CN116676317A - 一种水稻OsEns150基因及其在改良水稻株型、品质和增强穗发芽抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，公开一种水稻OsEns150基因及其在改良水稻株型、品质和增强穗发芽抗性中的应用；该水稻OsEns150基因在种子中特异性表达，敲除该基因可在一定程度上降低水稻株高，但对水稻粒形、千粒重和结实率等籽粒性状没有影响；敲除OsEns150基因可显著改良稻米蒸煮食味品质和营养品质，包括降低稻米直链淀粉含量和糊化温度，增加稻米胶稠度和蛋白质含量，改善其粘滞性等；此外，与野生型水稻对照相比，敲除OsEns150基因略微延迟水稻萌发速度，而对萌发率没有影响，但可显著增强水稻的穗发芽抗性，OsEns150基因在培育优质高产多抗的水稻新品种实践中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻OsEns150基因及其在改良水稻株型、品质和增强穗发芽抗性中的应用。
背景技术
水稻种植历史悠久，不仅是我国人民的主粮，同时也是世界三大主粮之一，因此常被人们称之为“世界粮食”。随着人口的增长、耕地面积减少和极端气候频发，水稻的高产稳产对于确保国家粮食安全至关重要。此外，随着人们生活水平的不断提高，人们对优质稻米的需求也越来越大。因此，培育优质高产多抗的水稻新品种成为水稻育种的最重要目标。
水稻种子不但是人类的直接口粮，而且还直接影响粮食生产。水稻种子良好的休眠和萌发特性是确保水稻优质高产的关键。播种后种子是否能够顺利萌发、快速出芽，出芽后是否根系健全以及快速达到早苗、壮苗和全苗的标准，均会影响水稻的生长状态及最终的收获情况。此外，水稻种子良好的休眠特性也非常重要。如果休眠性太强则种子不易萌发，而休眠过浅或不适当解除则容易在收获前高温高湿天气下产生穗发芽。穗发芽会造成水稻产量的重大损失和品质的严重下降。此外，穗发芽种子基本丧失种用价值，同时因其内部多个代谢通路已被激活，种子活力、营养、加工品质和储藏特性等也显著下降。因此，改良水稻种子的萌发和休眠特性可为水稻的优质稳产奠定重要基础。
近来，稻米品质逐渐成为消费者关注的热点。评价稻米品质优劣的指标主要包括直链淀粉含量(AC)、胶稠度(GC)、糊化温度(GT)和蛋白质含量(PC)等。一般而言，稻米直链淀粉含量较低的品种其食味值越高。胶稠度则是影响稻米蒸煮品质、米饭软硬以及口感的重要因素。而稻米中蛋白质含量高低是影响稻米营养品质的关键。蛋白质含量越高，则其营养价值越高。但同时，稻米蛋白质含量与食味品质呈显著负相关，蛋白质含量太高的品种往往米饭生硬、口感差，食味不佳。因而，平衡、协调稻米食味品质和营养品质是提高稻米综合品质的关键。
因此，克隆可用于改良水稻萌发、休眠和稻米品质等性状的重要基因对于利用分子设计育种等现代育种手段培育优质高产多抗的优异水稻新品种至关重要。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题，提供一种水稻OsEns150基因及其在改良水稻株型、品质和增强穗发芽抗性中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种水稻OsEns150基因，OsEns150基因位于水稻第12号染色体上，基因编号为Os12g0464400(NCBI编号)，LOC_Os12g27830(MSU编号)。OsEns150基因编码区CDS全长1050bp，基因结构中包括6个外显子和5个内含子。所述OsEns150基因的编码区序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGGTGGATTTGGTGAACGGCGTGCTCAACTGGGTGGCGACGCCGGCCATGGTGG
CCAGCCTGCTGCTCTTCTACCCGCCCTACTACCTCTTCAAGACCGTCCACTCCTTCC
TCTCCTACCTCTTCCCCGACGACCTCGCCCGCAAGGTCGTCCTCATCACCGGCGCC
TCCTCCGGCATCGGCGAGCAATTAGCATACAACTATGCTCTGAACCGGGCATCATT
GGTCCTTGTTGCAAGAAGAGAATGGAGCCTGCGTAAAGTTGCCGATCAAGCGTTC
GAGCTTGGAGCACCTGATGTGATCATTCTTCCGGGCGACGTTGCGAATCCTGAAGA
CTGCAAAAGATTTGTTCAGACCGCAATCGATCACTACGGGCGATTGGACCATCTTG
TGTGCAACGCTGGCATCGCAAGTGTTGGCGCGTTTCAGGAGATTCCAGATGTTACT
AACTACAGCTCTCAATTTGATGTGAACTTCTGGGGTTCAGTTCAGTCAACTTTTGA
AGCTCTCCCTCATCTGAAAAGGAGCCGAGGAAGAATCGTTGTTACTGCGTCGGCA
ACCGGATGGAATCCTGTTCCAAGAATGACCTTCTACAATGCTGCCAATGCTGCACT
GATAAACTTCTACGAGACGCTGCGGACAGAGCTTGGTAGCCAAGTTGGAATCACA
ATTGTAACACCTGGGTGGATCGAGTCTGAGATGTCAAAAGGGAAATTTCTCAAGG
ATCATGGTGAAATGGAGGTCGATCAAGAAATGCGAGATGCTCAAATTGGTTTATTT
CCCGTGGAGTACGCGAAGAATTGCGCAAAAGCCATGGTACAAGCGGTTCGGCAAG
GGAAGCGTTGTCTCACCGTGCCACCATGGTTCAGCACAATGTACCTGTGGAGGGTA
TTCGCACCGGAGGTCGTCGAGTTCTGCTACCGCCTCCTGTACATGCACCGCCATGG
TGGTAGCCAAGCTGATGCGCCGAGCAAGAAGATGGCTGAGGCTGGTGGAAAGAA
GCTCTTGTATCCAACGTCGCTGCGCTCTGATGACATCAAGGATGAGTGA；
OsEns150基因编码349个氨基酸，所述OsEns150编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MVDLVNGVLNWVATPAMVASLLLFYPPYYLFKTVHSFLSYLFPDDLARKVVLITGAS
SGIGEQLAYNYALNRASLVLVARREWSLRKVADQAFELGAPDVIILPGDVANPEDCKR
FVQTAIDHYGRLDHLVCNAGIASVGAFQEIPDVTNYSSQFDVNFWGSVQSTFEALPHL
KRSRGRIVVTASATGWNPVPRMTFYNAANAALINFYETLRTELGSQVGITIVTPGWIE
SEMSKGKFLKDHGEMEVDQEMRDAQIGLFPVEYAKNCAKAMVQAVRQGKRCLTVP
PWFSTMYLWRVFAPEVVEFCYRLLYMHRHGGSQADAPSKKMAEAGGKKLLYPTSLRSDDIKDE。
第二方面，本发明提供所述的水稻OsEns150基因的重组载体pC1300-OsEns150-Cas9，所述pC1300-OsEns150-Cas9包含OsEns150基因，载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统实现OsEns150基因的敲除。
第三方面，本发明提供所述重组载体pC1300-OsEns150-Cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-OsEns150；将测序鉴定正确的SK-gRNA-OsEns150中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接。
进一步地，用于编辑OsEns150基因的特异性靶位点序列为5-GAACGGCGTGCTCAACTGGG-3，目的基因互补引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| OsEns150-cas9-F | 5-GGCAGAACGGCGTGCTCAACTGGG-3 | SEQ ID NO.3 |
| OsEns150-cas9-R | 5-AAACCCCAGTTGAGCACGCCGTTC-3 | SEQ ID NO.4 |
。
第四方面，本发明提供所述的水稻OsEns150基因在改良水稻株型、水稻蒸煮食味和营养品质，以及增强水稻穗发芽抗性方面的应用。
所述应用的方法如下，对水稻OsEns150基因进行敲除，改良水稻株型、水稻蒸煮食味和营养品质，以及增强水稻穗发芽抗性，使得目标水稻中OsEns150的基因表达水平改变，进而获得不同表现型的水稻植株。
本发明具有以下有益效果：(1)本发明中的水稻OsEns150基因在水稻种子中特异表达，且其蛋白定位于细胞质和细胞核中；通过特异性编辑水稻OsEns150基因创建ens150突变体水稻，敲除OsEns150基因后，可在一定程度上降低水稻株高，有利于植株抗倒伏,但对水稻粒形、千粒重和结实率等籽粒性状没有影响；此外，稻米直链淀粉含量和糊化温度显著降低，且胶稠度显著上升，显著改良了稻米的蒸煮食味品质。
(2)本发明中敲除OsEns150基因可显著改良稻米蒸煮食味品质和营养品质，包括降低稻米直链淀粉含量和糊化温度，增加稻米胶稠度和蛋白质含量，改善其粘滞性等；敲除OsEns150基因后，稻米的蛋白质含量显著上升，一定层度上增强了稻米的营养品质。
(3)本发明中与野生型水稻对照相比，敲除OsEns150基因对水稻种子萌发略有延缓而不影响最终发芽率，但可显著增强水稻的穗发芽抗性，进而确保水稻的优质稳产，具有良好的育种应用价值；OsEns150基因在培育优质高产多抗的水稻新品种实践中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是OsEns150基因的时空表达模式。
图2是OsEns150蛋白的亚细胞定位结果。
图3是野生型中花11和ens150突变体水稻株高的比较。
图4是野生型中花11和ens150突变体水稻籽粒性状的比较，包括粒长、粒宽、粒厚、千粒重和结实率。
图5是野生型中花11和ens150突变体稻米蒸煮食味品质理化特性的比较，包括AAC(表观直链淀粉含量)、GC(胶稠度)、DSC(米粉热力学性质)和RVA(Rapid Visco-Analyzer，稻米黏滞性)。
图6是野生型中花11和ens150突变体水稻稻米蛋白质含量的比较。
图7是野生型中花11和ens150突变体水稻种子萌发特性的比较。
图8是野生型中花11和ens150突变体水稻穗发芽抗性的比较。
具体实施方式
为理解本发明，以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和实际均为市售商品。
实施例1
OsEns150时空表达模式
对野生型水稻植株根、茎、叶、叶鞘以及不同时期发育种子进行取样，将样品置于液氮中破碎磨粉后进行总RNA提取，反转录后利用设计的OsEns150基因特异性qRT-PCR引物进行OsEns150基因的时空特异性表达分析。结果显示OsEns150是一个在水稻种子中特异表达的基因，且表达量随着种子发育的进程不断增加(图1)。目标基因OsEns150和内参基因Actin1的qRT-PCR引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| OsEns150-qRT-F | 5-AAGAAGAGAATGGAGCCTGCGTAAA-3 | SEQ ID NO.7 |
| OsEns150-qRT-R | 5-GTAACATCTGGAATCTCCTGAAACG-3 | SEQ ID NO.8 |
| Actin1-qRT-F | 5-CCAAGGCCAATCGTGAGAAGA-3 | SEQ ID NO.9 |
| Actin1-qRT-R | 5-AATCAGTGAGATCACGCCCAG-3 | SEQ ID NO.10 |
。
实施例2
OsEns150亚细胞定位结果
为了解OsEns150基因表达产物在细胞中表达的具体部位，我们将OsEns150基因与GFP标签基因融合，构建OsEns150-GFP表达载体并转入农杆菌，而后利用农杆菌介导的转化法转入烟草叶片中，48小时后选取转化叶片组织置于激光共聚焦显微镜下进行观察荧光信号，结果表明OsEns150蛋白在细胞核和细胞质中均有表达(图2)。相关载体构建引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| OsEns150-eGFP-F | 5-ATTGGAGAGGACAGGGTACCATGGTGGATTTGGTGAACGG-3 | SEQ ID NO.11 |
| OsEns150-eGFP-R | 5-CACCATGGTACTAGTGTCGACCTCATCCTTGATGTCATCAGAGCG-3 | SEQ ID NO.12 |
实施例3
OsEns150基因重组载体pC1300-OsEns150-Cas9的构建
首先在OsEns150外显子区段筛选出包含NGG的特异性序列作为编辑的靶点，并设计一对互补引物，其中正向序列前加GGCA，反向互补序列前加AAAC。将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，利用T4连接酶将其与变性退火后的目标基因互补引物进行连接，然后转化大肠杆菌。经菌落PCR鉴定和测序验证后，利用Kpn I和Bgl II限制性内切酶进行酶切，并与经Kpn I和BamH I酶切后的最终载体pC1300-Cas9连接，所述OsEns150靶位点互补引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| OsEns150-cas9-F | 5-GGCAGAACGGCGTGCTCAACTGGG-3 | SEQ ID NO.3 |
| OsEns150-cas9-R | 5-AAACCCCAGTTGAGCACGCCGTTC-3 | SEQ ID NO.4 |
。
实施例4
水稻OsEns150基因在改良水稻株型、水稻蒸煮食味和营养品质，以及增强水稻穗发芽抗性方面的应用
(1)构建工程菌：将pC1300-OsEns150-Cas9载体通过热激法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素筛选，获得含有pC1300-OsEns150-Cas9载体的农杆菌；
(2)pC1300-OsEns150-Cas9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：用含有pC1300-OsEns150-Cas9载体的EHA105农杆菌侵染水稻愈伤组织，并于28℃培养箱中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养；经过两轮培养筛选后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤转移至分化培养基进行分化培养获得小苗，分化出的小苗转移至生根培养基上培养生根，最终经炼苗后移栽至田间。
水稻OsEns150基因编辑植株的分子鉴定：在OsEns150基因编辑靶位点前后设计一对特异性鉴定引物，利用该对引物扩增包含编辑靶位点在内的目标基因片段，然后进行测序鉴定，确认目标基因是否发生碱基数目的变化，并筛选发生移码突变(即发生了非3的倍数的碱基数目变化)的转基因水稻用于后续表型和功能分析。
检测引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Ens150-casJ-F | 5-GTGGAGCAAGCCAACCAAAG-3 | SEQ ID NO.5 |
| Ens150-casJ-R | 5-GATACACAGAGCAGAGCCCG-3 | SEQ ID NO.6 |
PCR产物为202bp。
实施例5
敲除OsEns150后水稻植株株型考察
为了解敲除OsEns150基因对水稻株型是否存在影响，我们对OsEns150基因编辑移码突变的纯合突变体材料及其野生型对照中花11进行田间株高测量，结果表明敲除OsEns150可在一定程度上降低水稻株高(图3)，表明敲除OsEns150基因具有增强水稻抗倒伏的潜力。
| ZH11 | ens150-1 | ens150-4 | |
| 株高(cm) | 103.94±2.30 | 93.40±1.34 | 97.90±2.91 |
实施例6
敲除OsEns150基因后水稻籽粒性状的考察
我们对ens150突变体水稻及其野生型对照中花11的籽粒性状进行系统考察，主要测量分析了籽粒的粒长、粒宽、粒厚、千粒重和结实率。结果显示敲除OsEns150基因不影响水稻的粒型、千粒重和结实率(图4)，表明遗传调控OsEns150基因对水稻籽粒性状无影响。
| ZH11 | ens150-1 | ens150-4 | |
| 粒长(mm) | 7.48±0.16 | 7.55±0.14 | 7.57±0.12 |
| 粒宽(mm) | 3.18±0.10 | 3.25±0.1 | 3.17±0.08 |
| 粒厚(mm) | 2.27±0.04 | 2.23±0.0 | 2.22±0.06 |
| 千粒重(g) | 24.76±0.09 | 24.48±0.18 | 23.94±0.26 |
| 结实率(％) | 89.18±1.43 | 84.60±4.15 | 90.47±3.28 |
实施例7
敲除OsEns150基因在改良稻米理化品质性状方面的考察
ens150突变体水稻及其野生型对照中花11的稻米理化特性进行测定，结果显示敲除OsEns150基因后可显著降低稻米的表观直链淀粉含量和糊化温度，同时胶稠度显著增加，粘滞性也有明显改善(图5)，上述结果表明ens150突变体稻米的蒸煮食味品质有明显的改良。此外，较野生型对照中花11，ens150突变体稻米的蛋白质含量也有一定提升(图6)。上述结果表明敲除OsEns150基因可同时改良稻米的蒸煮食味品质和营养品质。
| ZH11 | ens150-1 | ens150-4 | |
| 表观直链淀粉含量(％) | 18.13±0.21 | 17.2±0.34 | 16.86±0.54 |
| 胶稠度(mm) | 87.66±6.65 | 101±3.6 | 103.3±6.43 |
| 蛋白质(％) | 7.91±0.08 | 8.61±0.09 | 9.08±0.07 |
实施例8
敲除OsEns150基因仅略微延迟水稻种子萌发
在正常萌发条件下，ens150突变体种子的萌发速度稍慢于野生型对照(小于12h)，最终萌发率同野生型对照一致，均能够全部萌发(图7)。因此，敲除OsEns150基因对水稻种子的正常萌发影响不大。
实施例9
敲除OsEns150基因可显著增强水稻穗发芽抗性
在田间直接收获ens150突变体及其野生型对照花后30天左右的水稻主穗，通过在实验室模拟高温高湿条件以促进水稻穗发芽的发生。结果显示，在每个检测时间点OsEns150基因敲除材料的穗发芽率均显著低于野生型对照中花11，尤其是在长时间处理后，两者差异更为显著(图8)。本实验结果表明敲除OsEns150基因可显著增强水稻的穗发芽抗性，因此OsEns150基因在改良水稻品种的穗发芽抗性方面具有很大的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，然而并非用以限定本发明，本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，可利用上述揭示的技术内容对本发明做出可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，在未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均落在本发明技术方案保护范围内。
Claims (7)
1.一种水稻OsEns150基因，其特征在于，所述OsEns150基因的编码区序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种水稻OsEns150基因，其特征在于，所述OsEns150编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述的水稻OsEns150基因的重组载体pC1300-OsEns150-Cas9，其特征在于，所述pC1300-OsEns150-Cas9包含OsEns150基因，载体系统为CRISPR/Cas9，系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9。
4.权利要求3所述重组载体pC1300-OsEns150-Cas9的制备方法，其特征在于，所述的方法如下：
将中间载体SK-gRNA用限制性内切酶Aar I进行酶切后，用T4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体SK-gRNA-OsEns150；将测序鉴定正确的SK-gRNA-OsEns150中间载体利用Kpn I和Bgl II进行双酶切，并与经Kpn I和BamH I双酶切过的最终载体pC1300-Cas9连接。
5.根据权利要求4所述重组载体pC1300-OsEns150-Cas9的制备方法，其特征在于，用于编辑OsEns150基因的特异性靶位点序列为5-GAACGGCGTGCTCAACTGGG-3，目的基因互补引物序列如下：
。
6.一种如权利要求1或2所述的水稻OsEns150基因在改良水稻株型、水稻蒸煮食味和营养品质，以及增强水稻穗发芽抗性方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的方法如下，对水稻OsEns150基因进行敲除，改良水稻株型、水稻蒸煮食味和营养品质，以及增强水稻穗发芽抗性，使得目标水稻中OsEns150的基因表达水平改变，进而获得不同表现型的水稻植株。
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