CN113846074B - 一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体g91c及其应用 - Google Patents

一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体g91c及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C及其应用，其包括如下步骤：预测突变位点、制备脂肪酶突变体、测定脂肪酶酶活、热稳定性和pH稳定性测试。本发明提供的制备方法能够实现具有更高的酶活并且更好的热稳定性的脂肪酶。

Description

一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C及其应用。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一种丝氨酸水解酶并且属于α/β水解酶家族，在水油界面催化长链酰基甘油分解，生成甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸，该水解反应发生在甘油三酯的酯键。脂肪酶具有催化活性高、副反应较少、热稳定性、有机溶耐受性、最适pH值和底物专一性等优点。所以脂肪酶被广泛用于洗涤剂、造纸、有机合成、制药等行业，近年来也用于新能源行业，例如生物柴油的制备。但是工业生产中需要的高温环境往往会导致酶失活，从而限制了工业发展。因此，获得催化效率高且热稳定性高的脂肪酶具有重要意义。
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)来自于在生长温度上限高、嗜热的疏棉状嗜热丝孢菌，因为它有较好的热稳定性而被广泛应用于工业中。酶较高的热稳定性始终是工业发展的关键因素，因为反应速率随温度呈指数增长，直到酶变性。但是目前天然的TLL在耐高温和催化活性方面仍不能满足工业应用的要求。因此，在保持酶活力的同时提高热稳定性是人们长期追求的目标，因为这可以在工业制造过程中节省大量成本。
从自然界中筛选得到的微生物脂肪酶，因价格昂贵、活性低、难纯化等缺点，导致在工业生产中受限。随之，分子改造技术逐渐走进大众视野，它可以快速得到多种优良特性的脂肪酶，其中定向进化、半理性设计和理性设计是分子改造的主要方向。随着计算机行业的日益发展，许多先进软件被开发，并且蛋白质结构和分子催化机制被逐步解析，使得理性设计方法逐渐成熟。理性设计策略主要采用同源对比、计算机模拟辅助设计、和基于蛋白质构象引入外源作用力等方法。通过理性设计中计算机模拟的方法，可以精确高效获得高酶活、高热稳定性的人工酶，这也是工业化应用的前提。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有中脂肪酶在使用中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是，克服现有产品的不足，提供一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法，其包括如下步骤：
获得突变位点：使用分子动力学模拟和专业软件预测TLL脂肪酶的突变位点，并按照突变位点的分析获得突变体；
制备脂肪酶突变体质粒：将引物合成的目的基因导入出发质粒以制备重组质粒，在线性化后电转到菌株内并检验序列的一致性；
测定脂肪酶酶活：将选择合适浓度的酶液，测定不同的突变体和野生型菌株的酶活力；
热稳定性和pH稳定性测试：分别在多种温度和pH条件下对于野生型和突变体进行酶活的测定，判断热稳定性和pH稳定性的优劣。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：获得突变点制备突变体中，突变体为6个，包括G246C、G246R、G91C、G91I、G91K和G91T。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：获得突变点制备突变体中，所述突变体为G91C。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：制备脂肪酶突变体质粒中，所述出发质粒为pPICZαA，所述引物根据TLL-protll核苷酸序列设计。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：制备脂肪酶突变体质粒中，pPICZαA质粒中包括信号肽α-factor，还包括博来霉素抗性标记基因。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：制备脂肪酶突变体质粒中，使用限制性内切酶将目的基因导入出发质粒中，使用的限制性内切酶为SacI。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体制备方法的一种优选方案，其中：测定脂肪酶酶活中，突变体的酶活相较野生型有着更高的数值；所述热稳定性、pH稳定性测试中，突变体的最适温度相较野生型更高，在碱性环境中的酶活大于野生型。
本发明另一个目的是，提供一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的应用。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的应用，其特征在于：所述最适温度为45℃。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的应用的一种优选方案，其中：最适pH为10。
作为本发明所述疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的应用的一种优选方案，其中：在相同的温度或者pH条件下，部分突变体中的酶活始终高于野生型。
本发明提供了一种特定的突变体G91C突变体的氨基酸序列SEQ ID No.9和以及核苷酸序列SEQ ID No.3。基于SEQ ID No.7的TLL氨基酸序列，通过理性设计方法得到合理的突变位点。将SEQ ID No.7中的氨基酸序列中的第91位甘氨酸突变为半胱氨酸，增强盖子区域的氢键网络，以此获得热稳定性和酶活力均明显提高的突变菌株。
本发明根据获得的G91C突变体，与野生的TLL脂肪酶进行比较。改造后突变体的最适温度为45℃，相比野生型提高了5℃。相比于野生型TLL，G91C突变体在65℃的热稳定性提高了25～45％，在67℃的热稳定性提高了5～25％。而且所述突变体的催化活性提高了53.8％。这说明通过本发明获得的G91C突变体与野生型相比，在保证酶活力提升的情况下，其热稳定性也有显著提高。这有利于降低商业成本，从而提高工业价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为野生型TLL和突变体的SDS-PAGE图；
M为标准蛋白质分子量Marker，1为野生型TLL，2为G246C突变体，3为G246R突变体，4为G91C突变体，5为G91I突变体，6为G91K突变体，7为G91T突变体；
图2为野生型TLL和三个突变体的在65℃温度下保温2小时的热稳定性比较图；
图3为野生型TLL和G91C突变体在67℃保温2小时的热稳定性比较图；
图4为野生型TLL和G91C突变体的最适温度比较图；
图5为野生型TLL和G91C突变体的最适pH比较图；
图6为野生型TLL和G91C突变体的在pH在4～12范围内的pH稳定性比较图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术人员能够实施为准，制定了以下实施例。
实施例1
通过分子动力学模拟和Discovery Studio 2017软件预测TLL脂肪酶的突变位点。
从蛋白质数据库(PDB)中获得疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的三维模型(PDBID:1DT3)。通过分子动力学模拟软件Maestro对TLL在水溶剂条件下进行分子动力学模拟，从而获得蛋白柔性区域。接下来，通过Discovery Studio 2017软件突变全部氨基酸并计算突变能，以此来预测热稳定性突变位点。根据预测分析，最后获得了6个突变体，即G246C、G246R、G91C、G91I、G91K和G91T，其中G246C的基因序列如SEQ ID NO.1所示，G246R的基因序列如SEQ ID NO.2所示，G91C的基因序列如SEQ ID NO.3所示，G91I的基因序列如SEQ IDNO.4所示，G91K的基因序列如SEQ ID NO.5所示，G91T的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例2
以pPICZαA-TLL重组质粒作为模板DNA，根据TLL-protll核苷酸序列(如SEQ IDNO.8所示)设计PCR引物。突变体为在不同结构位置上突变成目标氨基酸，其氨基酸位置发生的突变需要使用毕赤酵母偏好性密码子合成。本发明中使用的质粒为pPICZαA质粒是最新的毕赤酵母分泌型表达质粒，其信号肽来自酿酒酵母α-factor,可以引导重组蛋白分泌到胞外，在实际生产过程中常常表现出蛋白表达量相较有着更高的特征。作为一种带有标记基因的质粒，其中包括博来霉素(Zeocin)抗性标记基因，可以作为转化子筛选的标记，在实际操作时可以提供转化子筛选的帮助和便利。基因合成部分由上海捷瑞公司完成。
使重组菌株在大肠杆菌中扩增培养，通过AxyPrep质粒DNA小量试剂盒得到重组质粒。然后使用限制性内切酶SacI进行酶切将载体线性化。线性化载体进行PCR清洁之后，取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。验证得到正确的单条带后，取10μL的载体和80μL的KM71H的感受态一起加入到预冷的电转杯中并冰置5分钟。在Gene Pulser Xcell型号电转仪上调出预设程序，2000V，5ms电击一次，电击后立即加入1mL的山梨醇。孵育1小时后，涂到YPDS平板，在30℃下培养4天。再挑取单菌落接入到YPD培养基，并加入博来霉素(Zeocin)抗性，在30℃条件下摇床培养18小时。接入到25mL的BMGY培养基中，培养8小时左右，使其OD600为2～6停止培养。在3000rcf条件下离心5分钟使其产生沉淀。重悬于50mL BMMY中，使其OD600＝1。将菌液放于250rpm，30℃条件下进行摇床培养，并且每24小时加250μL甲醇，培养96小时后离心收菌。将上清液中分泌蛋白经SDS-PAGE后，结果如图1所示。
由图1可得，野生型TLL和6个突变体呈现出分子量为35KDa的单一条带。这结果与预测的TLL氨基酸序列一致，表明该蛋白是所需的目的蛋白。
实施例3
一个酶活单位的定义：在pH＝7.5，40℃反应条件下，每分钟水解底物对硝基苯基月桂酸酯(C12)生成1μmoL的对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活单位以U表示。吸取180μL的PBS(pH＝7.5)作为缓冲液，再加入10μL 20mmol/L的底物对硝基苯基月桂酸酯(C12)，充分混匀后在40℃的水浴中保温5分钟。随后加入10μL稀释到适合测量酶活的合适倍数，准确反映5分钟，最后加入600μL的Na2CO3溶液终止反应。在12000rpm条件下离心3分钟，向每小格酶标板中加入200μL的反应液。最后用酶标仪在410nm处测定其吸光值。野生型TLL和6个突变体的酶活力如表1和所示。
表1野生型TLL和突变体的酶活比较
Figure BDA0003313430790000061
从表1可得，我方发明中制得的某些突变体有着酶活增高的效果，其中，突变体G246R、G91C和G91I的比活力比野生型分别提高了69.9％、53.8％和34.5％。
实施例4
1.筛选热稳定性提高的突变体
由表1中酶活提高的G246R、G91C和G91I三种突变体进行热稳定性筛选。将三种突变体的酶液放置到65℃的水浴锅中保温2小时，每隔半小时取样一次，测得的酶活数据记录在图2中。
如图2所示，G91I和G246R在保温30分钟后急速下降到原酶活力的40％，并不断下降最后的残余活性保持在10％。野生型TLL在保温120分钟后仍保持了30％左右的残余酶活，且WT的残余活性始终比G91I和G246R高10～20％。而G91C在保温60分钟之内保留了90％的残余活性，在60分钟之后保留了62％左右的残余活性。将三种突变体和野生型进行比较，相比而言，整体来说G91C比野生型TLL提高了25～45％的残余活性。
2.耐热稳定性
在最适pH下，将酶液放置到65℃和67℃的水浴锅中保温2小时，时隔半小时取样一次，分别测保温30分钟，60分钟，90分钟，120分钟和未保温的酶液的酶活力，从而测定其热稳定性，测得的结果如图2和图3所示。
由图2可得，在65℃保温2小时后发现G91C提高了25～45％残余活力。如图3所示，在67℃保温1小时内，G91C比野生型TLL提高了5％左右的残余活力；而在保温1小时之后，G91C比野生型TLL提高了12～25％的残余活性，G91C不仅具有更高的酶活，而且在热稳定性上相较野生型TLL也有着一定程度的提升。
3.最适温度
在最适pH条件下，将酶液处于30～75℃温度条件下反应得到的最高酶活，将温度和对应的酶活记录在图4中。
由图4可得，野生型TLL的最适温度在40℃，而G91C突变体的最适温度为45℃，相比而言G91C的最适温度提高了5℃，且在分别处于最适温度时，野生型TLI和G91C酶活数值差不多，G91C有着略微的优势，在实际使用时，野生型TLL有着适应更高温度使用的特点。
4.最适pH
在最适温度条件下，使用多种pH的溶液进行实验，不同pH溶液如下：50mmol/L甘氨酸-HCI缓冲液分别调节pH至3和4，200mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液分别调节pH至4和5，200mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液分别调节pH至5和6，50mmol/L Tris-HCI缓冲液调节至7、8、9，50mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液调节至9、10、11，50mmol/L Na2HPO4-NaOH缓冲液调节至11和12，通过在不同pH值下测定的酶活以此研究pH值的变化对酶活力的影响，将最高反应酶活所处的pH作为酶的最适反应pH，不同pH下酶活的数据记录在图5中。
由图5可得，pH在3.0～12.0范围内，野生型TLL的最适pH为9，而G91C的最适pH为10。值得注意的是，pH在3.0～12.0范围内，G91C的残余活性始终比野生型略高。
5.pH稳定性
在最适温度下，将酶液放于pH为3.0～12.0缓冲液范围内，在25℃下保温60分钟后，加入10μL底物对硝基苯基月桂酸酯(C12)在水浴锅保温5分钟，随后加入合适稀释倍数的酶液，准确反应5分钟，测其pH稳定性。以未处理的酶液为100％以计算相对酶活力，将测量和计算得到的酶活记录在图6中。
由图6可得，野生型TLL和G91C的pH稳定性呈现出相同的失活趋势，但G91C的整体残余活性比WT较高。pH在7.0～9.0范围内，G91C的相对酶活比WT高10～20％左右，说明该酶在碱性条件下具有较好的稳定性。
本发明公开申请了一种催化活性和热稳定性均有一定程度提高的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C及其应用，所述脂肪酶突变体G91C的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。通过理性设计选择合适突变点，将疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的氨基酸序列SEQ ID No.7中的第91位甘氨酸突变为半胱氨酸而获得突变体。该突变体具有较好的热稳定性能和偏碱性pH条件下高活性的特性。所述脂肪酶突变体在65℃的热稳定性高于野生型TLL脂肪酶25～45％，在67℃的热稳定性高于野生型TLL脂肪酶5～25％。此外，该突变体的比活力高达661.4U/mg，比野生型TLL高53.8％，其最适温度为45℃，最适pH为10。本发明获得了热稳定性和酶活力均明显提高的G91C突变体，这利于在工业生产中降低成本，为其广泛应用奠定了基础。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ttgattgttt tgtcctttag aggatctcgc tctattgaaa actggatttg taacttgaac 300
tttgatttga aggaaattaa cgatatttgt tccggatgta gaggacatga tggttttact 360
tcttcatgga gatccgttgc tgatactttg agacaaaagg ttgaagatgc tgttagagaa 420
catccagatt acagagttgt ttttactggt cattccttgg gaggtgcttt ggctactgtt 480
gctggagctg atttgagagg taacggttac gatattgatg ttttttcata cggtgctcca 540
agagttggaa acagagcttt tgctgaattt ttgactgttc aaactggagg aactttgtac 600
agaattactc atactaacga tattgttcct agattgccac ctagagaatt tggttactcc 660
cattcttcac ctgaatactg gattaagtcc ggaactttgg ttccagttac tagaaacgat 720
attgttaaga ttgaaggtat tgatgctact ggtggtaaca accaaccaaa cattcctgat 780
attccagctc atttgtggta ctttggattg attggaactt gtttg 825
<210> 4
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtccccta ttagaagaga agtttctcaa gatttgttta accaatttaa cttgtttgct 60
caatactccg ctgctgctta ctgtggtaag aacaacagag ccccagctgg aactaacatt 120
acttgtactg gaaacgcttg tccagaagtt gaaaaggctg atgctacttt tttgtactcc 180
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attccagctc atttgtggta ctttggattg attggaactt gtttg 825
<210> 5
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtccccta ttagaagaga agtttctcaa gatttgttta accaatttaa cttgtttgct 60
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<400> 6
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tttgatttga aggaaattaa cgatatttgt tccggatgta gaggacatga tggttttact 360
tcttcatgga gatccgttgc tgatactttg agacaaaagg ttgaagatgc tgttagagaa 420
catccagatt acagagttgt ttttactggt cattccttgg gaggtgcttt ggctactgtt 480
gctggagctg atttgagagg taacggttac gatattgatg ttttttcata cggtgctcca 540
agagttggaa acagagcttt tgctgaattt ttgactgttc aaactggagg aactttgtac 600
agaattactc atactaacga tattgttcct agattgccac ctagagaatt tggttactcc 660
cattcttcac ctgaatactg gattaagtcc ggaactttgg ttccagttac tagaaacgat 720
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attccagctc atttgtggta ctttggattg attggaactt gtttg 825
<210> 7
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn
1 5 10 15
Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp
20 25 30
Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu
35 40 45
Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu
65 70 75 80
Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly
85 90 95
Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys
100 105 110
Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr
115 120 125
Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg
130 135 140
Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala
145 150 155 160
Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr
165 170 175
Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val
180 185 190
Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val
195 200 205
Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile
225 230 235 240
Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn
245 250 255
Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr
260 265 270
Cys Leu
<210> 8
<211> 825
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtccccta ttagaagaga agtttctcaa gatttgttta accaatttaa cttgtttgct 60
caatactccg ctgctgctta ctgtggtaag aacaacagag ccccagctgg aactaacatt 120
acttgtactg gaaacgcttg tccagaagtt gaaaaggctg atgctacttt tttgtactcc 180
tttgaagatt caggagttgg tgatgttact ggatttttgg ctttggataa cactaacaag 240
ttgattgttt tgtcctttag aggatctcgc tctattgaaa actggattgg taacttgaac 300
tttgatttga aggaaattaa cgatatttgt tccggatgta gaggacatga tggttttact 360
tcttcatgga gatccgttgc tgatactttg agacaaaagg ttgaagatgc tgttagagaa 420
catccagatt acagagttgt ttttactggt cattccttgg gaggtgcttt ggctactgtt 480
gctggagctg atttgagagg taacggttac gatattgatg ttttttcata cggtgctcca 540
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agaattactc atactaacga tattgttcct agattgccac ctagagaatt tggttactcc 660
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<210> 9
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu
1 5 10 15
Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val
35 40 45
Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val
50 55 60
Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile
65 70 75 80
Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Cys Asn
85 90 95
Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg
100 105 110
Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu
115 120 125
Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val
130 135 140
Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly
145 150 155 160
Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly
165 170 175
Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln
180 185 190
Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro
195 200 205
Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys
260 265 270
Leu Ser

Claims (2)

1.一种疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C，其特征在于：所述突变体G91C的基因序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体G91C在制备对硝基苯酚中的应用，其特征在于：所述应用以对硝基苯基月桂酸酯为底物，使用所述脂肪酶突变体G91C进行水解，生成对硝基苯酚。
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