CN102762595A - 针对非功能性低聚p2x7受体的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及嘌呤受体、其抗体以及相关的用于结合到所述受体上的片段,涉及所述抗体以及片段的生产,并且涉及所述抗体和片段用于癌症检测和治疗的用途。具体地,所描述的抗体特异性地结合到由活细胞表达的非功能性P2X7受体上。
Description
发明领域
本发明涉及嘌呤受体、其抗体以及相关的用于结合到所述受体上的片段,涉及所述抗体以及片段的生产,并且涉及所述抗体和片段用于癌症检测和治疗的用途。
发明背景
在本说明书中对于任何现有技术的引用不是、并且不应当被当成是这样一种承认或任何形式的建议,即该现有技术形成了在澳大利亚或任何其他司法管辖区域中的公知常识的一部分或该现有技术可以由本领域的普通技术人员合理地被预期被确定、理解并且视为是相关的。
嘌呤(P2X)受体是ATP-门控阳离子选择通道。每个受体由三种蛋白质亚基或单体组成。迄今为止,已经鉴定了七种分离的编码P2X单体的基因:P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7。
P2X7受体是特别感兴趣的,因为这些受体的表达被理解为是限于具有经历程序性细胞死亡可能性的细胞,例如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞。在正常稳态(例如在红细胞上)中存在一些P2X7受体的表达。
有趣的是,在被理解为不能经历程序性细胞死亡的细胞(例如癌前期细胞以及肿瘤细胞)上已经发现了含有一种或多种在Pro210(根据SEQ ID NO:1)处具有顺式异构化并且缺乏ATP结合功能的单体的P2X7受体。该受体的这种同种型已经被称为“非功能”受体。
抗体是从用一种包含Pro210的肽的进行免疫产生的,Pro210处于与非功能性P2X7受体的顺式结合。然而,它们并不结合到能够结合ATP的P2X7受体上。因此,这些抗体对于选择性地检测许多形式的癌以及造血癌症(haemopoietic cancer)以及用于治疗这些病症的一些是有用的。
WO02/057306A1和WO03/020762A1均讨论了用于在处于单克隆抗体形式的功能性P2X7抗体与非功能性P2X7抗体之间进行区分的探针。
迄今为止,获得以所希望的亲和力结合到活细胞上的非功能性P2X7受体的血清学试剂已经是非常困难的。在癌症的检测和治疗应用中,较高亲和力的试剂通常是所希望的。
对于改进的结合到P2X7受体上的试剂,特别是能够在活细胞上的ATP与非ATP结合受体之间进行辨别的新的抗体以及其片段,存在着一种需要。对于表现出优先结合到P2X7受体上的抗体及其片段也存在着一种需要,因为一旦靶细胞已经死亡,该抗体以降低的结合到P2X7受体上的能力表达在活细胞上。
发明概述
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式1定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(带电荷的/极性的/芳香族的)(带电荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(带电荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。
X贯穿本说明书代表任何氨基酸。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式2定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:N(Y/F)XXXY(Y/F)EX。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式3定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:N(Y/F)(中性的)(带电荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式4定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:NFLESYFEA。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式5定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:N(Y/F)(带电荷的)(中性的)(带电荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式6定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:NYRGDYYET。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式7定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:H(芳香族的)XXXYYNI。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式8定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:H(Y/F)(中性的)(带电荷的(带电荷的)YYNI。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式9定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:H(Y/F)(中性的)(带电荷的(中性的)YYNI。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式10定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:HYSKEYYNI。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式11定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:HFQRGYYNI。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式12定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)XXXYY(带电荷的)(中性的)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式13定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式14定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式15定义:
FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:YFPLVYYDV。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式16定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:NYL PMYYEV。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式17定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:Y(带电荷的)XXXY(中性的)(中性的)(中性的)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式18定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:YHVIQYLGP。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式19定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:vFR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个选自下组的氨基酸序列,该组由以下各项组成:HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV、HYIKVYYEA、HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP、HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDV。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式20定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR1具有一个氨基酸序列KASQNVGTNVA。
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式21定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR1具有一个氨基酸序列SYYMS。
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式22定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS。
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式23定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR2具有一个氨基酸序列AINSNGGSTYYPDTVKG。
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式24定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR1具有一个氨基酸序列KASQNVGTNVA
CDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗 原结合位点,该抗原结合位点由以下通式25定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR1具有一个氨基酸序列SYYMS。
CDR2具有一个氨基酸序列AINSNGGSTYYPDTVKG
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列。
在一个实施方案中,在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点,其中FR1是MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC或DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS。
在一个实施方案中,在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点,其中FR2是WYQQKPGQSPKALIY或WVRQTPEKRLELVA。
在一个实施方案中,在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点,其中FR3是GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC或RFTISRDNAKNTIYLQMSSLKSEDTAFYYCTR。
在一个实施方案中,在此提供了一种根据以上描述的任何实施方案的抗原结合位点,其中FR4是FGSGTRLEIK或WGAGTTVTVSS。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式26定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-连接物-FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a
其中:
FR1、FR2、FR3、FR4、FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自是框架区;CDR1、CDR2、CDR3、CDR1a、CDR2a、CDR3a各自是互补决定区;
其中:
CDR1具有一个氨基酸序列KASQNVGTNVA
CDR2具有一个氨基酸序列SASFRYS
CDR3具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT。
CDR1a具有一个氨基酸序列SYYMS。
CDR2a具有一个氨基酸序列AINSNGGSTYYPDTVKG
当CDR3是任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列时,CDR3a具有任何描述CDR3序列的以上实施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT(SEQ ID NO:33)。
FR1具有氨基酸序列MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC(SEQ ID NO:25)
FR2具有氨基酸序列WYQQKPGQSPKALIY(SEQ ID NO:26)
FR3具有氨基酸序列GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC(SEQ ID NO:27)
FR4具有氨基酸序列FGSGTRLEIK(SEQ ID NO:28)
FR1a具有氨基酸序列DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:29)
FR2a具有氨基酸序列WVRQTPEKRLELVA(SEQ ID NO:30)
FR3a具有氨基酸序列RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR(SEQ ID NO:31)
FR4a具有氨基酸序列WGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式27定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(带电荷的/极性的/芳香族的)(芳香族的)(带电荷的/中性的)(带电荷的)(带电荷的/中性的)Y(芳香族的)(带电荷的)(中性的)。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式28定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(带电荷的/极性的/芳香族的)(F/Y)(带电荷的/中性的)(R/K)(带电荷的/中性的)Y(Y/F)(E/D)V。
在一个实施方案中,在此提供了一种用于结合到受体P2X7上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式30定义:
FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(H/N)(F/Y)(S/D)(R/K)(G/K)Y(Y/F)DV。
在一个实施方案中,通式26的连接物是一个具有15个氨基酸残基的氨基酸序列。典型地,该连接物主要包含甘氨酸和丝氨酸残基。优选地,该连接物是GGGGSGGGGSGGGGS。
在一个实施方案中,本发明的抗原结合位点具有包含HFSRGYYDV或NYDKKYFDV的CDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中,本发明的抗原结合位点具有由HFSRGYYDV或NYDKKYFDV组成的CDR3氨基酸序列。
在其他实施方案中,在此提供了一种具有如以上描述的序列,或包 括如在此描述的CDR和/或FR序列并且包括一个或多个用于增加所述位点结合到P2X7受体上的亲和力的突变的抗原结合位点。
在另一个实施方案中,在此提供了一种如在此描述的抗原结合位点,其中形成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一个或多个的氨基酸序列是人类序列。
在另一个实施方案中,在此提供了一种如在此描述的抗原结合位点,其中形成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一个或多个的氨基酸序列是犬或猫序列。
该抗原结合位点可以被工程化为具有来自特定动物的序列,例如它可以是嵌合体的(即,含有一些但并非所有的在接收该抗体的个体中发现的序列)。可替代地,它可以由异基因序列或同基因序列组成。后者的一个例子是用于狗的治疗中的狗抗体。
该抗体从中衍生的动物可以包括家养动物、伴侣动物或农场动物,包括狗、猫、奶牛、猪、马以及羊。
在另一个实施方案中,在此提供了一种抗P2X7受体免疫球蛋白可变域,抗体、Fab、dab、scFv,包括具有在此描述的序列的抗原结合位点,或包括如在此描述的CDR和/或FR序列。
在另一个实施方案中,在此提供了一种双链抗体或三链抗体,包括具有在此描述的序列的抗原结合位点,或包括如在此描述的CDR和/或FR序列。
在另一个实施方案中,在此提供了一种融合蛋白,包括如在此描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体,。
在另一个实施方案中,在此提供了一种偶联物,该偶联物处于如在此描述的结合到一种标记或细胞毒剂上的形式的抗原结合位点,免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体的形式。
在另一个实施方案中,在此提供了如在此描述的一种用于结合到免疫球蛋白可变域的抗原结合位点上的抗体、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。
在另一个实施方案中,在此提供了一种核酸,该核酸编码抗原结合位点,或如在此描述的CDR和/或FR序列;或如在此描述的一种免疫球 蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。
在另一个实施方案中,在此提供了一种包含在此描述的核酸的载体。
在另一个实施方案中,在此提供了一种包含在此描述的载体或核酸的细胞。
在另一个实施方案中,在此提供了一种由此衍生的包括在此描述的细胞的动物或组织。
在另一个实施方案中,在此提供了一种药物组合物,该药物组合物包括抗原结合位点,或包括如在此描述的CDR和/或FR序列;或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物,以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一个实施方案中,在此提供了一种诊断组合物,该药物组合物包括抗原结合位点,或包括如在此描述的CDR和/或FR序列;或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物,一种稀释剂以及任选地一种标记。
在另一个实施方案中,在此提供了一种试剂盒或制造物品,该试剂盒或制造物品包括抗原结合位点,或如在此描述的CDR和/或FR序列;或如在此描述的一种免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物。
在另一个实施方案中,在此提供了一种根据如在此描述的CDR1、CDR2、FR1、FR2、FR3和FR4的一个或多个的序列用于生产一种结合到P2X7受体上的抗原结合位点的用途。
在另一个实施方案中,在此提供了一种抗原结合位点,或如在此描述的CDR和/或FR序列用于生产具有增加的P2X7受体亲和力的抗P2X7受体抗原结合位点的用途。
在另一个实施方案中,在此提供了一种从抗原结合位点或如在此描述的CDR和/或FR序列突变产生的核酸分子的文库,其中所述文库中的至少一种核酸分子编码了用于结合到P2X7受体上的一种抗原结合位点。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于生产如在此描述的抗 P2X7抗原结合位点的方法,包括在如在此描述的一个细胞或动物中表达如在此描述的一种核酸。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于治疗个体中的癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法,包括以下步骤:对一位需要癌症或所述病症或疾病治疗的个体提供在此描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。
在另一个实施方案中,在此提供了如在此描述的抗原结合位点,免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物用于制造一种治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的药物的用途。
在另一个实施方案中,在此提供了用于治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的如在此描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于诊断癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法,包括以下步骤:将有待确定癌症的存在或缺乏的组织或细胞与一种试剂接触,该试剂处于如在此描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或诊断组合物的形式,然后检测该试剂与组织或细胞的结合。该方法可以在体内或体外操作。
典型地,根据本发明的抗原结合位点结合到非功能性P2X7受体上,尤其是其中P2X7的Pro210是顺式构象的受体。在某些实施方案中,根据本发明的抗原结合位点不结合到非功能性P2X7受体上,尤其是其中P2X7的Pro210是反式构象的受体。
典型地,根据本发明的抗原结合位点结合到活细胞上的非功能性P2X7受体上。在一些实施方案中,这些抗原结合位点不结合或以非常低的或不可检测的亲和力结合到在死亡的或濒死细胞上的非功能受体上。无论本发明的抗原结合位点结合或不结合到P2X7受体上,可以使用本领域已知的标准方法确定。
在一个实施方案中,根据本发明的抗原结合位点以在大约1pM至大约1uM范围内的亲和力(KD)结合到在活细胞上的P2X7受体上。典 型地,当该抗原结合位点是IgM的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约1pM至大约1nM之间,优选大约1pM至大约50pM。典型地,当该抗原结合位点是IgG的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约1pM至大约1nM之间,优选大约1pM至大100pM之间。典型地,当该抗原结合位点是Fab的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约100pM至大约100nM之间,优选大约1nM至大约100nM。典型地,当该抗原结合位点是scFV的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约10nM至大约1μM之间,优选大约10nM至大约100nM。典型地,当该抗原结合位点是dab的一部分时,对于活细胞上的P2X7受体的亲和力是在大约10nM至大约10μM之间,优选大约100nM至大约1μM。
在某些实施方案中,本发明的抗原结合位点以及包含它们的分子能够诱导凋亡。
在某些实施方案中,本发明的抗原结合位点以及包含它们的分子能够诱半胱天冬氨酸酶激活。
附图简要说明
图1.全长人P2X7受体(SEQ ID NO:1)。
图2.P2X7受体的胞外域序列。P2X7受体(47-306)(SEQ ID NO:2)(ECD2)是SEQ ID NO:1的氨基酸47至306。这些氨基酸删去(struck-through)了指定的从全长P2X7受体序列中缺失的氨基酸。
图3.P2X7受体的胞外域序列。P2X7受体(47-332)(SEQ ID NO:3)(ECD1)是SEQ ID NO:1的氨基酸47至332。这些氨基酸删去了指定的从全长P2X7受体序列中缺失的氨基酸。
图4.对于2F6VH的表达载体结构。
图5.对于2F6VL的表达载体结构。
图6.(a)2F6scFv序列,具有用于检测的添加的His标签(SEQ ID NO:4)。所显示的2F6scFV序列具有以下组织结构(以从N端到C-端的顺序)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-连接物-FR1a-CDR1a-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a-AAA- 表位标签(DYKDDDDK)-AAA-His标签。(b)通过尺寸排阻HPLC的重组2F6 IgG2a的纯化。通过HPLC分离重组IgG2a并且显示了一个实例HPLC色谱图。
图7.2F6mIgG2a纯化的HP-SEC。
图8.显示最终抗体产物纯度的SDS PAGE。
图9.(a)体外细胞抑制测定。使用细胞活力检测(Cell Titer Blue Assay),发现针对在癌细胞上表达的非功能P2X7受体的三聚物形式的初始抗体的IgM形式抑制了细胞生长。显示了一个实例,其中看到对照IgM抗体浓度从2.5增加到40μg/mL对于细胞生长(左栏)没有作用而2F6在相同剂量范围内在3天的生长测定中抑制了细胞生长(右栏)。(b)、(c)、(d)同样地通过与IgM形式的抗体孵育来抑制其他细胞类型。经过5天比经过3天的生长被抑制到一个更大的程度。相对于使用对照lgM抗体所获得的控制生长曲线,对生长数据作图。COLO205生长经过3天显著被抑制并且这些细胞甚至在2.5μg/mL的低剂量下经过5天而被消除。这表明表达轻微不同水平的受体的不同细胞系或多或少对于抗体结合是敏感的。(e)相反,重组IgG2a形式的抗体显示出更弱的细胞抑制,如在过3天获得的以下图中所示。细胞生长抑制测定(细胞活力测试,Cell Titer Blue)显示,与使用IgM形式抗体引出的抑制作用相比,IgG2a形式的抗体具有降低的肿瘤细胞生长抑制,与实际上含有两个而不是十个结构域的lgG的结合亲和力降低一致。
图10.细胞杀伤测定中的阻断反应。细胞活力生长抑制测定用于以MCF-7乳癌细胞系经过三天的细胞生长。注意,在右栏中的活的对照细胞不具有抗体或肽。左手栏是使用含500μg/mL肽表位(E200-300表位在图中描述为200/300)的10μg/mL 2F6IgM抗体孵育的细胞得到的信号,通过在三个中间栏中的数据证明足以阻断细胞生长抑制作用,显示了生长抑制不受对应的50μg/mL、5μg/mL或0μg/mL肽的存在的影响。在2F6中暴露5天之后发生细胞生长的完全抑制。
图11.由2F6诱导的具有与凋亡的复活有关的半胱天冬氨酸酶3/7活化的细胞死亡机制。在这个实验中,左侧显示吉西他滨对照药物的作用,已知其通过诱导COLO205癌细胞中的凋亡而激活半胱天冬氨酸酶。相反,药物或抗体的缺乏没有作用(仅有细胞的栏)。经过3天时间过程的实验中,高达40μg/mL剂量的对照lgM的存在同样对半胱天冬氨酸酶的激活没有作用,同时增加2F6抗体的量显示出与通过抗体诱导的凋亡相关的半胱天冬氨酸酶3/7激活的稳定增加。
图12.通过2F6IgM的直接细胞杀伤。在对照lgM抗体(a)和2F6IgM(b)存在24小时下的MCF-7细胞的共焦显微图象。
图13.(a)结合到活4T1肿瘤细胞上的2-2-1hFc,显示了一些膜结合(x40obj)。(b)结合到濒死细胞上的2-2-1hFc连同来自已经被杀死的细胞的膜碎片。(c)结合到活LL肿瘤细胞上的2-2-1hFc,显示了清楚的膜结合。(d)结合到已经被杀死的细胞的膜碎片上的2-2-1hFc。
图14.(a)结合到活4T1肿瘤细胞上的2F6hIgG1,显示了清楚的膜结合(x 40obj)。(b)仅结合到濒死细胞上的2F6hIgG1。(c)结合到活LL肿瘤细胞上的2F6hIgG1,显示了清楚的膜结合。(d)结合到濒死细胞上的2F6hIgG1,没有结合到相邻的表达功能能力(function-capable)的P2X7受体的红细胞上。
图15.通过2F6hIgG1在4T1同基因异种移植模型中到第14天时肺转移数目的抑制。肿瘤体积的总减小为89%,其中在治疗组中大多数转移的体积比未治疗组中的转移的体积小得多。
图16.在路易斯肺(LL)同基因异种移植模型中到第11天时肺转移数目的抑制。五个组是未治疗对照(组1)、10mg/kg的羊多克隆E200-300(组2)、1mg/kg(组3)以及10mg/kg(组4)的2F6hIgG1以及5mL/kg每天的索拉非尼(组5)。绵羊多克隆和2F6hIgG1两者都与具有96%抑制的索拉非尼等效。
图17.来自2F6的CDR3序列的亲和力成熟。亲和力成熟的scFv/Fab衍生物的氨基酸序列作为突变体克隆而列出,其中野生型(WT)2F6CDR3序列在清单的顶部。
图18.IgM、IgG2a和Fab铅的ELISA。铅亲和力成熟的2F6衍生的ELISA(对于IgM和IgG2a,水平为0.01-12.5μg/mL;对于Fab为0.1-100μg/mL)。对于初始lgM和重组IgG2a的EC50值分别测量为0.14和1.6μg/mL。WT Fab显示了非常低的EC50,而选自ScFv筛选(#10、#21、#42和#66)的铅亲和力成熟的Fab种类结合紧密得多,具有在2-4μg/mL范围内的EC50,或者比WT强125倍,从而匹配该完全形成的IgG2a抗体的亲和力。
图19.(a)针对重组Fab结合到活的结肠直肠COLO205肿瘤细胞上的流式细胞术结果。使用σ抗FLAG二级抗体(#F4049)来检测初级抗体的结合。WT 2F6Fab在相同的浓度范围内结合微弱。对于四个铅Fab 的EC50与从ELISA测量获得的值非常相似。(b)对于前列腺PC3细胞获得了非常相似的改进的结合结果。
图20.对不同的重组2F6IgG2a制剂进行比较,以确定与亲和力成熟的Fab相比的WT格式的抗体对PC3细胞的相对结合强度。使用Rockland IgG2a#010-001-332用于对照以确定背景(菱形)。全格式化的WT抗体的结合与通过铅Fab引出的结合相当。
图21.通过流式细胞术确定了对于通过铅Fab结合到人淋巴细胞上的功能性P2X7受体上的缺乏的验证。σ抗FLAG抗体#F4049用作二级抗体。Abcam HLA抗体用作对照。没有检测到在背景以上的结合,如通过在左手栏的仅仅二次信号所确定的。沿着x轴从左到右的初级抗体的顺序与图例从上到下的顺序相同。
图22.对于高亲和力的纯化羊多克隆抗体结合到PC3细胞上的流式细胞术结果,显示了比WT 2F6 hIgG2a显著更强的结合并且表明当转化成二价lgG结合物时从广泛的亲和力成熟的Fab的预期改进。
发明详细说明
现在将更详细地提及本发明的某些实施方案。虽然本发明将结合这些实施方案进行说明,将理解的是并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反,本发明旨在将涵盖如在由权利要求书所定义的包含在本发明的范围之内的多种替代方案、修改、以及等效物。
本领域的技术人员将会认识到类似于或等同于在此描述的那些的许多方法和材料,它们可以用于本发明的实践中。本发明绝非限于所描述的这些方法和材料。
将理解的是在本说明书中披露并且定义的本发明扩展到所提及的或根据正文或附图中明显的两个或更多个单独的特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的不同替代方面。
如在此使用的,除了上下文另外要求以外,术语“包括”(″comprise″),以及该词语的变体,例如“包括”(″comprising″)以及“包括”(″comprises″)和“包括”(″comprised″)不旨在排除其他的添加物、组分、整数或步骤。
本发明提供了能够结合到由活细胞表达的非功能性P2X7受体上的 抗原结合位点。这些受体处于更高水平的低聚物形式。这种低聚物形式是相关联的两种或更多种P2X7受体单体。典型地,该低聚物形式是三个P2X7受体单体的三聚物。本发明的结合更高水平的低聚P2X7形式的抗原结合位点的一个优点是,与仅仅结合单体的P2X7受体的抗体相比,将会降低从溶解的或凋亡的细胞释放的P2X7受体的单体形式的隐蔽(sequestration)。
为了解释本说明书的目的,以下定义将应用并且在适当时所使用的单数术语还包括复数并且反之亦然。在所列出的任何定义与通过引用结合在此的任何文献冲突的情况下,以下列出的定义将优先。
“嘌呤受体”通常是指使用嘌呤(如ATP)作为配体的一种受体。
“P2X7受体”通常是指由三个蛋白质亚基或单体形成的嘌呤受体,其中至少一个单体具有基本上如在SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列(参见图1)。“P2X7受体”可以是如下描述的功能或非功能性受体。“P2X7受体”包括天然发生的P2X7受体变体,例如其中P2X7单体是剪接变体、等位基因变体以及包含天然发生的形成P2X7受体的截短的或分泌形式的单体的同种型(例如由细胞外结构域序列组成的形式或其截短的形式)、天然发生的变体形式(例如,可替代地剪接形式)以及天然发生的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中,在此披露的天然序列P2X7单体多肽是成熟的或全长的天然序列多肽,包含在SEQ ID NO:1中示出的全长氨基酸序列。在某些实施方案中,P2X7受体可以具有修饰的氨基酸序列,例如显示在SEQ ID NO:1中的序列中的不同氨基酸可以被置换、缺失,或可以插入一个残基。
“功能性P2X7受体”通常是指具有用于结合到ATP上的结合位点或裂缝的P2X7受体的一种形式。当结合到ATP上时,该受体形成了一种孔状结构,该结构使得钙离子能够进入胞质溶胶中,其一个结果可能是程序性细胞死亡。在正常稳态中,功能性P2X7受体的表达通常限制于经历程序性死亡的细胞,如胸腺细胞、树突状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及单核细胞。还可以在红细胞上存在一些功能性P2X7受体表达。
“非功能性P2X7受体”通常是指其中一个或多个单体具有在Pro210顺式异构化的P2X7受体的形式(根据SEQ ID NO:1)。这种异构化可能是从导致该单体错折叠的任何分子事件产生的,包括例如单体基本序列的突变或异常的翻译后加工。异构化的一个结果是该受体不能结合到ATP上。在这些情况下,该受体不能形成孔并且这限制了钙离子可以进入到胞 质溶胶中的程度。非功能性P2X7受体表达在广泛的上皮癌和造血癌上。
在此使用的“胞外域”(ECD)是P2X7受体(47-306)(SEQ ID NO:2,参见图2)(ECD2)以及P2X7受体(47-332)(SEQ ID NO:3)(ECD1)。P2X7受体(47-306)(SEQ ID NO:2)是SEQ ID NO:1的氨基酸47至306。P2X7受体(47-332)(SEQ ID NO:3,参见图3)是SEQ ID NO:1的氨基酸47至332。
1.
“抗体”或“免疫球蛋白”或“Ig”是在血液、或其他体液或脊椎动物中发现的γ球蛋白蛋白,它们在免疫系统中起作用以结合到抗原上,由此识别并且中和外来物。
抗体通常是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。每个L链通过一个共价的二硫键连接到一个H链上。这两个H链通过一个或多个二硫键(取决于该H链的同种型)彼此连接。每个H和L链还具有规则地间隔开的链内二硫桥。
H和L链定义了特异性lg结构域。更具体地说,每个H链在N端具有关于可变域(VH),之后是三个恒定域(CH)(对于每个α和γ链)以及四个CH结构域(对于μ和ε同种型)。每个L链在N端具有一个可变域((VL),之后在其另一端是一个恒定域(CL)。VL与VH对齐并且CL与重链的第一恒定域(CH1)对齐。
抗体可以指定到不同的类别或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM,具有分别指定为α、δ、ε、γ、和μ的重链。γ和α类别基于在CH序列和功能方面的较小差异而进一步分成多个亚类,例如人类表达以下亚类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。来自任何脊椎动物种类的L链基于其恒定域的氨基酸序列可以被指定为两个明显不同的类型之一,称为κ和λ。
该恒定域包括Fc部分,该部分包括通过二硫化合物结合的两个H链的羟基端部分。通过在Fc区中的序列确定抗体(例如ADCC)的效应子功能,该区也是通过在某种类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
VH和VL的配对一起形成了一个“可变区”或“可变域”,包括抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可以被称为“VH”。轻链的可变域可以被称为“VL”。V结构域包括抗原结合位点,该抗原结合位点影 响了抗原的结合并且限定了一种特定抗体对于其特定抗原的特异性。V区跨过了大约110个氨基酸残基并且由15-30个氨基酸的被称为框架区(FR)(通常大约4)的相对不变伸展段(relatively invariant stretch)组成,该相对不变伸展段被极度易变的称为“高变区”(通常大约3)的各自具有9-12个氨基酸长的更短的区域分开。这些FR大部分采取β片构型并且高变区形成了连接β片结构的环,并且在一些情况下形成了β片结构的一部分。
“高变区”,“HVR”或“HV”是指抗体可变域的区域,这些区域在序列方面是高变的和/或形成在结构上定义的环。通常,抗体包括六个高变区;三个在VH(H1、H2、H3)中,并且三个在VL(Ll、L2、L3)中。在此使用并且包含了许多高变区的描绘。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且是最常使用的(Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.(免疫学兴趣的蛋白质序列,第5版)Public Health Service,National Institutes of Health(美国国立卫生研究院,公共卫生署),贝塞斯达,马里兰州(1991))。
“框架”或“FR”残基是除了在此定义的高变区残基以外的那些可变域残基。
“用于形成抗原结合位点的肽”通常是指可以形成针对抗原赋予抗原特异性的肽。例子包括全抗体或全抗体相关的结构,包含一个可变域的全抗体片段、其可变域和片段,包括轻和重链,或包括一些但并非所有的高变区或恒定区的轻以及重链的片段。
“完整的”或“全”抗体是包括抗原结合位点,连同CL以及至少重链恒定域CHI、CH2和CH3。恒定域可以是天然序列的恒定域(例如,人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。
“全抗体相关的结构”包括多聚化形式的全抗体。
“包含一个可变域的全抗体片段”包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段;双链抗体、线性抗体、单链抗体分子;以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
Fab片段由整个L链与H链的可变区结构域(VH)以及一个重链的第一恒定域(CHI)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的,即,它具有单个抗原结合位点。
Fab′片段与Fab片段的区别在于在CHI结构域的羧基端具有另外的很少的残基,包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH在此 是对于Fab′命名的,其中该恒定域的一个或多个半胱氨酸残基带有一个游离的巯基。
F(ab′)2片段大致地对应于两个具有二价抗原结合活性的二硫化物连接的Fab的片段并且仍然是能够交联抗原。
“Fv”是包括一个完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由以紧密的非共价缔合的一个重链的以及一个轻链的可变区结构域的二聚物组成。
在一个单链Fv(scFv)种类中,一个重链以及一个轻链可变域可以通过一个柔性肽连接物共价连接,使得该轻链和重链能够在一个类似于两链Fv种类的“二聚”结构中缔合。从这两个结构域的折叠发散出六个高变环(3个环各自来自H和L链),这些环有助于氨基酸残基用于抗原结合并且赋予抗原对抗体的结合特异性。
“单链Fv”还缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接形成一个单一的多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,该scFv多肽进一步包括在该VH和VL结构域之间的一个多肽连接物,使得该scFv形成了所希望的用于抗原结合的结构。
“单一可变域”是Fv的一半(仅包含三个对于抗原特异的CDR),该Fv具有识别并且结合抗原的能力,尽管比整个结合位点的亲和力更低。
“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段,这些片段包括连接到在同一多肽链(VH-VL)中的一个轻链可变域(VL)上的重链可变域(VH)。小的抗体片段通过在该VH与VL结构域之间构建具有短连接物(大约5-10个残基)的sFv片段(参见以上段落)而制备,使得实现了V结构域的链间配对但不是链内配对,从而导致了一个二价片段,即,具有两个抗原结合位点的片段。
双链抗体可以是二价的或双特异性的。双特异性的双链抗体是两个“交换型”sFv片段的异源二聚体,其中这两个抗体的VH与VL结构域在不同的多肽链上存在。三链抗体和四链抗体通常也是本领域已知的。
“分离的抗体”是已经从其预先存在的环境中的组分鉴定并且分离和/或回收的抗体。污染组分是将会干扰对于抗体的治疗用途的材料并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。
“人抗体”是指具有相应于由人产生的一种抗体的氨基酸序列和/或已经使用用于制造如在此披露的人抗体的任何技术所制造的抗体。人抗体 的定义确切地排除了包含非人的抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的不同技术生产,包括噬菌体展示文库。人抗体可以通过将该抗原给予一种转基因动物而制备,该转基因动物已经进行了改良以响应于抗原激发而产生这样的抗体,但是其内源性位点已经丧失能力。
非人(例如啮齿动物)的抗体的“人源化的”形式是包含衍生自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自该受体的高变区的残基被具有所希望的抗体特异性、亲和力和能力的来自非人种类(供体受体)(例如,小鼠、大鼠、兔、狗、猫或非人灵长类的高变区的残基取代。在一些情况下,人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外,人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常,这种人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、典型地两个可变域,其中相应于非人免疫球蛋白以及所有的或基本上所有的FR的所有的或基本上所有的高变环是人免疫球蛋白序列的那些。该人源化抗体任选地还包括至少一个免疫球蛋白恒定区(Fc),典型地人免疫球蛋白的至少一部分。
“单克隆抗体”是指从基本上均质性抗体的群体获得的一种抗体,即,包含该群体的单独的抗体是相同的,除了可能以较小的量存在的可能的天然发生的突变以外。单克隆抗体是高度特异性的,其直接针对在抗原上的单一抗原位点或决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体有利的是它们可以通过其他抗体未受污染地合成。单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备,或者使用重体DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制造。这些“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库中分离出。
在此的单克隆抗体包括“嵌合的”抗体,其中重和/或轻链的一部分与对应的衍生自一个特定种类的抗体或属于一个特定抗体种类或亚类的序列相同或同源,而该一个或多个链的其余部分是与衍生自另一个种类的抗体的或属于另一个抗体种类或亚类的抗体连同此种抗体的片段中的对应序列相同或同源,只要他们表现出所希望的生物活性即可。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化的(primatized)”的抗体,这些抗体包含衍生自非人灵长类(例如旧世界猴、猩猩等)的可变域抗原结合序列以及人类恒定区序列。
术语“抗-P2X7受体抗体”或“结合到P2X7受体上的抗体”是指能够以足够的亲和力结合到P2X7受体上使得该抗体作为一种诊断和/或治疗剂 在靶向P2X7受体(典型地非功能性P2X7受体)中是有用的抗体。优选地,将一种P2X7受体抗体结合到不相关的受体蛋白上的程度小于如所测量(例如通过放射免疫测定(RIA))的该抗体结合到P2X7受体上的约10%。在某些实施方案中,结合到P2X7受体上的抗体具有的解离常数(Kd)是<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、或<0.1nM。抗非功能性P2X7受体抗体通常是具有一些或所有这些血清学特征并且结合到非功能性P2X7受体上而不是功能性P2X7受体上的抗体。
一种“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变的抗体,这种改变与不具有一个或多个那种改变的母源抗体相比导致了抗体对于抗原的亲和力的改进。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔的对于靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体是通过本领域已知的程序生产的。
“抑制性”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低了该抗体结合的抗原的生物活性的抗体。优选的抑制性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制了该抗原的生物活性。
如在此使用的“激动剂抗体”是一种模拟感兴趣的多肽的功能性活性中的至少一种的抗体。
“结合亲和力”通常是指在一个分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如,抗原)之间的总的非共价相互作用的强度。通常“结合亲和力”是指反应结合对(例如,抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的方法测量亲和力,包括在此描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合到抗原上并且倾向于很容易地解离,而高亲和力抗体通常更快地结合到抗原上并且倾向于保持结合比较久。许多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的,其中任何方法可以用于本发明的目的。
如在此使用的,在以下表中定义了氨基酸的特性:
诸位发明人已经确定了许多可变域克隆的CDR序列,他们已经发现结合到非功能性P2X7受体上。这些CDR序列示于以下表1a中。
在一个实施方案中,在此提供了一种具有如在表1a或b中显示的序列的肽。这些肽对于构建抗原结合位点、可变域、抗体以及有关片段是特别有用的。
表1a:CDR序列
表1b
在某些实施方案中,该抗原结合位点是与以上描述的抗原结合位点具有至少75%,优选80%,更优选85%,更优选90%,更优选95%,更优选96%、97%、98%或99%的一致性的位点。
在某些实施方案中,CDR是与表1a中示出的CDR具有至少75%,优选80%,更优选85%,更优选90%,更优选95%,更优选96%、97%、98%或99%的一致性的CDR。
在某些实施方案中,该抗原结合位点包括或其组成为在表1b中示出的VH、VL或scFv序列或具有与表1b中描述的VH、VL或scFV具有75%,优选地80%,更优选85%,更优选90%,更优选95%,更优选96%、97%、98%或99%的一致性的序列。
在其他实施方案中,在此提供了一种具有如以上描述的序列并且包括一个或多个用于增加所述位点结合到抗P2X7受体上的亲和力的突变的抗原结合位点或CDR和/或FR。这种突变可以导致在CDR1、CDR2或CDR3中的一个或多个FR1、FR2、FR3或FR4中的或一个或多个的置换、插入或缺失。
在某些实施方案中,本发明的抗原结合位点以及包含它们的分子结合到在非ATP结合的P2X7受体(另外称为“非功能性受体”)上专一性地表达的表位。已经发现该表位和形成它的肽对于产生结合到在活细胞上表达的非功能性P2X7受体上的单克隆抗体是有用的。
活细胞结合是重要的,因为非功能性P2X7受体在细胞内或细胞(例子是上皮细胞)上的表达被认为是许多癌症,例如上皮癌和其他病症的生物标记。因此,通过结合到活细胞上的单克隆抗体,有可能提供对广泛的特征为非功能性P2X7受体表达的疾病提供全身治疗(处于抗体本身的形式,或处于抗体-细胞毒性剂偶联物的形式)。还有可能提供用于体内成像以及诊断或监测特征为非功能性P2X7受体表达的疾病。
仅仅在P2X7受体(即,P2X7单体形成的三聚物)上发现了该表位。更具体地说,该表位跨过了在三聚P2X7受体中的相邻单体。作为在非功能性三聚受体中的没有对齐的单独的P2X7单体因此不含该表位。这有利地允许一个人将肿瘤分期。这更困难的是使用结合到单体P2X7和三聚受体两者上的抗体。
因此,在某些实施方案中,本发明的抗原结合位点结合到P2X7受体的一个表位上
该表位由以下项形成:
一个第一区,处于P2X7受体第一单体区的形式;以及
一个第二区,处于该受体的第二单体区的形式;
其中该第一和第二区通过该受体单体的SEQ ID No:1中的位置210处残基的顺式异构化而形成在该受体中;
并且其中该第一和第二区在受体中彼此相邻安排,由此允许抗P2X7抗体的抗原结合位点结合到形成该表位的该第一和第二区上。
典型地,该表位是构象性表位。在这些实施方案中,该第一和第二区各自限定了一个分子空间,各自包括SEQ ID No:1的一个或多个残基。典型地,该第一区是限定了包括SEQ ID No:1的一个或多个残基的分子空间的区:这些残基被暴露用于由于具有在SEQ ID No:1中所示的序列的单体Pro210处的顺式异构化而结合到抗体的抗原结合位点上。这些残基包括Gly 200、His 201、Ash 202、Tyr 203、Thr 204、Thr 205、Arg 206、Asn 207、Ile 208、Leu 209和Pro210。在一个实施方案中,该第一区包括这些残基中的至少一个。典型地,该第一区包括这些残基中的至少4个,虽然它可以是更少的,例如2或3,这取决于在该第二区中存在多少残基。在一个实施方案中,该第一区包括在以下表2中示出的至少1对残基:
表2:
在某些实施方案中,该第一区包括2个或更多对在以下表2中示出 的残基。
该第一区另外可以含有一个或多个周围的残基,这些残基与在这两个细胞外结构域折叠中较大的一个上的ATP结合位点的形成紧密相关。存在Lys 193、Phe 275和Arg 294。Arg 125位于这两个细胞外结构域折叠中的较小的一个中。因此,在某些实施方案中,该第一区进一步包括SEQ ID No:1残基的以下一个或多个:Arg 125、Lys 193、Phe 275和Arg294。将理解的是该第一区不仅仅是由这些残基组成的。即,如以上讨论的,该第一区限定了包括SEQ ID No:1的一个或多个残基的分子空间的区:这些残基被暴露用于由于具有在SEQ ID No:1中所示的序列的单体Pro210处的顺式异构化而结合到抗体的抗原结合位点上。在此背景下,Arg 125、Lys 193、Phe 275和Arg 294仅仅是另外提供的,但是并非替代例如Gly 200、His 201、Ash 202、Tyr 203、Thr 204、Thr 205、Arg 206、Asn 207、Ile 208、Leu 209的一个或多个残基。
典型地,该第二区是限定了包括SEQ ID No:1的一个或多个残基的分子空间的区。这些残基被暴露用于由于具有在SEQ ID No:1中所示的序列的单体Pro210处的顺式异构化而结合到抗体的抗原结合位点上。这些残基包括Lys 297、Tyr 298、Tyr 299、Lys 300、Glu 301、Asn 302、Asn 303、Val 304、Glu 305和Lys 306。在一个实施方案中,该第二区包括这些残基中的至少一个。典型地,该第二区包括这些残基中的至少4个,虽然它可以是更少的,例如2或3,这取决于在该第一区中存在多少残基。在一个实施方案中,该第二区包括至少1对在以下表3中示出的残基:
表3
在某些实施方案中,该第二区包括2对或更多对在以下表3中示出的残基。
该第二区另外可以包括一个或多个周围残基,这些残基与ATP结合位点的形成紧密相关。存在Arg 307和Lys 311。因此,在某些实施方案中,该第二区进一步包括Arg 307和/或Lys 311。将理解的是该第二区不是仅仅由这些残基组成的。即,如以上讨论的,该第二区限定了包括SEQ ID No:1的一个或多个残基的分子空间的区:这些残基被暴露用于由于具有在SEQ ID No:1中所示的序列的单体Pro210处的顺式异构化而结合到抗体的抗原结合位点上。在此背景下,Arg 307和Lys 311仅仅是另外提供的,但是并非替代例如Lys 297、Tyr 298、Tyr 299、Lys 300、Glu 301、Asn 302、Asn 303、Val 304、Glu 305和Lys 306的一个或多个残基。
在某些实施方案中,该表位是或包括一个直链表位。实例包括其中该第一区包括以下在表4中的SEQ ID No:1序列之一:
表4
Gly 200至Tyr 203 |
His 201至Thr 204 |
Ash 202至Thr 205 |
Tyr 203至Arg 206 |
Thr 204至Asn 207 |
Thr 205至Ile 208 |
Arg 206至Leu 209 |
在这些实施方案中,该表位的第二区可以包括以下在表5中的SEQID No:1序列之一:
表5
Lys 297至Lys 300 |
Tyr 298至Glu 301 |
Tyr 299至Asn 301 |
Lys 300至Asn 303 |
Glu 301至Val 304 |
Asn 301至Glu 305 |
Ash 303至Lys 306 |
在某些实施方案中,该第一区含有比该第二区更多的残基。在其他实施方案中,该第二区含有比该第一区更多的残基。
该第一和第二区各自可以含有从大约4至大约10个残基,例如5、6、7、8或9个残基。当在该第二区中存在多个残基时,则在该第一区中可以存在更少的残基,即,小于4,例如2或3个。同样的情况反之亦然。
如在此使用的,该第一和第二区彼此相邻安排在受体中,由此允许抗P2X7抗体的抗原结合位点结合到形成该表位的该第一和第二区上。更详细地,诸位发明人已经发现,虽然位于分开的单体上,该第一和第二区联合形成可以通过一种抗体的单一抗原结合位点结合的表位。通常,该表位的第一和第二区间隔开不超过大于40埃。如果该距离大于这个值,则该抗体结合亲和力倾向于降低,因为该抗原结合位点需要横过更大的距离跨过该受体之内的单体,在这种情况下结合了更少的残基。通常,该第一和第二区间隔开大约10埃,但是小于40埃的更大距离是有可能的,例如15、20、25、30、35埃。
在此描述的表位能以基本上纯化的或分离的形式提供,例如作为天然发生的P2X7受体的片段或作为合成或重组P2X7受体。
Marks等人(1992)BioTechnology[生物技术]10:779,描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟;Barbas等人(1994)Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809;Schier等人(1995)Gene[基因]169:147-155;Yelton等人(1995)J.Immunol.155:1994;Jackson等人(1995),J.Immunol.[免疫学杂志]154(7):3310;以及Hawkins等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]226:889,描述了高变区和/或框架残基的随机诱变,是本领域已知的用于抗原结合位点的亲和力成熟的程序的例子。在某些实施方案中,对编码在表1a或b中示出的一个或多个序列的核酸进行诱变处理,以产 生一个不同的序列库。然后针对包含非功能性P2X7受体的表位的目标对该库进行筛选。一种示例性的方法在此处的实例中示出。
在另一个实施方案中,在此提供了一种如以上描述的抗原结合位点,其中形成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的一个或多个氨基酸序列衍生自人类序列或处于人类序列的形式。
该抗原结合位点能以人源化形式存在,包括非人(例如鼠类)以及人免疫球蛋白序列。典型地,几乎所有的抗原结合位点的CDR序列是来自非人的种类,例如小鼠、大鼠或兔。在一些情况下,该抗原结合位点的框架残基也可以是非人的。当该抗原结合位点以全抗体的形式提供时,典型地至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)是人的,由此允许不同的人效应子功能。
用于对非人抗原结合位点进行人源化的方法是本领域熟知的,适当的方法的例子包括在以下文献中的那些:Jones等人(1986)Nature[自然],321:522;Riechmann等人(1988)Nature[自然],332:323;Verhoeyen等人(1988)Science[科学],239:1534。
在此描述的使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法对于产生人抗原结合位点以及人抗体是有用的。
而且,可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但是可以表达人免疫球蛋白基因的转基因哺乳动物。这些小鼠可以通过随机地或有目的地将人类重和轻链免疫球蛋白基因插入到胚胎干细胞中产生。可以通过插入或通过一些其他的重组事件,例如通过宿主JH区的纯合性缺失使宿主重链以及轻链免疫球蛋白基因变成是非功能性的。转染的胚胎干细胞被扩增并且微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠,然后对这些小鼠进行饲养以产生表达人抗原结合位点的纯合后代。用P2X7表位免疫之后,可以获得人单克隆抗体。转基因动物系统的一个益处是有可能生产治疗上有用的同种型,因为人人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排并且随后在这种转基因小鼠中经历类别转换以及体细胞突变。
通过替代表面暴露的残基使得本发明的包含CDR和FR的可变域具有更小的免疫原性,以使得该抗体作为自身而出现在免疫系统。Padlan,E.A.,1991,MoI.Immunol.[分子免疫学]28,489提供了一种示例性的方法。通常,亲和力被保留,因为在抗原结合位点附近的氨基酸残基的内部包装(internal packing)保持不变并且通常影响结合特征的CDR残基或 相邻残基在这些过程中将不被置换。
在另一个实施方案中,在此提供了一种抗P2X7受体免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、或包含一种如在此描述的抗原结合位点的scFv。
与全抗体相比,较低分子量的抗体片段具有改进的实体瘤接近以及更快的清除,这可能在治疗以及体内诊断应用中是特别有用的。
已经开发不同的技术来生产抗体片段,包括完整抗体的蛋白质分解消化以及宿主细胞内的重组表达。关于后者,如以下描述的,Fab、Fv和scFv抗体片段均可以在大肠杆菌中表达并且由大肠杆菌分泌,抗体片段可以从抗体噬菌体库分离出并且Fab′-SH片段可以从大肠杆菌中直接回收并且化学偶联以形成F(ab′)2片段。在另一种方法中,直接从重组宿主细胞培养物中分离出F(ab′)2片段。
在某些实施方案中,以单链Fv片段(scFv)的形式提供抗原结合位点。Fv和scFv适合用于减少在体内使用过程中的非特异性结合,因为它们具有完整的缺乏恒定区的结合位点。包含scFv的融合蛋白可以被构建成在scFv的氨基或羧基端产生效应蛋白的融合。优选地,scFv是处于由一个连接物融合到VL结构域上的VH结构域的形式。在一个实施方案中,该连接物是至少15个氨基酸的长度。典型地,该连接物是至少10个氨基酸的长度。在一个实施方案中,该连接物通常由甘氨酸或丝氨酸残基构成。典型地,该连接物是GGGGSGGGGSGGGGS。
在一个实施方案中,scFV具有以下序列:
MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSYPFTFGSGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSS
在另一个实施方案中,在此提供了一种双链抗体或三链抗体或包含如以上描述的抗原结合位点的其他多特异性抗体。可以使用允许多聚化的多肽结构域装配多特异性抗体。例子包括Fc和CH1的CH2和CH3区以及Cκ和λ区。可以使用其他天然发生的蛋白多聚化结构域,包括亮氨酸拉链结构域(bZlP)、螺旋-环-螺旋基序、Src同源结构域(SH2、SH3)以及EF手、磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域、或其他本领域乙酯的结构 域。
在另一个实施方案中,在此提供了一种融合蛋白或异源蛋白,包括如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体。
一种异源多肽可以重组融合或化学结合到本发明的一种抗原结合位点或含有该位点的分子的N或C端上。
该抗体或抗原结合位点融合到其上的异源多肽可以对于靶向表达P2X7受体的细胞是有用的,或者对于一些其他功能例如,纯化、或增加多肽的体内半寿期、或用于使用本领域已知的方法的免疫测定中是有用的。
在优选的实施方案中,一种标记氨基酸序列例如六组氨酸肽对于该融合蛋白的方便的纯化是有用的。其他包括但不限于“HA”标签,该标签相应于衍生自流行性感冒病毒血凝素蛋白的表位;以及“flag”标签。例如,本发明的scFv可以是用以下序列进行flag标记的以及His标记的:
MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASFRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSYPFTFGSGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTRHYSSRFFDVWGAGTTVTVSSAAADYKDDDDKAAAHHHHHH
此外,根据本发明的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化作用、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻挡基团的衍生作用、蛋白酶解切割进行修饰而连接到一种细胞配体或其他蛋白上等等。
本发明的抗原结合位点可以由通过肽键或改性的肽键(即,肽等排体)彼此连接的氨基酸组成,并且可以包含该20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。本发明的抗原结合位点可以通过天然的方法,例如翻译后加工或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。此种修饰作用在基础文本连同研究文献中进行了充分说明。修饰可以发生在该抗原结合位点的任何地方,包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基端或在例如碳水化合物部分上。应当理解的是,相同类型的修饰可以在一个给定的抗原结合位点中 的若干位点处以相同的或不同程度存在。而且,一个给定的抗原结合位点可以包含许多类型的修饰。抗原结合位点可以是例如由于泛素化作用的结果而分支的,并且它们可以是环状的,具有或没有分支。环状的、分支的以及分支的环状抗原结合位点可以从翻译后天然加工中产生或者可以通过合成方法制造。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基作用、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化作用、γ-羧化作用、糖基化、GPI锚的形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、豆蔻酰化作用、氧化、聚乙二醇化作用、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋作用、硒化、硫酸化、转移RNA介导的到蛋白质上的氨基酸添加(如精氨酰化),以及泛素化作用。
在另一个实施方案中,在此提供了一种偶联物,该偶联物处于如在此描述的结合到一种标记或细胞毒剂上的形式的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体或三链抗体的形式,该细胞毒剂是例如化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如,细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性的毒素,或其片段)或一种标记物,例如放射性同位素(即,一种放射性偶联物)。在另一方面,本发明进一步提供了使用免疫偶联物的方法。在一个方面,一种免疫偶联物包括共价附接到细胞毒性剂或可检测剂上的任何上述可变域。
在另一个实施方案中,在此提供了一种抗体用于结合到如以上描述的抗原结合位点,免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物上。
在另一个实施方案中,在此提供了一种编码如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物的核酸。
一种编码根据以上描述的通式中的任一种的CDR或FR的多核苷酸,或包含它的抗原结合位点可以从任何来源的核酸产生,例如通过化学合成或从cDNA或基因组文库分离。例如,cDNA文库可以从产生抗体的细胞(例如B细胞、浆细胞或杂交瘤)以及通过使用针对感兴趣的特定克隆的寡核苷酸的PCR扩增分离的有关核酸而产生。然后可以使用任何本领域已知的方法将分离的核酸克隆到载体中。然后使用本领域已知的方法将相关核苷酸序列进行诱变,例如重组DNA技术、位点定向诱变、PCR 等等(参加,例如在Sambrook等人1990,Molecular Cloning[分子克隆],A Laboratory Manual[实验室手册],2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港]中,N.Y.and Ausubel等人,eds.,1998,Current Protocols in Molecular Biology[当代分子生物学实验方案],John Wiley&Sons,NY中描述的技术),以产生具有不同的氨基酸序列的抗原结合位点,例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
在另一个实施方案中,提供了一种包含在此描述的核酸的载体。该载体可以是例如处于质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种不同的程序将适当的核酸序列插入到载体中。通常,使用本领域已知的技术将DNA插入到适当的限制性内切核酸酶位点中。载体组分通常包括但不限于一个或多个单一的序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、以及转录终止序列。使用本领域技术人员已知的标准连接技术构建适当的含一种或多种这些组分的载体。
可以不仅直接地而且还可以间接地作为具有异源多肽的融合多肽重组生产抗原结合位点,该异源多肽可以是一个信号序列或其他的在成熟蛋白质或多肽的N端处具有特异性切割位点的多肽。通常,该信号序列可以是该载体的一种组分,或者它可以是插入到该抗体中的编码抗原结合位点的DNA的一部分。该信号序列可以是一种选自例如下组的原核信号序列:碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或耐热肠毒素II前导序列。对于酵母分泌,该信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列、或酸性磷酸酶前导序列或白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导序列。在哺乳动物细胞表达中,哺乳动物信号序列可以用来指导蛋白质的分泌,例如来自相同或相关种类的分泌多肽的信号序列,连同病毒性分泌前导序列。
可以使用如以上描述的标准重组技术获得编码本发明的抗原结合位点的多肽组分的多核苷酸序列。可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一经获得,将编码该多肽的序列插入到一个能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。在本领域中可得的并且已知的许多载体可以用于本发明的目的。一种适当的载体的选择主要取决于有待插入到该载体中核酸的尺寸以及有待用这种载体转化的特定宿主细胞。每个载体包含不同的组分,取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达,或者两者)以及其与它将位于其中的特定宿主细胞的相容性。
通常,含有衍生自与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质 粒载体可以与这些宿主结合使用。表达以及克隆载体均含有一个使该载体能在一个或多个所选择的宿主细胞中进行复制的核酸序列连同能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。这样的序列对于多种细菌、酵母和病毒是熟知的。来自质粒DBR322的复制起点,含有编码氨苄西林(Amp)和四环素(Tet)抗性基因并且因此提供了用于鉴定转化细胞的更容易的手段,适合于大多数革兰氏阴性菌,2μm的质粒起点适合于酵母以及许多病毒源(SV40、多瘤、腺病毒、VSV或BPV)并且对于在哺乳动物中克隆载体是有用的。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可以含有或被修饰为含有可以被微生物有机体使用以表达内源性蛋白质的启动子。
此外,含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以与这些宿主结合作为转化载体使用。例如,噬菌体,例如λGEM.TM.-11可以被用于制造一种重组载体中,该载体可以用来转化易感的宿主细胞,例如大肠杆菌LE392。
本发明的表达载体可以包含两个或更多个启动子-顺反子(一个顺反子是含有所有用于产生单一多肽的信息的DNA的片段)对。一个启动子是位于顺反子上游(5′)的的调整其表达的未翻译调控序列。原核启动子典型地分为两个类别,诱导型以及组成型。诱导型启动子是一种引发顺反子在其控制下响应于培养条件的变化(例如,营养素的存在或缺乏或温度的变化)的升高的转录水平的启动子。
被多种潜在的宿主细胞识别的许多启动子是熟知的。选择的启动子可以通过从源DNA中经由限制性内切酶的酶解而移除启动子并且将所分离的启动子序列插入到本发明的载体中而可操作地连结到编码轻链或重链的顺反子DNA上。天然启动子序列以及许多异源启动子均可以用于来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中,使用了异源启动子,因为与天然目标多肽启动子相比,它们通常允许表达的靶基因的更好的转录以及更高的产量。
被多种潜在的宿主细胞识别的启动子是熟知的。适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳聚糖酶以及乳糖启动子系统,碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子,例如tac或trc启动子。用于细菌系统中的启动子还含有可操作地连接到编码本发明的抗原结合位点的DNA上的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。然而,在细菌中起作用的其他启动子(例如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适合的。 它们的核苷酸序列已经公开,因此使得技术人员能使用连接物或适配子可操作地将它们连接到编码目标轻链以及重链的顺反子上以提供任何所需要的限制酶切位点。
在本发明的一个方面,在重组体载体之内的每个顺反子包括一个分泌信号序列组分,该信号序列组分指导表达的多肽跨过膜的易位。通常,该信号序列可以是该载体的一种组分,或者它可以是插入到该载体中的目标多肽DNA的一部分。为了本发明的目的选择的信号序列应该是被宿主细胞识别并且加工(即,被一种信号肽酶切割)的一种序列。对于不会将该天然信号序列识别并且加工成异源多肽的原核宿主细胞,该信号序列被一种例如选自下组的原核信号序列取代,该组由以下各项组成:碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或耐热肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PeIB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中,在表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一个方面,根据本发明的免疫球蛋白的生产可以在宿主细胞的细胞质中发生,并且因此不需要在每个顺反子之内存在分泌信号序列。在此方面,表达了免疫球蛋白轻链和重链,在细胞质之内折叠并且组装形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB菌株)提供了有利于二硫键形成的细胞质条件,由此允许表达的蛋白质亚基的适当折叠和组装。
本发明提供了一种表达系统,其中表达的多肽组分的定量比率可以进行调节,以便将本发明的分泌并且适当组装的抗原结合位点的产量最大化。此种调节至少部分地通过同时调节这些多肽组分的翻译强度来实现。
就在真核宿主细胞中的表达而言,这些载体组分总通常包括但不限于一种或多种以下项:信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件、启动子、以及转录终止序列。
用于真核宿主细胞中的载体还可以含有信号序列或其他的在成熟蛋白或感兴趣的多肽的N端具有特异切割位点的多肽。所选择的异源信号序列优选地是被宿主细胞识别并且加工(即,被一种信号肽酶切割)的一种序列。在哺乳动物细胞表达中,哺乳动物信号序列连同病毒分泌前导序列,例如单纯疱疹gD信号是可得的。
将针对这样的前体区域的DNA连接在编码该抗体的DNA的阅读框中。
通常,复制组分的起点对于哺乳动物表达载体是不需要的。例如,典型地可以仅仅使用SV40起点,因为它含有早期启动子。
表达以及克隆载体典型地含有一种选择基因,也称为一种选择标记。典型的选择基因编码以下蛋白质:这些蛋白质(a)对抗生素或其他毒素(例如氨苄西林、新霉素、氨甲喋呤或四环素)赋予抗性;(b)补偿营养缺陷型缺陷,或(c)提供重要的但是从复合培养基不可得的营养素,例如编码针对杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子是利用一种药物来阻止宿主细胞的生长。使用一种异源基因成功地转化的那些细胞产生一种赋予抗药性的蛋白质并且因此在该选择方案中得以存活。这样的优势选择的例子使用了药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适合的用于哺乳动物细胞的选择标记的例子是使得能够鉴定接纳编码抗原结合位点的核酸的细胞组分的那些,例如DHFR或胸腺嘧啶核苷激酶、金属硫蛋白-I和-II、优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、等等。当使用野生型DHFR时,适当的宿主细胞是制备并且繁殖的缺乏DHFR活性的CHO细胞系(例如ATCC CRL-9096)。例如,用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在含有甲氨蝶呤(DHFR的一种竞争拮抗剂)的培养基中培养所有的转化体进行鉴定。可替代地,可以通过在包含针对一种选择标记(例如一种氨基糖苷类抗生素,例如卡那霉素、新霉素或G418)的一种选择试剂的培养基中的细胞生长来选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白以及另一种选择标记,例如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)。
表达以及克隆载体通常含有一种可操作地连接到编码抗原结合位点的核酸序列上以指导mRNA合成的启动子。通过多种潜在的宿主细胞识别的启动子是已知的。
真核基因通常具有位于引发转录的位点的上游大约25至30碱基处的富含AT区域。在许多基因转录起始点的上游的70至80碱基处所发现的另一个序列是其中N可以是任何核苷酸的CNCAAT区域。在大多数的真核基因的3′端处是一个AATAAA序列,该序列可以是用于在该编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有的这些序列适合于插入到真核表达载体中。
适合的与酵母宿主一起使用的启动序列的例子包括针对以下个项的启动子:3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶,包括烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、以及葡萄糖激酶。
具有由生长条件控制的另外的转录优点的诱导型启动子的其他酵母启动子是对于以下项的启动子区域:醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮素代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶以及对于麦芽糖和半乳糖的利用负责的酶。
来自哺乳动物宿主细胞中的载体的抗原结合位点的转录是例如通过以下各项进行控制的:从病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及猿猴病毒40(SV40))的基因组获得的启动子,来自异源哺乳动物启动子,例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子以及热激启动子,条件是此类激动子与这些宿主细胞系统是相容的。
由更高的真核生物的编码抗原结合位点的DNA的转录可以通过将一个增强子序列插入到载体中而增加。增强子序列包括已知的来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎儿球蛋白以及胰岛素)的那些。然而,典型地,人们使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点(bp 100-270)的后期侧(late side)上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后期侧上的多瘤增强子以及腺病毒增强子。
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还含有对于转录的终止以及对于稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′以及有时候3′非翻译区获得。这些区域含有在编码抗原结合位点的mRNA的非翻译部分中的作为聚腺苷酸化片段转录的核苷酸片段。
在另一个实施方案中,在此提供了一种包含以上所述的载体或核酸的细胞。该核酸分子或载体可以在基因修饰的宿主细胞或宿主中存在,或者作为基因组外的独立的分子,优选地作为能够复制的分子,或者它可以稳定地整合到该宿主细胞或宿主的基因组中。
本发明的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。
原核细胞的例子是通常用于克隆像大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的那些。此外,真核细胞包括例如真菌或动物细胞。
适当的真菌细胞的例子是酵母细胞,优选酵母属的那些并且最优选酿酒酵母种类的那些。
动物细胞的例子是例如昆虫细胞、脊椎动物细胞,优选哺乳动物细胞,例如像HEK293、NSO、CHO、MDCK、U2-OS、Hela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、lMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。这些宿主细胞,例如CHO细胞可以为本发明的抗体分子提供翻译后修饰,包括前导肽的去除、H(重)和L(轻)链的折叠和组装、适当侧的分子糖基化以及功能分子的分泌。
本领域中已知的另外的适当的细胞系从从细胞系贮藏所,例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)处可获得。
在另一个实施方案中,在此提供了一种包含以上所述的细胞的动物。在某些实施方案中,包含转基因的动物及其组织在生产本发明的抗原结合位点中是有用的。作为转基因将核酸分子引入到非人宿主中以及它们随后的表达可以用于生产抗原结合位点,例如这样的转基因在转基因动物的乳中的表达提供了用于获得定量的抗原结合位点的手段。在这个方面有用的转基因包括本发明的核酸分子,例如针对在此描述的抗原结合位点的编码序列,其可操作地连接到来自乳腺特异性基因的启动子和/或增强子(像,酪蛋白或β-乳球蛋白)结构上。该动物可以是非人的哺乳动物,最优选小鼠、大鼠、绵羊、牛、狗、猴子或猿。
在另一个实施方案中,在此提供了一种药物组合物,包含如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物以及一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
用于制备其抗原结合位点或将其施用到对其有需要的一位受试者上的方法是本领域人员已知的或者可以很容易确定的。该抗原结合位点的给药途径可以是口服、肠胃外,通过吸入或局部给药。
如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。
虽然所有这些给药形式是如本发明的范围内清楚地考虑到的,一种 给药形式是用于注射的溶液,特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。经常,适合的用于注射的药物组合物可以包含一种缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、一种表面活性剂(例如聚山梨醇酯),任选地一种稳定剂(例如,人血白蛋白)、等等。
肠胃外给药的制剂包含无菌水溶液或非水溶液、悬浮液以及乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油,例如橄榄油以及可注射有机酯,例如油酸乙酯。水性载体包含水、醇/水溶液、乳液或悬浮液,包括盐水和缓冲介质。在主题发明中,药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M并且优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8%的盐水。其他普通的肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或固定油。静脉内载体包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)、等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂,例如像,抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体,等等。
更具体地说,适合于可注射用途的药物组合物包含无菌的水性溶液(适当时是水溶性的)或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的即时制备的无菌粉末,在这样的情况下,该组合物必须是无菌的并且应当是以容易注射的程度存在的流体。它应该是在制造以及存储条件下稳定的并且优选地针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存的。该载体可以是含有例如水,乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇,等等)的溶剂和分散介质,以及它们的适当的混合物。适当的流动性可以例如通过使用一种涂层(例如卵磷脂)通过保持在分散体的情况下所需要的粒径并且通过使用表面活性剂来维持。用于在此披露的治疗方法中的适当的配制品描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书],Mack Publishing Co.,16th ed.(1980)中。
防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌以及抗真菌剂,例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等来实现。在许多情况下,优选的是在该组合物中包含等张剂,例如糖、多元醇,例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含一种延缓吸收的试剂,例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可以通过将一种活性化合物(例如,抗原结合位点)以所需要的量与如所需要的一种或多种在此列举的成分组合,接着过滤灭菌来制备。通常,通过将该活性化合物结合到一种无菌载体中来制备分散体,该载体含有一种基础分散体介质以及所需要量的来自以上列举的那些 的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥,这产生了活性成分加任何另外的来自以上的其无菌过滤溶液的所希望的成分的粉末。对用于注射的制剂进行加工,过滤到容器例如安瓿、袋、瓶子、注射器或小瓶中,并且在根据本领域已知的无菌条件下进行密封。此外,这些制剂能以试剂盒的形式包装并且出售。这样的制造物品优选地具有标签或包装说明书(package insert),指明相关组合物对于治疗具有或易于患有失调的受试者是有用的。
本发明的组合物用于治疗如在此描述的失调的有效剂量取决于许多不同因素而改变,包括给药手段、目标位置、患者的生理状态,患者是否是人或动物、给予的其他药物治疗,以及治疗是预防性还是治疗性的。通常,患者是人但是非人哺乳动物包括转基因的哺乳动物也可以进行治疗。治疗剂量可以使用本领域普通技术人员已知的常规方法逐步增高剂量以优化安全性和效果。
对于治疗具有一种抗原结合位点的某些失调,剂量的范围可以是例如从大约宿主体重的0.0001至100mg/kg,并且更通常是0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、等等)。例如,剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内,优选至少1mg/kg。在以上范围内的剂量中间值也是旨在本发明的范围之内。可以对受试者每天、隔天、每周或根据经验分析确定的任何其他方案给予此剂量。示例性的治疗要求在一个延长的时期(例如,至少六个月)内以多个剂量给药。另外的示例性治疗方案要求每两周一次或每个月一次或每3至6个月一次给药。示例性的剂量方案包括1-10mg/kg或15mg/kg持续连续天,隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中,同时给予具有不同的结合特异性的两种或更多种抗原结合位点,在这种情况下所给予的每种抗原位点的剂量落在所指明的范围之内。
在此披露的抗原结合位点可以在多种情况下给药。单一剂量的之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔还可以是不规则的,如通过测量患者中的目标多肽或目标分子的血液水平所指示的。在一些方法中,对剂量进行调节以实现1-1000μg/mL的血浆多肽浓度并且在一些方法中是25-300μg/mL。可替代地,抗原结合位点可以作为持续释放的配制品给药,在这种情况下需要更低频率的给药。剂量和频率取决于患者中的抗原结合位点的半寿期而改变。抗原结合位点的半寿期还可以通过融合到一个稳定的多肽或部分,例如清蛋白或PEG上而延长。通常,人源化抗体显示出 最长的半寿期,接着是嵌合抗体以及非人抗体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合位点能以未结合的形式给药。在另一个实施方案中,用于在此披露的方法中的抗原结合位点能以未结合的形式多次给药。仍然在另一个实施方案中,本发明的抗原结合位点能以未结合的形式,然后以结合的形式给药,或反之亦然。
给药的剂量和频率可以取决于该治疗是预防性的或治疗性的而改变。在预防性的应用中,将包含抗体或其混合物的组合物给予并未在疾病状态中或在疾病前状态的患者以增强患者的抵抗力。这样一个量被定义为“预防有效剂量”。在这种使用中,精确的量再次取决于患者的健康状态以及全身免疫,但是通常范围是从0.1至25mg每剂量,尤其是0.5至2.5mg每剂量。较低的剂量是以较不频繁的间隔经过长的时期而给予。一些患者为了他们余下的生命而继续接受治疗。
在治疗应用中,有时候要求较高的剂量(例如,从大约1至400mg/kg的结合分子,例如每剂量的抗原结合位点,剂量是从5至25mg对于放射性免疫偶联物是更常使用的并且对于细胞毒素-药物结合的分子的剂量更高)以较短的间隔直至疾病的进展降低或结束,并且优选地直至患者表现出部分或完全的疾病症状的改善。此后,给予该患者一个预防性方案。
在一个实施方案中,对于一位受试者可以使用编码抗原结合位点的核酸分子(例如在载体中)进行治疗。对于编码多肽的核酸分子的剂量范围是每位患者从大约10ng至1g,100ng至100mg,1μg至10mg或30-300μgDNA。对于传染性病毒载体的剂量从每剂量10至100个或更多个病毒体而改变。
治疗剂可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内手段给药用于预防性和/或治疗性的治疗,在一些方法中,将药剂直接注射到其中非功能性受体细胞已经累积的特定组织中,例如颅内注射。肌内注射或静脉输注对于抗体的施用是优选的,在一些方法中,将特定的治疗抗体直接注射到颅骨中,在一些方法中,抗体作为持续释放的组合物或装置而给予。
本发明的抗原结合位点可以任选地与对于需要治疗的疾病或病症的治疗有效的(例如预防性或治疗性的)其他药剂联合给予。
在另一个实施方案中,在此提供了一种药物组合物,包含如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链 抗体、三链抗体、融合蛋白或偶联物以及一种稀释剂以及任选地一种标记。
在某些实施方案中,抗原结合位点或包含它们的分子是可检测地标记的。可以使用许多不同的标记,包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物以及生物发光化合物。通常使用荧光染料(荧光黄、罗丹明、德克萨斯红、等等)、酶(辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、等等)、放射性同位素(32P或125I)、生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物发光化合物(二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓)。
检测方法取决于所使用的标记的类型并且包含放射自显影法、荧光显微法、直接以及间接酶促反应。例子包括蛋白质印迹法、覆盖测定、RIA(放射性免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、以及CLIA(化学发光免疫测定)。
在另一个实施方案中,在此提供了一种试剂盒或制造物品,包含如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。
在其他实施方案中,在此提供了一种用于以上提及的治疗应用中的试剂盒,该试剂盒包括:
一个用于容纳处于一种或多种以下形式的治疗组合物的容器:抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物;
具有使用说明的一个标签或包装说明书。
在某些实施方案中,该试剂盒可以包含一种或多种另外的活性成分或组份,用于治疗一种癌症或用于防止以上描述的与癌症有关的并发症、或与非功能性P2X7受体表达相关的病症或疾病。
该试剂盒或“制造物品”可以包括一个容器以及在该容器上或与其相关的一个标签或包装说明书。适合的容器包括例如,瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装、等等。这些容器可以是从许多种材料(如玻璃或塑料)形成的。该容器容纳了一种治疗组合物,该组合物对于治疗病症是有效的并且可以具有一个灭菌的进入口(例如,该容器可以是一种静脉内溶液袋或具有一个由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。该标签或包装说明书指示了该治疗组合物是用于治疗选择的病症。在一个实施方案中,该标签或包装说明书包括使用说明并且指示了该治疗组合物可以用来治疗癌症或预 防起源于癌症的并发症。
该试剂盒可以包括(a)一种治疗组合物;以及(b)一个第二容器,该容器具有包含在其中的一种第二有效成分或组份。本发明的这个实施方案中的试剂盒可以进一步包括一个包装说明书,指示了该治疗组合物以及其他活性成分可以用来治疗一种疾病或预防起源于癌症的一种并发症。可替代地或此外,该试剂盒可以进一步包括一个第二(或第三)容器,该容器包括一种药学上可接受的缓冲剂,如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、以及葡萄糖溶液。它还可以进一步包含来自一种商用的以及使用者立场的其他的所期望的材料,包括其他的缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、以及注射器。
在某些实施方案中,该治疗组合物能以一种一次性或可重复使用的装置的形式提供,包括用于容纳该治疗组合物的一个贮器。在一个实施方案中,该装置是注射器。该装置可以容纳1-2mL的治疗组合物。该治疗组合物可以被提供在一个装置中,其状态是即用的或处于需要混合或加入另外的组分的状态。
在另一个实施方案中,在此提供了一种试剂盒或制造物品,包括:如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或诊断组合物。
在其他实施方案中,在此提供了一种用于以上描述的诊断应用中的试剂盒,该试剂盒包括:
一个用于容纳处于一种或多种以下形式的诊断组合物的容器:如以上描述的抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、或偶联物;
具有使用说明的一个标签或包装说明书。
该试剂盒或“制造物品”可以包括一个容器以及在该容器上或与相关的一个标签或包装说明书。适当的容器包括例如,瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装、等等。该容器可以是从许多种材料(如玻璃或塑料)形成的。该容器容纳了一种诊断组合物,该组合物对于检测癌症是有效的并且可以具有一个无菌进入口(例如,该容器可以是一种静脉内溶液袋或具有一个由皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。该标签或包装说明书指示了该诊断组合物是用于检测所选择的病症。在一个实施方案中,该标签或包装说明书包括使用说明并且指示了该诊断组合物可以用来检测癌症或特征为非 功能性P2X7受体表达的疾病或病症。
该试剂盒可以包括(a)一种诊断组合物;以及(b)一个第二容器,该容器具有包含在其中的一种第二诊断试剂或第二标签。它还可以进一步包含来自一种商业的以及使用者立场的其他的所期望的材料,包括其他的缓冲剂、稀释剂、过滤器、等等。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于生产如以上描述的抗P2X7抗原结合位点的方法,包括在如以上描述的一种细胞或非人动物中表达如以上描述的一种核酸。
本发明的抗原结合位点的生产通常需要一种含有多肽的表达载体,该多肽编码本发明的抗原结合位点。编码本发明的抗原结合位点的多肽可以获得并且被亚克隆到一种载体中,用于通过重组DNA技术使用本领域已知的技术(包括在此描述的技术)生产一种抗原结合位点。可以考虑许多不同的表达系统,包括使用使用哺乳动物细胞(包括人细胞)用于生产并且分泌抗原结合位点。细胞的实例包括293F、CHO和NSO细胞系。
可以使用本领域已知的方法来构建含有编码蛋白质的序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些包括体外重组DNA技术,合成技术和体内基因重组。在某些实施方案中,在此提供了一种可复制的载体,该载体具有一种编码一种可操作地连结到启动子上的抗原结合位点的核酸。
可以通过常规技术培养用一种表达载体转染的细胞以生产一种抗原结合位点。因此,在某些实施方案中,在此提供了包含一种多核苷酸的宿主细胞或细胞转染子,该多核苷酸编码了一种可操作地连接到启动子上的本发明的抗原结合位点。该启动子可以是异源的。可以利用许多种宿主表达载体系统并且在某些系统中该载体系统的转录机构特定地与该宿主细胞匹配。例如,可以使用包含来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体转染哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。另外地或可替代地,可以使用一种这样的宿主细胞,该细胞调整插入的序列的表达或如所需要修饰并且加工基因产物,包括不同形式的翻译后修饰。具有特定的的翻译后修饰过程的哺乳动物宿主细胞的例子包括CHO、VERY、BHK、HeIa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NSO、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。
取决于蛋白质分子的预期用途,可以有利地选择许多细菌表达载体。在一个实例中,可以使用引起高水平的易于纯化的融合蛋白产物的表达的载体,例如大肠杆菌表达载体pUR278,其中产生了大量的抗原结合位点。该表达产物能以一种具有lacZ的融合蛋白的形式生产。其他细菌载体包括pIN以及类似物。可以使用pGEX载体来将外来多肽表达为具有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白。通常,这些融合蛋白是可溶的,并且可以容易地通过吸附并且结合到谷胱甘肽-琼脂糖亲和基质上、之后在游离谷胱甘肽的存在下进行洗脱而从溶解细胞中纯化。可以在表达多肽中提供凝血酶和/或因子Xa蛋白酶切割位点使得所克隆的靶基因产物可以从该GST部分释放。
菖蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作一种在昆虫系统(包括草地贪夜蛾细胞)中表达外来基因的载体。所使用的特定启动子可以取决于该蛋白编码是否插入到该序列中。例如,该序列可以单独地克隆到该多角体蛋白基因中并且置于在该多角体蛋白启动子的控制下。
可以与哺乳动物细胞一起利用基于病毒的表达系统,例如腺病毒,由此感兴趣的编码序列可以被连接到腺病毒后期启动子以及三联前导序列上。然后可以使用体内或体外重组将这种嵌合体的基因插入到该腺病毒基因组中。插入区域E1或E3将会导致一种活的重组病毒,该病毒能够在感染的宿主细胞中表达该抗原结合位点。对于所插入的抗原结合位点编码序列的有效翻译需要包含ATG起始密码子以及相邻序列的特定引发信号。引发和翻译控制信号以及密码子可以获自多种不同来源,包括天然及合成两者。可以使用转录增强子元件以及转录终止子来增强一种基于病毒的系统的表达效率。
当需要重组蛋白的长期、高产率产生时,稳定表达是优选的。通常,使用一种选择标记基因,由此在转染之后,细胞在富集培养基中生长1-2天并且然后转移到一种含有选择性培养基的介质中,其中可以筛选含有相应的选择标记例如抗生素抗性的细胞。结果是具有质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长了并且形成了进而可以克隆并且扩增成细胞系的病灶。单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶以及腺嘌呤磷酸转移酶基因分别是tk-、hgprt-或aprT-细胞中使用的基因的例子,由此提供了适当的选择系统。在抗代谢选择系统中可以使用以下基因的例子是:dhfr,赋予对甲氨蝶呤的抗性;gpt,赋予对霉酚酸的抗性;neo,赋予对氨基糖甙G-418的抗性;以及hygro,赋予对潮霉素的抗性。
本发明的抗原结合位点可以通过一种重组表达系统通过已知的方法进行纯化,包括离子交换色谱法、亲和色谱法(尤其是针对特定的抗原蛋白A或蛋白G的亲和力)以及凝胶过滤柱色谱法、离心、差别溶解度,或通过蛋白质纯化的任何其他标准技术。通过提供处于融合蛋白形式的抗原结合位点可以促进纯化。
可以通过一种可升级的过程从一种中试表达系统开始在一个研究实验室中生产本发明的大量抗原结合位点,该实验室可以按比例放大到任何分析级别的生物反应器(典型地从5L到约50L的生物反应器)或生产规模的生物反应器(例如,但不限于75L、100L、150L、300L、或500L)。所希望的可升级的过程可以包括其中如通过HPSEC或rCGE测量存在低到不可检出水平的聚集的那些,典型地是不大于按重量计5%的蛋白聚集向下至不大于按重量计0.5%的蛋白聚集。另外地或可替代地,就代表该完整的抗原结合位点的总峰面积而言,所测量的不可检出水平的片段化在一个可升级的过程中可能是所希望的,使得至少80%并且高达99.5%或更高的总峰面积代表完整的抗原结合位点。在其他实施方案中,本发明的可升级的的过程以大约从10mg/L至大约300mg/L或更高的生产效率生产抗原结合位点。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于治疗个体中特征为非功能性P2X7受体表达的疾病或病症的方法,包括对需要针对所述病症的治疗的个体提供在此描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物。典型地,该病症是癌症,尤其是如在此描述的上皮癌。在某些实施方案中,该个体具有转移癌症或具有癌症转移的潜在性。
癌前期疾病以及肿瘤性疾病是可以应用本发明的方法的具体实例。广泛的例子包括乳房肿瘤、结肠直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞瘤、肝瘤/胆管癌(cholongio)、癌、神经内分泌肿瘤、垂体肿瘤、小20圆细胞瘤、鳞状细胞癌、黑素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、间质-睾丸间质细胞肿瘤、塞托利细胞瘤、皮肤肿瘤、肾肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口腔肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食管肿瘤、喉瘤、肝脏肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤以及肾母细胞瘤。
具体的癌症的例子包括但不限于:腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、牙瘤(adontoma)、艾滋病相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白 血病、急性髓性白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、特发性骨髓外化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞瘤、血管角化瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸细胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、胺前体摄取脱羧细胞瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干胶质瘤、大脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、鳃原瘤、中枢神经系统肿瘤、类癌瘤、子宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、癌(Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、布朗-皮尔斯癌、导管癌、艾氏瘤、克雷布斯2、梅克尔细胞癌、粘液癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌)、癌肉瘤、宫颈非典型增生、叶状囊肉瘤(cystosarcoma phyllodies)、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼:黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、胃癌、胃肠癌、胃肠类癌瘤、泌尿生殖系统癌、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、妇科癌症、巨细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、血管球瘤、颗粒细胞瘤、两性胚细胞瘤、血液学恶性肿瘤、毛细胞性白血病、头颈部癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多症、霍奇金病、人类乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽癌、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞疾病、恶性组织细胞病、组织细胞瘤、肝瘤、汗腺腺瘤、软骨肉瘤、免疫增生性小肠疾病(immunoproliferative small)、opoma、眼内黑素瘤(ontraocular melanoma)、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、李弗劳明综合征(li-fraumeni syndrome)、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤(leigomyosarcoma)、白血病(如B细胞、混合细胞、裸细胞、T细胞、T细胞慢性、HTLV-II-相关性质、淋巴管肉瘤、淋巴细胞性急性、淋巴细胞性慢性、肥大细胞性和髓性)、白血病性肉瘤、睾丸间质细胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管细胞瘤(lymphangiocytoma)、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤(lymphagiomyoma)、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、肾恶性横纹肌样瘤、 髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、恶性类癌综合征、类癌心脏病、髓母细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、间叶瘤、中肾瘤、间皮瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(nsclc)、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、肿瘤(如骨、乳腺、消化系统、结肠直肠、肝)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌(ostomy ovarian cancer)、胰腺癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、腮腺肿瘤、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见癌症和相关疾病(rare-cancers-and-associated-disorders)、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性血管萎缩性皮肤异色病(Rothmund-Thomson syndrome)、网状内皮组织增殖、横纹肌瘤、唾液腺肿瘤、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌(sclc)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌-(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(如实验性尤因肉瘤,卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、睾丸支持细胞瘤、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾脏-骨盆-/-输尿管)、滋养细胞癌、畸胎瘤、泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养层肿瘤、尿道癌、泌尿系统癌症、膀胱癌(uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
其他疾病和病症,包括各种炎性病症。例子可能包括一种增生性组分。具体的例子包括:痤疮、心绞痛、关节炎、吸入性肺炎、疾病、脓胸、肠胃炎、炎症、肠型感冒(intestinal flu)、nee、坏死性小肠结肠炎、盆腔炎、咽炎、盆腔炎症性疾病(pid)、胸膜炎、咽喉肿痛(raw throat)、发红、皮肤发红(rubor)、喉咙痛、胃型感冒(stomach flu)和尿路感染、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病或慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病。
在另一个实施方案中,在此提供了以上描述的抗原结合位点,免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFsv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或药物组合物用于制造一种治疗癌症的药物的用途。
以上对剂量的量、给药频率、给药途径等进行了详细说明。
在另一个实施方案中,在此提供了一种用于诊断癌症的方法,包括以下步骤:将有待确定存在或不存在癌症的组织或细胞与一种试剂接触,该试剂处于如以上描述的一种抗原结合位点、免疫球蛋白可变域、抗体、Fab、dab、scFv、双链抗体、三链抗体、融合蛋白、偶联物或诊断组合物的形式,然后检测该试剂与组织或细胞的结合。该方法可以在体内或体外操作。
对于在原位诊断,可以将该抗原结合位点给予有待通过静脉内、鼻内、腹膜内、大脑内、动脉内注射或其他途径诊断的生物,使得可以在根据本发明的抗原结合位点与非功能性P2X7受体上的表位区之间发生一种特异性结合。该抗体/抗原复合物可以方便地通过附接到该抗原结合位点或其功能片段上的标记或任何其他本领域已知的检测方法进行检测。
在根据本发明的诊断应用中所使用的并且如在此描述的免疫测定典型地依赖于标记抗原、抗体或用于检测的二级试剂。这些蛋白质或试剂可以用通常本领域的普通技术人员已知的化合物标记,包括酶、放射性同位素和荧光、发光以及发色物质,这些物质包括但不限于着色颗粒,例如胶体金以及胶乳珠。在这些中,放射性标记可以用于几乎所有类型的测定并且具有最大的变化。当放射活性必须避免或当需要快速结果时,酶结合标记是特别有用的。荧光染料,虽然其使用需要昂贵的设备,但是提供了非常灵敏的检测方法。在这些测定中有用的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体以及亲和纯化的多克隆抗体。
可替代地,该抗原结合位点可以间接地通过与对免疫球蛋白具有亲和力的标记物质(例如蛋白A或G或第二抗体)反应而进行标记。该抗原结合位点可以与一种第二物质结合并且用一种对结合到该抗原结合位点上的第二物质具有亲和力的一种标记的第三物质检测。例如,该抗原结合位点可以结合到生物素上并且该抗原结合位点-生物素偶联物使用标记的抗生物素蛋白或链霉亲和素进行检测。类似地,该抗原结合位点可以结合到一种半抗原上上并且该抗原结合位点-半抗原偶联物使用标记的抗半抗原抗体进行检测。
在某些实施方案中,免疫检测利用了一种双抗体法用于检测一种分析物的存在,其中该抗原结合位点通过与一种第二抗体的反应性间接标记,该第二抗体已经用一种检测标记进行了标记。该第二抗体优选地是一种结合到该抗原结合位点由其衍生的动物的抗体上的抗体。换言之,如果该抗原结合位点是一种小鼠抗体,则该标记的第二抗体是一种抗小鼠抗 体。对于有待在此处描述的测定中使用的抗原结合位点,这种标记优选地是一种抗体包被的珠粒,优选一种磁珠。对于有待在此处描述的免疫测定中使用的抗原结合位点,这种标记优选地是一种可检测分子,例如放射性的、荧光的或电化学发光的物质。
一种替代的双抗体系统,经常称为快速格式系统,因为它们被适配为快速确定一种分析物的存在,因此也可以用于本发明的范围内。该系统要求在该抗原结合位点与分析物之间的高亲和力。根据本发明的一个实施方案,使用一对抗原结合位点(每个对于P2X7受体蛋白是特异的)确定该非功能性P2X7受体的存在。所述抗原结合位点对之一在此被称为“检测抗原结合位点”并且所述抗原结合位点对中的另一个在此被称为“捕捉抗原结合位点”。本发明的抗原结合位点可以作为一个捕捉抗原结合位点或检测抗原结合位点使用。本发明的抗原结合位点还可以在一个单独测定中作为一个捕捉抗原结合位点以及检测抗原结合位点一起使用。因此本发明的一个实施方案使用了双抗原结合位点包夹法,用于检测生物流体样品中的非功能性P2X7受体。在这种方法中,该分析物(非功能性P2X7受体蛋白)夹在该检测抗原结合位点与该捕捉抗原结合位点之间,该捕捉抗原结合位点不可逆地固定到一个固体支持物上。该检测抗原结合位点含有一种可检测标记,以便鉴定该抗原结合位点-分析物夹心的存在以及因此该分析物的存在。
示例性的固相物质包括但不限于微量滴定板、聚苯乙烯试管、磁性、塑料或玻璃珠以及在放射性免疫测定和酶免疫测定领域中已知的载玻片。用于将抗原结合位点连接到固相上的方法是本领域普通技术人员已知的。最近,许多多孔材料,例如尼龙、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维以及其他多孔聚合物已经被用作固体支持物。
以下实例旨在展示但绝非限制本发明。
实例
实例1-2F6抗体的产生和纯化
目的:此处描述的实验详述了结合到表达在活细胞上的P2X7受体上的抗体的产生和纯化。具体地,这些实验描述了具有如在SEQ ID NO:4(2F6)中所示的序列的抗体的产生和纯化。
背景:结合一种P2X7受体单体的抗原结合位点是已知的,然而迄 今为止,还不知道特异性地结合到三聚物形式的表达在活细胞上的P2X7受体上的构象表位上(从而特异性地跨过相邻单体之间的界面)的抗体。如在癌细胞中发生,当这些受体不能结合ATP时,在所暴露的在一个单体上具有残基200-210的与在相邻单体上具有残基296-306的单体之间的正确填充界面(correctly packed interface)处形成ATP结合位点。
材料与方法:E200和E300肽的产生。通过在Chiron Mimotopes的固相合成制造了部分地由通过添加二肽GA间隔开的肽E200(在人P2X7受体序列中的残基200-211)以及肽E300(在人P2X7受体序列中的残基295-306)形成的复合肽表位E200-300。合成了一系列的偶联物以鉴定对于筛选目的最可能有用的那些。这些包括经由马来酰亚胺己酰-N-羟基琥珀酰亚胺(MCS)连接到在E200-300肽上的C-端Cys残基上的蛋白偶联物BSA、DT、卵白蛋白以及KLH。一个第四变体涉及在C端对该多肽E200-300进行生物素酰化。
使用结合到白喉类毒素(E200-300DT)上的E200-300在第0、16、37、56、88和162天使用25μg/剂量免疫BALB-C小鼠。在第0天以CpG佐剂给予皮下注射(ImmunoEasy,Lot#11547836、11235150&11549008,Qiagen)。在第16、37和88天给予半皮下注射和半肌内(im)注射。在第56和162天给予静脉内(iv)注射。最后静脉追加(boost)之后第四天,将免疫的小鼠放血并且针对抗P2X7E200-300活性通过ELISA对其血清进行筛选。将展现出最高的抗-P2X7E200-300滴度的三只动物处死并且移出它们的脾脏。将脾脏细胞分离并且以5∶1的比率融合到小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0的细胞中。将融合细胞铺板于RPMI 1640培养基中。依次地在添加有小鼠IL-6的HAT中接着在HT中选择杂交瘤。适当的前导克隆最初在固相和溶液相筛选中鉴定为ELISA阳性克隆。在由克隆抗体产物对该宿主细胞的存活作用诱导沉默之前,提取出低亲和力结合剂并且然后根据前导克隆对DNA进行测序。
结果:在将这些融合的细胞铺板于8x 96孔板中并且在两个克隆步骤之后,通过稀释到每孔0.3个细胞,通过ELISA将与P2X7E200-300牛血清白蛋白(BSA)偶联物反应的一个克隆连接,存活并且指定为2F6。将该克隆物进行亚克隆并且对指定为2F61-2F24的24个产物各自进行测序。这些抗体在每种情况下是具有κ链的IgM类别。
每个亚克隆被证实具有相同的序列。将VH和VL链提取出并且拼接成一个小鼠IgG2a序列(图2和图3)用于进一步分子开发目的,而IgM 在小鼠腹水中产生用于进一步表征。
图6显示了用于生物化学表征的C端FLAG和HIS标签标记的2F6scFv的序列。
小鼠IgG2a-2F6在用带有G418抗性的pcDNA3.1-mIgG2a-2F6转染的亲本HEK293细胞中产生。将这些细胞在G418中选择持续21天以产生抗性集合(resistant pool)。
在37℃下在一个Wave生物反应器中用Sartorius 20L CultiBag对经过七天的批次培养物进行稳定表达。该表达在Invitrogen Freestyle 293表达培养基中进行,其中用CO2控制将pH维持在7.3与6.8之间。将该培养物进行离心以除去这些细胞并且对收获的上清液迅速处理。
表6:细胞培养概述
细胞计数通过Cedex HiRes,Innovatis上的台盼蓝排除法进行
将获得的上清液的pH调节到7.1并且0.2μm过滤之后过夜加载到61mL的蛋白A柱上(GE Healthcare,rProtein A Sepharose FF)。在使用之前将该柱用2CV的0.1%Triton X-100清洗接着使用在20%的乙醇中的0.1M的乙酸清洁。以相反的方向使用0.1M乙酸的不连续的梯度将抗体从该柱中洗脱出。使用1M的乙酸钠将洗脱峰中和到pH 5。
表7:蛋白A色谱法概述
将中和峰进行0.2μm过滤以在阴离子交换之前除去任何微粒。将过滤的中和峰加载到54mL的阴离子交换柱(GE Healthcare,Q Sepharose FF)上。将该柱在高盐洗涤以及在0.1M乙酸(pH 5.0)中平衡之前洗涤并且用0.5M氢氧化钠进行清洁。电泳缓冲液是0.1M乙酸(pH 5.0)。对于从该阴离子交换步骤的流过物进行收集。
表8:阴离子交换色谱概述
将浓缩的阴离子交换的流过物直接地加载到一个140mL的脱盐柱(GE Healthcare,Sephadex G-25fine)上。将该柱在1x DPBS中平衡之前用0.2M的氢氧化钠进行清洗并且清洁。电泳缓冲液是1x DPBS。
在一个生物安全柜中,将该脱盐产物过滤通过一个0.2μm过滤器至一个无菌容器中。最终产物样品从该过滤的本体中无菌移出。将该过滤的本体以及最终产物在4℃下储存。
表9:缓冲液更换概述
对最终产物进行蛋白质浓度、内毒素、DNA含量、纯度以及聚集测定。在分析之前,将该产物在4℃下储存。
表10:最终产物的测定结果概述
将来自2F6的同一小鼠scFv移植到IgG1型人模型中并且同样地在HEK293细胞中表达。
结论:鉴定了对于活细胞上的P2X7受体的高亲和力结合的处于前导序列形式的抗原结合位点。当将该下面的ATP结合位点暴露于非功能性受体构象中时,对这些抗原结合位点进行选择以跨过形成该三聚受体的相邻单体之间的界面。目标化合物表位在该能功能组装的受体的单一构象上保持难接近,以避免与正常的表达P2X7受体的细胞的所有交叉反应性
实例2-2F6抗体形式的生物化学表征
目的:为了确定2F6抗体形式(包括IgM和小鼠IgG2a)是否结 合到活细胞表面上的非功能性受体上。而且,为了确定2F6抗体形式是否抑制了一种细胞(例如表达非功能性P2X7受体的癌细胞)的特性。
背景:已知的是癌细胞表达由P2X7受体单体的三聚物组成的非功能性受体。当能够起作用时,在该细胞表面上的组装的P2X7受体结合了具有以下作用的ATP:组装成一种三聚物的单体之间形成的通道经历到更宽的孔的过度,从而增加钙离子进入该细胞中以引发半胱天冬氨酸酶的活性,从而导致凋亡和细胞死亡。凋亡在不会死亡的癌细胞中保留或抑制,即使该P2X7受体被布置在该细胞表面上这些受体被称为非功能性P2X7并且已经在各种各样的癌症中发现。
结果:该2F6抗体形式,IgM(图9a-d)和IgG2a(图9e)这两者,抑制了一系列癌细胞系中的细胞生长,包括前列腺PC3、结肠COLO205、乳房MDAMB231、黑素瘤A375以及乳房MCF7,如在细胞生长的细胞活力检测中确定的。将细胞以适当的浓度播种并且生长经过3天或5天的时期以在对照抗体存在下以及在测试抗体(2F6的IgM或IgG2a型,浓度范围是0-40ug/mL)存在下达到一个在测试期结束时接近汇合的水平。细胞系生长的测试是用范围从100-2000的细胞/孔的种子密度进行的。与对于生长没有作用的不同的肿瘤细胞类型的对照抗体相比,渐增浓度的IgM或IgG2a型的2F6抑制了细胞的生长。
图10显示了在10μg/mL的2F6IgM抗体的存在或不存在下来自MCF7细胞生长的数据。抗体的存在大大抑制了经过3天的细胞生长,而该抗体与5-50μg/mL的可溶性肽表位的预孵育对于抑制没有影响。然而,在肽为500μg/mL时,该抗体不再能够影响细胞的生长,因为该肽有效地隔离了可用的抗体,从而预先排除它结合到细胞表面上的受体。
通过ApoOne凋亡测定来确定2F6能够抑制细胞生长的作用模式,其中半胱天冬氨酸酶3/7活性的测量与通过细胞活力检测的细胞生长相结合。Colo205细胞在一个3天生长测定中生长,使用了从0-40μg/mL的渐增的2F6。加入吉西他滨阳性对照以确立可以通过结合抗体的存在引出的凋亡的程度。图11清楚地揭示了凋亡是在渐增的抗体的存在下引发的,其中20-40μg/mL足以引发完全活性。
与没有结合到细胞上的对照抗体相比,在图12中的共焦点图象中示出了在20ug/mL的2F6IgM中生长的MCF7细胞的形态,其中在仅仅24小时的暴露之后许多细胞已经死亡。
结论:2F6抗体形式,IgM和IgG2a这两者与癌细胞上非功能性P2X7受体的相互作用引起了对细胞生长的抑制并且诱导了凋亡和细胞死亡。示例3-抗体到活肿瘤组织上的结合
目的:为了确立与死亡癌细胞上的残余目标相比,针对在癌细胞表面上的表达的P2X7三聚物之内跨过相邻单体的独特的可进入复合表位处的抗体是否更能够有区别地结合到活癌细胞表面上的目标上。
背景:2F6抗体结合跨过在癌细胞上表达的P2X7受体中的相邻单体,但不是在这样的受体上,即,这些受体表达在表达功能性或功能能力P2X7受体的正常细胞(例如在白细胞和红细胞中的那些)上。能够通过靶向一个限制于该受体单体的表位而特异性结合非功能性受体的抗体也能够结合到这样的单体目标,这些目标可以从死亡细胞的细胞质隔区释放,由此降低了治疗潜能,因为除了来自活细胞的P2X7受体之外,它被来自死亡细胞的P2X7受体部分地结合,迫使增加有效剂量。
材料与方法:对于用常位同基因4T1鼠乳房瘤在其第三乳房脂肪垫中接种的雌性BALB/c小鼠或用常位人Hep3b异种移植肿瘤在其肝中接种的NOD/SCID雌性小鼠使用针对单体目标(P2X7上的E200)的人结构域抗体(2-2-1hFc)或针对复合表位E200-300的2F6-hIgG1进行静脉内治疗。所有的程序经阿德莱德大学的动物伦理委员会批准(M46-2008)。在从抗体处理之后两天的小鼠移出的肿瘤部分上,使用杰克逊免疫研究羊抗人抗体测量了抗体到肿瘤中的渗透。将这些肿瘤固定在10%中性缓冲福尔马林中持续48小时,包埋在石蜡中,切片成5μm,去石蜡并且针对人抗体染色。使用了Biocare Mach 4二级检测系统,包括一种特异性羊抗体探针接着是具有HRP的聚合物,然后用DAB染色。
结果:靶向三聚物内的单体结合位点E200的抗体结合在4T1肿瘤内的活细胞(图13a),虽然它们同样结合到死亡细胞以及濒死细胞连同细胞碎片上(图13b)。在路易斯肺肿瘤的情况下,结合到活细胞(图13c)上显得是中度的并且膜性的,但是已经毁坏的细胞(图13d)仍然能够隔离这样的抗体(2-2-1hFc)。
使用2F6hIgG1针对残余的活细胞以及死细胞结合对同样的肿瘤类型进行了研究。到4T1中的活细胞上的结合显示了清楚的膜性标记(图14a)并且与2-2-1hFc单体结合剂相比,结合到单体之间的界面上的抗体 被大大地抑制了到细胞碎片上的结合,虽然它仍然结合到濒死细胞(图14b)上。同样地,结合到路易斯肺肿瘤上显示了强的膜性结合(图14c)。濒死细胞具有残余抗体标记,但是细胞碎片保持是清楚的(图14d)。该图还显示了保持完全未标记的红细胞,即使它们表达P2X7受体,虽然处于一种功能能力的构象,该构象不会将该E200-300表位暴露于该抗体。
结论:产生了抗原结合位点,使得针对跨过单体间界面的复合目标的抗体具有胜过限制于该单体上的结合位点的抗体的优点,因为少得多的2F6抗体通过结合到由于活细胞的死亡而产生的细胞碎片上而被误导,由此降低了所需要的治疗剂量。
实例4-2F6hIgG1的治疗效果
目的:2F6hIgG1的治疗效果在小鼠异种移植肿瘤模型中进行确定并且与提高到相同目标以及亲和纯化的高亲和绵羊多克隆抗体进行比较。
背景:针对在癌细胞上表达的非功能性P2X7中的单体表位目标E200的抗体已经展现出肿瘤细胞杀伤和肿瘤生长抑制的治疗作用。这些治疗抗体以亚纳米摩尔的范围结合,比2F6hIgG1表现出的结合常数高两个对数级(log)。针对相同的化合物E200-300表位开发了一种同样高亲和的绵羊多克隆抗体,以检查2F6形式的抗体在亲和成熟之后提高该结合常数的可能效果。
材料与方法:
用于4T1小鼠乳房肿瘤细胞培养的试剂是从以下供应商获得的:RPMI 1640细胞培养基、FCS、Glutamax、HBSS以及青霉素-链霉素来自Invitrogen Australia(Mt Waverley,VIC,澳大利亚);并且台盼蓝来自Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,澳大利亚)。MatrigelTM是从BD Biosciences(North Ryde,NSW,澳大利亚)获得的。
无菌盐水(0.9%的氯化钠水溶液)是从Baxter Healthcare Australia(Old Toongabbie,NSW,澳大利亚)获得的。磷酸盐缓冲盐水(PBS)是从Sigma-Aldrich获得的。福尔马林(10%的中性缓冲福尔马林)是从Australian Biostain(Traralgon,VIC,澳大利亚)获得的。
肿瘤切片的苏木精和伊红染色材料是从以下供应商获得的:正电荷防脱载玻片(Superfrost Plus slide),来自Menzel(德国);明矾苏木精和伊红,来自HD Scientific(NSW,澳大利亚);乙醇,浓盐酸以及碳酸 锂,来自Sigma Aldrich;DePex封固剂,来自BDH(UK)。
肿瘤细胞源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville,MD,美国)。
将肿瘤细胞(来自工作存储库中的第2代)在RPMI 1640细胞培养基中培养,该培养基添加有10%FCS、1%Glutamax和1%的青霉素-链霉素。这些细胞通过胰酶消化收获,在HBSS中洗涤两次并且计数。然后将细胞再悬浮在HBSS∶MatrigelTM(1∶1,v/v)中至最终浓度5x 107孔/mL。
在Lewis肺肿瘤模型中,给药每3天发生一次,以1或10mg/kg的抗体浓度静脉输注,或以PBS为治疗对照或以每天5mL/kg的索拉非尼作为阳性对照。基于研究第0天时的肿瘤体积,将这些小鼠随机化成10只小鼠的相等组。
任何动物如果其肿瘤体积达到2,000mm3则从该研究中移除。任何动物如果其体重下降到低于进入该研究中时的85%则停止对其治疗。任何动物如果对其观察到对该治疗的严重不良反应则将其淘汰。
将小鼠麻醉用于血液收集并且通过在初始治疗后的第11天或第14天,在最后给药后48小时,经由终端心脏流血(terminal cardiac bleed)48小时驱血法实施安乐死。
在结束时通过心脏穿刺从所有组的所有小鼠收集全血。
允许血样品在室温下凝固30分钟,接着在4℃下2小时,然后在4℃下离心(2000x g)15分钟。将血清组分收集到新鲜的冷冻小瓶中并且在-20℃下储存。
将所有组的所有小鼠中的肿瘤切下,称重并且保存在10%的中性缓冲福尔马林中。
从所有小鼠切除肺。对肺表面转移进行计数并且根据以下尺寸分类:小(<1mm),中等(≥1mm并且<3mm)以及大(≥3mm)。将切下的肺保存在10%的中性福尔马林中。
使用SigmaStat 3.0(SPSS Australasia,North Sydney,NSW,Australia)进行所有的统计计算。
使用配对t试验来确定对于治疗组在第0天与最终测量日之间的在治疗组内的体重变化的显著性。只有那些直到结束日依然存活的小鼠才能 被包含在该分析中。
对于所有动物中的肿瘤重量、组织学肿瘤尺寸以及肺和肝脏转移计数进行t试验。
对于直到研究结束日(对于4T1是第14天并且对于路易斯肺肿瘤是第11天)依然存活的所有组的肿瘤重量、组织学肿瘤尺寸、以及肺和肝转移计数进行单向方差分析(ANOVA)。
当使用单向ANOVA发现显著性差异时,进行多重比较与对照组程序(holm-sidak法)。在第9天使用预免疫对照(组2)作为对照组。在第14天,因为这个组中的小鼠已经死亡,载体对照(组1)用作对照组。虽然在一些情况下,这些数据失效了,使用绝对值进行正态性检验或等差异统计分析。
小于0.05的p值被认为是显著的。
结果:在14天之后,将4T1小鼠的肺从BALBc小鼠中切除,以测量肺转移的数目。10只小鼠的对照组具有6.4±1.0,而2F6-hIgG1治疗组显示3.4±0.7或对照的53%,如在图15中所示。在这两个组中的平均转移体积进一步从5.77降低到1.28mm3或22%并且总的转移体积降低了88%(从369到43mm3)或对照的11.8%。
使用了同基因路易斯肺肿瘤模型与另外的对照组。除了十只小鼠的PBS对照组(组1),包括使用每天5mL/kg的索拉非尼的阳性对照组(组5)连同由10mg/kg绵羊亲和纯化的E200-300多克隆抗体(组2)、1mg/kg的2F6-hIgG1(组3)以及10mg/kg的2F6-hIgG1(组4)组成的抗体治疗组。获得的结果如下:
这些结果总结在图16中。在对照组1与所有其他组之间的肿瘤转移的减少是显著的,为p<0.001。高亲和力的免疫抗体与远远更低亲和力的单克隆2F6以10mg/kg同样好地抑制了肿瘤形成,两者与索拉非尼阳性对照相同,所有均为相对于PBS对照96%的抑制。
结论:靶向的复合单体间表位结合位点在肿瘤细胞上是易接近的。具有范围从0.5nM(绵羊亲和纯化多克隆的)至50nM(2F6-hIgG1)的Kd的抗体显示出类似的效果,表明对于人治疗最佳的结合常数是在低nM范围内。
实例5-亲和成熟的抗原结合位点的产生和纯化
目的:在此描述的实验是用来开发多种抗体形式(即,scFv/Fab),它们展现出高的结合常数以提高对癌细胞上的非功能性P2X7受体的特异性结合而不会结合在任何正常细胞(例如淋巴细胞)上的功能性受体,并且因此获得在比用WT重组2F6单克隆实现的更低的抗体浓度下的癌细胞生长的抑制。
背景:2F6抗体形式表现了对于活的癌细胞上P2X7受体的特异性结合,然而用作一种诊断或治疗物,要求一种抗体的改进的亲和力。
来自2F6的CDR3序列HYSSRFFDV被用作迭代轮的随机以及筛选的起始点因为它被认为是最可能产生具有增加的亲和力的抗体先导物,这些先导物可以用于测试的目的而暴露于治疗试验模型中。
材料与方法:将2F6VH和VL基因片段扩增并且组装到大肠杆菌表达/分泌载体中。2F6scFv和Fab两者都被转化到大肠杆菌中并且诱导了基因构建体的表达。在诱导后5小时收获大肠杆菌培养物并且使用针对免疫抗原E200-300的ELISA和Biacore针对结合对scFv和Fab进行分析。
将筛选方法(包括SDS-PAGE以及N末端测序)与ELISA、Biacore以及针对癌细胞的流式细胞术结合,以确定在亲和成熟之前对照抗体结合结构域上的抗原结合位点的生物物理特征。
通过易错PCR、NNK随机化以及HCDR3的序列长度变异的组合引入2F6scFv的诱变。在噬菌粒载体中的突变库具有1x 107的等级。对于更高亲和力的变异体库的筛选使用了噬菌体展示与使用生物素酰化的E200-300抗原的过滤表达测定的结合。对于更高亲和力的scFv先导噬菌体克隆的选择经历了小规模的可溶抗体片段的表达,这些抗体片段具有使 用ELISA和Biacore测量的亲和力。
结果:从亲和成熟中获得的表现了比2F6增强的结合的scFv/Fab衍生物的HCDR3序列在图17中示出。
结合常数在ELISA中示出并且归纳表在图18中示出。这对表位目标物,多价的IgM具有比IgG形式更高的EC50。2F6重组体Fab显示了比经选择的亲和成熟的前导序列更低(2-log)的结合。
结论:产生了鼠类抗原结合位点使得在一种Fab形式中亲和力相对于重组体2F6单克隆抗体得以改进。
实例6-亲和成熟的Fab的生物化学的表征
目的:为了确定亲和成熟的Fab是否展示了针对活细胞上表达的非功能性P2X7受体的特异性。
背景:亲本2F6形式IgM和IgG2a仅仅结合活细胞上表达的具有高亲和力的非功能性P2X7受体,而不是单体P2X7受,也不是体功能性P2X7受体。进行了实验来证实这种特异性在亲和成熟中没有丢失。
材料与方法:使用流式细胞术来测量在人COLO-205和PC3细胞系中经选择的亲和成熟的重组Fab比起始2F6序列增强的结合。重组FLAG标记的Fab结合到细胞上并且以1∶75的浓度使用结合到FITC上的σF4049鼠类单克隆抗FLAG抗体进行检测。检验亲和纯化的绵羊200-300抗体,用于与2F6mIgG2a WT通过到PC3细胞的流式细胞术直接对比。
结果:Fab选择性地结合到具有比2F6WT Fab更高亲和力的在活细胞COLO-205细胞(图19a)和PC3细胞(图19b)上的非功能性受体上。使用不同的2F6mIgG2a形式制备物观察到了类似的亲和力,进一步显示出比WT序列增强的亲和力(图20)。相反,当对这些相同的重组亲和纯化的Fab针对表达功能性P2X7受体的人淋巴细胞进行测试时,发生了可忽略的结合。加入一种阳性HLA对照(图21)。与WT 2F6mIgG2a相比,使用亲和纯化的绵羊多克隆E200-300到PC3细胞上的结合通过流式细胞术显示了高得多的结合(图22),与来自亲和成熟的预期改进一致。
结论:已经产生了高亲和力的选择性Fab和scFv,它们对于诊断和治疗目的是有用的,与获自其本身已经显示出显著的治疗效果的多克隆绵 羊抗血清滴度的水平一致,如在小鼠异种移植研究中所显示的。
应当理解的是,在本说明书中披露并且定义的发明扩展到所提及的或从上下文或附图中明显的两个或更多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的不同替代方面。
Claims (23)
1.一种用于结合到P2X7受体上的抗原结合位点,该抗原结合位点由以下通式1定义:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中:
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架区;
CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区;
其中:
CDR3具有一个氨基酸序列:(带电荷的/极性的/芳香族的)(带电荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(带电荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。
并且其中X代表任何氨基酸。
2.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:N(Y/F)XXXY(Y/F)EX。
3.如权利要求2所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:N(Y/F)(中性的)(带电荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。
4.如权利要求3所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:NFLESYFEA。
5.如权利要求2所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:N(Y/F)(带电荷的)(中性的)(带电荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
6.如权利要求5所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:NYRGDYYET。
7.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:H(芳香族的)XXXYYNI。
8.如权利要求7所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:H(Y/F))(中性的)(带电荷的(带电荷的)YYNI。
9.如权利要求7所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:H(Y/F)(中性的)(带电荷的(中性的)YYNI。
10.如权利要求8所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:HYSKEYYNI。
11.如权利要求9所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:HFQRGYYNI。
12.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)XXXYY(带电荷的(中性的)。
13.如权利要求12所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV。
14.如权利要求12所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV。
15.如权利要求13所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:YFPLVYYDV。
16.如权利要求14所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:NYLPMYYEV。
17.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:Y(带电荷的)XXXY(中性的)(中性的)(中性的)。
18.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:YHVIQYLGP。
19.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:以下序列中的任一项:HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV、HYIKVYYEA、HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP、HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDV。
20.如权利要求1所述的抗原结合位点,其中CDR3具有以下氨基酸序列:HFSRGYYDV或NYDKKYFDV。
21.根据以上权利要求的任一项所述的抗原结合位点用于制造一种治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的药物的用途。
22.根据以上权利要求的任一项所述的抗原结合位点,用于治疗癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病。
23.一种用于诊断癌症或与非功能性P2X7受体表达有关的病症或疾病的方法,包括以下步骤:将有待确定癌症的存在或缺乏的组织或细胞与一种试剂接触,该试剂处于根据以上权利要求的任一项所述的一种抗原结合位点的形式;然后检测该试剂与组织或细胞的结合。
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