BR112014015564B1 - construtos de dna recombinante e métodos de aumento do teor de óleo de sementes de soja - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE E MÉTODOS DE AUMENTO DO TEOR DE ÓLEO DE SEMENTES DE SOJA. São descritas construções de DNA recombinante que compreendem o promotor de sacarose sintase de soja, ligado operativamente a polinucleotídeos que codificam fatores de transcrição tais como ODP1, Lec1 e FUSCA3. Estas construções são utilizadas para aumentar o teor de óleo, mantendo ao mesmo tempo a germinação normal em plantas oleaginosas. Métodos de aumento do teor de óleo nas sementes de uma planta oleaginosa utilizando esta construção também são descritos no presente.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção encontra-se no campo da biotecnologia; particularmente, refere-se ao aumento do teor de óleo mantendo, ao mesmo tempo, a germinação normal em plantas oleaginosas utilizando o promotor de sacarose sintase de soja para dirigir a expressão de fatores de transcrição tais como ODP1, Lec1 e FUSCA3.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Óleo vegetal é um recurso renovável valioso. Lipídios vegetais possuem uma série de usos industriais e nutricionais e são fundamentais para a função de membrana vegetal e adaptação climática. Além dos usos nutricionais, óleos vegetais estão ganhando interesse crescente como substitutos de materiais derivados do petróleo em combustíveis, lubrificantes e substâncias especializadas, especialmente à medida que caem as fontes de petróleo bruto. Oleaginosas fornecem uma plataforma exclusiva para a produção de ácidos graxos de alto valor que podem substituir produtos de petróleo não sustentáveis. (Cahoon et al (2007), Curr. Opin. Plant Biol. 10: 236-244). Métodos de aumento do teor, melhoria e alteração da composição de óleos vegetais são, portanto, desejados.

[003] Triacilglicerol (TAG) é o componente principal de óleo vegetal em plantas; ele é utilizado pela semente como forma de energia armazenada a ser utilizada durante a germinação de sementes. A qualidade e o conteúdo de óleo vegetal podem ser alterados por vários métodos, impostos sobre as enzimas envolvidas direta ou indiretamente na biossíntese de TAG.

[004] Existem limitações para o uso do cultivo de plantas convencionais para alterar a composição e o teor de ácidos graxos. Métodos de biologia celular e molecular oferecem o potencial de superar algumas das limitações da abordagem de cultivo convencional. Algumas das tecnologias particularmente úteis são a expressão específica de sementes de genes exógenos em plantas transgênicas (Goldberg et al (1989), Cell 56: 149-160) e o uso de RNA sem sentido para inibir genes alvo vegetais de forma dominante e específica de tecidos (van der Krol et al (1988), Gene 72: 45-50). Outros avanços incluem a transferência de genes exógenos para variedades comerciais de elite de safras oleaginosas comerciais, tais como soja (Chee et al (1989), Plant Physiol. 91: 1212-1218; Christou et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 7500-7504; Hinchee et al (1988), Bio/Technology 6: 915-922; publicação EPO 0.301.749 A2), canola (De Block et al (1989), Plant Physiol. 91: 694-701) e girassol (Everett et al (1987), Bio/Technology 5: 1201-1204) e o uso de genes como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) em um programa de cultivo, o que torna a introgressão de características recessivas em linhagens de elite rápida e menos cara (Tanksley et al (1989), Bio/Technology 7: 257-264). A aplicação de cada uma dessas tecnologias requer, entretanto, identificação e isolamento de genes comercialmente importantes.

[005] Fatores de transcrição regulam a transcrição e orquestram a expressão genética em plantas e outros organismos; o controle da expressão de gene de fator de transcrição fornece um meio poderoso de alteração do fenótipo vegetal. A transformação de plantas com fatores de transcrição, entretanto, pode resultar em desenvolvimento aberrante com base na sobre-expressão e/ou expressão ectópica do fator de transcrição e, portanto, o controle rígido do tempo, resistência e localização da expressão de fatores de transcrição é crucial para fenótipos ideais. O uso de promotores específicos de sementes fortes ou promotores constitutivos fortes pode gerar fenótipos aberrantes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção refere-se ao uso de um promotor específico de sementes de um gene sacarose sintase de soja ou gene sacarose sintase de Medicago trunculata para dirigir a expressão de fatores de transcrição tais como ODP1, Lec1 ou FUSCA3 de soja nas sementes de uma planta oleaginosa, para aumentar o teor de óleo.

[007] Em uma realização, um construto de DNA recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase de soja ou um promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende o construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante. A semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante pode ter germinação normal, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende a construto de DNA recombinante.

[008] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descrito no presente, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase de soja e o promotor de sacarose sintase de soja compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; (b) uma sequência de ácidos nucleicos com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; (c) uma sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza em SEQ ID NO: 8 sob condições estringentes; (d) uma sequência de ácidos nucleicos que difere de SEQ ID NO: 8 em pelo menos uma forma conforme descrito na Fig. 4; e (e) uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um fragmento funcional de (a), (b), (c) ou (d).

[009] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descrito no presente, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata, em que o promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85; (b) uma sequência de ácidos nucleicos com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85; (c) uma sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza em SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85 sob condições estringentes; e (d) uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um fragmento funcional de (a), (b) ou (c).

[010] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descirto no presente, em que o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codifica um polipeptídeo ODP1, em que o polipeptídeo ODP1 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 70.

[011] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descrito no presente, em que o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codifica um polipeptídeo Lec1 e o polipeptídeo Lec1 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 17, 20, 25 ou 65.

[012] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descirto no presente, em que o pelo menos um polinucleotídeo heterólogo codifica um polipeptídeo FUSCA3 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 32, 38, 45 ou 49.

[013] Em outra realização, uma planta ou semente compreende qualquer uma das construções de DNA recombinante descritas acima. A planta e a semente podem ser planta e semente oleaginosas. A planta ou semente pode ser uma planta ou semente de soja.

[014] Em outra realização, um construto de DNA recombinante conforme descrito no presente, em que o construto de DNA recombinante compreende adicionalmente um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT. O segundo polinucleotídeo heterólogo pode codificar um polipeptídeo DGAT1. O polipeptídeo DGAT1 pode compreender uma sequência de aminoácidos com identidade de sequências de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% com SEQ ID NO: 55. O segundo polinucleotídeo heterólogo pode codificar um polipeptídeo DGAT2. O polipeptídeo DGAT2 pode compreender uma sequência de aminoácidos com identidade de sequências de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% com SEQ ID NO: 60.

[015] Em outra realização, planta ou semente que compreende as construções de DNA recombinantes descritas acima, em que a coexpressão do mencionado polipeptídeo e do mencionado polipeptídeo DGAT em uma semente de soja transgênica que compreende o construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente transgênica, em comparação com uma semente controle que expressa o mencionado polipeptídeo DGAT do mencionado promotor específico de semente, mas não expressa o mencionado polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3. A planta e a semente podem ser planta e semente oleaginosas. A planta ou semente pode ser uma planta ou semente de soja.

[016] Em outra realização, planta que compreende um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3 e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT, em que a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende as mencionadas primeira e segunda construções de DNA recombinantes resulta em aumento do teor de óleo na semente transgênica, em comparação com uma semente controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinantes. A planta e a semente podem ser planta e semente oleaginosas. A planta e a semente podem ser planta e semente de soja

[017] Em outra realização, método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável de qualquer uma das construções de DNA recombinante descritas no presente; (b) regeneração de planta transgênica a partir da célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b) ou uma progênie de planta transgênica da planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica ou a progênie de planta transgênica compreende o construto recombinante e exibe aumento do teor de semente enquanto mantém a germinação total, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto recombinante de DNA. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[018] Em outra realização, método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável de um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3 e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de semente ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT; (b) regeneração de planta transgênica a partir da célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b) ou uma progênie de planta transgênica da planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica ou a progênie de planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante e a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende as mencionadas primeira e segunda construções de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo da semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinante. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[019] Em outra realização, planta transgênica obtida por meio de qualquer dos métodos descritos no presente e semente transgênica da mencionada planta transgênica.

[020] Em outra realização, vetor, célula, planta, tecido vegetal ou semente que compreende qualquer das construções de DNA recombinante descritas no presente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[021] A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, das figuras e da Listagem de Sequências anexas que fazem parte do presente pedido. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984), que são integralmente incorporados ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. § 1.822.

[022] A Fig. 1 é um diagrama esquemático que exibe a região promotora e as variantes de divisão 5’ de GmSuS ou Glyma13g17420. A região promotora de GmSus identificada codifica 5’ UTR do transcrito de cDNA bem como um intron que divide a 5’ UTR. As posições das caixas AW AW1 e AW2 também são exibidas.

[023] A Fig. 2 exibe um alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de Glyma17g00950 (SEQ ID NO: 17), Glyma07g39820 (SEQ ID NO: 20) e GmLec1 (SEQ ID NO: 25).

[024] A Fig. 3 exibe um alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de Glyma16g05480 (SEQ ID NO: 32) e Glyma19g27340 (SEQ ID NO: 38), conforme previsto no banco de dados Glyma, junto com a sequência dividida prevista para GmFusca3-2 (SEQ ID NO: 45) e para GmFusca3-1 (SEQ ID NO: 49).

[025] A Fig. 4 exibe a diversidade de sequências em diferentes linhagens de soja da região de DNA genômico que compreende o promotor, 5’ UTR e o primeiro intron do gene Glyma13g17420.

[026] As descrições de sequências e a Listagem de Sequências anexas ao presente atendem às normas que regem descrições de sequências de aminoácidos e/ou nucleotídeos em pedidos de patente conforme estabelecido em 37 C. F. R. §1.821-1.825. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC- IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical J. 219 (2): 345-373 (1984), que são incorporadas ao presente como referência. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. §1.822.

[027] SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos do gene Sacarose sintase 2 de Arabidopsis (AT5G49190), correspondente ao local descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2010/114989 e correspondente a GI n° 30695613.

[028] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência descrita em SEQ ID NO: 1 e corresponde a GI N° 332008397.

[029] SEQ ID NO: 3 é a sequência genômica do gene Sacarose sintase de soja correspondente ao local Glyma13g17420.

[030] SEQ ID NO: 4 é a sequência de cDNA do gene Sacarose sintase de soja correspondente ao local Glyma13g17420.

[031] SEQ ID NO: 5 é a CDS (sequência de codificação) do gene Sacarose sintase de soja correspondente ao local Glyma13g17420. O homólogo de soja ao gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis descrito em SEQ ID NO: 5 é denominado GmSuS.

[032] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 5 e é a sequência de polipeptídeo Sacarose sintase de soja.

[033] SEQ ID NO: 7 é a sequência para a extremidade 5’ de EST sdp3c.pk014.n18.

[034] SEQ ID NO: 8 é a sequência do DNA genômico acima no fluxo do códon de parada de GmSuS (SEQ ID NO: 5), correspondente ao promotor para GmSuS.

[035] SEQ ID NO: 9 e 10 são as sequências dos oligonucleotídeos GmSuSyProm-5 e GmSuSyProm-3, respectivamente.

[036] SEQ ID NO: 11 é a sequência do construto pLF284.

[037] SEQ ID NO: 12 é a sequência do plasmídeo pKR1963.

[038] SEQ ID NO: 13 é a sequência do construto pKR1964.

[039] SEQ ID NO: 14 é a sequência do construto pKR1965.

[040] SEQ ID NO: 15 é a sequência do clone de cDNA se2.11d12.

[041] SEQ ID NO: 16 é a sequência do clone de soja se2.11d12 de 38-718 bp e é a sequência de codificação de Lec1b (GI: 158525282) e corresponde a Glyma17g00950.

[042] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos fornecida em SEQ ID NO: 16.

[043] SEQ ID NO: 18 é a sequência de inserto completo do clone de cDNA se1.pk0042.d8.

[044] SEQ ID NO: 19 é a sequência do clone de cDNA de soja se1.pk0042.d8 com local de início corrigido, correspondente a Glyma07g39820.

[045] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência fornecida em SEQ ID NO: 19.

[046] SEQ ID NO: 21 e 22 são as sequências dos oligonucleotídeos SA275 e SA276, respectivamente.

[047] SEQ ID NO: 23 é a sequência do construto Glyma17g00950/pCR8/GW/TOPO.

[048] SEQ ID NO: 24 é a sequência de nucleotídeos de GmLec1.

[049] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos fornecida em SEQ ID NO: 24.

[050] SEQ ID NO: 26 e 27 são as sequências dos oligonucleotídeos GmLec-5 e Gmlec-3, respectivamente.

[051] SEQ ID NO: 28 é a sequência do construto pLF275, que contém GmLec1.

[052] SEQ ID NO: 29 é a CDS de GmODP1.

[053] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácidos de GmODP1.

[054] SEQ ID NO: 31 é a CDS prevista para Glyma16g05480.

[055] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácidos de Glyma16g05480.

[056] SEQ ID NO: 33 e 34 são as sequências dos oligonucleotídeos SA278 e SA279, respectivamente.

[057] SEQ ID NO: 35 é a sequência do plasmídeo Glyma16g05480/pCR8/GW/TOPO.

[058] SEQ ID NO: 36 é a sequência do inserto de cDNA no plasmídeo Glyma16g05480/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 35), determinada por meio de sequenciamento do inserto.

[059] SEQ ID NO: 37 é a sequência da CDS prevista de Glyma19g27340 do banco de dados Glyma.

[060] SEQ ID NO: 38 é a sequência da sequência de aminoácidos prevista de Glyma19g27340 do banco de dados Glyma.

[061] SEQ ID NO: 39 é a sequência genômica do banco de dados de genoma de soja, acima no fluxo de Glyma19g27340, inclusive.

[062] SEQ ID NO: 40 e 41 são as sequências dos oligonucleotídeos GmFusca3-1-5 e GmFusca3-3, respectivamente.

[063] SEQ ID NO: 42 é a sequência do construto pLF283.

[064] SEQ ID NO: 43 é a sequência do cDNA com comprimento total do produto de PCR resultante para GmFusca3-2, amplificada utilizando os primers de SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41.

[065] SEQ ID NO: 44 é a sequência da suposta CDS dividida para GmFusca3-2.

[066] SEQ ID NO: 45 é a sequência da sequência de aminoácidos de GmFusca3-2 codificada por SEQ ID NO: 44.

[067] SEQ ID NO: 46 é a sequência do oligonucleotídeo GmFusca3-2-5 utilizada para amplificar GmFusca3-1.

[068]SEQ ID NO: 47 é a sequência do construto pFL282.

[069] SEQ ID NO: 47 é a sequência do construto pFL282. SEQ ID NO: 48 é a sequência de nucleotídeos de GmFusca3-1 .

[070] SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos de GmFusca3-1 .

[071]SEQ ID NO: 50 é a sequência do construto pKR1968.

[072]SEQ ID NO: 51 é a sequência do construto pKR1971.

[073]SEQ ID NO: 52 é a sequência do construto pKR1969.

[074]SEQ ID NO: 53 é a sequência do construto pKR1970.

[075]SEQ ID NO: 54 é a CDS de GmDGAT1cAll.

[076] SEQ ID NO: 50 é a sequência do construto pKR1968.

[077] SEQ ID NO: 56 é a sequência do construto pKR2098.

[078] SEQ ID NO: 57 é a sequência do construto pKR2100.

[079] SEQ ID NO: 58 é a sequência do construto pKR2099.

[080] SEQ ID NO: 59 é a CDS de YLDGAT2.

[081] SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos de YLDGAT2.

[082] SEQ ID NO: 61 é a sequência do construto pKR2082.

[083] SEQ ID NO: 62 é a sequência do construto pKR2084.

[084] SEQ ID NO: 63 é a sequência do construto pKR2083.

[085] SEQ ID NO: 64 é CDS de ZmLec1.

[086] SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos de ZmLec1.

[087] SEQ ID NO: 66 e 67 são as sequências dos oligonucleotídeos oZLEC-1 e oZLEC-2, respectivamente.

[088] SEQ ID NO: 68 é a sequência do construto pKR2115.

[089] SEQ ID NO: 69 é a CDS de ZmODP1.

[090] SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos de ZmODP1.

[091] SEQ ID NO: 71 é a sequência do construto pKR2121.

[092] SEQ ID NO: 72 é a sequência do construto pKR2114.

[093] SEQ ID NO: 73 é a sequência do construto pKR2123.

[094] SEQ ID NO: 74 é a sequência do construto pKR2122.

[095] SEQ ID NO: 75 é a sequência do construto pKR2146.

[096] SEQ ID NO: 76 é a sequência do construto pKR2145.

[097] SEQ ID NO: 77 é um motivo de sequência Lec1 conservado.

[098] SEQ ID NO: 78 é a sequência de nucleotídeos da caixa AW.

[099] SEQ ID NO: 79 é a sequência de nucleotídeos da CDS prevista para Medtr4g124660.2.

[0100] SEQ ID NO: 80 é a sequência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 79.

[0101] SEQ ID NO: 81 é a sequência de nucleotídeos prevista da região promotora de Medtr4g124660.2.

[0102] SEQ ID NO: 82 é a sequência de nucleotídeos do primer frontal oMDSP-1F.

[0103] SEQ ID NO: 83 é a sequência de nucleotídeos do primer reverso oMDSP-1R.

[0104] SEQ ID NO: 84 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2434.

[0105] SEQ ID NO: 85 é a sequência de nucleotídeos real da região promotora Medtr4g124660.2 utilizada neste estudo. de nucleotídeos do

[0106] SEQ ID NO: 86 é a sequência construto pKR2446.

[0107] SEQ ID NO: 87 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2457.

[0108] SEQ ID NO: 88 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2461.

[0109] SEQ ID NO: 89 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2465.

[0110] SEQ ID NO: 90 é a sequência de nucleotídeos de amiRNA GM-MFAD2-1B.

[0111] SEQ ID NO: 91 é a sequência de nucleotídeos de Sequência Estrela de amiRNA 396b-GM-MFAD2-1B.

[0112] SEQ ID NO: 92 é a sequência de nucleotídeos de amiRNA GM-MFAD2-2.

[0113] SEQ ID NO: 93 é a sequência de nucleotídeos de Sequência Estrela de amiRNA 159-GM-MFAD2-2.

[0114] SEQ ID NO: 94 é a sequência de nucleotídeos do precursor de miRNA genômico de soja 159.

[0115] SEQ ID NO: 95 é a sequência de nucleotídeos do precursor de miRNA genômico de soja 396b.

[0116] SEQ ID NO: 96 é a sequência de nucleotídeos do precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159-fad2-2.

[0117] SEQ ID NO: 97 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2109.

[0118] SEQ ID NO: 98 é a sequência de nucleotídeos da construto pKR2118.

[0119] SEQ ID NO: 99 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2120.

[0120] SEQ ID NO: 100 é a sequência de nucleotídeos do construto pKR2119.

[0121] SEQ ID NO: 101 é a sequência de nucleotídeos de nt 1857-1880 de SEQ ID NO: 81, que é excluída em SEQ ID NO: 85.

[0122] SEQ ID NO: 102 é a sequência de nucleotídeos de uma inserção de 25 bp entre nt 2224 e 2225 de SEQ ID NO: 81, que está presente em SEQ ID NO: 85.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0123] O relatório descritivo de cada referência detalhada no presente é integralmente incorporado ao presente como referência.

[0124] Da forma utilizada no presente e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desta forma, por exemplo, referência a “uma planta” inclui uma série dessas plantas, referência a “uma célula” inclui uma ou mais células e seus equivalentes conhecidos dos técnicos no assunto e assim por diante.

[0125] No contexto do presente relatório descritivo, são utilizados diversos termos e abreviações. São fornecidas as definições a seguir.

[0126] As expressões “monocotiledônea” e “planta monocotiledônea” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Monocotiledônea de acordo com a presente invenção inclui as gramíneas.

[0127] As expressões “dicotiledônea” e “planta dicotiledônea” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Uma dicotiledônea de acordo com a presente invenção inclui as famílias a seguir: brassicáceas, leguminosas e solanáceas.

[0128] As expressões “complemento total” e “complemento com comprimento total” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam um complemento de uma dada sequência de nucleotídeos, em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem da mesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares.

[0129] “Transgênico” designa qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, cujo genoma foi alterado pela presença de um ácido nucleico heterólogo, tal como um construto de DNA recombinante, incluindo os eventos transgênicos iniciais bem como os criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do evento transgênico inicial. O termo “transgênico”, da forma utilizada no presente, não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extracromossômico) por meio de métodos de cultivo de plantas convencionais ou de eventos de ocorrência natural tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.

[0130] “Genoma”, da forma aplicável a células vegetais, engloba não apenas DNA cromossômico encontrado no núcleo, mas DNA de organelas encontrado em componentes subcelulares (tais como mitocôndrias, plastídeos) da célula.

[0131] “Planta” inclui referência a plantas inteiras, órgãos de plantas, tecidos de plantas, propágulos de plantas, sementes, células de plantas e sua progênie. Células de plantas incluem, sem limitações, células de sementes, cultivos em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos.

[0132] “Propágulo” inclui todos os produtos de meiose e mitose capazes de propagar uma nova planta, incluindo, mas sem limitações, sementes, esporos e partes de plantas que servem de meio de reprodução vegetativa, tais como bulbos, tubérculos, brotos ou estolhos. Propágulo também inclui enxertos nos quais uma parte de uma planta é enxertada em outra parte de uma planta diferente (mesmo de espécie diferente) para criar um organismo vivo. Propágulo também inclui todas as plantas e sementes produzidas por meio de clonagem ou reunião de produtos meióticos ou permissão da reunião de produtos meióticos para formar um embrião ou ovo fertilizado (naturalmente ou com intervenção humana).

[0133] “Planta transgênica” inclui referência a uma planta que compreende no seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Preferencialmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado de forma estável no genoma, de tal forma que o polinucleotídeo seja passado para as gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado ao genoma isoladamente ou como parte de um construto de DNA recombinante.

[0134] O desenvolvimento comercial de germoplasma geneticamente aprimorado também avançou para o estágio de introdução de diversas características em plantas de safra, frequentemente denominadas abordagem de empilhamento genético. Nesta abordagem, diversos genes que conferem diferentes características de interesse podem ser introduzidos em uma planta. O empilhamento genético pode ser realizado por muitos meios, incluindo, mas sem limitações, cotransformação, retransformação e cruzamento de linhagens com diferentes transgenes. “Planta transgênica” também inclui referência a plantas que compreendem mais de um polinucleotídeo heterólogo no seu genoma. Cada polinucleotídeo heterólogo pode conferir uma característica diferente à planta transgênica.

[0135] “Heterólogo”, com relação a sequência, indica uma sequência que se origina de uma espécie exógena ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada da sua forma nativa em sua composição e/ou local genômico por meio de intervenção humana deliberada.

[0136] “Progênie” compreende qualquer geração subsequente de uma planta.

[0137] “Polinucleotídeo”, “sequência de ácido nucleico”, “sequência de nucleotídeos” ou “fragmento de ácido nucleico” são utilizados de forma intercambiável e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla e contém opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Nucleotídeos (normalmente encontrados na sua forma de 5’-monofosfato) são indicados pela sua designação de letra única conforme segue: “A” para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou desoxicitidilato, “G” para guanilato ou desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), “Y” para pirimidinas (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A, C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.

[0138] “Polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são uma substância artificial análoga a um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “sequência de aminoácidos” e “proteína” também incluem modificações que incluem, mas sem limitações, glicosilação, ligação de lipídios, sulfatação, gamacarboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[0139] “RNA mensageiro (mRNA)” indica o RNA que não contém introns e que pode ser traduzido em proteína pela célula.

[0140] “cDNA” designa um DNA que é complementar a um modelo de mRNA que utiliza a enzima transcriptase reversa e é sintetizado a partir dele. O cDNA pode possuir fita simples ou ser convertido na forma de fita dupla utilizando o fragmento Klenow de DNA polimerase I.

[0141] “Região de codificação” designa a parte de um RNA mensageiro (ou a parte correspondente de outra molécula de ácido nucleico tal como uma molécula de DNA) que codifica uma proteína ou polipeptídeo. “Região não de codificação” designa todas as partes de um RNA mensageiro ou outra molécula de ácido nucleico que não é uma região de codificação, incluindo, mas sem limitações, por exemplo, a região promotora, a região não traduzida 5’ (“UTR”), 3’ UTR, intron e terminal. As expressões “região de codificação” e “sequência de codificação” são utilizadas de forma intercambiável no presente. As expressões “região não de codificação” e “sequência não de codificação” são utilizadas de forma intercambiável no presente.

[0142] Uma “Marca de Sequência Expressa” (“EST”) é uma sequência de DNA derivada de uma biblioteca de cDNA e, portanto, é uma sequência que foi transcrita. EST é tipicamente obtida por meio de uma única passagem de sequenciamento de um inserto de cDNA.

[0143] Proteína “madura” indica um polipeptídeo processado após a tradução; ou seja, do qual quaisquer pré ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primária tenham sido removidos.

[0144] Proteína “precursora” designa o produto primário de tradução de mRNA; ou seja, com pré e pró-peptídeos ainda presentes. Pré e pró- peptídeos podem ser e não se limitam a sinais de localização intracelular.

[0145] “Isolado” indica materiais, tais como moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas, que são substancialmente livres ou tenham sido removidos de outra forma de componentes que normalmente acompanham os materiais em um ambiente de ocorrência natural ou interagem com eles. Polinucleotídeos isolados podem ser purificados a partir de uma célula hospedeira na qual ocorrem naturalmente. Métodos convencionais de purificação de ácidos nucleicos conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para a obtenção de polinucleotídeos isolados. A expressão também engloba polinucleotídeos recombinantes e polinucleotídeos sintetizados quimicamente.

[0146] As expressões “complemento total” e “complemento com comprimento total” são utilizadas de forma intercambiável no presente e designam um complemento de uma dada sequência de nucleotídeos, em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem da mesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares.

[0147] “Recombinante” designa uma combinação artificial de dois segmentos de sequências separados de outra forma, tal como por meio de síntese química ou da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por meio de métodos de engenharia genética. “Recombinante” também inclui referência a uma célula ou vetor que tenha sido modificada por meio da introdução de um ácido nucleico heterólogo ou uma célula derivada de uma célula modificada desta forma, mas não engloba a alteração da célula ou vetor por eventos de ocorrência natural (tais como mutação espontânea, transformação, transdução ou transposição natural) tais como os que ocorrem sem intervenção humana deliberada.

[0148] As expressões “construto recombinante”, “construto de expressão”, “construto quimérico”, “construto”, “construto de DNA recombinante” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Um construto recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácidos nucleicos, tais como sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Um construto quimérica pode compreender, por exemplo, sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de forma diferente da encontrada na natureza. Esse construto pode ser utilizada isoladamente ou pode ser empregada em conjunto com um vetor.

[0149] Este construto pode compreender qualquer combinação de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou nucleotídeos modificados. O construto pode ser transcrita para formar um RNA, em que o RNA pode ser capaz de formar um RNA de fita dupla e/ou estrutura de grampo de cabelo. Este construto pode ser expressa na célula, isolada ou produzida sinteticamente. O construto pode adicionalmente compreender um promotor ou outras sequências que facilitam a manipulação ou expressão do construto.

[0150] A expressão “domínio conservado” ou "motivo" indica um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma sequência alinhada de proteínas com evolução relacionada. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre proteínas homólogas, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, estabilidade ou atividade de uma proteína. Como eles são identificados pelo seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, eles podem ser utilizados como identificadores, ou “assinaturas”, para determinar se uma proteína com sequência recém determinada pertence a uma família de proteínas identificada anteriormente.

[0151] As expressões “homologia”, “homólogo”, “substancialmente similar” e “substancialmente correspondente” são utilizadas no presente de forma intercambiável. Elas se referem a fragmentos de ácidos nucleicos em que as alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico de mediar a expressão genética ou produzir um certo fenótipo. Essas expressões também designam modificações dos fragmentos de ácido nucleico tais como a exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante com relação ao fragmento inicial não modificado. Compreende-se, portanto, como apreciarão os técnicos no assunto, que a presente invenção engloba mais que os exemplos de sequências específicos.

[0152] “Sequências reguladoras” ou “elementos reguladores” são utilizados de forma intercambiável e designam sequências de nucleotídeos localizadas acima no fluxo (sequências não codificadoras 5’), no interior ou abaixo no fluxo (sequências não codificadoras 3’) de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir, mas sem limitações, promotores, sequências líderes de tradução, introns e sequências de reconhecimento de poliadenilação. As expressões “sequência reguladora e "elemento regulador" são utilizadas de forma intercambiável no presente.

[0153] “Promotor” designa um fragmento de ácido nucleico capaz de controlar a transcrição de um outro fragmento de ácido nucleico.

[0154] “Promotor funcional em uma planta” é um promotor capaz de controlar a transcrição em células vegetais, seja a sua origem ou não uma célula vegetal.

[0155] Promotores que causam a expressão de um gene na maior parte dos tipos de células na maior parte das vezes são comumente denominados “promotores constitutivos”.

[0156] Expressão constitutiva de alto nível do possível gene sob controle do promotor 35S ou UBI pode apresentar efeitos pleiotrópicos, embora a eficácia do possível gene possa ser estimada quando dirigido por um promotor constitutivo. O uso de promotores específicos de tecido e/ou específicos de tensão pode eliminar efeitos indesejáveis, mas retém a capacidade de aumento da tolerância à seca. Este efeito foi observado em Arabidopsis (Kasuga et al (1999), Nature Biotechnol. 17: 287-91).

[0157] “Promotor específico de tecido” e “promotor preferido por tecido” são utilizados de forma intercambiável para designar um promotor que é expresso predominante mas não necessariamente de forma exclusiva em um tecido ou órgão, mas que pode também ser expresso em uma célula específica.

[0158] “Promotor regulado por desenvolvimento” designa um promotor cuja atividade é determinada por eventos de desenvolvimento.

[0159] Os promotores indutíveis expressam seletivamente uma sequência de DNA ligada operativamente em resposta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, tal como por compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento. Exemplos de promotores indutíveis ou regulados incluem, por exemplo, promotores regulados pela luz, calor, tensão, cheia ou seca, patógenos, fito-hormônios, feridas ou substâncias tais como etanol, jasmonato, ácido salicílico ou aprimoradores da segurança.

[0160] Um promotor básico ou mínimo é uma molécula de polinucleotídeo que é capaz de recrutar e ligar a maquinaria de transcrição básica. Um exemplo de maquinaria de transcrição básica em células eucarióticas é o complexo de RNA polimerase II e suas proteínas acessórias.

[0161] Promotores de RNA polimerase II vegetal, como os de outros eucariotes superiores, são compostos de vários “elementos reguladores da transcrição com ação cis” distintos, ou simplesmente “elementos cis”, cada um dos quais aparentemente conferindo um aspecto diferente do controle geral da expressão genética. Exemplos desses elementos com ação cis incluem, mas sem limitações, caixa TATA e caixa CCAAT ou AGGA. O promotor pode ser aproximadamente dividido em duas partes: uma parte próxima, denominada núcleo, e uma parte distante. Acredita-se que a parte próxima seja responsável pela montagem correta do complexo de RNA polimerase II na posição correta e pela direção de um nível básico de transcrição e também é denominada “promotor mínimo” ou “promotor básico”. Acredita-se que a parte distante do promotor contenha os elementos que regulam a expressão espaço-temporal. Além das partes próximas e distantes, também foram descritas outras regiões reguladoras que contêm elementos amplificadores e/ou repressores. Estes últimos elementos podem ser encontrados em alguns pares de quilobases acima do fluxo do local de início de transcrição, nos introns ou mesmo no lado 3’ dos genes que regulam (Rombauts, S. et al (2003), Plant Physiology 132: 1162-1176, Nikolov e Burley (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 15-22), Tjian e Maniatis (1994), Cell 77: 5-8; Fessele et al, 2002 Trends Genet. 18: 60-63, Messing et al (1983), Genetic Engineering of Plants: an Agricultural Perspective, Plenum Press, Nova Iorque, págs. 211-227).

[0162] Quando ligado operativamente a uma sequência de polinucleotídeos heterólogos, um promotor controla a transcrição da sequência de polinucleotídeos ligada.

[0163] “Ligado operativamente” designa a associação de fragmentos de ácidos nucleicos em um único fragmento, de tal forma que a função de um seja regulada pelo outro. Um promotor é ligado operativamente, por exemplo, a um fragmento de ácido nucleico quando for capaz de regular a transcrição daquele fragmento de ácido nucleico.

[0164] Uma sequência de introns pode ser adicionada à região não traduzida 5’, à região de codificação de proteínas ou à região não traduzida 3’ para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Demonstrou-se que a inclusão de um intron divisível na unidade de transcrição em construções de expressão animal e vegetal aumenta a expressão genética nos níveis de mRNA e de proteína em até mil vezes. Buchman e Berg, Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405 (1988); Callis et al, Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987).

[0165] “Expressão” designa a elaboração de um produto funcional. A expressão de um fragmento de ácido nucleico pode designar, por exemplo, a transcrição do fragmento de ácido nucleico (tal como a transcrição resultante em mRNA ou RNA funcional) e/ou a tradução de mRNA em uma proteína precursora ou madura.

[0166] “Sobre-expressão” designa a elaboração de um produto genético em organismos transgênicos que excede os níveis de produção em um organismo de segregação nulo (ou não transgênico) do mesmo experimento.

[0167] “Fenótipo” indica as características detectáveis de uma célula ou organismo.

[0168] “Introduzido”, no contexto da inserção de um fragmento de ácido nucleico (tal como um construto de DNA recombinante) em uma célula, indica “transfecção”, “transformação” ou “transdução” e inclui referência à incorporação de um fragmento de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado ao genoma da célula (tal como DNA de cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou mitocôndria), convertido em uma réplica autônoma ou expresso de forma transitória (tal como mRNA transfectado).

[0169] “Célula transformada” é qualquer célula na qual foi introduzido um fragmento de ácido nucleico (tal como um construto de DNA recombinante).

[0170] “Transformação”, da forma utilizada no presente, designa transformação estável e transformação transitória.

[0171] “Transformação estável” designa a introdução de um fragmento de ácido nucleico no genoma de um organismo hospedeiro que resulta em herança geneticamente estável. Uma vez transformado de forma estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável ao genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente.

[0172] “Transformação transitória” designa a introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro que resulte em expressão genética sem herança geneticamente estável.

[0173] “Alelo” é uma dentre várias formas alternativas de um gene que ocupa um dado local sobre um cromossomo. Quando os alelos presentes em um dado local sobre um par de cromossomos homólogos em uma planta diploide forem idênticos, aquela planta é homozigótica naquele local. Caso os alelos presentes em um dado local sobre um par de cromossomos homólogos em uma planta diploide sejam diferentes, aquela planta é heterozigótica naquele local. Caso um transgene esteja presente sobre um par de cromossomos homólogos em uma planta diploide, aquela planta é hemozigótica naquele local.

[0174] O termo “cruzado” ou “cruzamento” indica a fusão de gametas por meio de polinização para produzir progênie (tais como células, sementes ou plantas). O termo engloba cruzamentos sexuados (polinização de uma planta por outra) e autocruzamento (autopolinização, tal como quando o pólen e o óvulo são da mesma planta). O termo “cruzamento” designa o ato de fundir gametas por meio de polinização para produzir progênie.

[0175] “Alelo favorável” é o alelo em um local específico que confere ou contribui com um fenótipo agronomicamente desejável, tal como aumento da digeribilidade nas paredes celulares ou, alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas com redução da digeribilidade nas paredes celulares que pode ser removido de um programa de cultivo ou plantio (“contrasseleção”). Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável ou, alternativamente, segrega com o fenótipo vegetal desfavorável, de forma a fornecer o benefício de identificação de plantas.

[0176] “Construto de DNA de supressão” é um construto de DNA recombinante que, quando transformada ou integrada de forma estável ao genoma da planta, resulta no “silenciamento” de um gene alvo na planta. O gene alvo pode ser endógeno ou transgênico para a planta. “Silenciamento”, da forma utilizada no presente com relação ao gene alvo, designa geralmente a supressão de níveis de mRNA ou proteína/enzima expressos pelo gene alvo e/ou do nível da atividade enzimática ou funcionalidade de proteína. Os termos “supressão” e “silenciamento”, utilizados de forma intercambiável no presente, incluem redução, diminuição, declínio, decréscimo, inibição, eliminação ou prevenção. “Silenciamento” ou “silenciamento genético” não especifica mecanismos e inclui, mas sem limitações, sem sentido, cossupressão, supressão viral, supressão de grampo de cabelo, supressão de haste e circuito, abordagens com base em RNAi e abordagens com base em RNA pequeno.

[0177] Um construto de DNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene alvo de interesse e pode compreender, no todo ou em parte, a sequência de ácido nucleico da fita com sentido (ou fita sem sentido) do gene alvo de interesse. Dependendo da abordagem a ser utilizada, a região pode ser 100% idêntica ou menos de 100% idêntica (tal como pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica) à fita com sentido (ou fita sem sentido) do gene de interesse, no todo ou em parte.

[0178] Construções de DNA de supressão são bem conhecidas na técnica, facilmente construídas ao selecionar-se o gene alvo de interesse e incluem, sem limitações, construções de cossupressão, construções sem sentido, construções de supressão viral, construções de supressão de grampo de cabelo, construções de supressão de haste e circuito, construções de produção de RNA com fita dupla e, de forma mais geral, construções de RNAi (interferência de RNA) e construções de RNA pequeno, tais como construções de siRNA (RNA de interferência curta) e construções de miRNA (microRNA).

[0179] “Inibição sem sentido” indica a produção de transcritos de RNA sem sentido capazes de suprimir a expressão do gene alvo ou do produto genético. “RNA sem sentido” indica um transcrito de RNA que é complementar a um transcrito primário alvo ou mRNA, no todo ou em parte, e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucleico isolado alvo (Patente Norte- Americana n° 5.107.065). A complementaridade de um RNA sem sentido pode ser com qualquer parte do transcrito genético específico, ou seja, na sequência não codificadora 5’, sequência não codificadora 3’, introns ou a sequência de codificação.

[0180] “Cossupressão” indica a produção de transcritos de RNA com sentido capazes de suprimir a expressão do gene alvo ou produto genético. RNA “com sentido” designa o transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. Construções de cossupressão em plantas foram projetadas anteriormente por meio de concentração na sobre-expressão de uma sequência de ácidos nucleicos que possui homologia para um mRNA nativo, na orientação com sentido, o que resulta na redução de todo o RNA que possui homologia para a sequência sobre- expressa (vide Vaucheret et al, Plant J. 16: 651-659 (1998); e Gura, Nature 404: 804-808 (2000)).

[0181] Uma outra variação descreve o uso de sequências virais de plantas para dirigir a supressão de sequências de codificação de mRNA próximas (Patente PCT n° WO 98/36083, publicada em vinte de agosto de 1998).

[0182] A interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento genético pós-transcrição específico de sequências em animais mediado por RNAs interferentes curtos (siRNAs) (Fire et al, Nature 391: 806 (1998)). O processo correspondente em plantas é comumente denominado silenciamento genético pós-transcrição (PTGS) ou silenciamento de RNA e também é denominado supressão em fungos. Acredita-se que o processo de silenciamento genético pós-transcrição seja um mecanismo de defesa celular conservado por evolução utilizado para evitar a expressão de genes exógenos e é comumente compartilhado por flora e filos diversos (Fire et al, Trends Genet. 15: 358 (1999)).

[0183] RNAs pequenos desempenham um papel importante no controle da expressão genética. A regulagem de muitos processos de desenvolvimento, incluindo a floração, é controlada por RNAs pequenos. Agora é possível elaborar alterações na expressão genética de genes de plantas utilizando construções transgênicas que produzem RNAs pequenos na planta.

[0184] RNAs pequenos aparentemente funcionam por meio de emparelhamento de bases a sequências alvo de RNA ou DNA complementares. Quando unidos a RNA, RNAs pequenos acionam a divisão de RNA ou a inibição de tradução da sequência alvo. Quando unidos a sequências alvo de DNA, acredita-se que RNAs pequenos possam mediar a metilação de DNA da sequência alvo. A consequência desses eventos, independentemente do mecanismo específico, é a inibição da expressão genética.

[0185] MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificadores com cerca de 19 a cerca de 24 nucleotídeos (nt) de comprimento que foram identificados em animais e plantas (Lagos-Quintana et al, Science 294: 853-858 (2001), Lagos-Quintana et al, Curr. Biol. 12: 735-739 (2002); Lau et al, Science 294: 858-862 (2001); Lee e Ambros, Science 294: 862-864 (2001); Llave et al, Plant Cell 14: 1605-1619 (2002); Mourelatos et al, Genes Dev. 16: 720-728 (2002); Park et al, Curr. Biol. 12: 1484-1495 (2002); Reinhart et al, Genes Dev. 16: 1616-1626 (2002)). Eles são processados a partir de transcritos precursores mais longos que variam de tamanho de cerca de 70 a 200 nt e esses transcritos precursores possuem a capacidade de formar estruturas de grampos de cabelo estáveis.

[0186] MicroRNAs (miRNAs) aparentemente regulam genes alvo por meio de ligação a sequências complementares localizadas nos transcritos produzidos por esses genes. Parece provável que miRNAs possam iniciar pelo menos dois trajetos de regulagem de genes alvo: (1) inibição da tradução; e (2) divisão de RNA. MicroRNAs que iniciam o processo de divisão de RNA são análogos aos RNAs interferentes curtos (siRNAs) com 21 a 25 nt gerados durante interferência de RNA (RNAi) em animais e silenciamento genético pós- transcrição (PTGS) em plantas e provavelmente são incorporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que é similar ou idêntico ao observado para RNAi.

[0187] Fatores de transcrição são proteínas que geralmente ligam DNA em forma específica de sequências e ativam ou reprimem o início da transcrição. Pelo menos três tipos de domínios separados foram identificados em fatores de transcrição. Um é necessário para reconhecimento de DNA específico de sequências, um para ativação/repressão de início de transcrição e um para a formação de interações entre proteínas (tal como dimerização). Estudos indicam que muitos fatores de transcrição de plantas podem ser agrupados em classes distintas com base nos seus domínios de ligação de DNA conservados (Katagiri, F. e Chua, N. H., 1992, Trends Genet. 8: 22-27; Menkens, A. E., Schindler, U. e Cashmore, A. R., 1995, Trends in Biochem. Sci. 13: 506510; Martin, C. e Paz-Ares, J., 1997, Trends Genet. 13: 67-73). Cada membro dessas famílias interage e liga-se com motivos de sequência de DNA distintos que frequentemente são encontrados em diversos promotores genéticos controlados por diferentes sinais reguladores.

[0188] Proteínas de Desenvolvimento de Óvulos (ODP) são fatores de transcrição que contêm dois domínios AP2. Fatores de transcrição AP2 (denominados a seguir, de forma intercambiável, “fatores de transcrição de domínio AP2”, “proteínas AP2”, “fatores de transcrição de AP2/EREBP” ou “proteínas de fator de transcrição de AP2”) tais como ODP ativam diversos genes no processo biossintético de óleo ou TAG na célula vegetal.

[0189] O termo “ODP1” designa uma proteína de desenvolvimento de óvulos 1 que é envolvida com o teor de óleo crescente. ODP1 é um membro da família de proteínas APETALA2 (AP2) que desempenha papel em uma série de eventos biológicos que incluem, mas sem limitações, teor de óleo.

[0190] O Pedido de Patente Norte-Americano n° 61/165.548 descreve o uso de um gene ODP1 de alteração de características de óleo em plantas. A Patente Norte-Americana n° 7.579.529 descreve um fator de transcrição de domínio AP2 e métodos de sua utilização. A Patente Norte- Americana n° 7.157.621 descreve o uso de fator de transcrição ODP1 para aumento do teor de óleo em plantas. O Pedido de Patente da DuPont n° WO 2010/114989 descreve o uso de um promotor Sus2 de Arabidopsis para dirigir a expressão de ODP1 (WRI1) em Arabidopsis.

[0191] O suposto fator de transcrição de AP2/EREBP WRINKLED1 (WRI1) é envolvido na regulagem do metabolismo de armazenagem de sementes em Arabidopsis (Cernac e Benning (2004), Plant J. 40: 575-585). A expressão do cDNA de WRI1 sob o controle do promotor 35S de CaMV gerou aumento do teor de óleo das sementes. Mudas de acúmulo de óleo, entretanto, exibiram desenvolvimento aberrante consistente com um estado embriônico prolongado. Moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos similares a WRINKLED1 e métodos de uso também são descritas na Patente Internacional publicada n° WO 2006/00732 A2.

[0192] A família AP2/EREBP de proteínas é uma classe específica de plantas de supostos fatores de transcrição que se demonstrou regularem uma ampla variedade de processos de desenvolvimento e são caracterizadas pela presença de um domínio de ligação de DNA AP2/ERF. Especificamente, AP2 (APETALA2) e EREBPs (proteínas de ligação de elemento reagente a etileno) são os membros prototípicos de uma família de fatores de transcrição exclusiva de plantas, cuja característica diferenciadora é o fato de que elas contêm o chamado domínio de ligação de DNA AP2. Análise da sequência de DNA sugere que AP2 codifica um polipeptídeo teórico com 432 aminoácidos, com um motivo repetido com 68 aminoácidos distinto denominado domínio AP2. Demonstrou-se que este domínio é essencial para funções de AP2 e contém, dentro do motivo com 68 aminoácidos, uma região central com 18 aminoácidos que se prevê formar uma hélice α anfifática (Jofuku et al,, Plant Cell 6:1211-1225, 1994). Fatores de transcrição que contêm domínio similar a AP2 foram também identificados em Arabidopsis thaliana (Okamuro et al (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 7076-7081) e em fumo com a identificação das proteínas de ligação de elementos reagentes a etileno (EREBPs) (Ohme-Takagi e Shinshi (1995), Plant Cell 7: 2: 173-182).

[0193] Proteínas HAP constituem uma grande família de fatores de transcrição identificados em primeiro lugar em levedura. Elas se combinam para formar um complexo de proteínas heteroméricas que ativa a transcrição por meio de ligação a caixas CCAAT em promotores eucarióticos. As proteínas Hap ortólogas exibem alto grau de conservação evolucionária nos seus domínios funcionais em todas as espécies estudadas até aqui (Li et al (1992), Nucleic Acids Res., 20: 1087-1091).

[0194] Cotilédone folhoso 1 (Lec1 ou Lec1/Hap3) é um fator de transcrição que é regulador fundamental do desenvolvimento de sementes em plantas. Lec1 é um fator de transcrição do tipo fator de ligação de CCAAT (CBF). As expressões “cotilédone folhoso 1”, “Lec1” e “Hap3/Lec1” são utilizadas de forma intercambiável no presente. O polipeptídeo LEC1 é homólogo à subunidade HAP3 da classe CBF de ativadores da transcrição eucariótica que inclui NF-Y, CP1 e HAP2/3/4/5 (Lotan et al (1998), Cell, Vol. 93, 1195-1205, 26 de junho).

[0195] O gene de cotilédone folhoso 1 (LEC1) controla muitos aspectos distintos da embriogênese. A mutação lec1 é pleiotrópica, o que sugere que LEC1 desempenha diversos papéis no desenvolvimento posterior de embriões. LEC1 é necessário, por exemplo, para aspectos específicos de amadurecimento de sementes, inibição da germinação prematura e desempenha papel na especificação da identidade de órgãos embriônicos. Por fim, LEC1 aparentemente age apenas durante o desenvolvimento de embriões.

[0196] A Patente Norte-Americana n° 6.235.975 descreve genes de cotilédone folhoso 1 e seus usos. Um pedido de patente norte-americano pendente (o Pedido Norte-Americano n° 11/899370) refere-se a fragmentos de ácidos nucleicos isolados que codificam fatores de transcrição relativos a Lec1. As Patentes Norte-Americanas n° 7.294.759, 7.157.621, 7.888.560 e 6.825.397 descrevem o uso de genes Lec1 para alterar o teor de óleo em plantas.

[0197] Em Arabidopsis, demonstrou-se que Lec1 regula a expressão de genes biossintéticos de ácidos graxos e também se demonstrou que Lec1 está envolvido no desenvolvimento de embriões (Mu et al, Plant Physiology (2008) 148: 1042-1054; Lotan et al (1998), Cell, Vol. 93, 1195-1205, 26 de junho; Patente PCT publicada n° WO/1998037184 e Patentes Norte- Americanas n° 6.235.975, 6.320.102 e 6.545.201; Patente PCT publicada n° WO 2001/064022 e Patente Norte-Americana n° 6.781.035, Braybrook, S. A. e Harada, J. J. (2008), Trends Plant Sci. 13 (12): 1360-1385).

[0198] WO 99/67405 descreve genes de cotilédone folhoso 1 e seus usos. Demonstrou-se que um homólogo de Lec1 de milho do gene controlador da embriogênese de Arabidopsis AtLEC1 aumenta o teor de óleo e a eficiência de transformação em plantas. Vide, por exemplo, WO 03001902 e a Patente Norte-Americana n° 6.512.165.

[0199] Outros polipeptídeos que influenciam o desenvolvimento de óvulos e embriões e estimulam o crescimento celular, tais como Lec1, Kn1, WUSCHEL, Zwille e Aintegumeta (ANT) permitem maior eficiência de transformação quando expressos em plantas. Vide, por exemplo, o Pedido Norte-Americano n° 2003/0135889, incorporada ao presente como referência. De fato, demonstrou-se que um homólogo de Lec1 de milho do gene controlador da embriogênese de Arabidopsis AtLEC1 aumenta o teor de óleo e a eficiência de transformação em plantas. Vide, por exemplo, WO 03001902 e a Patente Norte-Americana n° 6.512.165.

[0200] Homólogos de Lec1 podem ser adicionalmente identificados utilizando motivos de sequência conservados, tais como a sequência de aminoácidos a seguir (fornecida em código de uma letra, em que “x” representa qualquer aminoácido) (Pedido Norte-Americano n° 60/301.913). Os aminoácidos sublinhados na sequência a seguir são aqueles que são conservados em Lec1 mas não encontrados em proteínas relativas a Lec1: REQDxxMPxANVxRIMRxxLPxxAKISDDAKExIQECVSExISFxTxEAN xRCxxxxRKTxxxE (SEQ ID NO: 77).

[0201] Os termos “FUS3” e “FUSCA3” são utilizados de forma intercambiável no presente. FUSCA3 é um fator de transcrição com um domínio B3 similar a VP1/ABI3 conservado que possui importância funcional para a regulagem do amadurecimento de sementes em Arabidopsis thaliana. Ele controla o tempo de desenvolvimento em Arabidopsis por meio dos hormônios giberelina e ácido abscísico e é regulado pelo fator de transcrição de Lec1 (Luerssen et al (1998), Plant J. (1998) 15 (6): 755-7; Stone et al (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (20): 11806-11811; Lee et al (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (4): 2152-2156, Patentes Norte-Americanas n° 7.511.190 e 7.446.241; Patente PCT publicada n° WO 1998021336; Patente PCT publicada n° WO 2008157226, Braybrook, S. A. e Harada, J. J. (2008), Trends Plant Sci. 13 (12): 1360-1385). A Patente Norte-Americana n° 7.612.253 descreve métodos de modulação de processos relativos a citoquinina em plantas utilizando proteínas de domínio B3 com uma série de homólogos de fusca3.

[0202] “Diacilglicerol aciltransferase” ou “DGAT” (também denominada “acil-CoA-diacilglicerol aciltransferase” ou “diacilglicerol O- aciltransferase”) (EC 2.3.1.20) é uma proteína de membrana integral que catalisa a etapa enzimática final na produção de triacilgliceróis em plantas, fungos e mamíferos. Esta enzima é responsável pela transferência de um grupo acila de acil-coenzima A para a posição sn-3 de 1,2-diacilglicerol (“DAG”) para formar triacilglicerol (“TAG”). DGAT é associado a frações de corpo de lipídio e membrana em plantas e fungos, particularmente em oleaginosas, nas quais contribui para a armazenagem de carbono utilizado como reserva de energia. DGAT é conhecido por regular a estrutura de TAG e dirigir a síntese de TAG. Além disso, sabe-se que a reação de DGAT é específica para a síntese de óleo (Lardizabal et al, J. Biol. Chem. 276 (42): 38862-28869 (2001)).

[0203] Foram identificadas duas famílias diferentes de proteínas DGAT. A primeira família de proteínas DGAT (“DGAT1”) é relacionada à acil- coenzima A: aciltransferase de colesterol (“ACAT”) e foi descrita nas Patentes Norte-Americanas n° 6.100.077 e 6.344.548. Uma segunda família de proteínas DGAT (“DGAT2”) não é relacionada com a família DGAT1 e é descrita na Patente PCT publicada WO 2004/011671, publicada em cinco de fevereiro de 2004. Outras referências a genes DGAT e seu uso em plantas incluem a Patente PCT publicada n° WO 1998/055.631 e a Patente Norte-Americana n° 6.822.141.

[0204] “DGAT” e “aciltransferase de diacilglicerol” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam qualquer membro ou combinação da família de proteínas DGAT1 ou DGAT2.

[0205] Genes DGAT de plantas e fungos foram descritos anteriormente (Patentes Norte-Americanas n° 7.198.937 e 7.465.565; Patente Norte-Americana publicada n° 20080295204 e Pedidos Norte-Americanos n° 12/470569 e 12/470517).

[0206] A expressão “ácidos graxos” designa ácidos alifáticos de cadeia longa (ácidos alcanoicos) com comprimentos de cadeia variáveis de cerca de C12 a C22 (embora sejam conhecidos ácidos com comprimento de cadeia mais longo e mais curto). Os comprimentos de cadeia predominantes são de C16 a C22. A estrutura de um ácido graxo é representada por um sistema de notação simples de “X:Y”, em que X é o número total de átomos de carbono (C) no ácido graxo específico e Y é o número de ligações duplas.

[0207] Geralmente, ácidos graxos são classificados como saturados ou insaturados. A expressão “ácidos graxos saturados” designa os ácidos graxos que não possuem “ligações duplas” entre a sua cadeia principal de carbono. Por outro lado, “ácidos graxos insaturados” contêm “ligações duplas” ao longo das suas cadeias principais de carbono (que se encontram mais comumente na configuração cis). “Ácidos graxos monoinsaturados” contêm apenas uma “ligação dupla” ao longo da cadeia principal de carbono (tal como normalmente entre o 9° e o 10° átomo de carbono como para ácido palmitoleico (16:1) e ácido oleico (18:1)), enquanto “ácidos graxos póli-insaturados” (ou “PUFAs”) contêm pelo menos duas ligações duplas ao longo da cadeia principal de carbono (tal como entre o 9° e o 10°, 12° e 13° átomo de carbono para ácido linoleico (18:2) e entre o 9° e o 10°, 12° e 13° e 15° e 16° para ácido a-linolênico (18:3)).

[0208] “Corpos de lipídios” designam gotículas de lipídios que normalmente são delimitadas por proteínas específicas e uma monocamada de fosfolipídio. Essas organelas são locais onde a maior parte dos organismos transporta/armazena lipídios neutros. Acredita-se que corpos de lipídios surjam de microdomínios do retículo endoplasmático que contêm enzimas de biossíntese de TAG; e sua síntese e tamanho aparentemente são controlados por componentes específicos de proteínas.

[0209] “Lipídios neutros” designam os lipídios comumente encontrados em células em corpos de lipídios na forma de óleos e gorduras de armazenagem e recebem esse nome porque, sob pH celular, os lipídios não contêm grupos carregados. Geralmente, eles são completamente não polares sem afinidade para água. Lipídios neutros geralmente designam mono, di e/ou triésteres de glicerol com ácidos graxos, também denominados monoacilglicerol, diacilglicerol ou TAG, respectivamente (ou, coletivamente, acilgliceróis). É necessário que ocorra uma reação de hidrólise para liberar ácidos graxos livres de acilgliceróis.

[0210] O termo “óleo” designa uma substância de lipídio que é líquida a 25 °C e normalmente póli-insaturada. Por outro lado, o termo “gordura” designa uma substância de lipídio que é sólida a 25 °C e normalmente saturada.

[0211] Os termos “triacilglicerol”, “óleo” e “TAGs” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam lipídios neutros compostos de três resíduos acila graxos esterificados em uma molécula de glicerol (e esses termos serão utilizados de forma intercambiável ao longo de todo o presente relatório descritivo). Esses óleos podem conter PUFAs de cadeia longa (ácidos graxos póli-insaturados), bem como ácidos graxos saturados e insaturados mais curtos e ácidos graxos saturados de cadeia mais longa. Desta forma, “biossíntese de óleo” designa genericamente a síntese de TAGs na célula (Patentes PCT n° WO 2005063988, WO 2007087492, WO 2007101273 e WO 2007103738, Patente Norte-Americana n° 7.812.216).

[0212] O teor de óleo e proteína em sementes pode ser determinado utilizando espectroscopia próxima de infravermelho por meio de métodos familiares dos técnicos no assunto (Agelet et al (2012), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (34): 8314-8322). Um aparelho e métodos de análise NIR de sementes isoladas e múltiplas sementes foram descritos na Patente Norte-Americana n° 7.508.517, incorporada ao presente como referência). Métodos adicionais de análise da composição de sementes são fornecidos na Patente Norte-Americana n° 8.143.473, incorporada ao presente como referência).

[0213] Medicago trunculata é um legume pequeno nativo da região do Mediterrâneo que é utilizado em pesquisas genômicas. Esta espécie vem sendo utilizada como modelo de organismo para a biologia de legumes, pois possui um genoma diploide pequeno, é autofértil, possui rápido tempo de geração e produção prolífica de sementes e é propensa a transformação genética.

[0214] A expressão “sacarose sintase” (SUS) designa uma enzima utilizada no metabolismo de carboidratos que catalisa a conversão reversível de sacarose e difosfato de uridina (UDP) em UDP-glicose e frutose in vitro. As expressões “sacarose sintase de soja 2” e “GmSuS” são utilizadas de forma intercambiável no presente. O gene sacarose sintase de soja é do local genômico Glyma13g17420.

[0215] O termo “germinação” designa o processo por meio do qual uma semente dormente começa a brotar e crescer em uma muda.

[0216] “Germinação normal”, da forma utilizada no presente, designa velocidade de germinação de semente de uma planta transgênica que compreende o construto de DNA recombinante que é de pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da taxa de germinação observada, sob as mesmas condições, de sementes de uma planta controle correspondente que não compreende o construto de DNA recombinante.

[0217] Em uma realização da presente invenção, os “elementos reguladores da transcrição com ação cis” da sequência promotora descritos no presente podem ser ligados operativamente a “elementos reguladores da transcrição com ação cis” de qualquer promotor heterólogo. Essa molécula promotora quimérica pode ser elaborada para ter propriedades regulatórias desejadas. Em uma realização da presente invenção, um fragmento da sequência promotora descrita que pode agir como sequência regulatória cis, sequência regulatória distante, sequência amplificadora ou sequência repressora pode ser combinado com uma sequência regulatória cis, regulatória distante, amplificadora, repressora ou qualquer combinação de quaisquer destas de uma sequência promotora heteróloga.

[0218] Em uma realização relacionada, um elemento cis do promotor descrito pode conferir especificidade particular tal como conferir expressão aprimorada de moléculas de polinucleotídeos ligadas operativamente em certos tecidos e, portanto, também é capaz de regular a transcrição de moléculas de polinucleotídeos ligadas operativamente. Consequentemente, quaisquer fragmentos, partes ou regiões do promotor que compreendem a sequência de polinucleotídeos exibida em SEQ ID NO: 3 podem ser utilizados como moléculas de polinucleotídeos regulatórias.

[0219] Fragmentos promotores que compreendem elementos regulatórios podem ser adicionados, por exemplo, fundidos à extremidade 5’ ou inseridos em outro promotor que possui as suas próprias sequências regulatórias parciais ou completas (Fluhr et al, Science 232: 1106-1112, 1986; Ellis et al, EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter e Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 84: 8986-8990, 1987; Poulsen e Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai et al, Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1991; 1987; Aryan et al, Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).

[0220] Elementos cis podem ser identificados por meio de uma série de métodos, que incluem análise de exclusão, ou seja, exclusão de um ou mais nucleotídeos da extremidade 5’ ou interna para um promotor; análise de proteínas de ligação de DNA utilizando pegada de DNase I; interferência de metilação; testes de mudança de mobilidade de eletroforese; pegada genômica in vivo por meio de PCR mediado por ligação; e outros testes convencionais; ou por meio de similaridade de sequências com motivos de elementos cis conhecidos por meio de métodos de comparação de sequências convencionais. A estrutura fina de um elemento cis pode ser adicionalmente estudada por meio de mutagênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou de outros métodos convencionais (vide, por exemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, págs. 397-422; e Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al, Eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, págs. 233-300).

[0221] Elementos cis podem ser obtidos por meio de síntese química ou de clonagem de promotores que incluem esses elementos e podem ser sintetizados com sequências laterais adicionais que contêm locais de enzimas de restrição úteis para facilitar a manipulação subsequente. Fragmentos promotores podem também compreender outros elementos reguladores tais como domínios amplificadores, que podem ser adicionalmente úteis para o construto de moléculas quiméricas.

[0222] Métodos de construto de promotores variantes e quiméricos de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, a combinação de elementos de controle de diferentes promotores ou a duplicação de partes ou regiões de um promotor (vide, por exemplo, a Patente Norte- Americana n° 4.990.607, a Patente Norte-Americana n° 5.110.732; e a Patente Norte-Americana n° 5.097.025). Os técnicos no assunto são familiares com os materiais de recursos padrão que descrevem condições e procedimentos específicos de construto, manipulação e isolamento de macromoléculas (tais como moléculas de polinucleotídeos e plasmídeos), bem como a geração de organismos recombinantes e a seleção e isolamento de moléculas de polinucleotídeos.

[0223] Em uma realização da presente invenção, o promotor de sacarose sintase de soja descrito no presente pode ser modificado. Os técnicos no assunto podem criar promotores que possuem variações da sequência de polinucleotídeos. A sequência de polinucleotídeos do promotor de acordo com a presente invenção conforme exibido em SEQ ID NO: 8 pode ser modificada ou alterada para aprimorar as suas características de controle. Como apreciarão os técnicos comuns no assunto, modificações ou alterações da sequência promotora podem também ser elaboradas sem afetar substancialmente a função promotora. Os métodos são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. As sequências podem ser modificadas, por exemplo, por meio de inserção, exclusão ou substituição de sequências modelo em uma abordagem de modificação de DNA com base em PCR.

[0224] A presente invenção engloba fragmentos funcionais e variantes da sequência promotora descrita no presente.

[0225] “Fragmento funcional” no presente é definido como qualquer subconjunto de nucleotídeos contíguos da sequência promotora descrita no presente que pode realizar função idêntica ou substancialmente similar à sequência promotora com comprimento total descrita no presente. “Fragmento funcional” com função substancialmente similar ao promotor com comprimento total descrito no presente designa um fragmento funcional que mantém, em grande parte, o mesmo nível de atividade da sequência promotora com comprimento total e exibe o mesmo padrão de expressão da sequência promotora com comprimento total. “Fragmento funcional” da sequência promotora descrita no presente exibe expressão constitutiva.

[0226] Uma realização da presente invenção é um fragmento funcional de SEQ ID NO: 8 que compreende pelo menos 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 ou 3000 nucleotídeos contíguos a partir da extremidade 3’ da sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85.

[0227] “Variante”, da forma utilizada no presente, é a sequência do promotor ou a sequênica de um fragmento funcional de um promotor que contém alterações nas quais um ou mais nucleotídeos da sequência original são excluídos, adicionados e/ou substituídos, mantendo substancialmente ao mesmo tempo a função promotora. Um ou mais pares de bases podem ser inseridos, excluídos ou substituídos internamente a um promotor. No caso de um fragmento promotor, promotores variantes podem incluir alterações que afetam a transcrição de um promotor mínimo ao qual é ligado operativamente. Promotores variantes podem ser produzidos, por exemplo, por métodos de mutagênese de DNA padrão ou por meio de síntese química do promotor variante ou uma de suas partes. Polinucleotídeos variantes também englobam sequências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como comutação de DNA. Com esse procedimento, um ou mais elementos cis para o promotor podem ser manipulados para criar um novo domínio amplificador. Desta forma, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos com sequências relacionadas que compreendem regiões de sequências que possuem identidade de sequências substancial e podem ser recombinadas de forma homóloga in vitro ou in vivo. Estratégias dessa comutação de DNA são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 1074710751; Stemmer (1994), Nature 370: 389-391; Crameri et al (1997), Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al (1997), J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 4504-4509; Crameri et al (1998), Nature 391: 288-291; e Patentes Norte-Americanas n° 5.605.793 e 5.837.458.

[0228] Substituições, exclusões, inserções ou quaisquer de suas combinações podem ser combinadas para produzir um construto final.

[0229] Para polinucleotídeos, variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de métodos de biologia molecular bem conhecidos, tais como métodos de hibridização e reação em cadeia de polimerase (PCR) conforme descrito no presente. Geralmente, variantes de um polinucleotídeo específico de acordo com a presente invenção possuirão identidade de sequências de pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com aquele polinucleotídeo específico conforme determinado por meio de programas de alinhamento de sequências e parâmetros descritos em outro ponto do presente. Uma variante biologicamente ativa de um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção pode diferir daquela sequência em até 1-15 resíduos de ácidos nucleicos, até 1-10, tal como 6-10, até 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou até 1 resíduo de ácido nucleico.

[0230] O promotor de acordo com a presente invenção pode também ser um promotor que compreende uma sequência de nucleotídeos hibridizável sob condições estringentes com a fita complementar da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85.

[0231] A hibridização dessas sequências pode ser conduzida sob condições estringentes. As expressões “condições estringentes” e “condições de hibridização estringentes”, da forma utilizada no presente, designam condições sob as quais uma sonda se hibridizará na sua sequência alvo até um grau detectavelmente maior que em outras sequências (tais como pelo menos duas vezes sobre o fundo). Condições estringentes são dependentes de sequências e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, podem ser identificadas sequências alvo que são 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta de coincidência nas sequências, de tal forma que sejam detectados alguns graus mais baixos de similaridade (sondagem heteróloga).

[0232] A expressão “sob condições estringentes” indica que duas sequências hibridizam-se sob condições de moderada ou alta estringência. Mais especificamente, condições moderadamente estringentes podem ser facilmente determinadas pelos técnicos comuns no assunto, dependendo, por exemplo, do comprimento de DNA. As condições básicas são descritas por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, capítulos 6 e 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, e incluem o uso de uma solução de lavagem prévia de filtros de nitrocelulose 5xSSC, 0,5% SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0), condições de hibridização de cerca de 50% de formamida, 2xSSC a 6xSSC a cerca de 40-50 °C (ou outras soluções de hibridização similares, tais como solução de Stark, em cerca de 50% de formamida a cerca de 42 °C) e condições de lavagem de, por exemplo, cerca de 40-60 °C, 0,5-6xSSC, 0,1% de SDS. Preferencialmente, condições de estringência moderada incluem hibridização (e lavagem) a cerca de 50 °C e 6xSSC. Condições de alta estringência podem também ser facilmente determinadas pelos técnicos no assunto, dependendo, por exemplo, do comprimento de DNA.

[0233] Geralmente, essas condições incluem hibridização e/ou lavagem sob temperatura mais alta e/ou concentração de sais mais baixa (tal como hibridização a cerca de 65 °C, 6xSSC a 0,2xSSC, preferencialmente 6xSSC, de maior preferência 2xSSC e, de preferência superior, 0,2xSSC), em comparação com as condições de estringência moderada. Condições de alta estringência podem incluir, por exemplo, hibridização conforme definido acima e lavagem a cerca de 65-68 °C, 0,2xSSC, 0,1% SDS. SSPE (1xSSPE é 0,15 M de NaCl, 10 mM de NaH2PO4 e 1,25 mM de EDTA, pH 7,4) pode ser substituído por SSC (1xSSC é 0,15 M de NaCl e 15 mM de citrato de sódio) nos tampões de hibridização e lavagem; a lavagem é realizada por quinze minutos após o término da hibridização.

[0234] Podem também ser atingidas condições estringentes com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida.

[0235] Também é possível utilizar um kit de hibridização disponível comercialmente que não utiliza substância radioativa como sonda. Exemplos específicos incluem hibridização com um sistema de detecção e marcação direta de ECL (Amersham). Condições estringentes incluem, por exemplo, hibridização a 42 °C por quatro horas utilizando o tampão de hibridização incluído no kit, que é suplementado com 5% (p/v) de reagente de bloqueio e 0,5 M de NaCl e lavagem por duas vezes em 0,4% de SDS, 0,5xSSC a 55 °C por vinte minutos e uma vez em 2xSSC à temperatura ambiente por cinco minutos.

[0236] Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sais é de menos de cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íons de Na (ou outros sais) sob pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (tais como dez a cinquenta nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (tais como mais de cinquenta nucleotídeos). Exemplos de condições de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37 °C e lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaCl/0,3 M de citrato trissódico) a 50-55 °C. Exemplos de condições de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C e lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 até 60 °C. Exemplos de condições de alta estringência incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37 °C e lavagem final em 0,1X SSC a 60 até 65 °C pelo período de pelo menos trinta minutos. A duração da hibridização é geralmente de menos de cerca de 24 horas, normalmente cerca de quatro a cerca de doze horas. A duração do tempo de lavagem será de pelo menos um período de tempo suficiente para atingir o equilíbrio.

[0237] A especificidade é tipicamente função de lavagens pós- hibridização, em que os fatores críticos são a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, Tm (ponto de fusão térmica) pode ser aproximado por meio da equação de Meinkoth e Wahl (1984), Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes; %GC é o percentual de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % form é o percentual de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob pH e resistência iônica definidos) em que 50% de uma sequência alvo complementar hibridizam-se em uma sonda perfeitamente coincidente. A Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de falta de coincidência; desta forma, Tm, condições de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridização em sequências com a identidade desejada. Caso sejam procuradas sequências com > 90% de identidade, por exemplo, a Tm pode ser reduzida em 10 °C. Geralmente, são selecionadas condições estringentes cerca de 5 °C mais baixas que a Tm para a sequência específica e seu complemento sob pH e resistência iônica definidos. Condições severamente estringentes podem utilizar, entretanto, hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menos que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menos que a Tm; condições de baixa estringência podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menos que a Tm. Utilizando a equação, composições de lavagem e hibridização e Tm desejadas, os técnicos comuns no assunto compreenderão que são inerentemente descritas variações na estringência de soluções de lavagem e/ou hibridização. Caso o grau desejado de falta de emparelhamento resulte em Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), prefere-se aumentar a concentração de SSC de forma que possa ser utilizada temperatura mais alta. Um extenso guia da hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al, eds. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova Iorque). Vide também Sambrook.

[0238] Em uma realização da presente invenção, sequências isoladas que possuem atividade promotora específica de sementes e hibridizam- se sob condições estringentes na sequência promotora de sacarose sintase de soja descrita no presente ou seus fragmentos são englobadas pela presente invenção. Geralmente, são selecionadas condições estringentes cerca de 5 °C mais baixas que a Tm para a sequência específica sob pH e resistência iônica definidos. Condições estringentes englobam, entretanto, temperaturas na faixa de cerca de 1 °C a cerca de 20 °C abaixo da Tm, dependendo do grau desejado de estringência ou de outra forma estabelecida no presente.

[0239] Os técnicos no assunto compreendem que diferentes sequências terminais podem ser utilizadas para as construções descritas na presente invenção. Os terminais incluem, mas sem limitações, terminal faseolina 3’ de feijão (WO 2004/071467), Glycine max Myb2 3’ (Pedido Norte-Americano n° 12/486793), inibidor tripsina kunitz 3’ de Glycine max (WO 2004/071467), BD30 (também denominado P34) 3’ de Glycine max (WO 2004/071467), legumina A2 3’ de Pisum sativum (WO 2004/071467) e albumina 2S 3’ de Glycine max (WO 2004/071467).

[0240] Além disso, WO 2004/071467 e a Patente Norte- Americana n° 7.129.089 descrevem a ligação adicional entre si de conjuntos terminais promotores/genéticos/de transcrição individuais em combinações e orientações exclusivas, em conjunto com conjuntos marcadores selecionáveis apropriados, a fim de obter a expressão fenotípica desejada. Embora isso seja feito principalmente utilizando diferentes locais de enzimas de restrição, os técnicos no assunto podem apreciar que diversos métodos podem ser utilizados para atingir as orientações ou a combinação de terminais promotores/genéticos/de transcrição desejados. Ao fazê-lo, qualquer combinação ou orientação de conjuntos de terminais promotores/genéticos/de transcrição específicos de embrião pode ser atingida. Os técnicos no assunto podem também apreciar que esses conjuntos podem estar localizados sobre fragmentos de DNA individuais ou sobre diversos fragmentos em que a coexpressão de genes é o resultado da cotransformação de diversos fragmentos de DNA.

[0241] Cálculos de percentual de identidade e alinhamentos de sequências podem ser determinados utilizando uma série de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas, incluindo, mas sem limitações, o programa MEGALIGN® da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison WI). A menos que indicado em contrário, o alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente foi realizado utilizando o método Clustal V de alinhamento (Higgins e Sharp (1989), CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando o método Clustal V são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal V, é possível obter valores de “percentual de identidade” e “divergência” observando-se a tabela “distâncias de sequências” no mesmo programa; a menos que indicado em contrário, os percentuais de identidade e divergências fornecidos e reivindicados no presente foram calculados desta forma.

[0242] Alternativamente, pode ser utilizado o método de alinhamento Clustal W. O método de alinhamento Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, D. G. et al, Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) pode ser encontrado no programa MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). Os parâmetros padrão de alinhamento múltiplo correspondem a PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 0,2, Sequências Divergentes de Atraso = 30%, Peso de Transição de DNA = 0,5, Matriz em Peso de Proteína = Série Gonnet, Matriz em Peso de DNA = IUB. Para alinhamentos em pares, os parâmetros padrão são Alinhamento = Lento-Preciso, Penalidade do Intervalo = 10,0, Comprimento do Intervalo = 0,10, Matriz em Peso de Proteína = Gonnet 250 e Matriz em Peso de DNA = IUB. Após alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal W, é possível obter valores de “percentual de identidade” e “divergência” observando a tabela “distâncias de sequências” no mesmo programa.

[0243] Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook”).

COMPOSIÇÕES

[0244] Uma composição de acordo com a presente invenção é uma planta que compreende no seu genoma qualquer das construções de DNA recombinantes (incluindo qualquer das construções de DNA de supressão) de acordo com a presente invenção (tais como quaisquer das construções discutidas acima). As composições também incluem qualquer progênie da planta e qualquer semente obtida da planta ou sua progênie, em que a progênie ou semente compreende no seu genoma o construto de DNA recombinante (ou construto de DNA de supressão). A progênie inclui gerações subsequentes obtidas por meio de autopolinização ou cruzamento de uma planta. A progênie também inclui híbridos e congênitos.

[0245] Em safras propagadas por sementes híbridas, plantas transgênicas maduras podem ser autopolinizadas para produzir uma planta congênita homozigótica. A planta congênita produz sementes que contêm o construto de DNA recombinante recém introduzida (ou construto de DNA de supressão). Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que exibiriam teor de óleo alterado ou utilizadas em um programa de cultivo para produzir sementes híbridas, que podem ser cultivadas para produzir plantas que exibiriam esse teor de óleo alterado.

[0246] As sementes e os grãos modificados de acordo com a presente invenção podem também ser obtidos por meio de cultivo com plantas transgênicas, cultivo entre eventos transgênicos independentes ou cultivo de plantas com um ou mais alelos (incluindo alelos mutantes) de genes que codificam as proteínas de acordo com a presente invenção. O cultivo, incluindo a introgressão de locais mutantes e transgênicos em cultivo de elite de germoplasma e adaptação (melhoria) de cultivo de germoplasma até a expressão de transgenes e alelos mutantes, pode ser facilitado por métodos tais como cultivo selecionado assistido por marcadores.

[0247] As realizações da presente invenção incluem:

[0248] Em uma realização, um construto de DNA recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

[0249] Em outra realização, um construto de DNA recombinante que compreende pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase específico de sementes de uma planta, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante é realizada em sementes em desenvolvimento em sincronia com o acúmulo de óleo e proteína, resultando em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante. O promotor de sacarose sintase específico de sementes pode ser de uma planta oleaginosa. O promotor de sacarose sintase específico de sementes pode ser de um legume.

[0250] Em outra realização, a mencionada semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante tem germinação normal, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

[0251] Em outra realização, a mencionada semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante possui taxa de germinação que é de pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da taxa de germinação observada, sob as mesmas condições, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

[0252] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de soja compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; (b) uma sequência de ácidos nucleicos com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8; (c) uma sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza em SEQ ID NO: 8 sob condições estringentes; e (d) uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um fragmento funcional de (a), (b) ou (c).

[0253] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de soja é um alelo de SEQ ID NO: 8.

[0254] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de soja é diferente de SEQ ID NO: 8 em pelo menos uma forma conforme descrito na Fig. 4.

[0255] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata compreende uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85; (b) uma sequência de ácidos nucleicos com identidade de sequências de pelo menos 95% com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85; (c) uma sequência de ácidos nucleicos que se hibridiza em SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85 sob condições estringentes; e (d) uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um fragmento funcional de (a), (b) ou (c).

[0256] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata é um alelo de SEQ ID NO: 81 ou SEQ ID NO: 85.

[0257] Em outra realização, o promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata difere de SEQ ID NO: 81 em pelo menos uma das formas a seguir: nt 67 é T, nt 489 é C, nts 553-555 (TTG) são excluídos, nt 629 é A, nt 649 é C, nt 715 é A, nt 784 é C, nt 800 é G, nt 893 é G, nt 1166 é A, nt 1535 é excluído (T), nt 1700 é G, nt 1718 é C, nt 1857-1880 são excluídos (ATTTTAGAATATGCAATAAAATTG; SEQ ID NO: 101), nt 1953 é G, nt 2038 é excluído (A), existe uma inserção de 25 bp entre nt 2224 e 2225 (AGGCTTGAGGAATAAGATAAGACTTGT; SEQ ID NO: 102), um A é inserido entre nt 2225 e 2226, nt 2421 é G, um C é inserido entre nt 2734 e 2735 e nt 2881 é um T.

[0258] Em outra realização, o polipeptídeo ODP1 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 70.

[0259] Em outra realização, o polipeptídeo ODP1 é um alelo de SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 70.

[0260] Em outra realização, o polipeptídeo ODP1 compreende dois domínios APETALA2 (AP2).

[0261] Sequências ODP1 também foram descritas na Patente PCT publicada n° WO 2010114989, Patentes Norte-Americanas n° 7.157.621 e US 20100242138, todas as quais são incorporadas ao presente como referência.

[0262] Em uma realização, o polipeptídeo Lec1 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 17, 20, 25 ou 65.

[0263] Em outra realização, o polipeptídeo Lec1 é um alelo de SEQ ID NO: 17, 20, 25 ou 65.

[0264] Em outra realização, o polipeptídeo Lec1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.

[0265] Sequências de Lec1 também foram descritas nos seguintes: Patente Norte-Americana n° 7.294.754; Patente Norte-Americana n° 6.825.397; Patente Norte-Americana n° 7.812.216; Publicações Norte- Americanas n° US 20100319086, US 20110162101, US 20110099665 e US 20080313770; e Patente Norte-Americana n° 7.317.146, cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.

[0266] Em uma realização, o polipeptídeo FUSCA3 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade com SEQ ID NO: 32, 38, 45 ou 49.

[0267] Em outra realização, o polipeptídeo FUSCA3 é um alelo de SEQ ID NO: 32, 38, 45 ou 49.

[0268] Em outra realização, o construto recombinante compreende adicionalmente um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT ligado operativamente a um promotor específico de sementes. Em uma realização, o segundo polinucleotídeo é um polipeptídeo DGAT1. Em uma realização, o polipeptídeo DGAT1 compreende uma sequência de aminoácidos com identidade de sequências de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% com SEQ ID NO: 55.

[0269] Em outra realização, o polipeptídeo DGAT1 é um alelo de SEQ ID NO: 55.

[0270] Em uma realização, o segundo polinucleotídeo é um polipeptídeo DGAT2. Em uma realização, o polipeptídeo DGAT2 compreende uma sequência de aminoácidos com identidade de sequências de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% com SEQ ID NO: 60.

[0271] Em outra realização, o polipeptídeo DGAT2 é um alelo de SEQ ID NO: 60.

[0272] Sequências de DGAT também foram descritas nas seguintes: Publicações Norte-Americanas n° US 20080295204, US 20090293152, US 20090293151, US 20090158460, US 20090293150 e US 20090291479; Patentes Norte-Americanas n° 7.273.746 e 7.267.976; e Patente PCT publicada n° WO 2011062748, cada uma das quais é incorporada ao presente como referência.

[0273] Em uma realização, planta que compreende umo primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3 e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT, em que a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende as mencionadas primeira e segunda construções de DNA recombinantes resulta em aumento do teor de óleo na semente transgênica, em comparação com uma semente controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinantes. A planta e a semente podem ser planta e semente oleaginosas. A planta e a semente podem ser planta e semente de soja

[0274] Uma realização da presente invenção é um método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável de uma ou mais construções de DNA recombinante conforme descrito no presente; (b) regeneração de uma planta transgênica da célula de soja regenerável de (a) em que a planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b) ou de uma progênie de planta transgênica da planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica ou da progênie de planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante e a expressão dos mencionados um ou mais polipeptídeos na semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende as mencionadas uma ou mais construções de DNA recombinante. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[0275] Uma realização da presente invenção é um método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável de um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3 e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de semente ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT; (b) regeneração de planta transgênica a partir da célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b) ou uma progênie de planta transgênica da planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica ou a progênie de planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante e a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende as mencionadas primeira e segunda construções de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo da semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinante. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[0276] Uma realização da presente invenção é um método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) introdução em uma primeira célula de soja regenerável de um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3; (b) regeneração de uma primeira planta transgênica da primeira célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende o primeiro construto de DNA recombinante; (c) introdução em uma segunda célula de soja regenerável de um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT; (d) regeneração de uma segunda planta transgênica da segunda célula de soja regenerável de (c) em que a planta transgênica compreende o segundo construto de DNA recombinante; (e) cruzamento da primeira planta transgênica com a segunda planta transgênica; e (f) seleção de uma terceira planta transgênica do cruzamento da etapa (e), em que a semente da terceira planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante e a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo na mencionada semente de soja transgênica resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinante. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[0277] Uma realização da presente invenção é um método de aumento do teor de óleo de sementes de soja, em que o método compreende as etapas de: (a) cruzamento dos seguintes: (i) uma primeira planta de soja transgênica que compreende um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, um polipeptídeo Lec1 e um polipeptídeo FUSCA3; com (ii) uma segunda planta de soja transgênica que compreende um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT; e (b) seleção de uma terceira planta transgênica do cruzamento da etapa (a), em que a semente da terceira planta transgênica compreende as primeira e segunda construções de DNA recombinante e a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo na mencionada semente de soja transgênica resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, mas não ambas, as primeira e segunda construções de DNA recombinante. O teor percentual de óleo da semente de soja transgênica pode ser de pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15%.

[0278] Em uma realização, uma semente de soja transgênica que compreende um construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata ligado a um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3, em que a expressão do mencionado polipeptídeo na mencionada semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

[0279] Em uma realização, o percentual de aumento do teor de óleo é de pelo menos 10%. Em realizações adicionais, o percentual de aumento é de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%.

[0280] Em uma realização, semente de soja transgênica que compreende um primeiro construto de DNA recombinante que compreende um promotor de sacarose sintase de soja ou Medicago trunculata ligado operativamente a um primeiro polinucleotídeo heterólogo que codifica um primeiro polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um polipeptídeo ODP1, polipeptídeo Lec1 e polipeptídeo FUSCA3 e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT, em que a coexpressão do mencionado primeiro polipeptídeo e do mencionado segundo polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende as mencionadas primeira e segunda construções de DNA recombinantes resulta em aumento do teor de óleo na semente transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, mas não ambas, dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinante.

[0281] Em uma realização, o percentual de aumento do teor de óleo é de pelo menos 10%. Em realizações adicionais, o percentual de aumento é de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%.

[0282] Nas realizações acima, a semente controle que compreende apenas uma, mas não as duas dentre as primeira e segunda construções de DNA recombinante pode ser: (a) uma semente controle que compreende o primeiro construto de DNA recombinante, mas não compreende o segundo construto de DNA recombinante; ou (b) uma semente controle que compreende o segundo construto de DNA recombinante, mas não compreende o primeiro construto de DNA recombinante.

[0283] Realizações adicionais incluem um vetor, célula, planta ou semente que compreende uma ou mais dentre as construções de DNA recombinante descritas na presente invenção.

[0284] A presente invenção também engloba plantas transgênicas regeneradas, maduras e férteis que compreendem uma ou mais das construções de DNA recombinante descritas acima, sementes transgênicas produzidas com elas, gerações T1 e subsequentes. As células, tecidos, plantas e sementes de plantas transgênicas podem compreender pelo menos um construto de DNA recombinante de interesse.

[0285] Em outra realização, a planta ou a semente que compreende o construto de DNA recombinante descrita no presente pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em: uma semente ou planta dicotiledônea; uma semente ou planta de legume; uma semente ou planta oleaginosa; e uma semente ou planta de soja.

[0286] Em outra realização, as sementes de soja transgênica de acordo com a presente invenção podem ser processadas para gerar óleo de soja, produtos de soja e/ou subprodutos de soja. Produtos e subprodutos de soja são descritos na Patente Norte-Americana n° 8.143.473, incorporada ao presente como referência.

[0287] Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook”).

EXEMPLOS

[0288] A presente invenção é adicionalmente ilustrada nos Exemplos a seguir, nos quais as partes e percentuais são em peso e os graus são Celsius, a menos que indicado em contrário. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizações da presente invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições. Desta forma, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, serão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima. Essas modificações também se destinam a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO E CLONAGEM DO PROMOTOR DE SACAROSE SINTASE DE SOJA

[0289] O gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis foi descrito anteriormente (Patente PCT Publicada n° WO 2010/114989) e as sequências de aminoácidos e de nucleotídeos são descritas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. Um homólogo de soja do gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis foi identificado por meio da condução de pesquisas de BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico; Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993)) em busca de similaridade de sequências contidas no conjunto genético “Glyma1.01” do Instituto Conjunto do Genoma DoE do Projeto do Genoma de Soja. Especificamente, a sequência de aminoácidos de sacarose sintase 2 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 2) foi utilizada com o algoritmo TBLASTN fornecido pelo Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI) com parâmeteros padrão, exceto pela Opção de Filtro, que foi definida em DESLIGADO.

[0290] O homólogo de soja do gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis identificado correspondeu a Glyma13g17420 e as sequências de aminoácidos, CDS, cDNA e genômicas previstas de Glyma são descritas em SEQ ID NO: 3-6, respectivamente.

[0291] Bibliotecas de cDNA de soja em desenvolvimento (tal como biblioteca de cDNA sdp3c) foram preparadas, os clones foram sequenciados e a sequência foi analisada conforme descrito na Patente Norte- Americana n° 7.157.621 (cujo teor é incorporado ao presente como referência). Busca TBLASTN similar contra sequências dessas bibliotecas de cDNA de soja identificou um cDNA (EST sdp3c.pk014.n18) com uma extremidade 5’ diferente daquela prevista na sequência de cDNA de Glyma13g17420 (SEQ ID NO: 4) pelo fato de que o intron foi dividido de forma diferente. A sequência da extremidade 5’ de EST sdp3c.pk014.n18 que foi sequenciada é definida em SEQ ID NO: 7. A CDS de sdp3c.pk014.n18 aparentemente é idêntica à de Glyma13g17420 (SEQ ID NO: 5). O homólogo de soja ao gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis descrito em SEQ ID NO: 5 foi denominado GmSus.

[0292] Uma região de DNA genômico acima no fluxo do códon de parada de GmSuS (SEQ ID NO: 5) foi identificada a partir do banco de dados Glyma por meio de condução de pesquisas de BLAST como região promotora e a sequência é definida em SEQ ID NO: 8. A Fig. 1 exibe um esquema da região promotora GmSus.

[0293] A região promotora GmSus identificada codifica 5’ UTR do transcrito de cDNA (bp 2101 a 3191 de SEQ ID NO: 8) bem como um intron (bp 2134 a 3168 de SEQ ID NO: 8). A região 5’ UTR e o intron foram incluídos como parte da região promotora, pois continham uma caixa AW (AW2 na Fig. 1) de bp 2662 a 2675 de SEQ ID NO: 8 no interior do intron. Outra caixa AW (AW1 na Fig. 1) ocorre de bp 616 a bp 629 de SEQ ID NO: 8. Caixas AW consistem da sequência de nucleotídeos [CnTnG](n)7[CG] (SEQ ID NO: 78), em que n é qualquer nucleotídeo, e caixas AW são locais de ligação importantes para fatores de transcrição tais como wri1 em Arabidopsis (Maeo, K. et al (2009), Plant Journal 60 (3): 476-487).

[0294] DNA genômico foi isolado a partir de folhas de plantas de soja 93B86 com cerca de quatro semanas de idade, utilizando o Mini Kit Vegetal DNEASY® (Qiagen, Valencia CA), seguindo o protocolo do fabricante. A região promotora GmSus (SEQ ID NO: 8) foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico 93B86 utilizando os oligonucleotídeos GmSuSyProm-5 (SEQ ID NO: 9) e GmSuSyProm-5 (SEQ ID NO: 10) com Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pLF284 (SEQ ID NO: 11).

[0295] O fragmento de EcoRI de pLF284 (SEQ ID NO: 11), que contém a região promotora GmSus (denominada GmSusPro), foi clonado no local EcoRI de pNEB193 (New England BioLabs, Beverly MA) para produzir pKR1963 (SEQ ID NO: 12).

[0296] O plasmídeo pKR1543, que foi descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2011 /079005 (publicada em 30 de junho de 2011, cujo teor é incorporado ao presente como referência), foi digerido com NotI/XbaI e o fragmento que contém o terminal Leg, descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2004/071467 (publicada em 26 de agosto de 2004, cujo teor é incorporado ao presente como referência) foi clonado no fragmento NotI/XbaI de pKR1963 (SEQ ID NO: 12), que contém o GmSusPro, para produzir pKR1964 (SEQ ID NO: 13).

[0297] O fragmento BsiWI de pKR1964 (SEQ ID NO: 13), que contém o GmSusPro, foi clonado no local BsiWI de pKR325, descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2004/071467, para produzir pKR1965 (SEQ ID NO: 14). O plasmídeo pKR1965 contém um local NotI ladeado pelo GmSusPro e o terminal Leg, bem como o gene fosfotransferase de higromicina B (Gritz, L. e Davies, J. (1983), Gene 25: 179-188), ladeado pelo promotor T7 e um terminal de transcrição, uma origem de reprodução bacteriana (ori) para seleção e reprodução em E. coli e o gene fosfotransferase de higromicina B, ladeado pelo promotor 35S (Odell et al (1985), Nature 313: 810812) e terminal de transcrição NOS 3’ (Depicker et al (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-570) (conjunto 35S/hpt/NOS3’) para seleção em soja. Desta forma, polinucleotídeos (tais como regiões de codificação de proteínas) ladeados por locais NotI podem ser clonados no local NotI de pKR1965 (SEQ ID NO: 14) e expressos em soja.

EXEMPLO 2 CLONAGEM DE HOMÓLOGOS DE LEC1, FUSCA3 E ODP1 DE SOJA

[0298] GmLec1 de cDNA: A biblioteca de cDNA de soja se2, derivada de sementes de soja em desenvolvimento (Glycine max L.) colhidas treze dias após a floração (DAF) foi preparada, os clones de cDNA foram sequenciados e a sequência foi analisada conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 7.157.621.

[0299] Foi identificado um clone de cDNA (se2.11d12) da biblioteca de cDNA se2 com homologia para o fator de transcrição COTILÉDONE FOLHOSO 1 (Lec1) (Lotan, T. et al (1998), Cell 93 (7): 1195-1205).

[0300] O clone de cDNA foi totalmente sequenciado por meio de métodos descritos na Patente Norte-Americana n° 7.157.621 e sua sequência é descrita em SEQ ID NO: 15. Este clone aparentemente contém dois clones de cDNA separados nele inseridos, mas a sequência de 38-718 bp é 100% idêntica à sequência de codificação de leclb (Acesso NCBI n° EU088289.1 GI:158525282) e à CDS de Glyma17g00950 com base em comparação Blast. A sequência de codificação do clone se2.11d12, que corresponde à de Glyma17g00950, é exibida em SEQ ID NO: 16 e a sequência de aminoácidos codificada é exibida em SEQ ID NO: 17.

[0301] Um clone de cDNA separado (se1.pk0042.d8) identificado a partir da biblioteca de cDNA se1, derivada de sementes de soja em desenvolvimento (Glycine max L.) colhidas a 6-10 DAF e descrito na Patente Norte-Americana n° 7.157.621, também continha um homólogo de lec1 conforme determinado por meio de análise Blast. A sequência de inserto completo de se1.pk0042.d8 é exibida em SEQ ID NO: 18. A sequência do clone de cDNA se1.pk0042.d8 é 99% idêntica à sequência de codificação de lec1a (Acesso NCBI n° EU088288.1 GI:158525280) e 100% idêntica à CDS de Glyma07g39820 com base em comparação Blast. A sequência de codificação do clone se1.pk0042.d8 aparentemente é 2 nt curta do ATG, mas é exibida em SEQ ID NO: 19 com o início correto em comparação com Glyma07g39820. A sequência de aminoácidos codificada correspondente é exibida em SEQ ID NO: 20.

[0302] DNA também foi preparado a partir de uma parcela de biblioteca de cDNA se2 utilizando o Kit Spin Miniprep QIAprep® (Qiagen Inc., Valencia CA), seguindo o protocolo do fabricante. O DNA da biblioteca de cDNA foi utilizado como modelo em uma reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos SA275 (SEQ ID NO: 21) e SA276 (SEQ ID NO: 22), utilizando a polimerase de DNA Taq marca “Platinum” (Life Technologies), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de PCR foi clonado utilizando o Kit de Clonagem TA pCR®8/GW/TOPO® (Invitrogen Corporation) para produzir Glyma17g00950/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 23). A CDS do produto de PCR contido em Glyma17g00950/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 23), denominada GmLec1, é descrita em SEQ ID NO: 24 e a sequência de aminoácidos correspondente de GmLec1 é descrita em SEQ ID NO: 25. Dever-se-á observar que tanto a CDS quanto a sequência de aminoácidos de GmLec1 são diferentes das correspondentes a Glyma17g00950 ou Glyma07g39820. Um alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de Glyma17g00950 (SEQ ID NO: 17), Glyma07g39820 (SEQ ID NO: 20) e GmLec1 (SEQ ID NO: 25) é exibido na Fig. 2.

[0303] O gene GmLec1 foi amplificado por PCR a partir de Glyma17g00950/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 23) utilizando os oligonucleotídeos Gmlec-5 (SEQ ID NO: 26) e Gmlec-3 (SEQ ID NO: 27) com Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de PCR foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pLF275 (SEQ ID NO: 28).

[0304] Fragmento de NotI que contém GmODP1: O ODP de soja (GmODP1) é descrito na Patente Norte-Americana n° 7.157.621. A clonagem de GmODP1 com locais Not1 laterais em plasmídeo KS334 foi descrita anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2010/114989 (publicada em sete de outubro de 2010, cujo teor é incorporado ao presente como referência). Dever-se-á observar que existe um erro de digitação no mapa de KS334 (SEQ ID NO: 14 em WO 2010/114989) e que deverá haver três nucleotídeos adicionais (TGA) na posição 1237 para formar um códon de parada e terminar a CDS em KS334. A CDS e a sequência de aminoácidos de GmODP1 de WO 2010/114989 são descritas no presente em SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, respectivamente.

[0305] PCR GmFusca3-1 e GmFusca3-2 de cDNA: Com base em análise BLAST do banco de dados de sequências de genoma de soja, Glyma16g05480 foi identificado com homologia para o fator de transcrição Fusca3 (Luerssen, H. et al (1998), Plant Journal, 15 (6): 755-764). A CDS prevista e a sequência de aminoácidos para Glyma16g05480, conforme previsto no banco de dados Glyma, são exibidas em SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32, respectivamente.

[0306] DNA preparado a partir de uma parcela de biblioteca de cDNA se2 (descrita acima) foi utilizado como modelo em uma reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos SA278 (SEQ ID NO: 33) e SA279 (SEQ ID NO: 34), utilizando a polimerase de DNA Taq marca “Platinum” (Life Technologies), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de PCR foi clonado utilizando o Kit de Clonagem TA pCR®8/GW/TOPO® (Invitrogen Corporation) para produzir Glyma16g05480/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 35). O inserto de cDNA em Glyma16g05480/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID NO: 35) foi sequenciado e a sequência é descrita em SEQ ID NO: 36.

[0307] O inserto de cDNA (SEQ ID NO: 36) foi analisado por meio de BLAST e concluiu-se que ele é diferente do previsto para Glyma16g05480 (SEQ ID NO: 31). A sequência também não codificou uma CDS perfeita, pois foram encontrados códons de parada iniciais no seu interior. Comparação da sequência de inserto de cDNA com a sequência de genoma em Glyma revelou que a extremidade 3’ do inserto de cDNA é 100% idêntica à sequência de codificação prevista de Glyma19g27340. A CDS prevista e a sequência de aminoácidos correspondente de Glyma19g27340 do banco de dados Glyma são exibidas em SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38, respectivamente.

[0308] O inserto de cDNA é maior que a CDS prevista para Glyma 19g27340 (SEQ ID NO: 38) e possui 1193 bp adicionais na extremidade 5’. Comparação adicional do inserto de cDNA com a sequência genômica acima no fluxo da CDS de Glyma19g27340 (SEQ ID NO: 37) revela 100% de identidade, com exceção de um único nucleotídeo proveniente de oligo SA278 (SEQ ID NO: 33). A sequência de DNA genômica completa do banco de dados de genoma de soja, acima no fluxo de Glyma19g27340, inclusive, é descrita em SEQ ID NO: 39.

[0309] O inserto de cDNA (SEQ ID NO: 36) não codificou uma CDS completa e determinou-se que uma sequência de introns não dividida estava contida na sequência de cDNA ou que um códon inicial alternativo estava presente. A sequência com comprimento total do inserto de cDNA (denominada GmFusca3-2), que pode conter introns, foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleotídeos GmFusca3-1-5 (SEQ ID NO: 40) e GmFusca3-3 (SEQ ID NO: 41) com a Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante.

[0310] O fragmento de PCR foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pLF283 (SEQ ID NO: 42).

[0311] O cDNA de comprimento total do produto de PCR resultante para GmFusca3-2 é exibido em SEQ ID NO: 43 e é idêntico ao cDNA original (SEQ ID NO: 36) exceto pela alteração do nucleotídeo 17 de C para T para concordar com o previsto em sequência de DNA genômica de Glyma19g27340. Uma suposta CDS dividida, bem como a sequência de aminoácidos codificada correspondente para GmFusca3-2, é exibida em SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45, respectivamente.

[0312] Uma segunda sequência de ORF mais curta contida no inserto de cDNA (SEQ ID NO: 36), denominada GmFusca3-1, foi amplificada por PCR utilizando os oligonucleotídeos GmFusca3-2-5 (SEQ ID NO: 46) e GmFusca3-3 (SEQ ID NO: 41) com a Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante.

[0313] O fragmento de PCR que contém Fusca3-1 resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pLF282 (SEQ ID NO: 47).

[0314] A sequência completa não contém introns não divididos e a sequência de codificação bem como a sequência de aminoácidos codificada correspondente de GmFusca3-1 é exibida em SEQ ID NO: 48 e 49, respectivamente.

[0315] Um alinhamento que compara as sequências de aminoácidos de Glyma16g05480 (SEQ ID NO: 32) e Glyma19g27340 (SEQ ID NO: 38), conforme previsto no banco de dados Glyma, junto com a sequência dividida prevista para GmFusca3-2 (SEQ ID NO: 45) e para GmFusca3-1 (SEQ ID NO: 49) é exibido na Fig. 3.

EXEMPLO 3 EXPRESSÃO DE GMLECI, GMODPI, GMFUSCA3-1 E GMFUSCA3-2 EM EMBRIÕES DE SOJA SOB O CONTROLE DO PROMOTOR GMSUS

[0316] O fragmento NotI de pLF275 (SEQ ID NO: 28), que contém GmLec1, o fragmento NotI de KS334, que contém GmODP1, o fragmento NotI de pLF282 (SEQ ID NO: 47), que contém GmFusca3-1, e o fragmento NotI de pLF283 (SEQ ID NO: 42), que contém GmFusca3-2, foram clonados no local NotI de pKR1965 (SEQ ID NO: 14), para produzir pKR1968 (SEQ ID NO: 50), pKR1971 (SEQ ID NO: 51), pKR1969 (SEQ ID NO: 52) e pKR1970 (SEQ ID NO: 53), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro). O plasmídeo pKR278, descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2008/147935 (publicada em 13 de outubro de 2009, cujo teor é incorporado como referência) e que não contém fator de transcrição, mas possui o marcador selecionável de higromicina, foi utilizado como controle negativo.

[0317] DNA de plasmídeos pKR1968 (SEQ ID NO: 50), pKR1971 (SEQ ID NO: 51), pKR1969 (SEQ ID NO: 52), pKR1970 (SEQ ID NO: 53) e pKR278 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo (“MSE”) é exibido na Tabela 1. TABELA 1

[0318] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 2.

[0319] Na Tabela 2, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 2, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 2

[0320] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 3. Na Tabela 3, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 3 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 3

[0321] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto em cada experimento é exibido na Tabela 4. Na Tabela 4, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 4 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 4 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS CINCO EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM GMLECI, GMFUSCA3-1, GMFUSCA3-2, GMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0322] As Tabelas 3 e 4 demonstram que a expressão de GmLec1, GmFusca3-1 e GmODP1 gera aumento do teor de óleo em soja. EXEMPLO 4 COEXPRESSÃO DE GMLECI, GMODPI, GMFUSCA-3-1 E GMFUSCA3-2 COM GMDGATICALL EM EMBRIÕES DE SOJA

[0323] O plasmídeo pKR1520 foi descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2009/143397 (publicada em 26 de novembro de 2009, cujo teor é incorporado como referência) e contém um DGAT1 de soja modificado (denominado GmDGAT1cAll no presente e denominado GM- DGAT1c9c10c11 em WO 2009/143397) sob controle do promotor de betaconglicinina de soja específico de sementes. A CDS e a sequência de aminoácidos de GmDGATIcAll da Patente PCT publicada n° WO 2009/143397 são descritas em SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55, respectivamente.

[0324] O fragmento SbfI de pKR1968 (SEQ ID NO: 50), que contém GmLec1, o fragmento SbfI de pKR1971 (SEQ ID NO: 51), que contém GmODP1 e o fragmento SbfI de pKR1969 (SEQ ID NO: 52), que contém GmFusca3-1, foram clonados no local SbfI de pKR1520 para produzir pKR2098 (SEQ ID NO: 56), pKR2100 (SEQ ID NO: 57) e pKR2099 (SEQ ID NO: 58), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro) e coexpressos com GmDGAT1cAll (SEQ ID NO: 54).

[0325] DNA de plasmídeos pKR2098 (SEQ ID NO: 56), pKR2100 (SEQ ID NO: 57) e pKR2099 (SEQ ID NO: 58) e pKR1520 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 5. TABELA 5

1 Gene1: sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 54 2 Gene1: sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55

[0326] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 6.

[0327] Na Tabela 6, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 6, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 6

[0328] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 7. Na Tabela 7, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 3 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 7 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE TODOS OS EVENTOS QUE EXPRESSAM GMDGATICALL COM GMLECI, GMFUSCA3-1 OU GMODPI

[0329] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto em cada experimento é exibido na Tabela 8. Na Tabela 8, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 4 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 8 RESUMO DO TEOR MÉDIO DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS CINCO EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM GMDGATICALL COM GMLECI, GMFUSCA3-1 OU GMODPI

[0330] As Tabelas 7 e 8 demonstram que a expressão de GmLec1, GmFusca3-1 e GmODP1 com GmDGAT1cAll gera aumento do teor de óleo em soja acima daquele de GmDGAT1cAll isolado. EXEMPLO 5 COEXPRESSÃO DE GMLECI, GMODPI, GMFUSCA-3-1 E GMFUSCA3-2 COM YLDGAT2 EM EMBRIÕES DE SOJA

[0331] O plasmídeo pKR1256 foi descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2008/147935 e contém DGAT2 de Yarrowia lipolytica (denominado YLDGAT2 em WO 2008/147935) sob controle do promotor de betaconglicinina de soja específico de sementes. A CDS e a sequência de aminoácidos de YLDGAT2 da Patente PCT publicada n° WO 2008/147935 são descritas em SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente.

[0332] O fragmento SbfI de pKR1968 (SEQ ID NO: 50), que contém GmLec1, o fragmento SbfI de pKR1971 (SEQ ID NO: 51), que contém GmODP1 e o fragmento SbfI de pKR1969 (SEQ ID NO: 52), que contém GmFusca3-1, foram clonados no local SbfI de pKR1256 para produzir pKR2082 (SEQ ID NO: 61), pKR2084 (SEQ ID NO: 62) e pKR2083 (SEQ ID NO: 63), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro) e coexpressos com YLDGAT2 (SEQ ID NO: 59).

[0333] DNA de plasmídeos pKR2082 (SEQ ID NO: 61), pKR2084 (SEQ ID NO: 62), pKR2083 (SEQ ID NO: 63) e pKR1256 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 9. TABELA 9 RESUMO DE GENES, PLASMÍDEOS E EXPERIMENTOS

1 Gene1: sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 59 2 Gene1: sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60

[0334] Cerca de 10 a 20 embriões maduros de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 10.

[0335] Na Tabela 10, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 10, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e o teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 10

[0336] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 11. Na Tabela 11, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 11 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 11

[0337] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto em cada experimento é exibido na Tabela 12. Na Tabela 12, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 12 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 12 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS CINCO EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM YLDGAT2 COM GMLECI, GMFUSCA3-1 OU GMODPI

[0338] As Tabelas 11 e 12 demonstram que a expressão de GmLec1 e GmODP1 com YLDGAT2 gera aumento do teor de óleo em soja acima daquele de YLDGAT2 isolado.

EXEMPLO 6 CLONAGEM DE HOMÓLOGOS DE LEC1 E ODP1 DE MILHO ZMLECI COM LOCAIS NOTI LATERAIS

[0339] O Lec1 de milho (ZmLec1) é descrito na Patente Norte- Americana n° 6.825.397. A CDS e as sequências de aminoácidos de ZmLec1 são descritas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65, respectivamente.

[0340] ZmLec1 foi amplificado por PCR a partir de um clone de cDNA utilizando os oligonucleotídeos oZLEC-1 (SEQ ID NO: 66) e oZLEC-2 (SEQ ID NO: 67) com a Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de PCR foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR2115 (SEQ ID NO: 68).

ZMODPI COM LOCAIS NOTI LATERAIS

[0341] O ODP1 de milho (ZmODP1) é descrito na Patente Norte- Americana n° 7.157.621. A clonagem de ZmODP1 com locais Not1 laterais em plasmídeo KS336 foi descrita anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2010/114989 (publicada em sete de outubro de 2010, cujo teor é incorporado ao presente como referência). Dever-se-á observar que existe um erro de digitação no mapa de KS336 (SEQ ID NO: 6 em WO 2010/114989) e que deverá haver três nucleotídeos adicionais (TGA) na posição 1192 para formar um códon de parada e terminar a CDS em KS336. A CDS e a sequência de aminoácidos de ZmODP1 em KS336 de WO 2010/114989 são descritas no presente em SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 70, respectivamente.

EXEMPLO 7 EXPRESSÃO DE ZMLECI E ZMODPI EM EMBRIÕES DE SOJA SOB O CONTROLE DO PROMOTOR GMSUS

[0342] O fragmento NotI de pKR2115 (SEQ ID NO: 68), que contém ZmLec1 e o fragmento NotI de KS336, que contém ZmODP1, foram clonados no local NotI de pKR1965 (SEQ ID NO: 14), para produzir pKR2121 (SEQ ID NO: 71) e pKR2114 (SEQ ID NO: 72), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro). O plasmídeo pKR278, que não contém fator de transcrição, mas possui o marcador selecionável de higromicina, foi utilizado como controle negativo.

[0343] DNA de plasmídeos pKR2121 (SEQ ID NO: 71), pKR2114 (SEQ ID NO: 72) e pKR278 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 13. TABELA 13 RESUMO DE GENES, PLASMÍDEOS E EXPERIMENTOS

[0344] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados e moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 14.

[0345] Na Tabela 14, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 14, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 14 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE EVENTOS QUE EXPRESSAM ZMLECI, ZMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0346] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 15. Na Tabela 15, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 15 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 15 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE TODOS OS EVENTOS QUE EXPRESSAM ZMLECI, ZMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0347] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto de cada experimento é exibido na Tabela 16. Na Tabela 16, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 16 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 16

[0348] As Tabelas 15 e 16 demonstram que a expressão de ZmLec1 e ZmODP1 gera aumento do teor de óleo em soja.

EXEMPLO 8 COEXPRESSÃO DE ZMLECI E ZMODPI COM GMDGATICALL EM EMBRIÕES DE SOJA

[0349] O fragmento SbfI de pKR2121 (SEQ ID NO: 71), que contém ZmLec1, e o fragmento SbfI de pKR2114 (SEQ ID NO: 72), que contém ZmODP1, foram clonados no local SbfI de pKR1520 para produzir pKR2123 (SEQ ID NO: 73) e pKR2122 (SEQ ID NO: 74), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro) e coexpressos com GmDGAT1cAll (SEQ ID NO: 54).

[0350] DNA de plasmídeos pKR2123 (SEQ ID NO: 73), pKR2122 (SEQ ID NO: 74) e pKR1520 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 17. TABELA 17

1 Gene1: sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 54 2 Gene1: sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55

[0351] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 18.

[0352] Na Tabela 18, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 18, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e o teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 18 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE EVENTOS QUE EXPRESSAM GMDGATICALL COM ZMLECI OU ZMODPI :

[0353] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 19. Na Tabela 19, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 3 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 19 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE TODOS OS EVENTOS QUE EXPRESSAM GMDGATICALL COM ZMLECI OU ZMODPI :

[0354] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto de cada experimento é exibido na Tabela 20. Na Tabela 20, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 4 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 20 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS 5 EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM GMDGATICALL COM ZMLECI OU ZMODPI:

[0355] As Tabelas 19 e 20 demonstram que a expressão de ZmLec1 e ZmODP1 com GmDGAT1cAll gera aumento do teor de óleo em soja acima daquele de GmDGAT1cAll isolado.

EXEMPLO 9 COEXPRESSÃO DE ZMLECI E ZMODPI COM YLDGAT2 EM EMBRIÕES DE SOJA

[0356] O fragmento SbfI de pKR2121 (SEQ ID NO: 71), que contém ZmLec1 e o fragmento SbfI de pKR2114 (SEQ ID NO: 72), que contém ZmODP1, foram clonados no local SbfI de pKR1256 para produzir pKR2146 (SEQ ID NO: 75) e pKR2145 (SEQ ID NO: 76), respectivamente. Desta forma, os fatores de transcrição correspondentes poderão ser expressos atrás do promotor de sacarose sintase de soja (GmSusPro) e coexpressos com YLDGAT2 (SEQ ID NO: 59).

[0357] DNA de plasmídeos pKR2146 (SEQ ID NO: 75), pKR2145 (SEQ ID NO: 76) e pKR1256 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 21. TABELA 21

1 Gene1: sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 59 2 Gene1: sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60

[0358] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 22.

[0359] Na Tabela 22, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 22, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e o teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 22 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE EVENTOS QUE EXPRESSAM YLDGAT2 COM ZMLECI OU ZMODPI

[0360] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 23. Na Tabela 23, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 3 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 23

[0361] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto de cada experimento é exibido na Tabela 24. Na Tabela 24, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 4 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 24 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS 5 EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM YLDGAT2 COM ZMLECI OU ZMODPI

[0362] As Tabelas 23 e 24 demonstram que a expressão de ZmLec1 e ZmODP1 com YLDGAT2 gera aumento do teor de óleo em soja acima daquele de YLDGAT2 isolado.

EXEMPLO 10 IDENTIFICAÇÃO E CLONAGEM DO PROMOTOR DE SACAROSE SINTASE DE MENDICAGO TRUNCATULA

[0363] Foi identificada a sequência de aminoácidos do homólogo de soja (Glyma13g17420) para o gene sacarose sintase 2 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 6).

[0364] Um homólogo de Medicago trunculata de Glyma13g17420 (SEQ ID NO: 6) foi identificado por meio de condução de BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico; Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993)) em busca de similaridade de sequências contidas no conjunto genético “Versão Mt3.5.1” do Projeto Genoma de Medicago trunculata. Informações de sequência do Projeto Genoma de Medicago trunculata são disponíveis no Instituto J. Craig Venter. Especificamente, a sequência de aminoácidos de Glyma13g17420 (SEQ ID NO: 6) foi utilizada com o algoritmo TBLASTN fornecido pelo Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI) com parâmeteros padrão, exceto pela Opção de Filtro, que foi definida em DESLIGADO.

[0365] O homólogo de Medicago trunculata identificado correspondeu a Medtr4g124660.2 e a CDS prevista e as sequências de aminoácidos correspondentes para Medtr4g124660.2 são descritas em SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80, respectivamente. A sequência de aminoácidos prevista de Medtr4g124660 compartilha identidade de sequências de 93,3% com a sequência de aminoácidos prevista de Glyma13g17420 em alinhamento CLUSTAL W. Dados de expressão de genes de Medicago trunculata são disponíveis na Pesquisa de Bioconjuntos de Biologia Vegetal da Universidade de Toronto (Winter, D. et al, PLoS One (2007), 2 (8): e718). Análise dos dados de expressão de genes de Medicago trunculata revelou que Medtr4g124660 é expresso em sementes em desenvolvimento em sincronia com acúmulo de óleo e proteína.

[0366] Uma região promotora de 3,3 kb de DNA genômico acima no fluxo do códon de início de Medtr4g124660.2 foi identificada a partir da “Versão Mt3.5.1” de Medicago e a sequência é descrita em SEQ ID NO: 81.

[0367] Sementes de Medicago trunculata foram esterilizadas e germinadas sobre placas utilizando métodos conhecidos dos técnicos no assunto. DNA genômico foi isolado a partir de folhas de mudas de Medicago trunculata com três semanas de idade utilizando o Mini Kit Vegetal DNEASY® (Qiagen, Valencia CA), seguindo o protocolo do fabricante. A região promotora de Medtr4g124660.2 (SEQ ID NO: 81) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico utilizando o primer frontal oMDSP-1F (SEQ ID NO: 82) e o primer reverso oMDSP-1R (SEQ ID NO: 83) com a Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PHUSION® (Cat. n° F553S, Finnzymes Oy, Finlândia), seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR®-BLUNT® utilizando o Kit de Clonagem de PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR2434 (SEQ ID NO: 84).

[0368] A sequência de região promotora para diversos produtos de PCR individuais foi determinada a partir de uma série de clones e a sequência real é definida em SEQ ID NO: 85. A sequência promotora real difere de SEQ ID NO: 81 pelo fato de que nt 67 é T, nt 489 é C, nts 553-555 (TTG) são excluídos, nt 629 é A, nt 649 é C, nt 715 é A, nt 784 é C, nt 800 é G, nt 893 é G, nt 1166 é A, nt 1535 é excluído (T), nt 1700 é G, nt 1718 é C, nt 1857-1880 são excluídos (ATTTTAGAATATGCAATAAAATTG; SEQ ID NO: 101), nt 1953 é G, nt 2038 é excluído (A), existe uma inserção de 25 bp entre nt 2224 e 2225 (AGGCTTGAGGAATAAGATAAGACTTGT; SEQ ID NO: 102), um A é inserido entre nt 2225 e 2226, nt 2421 é G, um C é inserido entre nt 2734 e 2735 e nt 2881 é um T. Essas diferenças devem-se provavelmente a um cultivar diferente de Medicago trunculata que é utilizado no lugar daquele usado para determinar a sequência de genoma.

[0369] A região promotora de Medtr4g124660.2 real (denominada MTSusPro; SEQ ID NO: 85) codifica a 5’ UTR de nt 2495-3285 que inclui um intron de nt 2524-3272.

[0370] O plasmídeo pKR1964 (SEQ ID NO: 13) foi digerido com NotI/SalI e o fragmento que contém o terminal Leg foi clonado no fragmento NotI/XhoI de pKR2434 (SEQ ID NO: 84), que contém o MTSusPro, para produzir pKR2446 (SEQ ID NO: 86).

[0371] O fragmento BsiWI de pKR2446 (SEQ ID NO: 86), que contém o MTSusPro, foram clonados no local BsiWI de pKR325 para produzir pKR2457 (SEQ ID NO: 87). O plasmídeo pKR2457 contém um local NotI ladeado pelo MTSusPro e o terminal Leg, bem como o gene fosfotransferase de higromicina B (Gritz, L. e Davies, J. (1983), Gene 25: 179-188), ladeado pelo promotor T7 e um terminal de transcrição, uma origem de reprodução bacteriana (ori) para seleção e reprodução em E. coli e o gene fosfotransferase de higromicina B, ladeado pelo promotor 35S (Odell et al (1985), Nature 313: 810-812) e terminal de transcrição NOS 3’ (Depicker et al (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-570) (conjunto 35S/hpt/NOS3’) para seleção em soja. Desta forma, polinucleotídeos (tais como regiões de codificação de proteínas) ladeados por locais NotI podem ser clonados no local NotI de pKR2457 (SEQ ID NO: 87) e expressos em seguida em soja.

EXEMPLO 11 EXPRESSÃO DE GMOPDI EM EMBRIÕES DE SOJA SOB CONTROLE DO PROMOTOR DE SACAROSE SINTASE MTSUSPRO DE MEDICAGO TRUNCULATA

[0372] O fragmento NotI de KS334, que contém GmODP1, foi clonado no local NotI de pKR2457 (SEQ ID NO: 87), para produzir pKR2461 (SEQ ID NO: 88). Desta forma, o GmODP1 poderá ser expresso atrás do promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata (MTSusPro).

[0373] O plasmídeo pKR278, descrito anteriormente na Patente PCT Publicada n° WO 2008/147935, que não contém fator de transcrição, foi utilizado como controle negativo.

[0374] DNA de plasmídeos pKR2461 (SEQ ID NO: 88) e pKR278 foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo (“MSE”) é exibido na Tabela 25. TABELA 25 RESUMO DE GENES, PLASMÍDEOS E EXPERIMENTOS

[0375] Cerca de 10 a 20 embriões amadurecidos de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 26.

[0376] Na Tabela 26, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 26, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% de óleo) e o teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 26 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE EVENTOS QUE EXPRESSAM GMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0377] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 27. Na Tabela 27, o teor de óleo médio é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 27 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 27 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE TODOS OS EVENTOS QUE EXPRESSAM GMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0378] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto de cada experimento é exibido na Tabela 28. Na Tabela 28, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (% médio de óleo nos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 28 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 28 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS CINCO EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM GMODPI OU CONTROLE DE VETOR VAZIO

[0379] As Tabelas 27 e 28 demonstram que a expressão de GmODP1, sob controle do MTSusPro, gera aumento do teor de óleo em soja.

EXEMPLO 12 COEXPRESSÃO DE GMODPI SOB O CONTROLE DO MTSUSPRO COM YLDGAT2 EM EMBRIÕES DE SOJA

[0380] O fragmento SbfI de pKR2461 (SEQ ID NO: 88), que contém GmODP1, foi clonado no local SbfI de pKR1256 para produzir pKR2465 (SEQ ID NO: 89). Desta forma, o GmODP1 poderá ser expresso atrás do promotor de sacarose sintase de Medicago trunculata (MTSusPro) e coexpresso com YLDGAT2 (SEQ ID NO: 59).

[0381] DNA do plasmídeo pKR2465 (SEQ ID NO: 89) foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido, bombardeado e eventos foram selecionados e amadurecidos sobre meios SHaM, exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Um resumo de genes, plasmídeos e números de experimento de sistema de modelo é exibido na Tabela 29. TABELA 29 RESUMO DE GENES, PLASMÍDEOS E EXPERIMENTOS

1 Gene1: sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 59 2 Gene1: sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60

[0382] Cerca de 10 a 20 embriões maduros de cada um dentre cerca de 30 eventos por experimento de bombardeamento foram liofilizados, moídos, o teor de óleo foi medido por meio de NMR e o perfil de ácidos graxos foi avaliado por meio de análise FAME-GC exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Os resultados do teor de óleo e perfil de ácidos graxos para cada evento bem como a média de todos os eventos (Média) e a média dos cinco eventos superiores que contêm teor de óleo mais alto (média dos cinco superiores) são exibidos na Tabela 30.

[0383] Na Tabela 30, os resultados são classificados com base no teor de óleo do mais alto para o mais baixo. Na Tabela 30, o teor de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (% em óleo) e o teor de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. TABELA 30 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE EVENTOS QUE EXPRESSAM YLDGAT2 COM GMODPI :

[0384] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio de todos os eventos em cada experimento é exibido na Tabela 31. Na Tabela 31, o teor médio de óleo é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio) e o teor médio de ácidos graxos para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 31 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 31 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DE TODOS OS EVENTOS QUE EXPRESSAM YLDGAT2 COM GMODPI

[0385] Um resumo que compara o teor de óleo médio e o perfil de ácidos graxos médio dos cinco eventos superiores que contêm o teor de óleo mais alto de cada experimento é exibido na Tabela 32. Na Tabela 32, o óleo médio para os cinco eventos que contêm teor de óleo mais alto é relatado na forma de percentual de peso seco total (óleo médio dos cinco superiores) e o teor de ácidos graxos médio para cada ácido graxo (ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) e ácido alfalinolênico (18:3)) é relatado na forma de % em peso do total de ácidos graxos. A Tabela 12 também exibe a mudança de teor de óleo (% médio de mudança dos cinco superiores) em comparação com o experimento controle, em que o % médio de mudança é calculado como o óleo médio para aquele experimento menos o óleo médio para o experimento controle dividido pelo óleo médio para o experimento controle expresso na forma de percentual. TABELA 32 RESUMO DO TEOR DE ÓLEO MÉDIO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS DOS CINCO EVENTOS SUPERIORES QUE CONTÊM TEORES DE ÓLEO MAIS ALTOS E EXPRESSAM YLDGAT2 COM GMODPI

[0386] As Tabelas 31 e 32 demonstram que a expressão de GmODP1, sob controle do MTSusPro, com YLDGAT2 gera aumento do teor de óleo em soja acima de YLDGAT2 isolado.

EXEMPLO 13 EXPRESSÃO DE GMLECI, GMODPI E GMFUSCA-3-1 EM SEMENTE DE SOJA SOB O CONTROLE DO PROMOTOR GMSUS

[0387] MicroRNAs artificiais que silenciam genes fad2 como relator de eventos transgênicos: As famílias genéticas dessaturase de ácido graxo 2-1 (Fad2-1) ou 2-2 (Fad2-2) (Heppard, E. P. et al (1996), Plant Physiology, 110 (1): 311-319), também conhecidas como delta-12 dessaturase ou ômega-6 dessaturase (Patentes Norte-Americanas n° US 6872872B1, US 6919466B2 ou US 7105721B2), convertem ácido oleico em ácido linoleico. Silenciamento eficaz das famílias genéticas fad2-1 e fad2-2 especificamente em sementes de soja resulta em óleo de semente que contém teor de ácido nucleico mais alto que pode ser detectado utilizando métodos conhecidos dos técnicos no assunto, tais como os descritos no presente. Esse teor de ácido oleico mais alto pode ser utilizado como relator para identificar sementes transgênicas na segregação de populações de sementes a partir de sementes nulas.

[0388] O projeto e a síntese de microRNAs artificiais (amiRNAs) e as sequências de estrela correspondentes que se emparelham com amiRNAs, para silenciar os genes fad2-1 e fad2-2 de soja, foram descritos anteriormente em US 20090155910A1 (WO 2009/079532) (cujo teor é incorporado como referência) e as sequências são descritas na Tabela 33. TABELA 33 SEQUÊNCIAS DE AMIRNA E DE ESTRELA PARA FAD2-1 E FAD2-2 DE SOJA

[0389] A identificação das sequências precursoras de miRNA genômicas 159 e 396b foi descrita anteriormente em US 20090155910A1 (WO 2009/079532) e suas sequências são descritas em SEQ ID NO: 94 e SEQ ID NO: 95, respectivamente.

[0390] As sequências precursoras de miRNA genômicas (SEQ ID NO: 94) e 396b (SEQ ID NO: 95) foram convertidas em precursores de amiRNA 396b-fad2-1b e 159-fad2-2 utilizando PCR sobreposto conforme descrito anteriormente em US20090155910A1 (WO 2009/079532).

[0391] Precursor de amiRNA 159-fad2-2 foi clonado abaixo no fluxo de 396b-fad2-1b para produzir o precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159- fad2-2 (SEQ ID NO: 96).

[0392] O precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159-fad2-2 (SEQ ID NO: 96) possui 1577 nt de comprimento e é substancialmente similar à sequência de desoxirribonucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 95 (de nt 1 a 574 de 396b-fad2-1b/159-fad2-2), em que os nucleotídeos 196 a 216 de SEQ ID NO: 95 são substituídos por amiRNA de GM-MFAD2-1B (SEQ ID NO: 90) e em que os nucleotídeos 262 a 282 de SEQ ID NO: 95 são substituídos por Sequência Estrela 396b-GM-MFAD2-1B (SEQ ID NO: 91). O precursor de amiRNA 396b- fad2-1b/159-fad2-2 (SEQ ID NO: 96) também é substancialmente similar à sequência de desoxirribonucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 94 (de nt 620 a 1577 de 396b-fad2-1b/159-fad2-2), em que os nucleotídeos 276 a 296 de SEQ ID NO: 94 são substituídos por amiRNA de GM-MFAD2-2 (SEQ ID NO: 92) e em que os nucleotídeos 121 a 141 de SEQ ID NO: 94 são substituídos por Sequência Estrela 159-GM-MFAD2-2 (SEQ ID NO: 93). Em precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159-fad2-2, nt 575 a 610 são derivados de clonagem. CONSTRUTO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE SOJA PKR2109

[0393] Utilizando métodos de clonagem e PCR padrão dos técnicos no assunto, os elementos de DNA a seguir foram reunidos para produzir o vetor de expressão de soja com 8095 bp pKR2109 (SEQ ID NO: 97) e possuem locais de restrição de SbfI (nt 8093) e BsiWI (nt 1) exclusivos para clonagem de conjuntos de expressão.

[0394] Em pKR2109 (SEQ ID NO: 97), a sequência 21-36 é uma sequência de DNA que compreende códons de parada de ORF em todos os seis quadros (ORFSTOP-A). A sequência 65-2578 é uma cadeia principal de vetor que contém o promotor T7 (sequência 1297-1394), a região de codificação de gene fosfotransferase de higromicina (hpt) (sequência 1395-2435) e o terminal T7 (sequência 2436-2582). A sequência 2616-2632 é uma sequência de DNA que compreende códons de parada de ORF em todos os seis quadros (ORFSTOP-B). A sequência 2698-4006 é o promotor SAMS de soja constitutivo (Patente Norte-Americana n° 7217858). A sequência 4011-4058 é um local de reconhecimento de FLP recombinase FRT1 (PatenteNorte-Americana n° 8.293.533). A sequência 4068-5093 é a região de codificação do gene fosfotransferase de higromicina (hpt) para seleção em soja. A sequência 51025382 é o terminal de transcrição 3’ NOS (Depicker et al, J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-570 (1982)). A sequência 5400-6170 é o fragmento de 776 bp do promotor anexina de soja (descrito na Patente Norte-Americana do cessionário do depositante n° 7.129.089). A sequência 6179-7756 é o precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159-fad2-2 (SEQ ID NO: 96). A sequência 7773-7988 é o terminal de transcrição BD30 de soja (descrito na Patente Norte-Americana do cessionário do depositante n° 8.084.074). A sequência 8021-8068 é um local de reconhecimento de FLP recombinase FRT87 (Patente Norte-Americana n° 8.293.533). EXPRESSÃO DE GMLECI, GMODPI E GMFUSCA3-1 EM SEMENTE DE SOJA SOB O CONTROLE DO PROMOTOR GMSUS

[0395] Os fragmentos SbfI de pKR1968 (SEQ ID NO: 50), que contém GmLec1, pKR1971 (SEQ ID NO: 51), que contém GmODP1 e pKR1969 (SEQ ID NO: 52), que contém GmFusca3-1, foram clonados no local SbfI de pKR2109 (SEQ ID NO: 97) para produzir pKR2118 (SEQ ID NO: 98), pKR2120 (SEQ ID NO: 99) e pKR2119 (SEQ ID NO: 100), respectivamente.

[0396] Cada experimento recebeu um nome e um resumo do nome do experimento, construto utilizado e genes expressos conforme exibido na Tabela 34. TABELA 34 RESUMO DE GENES, PLASMÍDEOS E EXPERIMENTOS

[0397] DNA desses plasmídeos foi preparado para bombardeamento de partículas em cultivo de suspensão embriogênica de soja e transformado exatamente conforme descrito anteriormente na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Cultivo de suspensão embriogênica de soja foi iniciado, cultivado, mantido e eventos foram selecionados e amadurecidos exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935. Neste caso, higromicina foi utilizada para seleção. Eventos de cada um dos três experimentos foram selecionados no estágio de embrião pelo perfil de ácidos graxos por meio de métodos descritos no presente e os que exibem fenótipo de ácido oleico mais alto avançaram.

[0398] Embriões de eventos selecionados foram secos, germinados e plantas T0 foram cultivadas e mantidas exatamente conforme descrito na Patente PCT publicada n° WO 2008/147935.

[0399] Cerca de 36 sementes T1 de plantas T0 para cada evento foram colhidas e sementes T1 individuais foram analisadas para determinar o teor de óleo e proteína utilizando espectrometria próxima de infravermelho por meio de métodos familiares dos conhecidos na técnica (Agelet et al (2012), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (34): 8314-8322).

[0400] As sementes também foram analisadas para determinar o perfil de ácidos graxos, a fim de identificar sementes transgênicas e nulas. As sementes que contêm teor de ácido oleico de mais de cerca de 30%, resultante da expressão do precursor de amiRNA 396b-fad2-1b/159-fad2-2, foram consideradas transgênicas. As sementes com teor de ácido oleico de cerca de menos de 30% foram consideradas sementes nulas.

[0401] Para cada evento, foi determinado o teor de óleo médio de todas as sementes transgênicas e todas as sementes nulas. O teor de óleo médio de sementes nulas foi subtraído em seguida do teor de óleo médio das sementes transgênicas e a diferença é relatada na Tabela 35 (% delta de óleo médio). A diferença do teor de proteína médio entre sementes transgênicas e nulas foi determinada de forma similar e é exibida na Tabela 35 (% delta de proteína médio). A soma do % delta de óleo médio e do % delta de proteína médio (% delta de proteína e óleo médio) também é exibido na Tabela 35. Para uma quantidade representativa de eventos de cada construto, pelo menos 24 sementes germinaram em solo e a taxa de germinação foi determinada dez dias após o plantio.

[0402] Na Tabela 35, o nome do experimento (Exp.), o gene sendo expresso (Gene) e o nome de evento (Evento) também são exibidos. TABELA 35 RESUMO DA DIFERENÇA DE TEORES DE PROTEÍNA E ÓLEO MÉDIOS ENTRE SEMENTE T1 TRANSGÊNICA E NULA DE EVENTOS DE SOJA QUE EXPRESSAM GMLECI, GMFUSCA3-1 OU GMODPI:

[0403] A Tabela 35 demonstra que o teor médio de óleo e proteína aumenta quando GmFusca3-1, GmODP1 ou GmLec1 é sobre-expresso em soja sob controle do promotor GmSus em comparação com a média de sementes nulas. Óleo e proteína aumentam em até 2,9 a 4,3 pontos nesses eventos. A Tabela 35 também demonstra que a frequência de germinação de sementes T1 de eventos com aumento significativo e óleo e proteína devido à expressão de fatores de transcrição de ODP1, LEC1 e Fusca3 pode ser de até 99%, 91% e 78%, respectivamente.

[0404] Foram plantadas sementes T1 de eventos que se segregam como cópia isolada (Fenótipo de alto teor de oleico: Nulo = 3:1), as plantas foram cultivadas exatamente como plantas T0 e foram obtidas sementes T2. Sementes T2 desses eventos foram analisadas para determinar o teor de ácido oleico, óleo e proteína exatamente conforme descrito no presente e os resultados são exibidos para Óleo 109 na Tabela 36.

[0405] Para cada evento, foi determinado o teor de óleo médio de todas as sementes T2 homozigóticas transgênicas e todas as sementes nulas. O teor de óleo médio de sementes nulas foi subtraído em seguida do teor de óleo médio das sementes transgênicas T2 homozigóticas e a diferença é relatada na Tabela 36 (% delta de óleo médio). A diferença do teor de proteína médio entre sementes transgênicas homozigóticas T2 e nulas foi determinada de forma similar e é exibida na Tabela 36 (% delta de proteína médio). A soma do % delta de óleo médio e do % delta de proteína médio (% delta de proteína e óleo médio) também é exibido na Tabela 36. TABELA 36 RESUMO DA DIFERENÇA DE TEORES DE PROTEÍNA E ÓLEO MÉDIOS ENTRE SEMENTE TRANSGÊNICA HOMOZIGÓTICA E NULA T2 DE EVENTOS DE SOJA QUE EXPRESSAM GMODPI

[0406] A Tabela 36 demonstra que o teor de óleo e proteína médio aumenta quando GmODP1 é sobre-expresso em soja sob controle do promotor GmSus em comparação com a média de sementes nulas. Óleo e proteína aumentam em até 3,0 a 4,7 pontos nesses eventos de cópia isolada.

EXEMPLO 14 IDENTIFICAÇÃO DE PROMOTORES ESPECÍFICOS DE SEMENTES PARA DIRIGIR A EXPRESSÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO EM PLANTAS OLEAGINOSAS LEGUMINOSAS:

[0407] Foi descrita a família de gene sacarose sintase de Arabidopsis e o papel de membros de família genética específicos durante o desenvolvimento de sementes, especificamente a mobilização de sacarose para a biossíntese de compostos de armazenagem de sementes (Ruuska, S. A. et al (2002), Plant Cell 14: 1191-1206; Baud S. et al (2004), J. Exp. Bot. 55: 397-409; Baud, S. e Graham, I. A. (2006), Plant J. 46: 155-169; Angeles-Nunez, J. G. e Tiessen, A. (2010), Planta 232 (3): 701-718; Angeles-Nunez, J. G. e Tiessen, A. (2012), Plant Mol. Biol. 78 (4-5): 377-392). A presente invenção descreve a utilidade de uma sequência promotora de um membro da família genética de sacarose sintase de soja específico, Glyma13g17420, que possui sequência de aminoácidos deduzida altamente similar ao produto genético At5g49190 (Patente PCT Publicada n° WO 2010114989 A1), para dirigir a expressão de genes de fator de transcrição heterológa ou nativa tais como LEC1, FUSCA3 e ODP1 de forma que permita o aumento do acúmulo de proteína e óleo durante o desenvolvimento de sementes oleaginosas leguminosas. Glyma13g17420 é expresso durante a maturação de embriões de soja em sincronia com o acúmulo de óleo e proteína (Severin, A. J. et al (2010), BMC Plant Biology 10: 160). Genes homólogos a Glyma13g17420 podem ser identificados em outras espécies de plantas leguminosas com base na similaridade de sequências de aminoácidos com o produto genético Glyma13g17420 e o padrão de expressão do homólogo durante o desenvolvimento de sementes. Os técnicos no assunto reconhecerão que sequências promotoras desses genes terão utilidade na expressão de genes de fatores de transcrição para maior acúmulo de óleo e proteína em sementes oleaginosas leguminosas.

EXEMPLO 15 IDENTIFICAÇÃO DA VARIABILIDADE DE SEQUÊNCIAS NO PROMOTOR GLYMA13G17420 E 5’ UTR EM LINHAGENS DE CULTIVO DE GLYCINE MAX

[0408] Sequenciamento de DNA genômico de uma série de linhagens de soja foi realizado por meio de métodos de sequenciamento de alto rendimento de última geração de acordo com as instruções do fabricante (Illumina, San Diego, Estados Unidos). Sequência genômica correspondente ao promotor, 5’ UTR e primeiro exon do gene Glyma13g17420 (SEQ ID NO: 8) foi montada para cada linhagem de soja das leituras de sequenciamento genômico. Esta região corresponde à sequência Gm13:21,216,136-21,219,309 no Conjunto Genômico de Soja Glyma1.01 (JGI). Dados de sequenciamento de leitura curtos foram extraídos para esta região a partir das linhagens de soja. Variantes polimórficas e variantes de inserção/exclusão foram detectadas a partir dos dados de sequenciamento e os alinhamentos foram inspecionados visualmente para determinar se as variantes identificadas podem haver sido causadas por erros de sequenciamento.

[0409] Os resultados de sequenciamento encontram-se resumidos na Figura 4 (linhagens sem variantes não foram relatadas). Os resultados indicam que existe diversidade significativa na sequência de DNA genômico que compreende o promotor, 5’ UTR e o primeiro intron do gene Glyma13g17420 dentro de diferentes linhagens de soja. Os técnicos no assunto reconhecerão que sequências reguladoras do gene Glyma13g17420 que inclui promotor, 5’ UTR e primeiro intron derivado de acessos de soja (Glycine max) divergentes terão utilidade na expressão de genes de fatores de transcrição para maior acúmulo de óleo e proteína em sementes oleaginosas leguminosas.

Claims (9)

1. CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizado por compreender pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipeptídeo de Proteína de Desenvolvimento de Óvulos 1 (ODP1), que compreende SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 69, em que o pelo menos um polinucleotídeo é ligado operativamente a um promotor de sacarose sintase de soja que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 8, em que a expressão do mencionado polipeptídeo em uma semente de soja transgênica que compreende o construto de DNA recombinante resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

2. CONSTRUTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mencionada semente de soja transgênica que compreende o mencionado construto de DNA recombinante possuir germinação normal, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

3. CONSTRUTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo construto de DNA recombinante compreender adicionalmente um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT.

4. CONSTRUTO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo segundo polinucleotídeo heterólogo compreender SEQ ID NO: 54.

5. CONSTRUTO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo segundo polipeptídeo heterólogo compreender SEQ ID NO: 59.

6. CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pela coexpressão de mencionado polipeptídeo e mencionado polipeptídeo DGAT na semente de soja transgênica compreender o construto de DNA recombinante em um aumentado do teor de óleo na semente transgênica, quando comparado à semente controle que expressa mencionado polipeptídeo DGAT a partir de mencionado promotor específico de semente, mas não expressa mencionado polipeptídeo ODP1.

7. CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de semente ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT, em que coexpressão de dito polipeptídeo e dito polipeptídeo DGAT em uma semente de soja transgênica compreende mencionado construto de DNA recombinante e mencionado segundo construto de DNA recombinante resulta em um aumento do teor de óleo na semente transgênica, quando comparado à uma semente controle que compreende apenas uma, mas não ambas, do construto de DNA recombinante e o segundo construto de DNA recombinante.

8. MÉTODO DE AUMENTO DO TEOR DE ÓLEO DE SEMENTES DE SOJA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável do construto de DNA recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica compreende o construto recombinante e exibe aumento do teor de óleo da semente, mantendo ao mesmo tempo germinação normal, em comparação com uma semente de soja controle que não compreende o construto de DNA recombinante.

9. MÉTODO DE AUMENTO DO TEOR DE ÓLEO DE SEMENTES DE SOJA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) introdução em uma célula de soja regenerável do construto de DNA recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e um segundo construto de DNA recombinante que compreende um promotor específico de sementes ligado operativamente a um segundo polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo DGAT; (b) regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de soja regenerável de (a), em que a planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante e o segundo construto de DNA recombinante; e (c) seleção de uma planta transgênica da etapa (b), em que a semente da planta transgênica compreende o construto de DNA recombinante e o segundo construto de DNA recombinante, e em que a coexpressão do mencionado polipeptídeo e do mencionado polipeptídeo DGAT em uma semente de soja transgênica resulta em aumento do teor de óleo na semente de soja transgênica, em comparação com uma semente de soja controle que compreende apenas uma, exceto ambas, do construto de DNA recombinante e os segundos construtos de DNA recombinante.

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