CN116286954A - 水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变体构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于种子科学与技术学领域，公开了水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7敲除突变体材料在提高水稻种子活力中的应用。所述的水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变后，在正常和盐胁迫下水稻种子萌发与幼苗形成能力显著提升。证明本发明OsGA2ox7基因敲除后能够提高水稻种子活力，利用该基因敲除材料有助于高种子活力水稻品种的遗传改良，有利于水稻直播生产。

Description

水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变体构建及其应用
技术领域
本发明属于种子科学与技术领域，涉及水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变体构建及其在种子活力中的应用，具体的，是在提高种子活力中的应用，专用于高活力种子水稻品种选育的遗传改良。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)作为我国重要的粮食作物，其直播种植面积逐渐不推而广。低种子活力水稻品种，萌发缓慢，成苗弱，抗杂草、病害能力差，不利于直播水稻生产。利用分子生物学技术，培育高活力水稻品种，对直播水稻高产、优质生产具有重要的意义。
种子活力是多基因控制的复杂数量性状。目前，至少克隆了10个种子萌发相关基因，qLTG3-1、Sdr4、OsVP1、OsGA20ox1、OsFbx352、qSE3、OsIPMS1、GD1、OsPK5和OsHIPL1等。但是，关于负调控水稻种子活力相关的基因很少。
植物赤霉素(GA)在种子萌发过程中扮演重要角色。在水稻种子萌发过程中，种胚中GA能够从盾片运输至糊粉层，诱导α-淀粉酶释放并运输至胚乳当中，促进淀粉水解，成为低分子可溶性葡萄糖，为种子萌发提供能源物质。已有研究表明，外施GA能够显著促进种子萌发与幼苗形成。植物内源GA含量取决于GA合成和分解代谢途径。水稻GA合成基因OsGA20ox1被已报道，能促进种子萌发，提高种子活力。GA分解基因，如OsGA2ox5、OsGA2ox6和OsGA2ox9，在水稻中也被鉴定出。但是，GA分解基因在水稻在种子萌发过程中的具体作用尚有明确的报道。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，申请人发现水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变能够显著的提高水稻种子活力。因此，利用本发明可以通过基因编辑技术突变水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7，或通过与水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变体杂交，培育高活力水稻新品种，对水稻直播生产具有重要意义。
本发明的第一个目的是提供敲除水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7在提高水稻种子活力中的应用。
进一步的，敲除水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7在正常条件和/或在盐条件下提高水稻种子活力。
进一步的，所述提高种子活力包括提高种子萌发率和/或提高种子萌发指数和/或提高成苗率和/或改良水稻种子活力遗传特性。
进一步的，所述水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGGTGGTGCTTGCCAAGGGCGAGCTCGAGCAGATAGCCCTGCCGGCGGCGCACCCGCCGCCAGCCGACGTGCGCGCGATCGACCTGTCCGCCACGGGTCCCGCCCGCGCGGCGGAGGCGCGCGCGCTGGTGGCGGCGTGCGAGGAGCAGGGGTTCTTCCGGGTGACGGGCCACGGCGTGCCGCCGGGGCTGGTGCGCGCCGCGGAGGCCGCCGCGGCGCGGTTCTTCGCGCTGCCGCAGCCCGACAAGGAGGCCGCCGCAGGGGCGCCGCTCGGGTACGCCAGCAAGCGGATCGGCAGCGCCGGCGACCTCGGCTGGATCGAGTACCTGCTACTCTGCCTCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCGGCATTGCCGTGCGCCGCGACGTCGCCCACGCCTCCTTGCCCCTTACGGGAGCTTCTACGCGAGTACAGCGCGGCGGTGCGGCGGGTGGCGTGCGGCGTGCTGGAGCTGATGGCGGAGGGGCTCGGCGTCGGGCCGGCGGACGCGCTGGCGCGGCTGGTGGCGCGCGAGGACAGCGACTCCATCCTCAGGGTGAACCACTACCCGCCGCGCCCCGATCAGCTGGGCGGCGGCGGCGGGCCGAACCTGACGGGGTTCGGCGAGCACACCGACCCGCAGATCATCTCCGTGCTCCGCTCCAACGGCGCCCCCGGGCTGGAGATCTCCCTCCGTGACGGCGCCTGGGCGTCCGTGCCGCACGACGGCGACGGCGACTCCTTTTTCGTCAACGTCGGCGACACCCTCCAGGTGCTAACGAACGGGAGGTTCAGGAGCGTGAAGCACAGGGTGGTGGTGAACAGCGAGAAGTCGAGGGTGTCCATGGTCTTCTTCGGCGGCCCGCCGCCCGGCGAGAGGCTGGCGCCGCTGCCGGCGTTATTAGGGGACGGCGGCCGGAGCCGGTACAGGGAGTTCACCTGGAAGGAGTACAAGGGCAGCGGCTGCAAGGGCCGGCTCGCCGACGACAGGCTCTGCAGATTTGAGAACTAG。
进一步的，所述水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MVVLAKGELEQIALPAAHPPPADVRAIDLSATGPARAAEARALVAACEEQGFFRVTGHGVPPGLVRAAEAAAARFFALPQPDKEAAAGAPLGYASKRIGSAGDLGWIEYLLLCLAPAAAAAALPCAATSPTPPCPLRELLREYSAAVRRVACGVLELMAEGLGVGPADALARLVAREDSDSILRVNHYPPRPDQLGGGGGPNLTGFGEHTDPQIISVLRSNGAPGLEISLRDGAWASVPHDGDGDSFFVNVGDTLQVLTNGRFRSVKHRVVVNSEKSRVSMVFFGGPPPGERLAPLPALLGDGGRSRYREFTWKEYKGSGCKGRLADDRLCRFEN。
本发明的第二个目的是提供一种提高水稻种子活力的方法，所述方法为基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7敲除突变体，获得提高水稻种子活力的植株。
进一步的，所述方法包括以下步骤：
(1)水稻基因OsGA2ox7突变体转基因构建：筛选水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的敲除靶位点，根据敲除靶位点，设计OsGA2ox7靶位点敲除引物，获得OsGA2ox7基因的点突变目标片段靶序，构建载体后转化水稻，获得水稻OsGA2ox7 CRISPR/Cas9突变体；
(2)水稻突变体筛选与鉴定：采用靶点检测引物扩增水稻OsGA2ox7 CRISPR/Cas9突变体幼叶中基因组，进行常规PCR产物测序，筛选纯合突变体植株，即为提高水稻种子活力的植株。
进一步的，水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的敲除靶位点1如SEQ ID NO.3所示：CTCGAGCAGATAGCCCTGC；敲除靶位点2如SEQ ID NO.4所示：CAGGGGTTCTTCCGGGTGA。
进一步的，敲除引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示：
SEQ ID NO.5：AATAATGGTCTCAGGCGCTCGAGCAGATAGCCCTGC。
SEQ ID NO.6：GCTCGAGCAGATAGCCCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。
SEQ ID NO.7：TCACCCGGAAGAACCCCTGCGCTTCTTGGTGCC。
SEQ ID NO.8：ATTATTGGTCTCTAAACTCACCCGGAAGAACCCCTG。
进一步的，靶点检测引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
SEQ ID NO.10：TTGGCTGCGTAGCGTGTA。
SEQ ID NO.11：CCAAAGGAACGGAGGAGA。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开一种培育高活力水稻品种的方法，实现方案是通过敲除水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7，使其尚失生物学功能，促进水稻在正常和盐胁迫下的种子活力，改良水稻种子活力遗传特性。
本发明也为选育高活力种子水稻新品种提供了理论技术支撑，对直播水稻生产具有重要意义。
附图说明
图1水稻突变体Osga2ox7植株OsGA2ox7基因结构与蛋白氨基酸序列。(a)OsGA2ox7基因结构；(b)OsGA2ox7蛋白氨基酸序列。
图2正常条件下水稻突变体Osga2ox7与其对照日本晴(Nip)的种子萌发表型。(a)为第3天的种子萌发表型；(b-d)分别为种子萌发率(Germination rate,GR)、成苗率(Seedling rate,SR)和种子萌发指数(Germination index,GI)。*表示在0.05水平上具有显著性差异；Bar＝1cm。图3 150mM NaCl条件下水稻突变体Osga2ox7与其对照日本晴(Nip)的种子萌发表型。(a)为第4天的种子萌发表型；(b-d)分别为种子萌发率(Germinationrate,GR)、成苗率(Seedling rate,SR)和种子萌发指数(Germination index,GI)。**表示在0.01水平上具有显著性差异；Bar＝1cm。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由南京思普金生物科技有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、连接酶、DNA ladder、高保真酶、载体等购自宝日医生物技术(北京)有限公司；RNA提取试剂盒购于北京全式金生物技术；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美吉生物科技有限公司，方法均参照说明书进行。
实施例1：基因克隆
利用粳稻品种日本晴萌发种子cDNA为模板克隆OsGA2ox7基因序列。获得水稻OsGA2ox7基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
实施例2：OsGA2ox7突变体植株构建
(一)水稻OsGA2ox7基因突变点靶定：
登入网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选OsGA2ox7基因靶点，在第1外显子上选择两个19bp目标片段的特异靶点，对应的两个靶序列sgRNA1和sgRNA2，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
针对2个选定的目标片段的特异靶点，设计OsGA2ox7靶定点突变位点特异性4条引物，敲除引物序列如SEQ ID NO.5-8所示；
以稀释100倍的pCBC-MT1T2载体为模板进行4条引物PCR扩增，电泳检测，且将扩增产物进行纯化回收，克隆获得OsGA2ox7基因的点突变目标片段特异靶序列sgRNA3，序列如SEQ ID NO.9所示。
(二)酶切-连接体系(15μL)：
PCR体系：点突变目标DNA片段，2μL；pBUE411载体，2μL；10xNEB T4 Buffer，1.5μL；10xBSA，1.5μL；BsaI(NEB)，1μL；T4 Ligase(NEB)/高浓度，1μL；ddH2O，6μL；
酶切-连接PCR反应程序：37℃，5小时；50℃，5分钟；80℃，10分钟。
(三)突变体株系的获得：
构建的水稻OsGA2ox7 CRISPR/Cas9突变体sgRNA3靶序列如序列表SEQ ID NO.9所示，通过(二)所述BsaI酶切连接体系，将OsGA2ox7基因的点突变靶序列sgRNA3连接到pHUE411载体上，得到的含有pHUE411-Target载体的质粒转化农杆菌；通过农杆菌介导的水稻转基因技术将带有转化质粒的农杆菌转化野生型的粳稻品种日本晴愈伤组织中。
SEQ ID NO.9：
ATATATGGTCTCTGGCCTCGAGCAGATAGCCCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTTCGTTTTGCATTGAGTTTTCTCCGTCGCATGTTTGCAGTTTTATTTTCCGTTTTGCATTGAAATTTCTCCGTCTCATGTTTGCAGCGTGTTCAAAAAGTACGCAGCTGTATTTCACTTATTTACGGCGCCACATTTTCATGCCGTTTGTGCCAACTATCCCGAGCTAGTGAATACAGCTTGGCTTCACACAACACTGGTGACCCGCTGACCTGCTCGTACCTCGTACCGTCGTACGGCACAGCATTTGGAATTAAAGGGTGTGATCGATACTGCTTGCTGCTCATGAATCCAAACCACACGGAGTTCAAATTCCCACAGATTAAGGCTCGTCCGTCGCACAAGGTAATGTGTGAATATTATATCTGTCGTGCAAAATTGCCTGGCCTGCACAATTGCTGTTATAGTTGGCGGCAGGGAGAGTTTTAACATTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTGAGAAATAATAATTGACAAGTAGATACTGACATTTGAGAAGAGCTTCTGAACTGTTATTAGTAACAAAAATGGAAAGCTGATGCACGGAAAAAGGAAAGAAAAAGCCATACTTTTTTTTAGGTAGGAAAAGAAAAAGCCATACGAGACTGATGTCTCTCAGATGGGCCGGGATCTGTCTATCTAGCAGGCAGCAGCCCACCAACCTCACGGGCCAGCAATTACGAGTCCTTCTAAAAGCTCCCGCCGAGGGGCGCTGGCGCTGCTGTGCAGCAGCACGTCTAACATTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAGGGAGCAGAACCAGCTTATAAGCGGAGGCGCGGCACCAAGAAGCCAGGGGTTCTTCCGGGTGAGTTTAGAGACCAATAAT。
(四)水稻突变体筛选与鉴定
根据克隆的OsGA2ox7基因第1外显子上2个特异靶点的目标片段物理位置，设计突变体材料PCR验证引物，所述突变体点扩增上游引物序列如序列表SEQ ID NO.10所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示。利用突变体材料PCR验证引物，扩增水稻OsGA2ox7CRISPR/Cas9突变体靶序列，筛选纯合突变体植株。获得突变体提前终止翻译Osga2ox7-1和发生移码突变Osga2ox7-2，水稻OsGA2ox7突变体植株Osga2ox7-1和Osga2ox7-2基因和编码氨基酸的结构示意图如所述附图1所示。
实施例3：突变体OsGA2ox7植株种子萌发表型分析
(一)种子萌发试验：
利用获得的OsGA2ox7基因的纯合突变体Osga2ox7-1和Osga2ox7-2植株种子，以及野生型对照日本晴(Nip,WT)水稻品种，进行如下种子萌发试验：每次重复挑选健康饱满的种子30粒，用2％的次氯酸钠溶液表面消毒10min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，均匀平铺于培养皿(直径9cm)中，正常条件下倒入10mL蒸馏水，盐胁迫下倒入150mM NaCl溶液，放置25℃条件下光照/黑暗各12h培养7d后，最后统计萌发与成苗情况。试验重复3次。
(二)结果分析：
相对野生型对照日本晴(Nip,WT)，水稻突变体Osga2ox7-1和Osga2ox7-2在正常(H2O)和盐(150mM NaCl)条件下种子萌发率、萌发指数与成苗率均显著上升。在盐胁迫下水稻突变体Osga2ox7-1和Osga2ox7-2种子萌发率、萌发指数与成苗率比在正常条件下的提升程度更加明显。水稻突变体Osga2ox7-1和Osga2ox7-2以及野生型对照日本晴(Nip,WT)在正常和盐条件下的具体种子萌发表型如所述附图2和3所示。可见，水稻OsGA2ox7基因敲除能够显著提高水稻正常和盐胁迫下的种子萌发与幼苗生长，提高水稻种子活力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.敲除水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7在提高水稻种子活力中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，敲除水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7在正常条件和/或在盐条件下提高水稻种子活力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高种子活力包括提高种子萌发率和/或提高种子萌发指数和/或提高成苗率和/或改良水稻种子活力遗传特性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种提高水稻种子活力的方法，其特征在于，所述方法为基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7敲除突变体，获得提高水稻种子活力的植株。
7.据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)水稻基因OsGA2ox7突变体转基因构建：筛选水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的敲除靶位点，根据敲除靶位点，设计OsGA2ox7靶位点敲除引物，获得OsGA2ox7基因的点突变目标片段靶序，构建载体后转化水稻，获得水稻OsGA2ox7 CRISPR/Cas9突变体；
(2)水稻突变体筛选与鉴定：采用靶点检测引物扩增水稻OsGA2ox7 CRISPR/Cas9突变体幼叶中基因组，进行常规PCR产物测序，筛选纯合突变体植株，即为提高水稻种子活力的植株。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7的敲除靶位点1如SEQ ID NO.3所示，敲除靶位点2如SEQ ID NO.4所示。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，敲除引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ IDNO.8所示。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，靶点检测引物如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11所示。
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