JPWO2020090734A1 - マルトトリオース生成アミラーゼ - Google Patents

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Abstract

マルトトリオースを産生する新たな酵素を提供する。下記のいずれかに示すポリペプチドからなる、マルトトリオース生成アミラーゼ：配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列それぞれにおいて、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド；配列番号１〜３で表わされるアミノ酸配列それぞれに対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。

Description

本発明は、マルトトリオース生成アミラーゼに関する。
マルトトリオースは、澱粉質を酵素又は酸で部分分解することで得られる、グルコース３分子がα−１，４−グルコシド結合を介して結合した糖である。マルトトリオースの甘味の強さは砂糖の１７％程度であるが、まろやかな甘味があるため、食品の低甘味剤として使用される。また、マルトトリオースは吸湿性及び保水性に優れているため、食品の乾燥防止剤、砂糖の結晶析出防止剤、デンプンの老化防止剤として有用である。さらに、マルトトリオースはグルコース及びマルトースより熱安定性に優れているため、食品加工で用いられる糖質素材としても有用である。
マルトトリオースはマルトース製造時の副産物から取得することができる。しかしながら、工業的に安定供給する観点では、澱粉質を酵素化学的に分解して製造することが望ましい。澱粉質からマルトトリオースを生成する酵素としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のＮ−Ａ４６８酵素（非特許文献１）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のアミラーゼＧ３（非特許文献２）が知られている。Ｎ−Ａ４６８酵素は、βアミラーゼと同様に分類され、マルトトリオース単位で澱粉質を分解し、アミラーゼＧ３は、αアミラーゼと同様に分類されマルトトリオースを主成分として含む澱粉分解物を生じる。
澱粉科学，第２３巻，第３号，１７５乃至１８１頁（１９７９年） Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５ Ｖｏｌｕｍｅ ４９ Ｉｓｓｕｅ ４ Ｐａｇｅｓ １０９１−１０９７
しかしながら、これらの酵素は微生物からの生産効率が低く、工業的に安定供給する観点において依然として課題がある。このため、マルトトリオースを産生する新たな酵素の取得が望まれる。
本発明の目的は、マルトトリオースを産生する新たな酵素を提供することにある。
本発明者は、鋭意検討の結果、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属細菌由来のマルトトリオース産生性アミラーゼ（以下、「マルトトリオース生成アミラーゼ」と記載する）を見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記（１−１）〜（１−３）、（２−１）〜（２−３）、及び（３−１）〜（３−３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、マルトトリオース生成アミラーゼ：
（１−１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１−２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
（１−３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
（２−１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２−２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
（２−３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
（３−１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３−２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
（３−３）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
項２． 項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼをコードしているＤＮＡ。
項３． 項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項４． 項２に記載のＤＮＡ又は項３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項５． 項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼの製造方法。
項６． 項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼを含む酵素製剤。
項７． 項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼを用いて、澱粉質からマルトトリオースを生成する工程を含む、マルトトリオースの製造方法。
本発明によれば、マルトトリオースを産生する新たな酵素が提供される。
試験例１において得られた、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属細菌から取得されたマルトトリオース生成活性を有するαアミラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製結果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
また、本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
１．マルトトリオース生成アミラーゼ
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属細菌由来である。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの第１実施形態は、下記（１−１）〜（１−３）のいずれかに示すポリペプチドである。
（１−１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（１−２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
（１−３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
前記（１−１）〜（１−３）に示すポリペプチドは、澱粉質のα−１，４−結合を切断するαアミラーゼ活性であって、且つ、マルトトリオースを生成する活性を有する。
前記（１−２）のポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（１−２）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜８個、１〜６個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記（１−３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
ここで、前記（１−３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
前記（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における第１９６位、第２２３位、第２８４位、第１０７位、第１６６位、第１１８位、第１１９位、第１２２位、第１２３位、第１５８位、第１６１位、第２１４位、第２１５位、第２１６位、第２１７位、第２４７位、第２５０位、第２５２位、第２５３位、第２７８位、第２８３位、第３３６位、第３４２位のアミノ酸は、活性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。第１０７位、第１６６位のアミノ酸はＣａ結合部位と推定され、第１９６位、第２２３位、第２８４位のアミノ酸は活性中心と推定されるため、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが特に望ましい。
前記（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
前記（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにおいて、「マルトトリオース生成能を有する」とは、マルトトリオース生成アミラーゼとしての機能を発揮できる程度の活性を有していることを意味する。具体的には、後述「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」でマルトトリオースのピーク検出を確認できることを意味する。好ましくは澱粉質に対して認められるマルトトリオース生成能が前記（１−１）のポリペプチドによるマルトトリオース生成能と同等又はそれよりも高い（例えば、当該「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」によって検出されるマルトトリオースのピーク強度比として、前記（１−１）のポリペプチドにおける場合の７０％以上である）ことを意味する。
第１実施形態の（１−１）のポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼの分子量は、約５５ｋＤａである。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの第２実施形態は、下記（２−１）〜（２−３）のいずれかに示すポリペプチドである。
（２−１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２−２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
（２−３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
前記（２−１）のポリペプチドは、前記第１実施形態の（１−１）のポリペプチドを含み、更に、そのＣ末端側に炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ領域）を有している。配列番号２に示すアミノ酸配列の第１位〜第５３３位が前記（１−１）のポリペプチドに相当する。また、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５８２位〜第６７４位がＣＢＭ領域に相当すると考えられる。ＣＢＭ領域は、マルトトリオース生成アミラーゼを基質（澱粉質）の表面に局在させて加水分解を効率化すると考えられる。ＣＢＭ領域は、前記第１実施形態の（１−１）〜（１−３）のいずれかに示すポリペプチドのＣ末端側に、直接的又は間接的に結合していてよい。なお、間接的に結合するとは、例えば１〜２５０個、好ましくは１０〜２２０個のアミノ酸からなるリンカー配列等の他のアミノ酸配列を介して結合することをいう。
前記（２−２）のポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２−２）のＣＢＭ領域に相当する領域において、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜８個、１〜６個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記（２−３）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
ここで、前記（２−３）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性であり、「配列同一性」とは、前記第１実施形態における（１−３）における配列同一性と同様である。
前記（２−２）及び（２−３）のポリペプチドにおいて、置換又は欠失を導入しないことが望ましい配列番号２におけるアミノ酸の位置は、前記第１実施形態の（１−２）及び（１−３）のポリペプチドでの置換又は欠失を導入しないことが望ましい配列番号１におけるアミノ酸の位置として前述したとおりであるが、具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列における第１９６位、第２２３位、第２８４位、第１０７位、第１６６位、第１１８位、第１１９位、第１２２位、第１２３位、第１５８位、第１６１位、第２１４位、第２１５位、第２１６位、第２１７位、第２４７位、第２５０位、第２５２位、第２５３位、第２７８位、第２８３位、第３３６位、第３４２位のアミノ酸は、活性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。第１０７位、第１６６位のアミノ酸はＣａ結合部位と推定され、第１９６位、第２２３位、第２８４位のアミノ酸は活性中心と推定されるため、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが特に望ましい。また、ＣＢＭ領域に関しては、第６０８位、第６３９位、第６５１位、第６５２位、第６５６位のアミノ酸は澱粉との結合に寄与していると考えられることから、マルトトリオース生成アミラーゼを基質（澱粉質）の表面に局在させたい場合はこれらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
前記（２−２）及び（２−３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。保存的置換については、前記第１実施形態における（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合のアミノ酸置換の態様としての保存的置換と同様である。
前記（２−２）及び（２−３）のポリペプチドにおいて、「マルトトリオース生成能を有する」とは、マルトトリオース生成アミラーゼとしての機能を発揮できる程度の活性を有していることを意味する。具体的には、後述「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」でマルトトリオースのピーク検出を確認できることを意味する。好ましくは澱粉質に対して認められるマルトトリオース生成能が前記（２−１）のポリペプチドによるマルトトリオース生成能と同等又はそれよりも高い（例えば、当該「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」によって検出されるマルトトリオースのピーク強度比として、前記（２−１）のポリペプチドにおける場合の７０％以上である）ことを意味する。
第２実施形態の（２−１）のポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼの分子量は、約７０ｋＤａである。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの第３実施形態は、下記（３−１）〜（３−３）のいずれかに示すポリペプチドである。
（３−１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（３−２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
（３−３）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
前記（３−１）のポリペプチドも、前記第１実施形態の（１−１）のポリペプチドを含む。より具体的には、前記（３−１）のポリペプチドは、前記第２実施形態の（２−１）のポリペプチドを含み、更に、そのＮ末端にプロ配列を有している。配列番号３の第５４位〜第５８６位が前記第１実施形態の（１−１）のポリペプチドに相当し、第５４位〜第７２８位が前記第２実施形態の（２−１）のポリペプチドに相当する。
前記（３−２）のポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（３−２）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜８個、１〜６個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記（３−３）のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
ここで、前記（３−３）のポリペプチドにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号３に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性であり、「配列同一性」とは、前記第１実施形態の（１−３）における配列同一性と同様である。
前記（３−２）及び（３−３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。保存的置換については、前記第１実施形態における（１−２）及び（１−３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合のアミノ酸置換の態様としての保存的置換と同様である。
前記（３−２）及び（３−３）のポリペプチドにおいて、置換又は欠失を導入しないことが望ましい配列番号３におけるアミノ酸の位置は、前記第１実施形態の（１−２）及び（１−３）のポリペプチドでの置換又は欠失を導入しないことが望ましい配列番号１におけるアミノ酸の位置として前述したとおりである。
前記（３−２）及び（３−３）のポリペプチドにおいて、「マルトトリオース生成能を有する」とは、マルトトリオース生成アミラーゼとしての機能を発揮できる程度の活性を有していることを意味する。具体的には、後述「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」でマルトトリオースのピーク検出を確認できることを意味する。好ましくは澱粉質に対して認められるマルトトリオース生成能が前記（３−１）のポリペプチドによるマルトトリオース生成能と同等又はそれよりも高い（例えば、当該「＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞」によって検出されるマルトトリオースのピーク強度比として、前記（３−１）のポリペプチドにおける場合の７０％以上である）ことを意味する。
第３実施形態の（３−１）のポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼの分子量は、約７７ｋＤａである。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの酵素活性は、以下に示す方法により測定することができる。
＜マルトトリオース生成アミラーゼの活性測定法＞
基質液（１％（ｗ／ｖ）可溶性澱粉溶液）２００μＬと酵素液５０μＬとを混合した反応用液を、５０℃、４８時間、１０００ｒｐｍで振盪して反応後、１００℃、５分間煮沸して反応を停止する。反応停止した反応用液を精製水で３０倍に希釈して０．４５μｍフィルターで濾過して分析用サンプルを得る。分析用サンプルをＨＬＰＣ分析してマルトトリオースのピークを検出することでマルトトリオース生成アミラーゼ活性を測定する。
２．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記のマルトトリオース生成アミラーゼをコードしているＤＮＡである。本発明のＤＮＡは、例えば、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属細菌由来の前記（３−１）〜（３−３）のいずれかのポリペプチドをコードしているＤＮＡを鋳型として、少なくとも前記（１−１）〜（１−３）のいずれかのポリペプチドをコードしている領域をＰＣＲ等によって取得することにより得ることができる。また、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼをコードしているＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
また、塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する場合、変異導入方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記マルトトリオース生成アミラーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記マルトトリオース生成アミラーゼをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記マルトトリオース生成アミラーゼをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼをコードしているＤＮＡの塩基配列については、当業者であれば、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼのアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。
本発明のＤＮＡの第１実施形態は、前記（１−１）〜（１−３）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。例えば、前記（１−１）のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡの第１実施形態には、前記（１−１）〜（１−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
更に、本発明のＤＮＡの第１実施形態には、前記（１−１）〜（１−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。上記相同性として、好ましくは８０％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
本発明のＤＮＡの第２実施形態は、前記（２−１）〜（２−３）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡである。例えば、前記（２−１）のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡの第２実施形態には、前記（２−１）〜（２−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
更に、本発明のＤＮＡの第２実施形態には、前記（２−１）〜（２−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。上記相同性として、好ましくは８０％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
本発明のＤＮＡの第３実施形態は、前記（３−１）〜（３−３）のいずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡである。例えば、前記（３−１）のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡの第３実施形態には、前記（３−１）〜（３−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
更に、本発明のＤＮＡの第３実施形態には、前記（３−１）〜（３−３）のポリペプチドをコードし、且つ、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。上記相同性として、好ましくは８０％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９以上が挙げられる。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
また、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
３．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼをコードするＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターは、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせなどが好ましく挙げられる。
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、上記の本発明のＤＮＡ又は上記の本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって得られる。
形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本発明の遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；放線菌等；酵母等；糸状菌等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。また、宿主としては、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの由来菌であるＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属であってもよい。
本発明の形質転換体は、宿主に上記の本発明のＤＮＡ又は上記の本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する方法は、目的の遺伝子が宿主に導入できる限り特に限定されない。また、ＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。
宿主に本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する条件は、導入方法及び宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
５．マルトトリオース生成アミラーゼの製造方法
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼは、前記本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。また、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼは、生産菌であるＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（形質転換されていないもの）を培養することによって製造することもできる。生産菌であるＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（形質転換されていないもの）を培養した場合、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼはプロセシングを受けることで（１−１）〜（１〜３）のいずれかのポリペプチド（第１実施形態のポリペプチド）と、（２−１）〜（２〜３）のいずれかのポリペプチド（第２実施形態のポリペプチド）と、（３−１）〜（３〜３）のいずれかのポリペプチド（第３実施形態のポリペプチド）とが混在した状態で製造される。一方、前記本発明の形質転換体を用いた場合、導入するＤＮＡによって、第１実施形態のポリペプチド、第２実施形態のポリペプチド、第３実施形態のポリペプチドのいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子のみを宿主に発現させることが可能となるため、第１実施形態のポリペプチド、第２実施形態のポリペプチド、第３実施形態のポリペプチドのいずれか１つのポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼを単独で製造すること、及び第１実施形態のポリペプチドと第２実施形態のポリペプチドと第３実施形態のポリペプチドとが混在した状態で製造することのいずれもが可能となる。
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収する。本発明のマルトトリオース生成アミラーゼが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを含む水溶性画分を得ることができる。
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを培養液中に分泌させることもできる。
上記のようにして得られた本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを含む培養液又は水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液又は水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
このようにして精製された本発明のマルトトリオース生成アミラーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．酵素製剤
本発明の酵素製剤は、上記の本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを有効成分として含む。酵素製剤に含まれるマルトトリオース生成アミラーゼとしては、（１−１）〜（１〜３）のいずれかのポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼのみが含まれていてもよく、（２−１）〜（２−３）のいずれかのポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼのみが含まれていてもよく、（３−１）〜（３−３）のポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼのいずれかのポリペプチドからなるマルトトリオース生成アミラーゼのみが含まれていてもよい。上記のマルトトリオース生成アミラーゼが複数含まれていてもよい。含まれるマルトトリオース生成アミラーゼの種類と含有比率は、基質によって適宜選択することが可能である。
本発明の酵素製剤は、上記の本発明のマルトトリオース生成アミラーゼの他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水からなる群より選択される添加剤を含有することができる。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ−グルコース、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては塩化ナトリウム、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては塩化ナトリウム、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。
本発明の酵素製剤におけるマルトトリオース生成アミラーゼの含有量としては、マルトトリオース生成アミラーゼの効果が発揮される範囲で適宜設定される。
本発明の酵素剤は、他の酵素を含んでいてもよい。他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素、プルラナーゼ等が挙げられる。
本発明の酵素製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば、液体、粉末、顆粒等が挙げられる。本発明の酵素製剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
７．マルトトリオースの製造方法
本発明のマルトトリオースの製造方法においては、上記の本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを用いて、澱粉質からマルトトリオースを生成する工程を含む。
澱粉質としては、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン及び澱粉；並びに、それらをアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した澱粉部分分解物としては、例えば、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）などのアミラーゼを用いて、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、澱粉などを分解して得られる部分分解物が挙げられる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させてもよい。
澱粉としては、例えば、トウモロコシ、小麦、米、バレイショ、サツマイモ、タピオカ等の由来の澱粉が挙げられる。これら澱粉は、糊化、液化して得られる液化澱粉溶液の態様で用いることができる。
本発明のマルトトリオース生成アミラーゼを澱粉質に作用させるに際し、澱粉質溶液の濃度は特に限定されないが、工業的観点から、濃度１０％（ｗ／ｖ）以上が挙げられる。反応温度は反応が進行する温度であれば特に制限されないが、具体的には約６５℃まで、好ましくは４５〜６０℃が挙げられる。反応ｐＨは、通常５〜９、好ましくは５．５〜７．５が挙げられる。酵素の使用量は、目的とする酵素反応の進行速度により適宜選択すればよい。
また、このマルトトリオース生成反応の際、他の酵素を更に同時併用して、糖化液中のマルトトリオース含量を増加させてもよい。例えば、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用することにより、糖化液のマルトトリオースの含量を増加させることができる。
上記の反応によって得られた反応液は、そのままマルトトリオース含有糖液として用いてもよいが、好ましくは、マルトトリオース含有糖液をさらに精製する。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ+型、ＯＨ-型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの１種又は２種以上の精製方法が挙げられる。
高純度のマルトトリオース含有糖質を得るための方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーが挙げられ、具体的には、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させたマルトトリオース又はこれを含む糖質を製造することができる。
このようにして得られたマルトトリオース含有糖質、又はその含量を向上させた糖質は、濃縮することによりシラップ状製品とすることができる。このシラップ状製品は、更に乾燥、粉砕することにより粉末状製品にすることもできる。
本発明の製造方法で得られるマルトトリオース又はこれを含む糖質は、シラップ又は粉末の形態で甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬部外品、医薬品などの各種組成物の添加剤として用いることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
以下のように、生産菌候補からαアミラーゼを取得し、取得したαアミラーゼについてマルトトリオース生成活性を確認した。また、マルトトリオース生成活性を確認したαアミラーゼを生産した生産菌候補の同定を行った。さらに、マルトトリオース生成活性を確認したαアミラーゼについてアミノ酸配列解析及び塩基配列決定を行った。
［試験例１：生産菌候補からのαアミラーゼ取得］
［１］生産菌候補の培養
以下の組成を有する液体培地を三角フラスコに入れ、オートクレーブを用い１２１℃、２０分で殺菌した。液体培地に生産菌候補を接種し、３０℃で３日間培養した。
Figure 2020090734
Figure 2020090734
［２］酵素の精製
菌体分離、限外ろ過、硫安分画、透析、１回目ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理、２回目ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理、１回目ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０処理、及び２回目ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０処理によって、生産菌候補が生産した酵素を精製した。
菌体分離は、培養上清を遠心分離（７，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）することにより行った。限外ろ過は、遠心上清に対し、限外ろ過膜（ＡＩＶ膜，旭化成）を用いることにより行った。硫安分画により、０−４０画分を取得した。透析は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて行った。１回目ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理においては、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用い、１０-3Ｍ Ｌ−システインを含む２．５×１０-3Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化及び洗浄し、ＫＣｌ（０〜１．０Ｍ グラジェント）により溶出を行い、アミラーゼ画分を集め、メンブレンフィルターにて濃縮後、 ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで再分画した。２回目ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理においては、１回目ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理と同様の操作を行った。１回目ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０処理においては、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０カラムを用い、１０-3Ｍ Ｌ−システインを含む２．５×１０-3Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化及び洗浄し、ＫＣｌ（０〜１．０Ｍ グラジエント）により溶出を行い、アミラーゼ画分を集め、メンブレンフィルターにて濃縮後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０カラムで再分画した。２回目ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０においては、１回目ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１５０と同様の操作を行った。
なお、アミラーゼ画分とは、αアミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ社製）を用い、当該キットのプロトコルに従ってαアミラーゼ活性を確認した画分である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、得られた画分を展開した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、得られた画分１０μＬを、ＳＤＳサンプルバッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー（ｐＨ６．８）０．１２５Ｍ、ＳＤＳ４％（ｗ／ｖ）、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）０．０１％（ｗ／ｖ）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）０．２Ｍ］５μＬで希釈して泳動サンプルを調製し、９９．９℃で１０分煮沸した後、泳動サンプルのうち１０μＬを泳動ゲル［ＳＤＳゲル；ＳｕｐｅｒＳｅｐTMＡｃｅ１５％（富士フイルム和光純薬株式会社製）］に供し、電気泳動した。泳動ゲルをＰＶＤＦ膜［トランスブロットＴｕｒｂｏTMミニＰＶＤＦ転写パック（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）］に転写し、染色液［５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液中、ＣＢＢ Ｒ−２５０を０．１％（ｗ／ｖ）含む］転写膜を染色し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で脱色した。
ＳＤＳゲルの染色結果を図１に示す。図１において、最も右のレーンは分子マーカーである。図１に示すように、得られた酵素はプロセシングにより３種類の形態をとることが示唆された。各形態の酵素の分子量は、それぞれ、矢印１で示されるものが５５ｋＤａ、矢印２で示されるものが７０ｋＤａ、矢印３で示されるものが７７ｋＤａであった。また、矢印１で示される分子量５５ｋＤａの酵素に関し、単一に精製したことを確認した。図１における５５ｋＤａの精製画分について、上述のαアミラーゼ測定キットによりαアミラーゼ活性を確認した。
［試験例２：マルトトリオース生成活性の確認］
図１における５５ｋＤａの精製画分について、さらに以下のようにしてマルトトリオース生成活性を確認した。
［１］基質液の調製
可溶性澱粉１ｇを約６０ｍＬの精製水に懸濁し、１００℃で５分間加熱し、溶解した。冷却後、精製水を用いて１００ｍＬにメスアップし、１％（ｗ／ｖ）可溶性澱粉を含む基質液を得た。
［２］反応用液の調製
基質液２００μＬと分析対象の酵素液５０μＬとを混合し、２５０μＬの反応用液を調製した。
［３］分析用サンプルの調製
反応用液を、５０℃、４８時間、１０００ｒｐｍで振盪して反応後、１００℃、５分間煮沸して反応を停止した。反応停止した反応用液を精製水で３０倍に希釈して０．４５μｍフィルターで濾過し、濾液を分析用サンプルとして得た。
分析用サンプルバイアルに移し、以下の条件でＨＰＬＣ分析した。
Figure 2020090734
ＨＰＬＣ分析の結果、生成物としてマルトトリオースのピークを検出した。つまり、５５ｋＤａ精製画分のマルトトリオース生成活性が確認できた。
同様にして、図１における７０ｋＤａ精製画分及び７７ｋＤａ精製画分についてマルトトリオース生成活性が確認できた。
［試験例３：マルトトリオース生成活性を有するαアミラーゼの生産菌同定］
マルトトリオース生成活性が確認されたαアミラーゼの生産菌候補を、１６ＳｒＲＮＡ解析に供した。その結果、当該生産菌候補がＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．と同定された。
［試験例４：マルトトリオース生成活性を有するαアミラーゼのアミノ酸配列解析及び塩基配列決定］
［１］Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列の解析
試験例１の項目［２］で得られた３種類のバンド（５５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７７ｋＤａ）を切り出し、プロテインシーケンサーで解析した。その結果、それぞれのバンドのＮ末端アミノ酸配列が特定できた。さらに各バンドをトリプシン処理後、ＬＣ−ＭＳＭＳにて解析することで内部アミノ酸配列を特定した。
［２］塩基配列の決定
［２−１］ＰＣＲ
特定したＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列を元にプライマーを設計した。ＰＣＲ反応液２０μＬ／ｔｕｂｅを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成及びＰＣＲの条件は以下の通りである。１％アガロースゲルにて泳動し、単一増幅を確認した。
Figure 2020090734
［２−２］ＴＡ−クローニング
ＰＣＲ産物２μＬとＴ−Ｖｅｃｏｒ ｐＭＤ２０ １μＬ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ３μＬを混合したライゲーション反応液を用いて、１６℃、３０分でライゲーション反応を行い、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）２５μＬに形質転換した。得られた形質転換溶液約３０μＬを、ＬＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＡｍｐ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含む液体培地（以下において、「ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地」と記載する。）プレートに塗布して、３７℃、Ｏ／Ｎで培養した。
［２−３］プラスミド抽出
形質転換体をＬＢ＋Ａｍｐ液体培地（２ｍＬ）で３７℃、Ｏ／Ｎで培養した。培養完了後、集菌し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ法にてプラスミドを抽出した。
［２−４］シークエンス解析
サンガー法にてシークエンス解析を行い、部分塩基配列を決定した。
［２−５］全長塩基配列解析
得られた部分塩基配列を基に作成したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを実施し、得られた陽性クローンの遺伝子配列を解析して、目的の塩基配列を決定した。その結果、５５ｋＤａのバンドからは配列番号４の塩基配列が得られた。７０ｋＤａのバンドからは配列番号５の塩基配列が得られた。７７ｋＤａのバンドからは配列番号６の塩基配列が得られた。
［３］アミノ酸配列の決定
上記塩基配列から、アミノ酸配列を決定した。配列番号４の塩基配列がコードするアミノ酸配列が配列番号１、配列番号５の塩基配列がコードするアミノ酸配列が配列番号２、配列番号６の塩基配列がコードするアミノ酸配列が配列番号３であった。つまり、試験例１によって、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のマルトトリオース生成アミラーゼが得られたことが分かった。
［試験例５：マルトトリオース生成アミラーゼの組換生産］
［１］発現ベクターの構築
［１−１］ＰＣＲ
アミラーゼ遺伝子を増幅するため、フォワードプライマーとして配列番号７に示すプライマー、リバースプライマーとして配列番号８に示すプライマーを設計した。ＰＣＲ反応液５０μＬ／ｔｕｂｅを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成及びＰＣＲの条件は以下の通りである。１％アガロースゲルにて泳動し、単一増幅を確認した。
Figure 2020090734
［１−２．ライゲーション及び形質転換］
ＰＣＲ産物とｐＵＢＣＭ２１（ｐＵＣ１９及びｐＵＢ１１０のシャトルベクター）とを混合したライゲーション液（５μＬ）を用いて、１６℃、３０分でライゲーション反応を行い、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α ５０μＬに形質転換した。得られた形質転換溶液約５５μＬを、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）プレートに塗布して、３７℃、Ｏ／Ｎで培養した。ライゲーション反応液の組成は以下の通りである。
Figure 2020090734
［１−３．プラスミド抽出］
試験例４の２−３と同様の方法によってプラスミド抽出を行い、プラスミドｐＵＢＣＭ２１−ａｍｙを取得した。
［２］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの形質転換
得られたベクターｐＵＢＣＭ２１−ａｍｙを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株由来ａｍｙＥ欠損株の形質転換を行った。形質転換の方法については、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａ社製）のプロトコルに従った。
［３］マルトトリオース生成アミラーゼの製造
［３−１］形質転換株の培養
ＬＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びカナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含む液体培地に形質転換株を接種し、３７℃、４日間振とう培養した。培養開始後１日毎に０．５ｍＬずつサンプリングを行い、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分遠心することで上清を回収し、マルトトリオース生成アミラーゼを得た。
［３−２］αアミラーゼの生産性確認
回収した上清（マルトトリオース生成アミラーゼ画分）について、活性測定及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによってαアミラーゼ生産性の確認を行った。活性測定は、αアミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ社）を用い、当該キットのプロトコルに従って測定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、試験例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に行った。
活性測定の結果、ネガティブコントロールであるｐＵＢＣＭ２１（空ベクター導入株）と比較して、マルトトリオース生成アミラーゼ画分で有意な活性を確認した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、コドンをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに最適化することで、αアミラーゼ由来の３種のバンドを確認した。この３種のバンドは、それぞれの分子量から、配列番号１、２及び３のアミラーゼのものであると推定された。つまり、本試験例によって、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のマルトトリオース生成アミラーゼが得られたと考えられる。
配列番号７及び８は、プライマーである。

Claims (7)

  1. 下記（１−１）〜（１−３）、（２−１）〜（２−３）、及び（３−１）〜（３−３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、マルトトリオース生成アミラーゼ：
    （１−１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （１−２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
    （１−３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
    （２−１）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２−２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
    （２−３）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
    （３−１）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （３−２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド、
    （３−３）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つ、マルトトリオース生成能を有するポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼをコードしているＤＮＡ。
  3. 請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  4. 請求項２に記載のＤＮＡ又は請求項３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼの製造方法。
  6. 請求項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼを含む酵素製剤。
  7. 請求項１に記載のマルトトリオース生成アミラーゼを用いて、澱粉質からマルトトリオースを生成する工程を含む、マルトトリオースの製造方法。
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