JP6585078B2 - 耐熱性イソアミラーゼ - Google Patents

Description

本発明は、耐熱性が向上した変異イソアミラーゼ、及び変異イソアミラーゼを用いるマルトースの製造法に関する。

糖化工業において、デンプンやアミロペクチン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素として、Klebsiella pneumoniaeなどが生産するプルラナーゼ及びイソアミラーゼが知られている。このうち、プルラナーゼは、２０％（ｗ／ｖ）以上という高濃度基質存在下では、可逆的な反応、つまりマルトースを重合して４糖を生成したり、また、マルトースをアミロースに転移させたりするため、β−アミラーゼと併用してマルトースを製造する場合、高い純度のマルトースを製造することができない。

一方、イソアミラーゼは、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素であり、可逆的な反応が見られないため、高純度のマルトースが生産できることが知られている。イソアミラーゼ生産菌としては、Pseudomonas amyloderamosa、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）などが報告されているが、これらのイソアミラーゼは、至適ｐＨや至適温度などが、併用される各種アミラーゼと合致しないため、十分な能力を発揮できなかった。一般にデンプン糖の生産は、他のアミラーゼの好適条件である５０℃以上の高温でｐＨ５．０〜６．０の弱酸性条件下で行われているが、Pseudomonas amyloderamosaが生産するイソアミラーゼは、至適ｐＨが３．０〜４．０と酸性領域に片寄っており（非特許文献１）、耐酸性の弱い麦芽β−アミラーゼや細菌β−アミラーゼ及びα−アミラーゼとは併用が困難であった。また、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）などが生産するイソアミラーゼは、至適ｐＨは併用される各種アミラーゼと合致するものの、至適温度が４０〜４５℃と低く（非特許文献２、３）、各種アミラーゼとの併用が困難であった。

Ｓｔａｒｃｈ(１９９６)，４８：２９５-３００ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８），１９（６），４５６−４６１ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），６５（９），４１６３−４１７０

デンプン等の多糖類から高純度のマルトースを工業的に製造するには、β−アミラーゼ等のアミラーゼとイソアミラーゼを併用することが望まれているが、Flavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼの至適温度は他のアミラーゼの至適温度よりも低く、併用できなかった。
従って、本発明の課題は、より至適温度が向上した、すなわち耐熱性が向上した新たなイソアミラーゼ、及びこれを用いたマルトースの製造法を提供することにある。

そこで本発明者は、前記のFlavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼのアミノ酸配列の一部を改変したタンパク質を製造し、その耐熱性を検討したところ、特定の位置の２ヶ所以上を他のアミノ酸に変異させることにより耐熱性が５℃〜１０℃向上した変異イソアミラーゼが得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］を提供するものである。

［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼ。
［２］アミノ酸変異が、Ｖ５１５Ｐ及びＭ５７０Ｌである［１］記載のイソアミラーゼ。
［３］さらに、アミノ酸番号２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異した［１］又は［２］記載のイソアミラーゼ。
［４］アミノ酸変異が、Ｓ２３９Ｎ、Ｔ２４１Ａ、Ｇ５３４Ｄ及びＳ６０１Ｔから選ばれる１又は２以上である［３］記載のイソアミラーゼ。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
［６］［５］記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
［７］［６］記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
［８］［７］記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
［９］デンプンに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼから選ばれる酵素と、［１］〜［４］のいずれかに記載のイソアミラーゼとを作用させることを特徴とするマルトースの製造法。

本発明のイソアミラーゼは、耐熱性が５℃以上向上しており、他の各種アミラーゼの至適温度と重複する。従って、本発明のイソアミラーゼは、各種アミラーゼと併用してデンプン等に作用させることにより、高純度のマルトースを工業的に有利に生産することができる。

ネイティブおよび各変異体酵素の熱安定性を示す図である。 ネイティブおよび各変異体酵素の至適温度を示す図である。 ネイティブおよび六重変異体酵素のｐＨ安定性を示す図である。 ネイティブおよび六重変異体酵素のカルシウム存在下での耐熱性向上を示す図である。

本発明のイソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼである。

ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼは、非特許文献２及び３に記載された、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）が産生するイソアミラーゼである。このイソアミラーゼには、同一のアミノ酸配列を有する限り、Flavobacterium odoratum由来でないイソアミラーゼが含まれる。また、同一アミノ酸配列を有する限り、ポリペプチドだけでなく、糖ペプチドも含まれる。なお、配列番号１は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。

配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおける、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜８個がさらに好ましい。また、当該欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼと配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができる。

本発明のイソアミラーゼは、少なくとも前記イソアミラーゼのアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したものである。なお、配列番号１のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼの場合には、当該アミノ酸番号５１５及び５７０は、変化する場合があるが、その場合、５１５のバリンに相当するバリン、及び５７０のメチオニンに相当するメチオニンが、他のアミノ酸に変異したものである。これは、後記のアミノ酸番号２３９、２４１、５３４及び６０１についても同様であり、変異前のアミノ酸に相当するアミノ酸が存在する位置である。
ここで、他のアミノ酸としては、アミノ酸番号５１５については、プロリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、アラニンが挙げられ、プロリン、イソロイシンがより好ましく、プロリンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５１５の変異としては、Ｖ５１５Ｐ、Ｖ５１５Ｉ、Ｖ５１５Ｌ、Ｖ５１５Ｇ、Ｖ５１５Ａが挙げられ、Ｖ５１５Ｐ、Ｖ５１５Ｉがより好ましく、Ｖ５１５Ｐがさらに好ましい。

また、アミノ酸番号５７０の他のアミノ酸については、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリンが挙げられ、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンがより好ましく、ロイシンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５７０の変異としては、Ｍ５７０Ｌ、Ｍ５７０Ｉ、Ｍ５７０Ｖ、Ｍ５７０Ａ、Ｍ５７０Ｐが挙げられ、Ｍ５７０Ｌ、Ｍ５７０Ｉ、Ｍ５７０Ｖ、Ｍ５７０Ａがより好ましく、Ｍ５７０Ｌがさらに好ましい。

本発明のイソアミラーゼは、少なくともアミノ酸番号５１５のバリンと５７０のメチオニンの２ヶ所が他のアミノ酸に変異していることにより５％以上の耐熱性向上が得られる。一方のみの変異では、耐熱性の向上は十分でない。

本発明のイソアミラーゼは、上記２ヶ所以外に、さらに、アミノ酸番号２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異したものであるのが好ましい。
ここで、アミノ酸番号２３９のセリンの変異後の他のアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、アスパラギンがより好ましい。従って、アミノ酸番号２３９の変異としては、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑが挙げられ、Ｓ２３９Ｎがより好ましい。

アミノ酸番号２４１のスレオニンの変異後の他のアミノ酸としては、アラニン、セリン、グリシンが挙げられ、アラニンがより好ましい。従って、アミノ酸番号２４１の変異としては、Ｔ２４１Ａ、Ｔ２４１Ｓ、Ｔ２４１Ｇが挙げられ、Ｔ２４１Ａがより好ましい。

アミノ酸番号５３４のグリシンの変異後の他のアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、アスパラギン酸、グルタミン酸がより好ましく、アスパラギン酸がさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５３４の変異としては、Ｇ５３４Ｄ、Ｇ５３４Ｅ、Ｇ５３４Ｎ、Ｇ５３４Ｑが挙げられ、Ｇ５３４Ｄ、Ｇ５３４Ｅがより好ましく、Ｇ５３４Ｄがさらに好ましい。

アミノ酸番号６０１のセリンの変異後の他のアミノ酸としては、スレオニン、アラニン、グリシン、アスパラギン、バリンが挙げられ、スレオニン、アラニン、グリシンがより好ましく、スレオニンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号６０１の変異としては、Ｓ６０１Ｔ、Ｓ６０１Ａ、Ｓ６０１Ｇ、Ｓ６０１Ｎ、Ｓ６１０Ｖが挙げられ、Ｓ６０１Ｔ、Ｓ６０１Ａ、Ｓ６０１Ｇがより好ましく、Ｓ６０１Ｔがさらに好ましい。

また、アミノ酸番号２３９、２４１、５３４及び６０１のアミノ酸変異は、１又は２以上であればよいが、前記５１５及び５７０に加えて、２４１の変異；２４１及び６０１の変異；２３９、２４１及び６０１の変異；又は２３９、２４１、５３４及び６０１の変異がされているのが、耐熱性向上の点で好ましい。

より好ましい多重変異の例としては、Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ、Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ、Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ、Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ、Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｇ５３４Ｄ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔが挙げられる。

本発明の変異イソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、アミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に置換し、必要によりさらに２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換することにより構築した遺伝子を用いて製造することができる。

本発明の変異イソアミラーゼを製造するための遺伝子は、前記の変異イソアミラーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子であり、例えば前記の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸配列をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。

このようにして得た遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られている。変異イソアミラーゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ−１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。

得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等の微生物に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明変異イソアミラーゼが得られる。

本発明のイソアミラーゼは、Flavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼに比べて耐熱性が５℃〜１０℃向上しており、かつ至適ｐＨ、イソアミラーゼ活性、 カルシウム依存性等はFlavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼと同等である。従って、デンプンに、β−アミラーゼ、α―アミラーゼから選ばれる酵素と、本発明イソアミラーゼとを作用させれば、高純度のマルトースが容易に得られる。ここでβ−アミラーゼとしては、ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２（合同酒精株式会社）、オプチマルトＢＢＡ（ダニスコジャパン株式会社）、β−アミラーゼＬ／Ｒ（ナガセケムテックス株式会社）、ハイマルトシンＧＬ（エイチビィアイ株式会社）等を用いることができる。また、α−アミラーゼとしては、例えばクライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。

反応は、例えばデンプンおよびアミラーゼ等のデンプン糖化酵素に前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、高純度のマルトースを工業的に有利に製造することができる。

次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例１（イソアミラーゼの部分特異的変異導入）
pHSG398（タカラバイオ株式会社）をテンプレートとして、プライマーMLUPHSG398-F（CGACGCGTGGCCAGGAACCGTAAAAAG（配列番号２））およびXBAPHSG398-R（GCTCTAGATTTAAGGGCACCAATAACTGC（配列番号３））を用いて約１．５ｋｂの断片を取得した。この断片を制限酵素Ｘｂａ Ｉ及びＭｌｕ Ｉで消化し、Flavobacterium odoratumゲノム上のイソアミラーゼ遺伝子を含む約２．５ｋｂのＸｂａ Ｉ及びＭｌｕ Ｉ断片とライゲーションすることにより、ｐ−ＭＬを取得した。ネイティブのイソアミラーゼの発現プラスミドであるプラスミドｐ−ＭＬに部位特異的変異導入を行い、二重変異体（Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ）発現プラスミドｐ−Ｗを取得した。さらにこれに部位特異的変異導入を行い、四重変異体（Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ）発現プラスミドｐ−Ｑ及び六重変異体（Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｇ５３４Ｄ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ）発現プラスミドｐ−Ｓを取得した。

実施例２（酵素の生成）
ネイティブイソアミラーゼ発現プラスミドｐ−ＭＬ、二重変異体発現プラスミドｐ−Ｗ、四重変異体発現プラスミドｐ−Ｑ、及び六重変異体発現プラスミドｐ−Ｓにより大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、それぞれのイソアミラーゼを生産する大腸菌株を取得した。これらの大腸菌を３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むLB培地（酵母エキス ０．５％、トリプトン１．０％、塩化ナトリウム ０．５％ ｐＨ ７．２）で、３０℃ ３日培養し、培養液１Ｌを得た。遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）により菌体を除去した後、UF濃縮（旭化成社製 ＡＩＰモジュール）により、１０，０００Ｕ／ｍｌとなるように濃縮した。これらを０．２μｍのポアサイズの膜で除菌することにより、ネイティブイソアミラーゼ、二重変異体イソアミラーゼ、四重変異体イソアミラーゼ、六重変異体イソアミラーゼの酵素溶液とした。

実施例３（各変異体の熱安定性向上）
これらを４５℃、４７．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃、６７．５℃、７０℃に１０分間保ったのちに急冷し、残存活性を測定した。

＜活性測定方法＞
イソアミラーゼの活性測定法は、以下のとおりである。
０．５％ワキシーコーンスターチ溶液０．３５ｍｌに、０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌを混合し、適時希釈した酵素液を０．１ｍｌ加え、４５℃で１５分間反応させる。その後、０．１Ｎ ＨＣｌ にて５倍希釈したヨード溶液（０．０５Ｍヨウ素を含む０．５Ｍヨウ化カリウム溶液）０．５ｍｌを加えて酵素反応を止め、１０ｍｌの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下で１分間に０．０１吸光度を増加する酵素量を１単位とした。
その結果、図１に示すように、二重変異体で約５℃、四重変異体で約８℃、六重変異体で約１０℃の耐熱性の向上が確認された。

実施例４（至適温度の上昇）
また、通常ネイティブの酵素の至適温度は４５℃であるが、ネイティブおよび得られた各変異体酵素について、４７．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃、６７．５℃、７０℃での活性を実施例３に記載の方法で測定した。
その結果、図２に示すように、二重変異体、四重変異体、六重変異体と変異を多重化するにつれて至適温度の上昇が認められた。

実施例５（至適ｐＨ）
ネイティブ及び六重変異体についてｐＨ安定性を調べた。ネイティブ及び六重変異体をｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０の各ｐＨで六重変異体６０℃、ネイティブ５２．５℃で１０分間保持後、急冷し残存活性を実施例３に記載の方法で測定した。
その結果、図３に示すように、アミノ酸の改変による至適ｐＨ域の大きな変動は認められなかった。

実施例６（カルシウム依存性）
ネイティブ及び六重変異体について、耐熱性に関するカルシウム依存性を調べた。ネイティブ及び六重変異体を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）もしくは塩化カルシウムを含まない２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）中で、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で１０分間保温後、急冷し残存活性を実施例３に記載の方法で測定した。
その結果、図４に示すように、ネイティブおよび六重変異体ともにカルシウム存在下で耐熱性が高いことが認められた。

実施例７（マルトースシロップの製造）
デキストリンからのマルトース精製試験を行った。１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にＢｒｉｘ３０となるようにデキストリンとしてパインデックス＃１００（松谷化学工業社製）を溶解し、（１）ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２（合同酒精株式会社製）をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇ添加したもの、（２）ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇおよびネイティブイソアミラーゼをデキストリン１ｇあたり４００Ｕ添加したもの、（３）ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇおよび六重変異体イソアミラーゼをデキストリン１ｇあたり４００Ｕ添加したもの、それぞれを６０℃で２４時間反応させた。
１００℃、５分間加熱し反応を停止させ、生成したマルトース量について、高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製２６９５）を用い、ＲＩ検出器（ウォーターズ社製２４１４）、ＣＡＲＢＯＳｅｐ ＣＨＯ−６２０ＣＡ（トランスジェノミック社製）カラム温度８５℃、水を溶離液として流速０．５ｍｌ／分にて測定した。

その結果、マルトース濃度は（１）１５．４％、（２）２３．４％、（３）２５．４％となり、六重変異体イソアミラーゼを使用した場合に最もマルトース生成量が高かった。
また、反応中の雑菌汚染をより防止するために反応温度を６２℃で行ったところ、マルトース濃度は（１）１４．０％、（２）１４．７％、（３）２１．１％となり、ネイティブイソアミラーゼでは枝切り効果がほとんど認められなかったのに対して、六重変異体イソアミラーゼでは枝切り効果が認められ、歩留まりの向上が認められた。

Claims (7)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されており、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるイソアミラーゼにおいて、少なくともＶ５１５Ｐ及びＭ５７０Ｌのアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
2. さらに、Ｓ２３９Ｎ、Ｔ２４１Ａ、Ｇ５３４Ｄ及びＳ６０１Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有する請求項１記載のイソアミラーゼ。
3. 請求項１又は２に記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
4. 請求項３記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
5. 請求項４記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
6. 請求項５記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
7. デンプンに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼから選ばれる酵素と、請求項１又は２に記載のイソアミラーゼとを作用させることを特徴とするマルトースの製造法。

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