CN117802153A - SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用，所述SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，应用的途径为通过使SlBIW基因过表达或者敲除SlBIW基因影响番茄果形指数，以实现对番茄果形的调控，同时也明确了SlBIW基因的编码蛋白在调控番茄果形上的作用。本发明还提供了可用于调控番茄果形的工程菌，并且得到了过表达或者敲除SlBIW基因的番茄植株，实现了对番茄果形的调控。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)是一种经济价值较高的园艺作物，在全球范围内被广泛种植。番茄的果实形状是其重要的外观品质之一，消费者普遍偏爱扁圆形的果实，而圆果或椭圆果则因其便于大规模采收与运输而受到了加工行业的喜爱。对番茄的果形展开研究，培育果形更多样化的新品种，有利于更好的满足市场需求。
番茄是研究肉质果实生长发育的模式植物，通过QTL定位技术已经挖掘出了包括SUN,OVATE,LOCULE-NUMBER(LC)和FASCIATED(FAS)在内的许多控制番茄果实形态的位点。IQD家族蛋白SUN能够结合钙调蛋白并进一步调节细胞分裂，促进近轴端和远轴端的生长，导致果实更长(Xiao et al.,2008,2009；Wu et al.,2011)。而OVATE则相反，作为负调节因子抑制果实的伸长。将具有OVATE结构域的OFP家族蛋白(OVATE Family Protein，OFP)突变后，纵向细胞数量增加而横向细胞数量减少，使果实呈梨形。进一步研究发现OFP家族的OVATE和OFP20蛋白能够分别与TRMTONNEAU1 Recruiting Motif 5(TRM5)互作，形成OFP-TRM蛋白复合体，改变TRM5细胞定位，这可能在器官发育早期影响了细胞分裂与生长，进而调控番茄果实形状(Wu et al.,2015；Snoiffer et al.,2020；Zhang et al.,2023)。LC与FAS在调控番茄果实形状方面具有相似的作用，lc突变体中番茄WUSCHEL(WUS)同源基因的启动子发生突变，阻碍了转录抑制因子与WUS的结合，使WUS表达量增加。fas突变体则是在番茄CLAVATA3(CLV3)同源基因上发生突变，造成CLV3表达量降低。两种突变均打破了WUS-CLV反馈通路的平衡，通过影响分生组织活性，使心室数增加，产生更加扁平的大果(Chu etal.,2019；Munos et al.,2011；Xu et al.,2015)。
在果实生长发育中，许多植物激素也直接或间接地参与到对果实形状的调控。外源施加生长素会使SUN基因表达水平显著提高，影响细胞微管结构，使子房和果实都变得更加细长。Auxin response factors(ARFs)是一类能够激活或抑制生长素响应基因表达的转录因子，研究发现，过表达SlARF10后，能够明显观察到果实的横向生长受到了抑制，果形狭长(Hendelman et al.,2012)；而沉默SlARF7基因则使细胞扩张速度加快，产生心形番茄果实(De Jone et al.,2011)。最近，油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)信号途径中的转录因子SlBZR1.7被发现能够直接结合在SUN基因启动子上调控其表达。将SlBZR1.7过表达后，果实变长、果皮层数减少。对BZR1家族成员进行分析发现，SlBZR1.5、SlBZR1.6基因过量表达也存在相似的作用，将上述三个基因敲除后果实呈现扁圆形，而任一基因的单突变体都没有果实形状的明显变化，说明BZR1家族基因在调控番茄果实形状中存在功能冗余(Yu etal.,2022)。
WD40蛋白，因结构中包含WD-repeat而得名，WD-repeat最早发现于G蛋白的β亚基(Fong et al.,1986)，是一种含有高糖蛋白的特殊基序。在植物体中WD40蛋白参与了许多过程，如：次生代谢、免疫反应、非生物胁迫响应、生长发育、光信号感知等。WD40蛋白LUG能特异性地调控花器官决定基因AGAMOUS(AG)的表达，LUG缺失突变体中的AG基因会在花的外两轮额外表达,导致花萼片转化成心皮,花冠转化成雄蕊，还会出现育性降低、柱头开裂等异常现象(Liu et al.,1995；Guan et al.,2018)，进而影响果实的品质与产量。WD40蛋白还能够与R2R3-MYB蛋白、bHLH蛋白形成MBW复合体，并调节植物体内花青素合成(Colaneroet al.,2018)。目前，针对WD40蛋白影响番茄生殖生长的研究，主要围绕着花器官发育和果实中代谢物的合成，对于其如何调控番茄果实形状还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可通过改变基因功能调控番茄果实形状的技术方法，为丰富番茄果形种类提供参考依据。
第一方面，本发明提供了SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用，所述SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了SlBIW基因编码的蛋白在调控番茄果实形状中的应用，所述SlBIW基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述基因工程菌中包含有编辑SlBIW基因的载体，所述SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述编辑包括对基因的敲除以及过表达。
第四方面，本发明提供了所述工程菌在调控番茄果实形状中的应用。
进一步地，所述工程菌可调控番茄果形指数。
进一步地，所述应用的途径为以下中的一种：
(1)通过过表达SlBIW基因，减小番茄果形指数，从而得到扁圆果形的果实；
(2)通过敲除SlBIW基因，增大番茄果实果形指数，从而得到椭圆果形的果实。
进一步地，所述过表达SlBIW基因的方法为：
(1)以野生型番茄cDNA为模板设计引物序列，克隆SlBIW基因，构建SlBIW基因的过量表达载体；
(2)将所述载体转入农杆菌感受态细胞中，获得过量表达SlBIW基因的农杆菌；
(3)利用含SlBIW基因过表达载体的农杆菌侵染普通野生型番茄的子叶，通过组织培养重新获得幼苗，筛选获得SlBIW基因的过表达植株。
进一步地，将克隆的SlBIW基因，连入pFGC1008-HA载体，以获得强启动子驱动的过表达载体。
进一步地，所述普通野生型番茄品种为Condine Red。
进一步地，所述敲除SlBIW基因的方法为：
(1)根据SlBIW基因组序列，设计靶序列sgRNA，构建番茄SlBIW基因编辑的CRISPR/Cas9载体；
(2)将所述载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含有SlBIW基因编辑CRISPR/Cas9载体的农杆菌；
(3)利用含SlBIW基因编辑CRISPR/Cas9载体的农杆菌侵染普通野生型番茄的子叶，通过组织培养重新获得幼苗，筛选获得遗传稳定的纯合SlBIW基因缺失突变体。
进一步地，所述靶序列sgRNA包括sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4，所述sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述sgRNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述sgRNA-4的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
进一步地，所述普通野生型番茄品种为Condine Red。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明揭示了SlBIW基因及其编码蛋白调控番茄果形的作用，为新品种的培育提供参考依据。
(2)本发明构建获得了SlBIW基因过表达以及基因敲除的转基因番茄植株，实现了对番茄果形的调控。
附图说明
图1为SlBIW基因过表达植株的western blot检测结果。其中，WT为普通野生型番茄品种Condine Red，OE-SlBIW为SlBIW基因过表达植株，RuBisCO含量用于表示确定上样量，anti-HA表示OE-SlBIW植株中存在携带有HA标签的过量表达BIW蛋白。
图2为敲除SlBIW基因的纯合突变体植株基因编辑位点及氨基酸变化。其中，WT为普通野生型番茄品种Condine Red，biw为SlBIW基因敲除突变体。
图3为SlBIW基因表达模式图。其中，L为叶片，R为根，S为茎，F为花，MG为果实绿熟期，BK为果实破色期，B+1/+3/+5/+7分别为破色后第1/3/5/7天，选用ACTIN作为内参基因。
图4为番茄果实表型(A)、果形指数(B)和果肩夹角(C)，其中WT为野生型番茄，biw为SlBIW缺失突变体番茄，OE-SlBIW为SlBIW基因过表达番茄。实验采用完全随机设计，设置三个重复，数据通过SAS软件进行方差分析(ANOVA)，差异显著性以不同数量*号表示(*，P<0.05；***，P<0.005)。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行。
本发明中SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，SlBIW基因的基因组序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGATAAGAAGAAAGTTGTGGCACCGCTTGTTTGCCATGGGCATTCTCGTCCTGTTGTTGATCTGTCCTACAGTCCAATCACTCCTGATGGATTCTTCCTCATCAGTGCCAGCAAGGATTCTACGCCAATGCTGAGAAATGGAGAAACTGGAGATTGGATTGGAACATTTGAAGGGCATAAAGGAGCCGTGTGGAGTTGTTGTCTGGATAAACATGCTCTTCGTGCTGCATCTGCATCTGCCGATTTCAGCGCGAAATTGTGGGATGCATTGACTGGGGATGTATTACACTCATTTGACCACAAGCACATAGTTCGAGCATGTGCCTTTTCAGAGGATACAAATCTGCTACTCACTGGTGGTTTTGAAAAAATTCTTCGAATATTTGATTTAAACCGACCTGATGCACCTCCAAGGGAAATTGACAGCTCTCCTGGTTCAGTACGGACAGTTGCTTGGCTGCACAGCGATCAAACTATCTTGAGTTCCTCTGGAGATGCTGGTGGATTGAGGTTATGGGACGTGAGGACCGGCAAAGTTGTTCAAATCCTTGAAACTAAGTTTCCTGTAACCAGTGCTGAAGTAAGTCAGGATGGTCGTTACATAACAACTGCTGATGGTTCCTCTGTCAAGTTTTGGGATGCTAACCACTTTGGATTGGTGAAGAGTCACGAATTGCCTTGCAAAGTTGAATCTGCTTCCCTGGAACCAAAGTTCGGTAATAGGTTCATTGCTGGAGGAGAAGATATGTGGGTTCATGTCTTTGATTTTCACACTGGAGAGGAAATTGGATGCAACAAGGGACACCACGGACCTGTGCACTGTTTGCGGTTCTCTCCTGGAGGTGAATCCTATGCCTCAGGATCTGAAGATGGGACTATTAGAATATGGCAGCTGGGTCCTCTTGGTCAGATTGAGGACAACTCCACAGCAAACGGGTCTACTACTGCAAATGCCAATGATGGTATGGGTGAGGTGACCCAAAAGATTGACGAGTTGGCTGTTTCAGAAACAAAGAAGAAGGAAGAGACACAGGTCGATGGTGTGGAGCAGAAGGTAGTTGATGCCTGA。
SEQ ID NO.2：
MDKKKVVAPLVCHGHSRPVVDLSYSPITPDGFFLISASKDSTPMLRNGETGDWIGTFEGHKGAVWSCCLDKHALRAASASADFSAKLWDALTGDVLHSFDHKHIVRACAFSEDTNLLLTGGFEKILRIFDLNRPDAPPREIDSSPGSVRTVAWLHSDQTILSSSGDAGGLRLWDVRTGKVVQILETKFPVTSAEVSQDGRYITTADGSSVKFWDANHFGLVKSHELPCKVESASLEPKFGNRFIAGGEDMWVHVFDFHTGEEIGCNKGHHGPVHCLRFSPGGESYASGSEDGTIRIWQLGPLGQIEDNSTANGSTTANANDGMGEVTQKIDELAVSETKKKEETQVDGVEQKVVDA*。
SEQ ID NO.3：
TGCGCCAAGCCCTATAGTTTCAGTATATTTTTATTTTTTCTTTTCTGTGGTTTTTGTATTAGTTATTTTTCTATATATTTTGTTTCTTAATTTGGTAATAATTCGGAGTTGTGATCTATCCTTAGGGCTTTTTATATGAGTTGATAGGGTTAGAAAGGTGTGGATCCATCAAAGAAACATCAAATCTCAAAATTAGGGTTTCCCACCTTTTACAGTCGCGCCAGTTCCCCATCTATCTATACATACATACATATCTGATTGTGATTTTGTAGATCTTTTCAAATTTATGTTTTAATTCTATGTTTCTTTGATCTCACAACTTGGCAAAAGCAATTCTGCTTAATTTTTTTGTTCATCGGTCAATTGTCTGTTTTCTTTCATTTGGGGACTTTTTTTTTTGATCAATTTCGATTCTTATCATATCGGCGCTGGGTTGGGTTTCTCGTAGATATCATAATCTTTGTGGTTTGATTTGATTTAATTAGAATTGGCAGTAATGGATAAGAAGAAAGTTGTGGCACCGCTTGTTTGCCATGGGCATTCTCGTCCTGTTGTTGATCTGTCCTACAGTCCAATCACTCCTGATGGATTCTTCCTCATCAGTGCCAGCAAGGGTAATTTTTTTTTCCGTTGATGAATGTTATGTCATTTTGATAGTTTTGATAATCTATTGAAGTGTCGAGTGTGGCATTCCGATTATCAAGAAGGATCGACTACATTCTAAATTATGGAACTTTCTTTTGGTAACCCTTGCTCCAGTATTTAAAGGTTGTGCTAATTACTTCTTTGAAAGTTCCATGTTTATGGTATTTACGTCCTTAGAACCCCCAGTACACCCCATTTATAGCATTTGACTTTTTACCATATAAGTATGAGCTAGTCACAACCTTGATTGTGAACGTTCTTGGCATTGTATTGGTAACATTTACTATAGCTAACCATTGGCTCTGTGCTGTCGCGTCTAATTTGTAGCAAATAGAGTAGCATGTTAGTTTCAATTGTAGGTTTGCTGTTGAACTTTAGGATTTCATGCATTTGTTTAGAGATTGTGGAAAATACTAAAAAGCATCAATAAGAAAGCCAAAGAAGATTATTTTTCAACTTGACGAAAATTGAAAAATGTTTCTGTATTTTCAGTGTTTAGGCATTGATGTGAAATGCACACTTCATTTATGTGCTGCAGATGTTATCAGACCTTGTTATAGTAAACCTTAATTCTTTTATCTGCATTCTATTCCATCAAATAATTTACCACGTTTAATGCATTCCATGGTAGGTATGTGCATATATTATCATCTTCAGTATTAGTTTTGCCTAGTGTTCTCACCAAACGTGGTGGTAAATAAAATGATTGGCTTGCTGCGGCACATGGTATCTTTGTTGTCAGTAGCCATTGAGATTTTATTACTACGTTGTCAGTGTTCATGCAAGTCATCACATGTATGCTAACTGTCTCTCCTTATTCTCTAGCTTACAGTGTCCAGAAAGATAGATAAAATCTCATCAGCCTCAGGTTTTTCACCACCATATCACAGGAGTCTGGTAAAGCAGAAACTGATATAAATGAAGATGTTCTTTAGTGTATTTATACCATCGTCAAAAAATTCCCAGTTCTTTTCTTCTGATATTTGTTGATTTAATGCTTTTGTTTTTTCGTCAATCAGATTTGGTGAAAGATAATGCTCAATTAAAGAAATAGACTTGTACAGGAAAGATACCATTTGGTCCTGAATATGTTTTAGTCATGTTAATATATATATTTTAGATTTTATGCCCTATGCTTCATAGGAGTTGGACTTATCAAACATTTTTATTCAAATAGAGAATAAAGAGAACTTTTAGTACTTCTATTTTTGTTTTGTATAATGTTGAATCGAGATGAATTTAATGGAGAAACATGGTCAATCATGATTTGTATTTGTTCACAATTTGTTTGGGACCTGTGTGTAGTAGTTGTTGTATTTGTTCATTTGCTGCAGTAGGTTTTCATGTTGTATTTGTTTATTTGCTGCAATAAGTTTTAATGTTGTATTTGTTCATATGCTGCAATAAGTTTTCATGTTGTTGTGTGTTCTTAATTTCTGAATTGTTTCATTTTGTAGATTCTACGCCAATGCTGAGAAATGGAGAAACTGGAGATTGGATTGGAACATTTGAAGGGCATAAAGGAGCCGTGTGGAGTTGTTGTCTGGATAAACATGCTCTTCGTGCTGCATCTGCATCTGCCGATTTCAGCGCGTATGTTATCTAGTGGCTTCACTTCAGTACTTTGAAAAGTAACATTTAAGTGACATTTATATGGTACATTAGTCTATAATAAGTGATGTAGAACAAAATAAATACTTTTGTGCCATGTCTATCGTTGATCTACCTTGCATGTCATTATATACTTATATTTATTAAAATAATATCTTATAGAATATGGTAGAATCTTTTTCATCCTTCTTTTAAATTTTCCATGGCTCAATATTGTCCTCTTTTTACCTTTCTATATTGTCATTTCTGTTGGTTGTTTTCAGGAAATTGTGGGATGCATTGACTGGGGATGTATTACACTCATTTGACCACAAGCACATAGTTCGAGCATGTGCCTTTTCAGAGGTACCTCCTGCTTTACTTCTATTAAAGTTCCTTCAGGTTAGAGCTCCTTAGAGCTCTTTATATCTTCACTTAAGTTGTAGAATACTGTTGCACTTTGTTTGACACATTATAAGGGGGTTAAAAAATGCACTTCTGTTCTTTTACAGCTTTGCATCTCCTTGATGCCTTAAAGAGAAATACCTTCACAAAACAATAGAATGCTGTGAATATATATGCCCATCAAGTCTTATGTATATTGGCAGAACCAGTAGGCGACGCTCTTGGGTGGTTATGTCAATTCCCCTTGTGTAGGTTGAAAACCTAACTGCTATTGCAAGGAAAACATCTTTCTTTATTAAAAGTAATATACATTGTTCAGGCTTTGATATAAATTCTCCAGTCAATCCTATTTGATGGGAACTTTCTTTCTCTCTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACACACACACAAAATCTCTTAATTGGTACCACATGTCAAAGGGACTTCAATTCATTTTTATCTTTTCCATTTATAAACCTTTACATTCTGCTAATTTGTATGAACTATGGTGTGATGACTTTGTAGGATACAAATCTGCTACTCACTGGTGGTTTTGAAAAAATTCTTCGAATATTTGATTTAAACCGACCTGATGCACCTCCAAGGGAAATTGACAGCTCTCCTGGTTCAGTACGGACAGTTGCTTGGCTGCACAGCGATCAAACTATCTTGAGTTCCTCTGGAGATGCTGGTGGATTGAGGTAGGCTTTCAAAAGTCTGCTGAATCTAGTTGTATATTTTGTTCATTTTTTTCTCACTGGTTGCATTAGTAATAGGCTAGTGTTCATGGCCACTTAGACTTTGCAATTAATTGATCTACTATTCAACCGTAAACTTGATCTACCATACCCTTAACCAAGTCATGTACAATACTTGCTAAATACTATTGGATACTTGATACAATGGCCATATGTGTGGTTCATATATCCGTATGAACATTCACTCCCCAGTTCTCTTCACTACCTTAAATTGGTTTTGATTTAATTGTTGTAAACTAGGTTATGGGACGTGAGGACCGGCAAAGTTGTTCAAATCCTTGAAACTAAGTTTCCTGTAACCAGTGCTGAAGTAAGTCAGGATGGTCGTTACATAACAACTGCTGATGGTTCCTCTGTCAAGTTTTGGGATGCTAACCAGTATGTATTGTTTTTTTTACTTCATTGGAACAAAAATGTTTTCAATTCAGTATCTTGCCATAGTTTACATTGCATTTTAACTTATTTCTTTACAAGCAGCTTTGGATTGGTGAAGAGTCACGAATTGCCTTGCAAAGTTGAATCTGCTTCCCTGGAACCAAAGTTCGGTAATAGGTTCATTGCTGGAGGAGAAGATATGTGGGTTCATGTCTTTGATTTTCACACTGGAGAGGAAATTGGTAAGTTGTGTGGGGCTCTGTAAATATTTAGAAATTAATTCTAGTTAGTCTAATCAATGCCCCTCTTTATTTGTGTTCCTTTTTCTGGTATTTGCATTTTCTTAAATTAAGTAGGGGTTTATGCTTCTATTTTCGTTCAAGTAGCTTCAAGCTTTAACCACATGCTATATTCTATTTTTTGTACAACATAGGATGCAACAAGGGACACCACGGACCTGTGCACTGTTTGCGGTTCTCTCCTGGAGGTGAATCCTATGCCTCAGGATCTGAAGATGGGACTATTAGAATATGGCAGCTGGGTCCTCTTGGTCAGATTGAGGACAACTCCACAGCAAACGGGTCTACTACTGCAAATGCCAATGATGGTATGGGTGAGGTGACCCAAAAGATTGACGAGTTGGCTGTTTCAGAAACAAAGAAGAAGGAAGAGACACAGGTCGATGGTGTGGAGCAGAAGGTAGTTGATGCCTGATTAGGAGTTTAAGGGTTCTGTATGGTTTCTCCTTTTGGAAAGCTGTAACTGGCTTGACTTTCGGAGGTTTTTGCTTATGAAATAAGACTTAAGCTTTTGAGAGTGTTGGATATTCTTTTCTGGCCCGTGATCGTAATCATCAGTTATATAGTCTTTGGAGTAGTTTTTTCTGTAGAACTGAGAGAAGTACCTTACTCTCTTGTCAGGTTCATATTGTCCTTGGATTTGCAATTGCTTTTACAAACCAGTAGGATGTCCAAACCTAGAGATATAATAGTATGAAAAAAGTGAACTCTGTAACAAGGCTTAATATAATGAAATAGTACTGAGTTTTGAAAAC。
实施例1 SlBIW基因过表达植株的获得与鉴定
1、SlBIW基因过表达载体的构建及含基因编辑载体的农杆菌的获得
通过SGN网站(http://solgenomics.net)检索获得SlBIW基因的全长CDS序列(如SEQ ID NO.1所示)，选择AscI和KpnI作为酶切位点，利用CE design设计特异性的同源重组引物HA-BIW-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.4)和HA-BIW-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，以野生型番茄cDNA为模板PCR扩增。
利用限制性内切酶AscI和KpnI对过表达载体pFGC1008-HA进行酶切。纯化PCR产物及酶切载体，并通过同源重组酶连接，37℃连接30min。
随后，将连接产物42℃水浴90s热击转化进入tran5α大肠杆菌中，挑取单斑进行电泳验证和测序验证，测序序列如SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5所示。构建成功的SlBIW过表达载体经2.5Kv电击转化进入农杆菌GV3101。
2、SlBIW基因过表达植株的获取
野生型番茄Condine Red(CR)种子经消毒后播种于培养基中，在暗处培养至种子发芽后，移至光下培养一周。子叶长出后，将子叶切下置于KC培养基中，在暗处恢复24h。
将构建好的农杆菌接种于25mL的液体培养基中，培养至OD600＝0.8～1.0时，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，加入MS0.2侵染液重新悬浮。
将KC培养基上的子叶置于重悬浮的农杆菌中，侵染2min，吸干子叶外植体表面剩余菌液后置于看护培养基上，共培养24h，转移至2Z培养基中脱分化，诱导愈伤组织产生。2～3周后转入0.2Z培养基中诱导发芽，直到长出小苗后，转入R培养基中诱导生根。
3、SlBIW基因过表达植株的验证
取0.05g植物材料于2mL离心管中，液氮速冻研磨成粉，加入0.2mL 2×上样缓冲液[250mM Tris-HCl，pH 6.8，10％(w/v)SDS，0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油，10mM DTT]，涡旋混匀，95℃变性10min。利用SDS-PAGE电泳分离蛋白，使用Anti-HA抗体对SlBIW过量表达蛋白进行western blot检测，在45kDa处有明显条带的即为阳性植株，结果如图1所示，OE-SlBIW植株中存在携带有HA标签的过量表达BIW蛋白。
SEQ ID NO.4：
TTACAATTACCATGGGGCGCGCCATGGATAAGAAGAAAGTTGTGGCA。
SEQ ID NO.5：
AACATCGTATGGGTAGGTACCGGCATCAACTACCTTCTGCTCC。
实施例2 SlBIW基因缺失突变体的获得与鉴定
1、SlBIW基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建与农杆菌的转化
在SGN网站https://solgenomics.net/上找到番茄SlBIW基因的基因组序列，如SEQ ID NO.3所示，将其输入http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，挑选出2个靶点，并按规则设计出靶序列作为引物序列，序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9所示。
利用BasⅠ限制性内切酶对pHEE401进行酶切。纯化PCR产物及酶切载体，使用NEBGolden Gate Assembly Mix连接片段。后续转化过程同实施例1所述。
2、SlBIW基因缺失突变体的获得
组织培养过程同实施例1所述。
3、SlBIW基因缺失突变体的验证
取少量T0代植株叶片提取基因组DNA并以其为模板，进行PCR并比对序列，将靶点处发生突变的植株进行自交，获得T0代种子。将T0代的种子播种后得到T1代植株，用相同方法进行验证，筛选出纯合株系进行表型观察及数据测量。验证引物序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。结果如图2所示，biw在基因编辑靶点处发生了5个碱基的缺失，导致翻译提前终止。
SEQ ID NO.6：
CTGGTCTCTATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTG。
SEQ ID NO.7：
CTGGTCTCTATGGCAAACAAGCGGTGCCATGCACCAGCCGGGAA。
SEQ ID NO.8：
GCTGGTCTCTCCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA。
SEQ ID NO.9：
GCTGGTCTCTAAACTCAGGAGTGATTGGACTGTATGCACCAGCCGGGAATCG。
SEQ ID NO.10；
TGTTGAATCGAGATGAAT。
SEQ ID NO.11：
TCAAACAAAGTGCAACAG。
实施例3 SlBIW基因表达模式分析
1、植物RNA提取：液氮研磨番茄各组织样品，使用植物总RNA提取试剂盒(RNA preppure Plant Kit,Tiangen)按照说明书进行提取。
2、cDNA合成：利用Nano Drop 2000分光光度计对提取的RNA浓度进行测定，随后使用反转录试剂盒(HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR,Vazyme)进行cDNA的合成。
3、基因表达检测：采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法，利用SYBR(ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix，Vazyme)混和反应体系，具体方法参考说明书，检测仪器为Light Cycler 480II real-time PCR仪(Roche，CH)。选用Actin作为内参基因，相对表达量的分析方法为2-△△Ct法，参考(Livak et al.,2001)。基因及Actin引物序列如SEQID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。结果如图3所示，SlBIW基因在番茄中的根、茎、叶、花及果实中均有表达。
SEQ ID NO.12：
CTGTTTGCGGTTCTCTCCTG。
SEQ ID NO.13：
TTGGGTCACCTCACCCATAC。
SEQ ID NO.14：
CTGTTTGCGGTTCTCTCCTG。
SEQ ID NO.15：
TTGGGTCACCTCACCCATAC。
实施例4 SlBIW基因过表达植株及缺失突变体的番茄果形观察
将野生型番茄(WT)、SlBIW基因缺失突变体biw、SlBIW基因过表达植株OE-SlBIW的种子，用高锰酸钾消毒后浸没于盛有水的锥形瓶中，28℃200rpm催芽2d，待种子胚根露白达到0.5～1cm时，播种至72孔穴盘(草炭:蛭石为3:1)，放置在光强200μmol m-2s-1，光周期12h/12h，昼夜温度25℃/20℃，相对湿度70％～80％的植物工厂培养，每周浇2～3次Hoagland营养液。待幼苗长到3叶1心时，将植株移出到营养钵中，置于植物工厂继续培养至结果。
待果实进入破色后期后，将果实纵切并拍照记录，结果如图4A所示，与野生型相比，OE-SlBIW果形更加扁圆，果形指数更小；biw表型相反，果形更加椭圆，果形指数更大。
利用Image-J对图片进行分析，分别测量果实果肩夹角以及果实横纵向长度，计算果形指数。如图4B所示，biw的平均夹角为77.52°，OE-SlBIW夹角为47.80°，统计结果显示，二者均与野生型存在显著差异。如图4C所示，biw的果形指数为0.87，WT为0.78，OE-SlBIW为0.59，OE-SlBIW与biw都与野生型存在显著差异。
综合以上实施例，可以看出，本发明发现了一个新的能够有效调控番茄果实形状的基因SlBIW，将其敲除后番茄果形更加椭圆，而过表达植株则表型相反，果形扁平。
Claims (9)
1.SlBIW基因在调控番茄果实形状中的应用，其特征在于：所述SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的SlBIW基因编码的蛋白在调控番茄果实形状中的应用，其特征在于：所述SlBIW基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种工程菌，其特征在于：所述基因工程菌中包含有编辑SlBIW基因的载体，所述SlBIW基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示，所述编辑包括对基因的敲除以及过表达。
4.如权利要求3所述的工程菌在调控番茄果实形状中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述工程菌可调控番茄果形指数。
6.根据权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于：所述应用的途径为以下中的一种：
(1)通过过表达SlBIW基因，减小番茄果形指数，从而得到扁圆果形的果实；
(2)通过敲除SlBIW基因，增大番茄果形指数，从而得到椭圆果形的果实。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述过表达SlBIW基因的方法为：
(1)以野生型番茄cDNA为模板设计引物序列，构建SlBIW基因的过量表达载体；
(2)将所述载体转入农杆菌感受态细胞中，获得过量表达SlBIW基因的农杆菌；
(3)利用含SlBIW基因过表达载体的农杆菌侵染普通野生型番茄(Condine Red)的子叶，通过组织培养重新获得幼苗，筛选获得SlBIW基因的过表达植株。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述敲除SlBIW基因的方法为：
(1)根据SlBIW基因组序列，设计靶序列sgRNA，构建番茄SlBIW基因编辑的CRISPR/Cas9载体；
(2)将所述载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含有SlBIW基因编辑CRISPR/Cas9载体的农杆菌；
(3)利用含SlBIW基因编辑CRISPR/Cas9载体的农杆菌侵染普通野生型番茄(CondineRed)的子叶，通过组织培养重新获得幼苗，筛选获得遗传稳定的纯合SlBIW基因缺失突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述靶序列sgRNA包括sg RNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4，所述sgRNA-1的核苷酸序列如SE Q ID NO.6所示，所述sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述sgRNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述sgRNA-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
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2024
- 2024-01-17 CN CN202410071219.4A patent/CN117802153A/zh active Pending
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