CN117925641A - 一种水稻垩白调控基因Chalk9及其编码蛋白质和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻垩白调控基因Chalk9及其编码蛋白质和应用，该基因在种子中优势表达，编码一个未知蛋白参与调控稻米垩白，并影响稻米理化品质。采用常规方法对Chalk9进行基因编辑，从而改变该基因的表达水平，进而获得Chalk9基因功能缺失的水稻新种质。本发明创建的水稻与亲本对照相比，在植株的生长发育和基本农艺性状方面没有显著差异，但是显著影响了稻米的垩白粒率和垩白度，稻米理化品质指标也发生改变。因此Chalk9基因调控稻米垩白的效应，为稻米品质的遗传改良提供了有用的基因资源，具有重要的育种利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻垩白调控基因Chalk9及其编码蛋白质和应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物。近年来我国水稻产量呈稳中有升趋势，但优质稻米的培育进程相对滞后。而随着人们生活水平的提高，对优质米的需求则逐渐增加。稻米外观品质是评价稻米品质的关键因素之一，同时也对稻米其他品质有一定的影响。稻米垩白程度高低直接决定了稻米对消费者的吸引力、稻米的商业价值。垩白是我国水稻品种优质达标率的最主要限制因素。因此，稻米垩白性状的改良是当前我国水稻(食用大米)育种亟需解决的难题。除了最常见的食用大米外，一些特殊的专用型大米培育，如清酒酿造大米、低谷蛋白大米等也走进了育种家的视野。不同于食用大米，高垩白对于清酒酿造大米则是一种有益效应(Zhang et al.,Molecular Plant 2023)。
垩白是籽粒胚乳中不透明的部分，是由胚乳中淀粉和储藏蛋白异常积累引起的，与籽粒灌浆过程密切相关。一般发生在稻米的腹部、背部、心部，从而产生腹白、背白和心白的表型。水稻垩白表型产生受多个遗传调控通路协同影响，主要涉及淀粉合成途径、蛋白合成转运通路、以及其他转录调控子、细胞器发育等间接影响淀粉和蛋白积累(Zhao et al.,Biotechnology Advances 2022)。垩白调控基因的挖掘还存在大量的空白，可利用的基因还非常有限(Wu et al.,The Plant Cell 2022)，远远不能满足优质食用、以及专用型水稻育种的需求。因此，需要继续加强垩白调控基因挖掘，从而利用有价值的基因来培育理想稻米品质的品种。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题，提供一种水稻垩白调控基因Chalk9及其编码蛋白质和应用，为稻米垩白性状改良提供新的基因资源。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种调控稻米垩白的基因Chalk9，其特征在于，所述Chalk9基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述Chalk9编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的调控稻米垩白的基因Chalk9在改变水稻籽粒垩白、以及稻米品质改良中的应用。
应用的方法如下：对水稻垩白基因Chalk9进行编辑，使得目标水稻品种中的Chalk9基因表达水平的改变，进而获得具有不同垩白表型的水稻植株。
Chalk9基因所用的重组载体pC1300-Chalk9-Cas9，包含Chalk9基因；载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
重组载体pC1300-Chalk9-Cas9的制备方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)进行连接，得到中间载体SK-gRNA-Chalk9；将测序鉴定正确的SK-gRNA-Chalk9中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接，获得重组载体pC1300-Chalk9-Cas9。
重组载体pC1300-Chalk9-Cas9的制备方法中，用于CRISPR/Cas9系统编辑Chalk9基因的特异性靶位点序列为5’-GCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’，所述引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Chalk9-cas9-F | 5’-GGCAGCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’ | SEQ ID NO.3 |
| Chalk9-cas9-R | 5’-AAACGCGTCTGTACTTGCTCGAGC-3’ | SEQ ID NO.4 |
。
本发明方法先进科学，通过本发明，第一方面，本发明提供一种水稻垩白调控基因Chalk9，Chalk9基因位于水稻第9号染色体上，基因编号为Os09g0368900(RAP-DB命名规则)，或LOC_Os09g20340(MSU命名规则)。Chalk9基因编码区核苷酸序列全长2061bp，序列如SEQ ID NO.1所示。所述Chalk9基因编码的氨基酸序列全长含有686个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供一种水稻垩白调控基因Chalk9在改变水稻籽粒垩白、稻米品质改良中的应用。
所述应用的方法如下：对水稻垩白基因Chalk9进行编辑，使得目标水稻品种中的Chalk9基因表达水平的改变，进而获得具有不同垩白表型的水稻植株。
所述基因编辑过程中所用的重组载体pC1300-Chalk9-Cas9，包含Chalk9基因。载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
重组载体pC1300-Chalk9-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-Chalk9；利用Kpn I和Bgl II将测序鉴定正确的中间载体SK-gRNA-Chalk9进行双酶切，回收目的片段(片段大小为300bp)并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接。
优选的，用于CRISPR/Cas9系统编辑Chalk9基因的特异性靶位点序列为5’-GCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’，所述引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Chalk9-cas9-F | 5’-GGCAGCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’ | SEQ ID NO.3 |
| Chalk9-cas9-R | 5’-AAACGCGTCTGTACTTGCTCGAGC-3’ | SEQ ID NO.4 |
通过本发明，本发明发现破坏Chalk9基因编码蛋白的生物学功能可以显著增加籽粒垩白、影响稻米的外观品质。本发明为水稻垩白性状调控，培育高垩白的酿酒专用性等水稻提供了有用的基因资源。
综上，本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻垩白调控基因Chalk9及其编码蛋白质和应用。该基因在种子中优势表达，编码一个未知蛋白参与调控稻米垩白，并影响稻米理化品质。采用常规方法对Chalk9进行基因编辑，从而改变该基因的表达水平，进而获得Chalk9基因功能缺失的水稻新种质。本发明创建的水稻与亲本对照相比，在植株的生长发育和基本农艺性状方面没有显著差异，但是显著影响了稻米的垩白粒率和垩白度，稻米理化品质指标也发生改变。因此Chalk9基因调控稻米垩白的效应，为稻米品质的遗传改良提供了有用的基因资源，具有重要的育种利用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1中水稻中Chalk9基因的时空表达模式。
图2是本发明实施例2中Chalk9基因编辑靶位点和突变类型示意图。
图3是本发明实施例3中Chalk9基因敲除株系的农艺性状分析。
图4是本发明实施例3中Chalk9基因敲除株系的垩白分析。
图5是本发明实施例3中Chalk9基因敲除株系的籽粒灌浆动态。
图6是本发明实施例3中Chalk9基因敲除株系的稻米理化品质分析。
具体实施方式
为便于理解本发明，以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1：水稻中Chalk9基因的时空表达模式分析；
本研究团队专注水稻种子优势表达基因调控稻米品质，筛选了一批种子优势表达基因，用于稻米品质调控效应研究。其中一个种子优势表达基因Chalk9，其编码蛋白含有686个氨基酸(SEQ ID NO.2)，对应基因包含了2061个核苷酸(SEQ ID NO.1)。上述基因核苷酸和氨基酸序列均来源于水稻品种日本晴参考基因组(rice.plantbiology.msu.edu)。
为了验证Chalk9基因的种子优势表达特性，在Chalk9基因外显子区，利用软件Primer Premier 5设计一对跨外显子的引物，用于定量PCR分析，引物序列如下：
以粳稻中花11亲本为材料，取水稻植株根、茎、叶、叶鞘、幼穗以及开花后不同时期的种子，将样品置于液氮中研磨、破碎细胞并进行总RNA的提取，然后利用反转录试剂盒进行第一链cDNA合成。利用定量PCR试剂盒和上述已设计好的定量PCR引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)检测Chalk9基因在不同组织中的表达水平。检测结果如附图1所示，Chalk9基因只在水稻籽粒灌浆期间高丰度表达，是一个种子优势表达的基因，说明该基因在种子发育过程中可能具有重要的作用。
实施例2：水稻中Chalk9基因敲除载体构建和遗传转化；
本研究根据现有CRISPR/Cas9相关实验方法，在Chalk9基因的外显子上选择含有NGG作为PAM位点的5’-CATTGCTCTAAGGCAGTTTG-3’序列作为敲除靶位点，并利用在线工具targetDesign软件设计用于基因编辑载体构建的引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)。CRISPR/Cas9基因编辑载体构建引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Chalk9-cas9-F | 5’-GGCAGCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’ | SEQ ID NO.3 |
| Chalk9-cas9-R | 5’-AAACGCGTCTGTACTTGCTCGAGC-3’ | SEQ ID NO.4 |
本研究所用的CRISPR/Cas9载体系统由中国水稻所王克剑研究员提供，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终表达载体pC1300-Cas9，其DNA骨架分别来源于pBlueScript(SK+)载体和pCAMBLA1300载体。
具体过程如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物(Chalk9-cas9-F/R)进行连接，得到中间载体SK-gRNA-Chalk9；将测序鉴定正确的SK-gRNA-Chalk9中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终表达载体pC1300-Cas9连接，获得重组载体pC1300-Chalk9-Cas9。随后，通过热激法将pC1300-Chalk9-Cas9载体转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素筛选，获得含有pC1300-Chalk9-Cas9载体的阳性农杆菌；
用上述含pC1300-Chalk9-Cas9的阳性农杆菌菌株，利用农杆菌介导的方法转化水稻中花11的愈伤组织细胞，水稻愈伤组织经潮霉素抗性筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤转移至分化培养基，经分化培养获得阳性转基因幼苗，最终经检测鉴定后移栽至大田，获得T0代水稻植株。
实施例3：Chalk9基因敲除株系的表型分析；
1.转基因植株检测；
利用农杆菌介导的遗传转化方法共获得30株幼苗，首先用潮霉素抗性基因的通用PCR检测引物，经PCR检测获得含有潮霉素抗性的阳性苗；然后，在敲除靶位点序列上下游设计一对PCR测序引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)，用于检测靶位点附近的序列变异情况。基于靶位点两侧序列的PCR扩增并测序分析后，获得3种Chalk9基因突变类型(附图2)。测序引物序列如下
2.Chalk9基因敲除株系的稻米垩白分析；
为了了解Chalk9基因的生物学功能，对水稻综合农艺性状进行调查。在T0和T1代种植中，对不同株系农艺性状进行了调查发现，与野生型亲本中花11相比，Chalk9基因敲除株系的株高、分蘖数、主穗长、剑叶长、剑叶宽没有差异(附图3)。Chalk9基因敲除株系的成熟籽粒在千粒重、粒长、粒宽、粒厚等方面也没有明显差异(附图3)；但在籽粒外观品质方面，垩白度和垩白粒率显著增加(附图4)。进一步追踪籽粒灌浆动态，发现在开花后17天左右，Chalk9基因敲除株系的籽粒开始出现与野生型中花11不一致的外观表型，具体表现为籽粒有明显的不透明现象(附图5)。说明Chalk9基因可特异调控籽粒垩白。
3.Chalk9基因敲除株系的稻米理化品质分析；
为了评价Chalk9基因的育种利用价值，进一步分析垩白对稻米理化品质的影响。与野生型亲本中花11相比，Chalk9基因敲除株系的直链淀粉含量增加、总蛋白含量、可溶性糖含量减少。结果表明Chalk9基因敲除后，除产生垩白外，也会导致稻米理化品质发生改变(附图6)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，然而并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，可利用上述揭示的技术内容对本发明做出可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，在未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均落在本发明技术方案保护范围内。
Claims (7)
1.一种调控稻米垩白的基因Chalk9，其特征在于，所述Chalk9基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种调控稻米垩白的基因Chalk9，其特征在于，所述Chalk9编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述的调控稻米垩白的基因Chalk9在改变水稻籽粒垩白、以及稻米品质改良中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用的方法如下：对水稻垩白基因Chalk9进行编辑，使得目标水稻品种中的Chalk9基因表达水平的改变，进而获得具有不同垩白表型的水稻植株。
5.一种如权利要求4所述的应用，其特征在于，Chalk9基因所用的重组载体pC1300-Chalk9-Cas9，包含Chalk9基因；载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，重组载体pC1300-Chalk9-Cas9的制备方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶AarI进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-Chalk9；将测序鉴定正确的SK-gRNA-Chalk9中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接，获得重组载体pC1300-Chalk9-Cas9。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，重组载体pC1300-Chalk9-Cas9的制备方法中，用于CRISPR/Cas9系统编辑Chalk9基因的特异性靶位点序列为5’-GCTCGAGCAAGTACAGACGC-3’，所述引物序列如下：
。
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