CN118086324A - 一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC及利用基因qAC改良直链淀粉含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC及利用基因qAC改良直链淀粉含量的方法，所述qAC基因包括qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因，其中qAC6.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，qAC6.2基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，qAC9.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述qAC6.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，qAC6.2基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，qAC9.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过本发明，该水稻qAC基因在种子中高表达，可特异改良水稻籽粒的直链淀粉含量，而对水稻植株其他主要农艺性状无显著影响。利用基因工程技术在水稻中敲除qAC基因可显著降低稻米直链淀粉含量，改良稻米蒸煮食味品质，因而qAC基因在水稻的优质育种中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC及利用基因qAC改良直链淀粉含量的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
水稻是世界上一半以上人口的主粮，我国是全球水稻生产和消费第一大国。近年来，随着人们生活水平的提高和稻米市场的开放，稻米作为商品进行广泛交易，人们对稻米品质也提出了越来越高的要求。而此前我国水稻育种一直以高产作为主要目标，品质改良进展相对缓慢，导致我国优质稻米品种较少。因此，在保证产量的基础上，进一步改良稻米品质是我国水稻育种的最重要目标。
直链淀粉与总淀粉的比值称为直链淀粉含量(amylose content，AC)，直链淀粉含量在很大程度上决定了稻米的蒸煮食味品质的优劣。直链淀粉含量过高的稻米，米质相对较差，胀性大，成饭后偏硬；而直链淀粉含量低于2％的糯米，米饭太软，弹性差；具有低直链淀粉含量(8％-12％)的软米米质介于糯性与粘性之间，米饭食味好。
Wx基因是直链淀粉合成的关键酶基因，编码颗粒结合淀粉合成酶I(Granule-Bound Starch Synthase I，GBSSI)。Wx基因序列变异会引起GBSSI酶活性的改变，从而影响稻米直链淀粉含量，改变米饭的柔软性。除了Wx基因，Du13等基因可通过直接调控Wxb等位基因的前体mRNA剪接，引起直链淀粉含量的变化(Cai et al.,Plant BiotechnologyJournal 2022)。此外，为了创制不同直链淀粉含量的稻米，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术精准编辑Wx基因编码区或上游调控区，获得了不同直链淀粉含量的水稻新种质(Zeng etal.,Plant Biotechnology Journal 2020；Huang et al.,Plant Biotechnology Journal2020)。
目前不同直链淀粉含量水稻种质的创制主要围绕Wx基因，鉴定和克隆新的直链淀粉含量基因，将丰富水稻基因资源，为创制新的优质水稻新种质奠定基础。此前，专注水稻种子优势表达基因调控稻米品质，筛选了一批种子优势表达基因，研究其调控稻米品质的效应。其中qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因(本发明中qAC基因是其统称)只在水稻籽粒灌浆期间高表达，是种子优势表达的基因，说明qAC基因在种子发育过程中可能具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是针对上述稻米食味品质改良过程中存在的问题，提供一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC及利用基因qAC改良直链淀粉含量的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC，其特征在于，所述qAC基因包括qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因，其中qAC6.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，qAC6.2基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，qAC9.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述qAC6.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，qAC6.2基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，qAC9.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
qAC基因在调控稻米直链淀粉含量、改良稻米食味品质中的应用。
所述应用的方法如下：对水稻直链淀粉含量基因qAC进行编辑，使得目标水稻品种中的qAC基因表达水平的改变，进而获得具有不同稻米直链淀粉含量的水稻植株。
基因编辑过程中所用的重组载体pC1300-qAC6.1-Cas9、pC1300-qAC6.2-Cas9、pC1300-qAC9.1-Cas9，分别包含qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因；载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
重组载体pC1300-qAC6.1-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC6.1；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC6.1中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.1基因的特异性靶位点序列为5’-CGCTGCTTTCAGCCCGGCAA-3’，所述引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| qAC6.1-cas9-F | GGCACGCTGCTTTCAGCCCGGCAA | SEQ ID NO.7 |
| qAC6.1-cas9-R | AAACTTGCCGGGCTGAAAGCAGCG | SEQ ID NO.8 |
。
重组载体pC1300-qAC6.2-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC6.2；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC6.2中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.2基因的特异性靶位点序列为5’-TGGTGGGGCGGGAGGAGCAG-3’，所述引物序列如下：
| qAC6.2-cas9-F | GGCATGGTGGGGCGGGAGGAGCAG | SEQ ID NO.9 |
| qAC6.2-cas9-R | AAACCTGCTCCTCCCGCCCCACCA | SEQ ID NO.10 |
。
重组载体pC1300-qAC9.1-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC9.1；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC9.1中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC9.1基因的特异性靶位点序列为5’-GGTCTCGTGCTCCTCGTGGG-3’；所述引物序列如下：
| qAC9.1-cas9-F | GGCAGGTCTCGTGCTCCTCGTGGG | SEQ ID NO.11 |
| qAC9.1-cas9-R | AAACCCCACGAGGAGCACGAGACC | SEQ ID NO.12 |
。
本发明方法先进科学，通过本发明，第一方面，本发明提供一种水稻qAC基因，其中qAC6.1基因位于水稻第6号染色体上，基因编号为Os06g0141400(RAP-DB命名规则)，或LOC_Os06g04930(MSU命名规则)。qAC6.1基因编码区核苷酸序列全长426bp，序列如SEQ ID NO.1所示。所述qAC6.1基因编码的氨基酸序列全长含有141个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
qAC6.2基因位于水稻第6号染色体上，基因编号为Os06g0528300(RAP-DB命名规则)，或LOC_Os06g33690(MSU命名规则)。qAC6.2基因编码区核苷酸序列全长621bp，序列如SEQ ID NO.3所示。所述qAC6.2基因编码的氨基酸序列全长含有206个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
qAC9.1基因位于水稻第9号染色体上，基因编号为Os09g0427800(RAP-DB命名规则)，或LOC_Os09g25890(MSU命名规则)。qAC9.1基因编码区核苷酸序列全长2661bp，序列如SEQ ID NO.5所示。所述qAC9.1基因编码的氨基酸序列全长含有886个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明提供一种水稻qAC基因在改变直链淀粉含量方面的应用。
所述应用的方法如下：对水稻基因qAC进行编辑，使得目标水稻品种中的qAC基因表达水平的改变，进而获得具有不同直链淀粉含量的水稻植株。
所述基因编辑过程中所用的重组载体pC1300-qAC6.1-Cas9、pC1300-qAC6.2-Cas9、pC1300-qAC9.1-Cas9，分别包含qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因。载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
重组载体pC1300-qAC-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接。
优选的，用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.1基因的特异性靶位点序列为5’-CGCTGCTTTCAGCCCGGCAA-3’，用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.2基因的特异性靶位点序列为5’-TGGTGGGGCGGGAGGAGCAG-3’，用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC9.1基因的特异性靶位点序列为5’-GGTCTCGTGCTCCTCGTGGG-3’。所述引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| qAC6.1-cas9-F | GGCACGCTGCTTTCAGCCCGGCAA | SEQ ID NO.7 |
| qAC6.1-cas9-R | AAACTTGCCGGGCTGAAAGCAGCG | SEQ ID NO.8 |
| qAC6.2-cas9-F | GGCATGGTGGGGCGGGAGGAGCAG | SEQ ID NO.9 |
| qAC6.2-cas9-R | AAACCTGCTCCTCCCGCCCCACCA | SEQ ID NO.10 |
| qAC9.1-cas9-F | GGCAGGTCTCGTGCTCCTCGTGGG | SEQ ID NO.11 |
| qAC9.1-cas9-R | AAACCCCACGAGGAGCACGAGACC | SEQ ID NO.12 |
本发明具有以下效果：
本发明公开一种水稻qAC基因及利用其改良直链淀粉含量的方法，该水稻qAC基因在种子中高表达，可特异改良水稻籽粒的直链淀粉含量，而对水稻植株其他主要农艺性状无显著影响。利用基因工程技术在水稻中敲除qAC基因可显著降低稻米直链淀粉含量，改良稻米蒸煮食味品质，因而qAC基因在水稻的优质育种中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中公共数据库检索水稻中qAC6.1基因的时空表达特性。
图2是实施例1中公共数据库检索水稻中qAC6.2基因的时空表达特性。
图3是实施例1中公共数据库检索水稻中qAC9.1基因的时空表达特性。
图4是实施例1中转录组测序实验验证水稻中qAC6.1基因的表达模式。
图5是实施例1中转录组测序实验验证水稻中qAC6.2基因的表达模式。
图6是实施例1中转录组测序实验验证水稻中qAC9.1基因的表达模式。
图7是实施例2中qAC基因编辑靶位点和突变类型示意图。
图8是实施例3中qAC基因敲除株系的农艺性状分析。
图9是实施例3中qAC基因敲除株系的理化品质分析。
具体实施方式
为便于理解本发明，以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
实施例1：水稻中qAC基因的时空表达模式分析；
本研究团队专注水稻种子优势表达基因调控稻米品质，筛选了一批种子优势表达基因，用于稻米品质调控效应研究。其中qAC基因在水稻籽粒灌浆期间高表达(附图1-3)，说明该基因在种子发育过程中可能具有重要的作用。qAC6.1(LOC_Os06g04930)基因编码的蛋白含有141个氨基酸(SEQ ID NO.2)，对应基因包含426个核苷酸(SEQ ID NO.1)；qAC6.2(LOC_Os06g33690)基因编码的蛋白含有206个氨基酸(SEQ ID NO.4)，对应基因包含621个核苷酸(SEQ ID NO.3)；qAC9.1(LOC_Os09g25890)基因编码的蛋白含有886个氨基酸(SEQID NO.6)，对应基因包含2661个核苷酸(SEQ ID NO.5)。上述基因的核苷酸和氨基酸序列均来源于水稻品种日本晴参考基因组(rice.plantbiology.msu.edu)。
为了验证qAC基因的种子优势表达特性，以粳稻中花11亲本为材料，利用转录组测序技术，分析qAC基因在水稻植株叶、颖壳、幼嫩花序以及开花后不同时期种子中的表达丰度。将样品置于液氮中研磨、破碎细胞并进行总RNA的提取，利用mRNA纯化试剂盒获得mRNA，然后按照普通有参转录组测序技术流程检测qAC基因在不同组织中的表达水平。检测结果如附图4-6所示，qAC基因在水稻籽粒灌浆期间高丰度表达，是一个种子优势表达的基因，说明该基因在种子发育过程中可能具有重要的作用。
实施例2：水稻中qAC基因敲除载体构建和遗传转化；
本研究根据现有CRISPR/Cas9相关实验方法，在qAC基因的外显子上选择含有NGG作为PAM位点的序列作为敲除靶位点，其中qAC6.1基因的特异性靶位点序列为5’-CGCTGCTTTCAGCCCGGCAA-3’，qAC6.2基因的特异性靶位点序列为5’-TGGTGGGGCGGGAGGAGCAG-3’，qAC9.1基因的特异性靶位点序列为5’-GGTCTCGTGCTCCTCGTGGG-3’。随后利用在线工具targetDesign软件设计用于基因编辑载体构建的引物，CRISPR/Cas9基因编辑载体构建引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| qAC6.1-cas9-F | GGCACGCTGCTTTCAGCCCGGCAA | SEQ ID NO.7 |
| qAC6.1-cas9-R | AAACTTGCCGGGCTGAAAGCAGCG | SEQ ID NO.8 |
| qAC6.2-cas9-F | GGCATGGTGGGGCGGGAGGAGCAG | SEQ ID NO.9 |
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| qAC9.1-cas9-F | GGCAGGTCTCGTGCTCCTCGTGGG | SEQ ID NO.11 |
| qAC9.1-cas9-R | AAACCCCACGAGGAGCACGAGACC | SEQ ID NO.12 |
本研究所用的CRISPR/Cas9载体系统由中国水稻所王克剑研究员提供，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终表达载体pC1300-Cas9，其DNA骨架分别来源于pBlueScript(SK+)载体和pCAMBLA1300载体。
具体过程如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接，获得重组载体pC1300-Cas9-qAC。通过热激法将pC1300-Cas9-qAC重组载体转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素筛选，获得含有pC1300-Cas9-qAC载体的阳性农杆菌；
用上述阳性pC1300-Cas9-qAC农杆菌菌株，利用农杆菌介导的方法转化水稻亲本中花11的愈伤组织细胞，水稻愈伤组织经潮霉素抗性筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤转移至分化培养基，经分化培养获得阳性转基因小苗，最终经检测鉴定后移栽至大田，获得T0代水稻植株。
实施例3：qAC基因敲除株系的表型分析；
1.转基因植株检测；
利用农杆菌介导的遗传转化方法qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因分别获得30株转基因苗，首先用潮霉素抗性基因通用检测引物，PCR检测获得含有潮霉素抗性的阳性苗；然后，在敲除靶位点序列上下游设计一对PCR测序引物(SEQ ID NO.13到18)，用于检测靶位点附近的序列变异情况。基于靶位点的序列PCR扩增并测序分析后，获得了qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因的突变类型(附图7)。测序引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| qAC6.1-cx-F | TGGCAAACTGCAAGGGATCA | SEQ ID NO.13 |
| qAC6.1-cx-R | CTTCTCCTGCTGCCTAGCTT | SEQ ID NO.14 |
| qAC6.2-cx-F | TTGCTACTAGGCTCATGGCG | SEQ ID NO.15 |
| qAC6.2-cx-R | ATCACGAAGCAGATTGCCGA | SEQ ID NO.16 |
| qAC9.1-cx-F | TAACTTGAAGGGCTATTG | SEQ ID NO.17 |
| qAC9.1-cx-R | GATCCGCCGGGGGGATTG | SEQ ID NO.18 |
2.qAC基因敲除株系的农艺性状和稻米理化品质分析；
为明确qAC基因在种子发育过程中的作用及其它生物学功能，对qAC基因敲除株系的种子关键性状和田间农艺性状进行调查。在T0和T1代种植中，与野生型亲本中花11相比，qAC基因敲除株系的株高、主穗长、结实率没有变化，粒长、粒宽、粒重等粒形性状也没有明显变化(附图8)，说明qAC基因对水稻的产量性状指标没用影响。进一步分析qAC基因对稻米品质性状的影响，与野生型亲本中花11相比，qAC基因敲除株系的稻米蛋白质含量没有变化，直链淀粉含量有明显下降的趋势(附图9)，说明qAC基因只特异性调控稻米直链淀粉含量，符合其种子特异性表达的特征。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，然而并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，可利用上述揭示的技术内容对本发明做出可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，在未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均落在本发明技术方案保护范围内。
Claims (8)
1.一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC，其特征在于，所述qAC基因包括qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因，其中qAC6.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，qAC6.2基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，qAC9.1基因编码区的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC，其特征在于，所述qAC6.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，qAC6.2基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，qAC9.1基因编码区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种如权利要求1或2所述的qAC基因在调控稻米直链淀粉含量、改良稻米食味品质中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法如下：对水稻直链淀粉含量基因qAC进行编辑，使得目标水稻品种中的qAC基因表达水平的改变，进而获得具有不同稻米直链淀粉含量的水稻植株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，基因编辑过程中所用的重组载体pC1300-qAC6.1-Cas9、pC1300-qAC6.2-Cas9、pC1300-qAC9.1-Cas9，分别包含qAC6.1、qAC6.2、qAC9.1基因；载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，重组载体pC1300-qAC6.1-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC6.1；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC6.1中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.1基因的特异性靶位点序列为5’-CGCTGCTTTCAGCCCGGCAA-3’，所述引物序列如下：
。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，重组载体pC1300-qAC6.2-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC6.2；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC6.2中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC6.2基因的特异性靶位点序列为5’-TGGTGGGGCGGGAGGAGCAG-3’，所述引物序列如下：
。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，重组载体pC1300-qAC9.1-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-qAC9.1；将测序鉴定正确的SK-gRNA-qAC9.1中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接；
用于CRISPR/Cas9系统编辑qAC9.1基因的特异性靶位点序列为5’-GGTCTCGTGCTCCTCGTGGG-3’；所述引物序列如下：
。
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