用Li-COR Odyssey CLx仪器成像。使用Image Studio Lite V5.2软件(Li-COR)量化条带强度。
葡萄糖摄取测定
使用Glucose-GloTM摄取试剂盒(目录号J1342,Promega,Madison,WI)根据生产商的说明书进行葡萄糖摄取测定。对于在MEF中的基础葡萄糖摄取，在前一天晚上将细胞铺板在96孔黑色透明底平板中。将细胞处理3小时，在PBS中洗涤一次，然后在含有它们各自药物处理的无葡萄糖培养基中用1mM 2-DG脉冲。10分钟后，根据生产商的方案将反应淬灭和显影(develop)。为了测定胰岛素刺激的葡萄糖摄取，将96孔黑色透明底平板中的成熟脂肪细胞血清饥饿16小时。将细胞在补充有0.2％无脂肪酸BSA的无血清培养基中处理3小时。将细胞在PBS中洗涤一次，并在含有或不含有100nM牛胰岛素的、含有它们各自药物处理的无葡萄糖培养基中温育15分钟。将浓缩的2-DG储备液直接添加到孔中10分钟(1mM终浓度)，然后根据生产商的方案停止反应并显影。
显微术
将MEF用PBS洗涤两次，并在室温用4％多聚甲醛固定10分钟。将细胞用0.3％Triton X-100在含有10％胎牛血清的封闭缓冲液中在37℃渗透化处理20分钟，然后与小鼠抗-柠檬酸合酶(sc-390693,Santa Cruz Biotechnology；稀释度,1:200)或1:100的兔-抗-DRP1(#8570,Cell Signaling Technology)一起在4℃温育过夜。然后将细胞用PBS洗涤两次，并与AlexaFluor 488山羊抗-小鼠(A28175,Invitrogen)或AlexaFluor 594驴抗-兔(A32754,Invitrogen)二级抗体一起在室温温育，然后与1μg/ml DAPI一起温育5分钟并在PBS中洗涤2次。对于NADH自发荧光研究，在ZT8.5(在ZT12.5和ZT18之间处死前4-10.5小时)用媒介物或120mg/kg鞘脂样化合物893对小鼠进行管饲。处死后，将肝脏切离，用PBS洗涤3次，置于补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中，并立即成像。使用Mai Tai双光子激光通过740nm激发和450±50nm检测器检测NADH/NADPH自发荧光。在使用具有1.7数值孔径(NA)的63X油物镜的Zeiss LSM 780共焦显微镜上，或使用具有100X油物镜(1.3NA)的NikonTE2000-S倒置落射荧光显微镜和Photometrics CoolSNAP ES2单色CCD照相机，进行荧光显微术。所有共焦图像都是来自8-15个具有0.5微米步长的Z-堆积(stack)的16位(bit)图像。获得了至少8-12个不重叠的视野。使用Zeiss Zen 2.3图像采集软件获得共焦图像。为了分析DRP1/柠檬酸合酶信号之间的共定位，在按视野基础上减除背景以后，使用ImageJv.1.52e(NIH)的JACOP共定位插件计算了Mander氏重叠系数(MOC)；从2个生物学重复中分析了40个细胞。对于H&E染色，将肝脏在福尔马林中固定，在乙醇中脱水，并由UCI的实验组织研究(Experimental Tissue Research)病理学核心设施进行处理，并在配备有DS-Fi3彩色照相机的Nikon Ti2-F倒置落射荧光显微镜上进行评价。从每组3只小鼠(SD、HFD或HFD+120mg/kg鞘脂样化合物893)获得的3个不同肝脏切片获得五个不重叠的区域。对于脑线粒体的成像，在安乐死后立即将小鼠穿心脏(transcardially)灌注PBS，随后灌注4％多聚甲醛。取出全脑，在4℃在4％多聚甲醛中温育24小时，并然后转移至0.1M PBS中的30％蔗糖溶液中以储存。为了评价下丘脑的弓状核(ARC)，使用小鼠脑图谱集(mouse brain atlas)(Franklin,K.B.J.和Paxinos,G.(2001)The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.第3版,Academic Press,New York)确定坐标-0.5至-2.4mm。将冠状薄片在干冰上的OCT中冷冻并制备30微米切片，用PBS再水合，用在0.3％Triton X-100中的5％正常山羊血清在37℃封闭和渗透化处理30分钟，在4℃与柠檬酸合酶一级抗体(1:100)一起温育24小时，洗涤，与Alexa Fluor 488-缀合的二级抗体(1:200)一起温育，并在固定到Vectashield中之前用DAPI复染色。当省略二级抗体时未观察到荧光。使用Zeiss LSM 780共焦显微镜和63X油物镜对每组(HFD+媒介物或HFD+120mg/kg鞘脂样化合物893)4只小鼠各自的2个不同切片中的5-10个非重叠区域的图像进行评价。
线粒体网络的形态测定定量
描述线粒体网络的定量分析的示意图提供在图1(体外)和11(体内)中。如(A.Chaudhry,R.Shi,和D.S.Luciani,Am J Physiol Endocrinol Metab.318:E87-E101,2020，其公开内容通过引用并入本文)中所述，使用ImageJ软件进行分析。简而言之，对来自Z-堆积的最大投影进行预处理以除去背景，根据需要手动设置阈值以准确捕获线粒体，并使用分析颗粒工具(圆度＝4×面积/π×宽度和宽高比＝宽度/高度)评价二元化的图像，或使用分析骨架2D/3D功能(分支长度)进行骨架化和分析。使用亮视野通道手动划定细胞边界。对于体内样品，用去杂点功能降低了噪声；由于肝线粒体具有最少分支，因此未计算体内样品的分支长度。对来自6-10个非重叠视野的40个细胞(来自2个生物学重复各自的20个细胞)进行体外分析。在每个细胞中，评价和平均化100-500个对象；将来自40个单独细胞的平均值用于生成每种条件的平均值。使用为每只动物收集的6-12个非重叠视野在每个视野的基础上进行肝脏和脑线粒体的分析。
统计分析
除非在图例中另外指出，否则给出的为平均值±SEM。除非在图例中另外指出，否则所有实验数据来自≥3个独立的生物学重复。使用Graphpad Prism软件进行统计分析，但是使用统计软件包R时的脂质分析除外。如图例所示对多重比较进行校正，并报告了调整的P-值：ns，不显著，P≥0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
等同原则
虽然以上描述含有本发明的许多具体实施方案，但是这些不应解释为对本发明范围的限制，而是作为其一个实施方案的一个实施例。因此，本发明的范围不应由所示实施方案确定，而应由所附权利要求及其等同方案确定。

Claims (59)

1.一种治疗障碍或病症的方法，其包含将鞘脂样化合物施用给患有所述障碍或病症的受试者，其中所述障碍或病症与代谢有关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的O-苄基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000011
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯；
R2是脂族链(C6-C10)；
R3是包含H、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；
R1或R4之一是醇(CH2OH)或H；
L是O-CH2；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的3-和4-C-芳基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000021
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯；
R2是脂族链(C6-C14)；
R3是包含氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物893：
Figure FDA0003736472650000022
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物1090：
Figure FDA0003736472650000031
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的、具有连接的杂芳族附带基团的氮杂环：
Figure FDA0003736472650000032
或其药学上可接受的盐；
R是任选地被取代的杂芳族部分，诸如任选地被取代的哒嗪、任选地被取代的吡啶、任选地被取代的嘧啶、吩噁嗪或任选地被取代的吩噻嗪；
R1是H；烷基，诸如C1-6烷基或C1-4烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等；Ac；Boc；胍部分；
R2是包含6-14个碳的脂族链；
R3是1、2、3或4个取代基，其中每个取代基独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、N3、NO2和CN；
n独立地是1、2、3或4；
m独立地是1或2；
所述苯基部分可以连接在氮杂环核心的任何可利用位置处；且
R是具有下式的1,2-哒嗪：
Figure FDA0003736472650000033
R4和R5是独立地选自以下的官能团：烷基，包括甲基；任选地被取代的芳基(即，未被取代的芳基或被取代的芳基)，包括任选地被取代的苯基；和任选地被取代的杂芳基，包括任选地被取代的吡啶和任选地被取代的嘧啶；且
所述哒嗪部分在哒嗪的位置4或5处连接至氮杂环。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物325：
Figure FDA0003736472650000041
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的2-C-芳基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000042
R1是选自以下的官能团：H、烷基链、OH、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nOR’、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯，其中R’是烷基、烯烃或炔烃；
R2是脂族链(C6-C14)；
R3是包括氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2、氰基(CN)或其组合的单-、二-、三-或四-芳族取代基；
R4是选自以下的官能团：H；烷基，包括甲基(Me)；酯；或酰基；
X-是合适酸的阴离子；
n是独立地选择的选自1、2或3的整数；且
m是独立地选择的选自0、1或2的整数。
9.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述障碍或病症包含肥胖。
10.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含代谢综合征。
11.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含高血糖症。
12.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含II型糖尿病。
13.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含胰岛素抵抗。
14.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含瘦素抵抗。
15.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含高瘦素血症。
16.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含肝脂肪变性。
17.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述疾病或病症包含非酒精性脂肪性肝炎。
18.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用减少所述受试者的食物摄入。
19.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用减少所述受试者中的重量增加。
20.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用降低所述受试者中的多脂症。
21.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用减轻所述受试者中的代谢功能障碍。
22.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用促进所述受试者中的胰岛素敏感性。
23.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用促进所述受试者中的瘦素敏感性。
24.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用改善葡萄糖耐量。
25.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用降低血浆瘦素水平。
26.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用降低血浆胰岛素水平。
27.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用降低神经酰胺水平。
28.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用增加脂联素水平。
29.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用减少体脂。
30.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用使所述受试者中的肝脂肪变性消退。
31.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述鞘脂样化合物的施用使脂肪性肝炎消退。
32.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述治疗与FDA批准的或EMA批准的护理标准组合。
33.根据任何前述权利要求所述的方法，所述方法进一步包含将所述个体诊断为患有所述病症或障碍。
34.一种减轻线粒体断裂的方法，其包含：
使生物细胞与鞘脂样化合物接触，其中所述生物细胞正在经历线粒体断裂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的O-苄基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000081
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯；
R2是脂族链(C6-C10)；
R3是包含H、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；
R1或R4之一是醇(CH2OH)或H；
L是O-CH2；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的3-和4-C-芳基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000082
R1是选自以下的任选官能团：烷基链、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nO-烷基、(CH2)nO-烯烃、(CH2)nO-炔烃、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯；
R2是脂族链(C6-C14)；
R3是包含氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2或氰基(CN)的单-、二-、三-或四-芳族取代基；且
n是独立地选择的选自1、2或3的整数。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物893：
Figure FDA0003736472650000091
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物1090：
Figure FDA0003736472650000092
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的、具有连接的杂芳族附带基团的氮杂环：
Figure FDA0003736472650000101
或其药学上可接受的盐；
R是任选地被取代的杂芳族部分，诸如任选地被取代的哒嗪、任选地被取代的吡啶、任选地被取代的嘧啶、吩噁嗪或任选地被取代的吩噻嗪；
R1是H；烷基，诸如C1-6烷基或C1-4烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等；Ac；Boc；胍部分；
R2是包含6-14个碳的脂族链；
R3是1、2、3或4个取代基，其中每个取代基独立地是H、卤素、烷基、烷氧基、N3、NO2和CN；
n独立地是1、2、3或4；
m独立地是1或2；
所述苯基部分可以连接在氮杂环核心的任何可利用位置处；且
R是具有下式的1,2-哒嗪：
Figure FDA0003736472650000102
R4和R5是独立地选自以下的官能团：烷基，包括甲基；任选地被取代的芳基(即，未被取代的芳基或被取代的芳基)，包括任选地被取代的苯基；和任选地被取代的杂芳基，包括任选地被取代的吡啶和任选地被取代的嘧啶；且
所述哒嗪部分在哒嗪的位置4或5处连接至氮杂环。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是具有下式的化合物325：
Figure FDA0003736472650000111
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述鞘脂样化合物是基于具有下式的非对映异构的2-C-芳基吡咯烷：
Figure FDA0003736472650000112
R1是选自以下的官能团：H、烷基链、OH、(CH2)nOH、CHOH-烷基、CHOH-炔烃、(CH2)nOR’、(CH2)nPO(OH)2及其酯、CH＝CHPO(OH)2及其酯、(CH2CH2)nPO(OH)2及其酯和(CH2)nOPO(OH)2及其酯、(CH2)nPO3及其酯，其中R’是烷基、烯烃或炔烃；
R2是脂族链(C6-C14)；
R3是包括氢、卤素、烷基、烷氧基、叠氮基(N3)、醚、NO2、氰基(CN)或其组合的单-、二-、三-或四-芳族取代基；
R4是选自以下的官能团：H；烷基，包括甲基(Me)；酯；或酰基；
X-是合适酸的阴离子；
n是独立地选择的选自1、2或3的整数；且
m是独立地选择的选自0、1或2的整数。
42.根据权利要求34所述的方法，其中所述生物细胞与代谢障碍或病症有关。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述障碍或病症包含肥胖。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述疾病或病症包含代谢综合征。
45.根据权利要求42、43或44所述的方法，其中所述疾病或病症包含高血糖症。
46.根据权利要求42-45中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含II型糖尿病。
47.根据权利要求42-46中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含胰岛素抵抗。
48.根据权利要求42-47中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含瘦素抵抗。
49.根据权利要求42-48中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含高瘦素血症。
50.根据权利要求42-49中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含肝脂肪变性。
51.根据权利要求42-50中的任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包含非酒精性脂肪性肝炎。
52.根据权利要求34-51中的任一项所述的方法，其中使所述生物细胞与所述鞘脂样化合物接触会逆转线粒体断裂。
53.一种减轻线粒体断裂的方法，其包含：
使生物细胞与ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂接触，其中所述生物细胞正在经历线粒体断裂。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述ARF6拮抗剂是NAV2729、SecinH3、奋乃静或其衍生物。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述PIKfyve拮抗剂是YM201636、APY0201、阿匹莫德、晚期内体运输抑制剂EGA或其衍生物。
56.根据权利要求53、54或55所述的方法，其中使所述生物细胞与所述ARF6拮抗剂或所述PIKfyve拮抗剂接触会逆转线粒体断裂。
57.一种治疗障碍或病症的方法，其包含将ARF6拮抗剂或PIKfyve拮抗剂施用给患有所述障碍或病症的受试者，其中所述障碍或病症与代谢有关。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述ARF6拮抗剂是NAV2729、SecinH3、奋乃静或其衍生物。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述PIKfyve拮抗剂是YM201636、APY0201、阿匹莫德、晚期内体运输抑制剂EGA或其衍生物。
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