WO2016088870A1 - 耐熱性イソアミラーゼ - Google Patents

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WO2016088870A1
WO2016088870A1 PCT/JP2015/084118 JP2015084118W WO2016088870A1 WO 2016088870 A1 WO2016088870 A1 WO 2016088870A1 JP 2015084118 W JP2015084118 W JP 2015084118W WO 2016088870 A1 WO2016088870 A1 WO 2016088870A1
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isoamylase
amino acid
mutant
seq
acid sequence
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博文 堀口
愛 伊豫谷
一磨 塩田
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合同酒精株式会社
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    • C13K7/00—Maltose

Definitions

  • the present invention relates to a mutant isoamylase with improved heat resistance and a method for producing maltose using the mutant isoamylase.
  • pullulanase and isoamylase produced by Klebsiella pneumoniae and the like are known as enzymes that hydrolyze ⁇ -1,6-glucopyranoside bonds in starch and amylopectin.
  • pullulanase is a reversible reaction in the presence of a high concentration substrate of 20% (w / v) or more, that is, maltose is polymerized to produce tetrasaccharide, or maltose is transferred to amylose. Therefore, when maltose is produced in combination with ⁇ -amylase, high-purity maltose cannot be produced.
  • isoamylase is an enzyme that hydrolyzes ⁇ -1,6-glucopyranoside bonds in starch, amylopectin, and glycogen, and is known to be able to produce high-purity maltose because no reversible reaction is observed.
  • isoamylase-producing bacteria Pseudomonas amyloderamosa, Flavobacterium odoratum (currently Naxibacter ⁇ haematophilus), etc. have been reported, but these isoamylases are not compatible with various amylases used in combination, such as optimum pH and optimum temperature. , Cann't show enough ability.
  • starch sugar is produced under mildly acidic conditions of pH 5.0 to 6.0 at a high temperature of 50 ° C. or higher, which is a suitable condition for other amylases.
  • isoamylase produced by Pseudomonas amyloderamosa is Appropriate pH is in the acidic range of 3.0 to 4.0 (Non-patent Document 1), and it was difficult to use malt ⁇ -amylase, bacterial ⁇ -amylase and ⁇ -amylase with low acid resistance.
  • isoamylase produced by Flavobacterium odoratum (currently Naxibacter haematophilus) and the like although the optimum pH is consistent with various amylases used together, the optimum temperature is as low as 40 to 45 ° C (Non-patent Documents 2 and 3) Combined use with various amylases was difficult.
  • an object of the present invention is to provide a new isoamylase having an improved optimum temperature, that is, improved heat resistance, and a method for producing maltose using the same.
  • the present inventor manufactured a protein in which a part of the amino acid sequence of isoamylase produced by the aforementioned Flavobacterium odoratum and the like was modified, and examined its heat resistance. As a result, two or more specific positions were changed to other amino acids. The present inventors have found that a mutant isoamylase having improved heat resistance of 5 ° C. to 10 ° C. can be obtained by mutation.
  • the present invention provides the following [1] to [9].
  • An isoamylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an isoamylase in which one to several amino acid residues are deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, An isoamylase in which at least amino acid number 515 valine and 570 methionine are mutated to other amino acids.
  • one or more amino acid residues selected from serine of amino acid number 239, threonine of 241, glycine of 534, and serine of 601 are mutated to other amino acids. amylase.
  • [8] A method for producing isoamylase comprising culturing the transformant according to [7] and collecting isoamylase from the culture.
  • a method for producing maltose comprising reacting an enzyme selected from ⁇ -amylase and ⁇ -amylase with the isoamylase according to any one of [1] to [4] on starch.
  • the isoamylase of the present invention has improved heat resistance of 5 ° C. or more, and overlaps with the optimum temperature of other various amylases. Therefore, the isoamylase of the present invention can industrially advantageously produce high-purity maltose by acting on starch and the like in combination with various amylases.
  • FIG. 5 shows the pH stability of native and hexafold mutant enzymes. It is a figure which shows the heat resistance improvement in the presence of calcium of a native and sixfold mutant enzyme.
  • the isoamylase of the present invention is an isoamylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or one to several amino acid residues are deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the isoamylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an isoamylase produced by Flavobacterium odoratum (currently Naxibacter haematophilus) described in Non-Patent Documents 2 and 3.
  • This isoamylase includes isoamylases not derived from Flavobacterium odoratum as long as they have the same amino acid sequence. Moreover, as long as it has the same amino acid sequence, not only polypeptide but glycopeptide is contained.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the mature protein.
  • the number of amino acid residue deletions, substitutions or insertions in an isoamylase in which 1 to several amino acid residues are deleted, substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 1.
  • it is not limited as long as it shows an enzyme activity equivalent to the isoamylase consisting of the amino acid sequence represented, it is preferably 1-20, more preferably 1-10, and even more preferably 1-8.
  • the identity between the deleted, substituted or inserted isoamylase and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and 95% or more. Further preferred.
  • sequence identity percentage can be calculated using publicly available or commercially available software with an algorithm that compares the reference sequence as a query sequence.
  • BLAST, FASTA, or GENETYX manufactured by Software Development Co., Ltd.
  • the isoamylase of the present invention is obtained by mutating at least valine at amino acid number 515 and methionine at 570 of the isoamylase to other amino acids.
  • the amino acid numbers 515 and 570 may change.
  • a valine corresponding to 515 valine and a methionine corresponding to 570 methionine are mutated to other amino acids.
  • amino acid numbers 239, 241, 534, and 601 described later which are positions where amino acids corresponding to the amino acids before mutation are present.
  • amino acid number 515 examples include V515P, V515I, V515L, V515G, and V515A, with V515P and V515I being more preferable, and V515P being more preferable.
  • amino acids of amino acid number 570 include leucine, isoleucine, valine, alanine and proline, leucine, isoleucine, valine and alanine are more preferable, and leucine is more preferable.
  • examples of the mutation at amino acid number 570 include M570L, M570I, M570V, M570A, and M570P. M570L, M570I, M570V, and M570A are more preferable, and M570L is more preferable.
  • the isoamylase of the present invention has a heat resistance improvement of 5% or more because at least two of valine at amino acid number 515 and methionine at 570 are mutated to other amino acids. With only one mutation, the improvement in heat resistance is not sufficient.
  • amino acid residues selected from serine of amino acid number 239, threonine of 241, glycine of 534 and serine of 601 were mutated to other amino acids in addition to the above two locations It is preferable.
  • amino acids after the mutation of serine of amino acid number 239 asparagine and glutamine are exemplified, and asparagine is more preferable. Therefore, examples of the mutation of amino acid number 239 include S239N and S239Q, and S239N is more preferable.
  • Examples of other amino acids after mutation of threonine of amino acid number 241 include alanine, serine, and glycine, and alanine is more preferable. Therefore, examples of the mutation at amino acid number 241 include T241A, T241S, and T241G, and T241A is more preferable.
  • amino acids after the mutation of glycine with amino acid number 534 include aspartic acid, glutamic acid, asparagine, and glutamine, with aspartic acid and glutamic acid being more preferable, and aspartic acid being further preferable. Accordingly, examples of the mutation at amino acid number 534 include G534D, G534E, G534N, and G534Q. G534D and G534E are more preferable, and G534D is more preferable.
  • amino acids after the mutation of serine of amino acid number 601 include threonine, alanine, glycine, asparagine, and valine, threonine, alanine, and glycine are more preferable, and threonine is more preferable. Therefore, examples of the mutation of amino acid number 601 include S601T, S601A, S601G, S601N, and S610V, S601T, S601A, and S601G are more preferable, and S601T is more preferable.
  • amino acid mutations of amino acid numbers 239, 241, 534, and 601 may be one or more, but in addition to the above-mentioned 515 and 570, mutation of 241; mutation of 241 and 601; mutation of 239, 241 and 601 Mutation; or 239, 241, 534, and 601 mutations are preferred from the viewpoint of improving heat resistance.
  • Examples of more preferable multiple mutations include V515P / M570L, T241A / V515P / M570L, T241A / V515P / M570L / S601T, S239N / T241A / V515P / M570L / S601T, S239N / T241A / V515P / T570 / 535S It is done.
  • the mutant isoamylase of the present invention is an isoamylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or one to several amino acid residues deleted or substituted or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • valine of amino acid number 515 and methionine of 570 are substituted with other amino acids, and if necessary, one or more amino acid residues selected from 239 serine, 241 threonine, 534 glycine and 601 serine It can be produced using a gene constructed by substituting a group with another amino acid.
  • the gene for producing the mutant isoamylase of the present invention is a gene having a base sequence encoding the above-mentioned mutant isoamylase.
  • the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 should be substituted. It can be constructed by substituting a base sequence encoding an amino acid sequence with a base encoding a desired amino acid residue. Various methods for such site-specific base sequence substitution are well known in the art, and can be performed, for example, by PCR using appropriately designed primers. Alternatively, a gene encoding a modified amino acid sequence may be totally synthesized.
  • the gene thus obtained is inserted into an appropriate expression vector, and this is transformed into an appropriate host (for example, E. coli).
  • an appropriate host for example, E. coli.
  • Many vector / host systems for expressing foreign proteins are known in the art.
  • Examples of the expression vector for incorporating the mutant isoamylase gene include plasmid vectors.
  • Examples of the expression vector for Escherichia coli include pET-14b and pBR322.
  • Examples of Bacillus subtilis include pUB110.
  • filamentous fungi include pPTRI.
  • pRS403 etc. are mentioned for yeast use.
  • the obtained recombinant plasmid is transformed into microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, filamentous fungi and yeast, and the transformant is cultured to obtain the mutant isoamylase of the present invention.
  • the isoamylase of the present invention has improved heat resistance by 5 ° C to 10 ° C compared to the isoamylase produced by Flavobacterium odoratum, etc., and the optimum pH, isoamylase activity, calcium dependency, etc. are produced by Flavobacterium odoratum etc. It is equivalent to isoamylase. Therefore, high purity maltose can be easily obtained by reacting starch with an enzyme selected from ⁇ -amylase and ⁇ -amylase and the isoamylase of the present invention.
  • ⁇ -amylase GODO-GBA2 (joint sake spirit Co., Ltd.), Optimalto BBA (Danisco Japan Co., Ltd.), ⁇ -amylase L / R (Nagase ChemteX Corporation), Hymaltocin GL (HIBI Co., Ltd.), etc. Can be used.
  • ⁇ -amylase for example, Christase T10 (Daiwa Kasei Co., Ltd.) can be used.
  • the reaction is performed, for example, by adding the enzyme to a starch saccharifying enzyme such as starch and amylase, and mixing and stirring under the pH and temperature conditions at which the enzyme acts.
  • a starch saccharifying enzyme such as starch and amylase
  • high-purity maltose can be produced industrially advantageously.
  • Example 1 (Partial specific mutagenesis of isoamylase) A fragment of about 1.5 kb was obtained using pHSG398 (Takara Bio Inc.) as a template and primers MLUPHSG398-F (CGACGCGTGGCCAGGAACCGTAAAAAG (SEQ ID NO: 2)) and XBAPHSG398-R (GCTCTAGATTTAAGGGCACCAATAACTGC (SEQ ID NO: 3)). This fragment was digested with restriction enzymes Xba I and Mlu I, and ligated with an approximately 2.5 kb Xba I and Mlu I fragment containing the isoamylase gene on the Flavobacterium odoratum genome to obtain p-ML.
  • Site-directed mutagenesis was performed on plasmid p-ML, which is an expression plasmid for native isoamylase, to obtain double mutant (V515P / M570L) expression plasmid p-W. Furthermore, site-directed mutagenesis was performed on this, and the quadruple mutant (T241A / V515P / M570L / S601T) expression plasmid pQ and the sixfold mutant (S239N / T241A / V515P / G534D / M570L / S601T) expression plasmid p -Obtained S.
  • Example 2 (Production of enzyme) Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with native isoamylase expression plasmid p-ML, double mutant expression plasmid pW, quadruple mutant expression plasmid pQ, and hexafold mutant expression plasmid pS. An E. coli strain producing isoamylase was obtained. These E. coli were cultured in LB medium (yeast extract 0.5%, tryptone 1.0%, sodium chloride 0.5% pH 7.2) containing 30 ⁇ g / ml chloramphenicol for 3 days at 30 ° C. 1 L of culture solution was obtained.
  • LB medium yeast extract 0.5%, tryptone 1.0%, sodium chloride 0.5% pH 7.2
  • the cells After removing the cells by centrifugation (10,000 g, 10 minutes), the cells were concentrated to 10,000 U / ml by UF concentration (AIP module manufactured by Asahi Kasei Corporation). These were sterilized with a membrane having a pore size of 0.2 ⁇ m to obtain enzyme solutions of native isoamylase, double mutant isoamylase, quadruple mutant isoamylase, and six mutant isoamylase.
  • Example 3 (Improvement of thermal stability of each mutant) After keeping these at 45 ° C, 47.5 ° C, 50 ° C, 52.5 ° C, 55 ° C, 57.5 ° C, 60 ° C, 62.5 ° C, 65 ° C, 67.5 ° C, 70 ° C for 10 minutes The remaining activity was measured.
  • the method for measuring the activity of isoamylase is as follows. To 0.35 ml of 0.5% waxy corn starch solution, 0.1 ml of 0.5 M acetate buffer (pH 6.0) is mixed, and 0.1 ml of enzyme solution diluted appropriately is added and reacted at 45 ° C. for 15 minutes. Thereafter, 0.5 ml of an iodine solution (0.5 M potassium iodide solution containing 0.05 M iodine) diluted 5 times with 0.1 N HCl was added to stop the enzyme reaction, and 10 ml of water was added and sufficiently stirred. Then, it measures at 610 nm using a spectrophotometer.
  • a iodine solution 0.5 M potassium iodide solution containing 0.05 M iodine
  • the unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that increases 0.01 absorbance per minute under the above conditions. As a result, as shown in FIG. 1, improvement in heat resistance of about 5 ° C. for the double mutant, about 8 ° C. for the quadruple mutant, and about 10 ° C. for the hexa mutant was confirmed.
  • Example 4 Increase of optimum temperature
  • the optimum temperature of the native enzyme is usually 45 ° C, but for the native and each mutant enzyme obtained, 47.5 ° C, 50 ° C, 52.5 ° C, 55 ° C, 57.5 ° C, 60 ° C.
  • the activity at 5 ° C., 62.5 ° C., 65 ° C., 67.5 ° C., and 70 ° C. was measured by the method described in Example 3.
  • the optimum temperature was increased as the double mutant, quadruple mutant, and hexafold mutant were multiplexed.
  • Example 5 The pH stability was examined for native and hexafold mutants. Native and hexafold mutants at pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, respectively, and sixfold mutant 60 ° C, native 52.5 ° C And held for 10 minutes, and then rapidly cooled, and the residual activity was measured by the method described in Example 3. As a result, as shown in FIG. 3, there was no significant change in the optimum pH range due to the amino acid modification.
  • Example 6 (Calcium dependence) The native and hexafold mutants were examined for calcium dependence on heat resistance. Native and hexafold mutants were treated at 35 ° C., 40 ° C., 45 ° C. in 20 mM acetate buffer (pH 6.0) with 10 mM calcium chloride or 20 mM acetate buffer (pH 6.0) without calcium chloride. C., 50.degree. C., 55.degree. C., and 60.degree. C. for 10 minutes, and then rapidly cooled and the residual activity was measured by the method described in Example 3. As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that both the native and hexafold mutants have high heat resistance in the presence of calcium.
  • Example 7 (Production of maltose syrup) A maltose purification test from dextrin was conducted. Dissolve Paindex # 100 (manufactured by Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.) as a dextrin in 10 mM acetate buffer (pH 6.0) as Brix30, and (1) GODO-GBA2 (manufactured by Godo Shusei Co., Ltd.) .2 mg added, (2) 0.2 mg of GODO-GBA2 per dextrin and 400 U of native isoamylase per dextrin, (3) 0.2 mg of GODO-GBA2 per g of dextrin and 6-fold mutant Isoamylase added with 400 U / g dextrin was reacted at 60 ° C.
  • the maltose concentration was (1) 15.4%, (2) 23.4%, (3) 25.4%, and the amount of maltose produced was the highest when the hexafold mutant isoamylase was used.
  • the reaction temperature was performed at 62 ° C. in order to further prevent contamination with bacteria during the reaction, the maltose concentrations were (1) 14.0%, (2) 14.7%, and (3) 21.1%.
  • the native isoamylase showed almost no debranching effect, whereas the six-fold mutant isoamylase showed a debranching effect and improved yield.

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Abstract

　耐熱性が向上したイソアミラーゼ、及びデンプンからマルトースの工業的生産方法の提供。　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼ。

Description

耐熱性イソアミラーゼ
　本発明は、耐熱性が向上した変異イソアミラーゼ、及び変異イソアミラーゼを用いるマルトースの製造法に関する。
　糖化工業において、デンプンやアミロペクチン中のα－１，６－グルコピラノシド結合を加水分解する酵素として、Klebsiella pneumoniaeなどが生産するプルラナーゼ及びイソアミラーゼが知られている。このうち、プルラナーゼは、２０％（ｗ／ｖ）以上という高濃度基質存在下では、可逆的な反応、つまりマルトースを重合して４糖を生成したり、また、マルトースをアミロースに転移させたりするため、β－アミラーゼと併用してマルトースを製造する場合、高い純度のマルトースを製造することができない。
　一方、イソアミラーゼは、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン中のα－１，６－グルコピラノシド結合を加水分解する酵素であり、可逆的な反応が見られないため、高純度のマルトースが生産できることが知られている。イソアミラーゼ生産菌としては、Pseudomonas amyloderamosa、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）などが報告されているが、これらのイソアミラーゼは、至適ｐＨや至適温度などが、併用される各種アミラーゼと合致しないため、十分な能力を発揮できなかった。一般にデンプン糖の生産は、他のアミラーゼの好適条件である５０℃以上の高温でｐＨ５．０～６．０の弱酸性条件下で行われているが、Pseudomonas amyloderamosaが生産するイソアミラーゼは、至適ｐＨが３．０～４．０と酸性領域に片寄っており（非特許文献１）、耐酸性の弱い麦芽β－アミラーゼや細菌β－アミラーゼ及びα－アミラーゼとは併用が困難であった。また、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）などが生産するイソアミラーゼは、至適ｐＨは併用される各種アミラーゼと合致するものの、至適温度が４０～４５℃と低く（非特許文献２、３）、各種アミラーゼとの併用が困難であった。
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　デンプン等の多糖類から高純度のマルトースを工業的に製造するには、β－アミラーゼ等のアミラーゼとイソアミラーゼを併用することが望まれているが、Flavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼの至適温度は他のアミラーゼの至適温度よりも低く、併用できなかった。
　従って、本発明の課題は、より至適温度が向上した、すなわち耐熱性が向上した新たなイソアミラーゼ、及びこれを用いたマルトースの製造法を提供することにある。
　そこで本発明者は、前記のFlavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼのアミノ酸配列の一部を改変したタンパク質を製造し、その耐熱性を検討したところ、特定の位置の２ヶ所以上を他のアミノ酸に変異させることにより耐熱性が５℃～１０℃向上した変異イソアミラーゼが得られることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［９］を提供するものである。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼ。
［２］アミノ酸変異が、Ｖ５１５Ｐ及びＭ５７０Ｌである［１］記載のイソアミラーゼ。
［３］さらに、アミノ酸番号２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異した［１］又は［２］記載のイソアミラーゼ。
［４］アミノ酸変異が、Ｓ２３９Ｎ、Ｔ２４１Ａ、Ｇ５３４Ｄ及びＳ６０１Ｔから選ばれる１又は２以上である［３］記載のイソアミラーゼ。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
［６］［５］記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
［７］［６］記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
［８］［７］記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
［９］デンプンに、β－アミラーゼ、α－アミラーゼから選ばれる酵素と、［１］～［４］のいずれかに記載のイソアミラーゼとを作用させることを特徴とするマルトースの製造法。
　本発明のイソアミラーゼは、耐熱性が５℃以上向上しており、他の各種アミラーゼの至適温度と重複する。従って、本発明のイソアミラーゼは、各種アミラーゼと併用してデンプン等に作用させることにより、高純度のマルトースを工業的に有利に生産することができる。
ネイティブおよび各変異体酵素の熱安定性を示す図である。 ネイティブおよび各変異体酵素の至適温度を示す図である。 ネイティブおよび六重変異体酵素のｐＨ安定性を示す図である。 ネイティブおよび六重変異体酵素のカルシウム存在下での耐熱性向上を示す図である。
　本発明のイソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼである。
　ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼは、非特許文献２及び３に記載された、Flavobacterium odoratum（現Naxibacter haematophilus）が産生するイソアミラーゼである。このイソアミラーゼには、同一のアミノ酸配列を有する限り、Flavobacterium odoratum由来でないイソアミラーゼが含まれる。また、同一アミノ酸配列を有する限り、ポリペプチドだけでなく、糖ペプチドも含まれる。なお、配列番号１は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおける、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１～２０個が好ましく、１～１０個がさらに好ましく、１～８個がさらに好ましい。また、当該欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼと配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができる。
　本発明のイソアミラーゼは、少なくとも前記イソアミラーゼのアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したものである。なお、配列番号１のアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼの場合には、当該アミノ酸番号５１５及び５７０は、変化する場合があるが、その場合、５１５のバリンに相当するバリン、及び５７０のメチオニンに相当するメチオニンが、他のアミノ酸に変異したものである。これは、後記のアミノ酸番号２３９、２４１、５３４及び６０１についても同様であり、変異前のアミノ酸に相当するアミノ酸が存在する位置である。
　ここで、他のアミノ酸としては、アミノ酸番号５１５については、プロリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、アラニンが挙げられ、プロリン、イソロイシンがより好ましく、プロリンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５１５の変異としては、Ｖ５１５Ｐ、Ｖ５１５Ｉ、Ｖ５１５Ｌ、Ｖ５１５Ｇ、Ｖ５１５Ａが挙げられ、Ｖ５１５Ｐ、Ｖ５１５Ｉがより好ましく、Ｖ５１５Ｐがさらに好ましい。
　また、アミノ酸番号５７０の他のアミノ酸については、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリンが挙げられ、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンがより好ましく、ロイシンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５７０の変異としては、Ｍ５７０Ｌ、Ｍ５７０Ｉ、Ｍ５７０Ｖ、Ｍ５７０Ａ、Ｍ５７０Ｐが挙げられ、Ｍ５７０Ｌ、Ｍ５７０Ｉ、Ｍ５７０Ｖ、Ｍ５７０Ａがより好ましく、Ｍ５７０Ｌがさらに好ましい。
　本発明のイソアミラーゼは、少なくともアミノ酸番号５１５のバリンと５７０のメチオニンの２ヶ所が他のアミノ酸に変異していることにより５％以上の耐熱性向上が得られる。一方のみの変異では、耐熱性の向上は十分でない。
　本発明のイソアミラーゼは、上記２ヶ所以外に、さらに、アミノ酸番号２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異したものであるのが好ましい。
　ここで、アミノ酸番号２３９のセリンの変異後の他のアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、アスパラギンがより好ましい。従って、アミノ酸番号２３９の変異としては、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑが挙げられ、Ｓ２３９Ｎがより好ましい。
　アミノ酸番号２４１のスレオニンの変異後の他のアミノ酸としては、アラニン、セリン、グリシンが挙げられ、アラニンがより好ましい。従って、アミノ酸番号２４１の変異としては、Ｔ２４１Ａ、Ｔ２４１Ｓ、Ｔ２４１Ｇが挙げられ、Ｔ２４１Ａがより好ましい。
　アミノ酸番号５３４のグリシンの変異後の他のアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、アスパラギン酸、グルタミン酸がより好ましく、アスパラギン酸がさらに好ましい。従って、アミノ酸番号５３４の変異としては、Ｇ５３４Ｄ、Ｇ５３４Ｅ、Ｇ５３４Ｎ、Ｇ５３４Ｑが挙げられ、Ｇ５３４Ｄ、Ｇ５３４Ｅがより好ましく、Ｇ５３４Ｄがさらに好ましい。
　アミノ酸番号６０１のセリンの変異後の他のアミノ酸としては、スレオニン、アラニン、グリシン、アスパラギン、バリンが挙げられ、スレオニン、アラニン、グリシンがより好ましく、スレオニンがさらに好ましい。従って、アミノ酸番号６０１の変異としては、Ｓ６０１Ｔ、Ｓ６０１Ａ、Ｓ６０１Ｇ、Ｓ６０１Ｎ、Ｓ６１０Ｖが挙げられ、Ｓ６０１Ｔ、Ｓ６０１Ａ、Ｓ６０１Ｇがより好ましく、Ｓ６０１Ｔがさらに好ましい。
　また、アミノ酸番号２３９、２４１、５３４及び６０１のアミノ酸変異は、１又は２以上であればよいが、前記５１５及び５７０に加えて、２４１の変異；２４１及び６０１の変異；２３９、２４１及び６０１の変異；又は２３９、２４１、５３４及び６０１の変異がされているのが、耐熱性向上の点で好ましい。
　より好ましい多重変異の例としては、Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ、Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ、Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ、Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ、Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｇ５３４Ｄ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔが挙げられる。
　本発明の変異イソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、アミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に置換し、必要によりさらに２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換することにより構築した遺伝子を用いて製造することができる。
　本発明の変異イソアミラーゼを製造するための遺伝子は、前記の変異イソアミラーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子であり、例えば前記の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸配列をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
　このようにして得た遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られている。変異イソアミラーゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ－１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。
　得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母等の微生物に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明変異イソアミラーゼが得られる。
　本発明のイソアミラーゼは、Flavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼに比べて耐熱性が５℃～１０℃向上しており、かつ至適ｐＨ、イソアミラーゼ活性、　カルシウム依存性等はFlavobacterium odoratumなどが生産するイソアミラーゼと同等である。従って、デンプンに、β－アミラーゼ、α―アミラーゼから選ばれる酵素と、本発明イソアミラーゼとを作用させれば、高純度のマルトースが容易に得られる。ここでβ－アミラーゼとしては、ＧＯＤＯ－ＧＢＡ２（合同酒精株式会社）、オプチマルトＢＢＡ（ダニスコジャパン株式会社）、β－アミラーゼＬ／Ｒ（ナガセケムテックス株式会社）、ハイマルトシンＧＬ（エイチビィアイ株式会社）等を用いることができる。また、α－アミラーゼとしては、例えばクライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。
　反応は、例えばデンプンおよびアミラーゼ等のデンプン糖化酵素に前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、高純度のマルトースを工業的に有利に製造することができる。
　次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
実施例１（イソアミラーゼの部分特異的変異導入）
　pHSG398（タカラバイオ株式会社）をテンプレートとして、プライマーMLUPHSG398-F（CGACGCGTGGCCAGGAACCGTAAAAAG（配列番号２））およびXBAPHSG398-R（GCTCTAGATTTAAGGGCACCAATAACTGC（配列番号３））を用いて約１．５ｋｂの断片を取得した。この断片を制限酵素Ｘｂａ　Ｉ及びＭｌｕ　Ｉで消化し、Flavobacterium odoratumゲノム上のイソアミラーゼ遺伝子を含む約２．５ｋｂのＸｂａ　Ｉ及びＭｌｕ　Ｉ断片とライゲーションすることにより、ｐ－ＭＬを取得した。ネイティブのイソアミラーゼの発現プラスミドであるプラスミドｐ－ＭＬに部位特異的変異導入を行い、二重変異体（Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ）発現プラスミドｐ－Ｗを取得した。さらにこれに部位特異的変異導入を行い、四重変異体（Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ）発現プラスミドｐ－Ｑ及び六重変異体（Ｓ２３９Ｎ／Ｔ２４１Ａ／Ｖ５１５Ｐ／Ｇ５３４Ｄ／Ｍ５７０Ｌ／Ｓ６０１Ｔ）発現プラスミドｐ－Ｓを取得した。
実施例２（酵素の生成）
　ネイティブイソアミラーゼ発現プラスミドｐ－ＭＬ、二重変異体発現プラスミドｐ－Ｗ、四重変異体発現プラスミドｐ－Ｑ、及び六重変異体発現プラスミドｐ－Ｓにより大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、それぞれのイソアミラーゼを生産する大腸菌株を取得した。これらの大腸菌を３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むLB培地（酵母エキス ０．５％、トリプトン１．０％、塩化ナトリウム ０．５％ ｐＨ ７．２）で、３０℃　３日培養し、培養液１Ｌを得た。遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）により菌体を除去した後、UF濃縮（旭化成社製　ＡＩＰモジュール）により、１０，０００Ｕ／ｍｌとなるように濃縮した。これらを０．２μｍのポアサイズの膜で除菌することにより、ネイティブイソアミラーゼ、二重変異体イソアミラーゼ、四重変異体イソアミラーゼ、六重変異体イソアミラーゼの酵素溶液とした。
実施例３（各変異体の熱安定性向上）
　これらを４５℃、４７．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃、６７．５℃、７０℃に１０分間保ったのちに急冷し、残存活性を測定した。
＜活性測定方法＞
　イソアミラーゼの活性測定法は、以下のとおりである。
　０．５％ワキシーコーンスターチ溶液０．３５ｍｌに、０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌを混合し、適時希釈した酵素液を０．１ｍｌ加え、４５℃で１５分間反応させる。その後、０．１Ｎ　ＨＣｌ　にて５倍希釈したヨード溶液（０．０５Ｍヨウ素を含む０．５Ｍヨウ化カリウム溶液）０．５ｍｌを加えて酵素反応を止め、１０ｍｌの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下で１分間に０．０１吸光度を増加する酵素量を１単位とした。
　その結果、図１に示すように、二重変異体で約５℃、四重変異体で約８℃、六重変異体で約１０℃の耐熱性の向上が確認された。
実施例４（至適温度の上昇）
　また、通常ネイティブの酵素の至適温度は４５℃であるが、ネイティブおよび得られた各変異体酵素について、４７．５℃、５０℃、５２．５℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃、６７．５℃、７０℃での活性を実施例３に記載の方法で測定した。
　その結果、図２に示すように、二重変異体、四重変異体、六重変異体と変異を多重化するにつれて至適温度の上昇が認められた。
実施例５（至適ｐＨ）
　ネイティブ及び六重変異体についてｐＨ安定性を調べた。ネイティブ及び六重変異体をｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０の各ｐＨで六重変異体６０℃、ネイティブ５２．５℃で１０分間保持後、急冷し残存活性を実施例３に記載の方法で測定した。
　その結果、図３に示すように、アミノ酸の改変による至適ｐＨ域の大きな変動は認められなかった。
実施例６（カルシウム依存性）
　ネイティブ及び六重変異体について、耐熱性に関するカルシウム依存性を調べた。ネイティブ及び六重変異体を、１０ｍＭ塩化カルシウムを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）もしくは塩化カルシウムを含まない２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃で１０分間保温後、急冷し残存活性を実施例３に記載の方法で測定した。
　その結果、図４に示すように、ネイティブおよび六重変異体ともにカルシウム存在下で耐熱性が高いことが認められた。
実施例７（マルトースシロップの製造）
　デキストリンからのマルトース精製試験を行った。１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にＢｒｉｘ３０となるようにデキストリンとしてパインデックス＃１００（松谷化学工業社製）を溶解し、（１）ＧＯＤＯ－ＧＢＡ２（合同酒精株式会社製）をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇ添加したもの、（２）ＧＯＤＯ－ＧＢＡ２をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇおよびネイティブイソアミラーゼをデキストリン１ｇあたり４００Ｕ添加したもの、（３）ＧＯＤＯ－ＧＢＡ２をデキストリン１ｇあたり０．２ｍｇおよび六重変異体イソアミラーゼをデキストリン１ｇあたり４００Ｕ添加したもの、それぞれを６０℃で２４時間反応させた。
　１００℃、５分間加熱し反応を停止させ、生成したマルトース量について、高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製２６９５）を用い、ＲＩ検出器（ウォーターズ社製２４１４）、ＣＡＲＢＯＳｅｐ　ＣＨＯ－６２０ＣＡ（トランスジェノミック社製）カラム温度８５℃、水を溶離液として流速０．５ｍｌ／分にて測定した。
　その結果、マルトース濃度は（１）１５．４％、（２）２３．４％、（３）２５．４％となり、六重変異体イソアミラーゼを使用した場合に最もマルトース生成量が高かった。
　また、反応中の雑菌汚染をより防止するために反応温度を６２℃で行ったところ、マルトース濃度は（１）１４．０％、（２）１４．７％、（３）２１．１％となり、ネイティブイソアミラーゼでは枝切り効果がほとんど認められなかったのに対して、六重変異体イソアミラーゼでは枝切り効果が認められ、歩留まりの向上が認められた。

Claims (9)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、少なくともアミノ酸番号５１５のバリン及び５７０のメチオニンが他のアミノ酸に変異したイソアミラーゼ。
  2. 　アミノ酸変異が、Ｖ５１５Ｐ及びＭ５７０Ｌである請求項１記載のイソアミラーゼ。
  3. 　さらに、アミノ酸番号２３９のセリン、２４１のスレオニン、５３４のグリシン及び６０１のセリンから選ばれる１又は２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸に変異した請求項１又は２記載のイソアミラーゼ。
  4. 　アミノ酸変異が、Ｓ２３９Ｎ、Ｔ２４１Ａ、Ｇ５３４Ｄ及びＳ６０１Ｔから選ばれる１又は２以上である請求項３記載のイソアミラーゼ。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
  6. 　請求項５記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
  7. 　請求項６記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
  8. 　請求項７記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
  9. 　デンプンに、β－アミラーゼ、α―アミラーゼから選ばれる酵素と、請求項１～４のいずれかに記載のイソアミラーゼとを作用させることを特徴とするマルトースの製造法。
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