CN116004652A - 一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种玉米ZmDHN15基因及其应用。本发明提供了玉米ZmDHN15基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。将本发明所述的基因ZmDHN15转化到烟草中并进行功能验证，以野生型烟草为对照，获得的过表达烟草植株对冷胁迫的耐受性增强。本发明为玉米抗冷性鉴定提供更多理论依据，为后续耐冷玉米新品系的培育和种质资源创新提供技术。

Description

一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用。背景技术

玉米(Zea mays L.) 是重要的粮食作物和工业原料作物，在世界粮食总产量中居首位，玉米是喜温作物，但我国东北处在高纬度地区，北方春播区玉米的苗期极易受到低温的危害，冷害延迟玉米生育期导致减产。因此需要了解在低温胁迫时，玉米的生理生化指标变化及其分子遗传机制，利用遗传改良技术提高玉米耐冷性，为培育出玉米新种质，进而提高玉米产量奠定基础。

玉米起源于亚热带，是喜温作物，其生长发育所需的最低温度为 10℃，因此对低温胁迫非常敏感，在我国东北，由于地理因素的影响，春季常常出现低温胁迫的现象，使玉米产量大幅度降低。低温胁迫主要包括冷害与冻害，当热带或者亚热带植物处于 0℃以上的低温环境中时，植物会在生长发育中会产生水分失衡、蛋白质分解、有毒物质的积累以及光合作用和呼吸作用受到抑制等现象，此时的胁迫称为冷胁迫。当植物处于 0℃以下的低温环境中时，植物细胞膜结构会出现不可逆的伤害最终导致植物发生死亡，此时的胁迫成为冻胁迫。玉米的整个生长发育的过程中遭受到低温胁迫时，玉米的形态以及生理生化方面都会发生变化。同时低温会引起细胞脱水损伤、 膜系统损伤、影响植物光合作用、 对影响呼吸作用等。

胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant proteins, LEAproteins）是一种在植物胚胎发育晚期蛋白量最为丰富，其表达量同时也受低温、干旱和盐渍等条件诱导，它的表达减轻了脱水效应对植物的伤害。LEA 蛋白是一类高度亲水并且具有很高的热稳定性的蛋白，在植物抵御非生物胁迫中能够起到关键作用。植物脱水素（dehydrin, DHNs）属于 LEA 蛋白家族中的 D-11 家族，脱水素（DHN）蛋白是其中的一员，是一种植物中广泛存在的亲水性蛋白，一般由 82～575 个氨基酸组成，不同成员分子量差异较大，分布于 9～200 kDa 。DHN 的一个重要结构特征是具有3个高度保守区域：K、S 和Y 片段，根据 K、S 和 Y 片段的存在与否以及分布数量可以将 DHN 分为 5 类：Kn、SKn、KnS、YnKn和 YnSKn。大量研究表明，DHN蛋白受多种非生物胁迫诱导，一般通过保护酶活性、降低膜相变温度、结合重金属离子等减轻细胞在低温、脱水等逆境胁迫的伤害。 DHNs 基因不仅可以在胚胎产生晚期大量表达累积，也可响应于低温、盐害、重金属、高温或者激素等各种非生物胁迫而高水平表达。脱水素基因（DHNs）是水分胁迫响应基因中抗脱水胁迫的主要组成成分之一。大量研究表明它们能够在细胞脱水的过程中稳定细胞的新陈代谢，通过分子伴侣活性与疏水性的相互作用或抗氧化剂活性来稳定细胞膜，从而防止了过多的活性氧（ROS）形成。

近年来，在许多植物中发现了脱水素蛋白，如拟南芥、小麦、凤仙花和辣椒等，玉米中的DHN基因也有报道，如ZmDHN13基因。ZmDHN13（NP_-001150115.1）基因属于二族LEA基因，也称之为脱水素。其开放阅读框为324bp，编码107个氨基酸，预测分子量12KD,等电点大约为6.33，分析二级结构发现，所有氨基酸的值都高于0.5（高于0.5说明是无序氨基酸），这说明ZmDHN13蛋白没有明显的二级结构。亚细胞定位结果表明，ZmDHN13主要定位于细胞核。序列分析发现其属于KS型的脱水素。组织特异性表达分析发现，ZmDHN13的表达在种子中最高，在根中表达量次之，在茎中的表达量最少。本发明所述的基因为ZmDHN15基因，ZmDHN15基因CDS为870bp，共编码290个氨基酸，分子量为31.44kD，理论等电点为6.05，通过对二级结构的预测，ZmDHN15蛋白由43.79%的α-螺旋（Alpha helix）、47.93%的无规则卷曲（Randomcoil）、5.17%的β-折叠（Beta turn ）和3.10%延伸链（Extended strand）共同构成。亚细胞定位结果显示其定位在细胞质。序列分析发现ZmDHN15基因属于SKn型的脱水素，不同于ZmDHN13基因，二者属于不同种类型脱水素基因，因此在蛋白结构和功能上存在一定差异。组织特异性表达分析发现，ZmDHN15的表达在叶片中较高，这与ZmDHN13的表达也大不相同。前人研究表明，金属离子对ZmDHN13的核酸酶活性具有激活作用，这说明金属离子对核酸酶活性具有重要作用，在烟草植株中过表达ZmDHN13可以通过结合金属离子来降低由于金属离子导致的氧化胁迫和离子毒害对植物的伤害，以此提高转基因烟草对铜离子胁迫抗性；同时还验证了过表达ZmDHN13基因可以提高转基因烟草对氧化胁迫的抗性。目前，对ZmDHN15基因在冷胁迫下的功能研究尚未见报道。

因此，本发明克隆了ZmDHN15基因，并进行植物过表达载体的构建，然后通过农杆菌介导法转化到烟草植株中，在冷胁迫条件下探究其基因功能。为后续耐冷玉米新品系的培育和种质资源创新提供理论依据和技术支撑，对提高玉米植株在不利环境中的耐冷性研究具有广阔前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用，以提供一种新的可用于玉米抗冷遗传改良的基因。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种玉米抗冷基因ZmDHN15，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步保护上述玉米抗冷基因ZmDHN15在提高玉米抗冷性能中的应用。

本发明进一步保护上述玉米抗冷基因ZmDHN15在玉米种质资源改良中的应用。

本发明进一步保护上述玉米抗冷基因ZmDHN15在制备抗冷转基因玉米中的应用。

本发明进一步保护一种玉米抗冷基因ZmDHN15的编码蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步保护含有上述玉米抗冷基因ZmDHN15的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、工程菌或细胞。

作为本发明的进一步改进，所述生物材料为载体，所述载体为pCAMBIA3301载体，所述pCAMBIA3301载体的多克隆位点区域依次连接有35S启动子、如权利要求1所述的ZmDHN15基因和终止子。

作为本发明的进一步改进，所述生物材料为细胞，所述细胞为宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的载体，和/或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的ZmDHN15基因的正向或反向序列。

本发明进一步保护一种提高植物抗冷性能的方法，将上述的玉米抗冷相关基因ZmDHN15整合到植物的细胞、组织和器官中，并使其过量表达。

作为本发明的进一步改进，所述植物包括玉米、水稻、小麦、拟南芥。

本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用，该基因为一种新的植物抗冷相关基因，在冷胁迫条件下的防御起着至关重要的作用。该基因的研究为后续抗冷玉米新品系的培育和种质资源创新提供理论依据和技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ZmDHN15基因凝胶电泳检测结果图；

图2为ZmDHN15基因过表达载体图谱；

图3为转基因烟草bar基因的检测结果；

图4为冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草根长测量结果柱状图；

图5为冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草种子萌发率测定结果柱状图；

图6为冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草表型变化结果图；

图7为正常培养条件和冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草叶片NBT染色结果图；

图8为正常培养条件和冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草叶片DAB染色结果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

实施例1 ZmDHN15基因的克隆

选择玉米自交系H8186为实验材料，提取三叶期玉米叶片组织，并反转录成cDNA备用。

从玉米数据库检索获取ZmDHN15的生物学信息，转录本ID为GRMZM2G147014。以基因序列为模板设计特异性扩增引物，同时结合克隆载体的多克隆酶切位点，选择BglII和BstEII酶切位点引入ZmDHN15序列两端，特异性扩增引物序列如下所示：

ZmDHN15-F：5’- AAGGCACTGAAGAAGCCAGTCA -3’

ZmDHN15-R：5’- GAAACCAAAGCAATTATTAACGCAT-3’

以cDNA为模板，ZmDHN15-F和ZmDHN15-R为引物，利用TAKARA公司生产的高保真酶Prim er STAR Max Premix(2×)进行扩增反应，扩增反应体系如下表1：

表1

药品名称	用量（μl）
		Primer STAR  Max  Premix(2×)	12.5
Zmhdz9-F引物	0.5
		Zmhdz9-R引物	0.5
模板	1
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	10.5

PCR扩增程序为95℃ 5min预变性，95℃ 30s变性，58℃ 35s退火，72℃ 30s延伸，共30个循环后，加0.5uL的Taq酶，给3'端加上poly尾巴，最后，72℃下继续延伸10min完成反应，获得的PCR产物用质量比为1%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。结果如图1所示，图中可以看出，目标基因条带清晰，且大小与预测结果一致，说明结果良好。

将目标基因用Axygen公司的胶回收试剂盒进行切胶回收，与pMD-18T载体连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，用BglII和BstEII进行双酶切验证，筛选阳性克隆子，并送去测序。测序结果表明：克隆获得片段大小为1442bp。

实施例2 ZmDHN15基因的生物信息学分析

测序结果经MEGA6.0软件与数据库中的序列比对后，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致，说明成功克隆获得ZmDHN15基因。经序列分析发现ZmDHN15基因编码区全长1442bp，共计编码290个氨基酸，PI为：6.05，MW为31.4kD，无跨膜结构域，具有多个磷酸化位点，为亲水性蛋白。

实施例3 ZmDHN15基因过表达载体的构建根据pCAMBIA3301的多克隆位点及目的基因的序列特征，选择在目的基因ZmDHN15两端加入BglII和BstEII酶切位点，克隆获得的阳性质粒为模板,进行扩增,获得PCR扩增片段。扩增引物序列如下所示：

ZmDHN15-F：5’-actcttgaccatggtagatct AAGGCACTGAAGAAGCCAGTCA -3’

ZmDHN15-R：5’-ggggaaattcgagctggtcacc GAAACCAAAGCAATTATTAACGCAT -3’

将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞,摇菌测序并保存,提取质粒,用BglII和BstEII双酶切质粒得到小的目的片段。连接体系如下：

药品名称	用量（μl）
		目的基因片段	6
Pcambia3301大片段	2
		10X T4连接酶	1
T4 Ligase	1

连接反应在16℃下进行3h后,转化至大肠杆菌感受态细胞中,挑斑、摇菌、提质粒,并通过双酶切验证,获得如图2所示的基因过表达载体pCAMBIA3301- ZmDHN15。

实施例4 ZmDHN15基因的烟草遗传转化

1、烟草种子的清洗先取10ml次氯酸钠溶液于90ml水中，配置成10%的次氯酸钠溶液，在配置70%酒精100ml。取待清洗种子于无菌离心管中，每管先加入1ml70%酒精，浸泡清洗5-10min，倒掉后用无菌水清洗3次，再加入1ml的10%的次氯酸钠溶液，浸泡清洗5-10min，期间间隔摇晃再用无菌水漂洗次，期间摇晃混匀，以洗净种子表面酒精、次氯酸钠溶液和杂质将清洗杀菌之后的烟草NC89种子在4℃冰箱处理1-2天，备用。

2、烟草的培养取出清洗之后种子，借助移液枪均匀铺散在MS固体培养基的方形培养皿上，将培养皿置于培养室中长日照培养21-28天。

3、农杆菌介导法转化烟草叶片待烟草叶片长至合适大小时，在超净工作台内将烟草叶片叶柄切除，留取叶片大小约为1cm×1cm并用刀尖在叶片上扎3-5个小孔，用含pCAMBIA-ZmDHN15-Bar的农杆菌EAH105通过农杆菌介导法侵染上述烟草叶片，接下来依次经过共培养、筛选培养、分化培养及生根培养（各培养基配方见表2），待长至顶盖时加入约70mlddH2O进行炼苗，两天后将其移栽到无菌土中继续培养。

表2: 各培养基配方

培养基名称	培养基成分/L
		萌发培养基	MS基础固体培养基+30g蔗糖
共培养培养基	萌发培养基+2ml6BA+2mlAS+200µlIAA
		筛选培养基	萌发培养基+2ml6BA+200µlIAA+1mlbar+1ml卡那霉素+1mlcef
分化培养基	萌发培养基+2ml6BA+200µlIAA
		生根培养基	1/2萌发培养基+1ml那霉素+1.5mlcef

4、转ZmDHN15基因烟草的筛选10天后取1.5g左右烟草叶片，提取其基因组并以bar基因为目的基因，对筛选的阳性植株进行分子检测，初步鉴定转基因烟草是否转化成功。

5、转ZmDHN15基因阳性烟草植株后代的获得按照上述步骤的方法，将初步鉴定为转基因烟草植株继续在培养室中培养3-4个月，获得T0代转基因烟草的种子。将初步鉴定为转基因烟草植株的种子（T0代）用含除草剂的培养基平板进行筛选，获得T1代烟草植株，并将T1代烟草植株移栽到营养土，营养黑土和蛙石体积比为1：1，继续温室培养以获得T1代转基因烟草。

6、在冷胁迫条件下对转基因烟草与野生型烟草的地上表型进行观察与上述T1代转基因烟草相同条件25℃，16h/8h光/暗下，培养野生型烟草与T1代转基因烟草21d，随后同时置于4℃低温下处理24h，进行表型观察。

结果如图4所示，在常温条件下培养时，转基因烟草与野生型烟草长势大致相同，4℃低温下处理后，出现叶片萎蔫的现象，野生型烟草叶片萎蔫程度大于转基因烟草，实验结果表明ZmDHN15基因可以使烟草对冷胁迫耐受性增强。

7、在冷胁迫条件下对转基因烟草与野生型烟草的根进行形态学观察消毒后的野生型烟草NC89种子和T1代转基因烟草的种子点在同一个MS培养基上，4℃春化后，分别置于常温培养箱和4℃培养箱中竖直培养14-21d。观察根部形态变化，统计根长。每组设置3个重复实验，统计平均根长。如图5所示，在常温培养的MS培养基上，转基因烟草和野生型烟草的生长状况没有明显区别，各植株的平均根长相差不大；在4℃低温下培养的MS培养基上，转基因烟草和野生型烟草的生长都受到抑制，野生型烟草生长受到的抑制更严重，转基因烟草的根长较野生型明显更长。实验结果表明ZmDHN15基因可以增强烟草在冷胁迫条件下的生长能力。

8、在冷胁迫条件下对转基因烟草与野生型烟草的萌发率的进行测定消毒后的野生型烟草种子和T1代转基因烟草的种子点在同一个MS培养基上，在4℃下进行低温胁迫培养并统计萌发率。每组设置3个重复实验，统计平均萌发率。

公式为：种子萌发率=发芽的种子数/总计种子数×100%；

如图6所示，在常温培养的MS培养基上，转基因烟草和野生型烟草的生长状况没有明显区别，各植株萌发率相差不大；在4℃低温下培养的MS培养基上，转基因烟草和野生型烟草的生长都受到抑制，野生型烟草生长受到的抑制更严重，转基因烟草的萌发率较野生型明显更高。实验结果表明ZmDHN15基因可以增强烟草在冷胁迫条件下的萌发率。

9、冷胁迫处理下转基因烟草与野生型烟草叶片ROS含量组织化学染色分析

组织化学氮蓝四唑( NBT) 染色法经常用来检测植物组织中 O₂ ^-的积累，一般颜色越浅，表明该植株的抗氧化能力越强，可以方便快速地表示植物所受到的胁迫，颜色较深则表明植物组织中活性氧的积累较多。生物体在有氧环境中会产生各种各样的ROS分子，例如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基、单线态分子氧及脂质过氧化物等。ROS活性非常大且极其不稳定，因此ROS的检测通常因其最终产物而定。其中的过氧化氢可通过DAB染色来检测，植物根尖或叶片中产生过氧化氢的部位会呈深棕色，其它呈浅棕色或者无色或者呈植物本身的色素。

将6中低温处理前后的转基因烟草和野生型烟草，取直径为10 mm的烟草叶片(注意不要取到叶脉)，分别进行组织化学染色。

NBT染色：首先配置NBT溶液，称取0.05gNBT于50ml离心管中，加入0.5ml1M磷酸缓冲液（pH 7.8），加入ddH₂O定容至50ml。然后将取样的叶片置于NBT溶液中染色0.5 h后取出，将染色后的叶片用95%的酒精脱色，直至叶绿素完全降解以便于观察并拍照记录。

DAB染色：首先配置DAB溶液，称取0.02gDAB和38mlddH₂O，0.2M HCl调pH以便溶解，配成终浓度为0.5mg/ml的DAB染液（注意现用现配，避免自我氧化）。然后将取样的叶片置于DAB溶液中染色0.5 h后取出，将染色后的叶片用95%的酒精脱色，直至叶绿素完全降解以便于观察并拍照记录。

如图7所示，NBT 染色结果显示，在常温条件下培养时转基因烟草和野生型烟草颜色深浅程度没有明显区别；在4℃低温条件下培养时，转基因烟草和野生型烟草颜色均会加深且野生型烟草颜色会深于转基因烟草。如图8所示，DAB 染色结果显示在常温条件下培养时转基因烟草和野生型烟草颜色深浅程度没有明显区别；在4℃低温条件下培养时，转基因烟草和野生型烟草颜色均会加深且野生型烟草颜色会深于转基因烟草。实验结果表明，ZmDHN15能提高烟草叶片的抗氧化能力，进而提高植株对冷的耐受性。

通过对转基因植株的耐冷性试验，结果发现冷胁迫下，转基因植株抗氧化能力较高，所受胁迫伤害较小，进一步验证了基因与植物的抗冷调控相关，过量表达该基因可以提高转基因植株的耐冷性，从而为玉米品种的基因工程改良提供了新的遗传资源。

与现有技术相比，本发明提供了一种玉米抗冷基因ZmDHN15及其应用，该基因为一种新的植物抗冷相关基因，在冷胁迫条件下的防御起着至关重要的作用。该基因的研究为后续抗冷玉米新品系的培育和种质资源创新提供理论依据和技术支撑。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种玉米抗冷基因ZmDHN15，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述玉米抗冷基因ZmDHN15在提高玉米抗冷性能中的应用。

3.如权利要求1所述玉米抗冷基因ZmDHN15在玉米种质资源改良中的应用。

4.如权利要求1所述玉米抗冷基因ZmDHN15在制备抗冷转基因玉米中的应用。

5.一种玉米抗冷基因ZmDHN15的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

6.含有权利要求1所述玉米的生物材料 ，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、工程菌或细胞。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为载体，所述载体为pCAMBIA3301载体，所述pCAMBIA3301载体的多克隆位点区域依次连接有35S启动子、如权利要求1所述的ZmDHN15基因和终止子。

8.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为细胞，所述细胞为宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求7所述的载体，和/或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的ZmDHN15基因的正向或反向序列。

9.一种提高植物抗冷性能的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的玉米抗冷相关基因ZmDHN15整合到植物的细胞、组织和器官中，并使其过量表达。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物包括玉米、水稻、小麦、拟南芥。

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