CN111593059A - 一种调控番茄果实颜色的基因、snp、分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用。本申请中通过对515份番茄重测序材料进行全基因组关联分析，定位到一个控制番茄条斑形成的QTL，构建F₂连锁群体进行图位克隆，进一步确定候选基因GS。通过生物信息学、遗传学和分子生物学解析GS启动子甲基化差异是叶绿素和类胡萝卜素在番茄不均匀分布的原因，解析了GS调控果实颜色形成的机理。该发明中解析的果实颜色调控机制将为番茄品质遗传改良奠定基础。

Description

一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用。

背景技术

条斑表型是自然界植物中的一种常见现象，例如在蝴蝶、玉米、苹果、西瓜和花卉中。但是现有 技术中对造成这种色彩差异分布的机理研究很少。目前科学家们对色彩差异分布的机理主要归功于功 能基因突变、RNA沉默、转座子跳跃和基因启动子甲基化。拟南芥突变体(immutans)(Aluru et al.,2007) 和番茄突变体(ghost)(Shahbazi et al.,2007)中质体末端氧化酶的基因突变导致杂色叶的产生。通过干 扰花青素生物合成途径中查尔酮合酶(CHS)可以获得多彩斑斓的花朵(Nakatsuka et al.,2007；Morita et al.,2012)。玉米中AC/DS转座子跳跃使玉米籽粒呈斑点表型，这个玉米的转座系统理论获得1983的 诺贝尔生理学奖(Ravindran,2012)。大丽花花瓣橘红色的杂色是由于DvIVS基因中转座子的插入造成 的(Ohno et al.,2011)。最近的研究表明，基因启动子甲基化也是果实着色多样化的原因。苹果表皮 MYB10基因启动子甲基化差异直接导致MYB10基因表皮差异性表达，进而差异化花色苷生物合成相 关的基因的表达，最终导致花青苷在苹果表面差异化积累形成黄条纹和红条纹(Telias et al.,2011)。同 样的，梨表皮的斑点和斑纹也是由于MYB10基因启动子甲基化差异造成的(Qian et al.,2014)。至今， 除了玉米籽粒杂色形成的AC/DS转座系统理论外，植物杂色形成的内在遗传机制仍是未知的。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，调控基因的表达进而影响植物的发育(Choi&Sano, 2007；Wang et al.,2013)。RNA介导DNA甲基化(RdDM)是一种重要的小RNA参与的表观修饰。在 细胞核中，小RNA以同源序列匹配的方式靶向基因组区域并诱导表观遗传修饰，例如胞嘧啶甲基化 和组蛋白甲基化(Matzke&Mosher,2014)。通过对玉米抗旱性的全基因组关联分析，发现ZmNAC111 基因启动子82-bp MITE的插入与玉米抗旱性显著相关，此MITE可以产生siRNA通过RdDM途径影 响ZmNAC111基因的表达(Mao et al.,2015)。番茄成熟延迟突变体cnr是由于SBP-box基因启动子高度 甲基化，但甲基化潜在的机理尚未清楚(Manning et al.,2006)。利用CRISPR/Cas 9系统敲除番茄中 SlDML2基因(拟南芥中ROS1的同源基因)，获得的突变体中TAGL1甲基化水平升高，最终延迟了 番茄果实成熟(Lang et al.,2017)。综上，DNA甲基化在植物生长发育中扮演重要的角色。

编码MADS-box转录因子的TAGL1基因调节果实的器官发生和发育。通过RNAi技术抑制番茄 TAGL1的表达，可以使转基因番茄果皮变薄(Vrebalov et al.,2009)。在TAGL1–SRDX超量转基因番茄 中，乙烯含量下降，叶绿素含量增加，果实成熟延迟。TAGL1被认为可以结合ACS2(乙烯合成途径 中的限速酶)基因的启动子，并激活ACS2的表达。TAGL1超量系的萼片可以积累番茄红素(Itkin et al., 2009)。利用RNAi获得的TAGL1干涉系的果实表现为薄的角质层和薄而坚硬的表皮，同时，在TAGL1 干涉系中角质中组分含量显著性下调，相反，TAGL1超量系果实的角质厚度增加而且组分也发生的改 变(Gimenez et al.,2015)。TAGL1也调控果实的营养成分。利用VIGS沉默TAGL1的果实中，氨基酸 和有机酸的含量下调(Zhao et al.,2018)。TAGL1通过细胞分裂，赤霉素代谢和生长素信号转导的基因 表达，使番茄适应盐胁迫(Ribelles et al.,2019)。

番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的蔬菜作物，为全球消费者提供丰富的营养物质。果实 色泽作为番茄果实一种重要的感观品质，直接影响果实的商品性。在番茄常规育种中，条斑番茄是自 然发生的突变体，类似于“家传宝”番茄，具有独特而迷人的果实颜色。番茄果实表面在特定情况下 不均匀着色表明其具有复杂而精细的调控。果实表面多样的着色方式引起育种家注意，更有意义的是， 这种多彩斑斓的果实能吸引鸟类取食，反而有利于种质传播。番茄全基因组测序及不同番茄品种简化 基因组数据可以共享(http://solgenomics.net/)，全基因组关联技术和图位克隆技术在很多物种得到应 用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用， 目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明利用全基因组关联分析和图位克隆技术获得调控番茄条斑形成的基因GS，该基因在果实 表皮浅绿条斑和绿条斑中差异表达是产生条斑的原因。利用转基因技术验证了GS调控番茄条斑的形 成。

本发明是这样实现的，一种调控番茄果实颜色的基因，其特征在于：所述基因为GS基因，序列 见NCBI登录号：NM_001313930或NCBI登录号：NP_001300859。

进一步地，所述GS基因调控番茄叶绿素差异化积累。

进一步地，所述GS基因调控番茄条斑形成。

一种番茄果实颜色相关的SNP，所述SNP标记为SL2.50ch07_63842838。

针对上述的SNP开发的分子标记，正向引物序列： 5′-GTCTCTATTTTTTTTTGGGCATCTTTGCAGCTAGTAAATTTTTCTCTCTCTTCCGAATT-3′，反向 引物序列：5'-ACTGAGTAACTCCCTCTAGTCAGAAAGA-3'。

一种番茄果实颜色性状检测方法，以上述的分子标记对番茄基因组进行PCR扩增，扩增产物利 用EcoRI酶切；若酶切能够产生59bp和355bp两个片段，则为条斑性状样品；若不能被酶切，则为 非条斑性状样品。

进一步地，所述检测方法能够条斑性状进行检测。

进一步地，所述PCR扩增的体系(20μL)为：10×Taq buffer 2μL,dNTPs 0.4μL,Fw引物0.5μL,Rv 引物0.5μL,DNA模板1μL,Taq酶0.1μL,ddH₂O 15.5μL。所述PCR扩增的程序为94℃预变性 3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，进行36个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min。

进一步地，所述EcoRI酶切条件为：PCR产物在37℃下通过EcoRI(ThermoScientific)酶切2h， 酶切体系为10μl：5μl PCR产物，1μl 10×buffer EcoRI，0.3μlEcoRI(10units/mL)，补ddH₂O。

如上述的GS基因或SNP在调控番茄叶绿素含量中的应用。

如上述的GS基因或SNP在调控番茄育种中的应用。

如上述的GS基因或SNP在调控番茄条斑性状中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请中通过对515份番茄重测序材料进行全基因组关联分析，定位到一个控制番茄条斑形成的 QTL，构建F2连锁群体进行图位克隆，进一步确定候选基因GS。通过生物信息学、遗传学和分子生 物学解析GS启动子甲基化差异是叶绿素和类胡萝卜素在番茄不均匀分布的原因，解析了GS调控果 实颜色形成的机理。该发明中解析的果实条斑机制将为番茄品质遗传改良奠定基础。

本发明通过条斑突变体gs与M82(果实表面颜色均匀)构建F₂分离群体，针对条斑性状进行图 位克隆，最后通过表达分析、测序分析和转基因技术确定调控番茄条斑形成的基因GS，GS基因的序 列见NCBI登录号：NM_001313930或NCBI登录号：NP_001300859，属于MADS-box转录因子家族 基因。GS第二内含子中的SNP(SL2.50ch07_63842838)与番茄核心种质和商业材料的条斑表型完全连 锁，该SNP影响GS第二内含子中可以转录出的长链非编码RNA二级结构，同时小RAN测序表明来 源于GS第二内含子MITE中的小干扰RNA(siRNA)在绿条斑的表达量高于浅绿条斑中的表达，本发 明解析了此SNP通过影响RdDM途径来影响GS启动子的甲基化，进而促使GS在果实表面的差异性 表达。针对条斑番茄内含子中保守的SNP(SL2.50ch07_63842838)，本发明开发了基因标记用于番茄育 种中的辅助选择。

附图说明

图1是条斑突变体gs的表型；

图2是在不同发育阶段gs果实的表型；

图3是通过GWAS结合BSA技术克隆GS；

图4是不同番茄品种SNP1和SNP2的分布情况；

图5是GS的结构特征及亚细胞定位；

图6是GS在条斑突变体gs中功能验证；

图7是GS的超量系和gs的红熟果实的表型；

图8是GS的特殊表达模式；

图9是在gs中浅绿条斑和绿条斑的GS启动子甲基化差异性检测；

图10是浅绿条斑和绿条斑中RNA-Seq分析；

图11是GS调控叶绿体发育相关基因的表达；

图12是在红条斑和黄条斑中GS和PSY1的相对表达量；

图13是针对GS第二内含子中保守SNP1(SL2.50ch07_63842838)开发的共显性dCAPS标记及其 在番茄商业品种中的应用。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细 说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具 体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用，具体如下各实施例所示。 本发明涉及的番茄材料：本实验室收集的515份番茄核心种质资源、条斑突变体gs、LA3530、7份条 斑表型的商业番茄品种。

条斑突变体gs的表型见图1所示，其中(a)绿条斑和浅绿条斑在gs绿熟期果实的表面随机分布， 红条斑和绿条斑在在gs红熟期果实的表面随机分布。MG,绿熟期；RR,红熟期；LGS，浅绿条斑； GS，绿条斑；RS，红条斑；YS，黄条斑；(b)果肉和上表皮从M82和gs的绿熟期果实分割；(c) 利用共聚焦荧光显微镜观察浅绿条斑和绿条斑的叶绿素荧光，叶绿素自发荧光呈红色；(d)通过透 射电子显微镜观察细胞和叶绿体的显微结构，Chl代表叶绿体，CW代表细胞壁；(e)在透射电子显 微镜视野中，每个细胞中叶绿体的数量；(f)是分别在M82和gs的果肉、M82和gs的上果皮、绿 条斑和浅绿条斑中叶绿素含量测定；(g)是在透射电子显微镜下，有色体的结构和质体小球的大小 及密度的观察，P代表质体小球，CE代表有色体包膜；(h)是在透射电子显微镜视野中，每个有色 体中质体小球的数量；(i)利用色差仪测定条斑果实红条斑和黄条斑的色差值a*和b*。不同发育阶 段gs果实的表型见图2所示。

本发明中涉及的GS基因组序列(gDNA)见SEQ ID NO.1；cDNA序列见SEQ ID NO.2；CDS序列 见SEQ ID NO.3；氨基酸序列见SEQ ID NO.4；启动子序列(ATG上游5Kb)见SEQ IDNO.5。

实施例1控制条斑性状基因的定位

本发明利用515份番茄核心种质(包括7份果实呈条斑的番茄品种)重测序开发了9349975个高 质量SNP，对番茄条斑表型进行关联分析，GWAS使用EMMAX软件中的混合线性模型完成，本发 明使用的参考基因组参考SL 2.50(http://solgenomics.net/)。最显著性的SNP(T/C)是 SL2.50ch07_63842838(P＝2.672960472e^-256)，落在了GS第二内含子中(见图3b，i)。

图3是通过GWAS结合BSA技术克隆GS的相关结果，其中(a)核心种质资源中7份番茄品种 呈现条斑表型。(b)番茄条斑表型全基因组关联马哈顿图，采用混合线性模型的方法，最高的SNP在 SL2.50ch07_63842838(P＝2.672960472e-256)。(c)呈现绿条斑的品种在核心种质资源中所占的比例及 在SL2.50ch07_63842838位置的基因型。(d)M82与gs构建F2群体，杂交F1代的果实呈现均匀颜色。 (e)F2群体中30棵果实呈均匀表型的DNA池与30棵果实呈绿条斑表型的DNA池的等位基因频率 差异。X轴代表番茄的12条染色体。Y轴代表两个池中等位基因频率差异。绿色线代表90％的置信 域。橘红色的线代表95％的置信域。超过95％的置信区间在7号染色体60.9M和64.7M之间。(f)控 制条斑表型的基因的精细定位，将目标基因锁定在M63825和M63919两个标记之间，两个标记距离 是93-Kb。(g)在候选区段内有11个候选基因。箭头代表基因的方向。(h)10个候选基因在绿条斑和 浅绿条斑中的相对表达分析。(i)ORF1的基因结构。黑色的框子代表外显子，细线代表内含子。

在本发明中，条斑突变体gs为父本与M82(果实呈均匀色)为母本进行杂交，F1代果实呈现均匀 的颜色，说明条斑为隐性性状(见图3d)。F1自交产生F2分离群体(627个单株)，其中460个单 株果实呈均匀颜色，167个单株果实呈条斑表型，经过卡方检验，F2代中颜色均匀果实的单株数与条 斑果实的单株数比例符合孟德尔分离比3：1(χ²＝0.8086)，可见条斑性状是由单基因控制。在F2代 中随机挑选30棵颜色均匀果实的单株和30棵条斑果实的单株，使用CTAB法加纯化DNA的方法分 别从60棵单株幼嫩叶片提取高质量DNA，通过凝胶电泳检测DNA的质量(主要观察DNA是否降解)， 然后使用NanoDrop 2000测定DNA的浓度，将30棵颜色均匀果实的单株的DNA进行等质量混合成 显性池，将30棵条斑果实的单株的DNA进行等质量混合成隐性池。将两个混池保存于干冰中，送于 诺禾致源生物信息科技有限公司进行DNA测序，每个池测序深度为30层。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)47软件将测序的reads比对到参考基因组SL 2.50(http://solgenomics.net/)，然后通 过SAMtools48筛选两个混池中的SNP。以Heinz1706为参考序列，在两个池中分别进行基因型频率 计算(index)，显性池中SNP index值与隐性池中SNP index值之差为delta(SNP index)。以1Mb长度为滑动窗口，以10kb为窗口一次滑动距离，马哈顿图每个点的SNP index为一次窗口内部delta (SNP index)的均值。根据两个池中等位基因频率的差异，申请人将控制番茄条斑性状基因锁定在 七号染色体60.9Mb到64.7Mb之间(超过99％的置信区间)(见图3e)，GWAS中最显著点 SL2.50ch07_63842838(P＝2.672960472e^-256)在此区间内。

为了精确定位控制条斑的基因，扩大到1600个单株的F2群体。基于M82与gs基因组SNP，开发了9个新的标记(M59885、M60966、M63665、M63825、M63919、M64035、M64166、M64769、M65244)。利用这9个标记在条斑单株中进行图位克隆，将控制条斑的基因进一 步定位在M63825和M63919之间(见图3f和g)，在M63825和M63919标记位置各有一 个重组事件。根据番茄SL2.5版本参考基因组序列，M63825与M63919之间的物理距离约为 93kb，涵盖11个预测的开放阅读框(ORF1-11)，将这11个候选基因分别在绿条斑和浅绿 条斑中进行qPCR，结果显示只有ORF1基因在绿条斑中的表达量显著低于浅绿条斑，因此， ORF1被认为是最可能控制条斑的基因(见图3h)。从M82和gs中扩增并测序了ORF1，结 果显示ORF1的3Kb启动子和1Kb长度3'UTR没有差异，只在ORF1的第2和第5的内含 子中各存在一个SNP，存在于ORF1第二内含子的SNP称为SNP1，存在于ORF1第五内含 子的SNP称为SNP2(见图3i)。本申请中搜集了7份商业品种呈现条斑表型，从美国番茄 遗传资源中心(http://tgrc.ucdavis.edu/)引进Ailsa Craig背景的LA3530品种呈现条斑表型， 利用这些材料进一步确定控制条斑表型形成基因的变异位点。通过对ORF1基因测序和序列 比对，SNP1在条斑品种中保守，SNP2在条斑品种中不保守(见图3c和图4)，这些结果表 明ORF1是控制条斑性状的候选基因。ORF1是Solyc07g055920(GS)，它编码一个MADS-box 蛋白，一类特异性调控番茄果实发育的核转录因子(见图5)，SNP1在染色体上的位置是 SL2.50ch07_63842838；SNP2在染色体上的位置是SL2.50ch07_63848537。

图4是不同番茄品种SNP1和SNP2的分布情况，其中，(a)通过PCR扩增及桑格测序来验证SNP1 和SNP2在Heinz1706,、M82、AC和条斑番茄的碱基；SNP1与条斑表型完全连锁，SNP2与条斑表 型不完全连锁；(b)SNP2在核心种质资源中分布情况。

图5是GS的结构特征及亚细胞定位，其中(a)NCBI公布的GS的保守结构域；(b)GS::YFP融 合蛋白的亚细胞定位。

实施例2 GS的超量载体构建及遗传转化

1、超量载体构建

SGN网站SL 2.50(http://solgenomics.net/)公布GS的gDNA长度为9.7Kb，GS的cDNA长度为 1.2Kb。利用Primer 5软件对GS基因进行引物设计，包括完整的ORF，正向引物：5' CATTTGGAGAGGACACGCTCGAG AGCTCTCCTGTTCAAACCTATACAAAAT 3'，反向引物：5'TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGA TTCTGAAGATGAAGAGCCTTGACC 3'，以M82 cDNA为模板， 用Phanta酶(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)进行PCR扩增。PCR扩增的体系(20μL)为：10×Taq buffer 2μL,dNTPs 0.4μL,Fw引物0.5μL,Rv引物0.5μL,cDNA模板1μL,Taq酶0.1μL,ddH₂O 15.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min， 30个循环，72℃延伸10min，4℃终止反应。产物经过1％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切 下目的条带，使用胶回收试剂盒对目的条带进行回收，获得较纯净的PCR产物。

超量载体骨架：用XhoI+XbaI双酶切pHELLSGATE8空载，回收大约1.3Kb的目的条带。酶切体 系为：20μL体系，包括XbaI酶1μL，XbaI 1μL，10×buffer 2μL，质粒5μL，ddH₂O11μL，反应条件 为37℃3h。纯净的PCR产物与酶切过的pHELLSGATE8载体骨架进行同源重组。同源重组反应体 系(10μL)：1μL Exnase，2μL 5×CE buffer，2μL pHellstage8载体，3μL PCR产物，2μL ddH₂O， 所用的试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。体系混好后轻轻吸打几次，于37℃恒温箱反应30min 立即冰浴5min。

将10μL同源重组产物加入25μL大肠杆菌感受态Trans T1，混合体系冰浴30min，42℃水浴锅 中反应55S立即冰浴2min，然后加入500μL空白LB，放入37℃摇床复苏1h，均匀涂在100mg/L的 Spec固体LB培养基上，37℃恒温箱培养18h，挑取单克隆于100mg/L的Spec液体LB培养基，放 入37℃摇床培养8h，经过PCR检测，呈正确条带的菌液送公司测序(由武汉天一辉远生物科技有 限公司完成)，通过MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)网站将测序结果 与参考序列进行比对分析。测序结果正确的菌液在37℃摇床培养，提取质粒，载体构建已经完成。

2、遗传转化

将构建好的载体质粒电激转入农杆菌感受态C58，对单克隆菌落进行PCR鉴定，阳性单克隆的 菌液加入10ml的80mg/L Spec+25mg/L Rif的液体LB培养基进行扩繁活化，通过农杆菌侵染番茄 子叶的方法获得转基因番茄，本发明中受体材料为条斑突变体gs(见图6a和图7)。对获得的T0代 植株进行阳性检测，首先提取T0代植株的DNA，载体上特异引物作为正向引物：5' ACGCACAATCCCACTATCCTTC 3'，GS基因引物作为反向引物：5' TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGATTCTGAAGATGAAGAGCCTTGACC 3'，以T0代植株的DNA为 模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20μL)：0.1μL Taq酶(5U/μL)，2.0μL 10×PCR Buffer，0.4μL dNTP(10mmol/μL)，正反引物(10ng/μL)10各0.4μL,1.0μL DNA(50-600ng/μL)，15.7μL ddH₂O (引物由北京擎科生物科技有限公司合成，Buffer，dNTP和Taq酶由北京全式金生物技术有限公司提供)；混好的体系用液体石蜡密封，以800r/min转速离心，放入PCR仪进行扩增，PCR反应程序： 94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，进行36个循环，72℃延伸10min， 4℃保存10min。PCR产物进行凝胶电泳检测，用1％琼脂糖(加入溴化乙锭)在120V电压条件下电 泳20min，用凝胶成像系统来检测PCR产物条带，最终确定转基因番茄植株的阳性。

图7是GS的超量系和gs的红熟果实的表型图。

通过荧光定量PCR(qPCR)方法检测GS基因表达水平。提取相关材料果实特定组织RNA，用 反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。利用LightCycler480 SYBR Green I MasterKit，根据试剂盒步 骤进行qPCR检测GS基因的相对表达量。构建GS启动子驱动GUS基因表达载体，通过农杆菌介导 转化番茄，通过GUS染色检测GS启动子表达模式。

图8是GS的特殊表达模式，其中，(a)GS在M82和gs的果肉和整个外果皮中表达量没有显著 性差异。(b)半定量PCR检测GS在M82外果皮、gs的浅绿条斑和绿条斑中的表达量。Actin作为 上样对照。(c)F2群体中随机挑选5棵有条斑果实的植株，检测GS在浅绿条斑和绿条斑中的相对 表达量。(d)在核心种质资源7份有条斑番茄品种中检测GS在浅绿条斑和绿条斑中的相对表达量。 (e)通过qPCR检测GS在AC不同组织中的相对表达水平，RNA分别从根、茎、叶、花、幼果、 绿熟期果实、破色期果实、红熟期果实中提取。(f)GS的启动子驱动GUS基因转化番茄，对转基因番 茄各器官进行X-Gluc染色。

实施例3 GS基因CRIPSR/Cas9基因敲除

CRIPSR/Cas9系统敲除载体的构建：本发明中敲除载体为pTX，是一种把番茄U6启动子 (Sequence ID:X51447.1)和2×35S zCas9的序列添加到pBin19载体(GenBankaccession number: U09365.1)上而得到的CRISPR/Cas9双元载体(Xing et al.,CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.2014)。利用在线软件(http://crispr.dbcls.jp/)设计两个sgRNA引物，正向引物：5' AATCTAACAGTGTAGTTTGTC TCAGTTGAGAAAAACAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC 3'，反向 引物：5'CTATTTCTAGCTCTAAAACTTT CTACGCTTGCAGAACGTCAAACTACACTGTTAGATTC 3'(划线部分表示GS第一外显子上的两个靶点)。载体构建及遗传转化等的方法同本发明的实施例2。 在T0代转基因番茄中，用PTX特异性引物，正向引物：5'CGGCCTCGATATTGGGACTAACTCT 3'， 反向引物：5'CTTATCTGTGGAGTCCACGAGCTTC 3'，来检测Cas9蛋白是否存在于转基因番茄中。 在T1代转基因番茄中，用双靶点侧翼的GS基因引物，正向引物：5' GTTGTTTTTTCTTCTTTTGGATGCTAC 3'；反向引物：5'CAAACCTGTTATTGGCATATTCATAGA 3'，来检测转基因植株中GS的突变类型(见图6c)，检测方法同本发明的实施例2。

图6是GS在条斑突变体gs中功能验证，其中，(a)在gs受体材料中，超量表达和敲除GS转 基因系果实的表型。(b)T1代GS超量表达量系果实表皮中GS的相对表达量。(c)三个CRISPR/Cas9 敲除T1株系中GS靶点处突变类型(d)在gs、GS超量系和敲除系表皮中叶绿素的含量。

实施例4 GS基因调控番茄果实叶绿素含量

RNA-Seq：本发明中以条斑突变体gs为研究材料，获取绿熟阶段的条斑果实，浅绿条斑和绿条 斑分别从gs果实外果皮切割，包含两个生物学重复，立即放入液氮中并保存于-80℃，提取总RNA。 总RNA送于华大基因进行测序，使用的是BGISEQ-500的测序系统。测序后所得的reads比对到SL 2.50 版本的基因组(http://solgenomics.net/)。如果基因在浅绿条斑和绿条斑中表达差异高于2倍且P值小 于0.05，则将该基因归为差异表达基因。利用DAVID软件对差异表达的基因进行KEGG分析，然后 利用R包ggplot2和Hmisc做出气泡图(见图10a)。

图10是浅绿条斑和绿条斑中RNA-Seq分析，其中，(a)浅绿条斑和绿条斑中RNA-Seq数据KEGG 分析，点的大小表示基因数量，点的颜色表示富集代谢通路的P值。(b)通过qPCR验证RNA-Seq的 结果。分别从浅绿条斑和绿条斑提取总RNA。选取了10个与光合作用、叶绿素合成和叶绿体发育相 关的基因进行定量PCR，qPCR结果与RNA-Seq结果一致。

图11是GS调控叶绿体发育相关基因的表达，其中，(a)RNA-seq结合ChIP-seq来鉴定GS的 靶基因。蓝色的韦恩图表示浅绿条斑和绿条斑的501个差异表达基因(来源于RNA-seq数据)。红色 韦恩图表示GS直接靶向9689个基因启动子(来源于ChIP-seq数据)；(b)RNA-seq和ChIP-seq 重叠的172个基因进行KEGG分析。点的颜色代表172个基因富集代谢通路的P值，点的大小代表 基因的数量；(c)3个与叶绿体发育相关基因(SlMPEC、SlPsbQ和SlCAB)在浅绿条斑和绿条斑中表 达。定量PCR结果与RNA-seq中基因差异表达一致。(d)双荧光素酶实验表明GS调控SlMPEC、 SlPsbQ和SlCAB基因的表达。GS的ORF连接效应载体(pGreen II 62-SK)，SlMPEC、SlPsbQ和SlCAB 基因的启动子连接报告载体。通过农杆菌转化烟草，两种载体在烟草叶片中瞬时表达，来测定LUC (荧光素酶)与RLU(海肾蛋白)的比值。

通过qPCR方法检测GS和类胡萝卜素相关基因PSY1表达水平。提取相关材料果实特定组织RNA， 用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。利用LightCycler480 SYBR Green IMaster Kit，根据试剂盒 步骤进行荧光定量PCR(qPCR)检测GS和PSY1基因的相对表达量。图12是在红条斑和黄条斑中 GS和PSY1的相对表达量，其中，(a)GS在gs和F₂群体中3个隐性单株中红条斑和黄条斑中相对表 达量；(b)PSY1在gs和F₂群体中3个隐性单株中红条斑和黄条斑中相对表达量；(c)双荧光素酶实验 表明GS正向调控PSY1基因的表达。

叶绿素含量测定：分割条斑突变体gs绿熟期果实的浅绿条斑和绿条斑(见图1f)，gs、GS超量 系和GS敲除系绿熟期果实的外表皮(见图6d)。称取经液氮研磨成粉状的样品0.2g于2ml离心管中， 加入1.5ml 80％的丙酮溶液，立即混匀并放置于暗处抽提至样品白色，抽提好的样品以12000r/min离 心10min，取200μL的上清液于酶标板中，利用酶标仪测定在波长646nm和663nm下的吸光值。叶 绿素含量测定与计算参考公开报道的方法(Lichtenthaler,1987)，计算公式如下：

叶绿素总含量(mg/g)＝(17.32A₆₄₆+7.18A₆₆₃)×1.5÷M÷1000

实施例5 GS启动子在gs的浅绿条斑(红条斑)和绿条斑(黄条斑)中甲基化检测

重硫酸盐测序：重亚硫酸盐处理浅绿条斑和绿条斑的基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧 啶，发生甲基化的胞嘧啶不会发生变化，经过PCR扩增连接载体进行单克隆测序，精确定量检测GS 启动子区段在浅绿条斑和绿条斑中甲基化情况。具体地是，选择绿熟期条斑果实，精细地把浅绿条斑 和绿条斑从条斑果实分离出来，使用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen 51304)提取高质量地DNA，利用

Bisulfite kit(Qiagen 59104)处理浅绿条斑和绿条斑的DNA。在甲基化专业网站MethPrimer针对启动子两个区段设计引物(见图9a)，Pro-1的正向引物：5' TTAGGTATGGGGAGACTTTTTTTTTCC 3'，Pro-1的反向引物：5'AAGATATTGAATTCAGCACTAAACCC 3'；Pro-2的正向引物：5'AGGGGGGAAGGTTCCCTAC 3'， Pro-2的反向引物：5'TTGAATCAGTGACAAAAGAAAAAATAA 3'。以重硫酸盐处理过的DNA为模 板，经PCR扩增产物连接T载体，针对每个样本的一个片段随机挑选10个阳性单克隆进行测序，通过kismeth(http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl)网站，计算三种甲基化类型(CG、CHG和 CHH)的甲基化比率(见图9b)。

McrBC-PCR：采用CTAB法从gs的浅绿条斑和绿条斑、红条斑和黄条斑中提取高质量的DNA。 每个样本的DNA分两份，一份加GTP，另一份不加GTP，DNA在37℃下通过McrBC(Takara Bio) 酶切6h，McrBC酶切反应体系(20μl)：2μl的McrBC(10U/l)，2μl的10X McrBCBuffer，4μl 的0.1％BSA，0.4μl的100mM GTP(100X)，100ng DNA，用ddH₂O补足至20μL，然后65℃孵育 20min，使酶变性。以McrBC酶切处理过的DNA为模板，引物还是重硫酸盐测序所用的引物，通过 PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上显示条带亮度，来评估GS启动子在浅绿条斑 和绿条斑、红条斑和黄条斑中甲基化程度。PME(Solyc03g123630)启动子没有被甲基化；CNR (Solyc02g077920)启动子高度甲基化，这些启动子可以作为正反对照来评估McrBC对甲基化DNA 消化情况(见图9c)。利用Primer 5软件对PME和CNR基因启动子进行引物设计，pPME的正向引 物：5'AAACTAGACCATGAGTGTTGAGA 3'，pPME的反向引物：5' TTTTAGAGTGAATTACAGAGAAGC 3'；pCNR的正向引物：5'TGAGCATCAACCACTCCTAATA 3'；pCNR的反向引物：5'CAGACTTAGTAATAACTCCGAT 3'。

通过检测果实不同颜色(深绿色和浅绿色)区域外果皮，可以看出GS启动子Pro-1和Pro-2具有 不同的甲基化差异水平。其中深绿区域中Pro-1和Pro-2启动子片段CG型、CHG型的甲基化水平高 于浅绿区域甲基化水平，深绿区域中Pro-2的CHH型甲基化水平高于浅绿区域。总体甲基化水平而 言，深绿区域亦高于浅绿区域(图9b)。这种甲基化差异水平进一步通过McrBC-PCR验证(图9c)。 进一步研究表明，这种甲基化差异与启动子区域的Hc-siRNA有关(图9d，e)，深绿区域中Hc-siRNA 表达丰度高(图9f)，可能招募甲基化相关因子，促进甲基化水平。图9是在gs中浅绿条斑和绿条 斑的GS启动子甲基化差异性检测，其中，(a)GS的简易结构图，数字代表距离ATG的相对位置， GS启动子选取两个区段(进行甲基化分析)，启动子1：-2138到-1777；启动子2：-947到-629。小 RNA测序检测到719到966区段有小RNA的富集；(b)进行重硫酸盐测序实验并计算在二个区段 中三种甲基化类型(CG、CHG和CHH)的甲基化的百分率；(c)通过McrBC-PCR方法，分别在浅 绿条斑和绿条斑(绿熟阶段)和红条斑和黄条斑(红熟阶段)中检测GS的二个片段的甲基化水平。+” 表示加了GTP用于McrBC消化甲基化的DNA；“-”表示不加入GTP，甲基化的DNA无法被McrBC 消化。PME(Solyc03g123630)启动子没有被甲基化；CNR(Solyc02g077920)启动子高度甲基化。 这些启动子作为正反对照来评估McrBC对甲基化的DNA消化；(d)浅绿条斑和绿条斑进行小RNA全基因组测序，分布在SL2.50ch07_63842389到SL2.50ch07_63842636位置中小RNA的reads数，最 下面的黑线代表24-nt siRNA(hc-siRNA)；(e)最高reads数对应于24-nt siRNA的序列；(f)通过qPCR 验证Hc-siRNA在浅绿条斑和绿条斑中相对表达量，U6基因作为内参基因。

实施例6针对GS基因SNP1开发dCAPS标记GS^SNP1与应用

本发明中分子标记GS^SNP1的开发：针对GS基因第二内含子保守的SNP1(SL2.50ch07_63842838) 开发共显性标记GS^SNP1，此标记也在商业条斑番茄品种(紫五彩、花绣球、大果五彩、多彩罗汉果、 黄皮球、一品多彩、多彩番茄)得到验证。SNP1所在位置没有酶切位点，通过在正向引物3'第5个 碱基引入突变(G→C)，这样从条斑番茄品种扩增的410-bp可以被EcoRI酶切成59bp和355bp两 个片段，从非条斑番茄品种扩增的410-bp不能被EcoRI酶切(比如M82)。扩增引物如下：正向引 物：5′-GTCTCTATTTTTTTTTGGGCATCTTTGCAGCTAGTAAATTTTTCTCTCTCTTCCGAATT-3′， 反向引物：5'-ACTGAGTAACTCCCTCTAGTCAGAAAGA-3'。PCR扩增的体系(20μL)为：10×Taq buffer 2μL,dNTPs 0.4μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,DNA模板1μL,Taq酶0.1μL, ddH₂O 15.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min， 进行36个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min。PCR产物在37℃下通过EcoRI(Thermo Scientific) 酶切2h，酶切体系为10μl：5μl PCR产物，1μl10×buffer EcoRI，0.3μl EcoRI(10units/mL)，补ddH₂O； 用2％琼脂糖凝胶在120V电压下电泳在35分钟分离不同长度的DNA片段，通过在凝胶成像系统观 察片段大小(见图13)。

图13是针对GS第二内含子中保守SNP1(SL2.50ch07_63842838)开发的共显性dCAPS标记及其 在番茄商业品种中的应用。用特异引物从非条斑番茄品种(比如M82)扩增的片段不能被EcoRI酶切， 但从条斑番茄扩增的片段能被EcoRI酶切成59bp和355bp的两个片段。7个商业条斑番茄品种：紫 五彩、花绣球、大果五彩、多彩罗汉果、黄皮球、一品多彩、多彩。

图13的结果说明，本发明开发的分子标记可以用于番茄育种的辅助选择上。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所 作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄果实颜色的基因、SNP、分子标记及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9410

<212> DNA

<213> 基因组gDNA(GS gDNA)

<400> 1

attttctgca agctctcctg ttcaaaccta tacaaaatag gaacaaattt gaagagaaaa 60

aaataaaaaa aatctctaag gtagattttc tttctttctt tctataccca atctttgcta 120

tatcgccatt tttttcttaa ttttaataat gaaaattgtt gttttttctt cttttggatg 180

ctacaaacac atacacaaaa atatttttaa tttttttttg ttagactata atttccctga 240

ttgagtgtgt aatttagcta acgagatcgc gatatttgtt ttgctttttt cagttttttt 300

tttcttcttt tcgatacaag acgatatggt ttttcctatt aatcaggaat tacttgtcga 360

tgagtcgtct tctcagttga gaaaaacaag tggaggaact ggtggaggag gtagagggaa 420

gattgaaatt aaaaggatcg aaaatacgac aaatcgacaa gttacgttct gcaagcgtag 480

aaatgggcta ttgaaaaaag cttatgaact ttctgttctt tgtgatgctg aagtttcact 540

aattgtattt tccagccgcg gccgtctcta tgaatatgcc aataacaggt ttgtttattt 600

aattcttttt ttctctaaca agatctgttt ttaaccctaa tgaaaaaaaa aaatgtgatt 660

ctgcagatct ttgccttttg tgtatgtttt tttttgattt gggtattttt gtaatcgggg 720

attgcttaga tgataagcac tcttaagatt atgagttcgt gtcaatatag gagctcgtaa 780

cgattgatct atgtcagtct agatatattt gtgtgttaaa aagagggtga ctatggtgtt 840

tatttaagtt aaaagattga gtttcttcca tcacaaagat ttgcttgtct aatccataat 900

ttttttttgt ttcctttctt tatgagcttc aaaaacacca aattttcctt tgattctaca 960

aatagatccg ttgatttgag tcgagaaatc ggttattaat attggttcta aacttgtttg 1020

gagtacgatt ctttctagaa ttttgattaa acagagatat tttgtgtgtc gactatctag 1080

atatagattc ttatcggtat aatacatata ttggatccta aacgtggctt taattttaac 1140

tttgatctcc aactttcata atgcagcaca ttaataatcc aatttttttt taaaataaac 1200

acatgagtcc tacatgaaac aatacacgta agacaccatg taggacaaaa aatgacttgt 1260

aggacatgtg tgtctatttg ttcaacttta tacaaattta agtatttatt tgtatacatt 1320

caaaattaaa gaatataaat gtaattcgaa aaatcttgat aaatttacaa gtagggttaa 1380

agagagatag ggaaaaatct taagcttaca aaatttattt ccccttttct ctctgtctct 1440

attttttttt gggcatcttt gcagctagta aatttttctc tctcttccca attttttttg 1500

tttgtctgta agctgtcaag ttctgattta ttttcaatca actcttccaa ttgatgcttc 1560

cttaatatat ataacatgtc atttcagaca tcacacaagc aatagcctat cagattacag 1620

attagggttt caggtacacc aaaagagtca agttgctttt tctttttcaa agttaggatt 1680

ttttttttct ttggtgaagc gaagggatcg aactctcagt aataaagtga aagttaagat 1740

agttctttgg aaaaaaagag aaactttttc aactcgtcat aattgaatta ggattatttt 1800

tacaagcaaa gcaatttctt tctgactaga gggagttact cagttggtaa acattcttca 1860

ctttcaattt taatattgtt ttgcctttgt ttttaccatt atagcctttc aataacagag 1920

atagaaattt tttgtttcta ggttatatat atatatatat atatccaaaa ttttaaacac 1980

aaaaacaaac tttaagtaaa agaattacta aattttatcg aacccatttg tatctcctct 2040

caccctcctt actttgtaat tgaggtaagg acaaatagtc cccttctctt tgatttggtg 2100

atatatataa ttttatcaaa tatataaggc tcaattaaaa ttattgaatt ctaataaact 2160

cataccattt ctttagaatt cagtaatttt aattgagcct tatatatttg ataaaactac 2220

cccgttgtct caatttatgc aaagaggctc aaaatacaat agttcaaata tttattttta 2280

attaaattat gaattaaagt atatattttt taaaatatac aaaatataaa tcaacatatt 2340

gaatattcaa aatatttaac aaattagttt gagaaaatta cactaaaaag aaaaaatctg 2400

tcaaactctc ctagttataa caccttcgta taaaatggga tagaaaaaat ataaataatt 2460

aatttcaaac tcaatataaa tcaaataagt gatagtcaaa agtcgaaaag ttagaaaggc 2520

atgatgtaga acttatttaa cttccaattt catggtagtc aaaaattatt tatttatttc 2580

taaaataatt ttttaataat ttcttgaaat gtggggttga aatatagggg ttagggtttc 2640

atgtgattat gagtataata catcatataa tagggagtta gacaagcata tttggtcacg 2700

tcacatacga atttttcagt tttgagctaa acaacaacaa tattttgtca tatatttttt 2760

ttctcgacgg ttcaaaaata tcaaattttc ctggggtttc caacaagcca aactttcaac 2820

gaattttgtc aaaaaaattc aattggaaat gtacacttta tgcaattatg atatagtgtc 2880

acgcaaatta aaattaaaat tctttaggta tttgatattt cctccttact tacatatctc 2940

ttgggttcta gctcaacctt gtcaactttg acattgaatc taatgcttat tacctaatct 3000

agttctataa gagtttgatt ttttatatgg tcattaaact aataattgtt atcttaaaaa 3060

tcacctctct tttttatttt gagatacttc ttccatttca atttgtttgt cttattaaaa 3120

cttgttacgg agtttaagaa agtaaaaaag aataatttaa atcttgtaat tttaaattac 3180

agatatgtca aatgtaccaa aagtagattt ttacttttaa cctactaaga aaagataact 3240

gttattttcc tatttatcct caatattagt tcctaactat tcttcaaaat tgtttcttaa 3300

aattaaagac tatacatcaa ttaatatgat atgagtacta tgaaaatgta ttcatattaa 3360

ttattgtttt tccagaggca tacaaaatat aaaataaata aaaataatta tattaataat 3420

taattaagtg attatatgag aaattaagtg gtagcagtaa agagttacat ttatgaagac 3480

ctagtcaaac taaaagctta ttaattaatt tttggtatcc tattttttca ccatttcttg 3540

gtgaatttta gtagagaggg agtacggaaa aaaaagagtc actgcacttt cctttcttac 3600

atagggaaga atgacttttg actgtctgca attttttcgt cgaaaattat atcgtataaa 3660

taaattagta cataagttgt tgaatctctt ttaattttag tgttaaagaa tgttttaagt 3720

tatgaatttt gaattataga ataatataac atttcattga gtagagaata gattttatgt 3780

atatatgcta atgtgaattt cttcaacata aatacatgat ttaggctaat gctatcaaac 3840

acctaattga tattgtagat tcctaccttt aggagtttag gggtgggtta gattttaggt 3900

attatatttt tttaaaaaaa ttcatatata aatttctgat tccgtcatta ttgaggtgga 3960

tttagggcat aagcaggttt atgaaaatcg aatacctctt gtacatatct attaaaaaaa 4020

tcattccgaa atcataattt gaactcatta ttattattat atatattttt tatttttatc 4080

tttacgattt attattatat aaatcttctt ttcaattgtc tgttttactt cttttttctt 4140

gtttgtttct taaagaatgt ctcttttctt attttgacaa atattttaac ttgaactttt 4200

cgttttcata tgatatgttt aaaatcataa gataaataat ttgtgataaa ataacgagat 4260

cacaaatcaa aatcagacaa ataaattgta gaatttattt ttgggatgtt tgcggggata 4320

aaagggtttt cgttgggggt attattcaat gggtaaaatt aagaaacatt gtagccaatc 4380

atgttgttgg atcttgagcc aacgtggcag ggaacaacca atcactagct cgatgaaatt 4440

aaggttacat aatgcttcaa ttcttcttac tgtaagtgca gaaaggatta cttgttcatc 4500

cttttaaccc agaggataaa agaagactca caaatcacat ttgatgcgac attgtttgac 4560

ttaacatgat gtttaagaaa aaaaaaagat tattctttta aattttgtgg tttaaaaaca 4620

ttattttgta gttataaatt atttttatca agagtgaaag gaattttgaa attgaattat 4680

ttctacatag tagggacaga tttaataaga aatgtgccac ataatataga gagtataatc 4740

tttaggtaga aagaatttaa cttttgattt tgactttttg agaggaatgt acaaccgtca 4800

aaaatactct ttgaattttt tagttctaaa agtatggaaa cataacattc ttttaaacaa 4860

atattaaaaa gttttaaaaa atcacttcac cttgactttt tacctagatc aaaatcagtt 4920

tcaggctatc caaacttttt gaaaggttat tacttgtaat tataatagtc tatgttattc 4980

ggatttatca aaaatataga cggataagta agattcttta aaagtaaagc atttttagtg 5040

attccgacat agatgcggca acatttattt tgtcgtaggc gtccacatct aaaagattga 5100

caagacattt tgtgtagttt ttttttttct tttgattaaa aaagttaaat ttatttatat 5160

gtaatatgca tccatacaag acctgtggcc tgaagcatta cattcaaaag aaatatttac 5220

taagttataa acatagttca tacatactat ctgataataa ggttaaaaat tgctctttcc 5280

tcgtctgcat tgacgatttt caaaacgaat acaggattgc tcttgtttgt atcatcatca 5340

tcatcaacaa tttctccgtc ttttggattg caattccaca ttctaggtcg aaaatacata 5400

gaattgtgac atctgaaaaa tgatttgttt tgtatttgtg tgtatttgca gtgttagggc 5460

aactattgat aggtacaaga aacaccatgc tgattccact agtactggat ctgtttctga 5520

agctaacact caggtaaact tgtttatata aatcattatt tttagatgta atttttttat 5580

atttaatcgt ccacctaggg ttttacctct cgtgcatcaa agcaaaagac taaacaaaaa 5640

tatctttagc actatctata tcaaggattt tttaacctcg cggttagctc aagattcgac 5700

acataggccg tgggctcgtg gcttcccttc ttaatgagga tagaggctaa ggccgaggtt 5760

gagtcaaaac agataataac atgaaatttg ggggctagga tgttaaaata ggtaataaag 5820

tttgtacctt tatgatgggg caaacctcaa caaagacctg tttctaaaaa ggaggatggg 5880

gagggaagtg ttacaaccta caaacaatta ctaattgttg aactctattg ttgagacgtc 5940

ttttcattta aaccttagac aaaatcgtga ggtttaaaag ccttaattaa aaacataaaa 6000

aatacttaac tagttgacct agaccattcc acttacattt tgttttagta tcaatcgcac 6060

agagaactag attttttcta atcatcacaa aaatgattaa attgactcaa acttttatat 6120

attcctcagt actaccagca agaagcatcc aaactgcgac gacaaattcg agatatacag 6180

acttataaca ggtcagtcca aagtggactt ctctaatata aatcattgtg tactatcaga 6240

aaatcactaa tttttattga atttttttgt tggaatttaa cagaatatgg aatgtcgaaa 6300

attagagatt ttctagtagt gaccaaagtt gtagtaatta tgattttttg ttttgtttag 6360

gcaaatagtt ggagaggcat tgggcagttt aagccctaga gacctcaaga atttggaagg 6420

gaaacttgaa aaggccattg gtagagtccg ttccaaaaag gtaaataatt caactttttg 6480

ttagctgatt ttcactgttt tcttcttatt attacaaagg taaaaaactg acattttttt 6540

attttatcat tttccagaat gaattgcttt tctcagaaat agagctcatg caaaagaggg 6600

taaaactact aatttatgtg ctttccttaa ttatatattt ataatcatga tgttcaggtc 6660

agtttgcgtg cacttaaatt aattttacaa gatatctgct acctttcact agcaataaat 6720

tacctagtag ttttgcctca tctgtattcg aacatgaaac atcatgaact taatattcag 6780

ttttattaat cagtaaacca cccccttaaa tgcaaaatat agacgacata cttcaatcaa 6840

ctttacgttt agatgagtca agataaattg agctaataaa taaatagatc attaattaac 6900

ttatccaaat tttataaatt ttattttcat gaactaatct tatcacttga caggagattg 6960

agctgcagaa cgccaacatg tatctacgcg caaaggtcct attattttct ctatgccttt 7020

atgttacgat aggactctac tagtatctgg acgtttgacc atgttacatt gtgaaatttt 7080

tttttaaaaa aatttttgtt tttaaaattg aaaatgatat ttcaaaattg aaattgtgtt 7140

tgaccatgtc aaattaaagt tgttttctac tttgtgtgag tgatttggag tgaatagtca 7200

aaaacacatt ttcgttgttt ttcaaattct tgaattcaac tatgacgaaa cgtgcttttt 7260

cagagttcaa ctccggaaaa attgaaaatt tttcatgatc aaacgcctcc ttgatcattt 7320

taacttgaaa attaatcctt gaaatgtaca tatgtagcag atagcagagg tagagagagc 7380

acaagagcaa atgaacttga tgcctggagg cggaggcgga ggcggaggcg gaggaggagg 7440

aggatctgat catcaatacc atcatcagcc aaattacgaa gatgctcgca ataacttcct 7500

gcctgtaaat ctcctggaac caaatcctca ttactctcgt cgcgacaatg gtgaccaaac 7560

tcctctccag cttgtgtatg cctctcttcc ttcttaatta taattttgta atttattagt 7620

tagactcaca tgagtgataa attttactaa aaacttatta aggttttaag tatggattga 7680

gattttatac catgaaacaa aaacttgtca tggaagggga ggtgtgaacg tttagctccc 7740

gataatagag agttgttcag atggtaaata ttccttactt tcaattctaa agatgagtta 7800

tcaagagagc aaaacgggtg gaagctctct gaggaggggt agaaaaaaaa ggaaatttta 7860

ccttttagta caattagaat atgaaactcg agaaaaaata atagttgaaa tatgtttttt 7920

tttttgacta ttttctctaa aacttcaatt agtggagtct ttgttatatc aaagctggga 7980

taaactaatc ccataatagc tttgatagtc caaaaaacct ggaacttcat tttaggttta 8040

tagaattgtt tttggtgttc ttaccaaaac cagggtcaaa gctacaactt tgcccacaga 8100

tttggtaaaa tctaataatt ttggctcaaa tcatatattt gtgtttaaaa gtttaaacta 8160

aaatgtattc aataatttgt tgaggaccca gtaaacaaca gattatgcct cactaaaaat 8220

tactttatgt gaagacggtg attcattatg tgcttttaac ctaactcaag ccaaaaaaaa 8280

tatttattca atagtcacca cttgccactt ttgctcccaa atctttctgg ttgttctttt 8340

caaaaaacat tggttacatc tttttacgtc attcattacc aataaccagt ttatagatga 8400

gtgttcttga agtagtcagt ctagatctga acctacatgc taagtagatg acttgctagg 8460

cgagcggagc ggaacctaag atttcttgta aatattttca gtcaatccac ccattgcctt 8520

aatgttttgt gtccaatgct caaaactttc ttactttttg tcttcattta tatgtgttgt 8580

aaagagattg tcagaatctt aaagaaagac aagaaacttt gtcaaatcta agaagaacta 8640

agtctatggt caggggaaga ttaactgatg ggagtttgcg gaacacaata acattagcgt 8700

gaatttcgta tttgtgttaa gaaattcact taatagacat aaataatctt atgtagaaca 8760

aagtgatcca aaattcatta ctttagctag cgtttggcta taaattttgg atcaaatttt 8820

aagaaaattc cactttcact actagaaata aaagggtttt ttccattgca aatcaatcga 8880

aaatttgtgt tacaaaatat gatttttcca ccaaagcagt tcattgtgaa aacacacggt 8940

ggagaaacaa attgtcacgg aaatattatg aaacttccta acttttcctt gcgaaaacat 9000

tactgttttt tattttcgtt caatcaaaat atatgtggaa atagctactg aaaagtgatt 9060

cttagtagtg cttaattact tcaattattt ttaactgatt atttctccat ttttgtcttg 9120

gctggtttta tttatgcagc tgataatcat ggagcaggta ttctgaaatt tggggtcaag 9180

gctcttcatc ttcagaaaaa tgtgtactac aatttttaac ctatagtgtt gtaaatcata 9240

atcataatta ttgccactga gatttaaact gtttattttt aagcaatatt attcagtcat 9300

ctgttaatta aggaatgaaa aatcttgttt gttatattat gactacttct atatactttt 9360

acagccttat ataaataata tgctattgaa ctatacatac aacattctct 9410

<210> 2

<211> 1184

<212> DNA

<213> 基因组cDNA (GS cDNA )

<400> 2

attttctgca agctctcctg ttcaaaccta tacaaaatag gaacaaattt gaagagaaaa 60

aaataaaaaa aaatctctaa gttttttttt tcttcttttc gatacaagac gatatggttt 120

ttcctattaa tcaggaatta cttgtcgatg agtcgtcttc tcagttgaga aaaacaagtg 180

gaggaactgg tggaggaggt agagggaaga ttgaaattaa aaggatcgaa aatacgacaa 240

atcgacaagt tacgttctgc aagcgtagaa atgggctatt gaaaaaagct tatgaacttt 300

ctgttctttg tgatgctgaa gtttcactaa ttgtattttc cagccgcggc cgtctctatg 360

aatatgccaa taacagtgtt agggcaacta ttgataggta caagaaacac catgctgatt 420

ccactagtac tggatctgtt tctgaagcta acactcagta ctaccagcaa gaagcatcca 480

aactgcgacg acaaattcga gatatacaga cttataacag gcaaatagtt ggagaggcat 540

tgggcagttt aagccctaga gacctcaaga atttggaagg gaaacttgaa aaggccattg 600

gtagagtccg ttccaaaaag aatgaattgc ttttctcaga aatagagctc atgcaaaaga 660

gggagattga gctgcagaac gccaacatgt atctacgcat agcagaggta gagagagcac 720

aagagcaaat gaacttgatg cctggaggcg gaggcggagg cggaggcgga ggaggaggag 780

gatctgatca tcaataccat catcagccaa attacgaaga tgctcgcaat aacttcctgc 840

ctgtaaatct cctggaacca aatcctcatt actctcgtcg cgacaatggt gaccaaactc 900

ctctccagct tgtctgataa tcatggagca ggtattctga aatttggggt caaggctctt 960

catcttcaga aaaatgtgta ctacaatttt taacctatag tgttgtaaat cataatcata 1020

attattgcca ctgagattta aactgtttat ttttaagcaa tattattcag tcatctgtta 1080

attaaggaat gaaaaatctt gtttgttata ttatgactac ttctatatac ttttacagcc 1140

ttatataaat aatatgctat tgaactatac atacaacatt ctct 1184

<210> 3

<211> 804

<212> DNA

<213> 基因组CDS (GS CDS )

<400> 3

atggtttttc ctattaatca ggaattactt gtcgatgagt cgtcttctca gttgagaaaa 60

acaagtggag gaactggtgg aggaggtaga gggaagattg aaattaaaag gatcgaaaat 120

acgacaaatc gacaagttac gttctgcaag cgtagaaatg ggctattgaa aaaagcttat 180

gaactttctg ttctttgtga tgctgaagtt tcactaattg tattttccag ccgcggccgt 240

ctctatgaat atgccaataa cagtgttagg gcaactattg ataggtacaa gaaacaccat 300

gctgattcca ctagtactgg atctgtttct gaagctaaca ctcagtacta ccagcaagaa 360

gcatccaaac tgcgacgaca aattcgagat atacagactt ataacaggca aatagttgga 420

gaggcattgg gcagtttaag ccctagagac ctcaagaatt tggaagggaa acttgaaaag 480

gccattggta gagtccgttc caaaaagaat gaattgcttt tctcagaaat agagctcatg 540

caaaagaggg agattgagct gcagaacgcc aacatgtatc tacgcatagc agaggtagag 600

agagcacaag agcaaatgaa cttgatgcct ggaggcggag gcggaggcgg aggcggagga 660

ggaggaggat ctgatcatca ataccatcat cagccaaatt acgaagatgc tcgcaataac 720

ttcctgcctg taaatctcct ggaaccaaat cctcattact ctcgtcgcga caatggtgac 780

caaactcctc tccagcttgt ctga 804

<210> 4

<211> 267

<212> PRT

<213> 氨基酸(GS)

<400> 4

Met Val Phe Pro Ile Asn Gln Glu Leu Leu Val Asp Glu Ser Ser Ser

1 5 10 15

Gln Leu Arg Lys Thr Ser Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Lys

20 25 30

Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn Arg Gln Val Thr Phe

35 40 45

Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Val

50 55 60

Leu Cys Asp Ala Glu Val Ser Leu Ile Val Phe Ser Ser Arg Gly Arg

65 70 75 80

Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Arg Ala Thr Ile Asp Arg Tyr

85 90 95

Lys Lys His His Ala Asp Ser Thr Ser Thr Gly Ser Val Ser Glu Ala

100 105 110

Asn Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ser Lys Leu Arg Arg Gln Ile

115 120 125

Arg Asp Ile Gln Thr Tyr Asn Arg Gln Ile Val Gly Glu Ala Leu Gly

130 135 140

Ser Leu Ser Pro Arg Asp Leu Lys Asn Leu Glu Gly Lys Leu Glu Lys

145 150 155 160

Ala Ile Gly Arg Val Arg Ser Lys Lys Asn Glu Leu Leu Phe Ser Glu

165 170 175

Ile Glu Leu Met Gln Lys Arg Glu Ile Glu Leu Gln Asn Ala Asn Met

180 185 190

Tyr Leu Arg Ile Ala Glu Val Glu Arg Ala Gln Glu Gln Met Asn Leu

195 200 205

Met Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Asp His Gln Tyr His His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Asn Asn

225 230 235 240

Phe Leu Pro Val Asn Leu Leu Glu Pro Asn Pro His Tyr Ser Arg Arg

245 250 255

Asp Asn Gly Asp Gln Thr Pro Leu Gln Leu Val

260 265

<210> 5

<211> 5000

<212> DNA

<213> 启动子序列(GS Promoter)

<400> 5

gcaaaatatg ctcaaagtat gcgaaattga actagctatg cttattcttt tcaccattgt 60

ttcgattgtc cctttattat catgaaatta aataattaag gcctttcgtg attcttataa 120

aataaaaaag aaaaaaaaat acatacttaa gggatcgatg cggttggtag ttcaataatt 180

tttttggttt atgatctggt gttcgatatt ttattataat ttaattatat ttcgatttga 240

aaaaattact tgaatgaatg ccttttaata atgtaaaaga actaattaaa tgcatacaag 300

ttccctaata atactagttg taattgtaca atgttaaaga tgtaaatata gttagttagt 360

tagttagaat atgtcagtaa attagttaga ggatattagt catgacatgt tgttatatat 420

aggtttatat gtatcattga agaggcagtt ttgatataga aattttcttc tcttcttcat 480

tacttctctg tttctctcta ccactcttca atggagtttt acttctttta attcactttc 540

ttaacatggt atcagagcag ggtctgtctc acccgatgtt ggggtttcca aaattaaaat 600

tgcccacgca tcagatgcta agcactgggc gtggggtggg tgttaaagaa tgacaaaagt 660

cccacatctg tgattaatga gatgagtaga ctatttataa ggcttgagca atcctcctcc 720

ctttgagcta acttttgggg tgtgagttag gcctaagacc taatttcaca aataaataat 780

tattgatttt aggatacttt ttatttatta ccatttatag caatattata ttaaatctgc 840

aagtgaatta agtatgcaat atagagtata tgtattataa ctattttaaa aatatattat 900

gcttgttagg taagaagttg acacattgta ttataagggt gttaattaaa atgtgtgata 960

aatatattat ccatcaataa aatgtattat atgtgaataa taaatttgtt tttgtaatat 1020

gaattaaaag tgtattataa atgtattaaa agtggtaaag tgaaaaaaaa atgttgttac 1080

tataaaaagt aaatattttt tgtttgttgt atatttatat aagtttcccc taattttgtt 1140

tcatggtccc aatacaattt tcttttttcc atttatagaa gcctaaattt aatatcttta 1200

aataaggata aagaaatttc aattatttgt attcaaaagt gtgacctagt agttaatgaa 1260

gtgactgaga atccaagatc ttacgttcaa aacttatatg agaaaatatg aagtgattct 1320

ttcaatcagt cctaatcttg attgacagag ttatctgata cgttttgtta gagttctatc 1380

ataccattta caaatagagt atacctgaag tttgtcgatg tgtgtgatat gtcctttaat 1440

tagagaaagc gactttgaca tagataggta tccactagca taaatgcaac ccaaataatt 1500

taatgccacc atctacctga aaacatgtaa ccctaattct tataccacat attttgtttc 1560

ttataagttg aatcttagac taaaattgct atatatatgc tccaattttg tctaattaag 1620

atgttacaca aacttctttc attttactga atcccaaatt ggaagcaata aaaatgaggt 1680

actaattaga cacagtgaaa acaaaatagt tgttttgtag ttttttttaa aaaaataaaa 1740

ataaatttat gaaattttta cgggaaaatc ttcatttata catataaaca gatcggaaaa 1800

ggctcaattt tcttctattt attttatagt tgcctaagaa atcctatttt ttcagaaaaa 1860

aatgtgattt tcagcaaatt cttatatata ctcgacgttt acactaacta tattaattta 1920

caatagttga gtgatataat aaaagaaata acatgcattt taaaccataa tttaggtgag 1980

aaaagttcat gtacatatac atatctttta tctatcgatt tagggaaaat acacaagtac 2040

cttcctagat tatgaccgaa atcccagaga cacaccttaa ctaaactaag gtcctattat 2100

cctcccgaac ctttatttat ttattttttt gtaattttgt acaccttttt ggcttatgtg 2160

gcaacaaaaa tatctcccac gcgcctcaat tgcgtgtata ccacacgtaa gacaaaaagt 2220

gtacaaaatt acaaaaaaat aagttcaagg ataatgagac attagtttag ttaaagtatg 2280

tatgagagat tgccatcata gtctacgagg tacttgtgca tgttcccaaa tattataaat 2340

gttgaatgca aataaatttt caaaccttgt gaaaaatgct cacctagcta gctagtgtaa 2400

cttttttaaa tcaaactagg taaaccctaa acaaaagaat ttggtactaa ttacatgtag 2460

gggtcacaag tcacaaccta ataaaacccc cactacatgg agggatttta attttttaat 2520

taaaattttc ttgtatttta attggaattt gttaatttca tatagttagt ggggagtaaa 2580

ttttggctac acaagatgaa aaagtttcac acaaacatat ggtcctagag tgatagatag 2640

taaccaaata tagcaaagtg tatcatgagg tttcccctac ccctttacca taaaagaatt 2700

gagtaatggg tgatggtgaa taggacatca catgggagtc ttgttcctat gaatcacaac 2760

ttcaagagat catggaagga aaaaaaaacc taataattta agagagagaa gtacttttag 2820

gtatggggag actttttttt ttcctttttt tctcgatttg atcatctgat atatgaaatt 2880

tattgaattt gataaatcag gatttacact aaaaaatcat cttaagaata gaagattcaa 2940

ttatcgaaag gtttggcaat cttaagaatc gcacgagaca gctaataaag agttgagaga 3000

gatatcgatt gatcatctca tgcctatctt gctcagactt tccaaaaaaa ataatgtggt 3060

acacgtgtta gatcctctaa taatgcatta atgctattgg aggattcaga tatgtattca 3120

gtcgcaattt caaaaaatct gagcaatagt taatagtctc tcactcaaag atcaacgatg 3180

acggtagagt agaaggtggg gtttagtgct gaattcaata tcttaactac gtgttcacat 3240

gaaccaaata gcttttgttc atatcttata tgtgtattaa aatattttat ttattgtgaa 3300

cccaaaaaac attaaaattt tgaatcaacg cctctagtga gaattcgatc ggtaagacac 3360

aattataact ttagttcaga ctcatttaac atatacaaat ccttaattta attgaataac 3420

tcaaaaatag agaaaatctt agtcggttag tttattgacc acctctacat tcacgttgtt 3480

tattagattt caatttttat ctagtaatcc cttctcctaa cttcattttt ttttttaaaa 3540

aaaaagcttt aaaataaaac tcaaaatgac aataacaact tgaatagtct ctacagctgc 3600

aaaattgaaa gtaaaaaaaa aaaattatac ataaaaaggg ttttgctagt tttatatttc 3660

tatactctat atttaaactg aaggttgact gcacttacaa caatattact caatttccat 3720

tagttgtcac ttttcaaaag agactctcat tgtccctttt ccccatactt atagaaaaat 3780

ggataattaa atggagtttg atcaaactat acacctaaaa ttttacaccc tccttttgct 3840

acttccattg agtaccactt acctacattt ccataaaaaa tagaatataa aaaatatact 3900

ctttgtctca aataaattat catgattttc tttttatacg ttcaaatttc atttgtgaat 3960

ttatatattt ttttttgatt tttcattcgg tgtcccatac ctgcatagaa gtttgattat 4020

ttcagatttc gcgatgcata ggcaccattt cgagaggggg gaaggttccc tacaatgaat 4080

tttttcatac tagggctcag atttcagacc tctgtttaat ggatgagcaa ccccatccgc 4140

tgtacatcat cctttggtgg tggatctacc gactacacta attaatttta aaaacaaagt 4200

tttttttatc acaaatcagt gagaaattta tgctataaaa catgatttcc cacaaaacta 4260

gctttacgtg taaaatacat gatgaaaata ctaaattttc actgtaatag tgaaaaactt 4320

cttaatattt ccatatgaaa tgattattat tttttctttt gtcactgatt caattaaaat 4380

atctacaaaa ataatcactg aatatctttc aatgagaaat ttagtgcaag aataatgatt 4440

ttctagtagt ataactaagt atattgttgt tgtttttcat ttacacgtct cttaagaaac 4500

attaattaat agaaatattg aactatttta ccctttataa tatcacgata actaatttga 4560

gacgaagaat agtttagtag tgtatagata tacactcaaa aagtagtata ttttagttgg 4620

acggtccaat tttttcctat ctataactat cctccagctt gttcaactca cttccatttt 4680

ctgcaagctc tcctgttcaa acctatacaa aataggaaca aatttgaaga gaaaaaaata 4740

aaaaaaatct ctaaggtaga ttttctttct ttctttctat acccaatctt tgctatatcg 4800

ccattttttt cttaatttta ataatgaaaa ttgttgtttt ttcttctttt ggatgctaca 4860

aacacataca caaaaatatt tttaattttt ttttgttaga ctataatttc cctgattgag 4920

tgtgtaattt agctaacgag atcgcgatat ttgttttgct tttttcagtt ttttttttct 4980

tcttttcgat acaagacgat 5000

Claims (10)

1.一种调控番茄果实颜色的基因，其特征在于：所述基因为GS基因，序列见NCBI登录号：NM_001313930或NCBI登录号：NP_001300859。

2.根据权利要求1所述的一种调控番茄果实颜色的基因，其特征在于：所述GS基因调控番茄叶绿素差异化积累。

3.一种番茄果实颜色相关的SNP，所述SNP标记为SL2.50ch07_63842838。

4.针对如权利要求3所述的SNP开发的分子标记，其特征在于：正向引物序列：5′-GTCTCTATTTTTTTTTGGGCATCTTTGCAGCTAGTAAATTTTTCTCTCTCTTCCGAATT-3′，反向引物序列：5'-ACTGAGTAACTCCCTCTAGTCAGAAAGA-3'。

5.一种番茄果实颜色性状检测方法，其特征在于：以权利要求4所述的分子标记对番茄基因组进行PCR扩增，扩增产物利用EcoRI酶切；若酶切能够产生59bp和355bp两个片段，则为条斑性状样品；若不能被酶切，则为非条斑性状样品。

6.根据权利要求5所述的一种番茄条斑性状检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系(20μL)为10×Taq buffer 2μL，dNTPs 0.4μL，Fw引物0.5μL，Rv引物0.5μL，DNA模板1μL，Taq酶0.1μL，ddH₂O 15.5μL；所述PCR扩增的程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，进行36个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min。

7.根据权利要求5所述的一种番茄条斑性状检测方法，其特征在于，所述EcoRI酶切条件为：PCR产物在37℃下通过EcoRI(Thermo Scientific)酶切2h，酶切体系为10μl：5μl PCR产物，1μl 10×buffer EcoRI，0.3μl EcoRI(10units/mL)，补ddH₂O。

8.如权利要求1中所述的GS基因或权利要求3所述的SNP在调控番茄叶绿素含量中的应用。

9.如权利要求1中所述的GS基因或权利要求3所述的SNP在番茄育种中的应用。

10.如权利要求1中所述的GS基因或权利要求3所述的SNP在番茄条斑性状中的应用。

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