JP2003514528A - ペントラキシンｉおよびペントラキシン受容体、前記タンパク質の阻害剤および前記化合物を含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト・ペントラキシン受容体および関連するタンパク質をコードする核酸配列、ならびに、（ａ）ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体、（ｂ）（ａ）のタンパク質の非機能的な変異体、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質に対する抗体、（ｄ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする核酸配列、（ｅ）ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体のｍＲＮＡに対して相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡに選択的に結合でき、当該配列は、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の合成の阻害が可能であることを特徴とするアンチセンスＲＮＡ配列、あるいは（ｆ）ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体のｍＲＮＡに対して相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡに選択的に結合して、切断でき、したがって、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の合成を阻害することができることを特徴とするリボザイム、これらの治療的に有効量を含んでなる医薬組成物が記載される。さらにまた、ニューロン異常の処置、あるいは神経保護作用を提供するための、上記化合物の用途が記載される。上記化合物はまた、上記タンパク質の脱調節された発現、あるいは、全く無いかまたは少なくとも低下してい生物学的活性を有するペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受容体の存在に基づく、ニューロン異常に付随する疾患の検出にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、ヒト・ペントラキシン受容体および関連するタンパク質をコードす
る核酸配列、（ａ）ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体、（ｂ
）（ａ）のタンパク質の非機能的な変異体、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパ
ク質に対する抗体、（ｄ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする核酸配
列、（ｅ）ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体のｍＲＮＡに対
して相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡに選択的に結合でき、当該配列は、ペント
ラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の合成の阻害が可能であることを
特徴とするアンチセンスＲＮＡ配列、あるいは（ｆ）ペントラキシンＩまたはヒ
ト・ペントラキシン受容体のｍＲＮＡに対して相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡ
に選択的に結合し、切断でき、したがって、ペントラキシンＩまたはヒト・ペン
トラキシン受容体の合成を阻害することができることを特徴とするリボザイム、
それらの治療的に有効量を含んでなる医薬組成物に関する。さらにまた、本発明
は、ニューロン異常の治療、または神経保護作用の提供のための、上記化合物の
用途に関する。最後に、上記化合物は、上記タンパク質の脱調節された発現、あ
るいは、全く無いかまたは少なくとも低下している生物学的活性を有するペント
ラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受容体の存在に基づく、ニューロン異常に付
随する疾患の検出に対しても有用である。

【０００２】 ペントラキシン類は、ニューロンのペントラキシンＩ（Ｐｔｘ Ｉ）、ニュー
ロンのペントラキシンＩＩ（Ｐｔｘ ＩＩ）およびニューロンのペントラキシン
受容体（Ｐｔｘ Ｒ）、ならびに感染または外傷の発生後にその血中濃度が増大
する、免疫応答に関与しているサイトカイン誘導性の急性期タンパク質である、
血清アミロイドＰタンパク質（ＳＡＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および
ペントラキシンＩＩＩなどの他の非ニューロン性メンバーが含まれる、タンパク
質のファミリーである。ペントラキシン・ファミリーのタンパク質は、それらの
五量体複合体の形成能によって特徴付けられ、そして、細菌、トキシンおよび細
胞外破片のカルシウム依存型の取込みを媒介していることが提案されている。

【０００３】 ペントラキシンＩは、ヘビ毒液トキシンのタイポキシンに対する結合タンパク
質として同定されていた。ラットおよびヒトのペントラキシンＩのｍＲＮＡは、
大きなサイズ（５．０７ｋｂ）を有し、神経系に局在化し、細胞外への輸送用の
シグナルペプチドを含んでいる。ペントラキシンＩは、シナプス破片の除去また
はニューロン形成性において役割を果たしていることが示唆された。ラットのニ
ューロン・ペントラキシン受容体は、ヘビ・トキシンのタイポキシンおよび他の
ニューロン・ペントラキシンに対するその結合によって同定された。ラットのペ
ントラキシン受容体は、仮想的なＮ末端の膜貫通ドメインを含有しており、この
ファミリーの異なるメンバーに対する受容体として作用し得ることを示唆してい
る。ラットのペントラキシンＩＩは、ＮＡＲＰ（Ｎｅｕｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｐｅｎｅｔｒａｘｉｎ）とも称され、シナプス活性後
の海馬および皮質のニューロンにおいて迅速に誘導される即時初期の遺伝子とし
て記載されていた。ペントラキシンＩＩは、長期間の神経形成性に関連する細胞
性質を制限することにおいて役割を果たしていることが考えられる。残念ながら
、ペントラキシン・ファミリーのメンバーの正確な生理学的役割は、現在のとこ
ろ解明されていない。一方、今までのところ、発作、急性頭部外傷、多発性硬化
症および脊髄損傷などのニューロン疾患の治療、あるいは神経保護作用の提供の
ために、有用な化合物の知識は、かなり限られている。

【０００４】 したがって、本発明の基礎をなす技術的課題は、ニューロン異常に付随する疾
患の治療用、または神経保護作用の提供用の手段を提供することである。

【０００５】 上記の技術的課題に対する解決が、請求項において特徴付けられる実施態様を
提供することによって達成された。ペントラキシンＩおよびペントラキシン受容
体は、神経毒性において極めて重要な役割を果たしていること、そしてペントラ
キシンＩおよびペントラキシン受容体の発現の抑制が、それぞれ、神経保護作用
を有することが解明される。

【０００６】 したがって、１つの形態において、本発明は、ヒト・ペントラキシン受容体ま
たは該ヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を示すタンパク質をコードし
、かつ （ａ）図１９に示されるヌクレオチド配列のコード領域を含んでなる核酸配列
、 （ｂ）（ａ）に明記される核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸配列、 （ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記される核酸配列から、遺伝暗号の縮重性に起
因して変異している核酸配列、ならびに （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に明記される核酸配列のフラグメント、誘導体または対
立遺伝子型変異体を表す核酸配列 からなる群から選択される核酸配列に関する。

【０００７】 本明細書中で使用される際には、ヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質
を示すタンパク質は、下記の実施例に例示されているように、ヒト・ペントラキ
シン受容体の活性の少なくとも１つを有するタンパク質であると理解される。

【０００８】 第１の実施態様において、本発明は、図１９に示されるヌクレオチド配列のコ
ード領域を含んでなる、ヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列を提
供する。

【０００９】 本発明は、図１９に示される核酸配列だけでなく、ヒト・ペントラキシン受容
体のｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡの一例をも提供する。寄託されたクローン
のヌクレオチド配列は、既知の方法に従って、寄託クローンの配列を決定するこ
とによって、容易に決定できる。その後、予想されるアミノ酸配列は、かかる寄
託物から確認することができる。さらに、寄託されたクローンによってコードさ
れるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチドの配列決定によって、あるいは
、寄託されたヒト・ペントラキシン受容体をコードするｃＤＮＡを含む好適な宿
主細胞において、該タンパク質を発現させ、タンパク質を回収して、その配列を
決定することによって、直接的に決定することができる。

【００１０】 本発明の核酸配列は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方で有り得る。適合す
るＤＮＡ分子は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ分子である。それらがヒト・ペ
ントラキシン受容体の活性を具えるポリペプチドをコードする限り、ヒト・ペン
トラキシン受容体の全体または一部をコードしている、全ての核酸分子もまた、
含まれることが理解される。本発明の核酸配列は、天然の供給源から単離するこ
とができ、または既知の方法に従って合成することができる。

【００１１】 本発明はまた、上記の核酸配列に対してハイブリダイゼーションする核酸配列
をも提供する。本明細書中で使用される際、用語「ハイブリダイゼーションする
」は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは、例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ 他、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版（１９８９年）、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹの中に記載されるように、厳格な条件下で、ハイブリダイ
ゼーションするという意味を有する。また、より低い厳格なハイブリダイゼーシ
ョン条件において、ヒト・ペントラキシン受容体の核酸配列とハイブリダイゼー
ションする核酸配列も包含される。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出
の厳格さの変化は、ホルムアミド濃度（より低いパーセントのホルムアミドは、
より低下した厳格さがもたす）；塩状態、あるいは温度の操作を介して、主とし
て達成される。例えば、より低い厳格さの条件には、６× ＳＳＰＥ（２０×
ＳＳＰＥ＝ ３Ｍ ＮａＣｌ； ０．２Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄； ０．０２Ｍ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ ホルムアミド、１００ｍｇ／
ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中における３７℃での一晩のイン
キュベーション、それに続く、１× ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０
℃での数回の洗浄、が含まれる。また、さらにより低い厳格さを達成するために
、厳格なハイブリダイゼーションの後で行われる洗浄を、より大きな塩濃度（例
えば、５× ＳＳＣ）で行うことができる。上記条件の様々な変化は、ハイブリ
ダイゼーション実験において、バックグラウンドを抑えるために使用される、代
わりのブロッキング試薬を含ませる、および／または置き換えることによって達
成してもよい。特異的なブロッキング試薬の含有は、適合性に関する問題のため
に、上記に記載されるハイブリダイゼーション条件の変更を要することもある。

【００１２】 本発明の核酸配列に対してハイブリダイゼーションする核酸配列は、例えば、
ラットまたはヒトの細胞系または組織から作製された、ゲノム・ライブラリーま
たはｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。かかる核酸分子を同定お
よび単離するために、本発明の分子またはこれらの分子の一部、あるいはこれら
分子の逆方向の相補体を、例えば、従来の方法に従って、ハイブリダイゼーショ
ンによって使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）を参照
のこと）。ハイブリダイゼーション・プローブとして、例えば、図１９に示され
るヌクレオチド配列またはこれらの配列の一部を、正確にあるいは基本的に有す
る核酸分子を使用することができる。ハイブリダイゼーション・プローブとして
使用されるフラグメントは、通常の合成方法で作製され、また、その配列は、基
本的には、本発明の核酸分子の配列に対応している、合成フラグメントであり得
る。

【００１３】 本発明の核酸配列にはまた、遺伝暗号の結果として、縮重している配列を有す
る分子が含まれる。

【００１４】 さらなる実施態様において、本発明は、本発明のタンパク質をコードする上記
の核酸配列のフラグメント、誘導体ならびに対立遺伝子変異体を含む核酸配列を
提供する。「フラグメント」は、記載されたタンパク質の１つをコードするのに
十分に長い核酸配列の一部であることが理解される。用語「誘導体」は、この関
係においては、それらの分子の配列は、上記の核酸配列の配列とは、１つまたは
いくつかの位置で異なるものの、これらの配列に対して、高レベルの相同性を有
していることを意味する。相同性は、これにより、少なくとも４０％の配列同一
性、特には、少なくとも６０％の、好ましくは８０％を超える、特に好ましくは
９０％を超える同一性を意味する。該核酸配列によってコードされる、これらの
タンパク質は、図１９に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に
対して、少なくとも８０％の、好ましくは８５％の、特に好ましくは９０％、９
５％、９７％そして９９％を超える、配列同一性を有している。上に記載される
核酸配列に対する偏移は、欠失、置換、挿入または組換えによって生じさせられ
ていてもよい。

【００１５】 上記に記載される配列に対して相同的であり、かつこれらの配列の誘導体を表
している該核酸配列は、通常、同じ生物学的機能を有する様々な改変を表してい
る、これらの配列の変異である。それらは、天然に存在する変動（例えば、他の
生物に由来する配列）、あるいは天然でも起こりえる、または特異的な変異誘発
により導入されている変異であってもよい。さらに、該変異は、合成的に作製さ
れた配列であってもよい。対立遺伝子変異体は、天然に存在する変異体、あるい
は、合成的に作製された変異体または組換えＤＮＡ法で作製された変異体のいず
れかであってもよい。

【００１６】 一般に、従来の分子生物学的プロセスによって、種々の変異を本発明の核酸配
列に導入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他（上記）を参照のこ
と）。その結果、ヒト・ペントラキシン受容体タンパク質、またはおそらく改善
された生物学的性質を有する関連するタンパク質が合成される。１つの可能性は
、核酸分子がコードＤＮＡ配列の５’末端または３’末端からの連続的な欠失に
よって作製され、そして、従って短縮されているタンパク質の合成につながる、
欠失変異体の作成である。別の可能性は、そこにおける、アミノ酸配列の改変が
、例えば、酵素活性または酵素の調節に影響を及ぼす、位置における個別的点変
異の導入である。この方法により、例えば、変化されたＫ_m値を有する、あるい
は、例えば、アロステリック制御または共有結合的な修飾に関して、細胞内で通
常存在している調節機構にもはや依存しない、ムテインを作成することができる
。かかるムテインはまた、ヒト・ペントラキシン受容体の治療的に有用なアンタ
ゴニストとして、価値があるかもしれない。

【００１７】 遺伝子工学によった、原核生物細胞における遺伝子操作のため、本発明の核酸
配列またはこれらの配列の一部は、ＤＮＡ配列の組換えによる、配列の変異誘発
または改変を可能とするプラスミドに導入することができる。従来の方法（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他（上記）を参照のこと）によって、塩基を変換するこ
とができ、また、天然のまたは合成された配列を付加することもできる。ＤＮＡ
フラグメントを互いに連結するために、アダプターまたはリンカーをフラグメン
トに付加することができる。さらに、適当な切断部位を用意する、あるいは不必
要なＤＮＡまたは切断部位を除く遺伝子操作を行うことができる。挿入、欠失ま
たは置換が可能である際には、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限酵素
切断または連結を行うことができる。分析方法として、通常、配列分析、制限分
析ならびに他の生化学的または分子生物学的方法が使用される。

【００１８】 本発明の核酸配列の様々な変異体によってコードされるタンパク質は、酵素活
性、分子量、免疫学的反応性、ないしは立体配座あるいは電気泳動移動度、クロ
マトグラフィー挙動、沈降係数、溶解度、分光学的性質、安定性、至適ｐＨおよ
び至適温度などの物理的性質等の、ある程度の共通した特徴を示す。

【００１９】 本発明はさらに、本発明の核酸配列を含むベクターに関する。好ましくは、そ
れらは、遺伝子工学の分野で通常的に使用されている、プラスミド、コスミド、
ウイルス、バクテリオファージならびに他のベクターである。本発明における用
途に適合するベクターには、これらに限定されないものの、細菌における発現用
のＴ７系発現ベクター、哺乳動物における発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター、
および昆虫細胞における発現用のバキュロウイルス由来ベクターが含まれる。好
ましくは、本発明の核酸配列は、原核生物および／または真核生物細胞中におい
て、翻訳ができるＲＮＡの転写および合成を保証する、本発明の組換えベクター
内の調節エレメントと機能的に連結される。転写すべきヌクレオチド配列は、Ｔ
７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリン・プロモーターのようなプロモータ
ーと機能的に連結することができる。

【００２０】 さらなる実施態様において、本発明は、本発明の核酸配列またはベクターを一
時的または安定的に含有している組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、インビ
トロの組換えＤＮＡを取り込む、そして、場合によっては、本発明の核酸分子に
よりコードされるタンパク質を合成することのできる生物であることが理解され
る。好ましくは、これら細胞は、原核生物または真核生物細胞であり、例えば、
哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である。本発明の宿主細胞は
、好ましくは、導入された本発明の核酸配列は、形質転換細胞に関して異種であ
る、すなわち、これらの細胞において天然に存在しない、あるいは、ゲノム中で
、対応する天然に存在する配列とは相違している部位に配置されているかのいず
れかという事実によって特徴付けられる。

【００２１】 本発明のさらなる実施態様は、ヒト・ペントラキシン受容体、あるいはヒト・
ペントラキシン受容体の生物学的性質を示し、かつ本発明の核酸配列によってコ
ードされているタンパク質、ならびに、例えば、本発明の宿主細胞を、タンパク
質の合成を可能にする条件下で培養し、そして、続いて培養された細胞および／
または培養培地からタンパク質を単離することによる、それらの製造方法に関す
る。組換え的に製造されたタンパク質の単離または精製は、製造用クロマトグラ
フィー、ならびにモノクローナルまたはポリクローナル抗体、例えば、下で、実
施例に記載する抗体を用いるアフィニティー・クロマトグラフィーを包含するア
フィニティーおよび免疫学的分離を含む、常用の手段によって行うことができる
。

【００２２】 本発明のタンパク質には、組換え的に製造されたタンパク質が含まれるだけで
なく、単離された天然産のタンパク質、合成的に作製されたタンパク質、あるい
はこれらの方法を組み合せて製造されたタンパク質も含まれる。かかるタンパク
質を調製する手段は、この分野では十分に知られている。

【００２３】 さらなる形態において、本発明は、次の化合物： （ａ）ペントラキシンＩまたは本発明の核酸配列によってコードされているタ
ンパク質； （ｂ）（ａ）のタンパク質の非機能的な変異体；、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質に対する抗体； （ｄ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする核酸配列； の少なくとも１つの治療的に有効量を、 場合によっては、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せて、 含んでなる医薬組成物に関する。

【００２４】 本明細書中で使用する際、用語「ペントラキシンＩ」は、Ｐｅｒｉｎ 他、Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ、 ３６、 １９９６、 ５４３〜５４５に記載されるようなヌ
クレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋデータベース・アクセション番号Ｕ６１８４９
の配列、または図１７に示されるヌクレオチド配列によってコードされているタ
ンパク質またはポリペプチドを示し、実質的にその活性に影響を及ぼさない変異
または欠失を含んでいるペントラキシンＩ変異体をも含まれる。かかる変異には
、特にはそのホモログによる、１つまたは複数のアミノ酸の置換、ならびに、特
にはＮまたはＣ末端における、１つまたは複数のアミノ酸の付加が含まれる。欠
失には、ＮまたはＣ末端からの欠失が含まれる。天然に存在する、ならびに合成
されたアミノ酸の双方による置換が可能である。化学的な修飾または酵素的修飾
によって修飾がなされたペントラキシンＩ変異体もまた、この定義に含まれる。
さらに、ペントラキシンＩのフラグメントは、化学的に合成された、または生物
学的な方法で生産された、また、改変されたまたは非改変である、そのいずれで
も、用語「ペントラキシンＩ」の定義中に包含される。

【００２５】 本明細書中で使用する際、用語「（ａ）のタンパク質の非機能的な変異体」は
、生物学的活性の実質的な喪失または生物学的活性の完全な喪失を示す、ペント
ラキシンＩ変異体またはヒト・ペントラキシン受容体変異体を指す。かかる変異
体は、ヒト・ペントラキシン受容体に対して、または用語「ペントラキシンＩ」
の定義に関して、上に記載したような、改変を含んでいてもよいが、ただし、こ
れらの改変は、「非機能的な」ペントラキシンＩおよびヒト・ペントラキシン受
容体の創製を起こす。かかる変異体は、天然タンパク質のアンタゴニストとして
、有用となるかのもしれない。

【００２６】 本明細書中で使用する際、用語「（ａ）または（ｂ）のタンパク質に対する抗
体」は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関し、好ましくは、種々の
エピトープ特異性を有する、プールされたモノクローナル抗体から本質的になる
抗体、ならびに個別のモノクローナル抗体調製物に関する。モノクローナル抗体
は、ペントラキシンＩ、ヒト・ペントラキシン受容体または上記するその変異体
のフラグメントを含む抗原から、当業者に周知の方法で作製される（例えば、Ｋ
ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、 Ｎａｔｕｒｅ ２５５６、 １９７５、
４９５〜４９７を参照のこと）。本明細書中で使用する際、用語「抗体」（Ａ
ｂ）または用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、完全な分子、ならびにタ
ンパク質と特異的に結合することができる、（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’
）２フラグメントなどの）抗体フラグメントを含んでいることを意味する。Ｆａ
ｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠い
ており、血流からより迅速に排除され、そして完全な抗体よりも小さい非特異的
な組織結合性を有してもよい。したがって、これらのフラグメントは、Ｆａｂま
たは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に好ましい。さらには、
本発明の抗体には、キメラ、単鎖のならびにヒト化抗体が含まれる。

【００２７】 本明細書中で使用する際、用語「（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードす
る核酸配列」は、ペントラキシンＩに関しては、Ｐｅｒｉｎ 他（上記）により
記載されるヌクレオチド配列、アクセション番号Ｕ６１８４９のＧｅｎＢａｎｋ
登録の配列、または図２０に示されるヌクレオチド配列を、また、ヒト・ペント
ラキシン受容体に関しては、上記の本発明の核酸配列、例えば、図１９に示され
る核酸配列を示す。これらの核酸配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方であり
得る。適切なＤＮＡ分子は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ分子である。ペント
ラキシンＩの全体または一部をコードする核酸配列は、ヒト・ペントラキシン受
容体をコードする核酸配列に対して定義されているような配列、例えば、ハイブ
リダイゼーションする配列、フラグメント、誘導体、対立遺伝子変異体なども、
さらに包含することが理解される。最後に、上記の定義にはまた、非機能的なペ
ントラキシンＩ変異体あるいは非機能的なヒト・ペントラキシン受容体変異体を
コードする核酸配列が含まれ、これらは、例えば、生物学的に活性な天然タンパ
ク質をコードする遺伝子を「ノック・アウト」するために有用である。

【００２８】 さらなる好ましい実施態様において、本発明は、 （ａ）ペントラキシンＩをコードする遺伝子、あるいは、ヒト・ペントラキシン
受容体またはヒト・ペントラキシン受容体の生物学的活性を示すタンパク質をコ
ードする本発明の核酸配列から転写されるｍＲＮＡ、ないしはそれらの一部に対
して相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合することが
でき、当該配列は、ペントラキシンＩ、あるいはヒト・ペントラキシン受容体ま
たはヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を有するタンパク質の合成を阻
害することができることを特徴とするアンチセンスＲＮＡ配列、あるいは、 （ｂ）ペントラキシンＩをコードする遺伝子、あるいはヒト・ペントラキシン受
容体またはヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を示すタンパク質をコー
ドする本発明の核酸配列から転写されるｍＲＮＡ、ないしはそれらの一部に対し
て相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合し、切断でき
、したがって、ペントラキシンＩ、あるいはヒト・ペントラキシン受容体または
ヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を有するタンパク質の合成を阻害す
ることができることを特徴とするリボザイム を含んでなる医薬組成物に関する。

【００２９】 １つのＲＮＡ鎖から構成されるリボザイムは、標的ＲＮＡ、例えば、ペントラ
キシンＩ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分子間的に切断することができる、Ｒ
ＮＡ酵素、すなわち、触媒活性なＲＮＡである。現在では、文献に記載された戦
略に従って、標的ＲＮＡを特異的な部位で切断することが可能なリボザイムを構
築することも可能である（例えば、Ｔａｎｎｅｒ他、 Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ．、 １９９３、 ４１５〜４２６を参照のこと）。かかるリボザイムに
対する、二つの主要な必要条件は、触媒活性なドメインと、標的ＲＮＡに対して
相補的であり、かつ、切断の前提条件となる、その基質にそれらを結合させるこ
とを可能とする領域とである。前記相補的な配列、すなわち、アンチセンスＲＮ
Ａまたはリボザイムは、ペントラキシンＩ発現を抑制し、例えば、神経保護作用
を提供するために、有用である。好ましくは、本発明のアンチセンスＲＮＡおよ
びリボザイムは、ペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受容体のｍＲＮＡの
コード領域に対して、例えば、該コード領域の５’部分に対して相補的である。
ペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列を提供さ
れた、当業者は、上記のアンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを作製し、利用す
ることができる立場となる。それぞれ、ペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシ
ン受容体のｍＲＮＡに対して相補性を示す、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイ
ムの領域は、好ましくは、少なくとも、特には、少なくとも２５塩基長を有し、
そして、特に好ましいのは、少なくとも５０塩基長さである。

【００３０】 さらにまた、さらなる実施態様において、本発明は、上記のアンチセンスＲＮ
Ａまたはリボザイムと類似する目的、すなわち、生物学的に活性なペントラキシ
ンＩ分子またはヒト・ペントラキシン受容体分子の低下または除去を実現する、
阻害剤に関する。かかる阻害剤は、例えば、アンタゴニストとして作用する天然
タンパク質の構造的アナログであってもよい。加えて、かかる阻害剤には、組換
え的に製造されたペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体を利用し
て、同定された分子が含まれ、例えば、組換え的に製造された該タンパク質は、
例えば、適切な条件下で該タンパク質と結合できる、潜在的な阻害剤の能力を発
掘することによって、阻害剤をスクリーニングし、同定するために使用すること
ができる。該阻害剤は、例えば、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン
受容体を、本来の立体配座の状態とすることができる、適当な条件下において、
阻害剤候補がペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体とともにイン
キュベーションされる、試験混合物を調製することによって、同定することがで
きる。かかるインビトロの試験系は、この分野で周知の方法に従って確立するこ
とができる。阻害剤は、例えば、組換え的に製造されたタンパク質と結合する、
合成または天然産の分子のいずれかに対する一次スクリーニング、および、その
後、二次ステップにおいて、下で、実施例に記載されているように当該タンパク
質の生物学的活性の少なくとも１つの阻害によって引き起こされるような、ペン
トラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の阻害について、それら選択さ
れた分子の細胞アッセイにおける試験によって、同定することができる。ペント
ラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体と結合する分子に対する、かかる
スクリーニングは、例えば、合成および／または天然の分子のライブラリーから
候補分子をスクリーニングすることによって、容易に大きなスケールで実施する
ことも可能である。かかる阻害剤は、例えば、合成された有機化学物質、天然の
発酵産物、微生物、植物または動物から抽出された物質、あるいはペプチドであ
る。

【００３１】 別の好ましい実施態様において、本発明は、ニューロン異常に付随する疾患の
予防あるいは治療または改善用の、あるいは、神経保護作用を提供するための、
医薬組成物の調製のための、上に開示された化合物のいずれかの使用に関する。
かかる疾患の例は、発作（脳虚血）、急性頭部外傷、多発性硬化症、脊髄損傷お
よびアルツハイマー病である。さらに、上記の化合物は、プロ−アポトーシス・
タンパク質として使用することができる。特には、ペントラキシンＩの過剰発現
またはアップレギュレーションにより、脳腫瘍を治療することができる。

【００３２】 投与に際し、上記の化合物は、好ましくは、適合する製薬学的キャリアと配合
される。適合する薬学的キャリアの例は、この分野では周知であり、そして、リ
ン酸塩緩衝化生理食塩水、水、オイル／水エマルションなどのエマルション、様
々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。かかるキャリアは、従来の方
法で調剤することができ、そして対象に適正な用量で投与することができる。適
切な組成物の投与は、種々の方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局
所または皮内投与によってなすことができる。当然のことではあるが、投与経路
は、疾患の性質および医薬組成物に含有される化合物の種類に依存する。投薬法
は、主治医ならびに他の臨床的要因によって決定される。医学分野では周知であ
るが、患者に対する投薬量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される
特定の化合物、投与時間および経路、全身的な健康状態、ならびに同時に投与さ
れている他の薬物を含む、多くの要因に依存する。

【００３３】 上記に核酸配列、すなわち、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの送達は、
直接的な適用、あるいは、好ましくは、これらの化合物を含んでいるキメラウイ
ルスなどの組換え発現ベクター、またはコロイド分散システムの使用によって、
達成することができる。これらの核酸を所望する標的へ送達することによって、
例えば、ペントラキシンＩの細胞内での発現、そして、その結果、ペントラキシ
ンＩのレベルを低下させることができ、上で説明したペントラキシンＩの好まし
くない作用の阻害がなされる。上記の核酸は、例えば、弾道学的送達によって、
コロイド分散システムとして、あるいは、動脈内の部位にカテーテルによって、
標的部位に直接投与することができる。上記の核酸の送達に使用可能な、コロイ
ド分散システムには、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ
ならびに、水中油型エマルション、（混合型）ミセル、リポソームおよびリポ複
合体を含む脂質系システムが含まれる。好ましいコロイドシステムは、リポソー
ムである。該リポソームの構成は、通常、リン脂質と、ステロイド、特に、コレ
ステロールとの組み合わせである。当業者は、所望する核酸分子の送達に適合す
るように、リポソームを選択することができる。器官特異的な、あるいは細胞特
異的なリポソームを、所望する部位のみへの送達を達成するために利用すること
ができる。リポソームの標的化は、当業者にとって、一般に知られている手法を
適用して、実施することができる。この標的化には、受動的標的化または能動的
標的化（例えば、周知の方法で、リポソームを特異的なリガンド、例えば、抗体
、受容体、糖、糖脂質、タンパク質などに連結することによる）が含まれる。

【００３４】 遺伝子治療に有用な、好ましい組換えベクターは、ウイルス・ベクター、例え
ば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｉ型ヘルペス単純ウイ
ルス（ＨＳＶ Ｉ）などのヘルペスウイルス、ワクシニア、あるいは、より好ま
しくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスである。さらにより好ましくは、
該レトロウイルス・ベクターは、ネズミまたはトリのレトロウイルスの誘導体で
ある。本発明において利用可能な、かかるレトロウイルス・ベクターの例には、
モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス
（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）ならびにラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）がある。最も好ましくは、ヒト以外の霊長類のレトロウイルス
・ベクター、例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）を使用すると、ネ
ズミベクターと比較してより広範囲の宿主範囲を提供する。組換えレトロウイル
スは不完全であるので、感染性粒子を産生するためには、手助けを要する。かか
る手助けを、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下に、レトロウイルスの構造遺
伝子の全てをコードしているプラスミドを含有しているヘルパー細胞株の使用に
よって、提供することができる。好適なヘルパー細胞株は、当業者には周知であ
る。前記ベクターは、付加的に、形質導入された細胞を同定することができるよ
うな、選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。さらには、レトロ
ウイルス・ベクターは、標的特異的となるようなやり方で、改変することができ
る。これは、例えば、糖、糖脂質、あるいは、タンパク質、好ましくは、抗体を
コードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成できる。当業者ならば
、標的特異的なベクターを創製するための、さらなる手法は判っている。インビ
トロまたはインビボでの遺伝子治療用の、さらなる好適なベクターおよび方法は
、文献に記載されており、また、当業者には公知となっている（例えば、国際特
許出願公開ＷＯ９４／２９４６９または同ＷＯ９７／００９５７を参照のこと）
。

【００３５】 標的の器官においてのみ発現を達成するために、例えば、アンチセンスＲＮＡ
またはリボザイムをコードする核酸配列もまた、組織特異的なプロモーターと機
能的に連結し、そして、遺伝子治療のために使用することができる。例えば、上
記の核酸配列、あるいはアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする核酸
配列を、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、ニューロン特異的
エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターおよびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡ
Ｐ）プロモーターなどの、脳特異的なプロモーターと連結することができる。他
の組織特異的なプロモーターも、当業者には周知である。

【００３６】 上に記載された化合物は、発作、急性頭部外傷、ならびに脳腫瘍、例えば、神
経膠芽細胞種などの疾患の予防、治療または改善のために、特に有用である。

【００３７】 本発明はまた、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の脱調節
された発現、あるいは、全く無いかまたは少なくとも低下している生物学的活性
を有するペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の存在に基づく、
ニューロン異常に付随する疾患を検出するための方法であって、 ペントラキシンＩ、ヒト・ペントラキシン受容体、あるいはペントラキシンＩま
たはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列を含有することが懸念さ
れる標的サンプルを、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体ある
いはペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列
と反応する試薬に接触させること、および ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体あるいはペントラキシンＩ
またはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列の異常な量または異常
な形態を検出すること を含んでなる方法に関する。該標的がｍＲＮＡである際には、試薬は、典型的に
は、核酸プローブあるいはＰＣＲ用のプライマーである。当業者は、ぞれぞれ、
図２０および図１９に示されるような、ペントラキシンＩおよびヒト・ペントラ
キシン受容体のヌクレオチド配列に関する情報、あるいは、上に開示されている
文献に基づき、好適な核酸プローブを設計することができる。該標的がタンパク
質である際には、試薬は、典型的には抗体プローブである（用語「抗体プローブ
」の定義については、用語「抗体」に対する上記の定義を参照のこと）。検出方
法には、ノーザン・ブロット分析、ＲＮａｓｅ保護、系内の手法、ＰＣＲ、ＬＣ
Ｒ、免疫アッセイ、および当業者に公知の他の検出アッセイが含まれる。プロー
ブは、例えば、放射性同位体、生物発光性化合物、化学発光性化合物、蛍光性化
合物、金属キレートまたは酵素を用いて、検出可能に標識化することができる。

【００３８】 組織内での、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の発現は、
古典的な免疫組織学的方法を用いて調べることができる。タンパク質の遺伝子発
現を検出するために有用な、抗体を基礎とする他の方法には、酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイ
が含まれる。好適な抗体アッセイ標識は、この分野では公知であり、そして、グ
ルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ならびにヨウ素（¹²⁵Ｉ、¹²¹Ｉ）、炭素
（¹⁴Ｃ）、イオウ（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉｎ）および
テクネチウム（⁹⁹ｍＴｃ）などの放射性同位体、また、フルオレセインおよびロ
ーダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。生物学的サンプル中の
タンパク質レベルをアッセイすることに加えて、ペントラキシンＩおよびヒト・
ペントラキシン受容体はまた、イメージングによって、インビボにおいて検出す
ることもできる。タンパク質のインビボ・イメージング用の抗体標識またはマー
カーには、Ｘ線撮影法、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが含まれる
。Ｘ線撮影法に対しては、好適な標識には、検出可能な放射線を放出するものの
、被験体に対して顕著には有害でないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位
体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲに対して、好適なマーカーには、関連するハ
イブリドーマ用栄養物の標識化によって、抗体内に取り込ませることもできる、
重水素などの、検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれる。適切な検出
可能なイメージング用成分、放射性同位体（例えば、¹³¹Ｉ、¹¹²Ｉｎ、⁹⁹ｍＴｃ
）、放射線不透明な物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質などで標識
されている、タンパク質特異的な抗体または抗体フラグメントが、哺乳動物に（
例えば、非経口的、皮下的または腹腔内に）導入される。対象のサイズおよび使
用されるイメージング・システムに依って、診断画像の作成に必要とされるイメ
ージング用成分の量が決定されることは、この分野では理解される。放射性同位
体成分の場合、ヒト被験体に対しては、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの⁹⁹ｍＴｃの範囲である。標識された抗体は、その後、特定の
タンパク質を含有する細胞の部位に選択的に蓄積する。ペントラキシンＩ／ヒト
・ペントラキシン受容体、あるいはペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受
容体をコードするｍＲＮＡの濃度が正常であるか、または低下しているか、また
は増加しているか、したがって、ニューロン異常に対する示唆を与えているかを
評価するためには、測定された濃度が正常な組織における濃度と比較される。さ
らなる診断方法には、タンパク質またはｍＲＮＡのサイズの測定、標準的な配列
決定方法による、ペントラキシンＩ／ヒト・ペントラキシン受容体の遺伝子のヌ
クレオチド配列の決定など、ならびに、健康な個体から得られた対応するデータ
との比較が含まれる。

【００３９】 上で論じた診断研究における用途として、キットもまた本発明により提供され
る。かかるキットは、ペントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受
容体あるいはペントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受容体をコ
ードするｍＲＮＡである、標的細胞成分を検出するために有用であり、その際、
タンパク質またはｍＲＮＡの低下した濃度または増大した濃度、あるいはタンパ
ク質または対応する核酸の異常な形態（例えば、サイズ、アミノ酸配列などに関
して）は、上に記載される異常のいずれかに対する指標となり、また、前記キッ
トは、ペントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受容体あるいはペ
ントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配
列（例えば、ｍＲＮＡ）と特異的に結合するプローブ（１つまたは複数）を含ん
でなる。該プローブは、検出可能に標識することができる。かかるプローブは、
タンパク質または対応するｍＲＮＡに対して特異的な、抗体またはオリゴヌクレ
オチドであってもよい。好ましい実施態様において、前記キットは、抗ペントラ
キシンＩ抗体および／または抗ヒト・ペントラキシン受容体抗体を含有して、Ｅ
ＬＩＳＡによる前記診断を可能にし、そしてこの分野で公知の手法を使用して、
固体支持体、例えば、ポリスチレン製マイクロ・タイター・ディッシュまたはニ
トロセルロース・ペーパーに対して結合させた抗体を含んでいる。あるいは、前
記キットは、ＲＩＡに基づき、そして、放射活性な同位体で標識された前記抗体
を含有する。本発明のキットの好ましい実施態様において、該抗体は、酵素、蛍
光性化合物、発光性化合物、強磁性プローブまたは放射能化合物で標識される。 （表の説明） 表１：ペントラキシンＩの系内ハイブリダイゼーション結果のまとめ。 中央中心溝動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後の種々の時間における、様々な脳領域におけ
るペントラキシンＩｍＲＮＡの発現：前頭皮質（左半球および右半球）、梨状皮
質（左半球および右半球）、および海馬の左半球。

【００４０】

【表１】

【００４１】 表２：ペントラキシン受容体の系内ハイブリダイゼーション結果のまとめ。 中央中心溝動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後の種々の時間における、様々な脳領域におけ
るペントラキシン受容体ｍＲＮＡの発現：前頭皮質（左半球および右半球）、梨
状皮質（左半球および右半球）、および海馬（左半球および右半球）。

【００４２】

【表２】

【００４３】 実施例１：一般的手順（インビトロ モデル） （Ａ）細胞モデル：小脳顆粒細胞培養物 顆粒細胞の一次培養物を７日齢ウイスターラットの子の小脳から調製した。切
離した細胞を、ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（１０μｇ／ｍｌ、ＭＷ＞３００
，０００、Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングされた２４ウエルプラスチックプレ
ート（２ｃｍ²）または１５０ｃｍ²フラスコに置床し、密度を約４×１０⁵細胞
／ｃｍ²になるように調節した。細胞を、下記の添加物を含むイーグル基本培地
で培養した：１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン
、０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２５ｍＭのＫＣｌ。非ニューロン細
胞の複製を、置床した１８時間後〜２４時間後にシトシンアラビノシド（１０μ
Ｍ）を加えることによって妨げた。培養物を、水蒸気を飽和させ、５％ＣＯ₂を
含む大気下、３７℃でインキュベーションした。８日間培養した後、この細胞を
上記に記載される実験のために使用した。

【００４４】 （Ｂ）培養物の処置 （Ｉ）カリウム欠乏により引き起こされるニューロンの死 最初の８日間、ニューロンを標準的な培地で維持し、その後、この培地を無血
清の標準的な培地と交換した。ニューロンを２回洗浄し、ＫＣｌが５ｍＭで、無
血清の標準的な培地（低カリウム）で維持した。コントロール培養物を同じよう
に洗浄して、２５ｍＭのＫＣｌを含有する無血清のＫ２５標準的な培地で維持し
た。ＲＮＡを、カリウムを欠乏させた２時間後および４時間後に小脳顆粒細胞コ
ントロールからＲＮＡ単離の上記説明に従って単離した（図１）。

【００４５】 （ＩＩ）グルタミン酸により誘導される神経毒性 神経毒性を、８日目に、培養状態で維持された細胞において誘導した。未処理
の培養物に由来する馴化培地をその後の使用のために保存した。培養物を、マグ
ネシウムおよびグルコースを含まない改変ロック緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌ
、５．６ｍＭのＫＣｌ、２．３ｍＭのＣａＣｌ₂、８．６ｍＭのＨＥＰＥＳ、１
０μＭのグリシン、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。４０分間のプレインキュベー
ションの後、１０μＭのグリシンおよび１００μＭのグルタミン酸を含有する新
しいロック緩衝液を加え、培養物を３７℃で１時間インキュベーションした。そ
の後、培養物を１回洗浄した後、馴化培地を再び導入して、細胞をインキュベー
ターに戻した（図２）。培養物を、直ちに（１ｈサンプル）または３時間後に（
４ｈサンプル）、ＲＮＡ抽出のために処理した（ＲＮＡ単離に対する説明を参照
のこと）。同じ実験のために、他の培養条件をアッセイした：ａ）ロック緩衝液
におけるグルコース欠乏、グルタミン酸誘導なし、ｂ）グルコースが５ｍＭのロ
ック緩衝液およびグルタミン酸誘導。両方の場合に、ＲＮＡ抽出を１時間および
４時間において行った。８日目の培養物をコントロールと見なした。

【００４６】 （Ｃ）アンチセンスアッセイ ラットのペントラキシンＩに対するセンス・オリゴヌクレオチドおよびアンチ
センス・オリゴヌクレオチドの作用を小脳顆粒ニューロンにおける低カリウム誘
導の細胞死について調べた。使用されたラット・ペントラキシンＩ転写物に対す
る２１ｍｅｒのアンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびセンス・
オリゴデオキシリボヌクレオチドのホスホロチオアートアナログは下記の通りで
あった： ＰＴＸ１ＡＳ ＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧ アンチセンス
ＰＴＸ１Ｓ ＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣ センス （下線部はホスホロチオアート化ヌクレオチドを示す。） １０μＭのＯＤＮの濃度が「アンチセンス・ノック・ダウン」に最適であるこ
とが見出された。センスＯＤＮまたはアンチセンスＯＤＮのいずれかを、顆粒細
胞培養物を高カリウム培地から低カリウム培地に切り換えた直後に加えた。生存
するニューロンを、カリウム欠乏の２４時間後にフルオレセインジアセタート（
ＦＤ）およびプロピジウムヨージド（ＰＩ）の２つの蛍光色素で同時に染色する
ことによって定量した。染色された細胞を標準的な上方照明蛍光顕微鏡で調べ、
写真撮影した。ニューロン細胞の死は、下記のようにして得られた％細胞死とし
て表された：ＰＩ陽性細胞×１００／（ＰＩ陽性細胞＋ＦＤ陽性細胞）。

【００４７】 実施例２：一般的手順（インビボ モデル） （Ａ）限局性永続的虚血 限局性の永続的な発作モデルには、Ｔａｍｕｒａ他（Ｊ．Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏ
ｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ、１９８１、５３〜６０）によって記載され、Ｂｅ
ｄｅｒｓｏｎ他（Ｓｔｒｏｋｅ、１７、１９８６、４７２〜４７８；Ｓｔｒｏｋ
ｅ、１７、１９８６、１３０４〜１３０７）に従って改変されるジアテルミー閉
塞を伴う側頭下での方法に従ったラットにおける左中大脳動脈（ＭＣＡ）の閉塞
を伴う。そのような方法により、ＭＣＡ領域内に限局性の永続的な梗塞が誘導さ
れる。この梗塞は、主に皮質に限定されるが、線条体のわずかな罹患（梗塞全体
の約５％）を伴う中くらいのサイズの梗塞部（約１６０ｍｍ³の容量）をもたら
す。総頸動脈の同側側の閉塞は、梗塞の再現性を改善するために寄与する。

【００４８】 フィッシャー−３４４ラット（オス、２３０ｇ〜２６０ｇ）をナトリウムペン
トバルビトールで麻酔した。梗塞の再現性を改善するために、永続的な左総頸動
脈の閉塞を、細い縫合用絹糸を用いた二重結紮によって行った。皮膚および側頭
筋肉を、顔面神経を傷つけることなくはさみで切った。頭骨を、連続的に生理食
塩水を流しながらドリルで開け、そして遠位の左中大脳動脈を、頬骨を傷つける
ことなく経頭蓋的に露出させた。硬膜を１０／０針で破った。ＭＣＡを遠位に持
ち上げ、細い双極鉗子（６Ｗ）を使用して閉塞させた。支脈もまた閉塞させた。
その後、再開通を避けるために、動脈をミクロはさみで処理した。処理中、体温
を３７℃〜３８℃で保った。

【００４９】 脳を、２時間後、６時間後、８時間後、２４時間後、７日後、１４日後または
２１日後に摘出した。

【００５０】 ＲＮＡを（Ｂ、ＣおよびＤに報告されるアッセイのために）得るために、左半
球および右半球を液体窒素で別々に凍結し、同じことを小脳について行った。脳
は、さらに使用されるまで−８０℃で保存された。

【００５１】 系内ハイブリダイゼーション（Ｈ）のための組織を得るために、動物を０．１
Ｍリン酸塩緩衝液で灌流し、その後、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ
リン酸塩緩衝液で灌流した。脳を切離して、同じ固定液で後固定した。

【００５２】 擬手術動物および無処理動物をコントロールとして含ませた。擬処理ラットに
対する手術処置は、ＭＣＡの電気凝固を除いて、手術された動物と同じであった
。脳を２４時間後に摘出して、通常通りに処置する。 梗塞容量を測定するために、神経保護アッセイ（Ｋに報告されるアンチセンスア
ッセイ）の場合、脳をＭＣＡ閉塞の４８時間後に摘出して、一連の２ｍｍの冠状
面脳切片を作製し、１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）における１％のＴＴＣ（
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物）で染色した。

【００５３】 梗塞領域を画像分析によって定量した。

【００５４】 （Ｂ）ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成 発作モデルからのＲＮＡ単離のために、無傷ラットおよび虚血ラットに由来す
る左半球および右半球ならびに小脳を液体窒素で凍結した。各処置から得られた
３個〜５個のサンプルをプールして、ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｙ他（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１９８７、１５６〜１
５９）に従って抽出し、ＣｓＣｌグラジエント（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記）で
精製した。ｍＲＮＡを、オリゴ−ｄＴカラムを使用して精製した。細胞モデルに
由来するＲＮＡを下記のように抽出した：示された時間で培養培地をフラスコか
ら除き、細胞を、ＲＮａｓｅを含まないＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。グアニジ
ニンイソチオシアナート緩衝液をフラスコに直接加えた。穏やかに振とうした後
、そして細胞の単層が破壊されたとき、細胞懸濁物を、細胞スクラッパーで細胞
をはがしながら回収して、１５ｍｌの円錐チューブに移し、直ちに２０Ｇの針に
通して破壊した。懸濁物を５．７ＭのＣｓＣｌ溶液に重層し、そして２０℃にお
いて９１，０００ｘｇで２０時間遠心分離して、ＲＮＡを沈澱させた。ｃＤＮＡ
合成を、１μｇのｍＲＮＡおよび１ｍＭの適切なオリゴヌクレオチドを用いて、
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから得られる「Ｙｏｕ
−ｐｒｉｍｅ ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ」キットを使用して行っ
た。ＲＮＡの操作を伴うすべてのステップは、一般的なプロトコル（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ他、上記）に従ってＤＥＰＣ処理した材料および溶液を用いて行った。

【００５５】 （Ｃ）ディファレンシャル・ディスプレイ 発作モデルに由来するＲＮＡ（擬処置、左半球からの２時間および６時間）、
ならびに血清およびカリウムが欠乏したもとでの顆粒細胞に由来するＲＮＡ（コ
ントロール、２時間および４時間）を「ディファレンシャル・ディスプレイ」（
ＤＤ）実験において使用した。使用した方法は最初に記載されたものであった（
ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、１９９２、９６７〜
９７１）。ｓｓｃＤＮＡ合成のために使用された１２個のオリゴヌクレオチドは
（ｄＴ）₁₁ＶＮ（下流オリゴヌクレオチド）であった。ｓｓｃＤＮＡの増幅を、
同じ３’オリゴヌクレオチドと別の１０ｍｅｒの任意の５’オリゴヌクレオチド
（上流オリゴヌクレオチド）とを用いて行った。ＰＣＲ増幅産物をＧｅｎｏｍｙ
ｘのＬＲ装置において変性６％ポリアクリルアミドゲル（Ｇｅｎｏｍｙｘ）で分
析した。ゲルを８００Ｖで１６時間泳動した。ＤＮＡを銀染色により可視化して
、乾燥した（図３）。示差的に調節されている遺伝子に対応するＤＮＡバンドを
ゲルから切り出した。ＤＮＡを、１０μｌのＨ₂Ｏに−２０℃で２時間浸漬する
ことによってゲルから溶出し、そして同じオリゴヌクレオチド対および同じＰＣ
Ｒ条件を使用して再度増幅した。得られたバンドを「ｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙ」
ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に直接クローン化して、３個の陽性クローンを配列
決定した（Ｐｒｏｍｅｇａから得られる銀配列システム）、３個のクローンが同
じ配列を有した場合、それらはゲルから選択されたバンドに対応し、１つだけが
存在すると考えられた。配列をゲノムデータベースと比較した。得られたバンド
の確認をリバースノーザンによって最初に行った。陽性バンドをノーザンおよび
／または半定量的ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲによってさらに分析した。

【００５６】 （Ｄ）リバース・ノーザン・ブロットおよびノーザン・ブロット ＤＤからの選択されたバンドを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロ
ンメンブランに移した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、上記）。メンブランを、シグナル
のコントロールとしてアクチンを使用し、ＤＤ実験において使用された各モデル
について、³²Ｐで標識された適切なｄｓｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ
た。各ハイブリダイゼーション実験に由来するバンドをアクチンに対して参照し
、対応するバンドと比較した。ノーザン・ブロットを、発作モデルに由来するｍ
ＲＮＡサンプル（無傷ラットおよび擬処置ラットならびに２時間、６時間、８時
間、２４時間、７日間、１４日間および２１日間の虚血ラットに由来する左半球
および右半球および小脳）、グルタミン酸処置のもとでの細胞培養物に由来する
ｍＲＮＡサンプル、または血清およびカリウムを欠乏させた細胞に由来するｍＲ
ＮＡサンプルの５μｇを用いて行った。ラットのペントラキシンＩおよびペント
ラキシン受容体をそれぞれ放射能標識して、プローブとして使用した。サンプル
あたりのｍＲＮＡの量を、アクチンを使用して調べた。ヒト組織および切離した
脳に由来するメンブランをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ハイブリダイゼーシ
ョンを、アクチン、およびヒト・ペントラキシンＩのサブクローンを用いて行っ
た。

【００５７】 （Ｅ）クローニング手順 ペントラキシンＩ： ヒト・ペントラキシンＩを、コード領域に対応する１組の特異的なオリゴヌク
レオチドを使用してＰＣＲによってクローン化した。完全なｃＤＮＡは以前に発
表されており（マウスおよびヒトのニューロンのペントラキシンＩ（Ｐｅｒｉｎ
他、上記））、配列はＧｅｎＢａｎｋデータベース（アクセション番号Ｕ６１８
４９）において見出された。これにより、ＰＣＲクローニング用の特異的なプラ
イマーを設計することができた。Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した全脳由来のｃＤ
ＮＡだけでなく、脳皮質、海馬および小脳に由来するヒトＲＮＡサンプルを使用
した。

【００５８】 下記のプライマーを使用した： フォワード １３９／１６３ ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣ
ＣＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＣＴ ＥｃｏＲＩ部位に下線を付す。ＡＴＧ開始コドンを太字で示す。

【００５９】 ９７５／９９５ ＡＧＧＣＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡ リバース １１１０／１１２８ ＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＡ １５０８／１４７２ ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧ
ＡＣＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧ １５５５／１５２９ ＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＧ
ＧＣＣＴＣＧＧ ｍＲＮＡの長さ（約５．５ｋｂ）のために、これらのプライマーは、コード領
域（塩基１３８〜１４３１）に対してのみ設計された。数個のｃＤＮＡクローン
が得られた。これらのクローンの１つが塩基７２３〜１３２８のフラグメントを
含む（図２０）。

【００６０】 ヒト・ペントラキシン受容体： 全長をクローン化するためには、ヒト・ペントラキシン受容体のｃＤＮＡ配列
を得る必要であった。ヒト・ペントラキシン受容体のｃＤＮＡ配列を、以前に発
表されたラットのペントラキシン受容体に由来する配列（Ｄｏｄｄｓ他、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１９９７、２１４８８〜２１４９４）（アクセショ
ン番号：ＡＦ００５０９９）を使用してＥＭＢＬデータバンクに見出されるゲノ
ム配列（アクセション番号：ＨＳ３２７Ｊ１６）から推定した。相同性検索を、
公開されているデータバンクで行い、遺伝子（アクセション番号：ＡＬ００８５
８３）のコード領域に対する相同性を示す１つのゲノム配列のフラグメントがい
くつか見出された。仮想的なエキソンに対応するこれらのフラグメントは、ラッ
ト配列のコード領域との８５％の類似性を有している。これにより、ＰＣＲクロ
ーニング用の特異的なプライマーを設計することができた。ヒト脳組織およびＣ
ｌｏｎｔｅｃｈから購入した脳ｃＤＮＡを使用した。

【００６１】 下記のプライマーを使用した： フォワード １７１／１９４ ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧ
ＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧ ＥｃｏＲＩ部位に下線を付す。ＣＴＧ開始コドンを太字で示す。

【００６２】 ９５０／９７９ ＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡ
ＡＡＡＧＧＡＧＴＴ リバース １０４８／１０２５ ＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡ
ＧＧＣＴ １７５５／１７３０ ＧＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧ
ＧＡＡＴＡ １８４２／１８２２ ＴＣＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧ
Ｇ 数個のｃＤＮＡクローンが得られた。これらのクローンの１つがコード領域の
全体を含み、図１９に表されている。

【００６３】 （Ｆ）半定量的ＰＣＲ ｓｓｃＤＮＡを、（ｄＡ）₁₂Ａ、（ｄＴ）₁₂Ｃおよび（ｄＴ）₁₂Ｇの混合物、
発作モデルに由来するｍＲＮＡサンプル（無傷ラットおよび擬処置ラットならび
に２時間、８時間および２４時間の虚血ラットに由来する左半球および右半球）
およびグルタミン酸処置のもとでの顆粒細胞培養物に由来するｍＲＮＡサンプル
の各１μＭを使用して合成した。ＰＣＲ増幅のために、ラット・ペントラキシン
Ｉ（フォワード１３９０／１４１０：ＡＧＧＣＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴ
ＣＡ；リバース１７９５／１７７７：ＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＡ
）、ラット・ペントラキシン受容体（フォワード９５０／９７９：ＣＣＧＧＣＡ
ＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴ；リバース１５７４／１５
４９：ＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧ）、および内部
コントロールとしてのアクチン（フォワード：ＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴ
ＣＧＴＣＧＴ；およびリバース：ＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣ）
を使用した。フォワードプライマーをビオチン−ＵＴＰで標識した。遺伝子増幅
の指数関数期を決定するために、サンプルを１５回〜３０回の各サイクルから取
り出した。ＰＣＲ産物を電気泳動して、ナイロンメンブランに移した。キミオル
ミニセント（ｑｕｉｍｉｏｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）検出の後、フィルムを走査
して、バンドの強度を測定した。アクチンとペントラキシンＩまたはペントラキ
シン受容体との比率を計算して、異なるサンプルについて同じサイクルの値を比
較した。

【００６４】 （Ｇ）リアルタイムＰＣＲ 発作モデルのサンプルにおけるラットのペントラキシンＩおよびペントラキシ
ン受容体の発現レベルを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出シ
ステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイムＴａ
ｑＭａｎ ＰＣＲ技術によって調べた。この技術を用いて、ｃＤＮＡの絶対濃度
を高感度で測定することができる。長さが２５ｂｐおよび２９ｂｐの特別なプラ
イマーと３２ｍｅｒのプローブ（レポーター色素：ＦＡＭ／クエンチャー色素：
ＴＡＭＲＡ）とを市販の説明書に従って設計した。

【００６５】 （Ｈ）系内ハイブリダイゼーション ＭＣＡＯが行われたラットを閉塞後の６時間および２４時間および７日目に屠
殺し、０．１Ｍリン酸塩緩衝液で灌流し、その後、４％パラホルムアルデヒドを
含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液で灌流した。脳を切離して、同じ固定液において４
℃で８時間にわたって後固定し、１０％スクロース溶液で凍結保護した。２０μ
ｍ厚の冠状面切片をクリオスタットで切断し、シラン処理したスライドガラスに
載せ、−４０℃で保存した。無傷ラットをコントロールとして使用した。

【００６６】 ラット・ペントラキシンＩフラグメントまたはラット・ペントラキシン受容体
フラグメントを含有するプラスミドＤＮＡを、選択された制限酵素で線状化し、
フェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈澱した。ペレットを２５μｌ
のＨ₂Ｏに再懸濁して、濃度をＵＶで測定した。１μｇの精製した線状化プラス
ミドを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得られる「Ｄｉｇ ＲＮＡ標
識」キットとともにＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳ
ｐ６ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写した。標識されたＲＮＡの収率を、同じ
キットに由来する標識されたコントロールＲＮＡをドットブロット法で使用して
見積もった。リボプローブを２５０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌで使用した。

【００６７】 ハイブリダイゼーションの前に、切片をＰＢＳで連続的に水和させ、０．２％
のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳとともにインキュベーションした。その後、
切片を０．２ＮのＨＣｌで処理（１０分）し、そして０．１Ｍトリエタノールア
ミン、０．２５％無水酢酸においてアセチル化（５分）した。その後、切片を４
％パラホルムアルデヒドで後固定（１０分）して、ＰＢＳで洗浄し、０．０２５
Ｍグリシンで洗浄（５分）し、エタノール（５０％、７０％、９０％および１０
０％）で順次脱水した。切片を、５０％ホルムアミド、２０％デキストラン硫酸
、５％デンハルト溶液、２％の０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２％の１Ｍ ＰＩＰＥＳ、
０．２％ＳＤＳ、５％の１Ｍ ＤＴＴ、２．５％の１０ｍｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ
、２．５％の１０ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよび１０％の２０×ＳＳＣを含むハ
イブリダイゼーション緩衝液でプレハイブリダイゼーション（６０℃で２時間）
し、続いて、４００ｎｇ／ｍｌのプローブを含有する同じ緩衝液でハイブリダイ
ゼーション（６０℃で一晩）した。ハイブリダイゼーションの後、切片を２×Ｓ
ＳＣで２回洗浄して、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む０．０１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で処理した（１時間、３７℃）。その後、連続的なス
トリンジェンシーの洗浄を、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ（室温で
各１５分）および０．１×ＳＳＣ（６０℃で３０分）で行った。

【００６８】 続いて、切片を、１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）でブロッキ
ングし（室温で２時間）、アルカリホスファターゼと結合させたヒツジポリクロ
ーナル抗ジゴキシゲニン抗血清を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）とインキュ
ベーションした（４℃で一晩）。その後、切片を洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴと数
時間インキュベーションして発色させた。

【００６９】 （Ｉ）合成ペプチドの設計および結合 合成ペプチドを、ラット・ペントラキシンＩおよびラット・ペントラキシン受
容体の配列に基づいて、それぞれ、特異的な抗体を惹起させるために設計した。
設計のために、ペントラキシン・ファミリーのメンバー間の大きな相同性と、ア
ミノ酸残基のアクセス性との２つの基本的な面を考慮した。図４には、ペプチド
の配列が示されている。タンパク質の構造を予測するために従来の方法を使用し
た。

【００７０】 合成ペプチドを、ＳＭＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイイミドプロピオ
ナート）およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ−
プロピオナート））の２つの市販リンカー（ともにＰｉｅｒｃｅから得られる）
を製造者の説明書に従って使用してキャリア（ＢＳＡまたはＫＬＨ）に連結した
。

【００７１】 （Ｊ）抗体の産生 合成ペプチドに対するポリクローナル抗体が、ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、
結合ＫＬＨ−ペプチドおよびアジュバントとしてのＲｉｂｉを腹腔内（ｉ．ｐ．
）投与した後に得られた。２回目の用量を最初の用量の２１日後に投与し、血清
を３１日目に取り出した。５０μｇのペプチドを用量あたりに使用し、１０匹の
動物をペプチドあたりに使用した。血清中における特異的な抗体の存在を、標準
的なＥＬＩＳＡ法を使用して調べた。交差反応を避けるために、ＥＬＩＳＡプレ
ートのコーティングを、ＳＭＳ−ＢＳＡペプチドおよびペプチド−ＳＰＤＰ−Ｂ
ＳＡを１μｇ／ｍｌで使用して行った。モノクローナル抗体の場合、免疫化され
たマウスの脾臓に由来するＢ細胞を、標準的な方法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ、上記）に従ってＰＥＧを使用して、パートナーとしてのＦｒｉｅｎ
ｄｌｙメラノーマ−６５３（Ｖｅｒｔｅｘ）細胞と融合した。

【００７２】 （Ｋ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）をＬａｅｍｍｌｉの方法に従って行った。タンパク質をニトロセルロース・
メンブランに移した。細胞抽出物または組織抽出物におけるペントラキシンＩお
よびペントラキシン受容体の存在を、ウエスタン・ブロットによって、ポリクロ
ーナル血清（１／２０００に希釈）またはハイブリドーマ上清のインキュベーシ
ョンを行い、その後、結合抗体のインキュベーションを行った後に決定した。

【００７３】 （Ｌ）インビトロでのアンチセンスアッセイ ラットのペントラキシンＩに対するセンス・オリゴヌクレオチドおよびアンチ
センス・オリゴヌクレオチドの作用を小脳顆粒ニューロンにおける低カリウム誘
導の細胞死について調べた。使用されたラット・ペントラキシンＩ転写物に対す
る２１ｍｅｒのアンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびセンス・
オリゴデオキシリボヌクレオチドのホスホロチオアートアナログは下記の通りで
あった： ＰＴＸ１ＡＳ ＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧ アンチセンス
ＰＴＸ１Ｓ ＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣ センス （下線部はホスホロチオアート化ヌクレオチドを示す。） １０μＭのＯＤＮの濃度が「アンチセンス・ノック・ダウン」に最適であるこ
とが見出された。センスＯＤＮまたはアンチセンスＯＤＮのいずれかを、顆粒細
胞培養物を高カリウム培地から低カリウム培地に切り換えた直後に加えた。生存
するニューロンを、カリウム欠乏の２４時間後にフルオレセインジアセタート（
ＦＤ）およびプロピジウムヨージド（ＰＩ）の２つの蛍光色素で同時に染色する
ことによって定量した。染色された細胞を標準的な上方照明蛍光顕微鏡で調べ、
写真撮影した。ニューロン細胞の死は、下記のようにして得られた％細胞死とし
て表された：ＰＩ陽性細胞Ｘ１００／（ＰＩ陽性細胞＋ＦＤ陽性細胞）。

【００７４】 （Ｍ）インビボモデルに対するアンチセンスアッセイ ラット・ペントラキシンＩおよびラット・ペントラキシン受容体に対するアン
チセンス・オリゴヌクレオチドの作用をラット発作モデルで調べた。 使用されたラット・ペントラキシンＩ転写物およびラット・ペントラキシン受容
体転写物に対する２１ｍｅｒのアンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチド
のホスホロチオアートアナログは下記の通りであった： ＰＴＸＩＡＳ ＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧ ラット・ペント
ラキシンＩアンチセンス ＰＴＸＲＡＳ ＧＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＣＧＣ ラット・ペント
ラキシン受容体アンチセンス （下線部はホスホロチオアート化ヌクレオチドを示す。） それぞれのアンチセンス・アッセイは２つのコントロール群を有した：ビヒク
ル（生理食塩水溶液）で処置された群およびコントロール・オリゴヌクレオチド
で処置された別の群。

【００７５】 使用されたラット・ペントラキシンＩ転写物およびラット・ペントラキシン受
容体転写物に対する２１ｍｅｒのコントロール・オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのホスホロチオアートアナログは下記の通りであった： ＰＴＸＩＳ ＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣ ラット・ペントラ
キシンＩセンス ＰＴＸＲＭＩＳ ＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＣ ラット・ペン
トラキシン受容体ミスマッチ （下線部はホスホロチオアート化ヌクレオチドを示す。） （Ｉ）ラット・ペントラキシンＩのアンチセンス・アッセイ 処置（ビヒクル、ラット・ペントラキシンＩのセンス・オリゴヌクレオチドお
よびアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を、梗塞領域の中心部に対応する座標
（ＡＰ −１．６、Ｌ ＋５．５、Ｐ −１．０）に埋め込まれたカニューレガ
イドを介してラットの左脳皮質に注入することによって適用した。オリゴヌクレ
オチドは、１０μＭにおいて、０．５μＬ／分で２分間にわたって投与された。
それぞれの投与におけるオリゴヌクレオチドの最終的な量は１０ｎｍｏｌであっ
た。コントロール群の動物には、１μＬの生理食塩水溶液が投与された。それぞ
れの動物には下記の４回の投与が行われた：最初の投与がＭＣＡ閉塞（ＭＣＡＯ
）の４８時間前に行われ、２回目がＭＣＡＯの２４時間前に行われ、３回目がＭ
ＣＡＯの５分後に行われ、そして最後が損傷の２４時間後に行われた。投与され
たオリゴヌクレオチドの最終的な量は動物あたり４０ｎｍｏｌであった。

【００７６】 脳をＭＣＡＯの４８時間後に摘出して染色し、梗塞容量を画像分析によって定
量した。

【００７７】 （ＩＩ）ラット・ペントラキシン受容体のアンチセンス・アッセイ 処置（ビヒクル、ラット・ペントラキシン受容体のミスマッチオリゴヌクレオ
チドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を、梗塞領域の中心部に対応す
る座標（ＡＰ −１．６、Ｌ ＋５．５、Ｐ −１．０）に埋め込まれたアルゼ
ット（ａｌｚｅｔ）ポンプを介してラットの左脳皮質に注入することによって適
用した。

【００７８】 アルゼットポンプを０．８３μＭのオリゴヌクレオチドで満たした；ポンプは
流速が０．５μＬ／時であった。したがって、動物には、２４時間の期間毎に１
０ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドが投与された。コントロール群の動物には、１
日あたり１２μＬの生理食塩水溶液が投与された。アルゼットポンプの能力は７
日間の注入期間に対してであった。したがって、ポンプはＭＣＡＯの５日前に埋
め込まれ、損傷後の２日目から作動させた。投与されたオリゴヌクレオチドの最
終的な量は動物あたり７０ｎｍｏｌであった。

【００７９】 脳をＭＣＡＯの４８時間後に摘出して染色し、梗塞容量を画像分析によって定
量した。

【００８０】 実施例３：発作モデルおよびインビトロ アポトーシス・モデルにおけるペン
トラキシンＩ遺伝子の発現 発作モデルを、その後のＤＤ研究のために、コントロールとしてのβ−アクチ
ンと、ＭＣＡＯ後に誘導される即時初期遺伝子として記載されるヒート・ショッ
クタンパク質７０（ＨＳＰ７０）とを用いた、ＭＣＡＯ後の両方の半球（同側側
および反対側）に由来するサンプルのハイブリダイゼーションによって確認した
（図５）。弱いシグナルがＭＣＡＯの３０分後に左半球に存在し、これは２時間
でその最大値に達し、少なくとも８時間続いた。反対側の半球では発現は見られ
なかった。これらの結果により、擬処置、ＭＣＡＯの２時間後および６時間後に
由来するサンプルをＤＤ実験のために選択した。

【００８１】 インビトロ アポトーシス・モデルを同じ目的で組み立てた。インビトロで８
日目の小脳顆粒細胞の培養条件を、高ＫＣｌ（２５ｍＭ）を含有する培地から低
濃度（５ｍＭ）を含有する培地に交換することによって、プロピジウムヨージド
の蛍光により測定されるニューロン細胞死の時間依存的な増大がもたらされた（
図１）。カリウム濃度を低下させ、血清を除いた２４時間後のニューロンの喪失
は、コントロールにおける１５％の死および２５ｍＭカリウムの存在下でカリウ
ムを除いた後における２０％の死と比較して約６０％であった。細胞死の著しい
差は、処置した２時間後および４時間後のこれらの群の間には認められなかった
。これらの時間における各処置群の総ＲＮＡを使用して、示差的な遺伝子発現を
調べた。

【００８２】 両方の実験モデルにおいて、ＤＤ実験からの選択されたバンドは、以前に記載
されたヒトおよびラットのニューロン・ペントラキシンＩに対する大きな相同性
を示した。発作モデルに由来するバンドは、塩基１４７９から塩基１８７７（塩
基１８５３で停止）までのラット・ペントラキシンＩに対して相同的であり、ア
ポトーシス・モデルに由来するバンドは塩基５１２７から塩基５３３９までのラ
ット・ペントラキシンＩに対して相同的であった。しかし、ラット発作モデルで
は、時間の経過とともにシグナルが低下するために、このバンドが選択されたが
、インビトロ アポトーシス・モデルでは強度が増大した。ノーザン分析により
、アポトーシス・モデルにおけるこの結果が確認される（図６）。このことは、
血清およびＫＣｌを欠乏させた培養物におけるアップレギュレーションを示して
いるが、発作モデルでは、非コード領域に由来する配列がプローブとして使用さ
れた場合でさえ、ペントラキシンＩの発現における明瞭な差を認めることはでき
なかった（図７／Ｉ）。それにも関わらず、ＴａｑＭａｎ技術を使用することに
より、ラット発作モデルにおけるペントラキシンＩの発現の著しい増大を明らか
にすることができた（図８、パネルＡ）。

【００８３】 実施例４：発作モデルにおけるペントラキシン受容体遺伝子の発現 発作モデルを、その後のＤＤ研究のために、コントロールとしてのβ−アクチ
ンと、ＭＣＡＯ後に誘導される即時初期遺伝子として記載されるヒート・ショッ
クタンパク質７０（ＨＳＰ７０）とを用いた、ＭＣＡＯ後の両方の半球（同側側
および反対側）に由来するサンプルのハイブリダイゼーションによって確認した
（図５）。弱いシグナルがＭＣＡＯの３０分後に左半球に存在し、これは２時間
でその最大値に達し、少なくとも８時間続いた。反対側の半球では発現は見られ
なかった。これらの結果により、擬処置、ＭＣＡＯの２時間後および６時間後に
由来するサンプルをＤＤ実験のために選択した。ＤＤ実験からの選択されたバン
ドは、以前に記載されたラットのニューロン・ペントラキシン受容体に対する大
きな相同性を示した。このバンドは、塩基２４９５から塩基３０５７（塩基１６
３１で停止）までのラット・ペントラキシン受容体に対して相同的であった。こ
のバンドは、強度が増大したために選択された。ノーザン分析により、ペントラ
キシン受容体の発現における明瞭な差を認めることことはできなかった（図７／
ＩＩ）。ペントラキシン受容体の過剰な発現が、ＴａｑＭａｎなどのより高感度
な技術を使用して確認された（図８、パネルＢ）。

【００８４】 実施例５：ペントラキシンＩのｍＲＮＡの組織分布 ヒト・ペントラキシンＩ遺伝子の塩基７２３〜１０４８（コード領域）に対応
するフラグメントを用いたノーザン・ドットブロットのハイブリダイゼーション
により、ペントラキシンＩが主に脳全体に分布していること、そして弱いシグナ
ルが下垂体および副腎に現れることが示された。脳において、その発現は、大脳
皮質、扁桃、海馬、後頭葉および小脳に見られ、そしてそれらよりも小さい程度
で、被殻に見られた（図９／Ｉ）。また、発現をいくつかのヒトおよびラットの
神経膠腫細胞株および神経芽細胞腫細胞株で調べた。大きな発現がＰＣＲ増幅に
よってヒト細胞株のＴ９８Ｇにおいて検出され（図１０／Ｉ）、そして弱いバン
ドのみがラット神経芽細胞腫細胞株のＢＥ１０およびＢＥ１０．７において検出
された（図１１／Ｉ）。

【００８５】 ラット・ペントラキシンＩ遺伝子の塩基１３９０から塩基１７９５までのフラ
グメントから作製されたリボプローブを使用する系内ハイブリダイゼーションに
より、ノーザン・ドットブロットと同じシグナル分布が示された（表１）。また
、皮質および海馬において同側側半球および反対側半球の両方でシグナルの増大
を認めることができた。小脳では、この増大はあまり明かではなかった。

【００８６】 実施例６：ペントラキシン受容体のｍＲＮＡの組織分布 塩基１０２９〜１７５５に対応するフラグメントを用いたノーザンドットブロ
ットのハイブリダイゼーションにより、ペントラキシン受容体が主に脳全体に分
布していることが示された。発現が、大脳皮質、扁桃、海馬、後頭葉、前頭葉お
よび側頭葉ならびに小脳において見られ、そしてそれらよりも小さい程度で被殻
において見られた（図９／ＩＩ、ＩＩＩ）。また、発現をいくつかのヒトおよび
ラットの神経膠腫細胞株および神経芽細胞腫細胞株で調べた。大きな発現がＰＣ
Ｒ増幅によってヒト細胞株のＵ１８６ＭＧおよびＵ８７ＭＧにおいて検出され（
図１０／ＩＩ）、そしてラット神経芽細胞腫細胞株のＢＥ１０、ＢＥ１０．７お
よびＢＥ１０．７後期ならびに神経膠腫細胞のＣ６において検出された（図１１
／ＩＩ）。

【００８７】 ラット・ペントラキシン受容体遺伝子の塩基２４９５から塩基３０５７までの
フラグメントから作製されたリボプローブを使用する系内ハイブリダイゼーショ
ンにより、ノーザン・ドットブロットと同じシグナル分布が示された（表２）。
また、皮質および海馬において同側側半球および反対側半球の両方でシグナルの
増大を認めることができた。小脳では、この増大はあまり明かではなかった。

【００８８】 実施例７：ペントラキシンＩ遺伝子の発現の調節機構 ペントラキシンＩ発現の考えられる調節機構を調べるために、小脳顆粒細胞に
おけるグルコースおよび／またはグルタミン酸の転写物レベルに対する影響を調
べた。図２のパネルＢに示されているように、細胞死として測定されるグルタミ
ン酸の興奮毒性作用が、グルタミン酸処置の前およびその期間中にグルコースが
欠乏したときに見られる。半定量的ＰＣＲ研究により、グルコースが欠乏した細
胞（レーン２および３）では、ペントラキシンＩのｍＲＮＡレベルが最初の４時
間のときに低下していることが示された（図１２／Ｉ）。グルコースが欠乏し、
かつグルタミン酸で処置された細胞（レーン４および５）では、両方の培養時間
においてｍＲＮＡレベルがコントロールまで増大した。この作用はまた、グルタ
ミン酸処置がグルコースの存在下で行われた場合（レーン６および７）にも見ら
れたが、前者よりも遅かった。したがって、グルタミン酸により、細胞生存性に
対する作用に関わらず、ペントラキシンＩの発現が誘導され、そしてグルコース
欠乏により、その発現が抑制されると結論することができる。

【００８９】 実施例８：ペントラキシン受容体遺伝子の発現の調節機構 ペントラキシン受容体発現の考えられる調節機構を調べるために、小脳顆粒細
胞におけるグルコースおよび／またはグルタミン酸の転写物レベルに対する影響
もまた調べられた。半定量的ＰＣＲ研究により、グルコースが欠乏した細胞（レ
ーン２および３）では、ペントラキシン受容体のｍＲＮＡレベルが最初の２時間
のときに素早く低下していることが示された（図１２／ＩＩ）。４時間後、増大
しているが、レベルは依然としてコントロール・レベルよりも小さい。グルコー
スが欠乏し、かつグルタミン酸で処置された細胞（レーン４および５）では、両
方の培養時間においてｍＲＮＡレベルがコントロールまでわずかに増大した。し
かし、グルタミン酸処置がグルコースの存在下で行われた場合（レーン６および
７）、４時間でコントロール・レベルにまで増大した。したがって、グルタミン
酸によりまた、細胞生存性に対する作用に関わらず、ペントラキシン受容体の発
現が誘導され、そしてグルコース欠乏によりその発現が抑制されると結論するこ
とができる。

【００９０】 実施例９：アンチセンスＲＮＡの存在下におけるペントラキシンＩの発現 ペントラキシンＩ遺伝子の塩基５６１〜５８１に対応するオリゴヌクレオチド
（センスおよびアンチセンス）を、アポトーシス・モデルにおける細胞生存性に
対する影響を見るために使用した。図１３／Ｉに示されているように、アンチセ
ンス処置のみが細胞死の割合の著しい低下を誘導する。このことは、ペントラキ
シンＩタンパク質の発現の抑制が神経保護作用を有することを示している。

【００９１】 ペントラキシンＩ遺伝子の塩基６３０〜６５０に対応するオリゴヌクレオチド
（センスおよびアンチセンス）を、ラット発作モデルにおける神経保護作用を見
るために使用した。図１３／ＩＩ／Ａに示されているように、アンチセンス処置
のみが梗塞容量の著しい低下を誘導する（約２６％、ｐ＜０．０２、ステューデ
ントＴ検定）。このことは、ペントラキシンＩタンパク質の発現の抑制が神経保
護作用を有することを示している。

【００９２】 実施例１０：アンチセンスＲＮＡの存在下におけるペントラキシン受容体の発
現 ペントラキシン受容体遺伝子の塩基１８７〜２０７に対応するオリゴヌクレオ
チド（ミスマッチおよびアンチセンス）を、ラット発作モデルにおける神経保護
作用を見るために使用した。図１３／ＩＩ／Ｂに示されているように、アンチセ
ンス処置のみが梗塞容量の著しい低下を誘導する（約２０％、ｐ＜０．０２、ス
テューデントＴ検定）。このことは、ペントラキシン受容体タンパク質の発現の
抑制が神経保護作用を有することを示している。

【００９３】 実施例１１：特異的な抗ペントラキシンＩ抗体の作製 ポリクローナル抗体を、ラットのペントラキシンＩ配列に対して相同的な合成
ペプチドを使用して得た。特異的なペプチドであるペプチド１（図４／Ｉ、パネ
ルＢ）を、免疫化のためにＫＬＨに結合し、そしてスクリーニングのためにＢＳ
Ａに結合した（図１４／Ｉ）。特異的な抗体の存在を、ＳＭＰおよびＳＰＤＰの
２つの異なるリンカーによるＢＳＡに対するペプチド１結合体をコーティングの
ために使用して検出した。約１００ｋＤａの特異的なバンドが、２つのニューロ
ンラット細胞株の抽出物を用いたウエスタン・ブロッティングの後で検出された
（図１５／Ｉ）。抗ペプチド１抗血清とともにインキュベーションした後のウエ
スタン・ブロットで得られるこの１００ｋＤａバンドは、この抗血清がペプチド
１とプレインキュベーションされた場合には消失する（図１６）。

【００９４】 実施例１２：特異的な抗ペントラキシン受容体抗体の作製 ポリクローナル抗体を、ラットのペントラキシン受容体配列に対して相同的な
合成ペプチドを使用して得た。特異的なペプチドであるペプチド１（図４／ＩＩ
、パネルＢ）を、免疫化のためにＫＬＨに結合し、そしてスクリーニングのため
にＢＳＡに結合した（図１４／ＩＩ）。特異的な抗体の存在を、ＳＭＰおよびＳ
ＰＤＰの２つの異なるリンカーによるＢＳＡに対するペプチド１結合体をコーテ
ィングのために使用して検出した。約４５ｋＤａの特異的なバンドが、すべての
ニューロンラット細胞株の抽出物を用いたウエスタン・ブロッティングの後で検
出された（図１５／ＩＩ）。

【００９５】 実施例１３：発作モデルおよびインビトロ アポトーシス・モデルにおけるペ
ントラキシンＩのタンパク質レベル ラット・ペントラキシンＩの発現を、市販のモノクローナル抗体および標準的
なウエスタン・ブロット技術を使用して検出した。

【００９６】 この計画のために、ＭＣＡＯ発作モデルの後で、ラットの脳を、右半球、非梗
塞の左半球、梗塞した左半球、および小脳で切離した。抽出物（緩衝液（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．１％トリトンＸ−１００；５ｍＭのＥ
ＤＴＡ；２５０ｍＭのＮａＣｌ；１０μｌ／ｍｌのＰＭＳＦ）において）を、レ
ーンあたり２０μｇを使用して泳動した。ペントラキシンＩの特異的な４７ｋＤ
ａの特異的なバンドが検出され（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｎ３５１３０）、チュブリン（ＩＣＮ、６５０９５２）などのハウス
・キーピング遺伝子のシグナルと比較された（図１７、パネルＩ）。バンドのデ
ンシトメトリー分析（図１７、パネルＩＩ）により、反対側半球および同側側半
球におけるペントラキシンＩ発現の明らかな増大が示された。発現の増大は閉塞
の２時間後に検出される。この結果は、ペントラキシン類が急性期のタンパク質
として分類されることと一致する。

【００９７】 ペントラキシンＩレベルの増大はまた、アポトーシス顆粒細胞モデルにおいて
も検出された。カリウム欠乏の後、ペントラキシンＩの発現は明らかに増大した
（図１８）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 カリウム除去後の小脳顆粒細胞培養物における特異的な遺伝子発現。

【図２】 小脳顆粒細胞培養物におけるグルタミン酸誘導の神経毒性。 （ａ）小脳顆粒細胞培養物におけるグルタミン誘導神経毒性モデルの概要、 （ｂ）小脳顆粒細胞の生存能に対するグルタミン酸の経時的作用、 （ｃ）グルタミン酸処理下での生存能に対するグルコースの作用。

【図３】 ラット発作モデルにおける特異的な遺伝子の表出。 ｃＤＮＡ増幅のために下流プライマー（Ｔ）₁₁ＡＴと組み合せて使用された３
つの上流プライマー（Ｄ１２、Ｄ１５、Ｄ１６）が、図の上部に示される。各プ
ライマーの具体的な配列は、図の下部に示される。鏃印は、差異を示すバンドを
示している。

【図４／Ｉ】 ラットのペントラキシンＩ（図４／Ｉ）およびペントラキシン受容体（図４／
ＩＩ）に対する抗原性ペプチドの設計。 （Ｉ／Ａ）抗原特異性を決定するためのラットのペントラキシンＩおよびペン
トラキシン受容体のアミノ酸配列の比較。抗体用の合成ペプチドは、囲い内に示
す。 （Ｉ／Ｂ）ラットのペントラキシンＩ配列の配列に基づく、ペプチド１の設計
。システインを、キャリアとの結合を容易にするためにＮ末端に含ませた。 （ＩＩ／Ａ）抗原特異性を決定するためのラットのペントラキシンＩおよびペ
ントラキシン受容体のアミノ酸配列の比較。抗体用の合成ペプチドは、囲い内に
示す。 （ＩＩ／Ｂ）ラットのペントラキシン受容体配列の配列に基づく、ペプチド２
の設計。システインを、キャリアとの結合を容易にするためにＮ末端に含ませた
。

【図４／ＩＩ】 ラットのペントラキシンＩ（図４／Ｉ）およびペントラキシン受容体（図４／
ＩＩ）に対する抗原性ペプチドの設計。 （Ｉ／Ａ）抗原特異性を決定するためのラットのペントラキシンＩおよびペン
トラキシン受容体のアミノ酸配列の比較。抗体用の合成ペプチドは、囲い内に示
す。 （Ｉ／Ｂ）ラットのペントラキシンＩ配列の配列に基づく、ペプチド１の設計
。システインを、キャリアとの結合を容易にするためにＮ末端に含ませた。 （ＩＩ／Ａ）抗原特異性を決定するためのラットのペントラキシンＩおよびペ
ントラキシン受容体のアミノ酸配列の比較。抗体用の合成ペプチドは、囲い内に
示す。 （ＩＩ／Ｂ）ラットのペントラキシン受容体配列の配列に基づく、ペプチド２
の設計。システインを、キャリアとの結合を容易にするためにＮ末端に含ませた
。

【図５】 ラットにおける永続的な大脳虚血下での遺伝子発現。 （ａ）ラットにおける左中大脳動脈（ＭＣＡ）のジアルテミー閉塞の拡大写真
。 （ｂ）ＭＣＡＯ（中央中心溝動脈閉塞）後の種々の時間における、損傷した脳
のＴＴＣ染色された冠状面切片。梗塞領域は染色されない（白く明るい染色）。 （ｃ）ノーザン分析によるＭＣＡＯ後の種々の時間における、両半球でのアク
チンおよびＨＳＰ−７０（ヒート・ショックタンパク質−７０）のレベル。

【図６】 血清およびカリウムを欠乏させた後の小脳顆粒細胞培養物におけるラット・ペ
ントラキシンＩのノーザン分析。 処置後の種々の時間における、ラット・ペントラキシンＩの発現およびコント
ロールとしてのβ−アクチンの評価。 Ｋ（＋）：２５ｍＭのカリウム；Ｋ（−）：５ｍＭのカリウム。

【図７／Ｉ】 発作モデルにおけるラットのペントラキシンＩ（図７／Ｉ）およびペントラキ
シン受容体（図７／ＩＩ）のノーザン分析。 （７／Ｉ）ＭＣＡＯ後の種々の時間における、両半球におけるラット・ペント
ラキシンＩの発現およびコントロールとするβ−アクチンの評価。 （７／ＩＩ）ＭＣＡＯ後の種々の時間における、両半球におけるラット・ペン
トラキシン受容体の発現およびコントロールとするβ−アクチンの評価。

【図７／ＩＩ】 発作モデルにおけるラットのペントラキシンＩ（図７／Ｉ）およびペントラキ
シン受容体（図７／ＩＩ）のノーザン分析。 （７／Ｉ）ＭＣＡＯ後の種々の時間における、両半球におけるラット・ペント
ラキシンＩの発現およびコントロールとするβ−アクチンの評価。 （７／ＩＩ）ＭＣＡＯ後の種々の時間における、両半球におけるラット・ペン
トラキシン受容体の発現およびコントロールとするβ−アクチンの評価。

【図８】 リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）によって決定されたペントラキシンＩお
よびペントラキシン受容体のｍＲＮＡレベル。 ペントラキシンＩ（パネルＡ）およびペントラキシン受容体（パネルＢ）のｍ
ＲＮＡレベルを、ＴａｑＭａｎ法を使用して決定した。プローブとして使用され
たサンプルは、種々の時間における、ＭＣＡＯ手術ラットの左脳半球（虚血）に
由来した。擬処置動物またはコントロール動物（非手術）から採取された材料を
コントロールとして使用した。ペントラキシンＩおよびペントラキシン受容体の
レベルは、β−アクチンのレベルに対して、有意な（^*）増大を示した。

【図９／Ｉ】 ヒト組織におけるペントラキシンＩ（図９／Ｉ）およびペントラキシン受容体
（図９／ＩＩ、ＩＩＩ）の分布。 ペントラキシンＩプローブ（図９／Ｉ）、ペントラキシン受容体プローブ（図
９／ＩＩ、ＩＩＩ）、およびコントロールとしてのユビキチン（図９／Ｉ、ＩＩ
）を用いたノーザン・ブロット（多組織ノーザン・ブロット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。

【図９／ＩＩ】 ヒト組織におけるペントラキシンＩ（図９／Ｉ）およびペントラキシン受容体
（図９／ＩＩ、ＩＩＩ）の分布。 ペントラキシンＩプローブ（図９／Ｉ）、ペントラキシン受容体プローブ（図
９／ＩＩ、ＩＩＩ）、およびコントロールとしてのユビキチン（図９／Ｉ、ＩＩ
）を用いたノーザン・ブロット（多組織ノーザン・ブロット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。

【図９／ＩＩＩ】 ヒト組織におけるペントラキシンＩ（図９／Ｉ）およびペントラキシン受容体
（図９／ＩＩ、ＩＩＩ）の分布。 ペントラキシンＩプローブ（図９／Ｉ）、ペントラキシン受容体プローブ（図
９／ＩＩ、ＩＩＩ）、およびコントロールとしてのユビキチン（図９／Ｉ、ＩＩ
）を用いたノーザン・ブロット（多組織ノーザン・ブロット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。

【図１０／Ｉ】 いくつかのヒト細胞株におけるペントラキシンＩ（図１０／Ｉ）およびペント
ラキシン受容体（図１０／ＩＩ）のｃＤＮＡレベルのＰＣＲによる検出。

【図１０／ＩＩ】 いくつかのヒト細胞株におけるペントラキシンＩ（図１０／Ｉ）およびペント
ラキシン受容体（図１０／ＩＩ）のｃＤＮＡレベルのＰＣＲによる検出。

【図１１／Ｉ】 いくつかのラット細胞株におけるペントラキシンＩ（図１１／Ｉ）およびいく
つかのラット細胞株におけるペントラキシン受容体（図１１／ＩＩ）のｃＤＮＡ
レベルのＰＣＲによる検出。

【図１１／ＩＩ】 いくつかのラット細胞株におけるペントラキシンＩ（図１１／Ｉ）およびいく
つかのラット細胞株におけるペントラキシン受容体（図１１／ＩＩ）のｃＤＮＡ
レベルのＰＣＲによる検出。

【図１２／Ｉ】 ラット小脳顆粒細胞でのグルタミン酸神経毒性モデルにおける、種々の培養条
件での半定量的ＰＣＲによるペントラキシンＩの発現（図１２／Ｉ）およびペン
トラキシン受容体の発現（図１２／ＩＩ）。

【図１２／ＩＩ】 ラット小脳顆粒細胞でのグルタミン酸神経毒性モデルにおける、種々の培養条
件での半定量的ＰＣＲによるペントラキシンＩの発現（図１２／Ｉ）およびペン
トラキシン受容体の発現（図１２／ＩＩ）。

【図１３／Ｉ】 小脳顆粒細胞（図１３／Ｉ）における低カリウム誘導によるニューロン細胞死
、ならびにラット発作モデル（図１３／ＩＩ）における、アンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドおよびセンス・オリゴヌクレオチドの作用。

【図１３／ＩＩ】 小脳顆粒細胞（図１３／Ｉ）における低カリウム誘導によるニューロン細胞死
、ならびにラット発作モデル（図１３／ＩＩ）における、アンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドおよびセンス・オリゴヌクレオチドの作用。

【図１４／Ｉ】 ラットのペントラキシンＩおよびペントラキシン受容体に対する抗体を検出す
るためのＥＬＩＳＡアッセイ。 アッセイを、リンカーとしてＳＭＰまたはＳＰＤＰを使用してＢＳＡと結合さ
せた、ペプチド１（図１４／Ｉ；ペントラキシンＩ）またはペプチド２（図１４
／ＩＩ；ペントラキシン受容体）をそれぞれ用いて行った。図１４／Ｉではペプ
チド２（ペントラキシン受容体）およびＣＴ１９を陰性コントロールとして使用
し、図１４／ＩＩではペプチド１（ペントラキシン１）およびＣＴ１９を陰性コ
ントロールとして使用した。

【図１４／ＩＩ】 ラットのペントラキシンＩおよびペントラキシン受容体に対する抗体を検出す
るためのＥＬＩＳＡアッセイ。 アッセイを、リンカーとしてＳＭＰまたはＳＰＤＰを使用してＢＳＡと結合さ
せた、ペプチド１（図１４／Ｉ；ペントラキシンＩ）またはペプチド２（図１４
／ＩＩ；ペントラキシン受容体）をそれぞれ用いて行った。図１４／Ｉではペプ
チド２（ペントラキシン受容体）およびＣＴ１９を陰性コントロールとして使用
し、図１４／ＩＩではペプチド１（ペントラキシン１）およびＣＴ１９を陰性コ
ントロールとして使用した。

【図１５／Ｉ】 ペントラキシンＩポリクローナル抗体（図１５／Ｉ）およびペントラキシン受
容体ポリクローナル抗体（図１５／ＩＩ）をそれぞれ使用した細胞株に関するウ
エスタン・ブロット。 陰性コントロールとして、抗リンカー抗体および抗ペプチド（ペントラキシン
Ｉ）抗体または抗ペプチド２（ペントラキシン受容体）抗体を使用した。

【図１５／ＩＩ】 ペントラキシンＩポリクローナル抗体（図１５／Ｉ）およびペントラキシン受
容体ポリクローナル抗体（図１５／ＩＩ）をそれぞれ使用した細胞株に関するウ
エスタン・ブロット。 陰性コントロールとして、抗リンカー抗体および抗ペプチド（ペントラキシン
Ｉ）抗体または抗ペプチド２（ペントラキシン受容体）抗体を使用した。

【図１６】 ラット・ペントラキシンＩ抗体に関する競合アッセイ。 ラット細胞株をウエスタン・ブロットした後、フィルターを、抗リンカー抗体
、抗ペプチド１抗体、ならびに、ペプチド１とプレインキュベーションした抗ペ
プチド１抗体とともにインキュベーションした。

【図１７】 ＭＣＡＯラットの脳抽出物に対する、ペントラキシンＩモノクローナル抗体を
使用するウエスタン・ブロット。 ペントラキシンＩのタンパク質レベルを、市販のモノクローナル抗体（Ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎ３５１３０）を使用して検
出した。ＭＣＡＯ発作モデルの後、ラットの脳を、右半球、非梗塞の左半球、梗
塞した左半球、および小脳に切離した。サンプルを、さらなる例に示されている
ように調製した。ハウス・キーピング遺伝子のチュブリンをコントロールとして
使用した（ＩＣＮ、６５０９５２）。パネルＩには、コントロール（チュブリン
）および特異的なペントラキシンＩ抗体を使用するウエスタン・ブロットが示さ
れている。 バンドをデンシトメトリーで定量した。パネルＩＩに示される結果は、コント
ロールを基準とする、正規化された結果のパーセンテージ（ペントラキシンＩの
バンド／チュブリンのバンド）に対応する。

【図１８】 アポトーシス・モデル（カリウム欠乏）に由来する細胞抽出物に対する、ペン
トラキシンＩモノクローナル抗体を使用するウエスタン・ブロット。 チュブリンおよびペントラキシンＩが、図１７に示される同じ抗体を使用して
検出された。ペントラキシンＩの発現がコントロール細胞で弱く検出されたが、
処置された細胞における発現はカリウム欠乏の後に劇的に増大した。

【図１９】 開始コドン（ＣＴＧ）および停止コドンを含むヒト・ペントラキシン受容体の
コード領域。

【図２０】 記載された配列（Ｕ６１８４８９）に対して相同的なヒト・ペントラキシンＩ
の部分クローン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 25/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８６ 25/28 16/28 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/21 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 メッセグエル ペイポーシュ、 ラモン スペイン国 エス−08330 プレミア デ マル ピントール ポウ ロイグ通り 37番 １番２アー (72)発明者 ロッセル ヴィヴエス、 エリザベト スペイン国 エス−08008 バルセローナ エンリク グラナドス通り 43番 ３号 (72)発明者 マルティネス エスコーラ、 ジョセフ、 マ スペイン国 エス−08017 バルセローナ ボリ−イ フォンテスタ通り 49番−ア 13号 エイチ (72)発明者 ロデス グベラン、 ブランカ スペイン国 エス−08849 サン クリメ ント デ ヨブレガト ジョウム フォン ト通り ３番 ２号 (72)発明者 アダン プラーナ、 ジョウム スペイン国 エス−08301 マタロウ プ ジョウル通り 28番 (72)発明者 プユイグ カルボ、 ヌリア スペイン国 エス−08027 バルセローナ プエルト プリンシペ通り 47番−53号 アテイコ ３アー (72)発明者 カルセイエール ローサ、 アナ スペイン国 エス−08028 バルセローナ タキグラフォウ マルティ通り ６番 ２号 ２アー (72)発明者 マーサ アルヴァレス、 マルク スペイン国 エス−08020 バルセローナ ジョセフ ミレット通り 21番 ２号 ３アー (72)発明者 ピウラト サンコ、 ジョウム スペイン国 エス−08030 バルセローナ エム．キンティ マヨフレ通り ２番 ６号 (72)発明者 デン ダース、 イツァーク ドイツ連邦共和国 64407 フレンキッシ ュ−クラムバッハ シュイラーシュトラー セ 76 (72)発明者 トゥルヤス オリヴァ、 ラモン スペイン国 エス−08226 テラッサ プ ラト デ ラ リバ通り 169番 デー１ 号 (72)発明者 デ グレゴリオ−ロウ−カソラーノ バル バニー、 ヌーリア スペイン国 エス−08921 サンタ コロ ーマ デ グラマネト メストレ ジョセ フ マルトレール 12番 アーティク Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA41 BA63 CA04 CA09 DA02 DA03 DA05 DA12 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ53 QR32 QR38 QR55 QR59 QR82 QS25 QS28 QS34 QS39 QX01 4B064 AG20 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA72X AA90X AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA02 BA23 CA53 CA56 DC01 NA14 ZA012 ZA022 ZA162 4C085 AA13 AA14 BB11 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA16 ZB21 ZB26 ZC02 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA50 DA76 DA86 EA21 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト・ペントラキシン受容体または該ヒト・ペントラキシン
   受容体の生物学的性質を示すタンパク質をコードし、かつ （ａ）図１９に示されるヌクレオチド配列のコード領域を含んでなる核酸配列
   ； （ｂ）（ａ）に明記される該核酸配列にハイブリダイゼーションする核酸配列
   ； （ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記される該核酸配列から、遺伝暗号の縮重性に
   起因して変異している核酸配列、ならびに （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に明記される核酸配列のフラグメント、誘導体または対
   立遺伝子型変異体を表す核酸配列 からなる群から選択される核酸配列。
2. 【請求項２】 請求項１に記載される該核酸配列を含む組換えベクター。
3. 【請求項３】 該核酸配列は、原核生物宿主細胞および／または真核生物宿
   主細胞中において、翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を可能とする調節エレメ
   ントと機能的に連結されている、請求項２に記載の組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載される該組換えベクターを含有する組換え宿
   主細胞。
5. 【請求項５】 哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である、
   請求項４に記載の組換え宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項１に記載される核酸分子によってコードされている、
   該ヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を示すタンパク質。
7. 【請求項７】 該ヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を示すタンパ
   ク質の製造方法であって、 （ａ）請求項４または５に記載される該組換え宿主細胞を、前記タンパク質が
   発現されるような条件下で培養すること、および （ｂ）該タンパク質を回収すること を含んでなる方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載される方法によって製造されるタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項６または８に記載される該タンパク質に対する抗体。
10. 【請求項１０】 下記成分： （ａ）ペントラキシンＩまたは請求項１に記載される核酸配列によってコード
    されているタンパク質、 （ｂ）（ａ）のタンパク質の非機能的な変異体、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質に対する抗体、 （ｄ）（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする核酸配列、 （ｅ）ペントラキシンＩをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、請求項
    １に記載される核酸配列から転写されるｍＲＮＡ、またはそれらの一部に対して
    相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡまたはその一部に選択的に結合することができ
    ることを特徴とし、ペントラキシンＩ、あるいはヒト・ペントラキシン受容体ま
    たはヒト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を有するタンパク質の合成を阻
    害することができるアンチセンスＲＮＡ配列、 あるいは （ｆ）ペントラキシンＩをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、請求項
    １に記載される核酸配列から転写されるｍＲＮＡ、またはそれらの一部に対して
    相補的であり、かつ前記ｍＲＮＡまたはその一部と選択的に結合して、切断し、
    したがって、ペントラキシンＩ、あるいはヒト・ペントラキシン受容体またはヒ
    ト・ペントラキシン受容体の生物学的性質を有するタンパク質の合成を阻害する
    ことができることを特徴とするリボザイム の少なくとも１つの治療的に有効量を、 場合によっては、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せて、 含んでなる医薬組成物。
11. 【請求項１１】 ニューロン異常に付随する疾患の防止、あるいは治療また
    は改善用の、ないしは神経保護作用の提供用の医薬組成物を製造するための、請
    求項１０に規定される化合物の１つの使用。
12. 【請求項１２】 該ニューロン異常は、発作、急性頭部外傷、多発性硬化症
    、脊髄損傷、アルツハイマー病または脳腫瘍である、請求項１１に記載の使用。
13. 【請求項１３】 ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の脱
    調節された発現、あるいは、全く無いか、ないしは少なくとも低下している生物
    学的活性を有するペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体の存在に
    基づく、ニューロン異常に付随する疾患を検出するための方法であって、 ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体、あるいはペントラキシン
    Ｉまたはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列を含有することが懸
    念される標的サンプルを、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体
    、あるいはペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核
    酸配列と反応する試薬と接触させること、および ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン受容体、あるいはペントラキシン
    Ｉまたはヒト・ペントラキシン受容体をコードする核酸配列の異常な量または異
    常な形態を検出すること を含んでなる方法。
14. 【請求項１４】 該試薬は、ペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシン
    受容体をコードする核酸配列に対して、特異的にハイブリダイゼーションし得る
    ポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該試薬は、抗ペントラキシンＩ抗体または抗ヒト・ペント
    ラキシン受容体抗体である、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 該試薬は、検出可能に標識化がなされている、請求項１３
    〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 ペントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受
    容体、あるいはペントラキシンＩおよび／またはヒト・ペントラキシン受容体を
    コードする核酸配列の異常な量または異常な形態を検出するためのプローブ（１
    つまたは複数）を含んでなる診断キット。
18. 【請求項１８】 該プローブは、抗ペントラキシンＩ抗体または抗ヒト・ペ
    ントラキシン受容体抗体、あるいはペントラキシンＩまたはヒト・ペントラキシ
    ン受容体をコードする核酸配列に対して特異的にハイブリダイゼーションし得る
    ポリヌクレオチドである、請求項１７に記載のキット。