CN116042705A - 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用 - Google Patents

玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042705A
CN116042705A CN202211569794.4A CN202211569794A CN116042705A CN 116042705 A CN116042705 A CN 116042705A CN 202211569794 A CN202211569794 A CN 202211569794A CN 116042705 A CN116042705 A CN 116042705A
Authority
CN
China
Prior art keywords
zmnlp9
nitrogen
corn
seq
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211569794.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张静
陈国经纬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202211569794.4A priority Critical patent/CN116042705A/zh
Publication of CN116042705A publication Critical patent/CN116042705A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2
    • Y02P60/21—Dinitrogen oxide [N2O], e.g. using aquaponics, hydroponics or efficiency measures

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。本发明经过研究发现，在玉米中利用基因编辑技术敲除ZmNLP9基因能够显著提升玉米氮利用效率；本发明提供的ZmNLP9蛋白及其编码基因的这一新应用，为培育耐低氮玉米新品种提供新的种质资源，同时对于研究植物低氮应答响应分子机制和提高植物氮利用效率研究奠定了一定的理论基础。

Description

玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及玉米ZmNLP9蛋白及其编码基因在构建耐低氮玉米中的应用。
背景技术
随着世界人口的迅速增加以及生活水平的不断提高，人类的粮食需求快速增加，而化肥的施用以及优良品种的选育，是粮食产量产生质的飞跃的关键因素。但是以氮肥为主的化肥大规模施用会对生态环境造成破坏，而低氮环境广泛存在与我们的耕地之中，氮素营养不存不仅会影响到植物的生长发育，更是制约玉米产量的主要非生物逆境，因此，从分子生物学角度研究玉米如何耐受低氮，了解低氮环境下玉米生理生化变化，对培育玉米耐低氮新品种显得尤为重要。
玉米作为重要的农业作物，其播种面积以及产量高居全国第一，而玉米对土壤氮肥的含量要求较高，且不具有生物固氮的能力，提升玉米的氮利用效率，增强玉米对低氮土地的耐受性，对减少农业支出和减轻环境污染有着重要的意义。研究玉米具体响应低氮胁迫的分子机制和影响其主要生理生化过程中的主效因子，可以通过敲除相关基因在玉米野生型植株中，运用相应实验方法检测该转基因植株较野生型耐低氮能力是否发生变化，能有效的发掘低氮相关的优质基因资源，从而为进一步改善玉米耐低氮能力和培育耐低氮新品种提供一定的理论依据。
发明内容
针对以上情况，本发明通过编码玉米类NIN蛋白的基因ZmNLP9(全称为NODULEINCEPTION LIKE PROTEIN 9)的研究，发现降低该基因表达的转基因植株较野生型植株具有明显耐低氮的表型。
一方面，本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。
另一方面，玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在氮高效植物育种中的应用。
另一方面，本申请提供了增强植物对于低氮胁迫抗性的方法，包括敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达。
进一步地，所述ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
进一步地，所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.9。
进一步地，所述植物为单子叶植物。
进一步地，所述植物为玉米。
进一步地，敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达使用CRISPR方法进行。
进一步地，所述CRISPR方法包括设计gRNA序列；扩增、回收、构建载体；转入农杆菌；侵染植株。
进一步地，gRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，以pXUE411为模板，使用序列为SEQ ID NO.2-5的引物进行扩增。
构建耐低氮ZmNLP9的CRISPR/Cas9材料的方法，包括以下步骤：
1)利用CRISPR/Cas9靶点设计在线网站crispr-P(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR)设计并筛选候选靶序列，靶序列通常要求位于CDS的保守功能域内或其上游、GC含量在45％-75％之间；
2)利用网站CRISPR-RGEN-Tools(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)对候选靶序列进行脱靶分析，进一步筛选确定最优的、潜在脱靶率低且对其他基因编码区无影响的特异性靶序列。
3)以待选靶序列为目标，在其上下游设计特异性引物，以受体材料基因组DNA作为模板对目的基因进行扩增，对PCR产物测序进行验证，如有差异，需要修正靶序列后重新进行脱靶分析，最终选择最优靶序列进行载体构建，本发明所用gRNA序列为CCCTCCGCTGCGCAACAGA(SEQ ID NO.1)，所用载体为中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心pXUE411。
4)载体构建后经测序检测，转化农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌侵染玉米幼胚获得转基因阳性幼苗，通过自交与测序检测获得纯合的突变材料。
本申请中所述的ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.9、所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.10；但与之有一个或多个核苷酸或氨基酸区别，但功能相同或者类似的变体仍然在本申请的保护范围内。
只要其中具有所述ZmNLP9基因，本申请的方法适用于各种玉米品种。
本申请中的敲除或者抑制方法，如CRISPR方法的操作细节和试剂本领域公知或者可以使用现有的试剂盒完成。
有益效果：
本发明提供的ZmNLP9蛋白及其编码基因为培育耐低氮玉米新品种提供了基因资源，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。
附图说明
图1为ZmNLP9的CRISPR/Cas9材料鉴定结果。
图2为本发明实施例3中CRISPR/Cas9株系高低氮培养后照片。
图3为本发明实施例3中过表达株系高低氮培养后植株生物量和叶绿素含量统计图。
图4为表达载体pXUE411结构图谱。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
以下实施例中的主要试剂为：Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD、购自NEB、Toyobo等生物公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LB Medium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
实施例中所使用的引物由北京擎科生物科技有限公司合成，并进行相关测序。
实施例1ZmNLP9基因CRISPR/Cas9材料的构建和检测
根据ZmNLP9基因(玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G105004)的编码区序列分析，设计gRNA其序列为CCCTCCGCTGCGCAACAGA(SEQ ID NO.1)，并设计引物以pXUE411为模板进行四引物扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，配制酶切链接体系构建pXUE411-ZmNLP9载体。
所用引物包括：
ZmNLP9-BsF:AATAATGGTCTCAGGCGCCCTCCGCTGCGCAACAGA(SEQ ID NO.2)；
ZmNLP9-F0:CCCTCCGCTGCGCAACAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.3)；
ZmNLP9-R0:TCTGTTGCGCAGCGGAGGGCGCTTCTTGGTGCC(SEQ ID NO.4)；
ZmNLP9-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACTCTGTTGCGCAGCGGAGGG(SEQ ID NO.5)；
将回收后的PCR产物按照如下比例配制酶切连接体系，
1.PCR片段(964-bp) 2μL
2.pXUE411 2μL
3.10xNEBT4Buffer 1.5μL
4.10xBSA 1.5μL
5.BsaI(NEB) 1μL
6.T4 Ligase(NEB)/高浓度 1μL
7.ddH2O 6μL
8.Total 15μL
将反应体系先后在金属浴中37℃处理5h，50℃处理5min，80℃处理10min之后取5μL转入大肠杆菌涂于卡纳抗性LB培养基上，挑取阳性克隆菌斑进行测序，获得正确载体，测序引物TaU3-RD其序列为CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC(SEQ ID NO.6)。将pXUE411-ZmNLP9转入农杆菌EHA105，通过幼胚侵染的方法获得转基因植株，通过对包括靶点在内的基因片段进行PCR扩增、测序确定转基因阳性植株。最终获得了两个ZmNLP9候选基因的敲除材料(命名为ZmNLP9crispr-1和ZmNLP9crispr-2)，测序结果表明获得两个纯合突变的转基因株系如图1。鉴定转基因材料的引物为1985F、1985R，序列分别为CATTTCGGCGTACTAGGTG(SEQ IDNO.7)和CTGGTCAAGTAAATAGGGCT(SEQ ID NO.8)，测序引物用1985即可。
实施例2ZmNLP9基因CRISPR/Cas9材料的耐低氮能力检测
首先将野生型玉米中和实施例2中所得的ZmNLP9crispr-1和ZmNLP9crispr-2株系在蛭石中萌发，萌发一周后玉米幼苗长至一叶一心期，然后用去离子水洗去幼苗根部的蛭石，去除胚乳后移栽至水培正常氮浓度营养液中，缓苗两天后将水培幼苗分为正常氮和低氮处理，两周后观察表型。在正常氮(4mM)处理下的转基因材料与野生型材料无明显差异，而在低氮(0.04mM)处理下ZmNLP9crispr-1和ZmNLP9crispr-2表现出叶片持绿性更好，野生型材料在低氮条件下叶片失绿早衰(图2)。同时对材料的鲜重和叶绿素含量及总氮(nitrogen)含量进行测量统计(图3)。由此可见，玉米转录因子ZmNLP9敲除后能够显著提高植物对低氮环境的耐受能力。ZmNLP9氨基酸序列：(SEQ ID NO.9)
Figure BDA0003987527240000041
Figure BDA0003987527240000051
ZmNLP9核甘酸序列：(SEQ ID NO.10)
Figure BDA0003987527240000052
Figure BDA0003987527240000061
Figure BDA0003987527240000071

Claims (10)

1.玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。
2.玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在氮高效植物育种中的应用。
3.增强植物对于低氮胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法包括敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用或方法，其中所述ZmNLP9核苷酸序列为SEQ IDNO.10。
5.根据权利要求4所述的应用或方法，所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.9。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用或方法，其中所述植物为单子叶植物。
7.根据权利要求6所述的应用或方法，其中所述植物为玉米。
8.根据权利要求1-7任一项所述的应用或方法，其中敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达使用CRISPR方法进行。
9.根据权利要求8所述的应用或方法，其中所述CRISPR方法包括设计gRNA序列；扩增、回收、构建载体；转入农杆菌；侵染植株。
10.根据权利要求9所述的应用或方法，其中gRNA序列如SEQ ID NO.1所示；以pXUE411为模板，使用序列为SEQ ID NO.2-5的引物进行扩增构建载体。
CN202211569794.4A 2022-12-08 2022-12-08 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用 Pending CN116042705A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211569794.4A CN116042705A (zh) 2022-12-08 2022-12-08 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211569794.4A CN116042705A (zh) 2022-12-08 2022-12-08 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042705A true CN116042705A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86119016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211569794.4A Pending CN116042705A (zh) 2022-12-08 2022-12-08 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042705A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113197087B (zh) 一种小麦抗赤霉病分子育种方法
CN107880099B (zh) 水稻种子休眠性调控基因OsMPK7及其应用
CN111303259A (zh) 水稻转录因子基因OsBEAR1在培育胚芽鞘增长或适于田间直播的水稻品种中的应用
CN110819635B (zh) 豆科植物han同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用
CN103014035B (zh) 茎瘤芥抗逆基因及其植物表达载体和构建方法及应用
CN108047319B (zh) 水稻种子休眠性调控基因OsMPK14及其应用
CN109852634A (zh) 一种培育高结瘤固氮转基因植物的方法
CN113186200B (zh) 一对控制西瓜卷须有无和侧枝多少的基因ClTFL/Cltfl1及用途
CN108795927A (zh) 普通小麦基因TaSPX3编码序列的克隆及其应用
CN116042705A (zh) 玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用
CN111705077B (zh) 番茄miR156e-3p基因在提高番茄低温抗性中的应用和植物过表达载体
CN116286954B (zh) 水稻赤霉素分解基因OsGA2ox7突变体构建及其应用
CN110964729A (zh) 一种普通小麦基因TaSNX1的克隆方法、应用及应用方法
CN116732048B (zh) 水稻转录因子基因OsbZIP48在获得高锌水稻籽粒和/或调节氮素吸收中的应用
CN112410455B (zh) 一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1、分子标记及其应用
CN116121261B (zh) 一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法
CN112280789B (zh) 高粱耐盐碱胁迫基因、检测引物组和试剂盒及应用
CN116121292B (zh) 一种水稻myb转录因子及其编码蛋白的应用
CN115772522B (zh) 利用基因编辑敲除TaSK2A在增加小麦籽粒长度中的应用
CN112501195B (zh) 水稻miRNA基因smNRT2.3-1的应用
CN110129338B (zh) 玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用
CN107058381A (zh) 一种获得耐盐转基因大豆材料的方法
CN116103309A (zh) 油菜BnHOS1基因及其提高植物抗寒性中的应用
CN118006680A (zh) 水稻热精胺合成酶基因OsACL5在调节中胚轴伸长和直播出苗率中的应用
CN117343955A (zh) OsZNF9基因提高水稻耐盐的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination