ES2904911T3 - Anticuerpos anti-receptor P2X7 y fragmentos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo con dominio variable único para la unión a un receptor P2X7, en donde el anticuerpo con dominio variable único tiene un sitio de unión a antígeno que está definido por la fórmula general: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en donde: FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; en donde: CDR1 tiene una secuencia: RNHDMG SEQ ID NO: 88; CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 89; CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-receptor P2X7 y fragmentos de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere a receptores purinérgicos, a anticuerpos y fragmentos de los mismos relacionados para la unión con dichos receptores, a la producción de dichos anticuerpos y fragmentos y al uso de dichos anticuerpos y fragmentos para la detección y la terapia del cáncer.

Antecedentes de la invención

Los receptores purinérgicos (P2X) son canales selectivos de cationes activados por ATP. Cada receptor está formado por tres subunidades proteicas o monómeros. Hasta la fecha, se han identificado siete genes distintos que codifican los monómeros de P2X: P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6, P2Xy.

Los receptores P2X7 son de particular interés ya que se entiende que la expresión de esos receptores está limitada a células que tienen el potencial de experimentar una muerte celular programada, tales como timocitos, células dendríticas, linfocitos, macrófagos y monocitos. Hay alguna expresión de los receptores P2X7 en la homeostasis normal, tal como en los eritrocitos.

Curiosamente, se ha encontrado un receptor P2X7 que contiene uno o varios monómeros que tienen una isomerización en cis de Pro210 (según SEQ ID NO: 1) y que carece de función de unión a ATP, en células que se sabe que no pueden sufrir una muerte celular programada, como las células preneoplásicas y las células neoplásicas. Esa isoforma del receptor se ha denominado receptor "no funcional".

Los anticuerpos generados a partir de la inmunización con un péptido que incluye Pro210 en cis, se unen a receptores P2X7 no funcionales. Sin embargo, no se unen a receptores P2X7 capaces de unirse a ATP. Por consiguiente, esos anticuerpos son útiles para detectar selectivamente muchas formas de carcinoma y cánceres hemopoyéticos y para el tratamiento de algunas de esas afecciones.

Los documentos WO02/057306A1 y WO03/020762A1 ambos analizan una sonda para distinguir entre los receptores P2X7 funcionales y los receptores P2X7 no funcionales, en forma de un anticuerpo monoclonal.

El documento WO2009/033233 analiza un epítopo presente en los receptores no funcionales, pero no en los receptores funcionales, y anticuerpos para unirse a los mismos.

El documento WO2008/043145 describe hibridomas que producen anticuerpos contra un receptor P2X7 no funcional. Hasta la fecha ha sido muy difícil obtener reactivos serológicos que se unan a receptores P2X7 no funcionales en células vivas con una afinidad deseable. Los reactivos de mayor afinidad son generalmente deseables en aplicaciones para la detección y el tratamiento del cáncer.

Existe una necesidad de reactivos mejorados para la unión a receptores P2X7, particularmente de nuevos anticuerpos y fragmentos de los mismos que sean capaces de discriminar entre receptores P2X7 que se unen a ATP y que no se unen a ATP en células vivas.

Compendio de la invención

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 1:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: DNEPMG, RNHDMG, SGYAMA, GMYNMS, PASNMS, GSYAMA, GAYAMS, DGYNMS, TYDMAW, QEYGMG, ARYPMA, SSYAMA, AKYPMV, SSYAMS, DNVEMS y PMKDMG.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 2:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: SIADSGNHTYYADSVKG, AISGSGGSTYYADSVKG, TILSDGSRTYYADSVKG, SINATGGRTYYADSVKG, SITASGYRTYYADSVKG, TISTSGSSTYYADSVKG, TINGSGLATYYADSVKG, SITANGNSTYYADSVKG, SIAAAGSRTYYADSVKG, SITPSGDKTYYADSVKG, SIDGGGLQTYYADSVKG, TIDGNGLITYYADSVKG, SIGPGGARTYYADSVKG, TITSDGLRTYYADSVKG, SIGSKGEDTYYADSVKG, AISGSGGSTYYANSVKG, AISGSGGGTYYADSVKG, SIGTKGEYTYYADSVKG, SIGSKGEYTYYADSVKG y AISGSGGGTYYANSVKG.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 3:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: KQRGLNRYRAQFDY, EPKPMDTEFDY, KIKTFRNHSVQFDY, KFNGFSHRQYNFDY, KQGQISNFPRFDY, KVRFATSKSINFDY, KCSSCTSLNANFDY, KASYSRPYNFQFDY, KQRSISIRPMFDY, KVRSMSYAHFDFDY, KASAPKYFRFDY, KLQRYDRYTLNFDY, KPWRVYSYDRFDY, KVHTFANRSLNFDY, QTVNVPEPAFAY y EPSHFDRPFDY.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 4:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (P/R)(N/M)(H/K)DMG.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 5:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 6:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY. En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 7:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY;

y FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 8:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: (P/R)(N/M)(H/K)DMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY; y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 9:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: (P/R)(N/M)(H/K)DMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLE(S/P)GGGLVQPGGSLRLSCAASG(Y/F/V)(R/T/N)(I/F/V);

FR2 tiene una secuencia: W(V/A) RQAPGKGL EW(V/A)S;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNS(R/K)NTLYLQMNS(L/M)RAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

De acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo de dominio variable único para la unión de un receptor P2X7, en donde el anticuerpo de dominio único tiene un sitio de unión a antígeno que se define mediante la fórmula general:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

y en donde:

CDR1 tiene una secuencia: RNHDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGSTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el anticuerpo de dominio variable único por la fórmula general 10:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: PMKDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTF;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: PSPGTLVTVLE, WGQGTLVTVSS, WGQGTLVTVLS, RSPGTLVTVSS, PSPGTQVTVSS, PSPGTLVTVSS, RSQGTLVTVSS, WSQGTLVTVSS, RGQGTLVTVSS, RFQGTLVTVSS, WSPGTLVTVSS, GSPGTLVTVSS, WGPGTLVTVSS, RGPGTLVTVSS, CGPGTLVTVSS, RSCGTLVTVSS o RSPGTLVTVLE

De acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo de dominio variable único para la unión de un receptor P2X7, estando definido el anticuerpo de dominio variable único por la fórmula general:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: RNHDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGSTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY; y

FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA; y

FR4 tiene una secuencia: WSPGTLVTVSS, WGQGTLVTVSS, RSPGTLVTVSS, PSPGTLVTVSS, RSQGTLVTVSS, WSQGTLVTVSS, RGQGTLVTVSS, RFQGTLVTVSS, GSPGTLVTVSS, WGPGTLVTVSS, RGPGTLVTVSS, CGPGTLVTVSS o FSQGTLVTVSS.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia tal y como se describe en este documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en este documento y que incluye una o varias mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio para unirse a un receptor P2X7.

En otra realización reivindicada, se proporciona un sitio de unión a antígeno tal y como se describe en este documento, en donde una secuencia de aminoácidos que forma una o varias entre FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 es una secuencia humana.

En otra realización descrita, se proporciona un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv anti­ receptor P2X7 que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia tal y como se describe en este documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR, tal y como se describe en este documento.

En otra realización descrita, se proporciona un diacuerpo o un triacuerpo que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia tal y como se describe en este documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR, tal y como se describe en este documento.

En otra realización descrita, se proporciona una proteína de fusión que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo, tal y como se describe en este documento.

En otra realización descrita, se proporciona un conjugado en forma de sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo o proteína de fusión, tal y como se describe en este documento, conjugado con un marcador o un agente citotóxico.

Se describe adicionalmente un anticuerpo para la unión a un sitio de unión a antígeno de un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado, tal y como se describe en este documento.

En otra realización descrita, se proporciona un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado, tal y como se describe en este documento.

En otra realización descrita, se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito en el presente documento.

En otra realización descrita, se proporciona una célula que incluye un vector o un ácido nucleico descrito en el presente documento.

También se describe un animal o un tejido obtenido a partir del mismo que incluye una célula descrita en el presente documento.

En otra realización descrita, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado tal y como se describe en este documento, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se describe además una composición de diagnóstico que incluye un sitio de unión a antígeno, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en este documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado tal y como se describe en este documento, un diluyente y opcionalmente un marcador.

Se describe además un kit o un artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado tal y como se describe en este documento.

Además, se describe el uso de una secuencia de acuerdo con una o varias entre CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 y FR4 tal y como se describe en el presente documento, para producir un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7.

Además, se describe el uso de un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en el presente documento, para producir un sitio de unión a antígeno anti-receptor P2X7 que tiene mayor afinidad hacia el receptor P2X7.

Se describe además un banco de moléculas de ácido nucleico producidas a partir de la mutación de un sitio de unión a antígeno o de una secuencia de CDR y/o FR tal y como se describe en el presente documento, en donde al menos una molécula de ácido nucleico en dicho banco codifica un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7.

Además se describe un método para producir un sitio de unión a antígeno anti-receptor P2X7 tal y como se describe en el presente documento, que incluye la expresión de un ácido nucleico tal y como se describe en el presente documento en una célula o un animal tal y como se describe en el presente documento.

Además, se describe un método para el tratamiento de un cáncer o una afección o enfermedad asociada con la expresión de un receptor P2X7 no funcional en un individuo, que incluye la etapa de proporcionar un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica tal y como se describe en el presente documento, a un individuo que requiere un tratamiento contra el cáncer o dicha afección o enfermedad.

Se describe además el uso de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica, tal y como se describe en el presente documento, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una afección o enfermedad asociada con la expresión de un receptor P2X7 no funcional.

Además, se describe un método para el diagnóstico de un cáncer o una enfermedad o afección asociada con la expresión de un receptor P2X7 no funcional, que incluye la etapa de poner en contacto tejidos o células en los que se va a determinar la presencia o ausencia de cáncer con un reactivo en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición de diagnóstico, tal y como se describe en este documento, y que detecta la unión del reactivo con los tejidos o células. El método puede llevarse a cabo in vivo o in vitro.

Normalmente, los sitios de unión a antígeno según la invención se unen a receptores P2X7 no funcionales, especialmente receptores en los que Pro210 de P2X7 está en la conformación cis. En determinadas realizaciones, los sitios de unión a antígeno según la invención no se unen a receptores P2X7 funcionales, especialmente a receptores en los que Pro210 de P2X7 está en la conformación trans.

Normalmente, los sitios de unión a antígeno según la invención se unen a receptores P2X7 no funcionales en células vivas. En otras realizaciones, el sitio de unión al antígeno no se une a los receptores en tejidos de células fijadas o muertas, como los que se estudian en histología o citología.

En un aspecto, los sitios de unión al antígeno según la descripción se unen a receptores P2X7 en células vivas con afinidades en el intervalo de 0,1 a 5 nM.

La invención proporciona un anticuerpo de dominio variable único que incluye un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, preferiblemente de un receptor P2X7 no funcional.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Positivos de ELISA de dAb del ciclo 2 examinados en Biacore a partir del fago del ciclo 2

Figura 2. PEP2-420 nM, sin péptido, cáncer de cuello uterino, objetivo x10

Figura 3. PEP2-420 nM, péptido 0,1 mM, cáncer de cuello uterino, sección en serie, unión limitada

Figura 4. PEP2-420 nM, péptido 1,0 mM, cáncer de cuello uterino, sección en serie, sin unión

Figura 5. PEP2-420 nM, sin péptido, cáncer de cuello uterino, objetivo x10

Figura 6. PEP2-420 nM, péptido 0,1 mM, cáncer de cuello uterino, sección en serie, unión limitada

Figura 7. Pep2-420 nM, péptido 1,0 mM, cáncer de cuello uterino, sección en serie, sin unión

Figura 8. Pep2-420 nM, sin péptido, cáncer de cuello uterino

Figura 9. Pep2-420 nM, péptido 10 uM, cáncer de cuello uterino, sección en serie, unión no afectada

Figura 10. PEP2-420 nM, melanoma, objetivo x20

Figura 11. dAb-Fc inicial que se expresa con un peso molecular de 75 kDa

Figura 12. Las trazas que se pueden determinar fácilmente desde abajo incluyen el dAb de control, HEL4-Fc (verde), PEP2-47, PEP2-42, p Ep2-42-1 , PEP2-2 (azul) con otros ligandos de mayor afinidad arriba. El caudal era de 50 uL/min. Figura 13. El dominio extracelular 47-332 de P2X7 con el marcador C-terminal c-Myc y el marcador N-termina1HA fijados al anclaje transmembranal de PDGFR para uso en la detección de ligandos del antígeno conformacional E200 expresados en células HEK293.

Figura 14. SDS-PAGE de transferencia Western de lisado celular y proteínas expresadas en la superficie que expresan ECD1, P2X7 de tipo silvestre (WT) y los dos mutantes del receptor P2X7 no funcional, R307Q y E496A. El ^eC^d 1 se expresa en 52 kDa, los tres receptores P2X7 en 75 kDa. El control de anticadherina en la sección inferior está en 98 kDa y la antiactina en el lisado celular en 42 kDa.

Figura 15. SDS-PAGE de ECD2 (47-306) y una estructura artificial mutante K193A (47-306) que muestra las fracciones 1- 5 de la proteína A y el material sobrenadante (NB) con patrones de peso molecular a la izquierda.

Figura 16. SDS-PAGE de dAb-Fc y ECD2-Fc ambos no reducidos y reducidos junto con las transferencias Western correspondientes que reaccionaban con anticuerpo anti-P2X7.

Figura 17. Una selección de dAbs sometidos a ensayo en 5 uM. La tinción se detectó con Fab anti-IgG humana. Figura 18. Citometría de flujo de la unión de dAb-Fc a pDisplay-ECD2 en células HEK que muestra una unión celular más estrecha con especies de mayor afinidad.

Figura 19. Rastreos con Biacore de clones PEP2-42 seleccionados que muestran una unión mejorada al péptido E200. Figura 20. Secuencias de clones PEP2-42.

Figura 21. Árbol de las familias de maduración por afinidad desde el ligando inicial hasta el dominio extracelular expresado del receptor diana.

Figura 22. Rastreos con Biacore del clon PEP2-2-3 Fc con concentraciones crecientes ejecutadas frente a 10 UR de péptido E200.

Figura 23. Rastreos con Biacore de clones producidos mediante exploración NNS de Trp103 en PEP2-2-1.

Figura 24. Unión por citometría de flujo de PEP2-2-1 a células que expresan ECD1 o ECD2 junto con controles (simulado y pDisplay únicamente).

Figura 25. Rastreos con Biacore que muestran una unión competitiva entre PEP2-2-1, péptido E200 y ECD2 (47-306). Figura 26. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células PC3 de próstata vivas con 0-20 ug/mL. Figura 27. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células MDA MB 231 de mama vivas con 0-20 ug/mL. Figura 28. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células SKOV-3 de ovario vivas con 0-20 ug/mL. Figura 29. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células 786-O renales vivas con 0-20 ug/mL. Figura 30. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células G361 de melanoma vivas con 0-20 ug/mL. Figura 31. Unión de los dAbs iniciales 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc a células NCI-H596 de pulmón vivas con 0-20 ug/mL. Figura 32. Citometría de flujo de linfocitos y monocitos humanos procedentes de PBMC que no muestran unión con PEP2-2-1 Fc o PEP2-2-3 Fc.

Figura 33. Citometría de flujo de células LNCap de próstata que muestran unión con PEP2-2-1 Fc, PEP2-2-3 Fc y HLA mientras que el control HEL4 no muestra unión por encima del secundario solo.

Figura 34. Ensayo CTB que muestra la inhibición del crecimiento de células PC3 durante 5 días en presencia de PEP2-2- 1 Fc y PEP2-2-3 Fc incrementados en comparación con el control HEL4 Fc.

Figura 35. Ensayo CTB que muestra la inhibición del crecimiento de células COLO205 durante 3 y 5 días en presencia de PEP2-2-1 Fc y PEP2-2-3 Fc incrementados en comparación con el control HEL4 Fc.

Figura 36. Ensayo CTB que muestra la inhibición del crecimiento de células A375 durante 3 y 5 días en presencia de PEP2-2-1 Fc y PEP2-2-3 Fc incrementados en comparación con el control HEL4 Fc.

Figura 37. Rastreos con Biacore del dominio PEP2-2-12 dAb sometido ensayo con 10, 5, 2,5, 1 y 0,5 nM. Figura 38. Rastreos con Biacore del dominio PEP2-2-12Alexa488 sometido ensayo con 5 y 2,5 nM.

Figura 39. Rastreos con Biacore del dominio PEP2-472-12Alexa488 sometido ensayo con 10 y 5 nM. Figura 40. Alineación de secuencias

de dAb.

Figura 41. (SEQ ID NO: 1) Secuencia de P2X7.

Figura 42. (SEQ ID NO: 2) Secuencia de ECD2

Figura 43 (SEQ ID NO: 3) Secuencia de ECD1.

Figura 44. Mapa de la estructura artificial pcDNA3.1 PEP2-2-1 dAb-FC.

Figura 45 (SEQ ID NO: 198) Secuencia de pcDNA3.1 PEP2-2-1 dAb-FC.

Descripción detallada de las realizaciones

Ahora se hará referencia con detalle a ciertas realizaciones de la invención descrita. Aunque la invención descrita se describirá junto con las realizaciones, se entenderá que la intención no es limitar la invención descrita a esas realizaciones.

Tal y como se usa en este documento, excepto cuando el contexto requiera lo contrario, el término "comprender" y variaciones del término, tales como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no pretenden excluir aditivos, componentes, números enteros o etapas adicionales.

Con el fin de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando corresponda, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que alguna definición establecida entre en conflicto con cualquier documento, prevalecerá la definición establecida a continuación.

"Receptor purinérgico” generalmente se refiere a un receptor que usa una purina (tal como ATP) como ligando.

"Receptor P2X7" generalmente se refiere a un receptor purinérgico formado a partir de tres subunidades proteicas o monómeros, en donde al menos uno de los monómeros tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en SEQ ID NO: 1. El "receptor P2X7' puede ser un receptor funcional o no funcional tal y como se describe a continuación. "Receptor P2X7' incluye variantes de origen natural del receptor P2X7, por ejemplo, en donde los monómeros de P2X7 son variantes por corte y empalme, variantes alélicas e isoformas que incluyen formas truncadas o secretadas de origen natural de los monómeros que forman el receptor P2X7 (p. ej., una forma que consiste en la secuencia del dominio extracelular o una forma truncada de la misma), formas variantes de origen natural (p. ej., formas con cortes y empalmes alternativos) y variantes alélicas de origen natural. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia natural de los polipéptidos monoméricos de P2X7 descritos en el presente documento, son polipéptidos maduros o de secuencia natural, de longitud completa que comprenden la secuencia de aminoácidos de longitud completa que se muestra en SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones el receptor P2X7 puede tener una secuencia de aminoácidos que está modificada, por ejemplo, varios de los aminoácidos en la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 se pueden sustituir, delecionar o se puede insertar un residuo.

"Receptor P2X7 funcional" generalmente se refiere a una forma de receptor P2X7 que tiene un sitio de unión o una hendidura para unirse al ATP. Cuando se une al ATP, el receptor forma una estructura similar a un poro que permite la entrada de iones de calcio en el citosol, una consecuencia de lo cual puede ser la muerte celular programada. En una homeostasis normal, la expresión de receptores P2X7 funcionales generalmente se limita a células que sufren muerte celular programada, como los timocitos, las células dendríticas, los linfocitos, los macrófagos y los monocitos. También puede haber alguna expresión de receptores P2X7 funcionales en eritrocitos.

"Receptor P2X7 no funcional" generalmente se refiere a una forma de receptor P2X7 en el que uno o varios de los monómeros tiene una isomerización en cis de Pro210 (según SEQ ID NO: 1). La isomerización puede surgir por cualquier evento molecular que conduzca a un plegamiento incorrecto del monómero, lo que incluye, por ejemplo, una mutación de la secuencia primaria del monómero o un procesamiento postraduccional anormal. Una consecuencia de la isomerización es que el receptor es incapaz de unirse al ATP, o bien se une al ATP con una afinidad menor que la observada entre el ATP y los receptores que no contienen una isomerización en Pro210. En esas circunstancias, el receptor no puede formar un poro y eso limita la medida en que los iones de calcio pueden entrar en el citosol. Los receptores P2X7 no funcionales se expresan en una amplia gama de cánceres epiteliales y hematopoyéticos.

"Dominio extracelular" (ECD) utilizado en este documento son el receptor P2X7 (47-306) (SEQ ID NO: 2) (ECD2) y el receptor P2X7 (47-332) (S^eQ ID NO: 3) (ECD1). El receptor P2X7 (47-306) (S^eQ ID NO: 2) tiene los aminoácidos 47 a 306 de SEQ ID NO: 1. El receptor P2X7 (47-332) (SEQ ID NO: 3) tiene los aminoácidos 47 a 332 de SEQ ID NO: 1.

"Anticuerpos" o "inmunoglobulinas" o "Igs" son proteínas de gamma globulina que se encuentran en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrados que actúan en el sistema inmune para unirse a un antígeno y, por lo tanto, para identificar y neutralizar objetos extraños.

Los anticuerpos son generalmente una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente. Las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o varios enlaces disulfuro según el isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente.

Las cadenas H y L definen dominios específicos de la Ig. Más particularmente, cada cadena H tiene en el extremo N-terminal, un dominio variable (V^h) seguido de tres dominios constantes (C^h) para cada una de las cadenas a y y, y cuatro C^h dominios para los isotipos g y £. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal un dominio variable (V^l) seguido de un dominio constante (C^l) en su otro extremo. El V^l está alineado con el V^h y el C^l está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1 ).

Los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, con cadenas pesadas denominadas a, 5, £, y y M, respectivamente. Las clases y y a se dividen además en subclases basándose en diferencias relativamente menores en la secuencia y la función de C^h, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. La cadena L de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El dominio constante incluye la porción Fc que comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H que se mantienen juntas por enlaces disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos, tal como ADCC, están determinadas por secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.

El emparejamiento de un V^h y un V^l entre sí forma una "región variable” o un "dominio variable” que incluye los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "VH'. El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse " VL'. El dominio V contiene un sitio de unión a antígeno que afecta a la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular hacia su antígeno particular. Las regiones V incluyen alrededor de 110 residuos de aminoácidos y consisten en tramos relativamente invariables, denominados regiones estructurales (FRs) (generalmente aproximadamente 4) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" (generalmente aproximadamente 3) que tienen entre 9 y 12 aminoácidos de longitud cada una. Las FRs adoptan en gran medida una configuración de hoja p y las regiones hipervariables forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p.

"Región hipervariabie", "HVR", o "H V se refiere a las regiones del dominio variable de un anticuerpo que son hipervariables en la secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). Una serie de delineaciones de regiones hipervariables están en uso y se incluyen en este documento. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de Kabat se basan en la variabilidad de la secuencia y son las más utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

Residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable, distintos de los residuos de la región hipervariable, definidos en el presente documento.

"Un péptido para formar un sitio de unión a antígeno"generalmente se refiere a un péptido que puede crear una conformación que confiere la especificidad de un anticuerpo hacia un antígeno. Los ejemplos incluyen anticuerpos completos o estructuras relacionadas con anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos completos que incluyen un dominio variable, dominios variables y fragmentos de los mismos, incluyendo las cadenas ligeras y pesadas, o fragmentos de cadenas ligeras y pesadas que incluyen algunas pero no todas las regiones hipervariables o regiones constantes.

Un anticuerpo "intacto" o ”completo" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno, así como un C^l y al menos los dominios constantes de la cadena pesada, C^h1, C^h2 y C^h3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de una secuencia natural humana) o variantes de una secuencia de aminoácidos de los mismos.

"Estructuras relacionadas con anticuerpos completos" incluyen formas multimerizadas de un anticuerpo completo.

Los "fragmentos completos de anticuerpo que incluyen un dominio variable" incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V^h), y el primer dominio constante de una cadena pesada (C^h1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un solo sitio de unión al antígeno.

Un fragmento Fab' se diferencia de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el extremo carboxiterminal del dominio C^h1 que incluye una o varias cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en este documento para un Fab' en el que el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes son portadores de un grupo tiol libre.

Un fragmento F(ab')2 se corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab enlazados por un enlace disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y todavía son capaces de entrecruzar el antígeno.

Un "F v es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y de reconocimiento de antígeno. Ese fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una estrecha asociación, no covalente.

En una especie de Fv monocatenario (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden unir covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de modo que las cadenas ligera y pesada se puedan asociar en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv bicatenario. Con el plegamiento de esos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles desde cada cadena H y L) que aportan los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno.

"Fv monocatenario" también abreviado como "sFv" o "scFv son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios V^h y V^l de un anticuerpo conectados para formar una sola cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios V^h y V^l que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

Un "dominio variable simple"es la mitad de un Fv (que comprende solo tres CDRs específicas de un antígeno) que tiene la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

"Diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Los pequeños fragmentos de anticuerpos se preparan construyendo fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V^h y V^l, de modo que se logra un emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno.

Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "transversales" en los que los dominios V^h y V^l de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los triacuerpos y tetracuerpos también son generalmente conocidos en la técnica.

Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente preexistente de su entorno. Los componentes contaminantes son materiales que interferirían con los usos terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.

Un "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos tal y como se describen en este documento. Esa definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo los bancos de presentación en fagos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir esos anticuerpos, como respuesta a una estimulación antigénica, pero cuyos loci endógenos se han desactivado.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima obtenida a partir del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos los residuos de la región estructural (FRs) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Esas modificaciones se realizan para perfeccionar aún más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

"Anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto debido a posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo sitio de sitio o determinante antigénico en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse con otros anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante la metodología del hibridoma, o se pueden producir utilizando métodos de ADN recombinante en bacterias, células animales o vegetales eucariotas. Los "anticuerpos monoclonales"también se pueden aislar a partir de bancos de anticuerpos en fagos.

Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen los anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) a u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos obtenidos a partir de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada. Los anticuerpos quiméricos de interés en este documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno del dominio variable obtenidas a partir de un primate no humano (por ejemplo, un mono del viejo mundo, hominoideos, etc.) y secuencias de regiones constantes humanas.

La expresión "anticuerpo anti-receptor P2X7" o ”un anticuerpo que se une al receptor P2X7" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al receptor P2X7 con una afinidad suficiente para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse al receptor P2X7, típicamente un receptor P2X7 no funcional. Preferiblemente, el grado de unión de un anticuerpo del receptor P2X7 con una proteína de un receptor no relacionado es menor del 10% de la unión del anticuerpo con un receptor P2X7, tal y como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a un receptor P2X7 tiene una constante de disociación (Kd) < 1 gM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. Un anticuerpo anti-receptor P2X7 no funcional es generalmente uno que tiene algunas o todas esas características serológicas y que se une a receptores P2X7 no funcionales pero no a receptores P2X7 funcionales.

Un anticuerpo "madurado por afinidad' es uno con una o varias alteraciones en una o varias HVRs del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo hacia el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares hacia el antígeno diana Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Un anticuerpo de "bloqueo” o un anticuerpo "antagonista"es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Los anticuerpos de bloqueo o los anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", tal y como se usa en esta memoria, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

"Afinidad de la unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y un ligando (por ejemplo, un antígeno). En general, "afinidad de la unión" se refiere a la afinidad de la unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de una pareja de unión (p. ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X hacia su pareja Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos en el presente documento. Los anticuerpos con baja afinidad generalmente se unen lentamente al antígeno y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen más rápido al antígeno y tienden a permanecer unidos durante más tiempo. Se conoce en la técnica una variedad de métodos para medir la afinidad de la unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención.

Los inventores han determinado las secuencias de CDRs de una serie de clones de dominios variables que se ha encontrado que se unen a la diana de ECD. Esas secuencias de CDRs se muestran en la Tabla 1 a continuación.

En una realización descrita, se proporciona un péptido que tiene una secuencia tal y como se muestra en la Tabla 1. Esos péptidos son particularmente útiles para construir sitios de unión a antígeno, dominios variables, anticuerpos y fragmentos relacionados.

Tabla 1: Secuencias de CDRs

Los inventores han determinado las secuencias de FRs de una serie de clones de dominios variables que se ha encontrado que se unen a la diana de ECD. Esas secuencias de FRs se muestran en la Tabla 2 a continuación. Se podrían usar otras secuencias de FRs conocidas con las CDRs descritas anteriormente para formar un sitio de unión de antígeno para unirse a un receptor P2X7 no funcional.

Tabla 2: Regiones estructurales

En ciertas realizaciones, se proporciona un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia que se muestra en la Tabla 3 a continuación:

Tabla 3: Sitios de unión a antígeno

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión al antígeno por la fórmula general 11:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S) En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 12:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión al antígeno por la fórmula general 13:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y

en donde A1 se refiere a un no aminoácido entre (E/P) y F o alanina.

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 14:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 15:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S);

CDR2 tiene una secuencia: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/SA/)(P/H/N)(M/FA/)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y; en donde A1 se refiere a un no aminoácido entre (E/P) y F o alanina, y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En este documento se describe un sitio de unión a antígeno para la unión de un receptor P2X7, estando definido el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 16:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S);

CDR2 tiene una secuencia: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/SV/)(P/H/N)(M/FA/)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y, en donde A1 se refiere a un no aminoácido entre (E/P) y F o alanina;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLE(S/P)GGGLVQPGGSLRLSCAASG(Y/F/V(R/T/N)(I/F/V);

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNS(L/M)RAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En determinadas realizaciones descritas, el sitio de unión a antígeno es uno que tiene al menos un 75%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 98% o un 99% de identidad con un sitio de unión a antígeno que se muestra en Tabla 3. En ciertas realizaciones descritas, la CDR es una que tiene al menos un 75%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 98% o un 99% de identidad con una CDR que se muestra en la Tabla 1.

El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante métodos convencionales, por medio de programas informáticos conocidos en la técnica, tal como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711) como se describe en Needleman, SB y Wunsch, CD, (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. GAP se utiliza con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización por creación de hueco de 3,0 y penalización por extensión de hueco de 0,1.

La identidad de secuencia de las moléculas de polinucleótidos se determina mediante métodos similares utilizando GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de ADN: penalización por creación de hueco de 5,0 y penalización por extensión de hueco de 0,3.

En otras realizaciones descritas, se proporciona un sitio de unión a antígeno o a CDR y/o FR que tiene una secuencia tal y como se ha descrito anteriormente e incluye una o varias mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio para la unión a un anti-receptor P2X7. La mutación puede dar lugar a una sustitución, inserción o deleción de un resto en una o varias entre las c Dr 1, CDR2 o CDR3, o una o varias entre las FR1, FR2, Fr 3 o FR4.

Marks et al. (1992) BioTechnology 10:779, que describe la maduración por afinidad mediante la mezcla al azar de los dominios VH y VL; Barba et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 9 1:3809; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994; Jackson et al. (1995), J. Immunol. 154(7):3310; y Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889, que describen una mutagénesis aleatoria de la región hipervariable y/o los residuos estructurales, son ejemplos de procedimientos conocidos en la técnica para la maduración por afinidad de sitios de unión a antígeno. En ciertas realizaciones descritas, un ácido nucleico que codifica una o varias de las secuencias que se muestran en la Tabla 1 o la Tabla 3, se mutageniza para crear un banco diverso de secuencias. A continuación, el banco se escruta en busca de una diana que incluye un epítopo de un receptor P2X7 no funcional. En los Ejemplos de este documento se muestra un método ejemplar.

En otra realización reivindicada, se proporciona un sitio de unión a antígeno tal y como se ha descrito anteriormente, en donde una secuencia de aminoácidos que forma una o varias entre FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, se obtiene a partir de una secuencia humana o en forma de una secuencia humana.

El sitio de unión a antígeno puede presentarse en una forma humanizada que incluye secuencias de inmunoglobulina humana y no humana (por ejemplo, murina). Típicamente, todas excepto las secuencias de CDRs del sitio de unión al antígeno, son de una especie no humana tal como ratón, rata o conejo. En algunos casos, los residuos estructurales del sitio de unión a antígeno también pueden ser no humanos. Cuando el sitio de unión al antígeno se proporciona en forma de un anticuerpo completo, normalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) es humana, lo que permite varias funciones efectoras humanas.

Los métodos para humanizar sitios de unión a antígeno no humanos son bien conocidos en la técnica, ejemplos de procedimientos adecuados incluyen los de Jones et al., (1986) Nature, 321:522; Riechmann et al., (1988) Nature, 332:323; Verhoeyen et al., (1988) Science, 239:1534.

Los métodos de presentación en fagos descritos en el presente documento que usan bancos de anticuerpos obtenidos a partir de secuencias de inmunoglobulina humana, son útiles para generar sitios de unión a un antígeno humano y anticuerpos humanos.

También, pueden usarse mamíferos transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Esos ratones pueden generarse mediante una inserción aleatoria o dirigida de genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera humana en células madre embrionarias. Los genes de inmunoglobulina de la cadena ligera y pesada del hospedador pueden volverse no funcionales mediante la inserción o por algún otro evento de recombinación, por ejemplo, mediante deleción homocigótica de la región JH del hospedador. Las células madre embrionarias transfectadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos que luego se crían para producir una descendencia homocigótica que expresa sitios de unión a antígeno humanos. Después de la inmunización con un epítopo de P2X7, se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos. Un beneficio de los sistemas de animales transgénicos es que es posible producir isotipos terapéuticamente útiles porque los transgenes de inmunoglobulina humana se reorganizan durante la diferenciación de los linfocitos B y posteriormente experimentan un cambio de clase y una mutación somática en los ratones transgénicos.

Los dominios variables que incluyen CDRs y FRs de la invención pueden haberse vuelto menos inmunogénicos al reemplazar los residuos expuestos en la superficie para hacer que el anticuerpo parezca ser propio para el sistema inmunitario. Padlan, E. A., 1991, Mol. Immunol. 28, 489 proporciona un método ejemplar. En general, la afinidad se conserva porque el empaquetamiento interno de residuos de aminoácidos en la proximidad del sitio de unión a antígeno permanece invariable y generalmente los residuos de CDRs o los residuos adyacentes que influyen en las características de la unión, no deben sustituirse en estos procedimientos.

En otra realización descrita se proporciona un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab o scFv anti­ receptor P2X7 que incluye un sitio de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente. El sitio de unión a antígeno de la invención tiene una secuencia como se muestra en la Tabla 3.

Los fragmentos de anticuerpos de peso molecular más bajo, en comparación con los anticuerpos completos, pueden tener un mejor acceso a los tumores sólidos y un aclaramiento más rápido, lo que puede ser particularmente útil en una terapia y aplicaciones diagnósticas in vivo.

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos, incluida la digestión proteolítica de anticuerpos intactos y la expresión recombinante en células hospedadoras. Con respecto a esta última, tal y como se describe a continuación, los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar desde los bancos de anticuerpos en fagos y los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente a partir de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')2. En otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se aíslan directamente a partir del cultivo de células hospedadoras recombinantes.

En determinadas realizaciones descritas, el sitio de unión al antígeno se proporciona en forma de un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Fv y scFv son adecuados para una unión no específica reducida durante el uso in vivo, ya que tienen sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes. Las proteínas de fusión que incluyen scFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino-terminal o carboxi-terminal de un scFv.

En otra realización descrita, se proporciona un diacuerpo o triacuerpo u otro anticuerpo multiespecífico que incluye un sitio de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden ensamblar utilizando dominios polipeptídicos que permiten una multimerización. Los ejemplos incluyen las regiones CH2 y CH3 de Fc y las regiones CH1 y Ckappa/lambda. Se pueden usar otros dominios de multimerización de proteínas naturales, incluidos el dominio de cremallera de leucina (bZIP), el motivo hélice-bucle-hélice, el dominio de homología Src (SH2, SH3), una mano EF, un dominio de unión a fosfotirosina (PTB) u otros dominios conocidos en la técnica.

En otra realización descrita, se proporciona un dominio de fusión o proteína heteróloga que incluye un sitio de unión a antígeno, un dominio variable de inmunoglobulina, un anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo como se han descrito anteriormente.

Un polipéptido heterólogo puede fusionarse de forma recombinante o conjugarse químicamente con un extremo N-terminal o C-terminal de un sitio de unión a antígeno o una molécula que lo contiene de la invención.

El polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo o el sitio de unión a antígeno puede ser útil para dirigirse a células que expresan receptores P2X7, o ser útil para alguna otra función, como la purificación o el aumento de la semivida in vivo de los polipéptidos, o para uso en inmunoensayos empleando métodos conocidos en la técnica.

En realizaciones descritas preferidas, una secuencia de aminoácidos marcadora, tal como un péptido de hexahistidina es útil para una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras incluyen, pero no se limitan a, el marcador "HA", que se corresponde con un epítopo obtenido a partir de la proteína hemaglutinina de la gripe y el marcador "flag".

Además, el sitio de unión a antígeno, el dominio variable de la inmunoglobulina, el anticuerpo, el Fab, el dab, el scFv, el diacuerpo o el triacuerpo de la invención, pueden modificarse mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc.

Los sitios de unión a antígeno de la invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los sitios de unión a antígeno de la invención pueden modificarse mediante procesos naturales, como el procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos, así como en las publicaciones investigativas. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte del sitio de unión al antígeno, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales, o en restos tales como carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en varios grados en varios lugares en un sitio de unión a antígeno dado. Además, un sitio de unión a antígeno dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Un sitio de unión a antígeno puede estar ramificado, por ejemplo, como resultado de la ubicuitinación, y puede ser cíclico, con o sin ramificación. Los sitios de unión a antígeno cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales posteriores a la traducción o se pueden preparar mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de un grupo hemo, fijación covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o un derivado de lípido, fijación covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de un anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación y ubicuitinación.

En otra realización descrita, se proporciona un conjugado en forma de sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFsv, diacuerpo, triacuerpo o proteína de fusión, como se ha descrito anteriormente, conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un marcador tal como un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En otro caso, la descripción proporciona además métodos para usar los inmunoconjugados. En un aspecto, un inmunoconjugado comprende cualquiera de los dominios variables anteriores, fijados covalentemente a un agente citotóxico o a un agente detectable.

En otra realización descrita, se proporciona un anticuerpo para la unión a un sitio de unión a antígeno de un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado, como se ha descrito anteriormente.

En otra realización descrita, se proporciona un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado, como se ha descrito anteriormente.

Un polinucleótido que codifica una CDR o FR de acuerdo con cualquiera de las fórmulas generales descritas anteriormente, o un sitio de unión a antígeno que las comprende, puede generarse a partir de un ácido nucleico de cualquier fuente, por ejemplo, mediante síntesis química o aislamiento a partir de un banco de ADNc o genómico. Por ejemplo, se puede generar un banco de ADNc a partir de una célula productora de anticuerpos, tal como un linfocito B, una célula plasmática o una célula de hibridoma, y aislar el ácido nucleico relevante mediante amplificación por PCR, utilizando oligonucleótidos dirigidos al clon particular de interés. Después, los ácidos nucleicos aislados pueden clonarse en vectores utilizando cualquier método conocido en la técnica. A continuación, la secuencia de nucleótidos pertinente se puede mutagenizar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel et al., compiladores, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar sitios de unión a antígeno que tengan una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

En otra realización descrita, se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito anteriormente. El vector, por ejemplo, puede estar en forma de plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados, utilizando métodos conocidos en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o varios entre una secuencia señal, un origen de replicación, uno o varios genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o varios de esos componentes emplea técnicas de unión convencionales que son conocidas por los expertos en la materia.

El sitio de unión al antígeno se puede producir de forma recombinante, no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el sitio de unión al antígeno que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa o el líder de la fosfatasa ácida o el líder de la glucoamilasa de C. albicans. En la expresión de células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes secretores virales.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican los componentes polipeptídicos del sitio de unión a antígeno de la invención se pueden obtener usando técnicas recombinantes estándar, como se ha descrito anteriormente. Los polinucleótidos se pueden sintetizar usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en hospedadores procarióticos. Muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica pueden usarse en relación con la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y de la célula hospedadora particular que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes, según su función (amplificación o expresión de un polinucleótido heterólogo, o ambas) y su compatibilidad con la célula hospedadora particular en la que reside.

En general, los vectores de plásmidos que contienen un replicón y secuencias de control que se obtienen a partir de especies compatibles con la célula hospedadora, se usan en relación con estos hospedadores. Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o varias células hospedadoras seleccionadas, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322, que contiene genes que codifican la resistencia a la ampicilina (Amp) y la tetraciclina (Tet) y, por lo tanto, proporciona un medio sencillo para identificar las células transformadas, es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido de 2 gm es adecuado para la levadura, y varios orígenes de virus (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. pBR322, sus derivados u otros plásmidos o bacteriófagos microbianos también pueden contener, o se pueden modificar para contener, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas.

Además, los vectores de fagos que contienen un replicón y secuencias de control que son compatibles con el microorganismo hospedador, pueden usarse como vectores de transformación en conexión con estos hospedadores. Por ejemplo, se puede utilizar un bacteriófago tal como AGEM.TM.-11 para preparar un vector recombinante que se puede usar para transformar células hospedadoras susceptibles, tal como E. coli LE392.

El vector de expresión de la invención descrita puede comprender dos o más parejas de promotor-cistrón (un cistrón que es un segmento de ADN que contiene toda la información para la producción de un único polipéptido). Un promotor es una secuencia reguladora no traducida ubicada aguas arriba (5') de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procarióticos normalmente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que inicia mayores niveles de transcripción del cistrón bajo su control como respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, p. ej., la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

Se conoce bien una gran cantidad de promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales. El promotor seleccionado se puede ligar funcionalmente al ADN del cistrón que codifica la cadena ligera o pesada, eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia del promotor aislado en el vector de la invención. Tanto la secuencia del promotor natural como muchos promotores heterólogos pueden usarse para dirigir la amplificación y/o la expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de gen diana expresado, en comparación con el promotor del polipéptido diana natural.

Los promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para uso con hospedadores procarióticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas promotores de p-galactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o trc. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada funcionalmente al ADN que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención. Sin embargo, también son adecuados otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o fagos conocidos). Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, lo que permite a un experto en la materia ligarlos funcionalmente a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana, utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

En un aspecto de la invención descrita, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para los fines de esta invención descrita debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias señal naturales de los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo que consiste en líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II termoestable (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA y MBP. En una realización de la invención descrita, las secuencias señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión, son secuencias señal de STII o variantes de las mismas.

En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención descrita puede ocurrir en el citoplasma de la célula hospedadora, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias señal de la secreción dentro de cada cistrón. En ese sentido, las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas se expresan, pliegan y ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedadoras (p. ej., las cepas de E. coli trxB-) proporcionan condiciones en el citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, lo que permite un plegamiento y ensamblaje adecuados de las subunidades de las proteínas expresadas.

La presente invención descrita proporciona un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de los componentes polipeptídicos expresados puede modularse para maximizar el rendimiento de los sitios de unión a antígeno secretados y ensamblados adecuadamente de la invención. Esa modulación se logra, al menos en parte, modulando simultáneamente la potencia de la traducción de los componentes polipeptídicos.

En términos de expresión en células hospedadoras eucariotas, los componentes del vector generalmente incluyen, entre otros, uno o varios de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o varios genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Un vector para uso en una célula hospedadora eucariótica también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o el polipéptido maduro de interés. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como líderes secretores de virus, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN para esa región precursora se liga en marco de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo.

Generalmente, no se necesita un componente de origen de replicación para los vectores de expresión de mamífero. Por ejemplo, el origen de SV40 normalmente se puede usar solo porque contiene el promotor temprano.

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes decisivos que no están disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección emplea un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que les confiere resistencia a los fármacos y, por lo tanto, sobreviven con el régimen de selección. Ejemplos de esa selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero, son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el sitio de unión al antígeno, como DHFR o timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO que carece de actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096), preparada y propagada. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Alternativamente, se pueden seleccionar células hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteína de DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418.

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor ligado funcionalmente al sitio de unión al antígeno que codifica la secuencia de ácido nucleico para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales son bien conocidos.

Los genes eucariotas generalmente tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra entre 70 y 80 bases aguas arriba desde el comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas esas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas que incluyen enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de la levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada a través de las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de las enzimas alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

La transcripción del sitio de unión de antígenos de vectores en células hospedadoras de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus, tal como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y el virus de simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que esos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

La transcripción de un ADN que codifica el sitio de unión al antígeno por parte de eucariotas superiores puede incrementarse mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Las secuencias potenciadoras incluyen las conocidas a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Normalmente, sin embargo, se utilizará un potenciador procedente de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus.

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levadura, hongo, insecto, planta, animal, ser humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Esas secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de los ADN o ADNc eucariotas o víricos. Esas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica un sitio de unión a antígeno.

En otra realización descrita, se proporciona una célula que incluye un vector o ácido nucleico descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico o vector puede estar presente en la célula hospedadora modificada genéticamente o en el hospedador como una molécula independiente fuera del genoma, preferiblemente como una molécula que es capaz de replicarse, o puede estar integrada de forma estable en el genoma de la célula hospedadora o el hospedador.

La célula hospedadora de la presente invención descrita puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

Ejemplos de células procariotas son las que generalmente se usan para la clonación como E. co lio Bacillus subtilis. Además, las células eucariotas comprenden, por ejemplo, células fúngicas o animales.

Ejemplos de células fúngicas adecuadas son las células de levadura, preferiblemente las del género Saccharomyces y lo más preferiblemente los de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Ejemplos de células animales son, por ejemplo, células de insecto, células de vertebrado, preferiblemente células de mamífero, como p. ej., HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OS, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Estas células hospedadoras, p. ej., las células CHO, pueden proporcionar modificaciones postraduccionales a las moléculas de anticuerpo de la invención, incluida una eliminación del péptido líder, plegamiento y ensamblaje de las cadenas H (pesada) y L (ligera), glicosilación de la molécula en los lados correctos y la secreción de la molécula funcional.

Otras líneas celulares adecuadas conocidas en la técnica se pueden obtener a partir de depósitos de líneas celulares, como la American Type Culture Collection (ATCC).

En otra realización descrita, se proporciona un animal que incluye una célula descrita anteriormente. En ciertas realizaciones descritas, los animales y tejidos de los mismos que contienen un transgén son útiles para producir los sitios de unión a antígeno de la invención. La introducción de moléculas de ácido nucleico como transgenes en hospedadores no humanos y su posterior expresión, puede emplearse para la producción de sitios de unión a antígeno, por ejemplo, la expresión de un transgén de ese tipo en la leche del animal transgénico, proporciona medios para obtener los sitios de unión a antígeno en cantidades cuantitativas. Los transgenes útiles a este respecto comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, secuencias codificantes para los sitios de unión a antígeno descritos en este documento, ligados funcionalmente a estructuras promotoras y/o potenciadoras de un gen específico de la glándula mamaria, tal como caseína o betalactoglobulina. El animal puede ser un mamífero no humano, más preferiblemente ratones, ratas, ovejas, terneros, perros, monos o simios.

En otra realización descrita, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los métodos para preparar y administrar los sitios de unión a antígeno a un sujeto que los necesite son bien conocidos por los expertos en la técnica o se determinan fácilmente. La vía de administración del sitio de unión a antígeno puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica.

El término parenteral tal y como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, una administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal.

Si bien todas esas formas de administración están claramente contempladas dentro del alcance de la invención descrita, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Normalmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales como el aceite de oliva y los ésteres orgánicos inyectables como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. En la presente invención, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, tampón fosfato 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes agentes conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles, en tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida de que exista una inyectabilidad fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y preferentemente se preservará contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para uso en los métodos terapéuticos descritos en este documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16a ed. (1980).

Una prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un compuesto activo (p. ej., el sitio de unión a antígeno) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, con un ingrediente o una combinación de ingredientes indicados en este documento, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, lo que produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución filtrada previamente estéril de los mismos. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se envasan en recipientes tales como ampollas, bolsas, botellas, jeringas o viales y se sellan en condiciones asépticas según métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de kit. Esos artículos de fabricación tendrán preferiblemente etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padece trastornos predispuestos.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de trastornos, tal y como se describe en el presente documento, varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también puede tratarse de mamíferos no humanos, incluidos los mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de un tratamiento pueden valorarse usando métodos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para el tratamiento de ciertos trastornos con un sitio de unión a antígeno, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.) de peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg. También se entiende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la invención. A los sujetos se les pueden administrar esas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otra pauta determinada por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en dosificaciones múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Las pautas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más sitios de unión a antígeno con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada sitio de unión a antígeno administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados.

Un sitio de unión a antígeno descrito en este documento puede administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, tal y como se indica midiendo los niveles en sangre del polipéptido diana o la molécula diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de polipéptidos en plasma de 1-1000 gg/ml y en algunos métodos de 25-300 gg/ml. Alternativamente, los sitios de unión a antígeno se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían según la semivida del sitio de unión al antígeno en el paciente. La semivida de un sitio de unión a antígeno también se puede prolongar mediante la fusión con un polipéptido o un resto estable, por ejemplo, albúmina o PEG. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más prolongada, seguidos de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. En una realización, el sitio de unión a antígeno de la invención se puede administrar en forma no conjugada. En otra realización, los sitios de unión a antígeno para usar en los métodos descritos en el presente documento, se pueden administrar múltiples veces en forma conjugada. En aún otra realización, los sitios de unión a antígeno de la invención pueden administrarse en forma no conjugada, luego en forma conjugada o viceversa.

La dosificación y la frecuencia de la administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que comprenden anticuerpos o una mezcla de los mismos se administran a un paciente que aún no está en el estado de enfermedad o en un estado anterior a la enfermedad, para mejorar la resistencia del paciente. Esa cantidad se define como una "dosis efectiva profiláctica". En ese uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud y la inmunidad general del paciente, pero generalmente oscilan entre 0,1 y 25 mg por dosis, especialmente entre 0,5 y 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo un tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta (p. ej., de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de molécula de unión, p. ej., de sitio de unión al antígeno por dosis, siendo las dosificaciones más comúnmente utilizadas de 5 a 25 mg para radioinmunoconjugados y dosis más altas para moléculas conjugadas con fármaco de citotoxina) a intervalos relativamente cortos, a veces se requiere hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

En una realización descrita, un sujeto puede tratarse con una molécula de ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno (p. ej., en un vector). Las dosis para ácidos nucleicos que codifican polipéptidos oscilan entre aproximadamente 10 ng y 1 g, entre 100 ng y 100 mg, entre 1 gg y 10 mg o entre 30-300 gg de ADN por paciente. Las dosis para vectores víricos infecciosos varían de 10-100 o más viriones por dosis.

Los agentes terapéuticos se pueden administrar por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular en donde se han acumulado células con el receptor P2X7 no funcional, por ejemplo, con inyección intracraneal. Se prefiere la inyección intramuscular o la infusión intravenosa para la administración de anticuerpos, en algunos métodos, los anticuerpos terapéuticos particulares se inyectan directamente en el cráneo, en algunos métodos, los anticuerpos se administran como una composición o un dispositivo de liberación sostenida.

Un sitio de unión a antígeno de la invención se puede administrar opcionalmente en combinación con otros agentes que son efectivos para tratar el trastorno o la afección que necesita tratamiento (p. ej., profiláctico o terapéutico).

En otra realización descrita, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente, un diluyente y opcionalmente un marcador.

En determinadas realizaciones, los sitios de unión a antígeno o la molécula que los incluye están marcados de forma detectable. Se pueden usar muchos marcadores diferentes, incluyendo enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Fluorocromos (fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, etc.), enzimas (peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc.), isótopos radiactivos (32P o 125I), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes o bioluminiscentes (dioxetanos, luminol o acridinios) se emplean comúnmente.

Los métodos de detección dependen del tipo de marcador utilizado e incluyen autorradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas. Los ejemplos incluyen transferencia Western, ensayos de superposición, RIA (ensayo radioinmunológico) e IRMA (ensayo radioinmunométrico inmunológico), EIA (ensayo inmunológico enzimático), ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), FIA (ensayo inmunofluorescente) y CLIA (ensayo inmunológico quimioluminiscente).

En otra realización descrita, se proporciona un kit o un artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica, como se ha descrito anteriormente.

En otras realizaciones descritas, se proporciona un kit para uso en una aplicación terapéutica mencionada anteriormente, en donde el kit incluye:

- un recipiente que contiene una composición terapéutica en forma de uno o varios sitios de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica;

- una etiqueta o prospecto con instrucciones de uso.

En ciertas realizaciones descritas, el kit puede contener uno o varios principios activos o ingredientes adicionales para el tratamiento de un cáncer o para prevenir una complicación relacionada con el cáncer descrita anteriormente, o una afección o enfermedad asociada con una expresión del receptor P2X7 no funcional.

El kit o "artículo de fabricación" puede comprender un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, blísteres, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición terapéutica que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto indica que la composición terapéutica se usa para tratar la afección elegida. En una realización, la etiqueta o el prospecto incluye instrucciones de uso e indica que la composición terapéutica se puede usar para tratar un cáncer o para prevenir una complicación derivada del cáncer.

El kit puede comprender (a) una composición terapéutica; y (b) un segundo recipiente con un segundo principio activo o un ingrediente contenido en el mismo. El kit en esa realización descrita de la invención puede comprender además un prospecto que indica que el principio activo y otros pueden usarse para tratar un trastorno o prevenir una complicación derivada del cáncer. Como alternativa, o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

En ciertas realizaciones descritas, la composición terapéutica se puede proporcionar en forma de un dispositivo, desechable o reutilizable, que incluye un receptáculo para contener la composición terapéutica. En una realización, el dispositivo es una jeringa. El dispositivo puede contener 1-2 ml de la composición terapéutica. La composición terapéutica puede proporcionarse en el dispositivo en un estado que esté listo para el uso o en un estado que requiera la mezcla o adición de otros componentes.

En otra realización descrita, se proporciona un kit o un artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o una composición de diagnóstico como se ha descrito anteriormente.

En otras realizaciones descritas, se proporciona un kit para uso en una aplicación de diagnóstico mencionada anteriormente, en donde el kit incluye:

- un recipiente que contiene una composición de diagnóstico en forma de uno o varios sitios de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado;

- una etiqueta o prospecto con instrucciones de uso.

El kit o "artículo de fabricación” puede comprender un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, blísteres, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tal como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de diagnóstico que es eficaz para la detección del cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto indica que la composición de diagnóstico se usa para detectar la afección elegida. En una realización descrita, la etiqueta o el prospecto incluye instrucciones de uso e indica que la composición de diagnóstico puede usarse para detectar un cáncer o una enfermedad o afección caracterizada la expresión del receptor P2X7 no funcional.

El kit puede comprender (a) una composición de diagnóstico; y (b) un segundo recipiente con un segundo agente de diagnóstico o una segunda etiqueta contenida en el mismo. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, etc.

En otra realización descrita, se proporciona un método para producir un sitio de unión a antígeno anti-P2X7 como se ha descrito anteriormente, que incluye la expresión de un ácido nucleico, como se ha descrito anteriormente en una célula o en un animal no humano, como se ha descrito anteriormente.

La producción de un sitio de unión a antígeno de la invención generalmente requiere un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el sitio de unión a antígeno de la invención. Un polinucleótido que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención puede obtenerse y subclonarse en un vector para la producción de un sitio de unión a antígeno mediante tecnología de ADN recombinante, utilizando técnicas bien conocidas en la materia, incluidas las técnicas descritas en este documento. Se contemplan muchos sistemas de expresión diferentes, incluido el uso de células de mamífero, incluidas las células humanas, para la producción y secreción de sitios de unión a antígeno. Los ejemplos de células incluyen la línea celular 293F, CHO y NSO.

Los vectores de expresión que contienen secuencias que codifican proteínas y señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas pueden construirse utilizando métodos conocidos en la técnica. Éstos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. En ciertas realizaciones descritas, se proporciona un vector replicable que tiene un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno ligado funcionalmente a un promotor.

Las células transfectadas con un vector de expresión pueden cultivarse mediante técnicas convencionales para producir un sitio de unión a antígeno. Por lo tanto, en ciertas realizaciones descritas, se proporcionan células hospedadoras o células transfectadas que contienen un polinucleótido que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención ligado funcionalmente a un promotor. El promotor puede ser heterólogo. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión en un hospedador y, en ciertos sistemas, la maquinaria de transcripción del sistema de vector se adapta particularmente a la célula hospedadora. Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), pueden transfectarse con un vector que incluye el principal elemento promotor del gen temprano intermedio del citomegalovirus humano. Adicional o alternativamente, se puede usar una célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico según se requiera, incluyendo diversas formas de modificación postraduccional. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero que tienen procesos de modificación particulares, posteriores a la traducción, incluyen las células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NSO, CRL7O3O y HsS78Bst.

Dependiendo del uso previsto para la molécula de proteína, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión bacterianos. En un ejemplo, los vectores que causan la expresión de niveles elevados de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente, como el vector de expresión de E. coli pUR278, se puede utilizar cuando se va a producir una gran cantidad de un sitio de unión a antígeno. El producto de expresión se puede producir en forma de una proteína de fusión con lacZ. Otros vectores bacterianos incluyen vectores pIN y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión-Stransferasa (GST). Esas proteínas de fusión son generalmente solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de afinidad de glutatión-agarosa, seguida de elución en presencia de glutatión libre. Se puede proporcionar un sitio de escisión mediante la proteasa de trombina y/o factor Xa en el polipéptido expresado, de manera que el producto del gen diana clonado pueda liberarse del resto GST.

El virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se puede utilizar como vector para expresar genes extraños en un sistema de insecto, incluidas las células de Spodoptera frugiperda. El promotor particular usado puede depender de dónde se inserta la proteína que codifica en la secuencia. Por ejemplo, la secuencia puede clonarse individualmente en el gen de la polihedrina y colocarse bajo el control del promotor de la polihedrina.

Los sistemas de expresión basados en virus se pueden utilizar con células de mamífero tales como un adenovirus, de manera que la secuencia codificante de interés se puede ligar con el promotor tardío adenovírico y la secuencia líder tripartita. Después se puede usar una recombinación in vitro o in vivo para insertar ese gen quimérico en el genoma adenovírico. Las inserciones en la región E1 o E3 darán como resultado un virus recombinante viable que es capaz de expresar el sitio de unión a antígeno en las células hospedadoras infectadas. Pueden ser necesarias señales de iniciación específicas, incluido el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes, para una traducción eficaz de las secuencias codificantes del sitio de unión a antígeno insertado. Las señales y codones de control de iniciación y traducción se pueden obtener a partir de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Pueden usarse elementos potenciadores de la transcripción y terminadores de la transcripción para potenciar la eficacia de la expresión de un sistema basado en virus.

Cuando se requiere una producción de alto rendimiento a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. En general, se utiliza un gen marcador seleccionable mediante el cual, después de la transfección, las células se cultivan durante 1 o 2 días en un medio enriquecido y luego se transfieren a un medio que contiene un medio selectivo en el que se pueden detectar las células que contienen el marcador seleccionable correspondiente, por ejemplo, resistencia a antibióticos. El resultado es que las células que han integrado de manera estable el plásmido en sus cromosomas crecen y forman focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Los genes de la timidina cinasa, hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa del virus del herpes simple son ejemplos de genes que se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprT- respectivamente, proporcionando así sistemas de selección apropiados. Los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418; e higro, que confiere resistencia a la higromicina, son ejemplos de genes que se pueden utilizar en sistemas de selección de antimetabolitos.

Un sitio de unión a antígeno de la invención puede purificarse con un sistema de expresión recombinante mediante métodos conocidos que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad (especialmente afinidad hacia los antígenos específicos Proteína A o Proteína G) y cromatografía en columna con filtración en gel), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. La purificación puede facilitarse proporcionando el sitio de unión al antígeno en forma de una proteína de fusión.

Se pueden producir grandes cantidades de sitios de unión a antígeno de la invención mediante un procedimiento ampliable que comienza con un sistema de expresión piloto en un laboratorio de investigación que se amplía a un biorreactor a escala analítica (típicamente desde biorreactores de 5 L a aproximadamente 50 L) o biorreactores a escala de producción (por ejemplo, pero no limitados a, 75 L, 100 L, 150 L, 300 L o 500 L). Los procedimientos ampliables deseables incluyen aquellos en los que hay niveles de agregación de bajos a indetectables, medidos mediante HPSEC o rCGE, normalmente no más del 5% de agregación en peso de proteína hasta no más del 0,5% en peso de agregación de proteína. Adicional o alternativamente, se pueden desear niveles indetectables de fragmentación medidos en términos del área total del pico que representa el sitio de unión al antígeno intacto en un procedimiento ampliable, de modo que al menos el 80% y hasta el 99,5% o más del área total del pico representa el sitio de unión al antígeno intacto. En otras realizaciones, el procedimiento ampliable de la invención produce sitios de unión a antígeno con una eficacia de producción de aproximadamente 10 mg/l a aproximadamente 300 mg/l o superior.

En otra realización descrita, se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizada por la expresión del receptor P2X7 no funcional en un individuo que incluye la etapa de proporcionar un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente a un individuo que requiere tratamiento para esa afección. Típicamente, la afección es cáncer, especialmente un cáncer epitelial como se describe en este documento.

Las enfermedades preneoplásicas y neoplásicas son ejemplos particulares a los que se pueden aplicar los métodos de la invención. Ejemplos generales incluyen tumores de mama, tumores colorrectales, adenocarcinomas, mesotelioma, tumores de vejiga, tumores de próstata, tumores de células germinales, hepatoma/colongio, carcinoma, tumores neuroendocrinos, neoplasia hipofisaria, tumor de células pequeñas y redondas 20, cáncer de células escamosas, melanoma, fibroxantoma atípico, seminomas, no seminomas, tumores de las células de Leydig del estroma, tumores de las células de Sertoli, tumores de piel, tumores renales, tumores testiculares, tumores cerebrales, tumores de ovario, tumores de estómago, tumores orales, tumores de vejiga, tumores óseos, tumores cervicales, tumores esofágicos, tumores laríngeos, tumores de hígado, tumores pulmonares, tumores vaginales y tumor de Wilm.

Ejemplos de cánceres particulares incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma, adenoma, adenofibroma, adenolinfoma, adontoma, cánceres relacionados con el SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoquístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogénica, alopecia, sarcoma alveolar de partes blandas, ameloblastoma, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatosis, apudoma, cáncer anal, angiosarcoma, anemia aplásica, astrocitoma, ataxiatelangiectasia, carcinoma de células basales (piel), cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de intestino, glioma de tronco encefálico, tumores cerebrales y del SNC, cáncer de mama, branquioma, tumores del SNC, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, tumores cerebrales infantiles, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejido blando infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de linfocitos T, carcinoma (p. ej., Walker, de células basales, basoescamoso, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, células de Merkel, mucinoso, pulmón de células no pequeñas, células en avena, papilar, escirro, bronquiolar, bronquiogénico, de células escamosas y de células de transición), carcinosarcoma, displasia cervical, filodias de cistosarcoma, cementoma, cordoma, coristoma, condrosarcoma, condroblastoma, craneofaringioma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, dermatofibrosarcoma protuberante, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, carcinoma ductal, disgerminoma, cánceres endocrinos, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer ocular, ojo: melanoma, retinoblastoma, cáncer de las trompas de Falopio, anemia de Fanconi, fibroma, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres genitourinarios, tumores de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cánceres ginecológicos, tumores de células gigantes, ganglioneuroma, glioma, glomangioma, tumor de células de la granulosa, ginandroblastoma, neoplasias malignas hematológicas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, histiocitosis, enfermedad de Hodgkin, virus del papiloma humano, mola hidatiforme, hipercalcemia, cáncer de hipofaringe, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, hemangiosarcoma, trastornos histiocíticos, histiocitosis maligna, histiocitoma, hepatoma, hidradenoma, hondrosarcoma, inmunoproliferativo pequeño, opoma, melanoma intraocular, cáncer de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de li-fraumeni, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, leigomiosarcoma, leucemia (p. ej., de linfocitos B, de células mixtas, de células nulas, de linfocitos T, crónica de linfocitos T, asociada a htlv-ii, linfangiosarcoma, linfocítica aguda, linfocítica crónica, mastocitos y mieloide), leucosarcoma, tumor de células de Leydig, liposarcoma, leiomioma, leiomiosarcoma, linfangioma, linfangiocitoma, linfagioma, linfagiomioma, linfangiosarcoma, cáncer de mama masculino, tumor renal rabdoide maligno, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos mieloproliferativos, síndrome carcinoide maligno cardiopatía carcinoide, meduloblastoma, meningioma, melanoma, mesenquimoma, mesonefroma, mesotelioma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, mixoma, mixosarcoma, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nijmegen, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (nsclc), neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibromatosis, neurofibroma, neuroma, neoplasias (p. ej., de hueso, mama, sistema digestivo, colorrectal, hígado), cánceres oculares, cáncer de esófago, cáncer de cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovario de ostomía, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer pituitario, policitemia vera, cáncer de próstata, osteoma, osteosarcoma, carcinoma de ovario, papiloma, paraganglioma, paraganglioma no cromafín, pinealoma, plasmocitoma, protooncogén, cánceres raros y trastornos asociados, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, reticuloendoteliosis, rabdomioma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas (sclc), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumores de la médula espinal, carcinoma de células escamosas (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, sarcoma (p. ej., sarcoma experimental de Ewing, sarcoma de Kaposi y de mastocitos), tumor de células de Sertoli, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición (vejiga), cáncer de células de transición (pelvis renal-/-uréter), cáncer trofoblástico, teratoma, tumor de células de la teca, timoma, tumor trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer del sistema urinario, uroplaquinas, sarcoma uterino, cáncer de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.

Otras enfermedades y afecciones incluyen varias afecciones inflamatorias. Los ejemplos pueden incluir un componente proliferativo. Los ejemplos particulares incluyen acné, angina, artritis, neumonía por aspiración, enfermedad, empiema, gastroenteritis, inflamación, gripe intestinal, nee, enterocolitis necrotizante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, EPI, pleuresía, garganta dolorida, enrojecimiento, rubor, dolor de garganta, gastroenteritis e infecciones del tracto urinario, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica o polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.

En otra realización descrita, se proporciona el uso de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFsv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

La cantidad de dosificación, la frecuencia de la dosificación, las vías de administración, etc., se han descrito con detalle anteriormente.

En otra realización descrita, se proporciona un método para el diagnóstico del cáncer que incluye la etapa de poner en contacto tejidos o células en los cuales se va a determinar la presencia o ausencia de cáncer, con un reactivo en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición de diagnóstico como se ha descrito anteriormente y detectando la unión del reactivo con los tejidos o células. El método puede llevarse a cabo in vivo o in vitro.

Para un diagnóstico in situ, el sitio de unión a antígeno se puede administrar al organismo que va a ser diagnosticado mediante inyección intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial u otras vías de modo que pueda tener lugar una unión específica entre un sitio de unión a antígeno de acuerdo con la invención con una región epitópica en el receptor P2X7 no funcional. El complejo anticuerpo/antígeno puede detectarse convenientemente a través de un marcador adherido al sitio de unión a antígeno o a un fragmento funcional del mismo o mediante cualquier otro método de detección conocido en la técnica.

Los inmunoensayos usados en aplicaciones de diagnóstico de acuerdo con la invención descrita y tal y como se describe en el presente documento, normalmente se basan en antígenos marcados, anticuerpos o reactivos secundarios para la detección. Esas proteínas o reactivos se pueden marcar con compuestos generalmente conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas, incluidas, entre otras, partículas coloreadas, como oro coloidal y perlas de látex. Entre estos, se puede usar un marcador radiactivo para casi todos los tipos de ensayos y con la mayoría de las variaciones. Los marcadores conjugados con enzimas son particularmente útiles cuando se debe evitar la radiactividad o cuando se necesitan resultados rápidos. Los fluorocromos, aunque requieren un equipo costoso para su uso, proporcionan un método de detección muy sensible. Los anticuerpos útiles en esos ensayos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos policlonales purificados por afinidad.

Alternativamente, el sitio de unión a antígeno se puede marcar indirectamente mediante una reacción con sustancias marcadas que tienen afinidad hacia la inmunoglobulina, tal como la proteína A o G o segundos anticuerpos. El sitio de unión a antígeno puede conjugarse con una segunda sustancia y se detecta con una tercera sustancia marcada que tiene afinidad hacia la segunda sustancia, conjugada con el sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno puede conjugarse con biotina y el conjugado de sitio de unión a antígeno-biotina puede detectarse usando avidina o estreptavidina marcada. De manera similar, el sitio de unión a antígeno se puede conjugar con un hapteno y el conjugado de sitio de unión a antígeno-hapteno se puede detectar utilizando un anticuerpo anti-hapteno marcado.

En determinadas realizaciones descritas, los inmunoensayos utilizan un método de doble anticuerpo para detectar la presencia de un analito, en donde el sitio de unión a antígeno se marca indirectamente mediante reactividad con un segundo anticuerpo que se ha marcado con un marcador detectable. El segundo anticuerpo es preferiblemente uno que se une a anticuerpos del animal a partir del cual se ha obtenido el sitio de unión al antígeno. En otras palabras, si el sitio de unión a antígeno es un anticuerpo de ratón, entonces el segundo anticuerpo marcado es un anticuerpo anti­ ratón. Para que el sitio de unión a antígeno se utilice en el ensayo descrito en el presente documento, ese marcador es preferiblemente una perla recubierta de anticuerpo, particularmente una perla magnética. Para que el sitio de unión a antígeno se emplee en el inmunoensayo descrito en el presente documento, el marcador es preferiblemente una molécula detectable, tal como una sustancia radiactiva, fluorescente o electroquimioluminiscente.

Un sistema de doble anticuerpo alternativo, a menudo denominado sistema de formato rápido porque está adaptado a determinaciones rápidas de la presencia de un analito, también puede emplearse dentro del alcance de la presente invención descrita. El sistema requiere una afinidad elevada entre el sitio de unión a antígeno y el analito. De acuerdo con una realización de la presente invención, la presencia del receptor P2X7 no funcional se determina utilizando una pareja de sitios de unión a antígeno, cada uno específico para una proteína del receptor P2X7. Un miembro de dichas parejas de sitios de unión a antígeno se denomina en este documento "sitio de unión a antígeno detector" y el otro miembro de dicha pareja de sitios de unión a antígeno se denomina en este documento "sitio de unión a antígeno de captura". El sitio de unión a antígeno de la presente invención se puede utilizar como sitio de unión a antígeno de captura o como sitio de unión a antígeno detector. El sitio de unión a antígeno de la presente invención también se puede usar como sitio de unión a antígeno de captura y detector, juntos en un solo ensayo. Por lo tanto, una realización de la presente invención descrita utiliza el método sándwich de sitio de unión a antígeno doble para detectar el receptor P2X7 no funcional, en una muestra de fluido biológico. En este método, el analito (proteína del receptor P2X7 no funcional) se intercala entre el sitio de unión a antígeno detector y el sitio de unión a antígeno de captura, quedando inmovilizado irreversiblemente el sitio de unión a antígeno de captura sobre un soporte sólido. El sitio de unión a antígeno del detector contendrá un marcador detectable, con el fin de identificar la presencia del sándwich entre el sitio de unión a antígeno-analito y, por lo tanto, la presencia del analito.

Ejemplos de sustancias en fase sólida incluyen, pero no se limitan a, placas de microvaloración, tubos de ensayo de poliestireno, perlas magnéticas, de plástico o de vidrio y portaobjetos que son bien conocidos en el campo de los radioinmunoensayos y los inmunoensayos enzimáticos. Los métodos para acoplar sitios de unión a antígenos a fases sólidas, también son bien conocidos por los expertos en la materia. Más recientemente, se han empleado como soportes sólidos varios materiales porosos tales como nailon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos.

Los ejemplos que siguen pretenden ilustrar pero de ningún modo limitar la presente invención descrita.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Identificación de candidatos iniciales de dAbs para la unión con receptores no funcionales en células vivas

Objetivo: Los experimentos descritos en este documento se han realizado para encontrar sitios de unión a antígeno que se unen al péptido E200.

Antecedentes: Los antisueros que se unen a P2X7 tienen baja afinidad hacia P2X7 tal y como se expresa en células cancerosas vivas, ya que la conformación del epítopo diana en las células cancerosas vivas es diferente. Para identificar candidatos iniciales de dAbs para ligandos de alta afinidad, primero necesitábamos identificar una diana adecuada, sabiendo que se requiere una buena diversidad de secuencias de ligandos para ampliar la selección del espacio conformacional, para incluir compuestos iniciales adecuados. Seleccionamos el péptido E200 como una diana adecuada para identificar candidatos iniciales de dAbs.

Materiales y métodos: El péptido E200 se preparó mediante síntesis en fase sólida en Chiron Mimotopes. Se sintetizó una serie de conjugados para identificar aquellos que tenían más probabilidades de ser útiles para los fines de detección. Estos incluían conjugados de proteínas de BSA, DT y ovoalbúmina ligados a los residuos Cys C-terminales en el péptido E200 a través de MCS. Una cuarta variante implicaba una biotinilación del péptido E200 en el extremo C-terminal.

Los clones iniciales adecuados se identificaron inicialmente como positivos para ELISA, tanto en las selecciones en fase sólida como en fase de solución. Estos se prepararon contra los péptidos no conjugados y los conjugados. Se sintetizaron péptidos adicionales (200-208 y 207-215) para diferenciar más a fondo las regiones de unión de los diversos clones iniciales. Se sometieron a ensayo las propiedades de la solución, utilizando SEC-MALLS de los clones iniciales para garantizar que fueran adecuados para un desarrollo posterior.

Resultados:

Se identificó y se aisló una gran cantidad de candidatos iniciales de primera generación que inicialmente se unían al péptido E200 con una afinidad de unión en el intervalo de K^d uM, medido por Biacore y luego unido de forma detectable mediante citometría de flujo a células cancerosas vivas que expresaban la diana de receptor P2X7 no funcional en su superficie. Los anticuerpos de un dominio único producidos a partir de un banco de presentación en fagos de Domantis que se examinaron frente al antígeno peptídico E200, mostraban una K^d del orden de 1 uM usando análisis de unión de Biacore. Los clones iniciales que se hicieron avanzar, mostraban diversidad en sus características de unión. Tres dAbs iniciales, PEP2-2, PEP2-4 y PEP2-5 mostraron la mayor afinidad cuando se sometieron a ensayo en células de cáncer de próstata humano PC3 vivas mediante citometría de flujo. Una detección adicional implicaba el uso de inmunohistoquímica estándar en la que se incubaba tejido humano normal y canceroso con el dAb elegido, marcado con marcador Myc al que se había añadido un anticuerpo anti-Myc marcado con HRP. Se añadió diaminobenzoato (DAB) para que reaccionara con cualquier HRP restante, después de que se completaran las debidas etapas de lavado. PEP2-4 y PEP2-5 se unían moderadamente al tejido tumoral, pero no al tejido normal, tal como la próstata y la piel humanas, mientras que PEP2-2 era un ejemplo de un dAb inicial que mostraba una unión poco efectiva con el tejido en la selección inicial.

La selección pasiva se realizó usando los péptidos E200, el conjugado E200-BSA, el conjugado E200 de ovoalbúmina y el conjugado E200-DT, mientras que el cribado en solución empleaba el péptido biotinilado y luego se analizó usando estreptavidina. Tanto las selecciones pasivas como en solución de los numerosos dAbs iniciales, funcionaron bien con ligandos específicos, demostrando una buena diversidad de secuencias en forma de dominios V^h únicos. La detección frente al péptido E200 y partes más pequeñas (200-208 y 207-215) reveló que los dAbs iniciales se unían a diferentes regiones. Se hicieron avanzar a aquellos con las mejores propiedades en solución, que eran la mayor solubilidad de los monómeros. Aquellos que demostraron unas características de unión bifásicas en Biacore no continuaron. Todos mostraron una unión uM al péptido E200. Finalmente, se llevaron a cabo un total de cinco ciclos de selección, tal y como se muestra en el Ejemplo 5. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de los resultados del Ciclo 2.

A continuación, se muestra un ejemplo de la unión de un dAb a tejido canceroso, en donde el tejido de cáncer de cuello uterino humano se tiñó con el dAb PEP2-4 marcado con c-Myc y luego se desarrolló usando un anticuerpo anti-Myc de ratón (1:600) seguido por el sistema de detección de polímero secundario Biocare Medical Mach4 y DAB. Para inhibir la unión, el sustrato peptídico se añadió al primario con concentraciones de 0 (Figura 2), 25 nM (sin pérdida de unión), 0,25 uM (sin pérdida de unión), 10 uM (sin pérdida de unión), 0,1 mM (Figura 3) y 1 mM (Figura 4).

No se observó una inhibición de la unión con una concentración inferior a 0,01 mM, lo que indicaba que el ideal para una inhibición del 50% es aproximadamente 40-50 uM.

En las Figuras 5 a 7 se muestra un segundo conjunto de secciones en serie procedente de diferentes secciones de tejido, con un aumento también de 10x.

Por el contrario, la diferencia entre añadir 0 y 10 uM de péptido competidor era mínima, como se muestra en las Figuras 8 (sin péptido) y 9 (péptido 10 uM).

Hay una clara inhibición con 100 uM y ninguna inhibición con 10 uM, lo que indica que la unión con un 50% de inhibición parece ser con aproximadamente 40-50 uM en este sistema.

En la Figura 10 a continuación se muestra una sección de tejido de melanoma humano teñido de manera similar con PEP2-4 dAb 20 nM:

Conclusión: Se identificaron los sitios de unión a antígeno en forma de candidatos iniciales de dAbs para la unión de alta afinidad de P2X7 con las células PC3. Se desconocía y posteriormente se investigó si esos sitios de unión a antígeno interaccionaban con un epítopo lineal o conformacional. Un refinamiento de los candidatos iniciales requería una detección adicional frente a un epítopo conformacional que representaba la forma del sitio de unión a antígeno de la diana E200, tal y como se expresaba en las células cancerosas.

Ejemplo 2 - Determinación de la actividad de los candidatos iniciales de dAbs en formato dAb-Fc

Objetivo: Los experimentos descritos en este documento han sido para mejorar la afinidad de los sitios de unión a antígeno que se unen al péptido E200, formateando los dabs iniciales como dAb-Fc.

Antecedentes: La unión cooperativa de los dabs iniciales se logró produciendo dAb-Fc de formato estándar con el subtipo IgG1 Fc de tipo humano. Esos formatos permitieron una selección más considerada de los clones de dAb iniciales al permitir la eliminación de dabs iniciales de alta afinidad, para los cuales el formateo como dAb-Fc proporcionaba pocos beneficios debido a problemas de solubilidad. A continuación se seleccionarían soluciones conformacionales favorables para ciclos adicionales de selección.

Resultados: Los primeros dabs formateados PEP2-4 y PEP2-5 que habían sido elegidos como candidatos iniciales de alta afinidad en el Ejemplo 1, mostraban poca unión adicional con el péptido E200 mientras que PEP2-2 y otros (2-47, 2-42) se beneficiaban con un mejora típica en la K^d de 100-1000 veces. El formateo de los diversos candidatos iniciales daba como resultado una buena expresión, como se mostraba en el gel SDS-PAGE en la Figura 11.

La mejora en la unión es evidente con los candidatos iniciales que incluyen PEP2-2, PEP2-42, PEP2-47 que se muestran en la Figura 12, en los que el chip de Biacore se revistió con 100 Ur de E200 y cada dAb-Fc se ejecutó con 100 nM.

Ejemplo 3 - Determinación de un epítopo conformacional para la selección frente a los candidatos iniciales de dAbs

Objetivo: Los experimentos descritos en este documento han sido para determinar un epítopo conformacional apropiado para encontrar dAbs que se unan al péptido E200 y también se unan a un epítopo conformacional.

Antecedentes: Los ligandos de alta afinidad deben unirse a un dominio extracelular del receptor P2X7 no funcional. La secuencia de P2X7 se muestra en SEQ ID NO: 1. Existe una serie de posibles estructuras artificiales que se podrían desarrollar, pero teníamos que determinar cuál de ellas sería el modelo para los epítopos conformacionales tal como se observaban en una célula cancerosa viva. En particular, necesitábamos una diana que pudiera unirse con una fase sólida para experimentos posteriores de maduración por afinidad.

Comenzamos con ECD1 que tiene la estructura 47-332 porque constituye todos los aminoácidos que forman el dominio extracelular entre los dominios transmembranales TM1 y TM2, incluyendo el supuesto segmento intramembranoso en el extremo C-terminal del segmento 325-332. Al incluir todos los residuos, se consideró probable que se conservara la estructura alrededor de la diana E200.

Materiales y métodos: ECD1 se construyó de forma recombinante usando procedimientos estándar de biología molecular y se expresó en células de E. coli como una proteína soluble y se formateó como ECD-Fc y en pDisplay para inmunofluorescencia, transferencia Western y citometría de flujo. La estructura pDisplay tenía la forma que se muestra en el esquema de la Figura 13.

Resultados: La expresión en la superficie celular de P2X7 en forma de tipo silvestre (WT) y en dos formas mutantes de longitud completa no funcionales (R307Q y E496A), se comparó junto con el ECD1 en células HEK293E y se midió con transferencia Western. Los lisados celulares y la expresión en la superficie celular se compararon en las tres formas y se añadió el marcador al ECD1. Se utilizó anticadherina como control de estandarización. Las células se biotinilaron con sulfo-NHS-SS-biotina, la reacción se extinguió y la lisis se realizó con un detergente suave. En esa etapa se conservaba una parte alícuota para indicar la proteína celular total.

La proteína biotinilada se capturó con resina de neutravidina que se lavó y eluyó con DTT 50 mM. El material sobrenadante se conservó para una indicación del conjunto intracelular de proteína específica. A continuación, las muestras se analizaron en SDS PAGE reductor convencional/transferencias Western (Figura 14).

La expresión en la superficie celular indica una reducción en los niveles de mutantes no funcionales en comparación con WT en la superficie celular. La expresión de ECD1 a partir de pDisplay expresado, es alta de forma eficaz. Esta forma de la proteína está marcada con anticuerpos para la forma no funcional del receptor, la forma específica de un tumor, y por lo tanto puede considerarse una posible forma representativa del tumor. Los monocitos, por el contrario, que expresan la forma WT, no se pudieron unir a los dAbs. La eficacia de la unión de los dabs con pDisplayECD1 era inferior que los niveles de expresión indicados si hubiera sido el caso. Eso indica que el epítopo diana está impedido estéricamente para la unión a células vivas y que la estructura de ECD1 es subóptima.

Conclusión: Si bien la estructura artificial ECD1 se unía a los dAbs iniciales, indicando la unión a un epítopo conformacional, la unión era subóptima, lo que planteaba la cuestión de si esa estructura artificial era útil para los estudios de maduración por afinidad.

Ejemplo 4: Determinación de una estructura artificial adicional para la maduración por afinidad de los dAbs iniciales

Objetivo: Producir una estructura artificial que se pueda usar en estudios de maduración por afinidad.

Antecedentes: El Ejemplo 3 ha revelado que ciertas isoformas de ECD podrían no reproducir los epítopos conformacionales de P2X7, tal y como se observa en los tumores vivos. Decidimos buscar una estructura artificial adicional en forma de la estructura 47-306 (ECD2).

Materiales y métodos: ECD2 se construyó de forma recombinante como en el Ejemplo 3, en forma soluble, formato Fc y como pDisplay para la inmunofluorescencia, transferencia Western y citometría de flujo.

Resultados: La expresión de ECD2 como una estructura artificial de Fc se muestra en la Figura 15. Una SDS-PAGE reductora con fracciones de Proteína A se muestra en dos formas: forma WT (funcional) y mutante K193A (no funcional). Se identificaron dAbs que se unían a la estructura artificial ECD2. NB es una parte alícuota del material sobrenadante que representa la proteína no unida a la Proteína A.

Las especies de dAb-Fc, PEP2-4 y PEP2-5, junto con el control dAb HEL4, se analizaron en geles no reducidos y en geles reducidos y las transferencias Westerns correspondientes se analizaron en las fracciones que se revelaron con anticuerpo anti-P2X7 (Figura 16). Tanto la expresión de dAb-Fc como la de ECD2-Fc es clara. Los geles reducidos muestran un marcador específico en ECD2Fc del anticuerpo anti-P2X7 en 62 kDa, con un fragmento proteolítico de menor peso molecular (cadena única) en 31 kDa. La transferencia Western correspondiente muestra reactividad con ambas bandas de ECD2 pero ninguna con HEL4Fc, PEP2-4Fc o PEP2-5Fc.

Se mejoró claramente la unión mediante citometría de flujo a las células HEK293E vivas que expresaban pDisplay-ECD2 (Figura 17). Una activación de la unión de las células vivas con HEL4 como ligando de control negativo, mostraba claras mejoras con un mayor porcentaje de células positivas detectadas con dAbs iniciales, lo que indicaba que el epítopo diana estaba menos impedido estéricamente y estaba disponible para la unión (Figura 18).

Conclusión: Se han identificado sitios de unión a antígeno que se unen al receptor P2X7 no funcional en células vivas y ECD2. La eliminación de los residuos 307-332, comenzando aproximadamente a 3 nm desde el sitio del epítopo E200, ha mejorado la unión con una eliminación del impedimento estérico parcial. No se produce una pérdida de conformación de E200 aunque se habría esperado que el segmento 307-332 estabilice el plegamiento de la proteína ya que interacciona estrechamente con el segmento N-terminal.

Ejemplo 5 - Generación de diversos ligandos de alta afinidad.

Objetivo: Generar sitios de unión a antígeno con alta afinidad hacia el receptor P2X7 no funcional.

Antecedentes: Los sitios de unión a antígeno del Ejemplo 1 que tienen las siguientes secuencias:

se usaron como puntos de partida para ciclos iterativos de aleatorización y selección sujetos a problemas de unión en el formato Fc, solubilidad y posesión de una traza de disociación monofásica en Biacore. PEP2-2 y PEP2-47 poseían las características requeridas y se seleccionaron para la maduración por afinidad, aunque sorprendentemente tenían una afinidad de dominio único más baja hacia las dianas conformacionales de ECD2 y peptídicas de E200 que otros dAbs iniciales, tales como PEP2-4 y PEP2-5.

Materiales y métodos: Los dominios V^h seleccionados que incluían 2-2, 2-47 y descendientes madurados por afinidad a través de 6 ciclos de diversificación de secuencias que incluían todas las CDRs, así como todas las regiones estructurales a través de una diversificación NNS que tomó muestras de los 20 aminoácidos en cada posición. El armazón del banco de V^h originado a partir del V^h humano que daba lugar al contro1HEL4 no ligando y a los diversos ligandos positivos, tiene la secuencia:

VHD EVQLLEPGGGLVQPGGSLRLSCAASGVNVSHDSMTWVRQAPGKGLEWVSAIRGPNGSTYYADSVKGRFTISR

DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGARHADTERPPSQQTMPFWGQGTLVTVSS

Se generaron bancos propensos a errores con una tasa de error de 2,7 aminoácidos. Los conjuntos de clones se seleccionaron inicialmente frente a E200 y luego frente a ECD2 mediante ELISA en fagos en busca de una afinidad de la unión incrementada. Se subclonaron ocho bancos propensos a error en el vector de expresión de dAb soluble, pDOM38, sin marcador. Se realizó una selección pasiva hasta el Ciclo 3. Con Biacore se seleccionó un total de 1000 clones a partir de los bancos del Ciclo 5, PEP2-42, PEP2 agrupado y el banco del Ciclo 4 PEP2 agrupado. El grupo de clones representa los clones 2-1,2-2, 2-11,2-13, 2-30, 2-34, 2-42 y 2-47 de PEP2. Se observaron mejoras en la tasa de disociación con Biacore. El examen con ELISA frente a E200 biotinilado 1 nM mostraba una mejora de la CE50 desde el intervalo de 107 a 106 ug/mL en el Ciclo 3, hasta 104 ug/mL en el Ciclo 5, muy por encima de los dAbs de control.

En la Figura 19 se muestra el rastreo con Biacore de los clones PEP2-42 seleccionados para el péptido E200. El clon original y los dabs de control de HEL4 se encuentran en la parte inferior de la figura. Las variaciones de la secuencia de los clones seleccionados se muestran en la siguiente figura. De los 32 clones que se muestran, todos tienen tasas de disociación mejoradas. Las curvas de las tasas de disociación se dividieron en dos familias y los clones se seleccionaron en consecuencia (Figura 20) con E/F (azul a la izquierda) que representaba una curva clásica de la tasa de disociación y G/H (rojo a la izquierda) un tipo bifásico irregular. Los valores de K^d son 76 nM para el clon 6 y 200 nM para el clon 7.

La determinación de las características bioquímicas y/o biofísicas de los sitios de unión a antígeno, se obtuvo mediante SEC-MALLS. Se seleccionaron aquellos con características de solución monomérica sobre aquellos con propensión a agregarse. Generalmente se encontraron clones con una solubilidad en PBS >10 mg/mL.

Para refinar la unión al antígeno, se usó una exploración NNS, en particular de parte de la región CDR3 variable, pero extendiéndose a residuos decisivos en F4, tales como los residuos 103-105.

Resultados:

El árbol de las familias de maduración por afinidad de los anticuerpos se muestra en la Figura 21. Un ejemplo de unión mejorada por Biacore se muestra en la forma del clon PEP2-2-3Fc en la Figura 22. El canal se recubrió con 10 UR de péptido E200 y luego se cargó con PEP2-2-3 100 pM, 250 pM, 500 pM y 1 nM en orden ascendente en la figura. El ajuste de la curva muestra una K^d de 130 pM. El valor correspondiente para el dAb PEP2-2-3 sin formatear frente a E200 es de 7 nM, lo que muestra un aumento más moderado de la unión para los dabs de alta afinidad, cuando se formatean como dAb-Fc, en comparación con el aumento de los dabs originales, tales como PEP2-2 que aumentó de 1 uM a 300 pM.

Los valores correspondientes para la K^d cuando se medía frente a ECD2 en forma de solución o como una estructura artificial ECD-Fc, mostraban una unión significativamente menor frente al epítopo conformacional, en donde PEP2-2-3 Fc producía un valor de 1,5 nM, PEP2-2-1 de 560 pM y PEP2-472-1 de 584 pM, a modo de ejemplo.

En la siguiente tabla se muestran ejemplos de KD de PEP2-Fc obtenidos con Biacore usando E200.

El efecto de la exploración NNS en la posición 103 en PEP2-2-1 se muestra en la Figura 23. La T raza 1 es solo tampón y la Traza 5 es un ejemplo típico de unión mejorada obtenida al intercambiar el residuo Trp por Arg.

En la Figura 24 se observa la unión de clones iniciales seleccionados con células HEK293 que expresan un control de simulación (sin unión), pDisplay-ECD1 (unión moderada), pDisplay-ECD2 (unión más elevada) y control de pDisplay (sin unión).

Los clones iniciales se unen de forma específica y competitiva con el antígeno diana y se pueden anular por competición con la adición del ECD2 soluble. A modo de ejemplo, la Figura 25 muestra que PEP2-2-1 Fc 50 nM se anula por competición con 1 uM de ECD2 soluble. Un chip de SA Biacore se recubre con péptido E200-biotina. Los datos que se muestran corresponden a un canal recubierto de 20 UR con un caudal de 20 uL/min en tampón HBS-EP. El HEL 4 Fc no se une ni se ve afectado por la adición del ECD2. Se logran resultados similares de anular por competición a PEP2-2-1 Fc con E2005 uM o la estructura artificial ECD2 Fc 1 uM.

En los siguientes ejemplos se muestra la citometría de flujo de la unión de varios ligandos de antígenos dAb-Fc iniciales con células cancerosas vivas. Estas incluyen: líneas celulares PC3 de próstata (Figura 26), MDA-MB 231 de mama (Figura 27), SKOV-3 de ovario (Figura 28), 786-O de riñón (Figura 29), G361 de melanoma (Figura 30) y NCI-H596 de pulmón (Figura 31).

La falta de reactividad cruzada con los receptores P2X7 funcionales en los linfocitos y monocitos se examinó con citometría de flujo. En la Figura 32 se muestra un ejemplo en el que los dos clones de dAb Fc, PEP2-2-1 y PEP2-2-3 Fc, no mostraban unión por encima del fondo de control HEL4 Fc. Por el contrario, la unión a células cancerosas vivas como LNCap de próstata es clara (verde en la Figura 33, con el control HEL4 en rojo que no muestra unión por encima del secundario y el control positivo de HLA en azul).

Una muerte celular directa o la inhibición del crecimiento, medida usando el ensayo Cell Titer Blue, se vigiló con los clones iniciales PEP2-2-1 y PEP2-2-3, usando una variedad de líneas celulares. Durante un ciclo de crecimiento de 3 o 5 días, las células de control crecieron mientras que el crecimiento neto en presencia de 2-2-1 Fc o 2-2-3 Fc se midió como una proporción del crecimiento en presencia del control HEL4 Fc. La Figura 34 muestra el crecimiento de células PC3 progresivamente inhibido a medida que 2-2-1 o 2-2-3 se valoran hasta 40 ug/mL durante 5 días, mientras que las células de control no se ven afectadas por HEL4 Fc. La línea celular de cáncer colorrectal COLO205 muestra más sensibilidad con 2-2-1 y 2-2-3 Fc, lo que causa una inhibición significativa del crecimiento a los 3 días, mientras que a los 5 días no quedan células incluso con 2,5 ug/mL (Figura 35). De manera similar, la línea celular de melanoma A375 muestra una muerte celular significativa a los 3 días, mientras que a los 5 días no quedan células (Figura 36).

Conclusión: Los sitios de unión a antígeno que tienen alta afinidad hacia el receptor P2X7 no funcional en células vivas fueron identificados, secuenciados y biofísicamente caracterizados. Se examinaron sus efectos sobre la función celular.

Ejemplo 6 - Experimentos futuros

Objetivo: Mejorar aún más la afinidad de los dabs iniciales a través de una exploración adicional NNS dirigida de los residuos involucrados en la unión directa al antígeno y en los residuos que permiten que las CDRs se empaqueten de manera más eficaz. Mejorar la estabilidad y la solubilidad de los sitios de unión a antígeno mediante una modificación del Fc. Mejorar la eficacia de la muerte celular.

Materiales y métodos: Se realizarán técnicas convencionales para mejorar la afinidad de la unión, tales como ciclos adicionales de exploración NNS. Los clones producidos serán examinados por Biacore para encontrar aquellos con tasas de disociación mejoradas y ELISA en fagos frente a ECD2 (47-306). Se realizará un cribado adicional utilizando el ensayo CTB para identificar los clones con la combinación más eficaz para la afinidad de la unión y la capacidad de destrucción.

Resultados previstos: Se espera que se aíslen clones con constantes de unión al menos un logaritmo más bajas, que también destruyan las células cancerosas de manera más eficiente que los candidatos iniciales existentes. A modo de ejemplo, los nuevos dominios de dAbs iniciales con alta afinidad (sin formato Fc) tales como PEP2-2-12 en la Figura

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo con dominio variable único para la unión a un receptor P2X7, en donde el anticuerpo con dominio variable único tiene un sitio de unión a antígeno que está definido por la fórmula general:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en donde:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones estructurales;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en donde:

CDR1 tiene una secuencia: RNHDMG SEQ ID NO: 88;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 89;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY SEQ ID NO: 9.

2. Un anticuerpo con dominio variable único para la unión a un receptor P2X7 según la reivindicación 1, en donde FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SEQ ID NO: 139;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS SEQ ID NO: 145;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA SEQ ID NO: 148; y

FR4 tiene una secuencia: WSPGTLVTVSS SEQ ID NO: 162, WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 153, RSPGTLVTVSS SEQ ID NO: 155, PSPGTLVTVSS SEQ ID NO: 157, RSQGTLVTVSS SEQ ID NO: 158, WSQGTLVTVSS SEQ ID NO: 159, RGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 160, RFQGTLVTVSS SEQ ID NO: 161, GSPGTLVTVSS SEQ ID NO: 163, WGPGTLVTVSS SEQ ID NO: 164, RGPGTLVTVSS SEQ ID NO: 165, CGPGTLVTVSS SEQ ID NO: 166 o FSQGTLVTVSS.

3. Un anticuerpo con dominio variable único según la reivindicación 2, en donde FR4 tiene una secuencia: WSPGTLVTVSS SEQ ID NO: 162.

4. Un dominio variable de inmunoglobulina (un Fv), un Fab, un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo o un conjugado que comprende un anticuerpo con dominio variable único según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el conjugado comprende un agente citotóxico o un marcador detectable.

5. Un scFv según la reivindicación 4, en donde el scFv se proporciona en forma de una proteína de fusión.

6. Un scFv según la reivindicación 5, en donde la proteína de fusión incluye el scFv conjugado con una proteína efectora en el extremo amino o carboxi del scFv.

7. Un dominio de fusión o una proteína heteróloga que incluye un anticuerpo con dominio variable único según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo con dominio variable único según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el dominio de fusión según la reivindicación 7.

9. Una célula que expresa un ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Una célula modificada genéticamente que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8.