CN117320561A - 加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种加工技术，该加工技术在燕麦饮食品或食品原材料的加工中，在抑制源自燕麦的β‑葡聚糖的分解的同时能够进行蛋白质脱酰胺反应。根据包括利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下对未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序的加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法，在抑制源自燕麦的β‑葡聚糖的分解的同时能够进行蛋白质脱酰胺反应。

Description

加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法
技术领域
本发明涉及一种燕麦饮食品或食品原材料的加工技术。具体而言，本发明涉及一种在抑制源自燕麦的β-葡聚糖的分解的同时能够进行蛋白质脱酰胺反应的加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法。
背景技术
以近年的健康热潮、对过敏问题的应对、宗教上的理由、伴随着传染病扩大等的外出克制的机会增大等各种背景为理由，作为含有动物性蛋白质饮食品的替代品，营养丰富且保存时间长的含有植物性蛋白质饮食品的人气增高。
其中，由于蛋白质、脂质、β-葡聚糖、以及矿物质等营养价值丰富，燕麦作为含有植物性蛋白质的饮食品的材料受到长久关注，研究了其加工方法。
例如，专利文献1中公开了如下技术：为了得到“一种酶制剂，其通过更经济且更省时的方法水解谷物淀粉，同时制造可以保持天然谷物风味品质和芳香品质的谷物悬浮物产品，其中，能够将粘度、糖含量、以及整体的质地调节或改善为合适的最终产品”，利用β-淀粉酶和α-淀粉酶在约54℃～57℃对燕麦悬浮液进行处理。
另一方面，燕麦中含有β-葡聚糖酶，因此在燕麦加工过程中β-葡聚糖酶使β-葡聚糖减少。因此，为了得到富含β-葡聚糖的燕麦饮食品，需要使β-葡聚糖酶失活。
β-葡聚糖酶的失活采用加热处理。例如，专利文献2中公开了为了得到β-葡聚糖丰富的组合物，在85℃～110℃处理燕麦。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2002-527089号公报
专利文献2：美国专利第7494683号说明书
发明内容
发明所要解决的技术问题
为了能够高效摄取燕麦包含的营养素，除了通过β-葡聚糖酶的失活来增加β-葡聚糖的量以外，还希望能够进行通过蛋白质增溶而使可溶性蛋白质增量等的加工。
在此，有时在饮食品材料的加工中使用蛋白质脱酰胺酶。蛋白质脱酰胺酶具有不伴随肽键的切断以及蛋白质的交联而分解蛋白质的含酰胺基侧链的作用，利用该作用，能够用于饮食品材料中的蛋白质的增溶等。
但是，为了使β-葡聚糖增量而用于使β-葡聚糖酶失活的热处理，同时会使用于增量可溶性蛋白质的蛋白质脱酰胺酶失活。即，本质上无法兼顾用于得到丰富的β-葡聚糖的手段即酶失活和用于享受蛋白质脱酰胺反应带来的增溶效果等效果的手段即酶处理。
因此，本发明的目的在于提供一种加工技术，该加工技术在燕麦饮食品或食品原材料的加工中，在抑制源自燕麦的β-葡聚糖的分解的同时能够进行蛋白质脱酰胺反应。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人出乎意料地发现，在65℃～75℃这样的极其有限的温度条件下使蛋白质脱酰胺酶作用于燕麦饮食品材料的情况下，不会使蛋白质脱酰胺酶失活，而能够使β-葡聚糖酶失活。本发明是基于这些见解进一步反复研究而完成的。
即，本发明提供下述揭示的方式的发明。
项1.一种加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法，所述制造方法包括利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下对未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序。
项2.根据项1所述的制造方法，其中，所述蛋白质脱酰胺酶为源自解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶。
项3.根据项1所述的制造方法，其中，所述蛋白质脱酰胺酶为包含以下(1)至(3)中任一项所示的多肽的蛋白质谷氨酰胺酶：
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及
(3)相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
项4.根据项1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述燕麦饮食品或食品原材料为燕麦奶。
项5.一种蛋白质脱酰胺化剂，包含蛋白质脱酰胺酶，其在65℃～75℃的温度条件下使用，以使未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料在抑制β葡聚糖分解的同时进行蛋白质脱酰胺化。
发明效果
根据本发明，提供一种加工技术，该加工技术在燕麦饮食品或食品原材料的加工中，在抑制源自燕麦的β-葡聚糖的分解的同时能够进行蛋白质脱酰胺反应。
附图说明
图1是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的纯化级分的SDS-PAGE图像。
图2是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的纯化级分的SDS-PAGE图像。
图3是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株以及61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的温度稳定性试验结果。
图4是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株以及61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适温度试验结果。
图5是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株以及61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的pH稳定性试验结果。
图6是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株以及61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适pH试验结果。
图7表示试验例中得到的加工燕麦奶的β-葡聚糖量。
图8表示试验例中得到的加工燕麦奶的蛋白质脱酰胺化率。
具体实施方式
1.加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法
本发明的加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法具有如下特征：包含利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下对未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序。以下，对本发明的加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法进行详述。
1-1.燕麦饮食品或食品原材料
在本发明中，燕麦饮食品或食品原材料是指在供于利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下进行处理的工序时预先准备的材料。在本发明中，使用没有事先进行加热处理(以下，也记载为“预加热处理”)的燕麦饮食品或食品原材料。这里所说的预加热处理是指有时在燕麦饮食品或食品原材料的制备中进行的、为了使燕麦中包含的酶失活而进行的加热处理。该酶中至少包含β-葡聚糖酶，进而，也可以包含脂肪酶、脂氧合酶等其他内源性酶。关于用于预加热处理的具体温度，是β-葡聚糖酶、或者除此之外还包含的脂肪酶、脂氧合酶等作为失活对象的酶能够失活的温度，根据该失活对象的种类而定，因此本领域技术人员可以适当选择。即，作为未进行预加热处理的燕麦饮食品或食品原材料，使用在燕麦被制备成该饮食品或食品原材料的形态之前的任意阶段未受到基于上述预加热处理的热历史的燕麦饮食品或食品原材料。
在本发明中使用的未进行加热处理(即预加热处理)的燕麦饮食品或食品原材料，具体而言，是包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料(即，饮用的饮品。燕麦饮料。)或包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品(即食用的食品。燕麦食品。需要说明的是，本发明中，“食品”不仅包括人用的食品，还包括人以外的动物用的饲料。)，或者，包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品原材料(即，与其他食品材料组合而构成饮料或食品的食品原材料。燕麦食品原材料。)。
作为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料，只要是源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖在水中溶解和/或分散得到的液体，就没有特别限定。作为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料的具体例，可举出：(i)使含有源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品材料的干燥粉末在水中分散而得到的液体；(ii)使含有源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品材料在水中破碎和分散而得到的液体；(iii)从上述(i)或(ii)的液体中去除源自燕麦的蛋白质以外的成分的至少一部分等而提高了源自燕麦的蛋白质和/或β-葡聚糖的含量的液体；(iv)将由上述(i)～(iii)中的任一液体制备的干燥粉末在水中溶解和/或分散而得到的液体等。作为含有源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品材料，可举出：燕麦的胚乳；燕麦的带有糊粉层的胚乳；燕麦的糊粉层以及带有种皮的胚乳；在它们中带有胚芽的食品材料；以及燕麦的整粒等。作为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料的优选例，可举出燕麦奶。作为燕麦奶的例子，可举出燕麦粉的水分散物。
作为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品，例如，可举出组织状燕麦蛋白质。组织状燕麦蛋白质是以含有上述源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的食品材料为原料，利用挤压机等进行组织加工，加工成接近肉的口感的制品。
作为包含源自燕麦的蛋白质和β葡聚糖的食品原材料，例如，可举出含有上述源自燕麦的蛋白质和β葡聚糖的食品材料的干燥粉末等。
作为本发明中使用的燕麦饮食品或食品原材料中的蛋白质含量，没有特别限定，能够根据饮食品或食品原材料的性状而不同，例如，可举出0.05重量％以上、或0.1重量％以上，优选为0.5重量％以上，更优选为1重量％以上，进一步优选为1.25重量％以上、或1.5重量％以上。作为燕麦饮食品或食品原材料中的蛋白质含量范围的上限，例如可举出：10重量％以下，优选为5重量％以下，更优选为3重量％以下，进一步优选为2.5重量％以下、或2重量％以下。上述蛋白质含量范围可以适用于任意性状的燕麦饮食品或食品原材料，特别优选适用于燕麦饮食品或食品原材料为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料的情况。
作为本发明中使用的燕麦饮食品或食品原材料中的β-葡聚糖含量，没有特别限定，能够根据饮食品或食品原材料的性状而不同，例如，可举出0.01重量％以上、0.05重量％以上，优选为0.1重量％以上，更优选为0.2重量％以上，进一步优选为0.3重量％以上、或0.4重量％以上。作为燕麦饮食品或食品原材料中的β-葡聚糖含量范围的上限，例如可举出：2.5重量％以下、2重量％以下，优选为1.5重量％以下，更优选为1重量％以下，进一步优选为0.75重量％以下、或0.5重量％以下。上述β-葡聚糖含量范围可以适用于任意性状的燕麦饮食品或食品原材料，特别优选适用于燕麦饮食品或食品原材料为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料的情况。
作为本发明中使用的燕麦饮食品或食品原材料中的燕麦含量(燕麦含量由燕麦的整粒粉换算量表示。以下相同)，没有特别限定，能够根据饮食品或食品原材料的性状而不同，例如，可举出0.5重量％以上、1重量％以上、3重量％以上，优选为5重量％以上、8重量％以上，更优选为10重量％以上，进一步优选为12重量％以上、或13重量％以上。作为燕麦饮食品或食品原材料中的燕麦含量范围的上限，例如可举出：40重量％以下、30重量％以下，优选为25重量％以下，更优选为20重量％以下，进一步优选为15重量％以下。上述燕麦含量范围可以适用于任意性状的燕麦饮食品或食品原材料，特别优选适用于燕麦饮食品或食品原材料为包含源自燕麦的蛋白质和β-葡聚糖的饮料的情况。
1-2.蛋白质脱酰胺酶
作为本发明中使用的蛋白质脱酰胺酶，只要是不伴随肽键的切断和蛋白质的交联，且显示分解蛋白质的含酰胺基侧链的作用的酶，则对其种类和来源等没有特别限定。另外，只要上述作用为主要活性，则也可以进一步具有伴随肽键的切断和蛋白质的交联的分解蛋白质的含酰胺基侧链的作用。
1-2-1.蛋白质脱酰胺酶的具体例
作为蛋白质脱酰胺酶的例子，可举出将蛋白质中的谷氨酰胺残基进行脱酰胺化，转化为谷氨酸的酶(例如蛋白质谷氨酰胺酶)、以及将蛋白质中的天冬酰胺残基进行脱酰胺化，转化为天冬氨酸的酶(例如蛋白质天冬酰胺酶)。
作为蛋白质脱酰胺酶的更具体的例子，可举出：源自金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属、金杆菌(Aureobacterium)属、类香味菌(Myroides)属、Luteimicrobium属、壤霉菌(Agromyces)属、微杆菌(Microbacterium)属、或雷夫松氏菌(Leifsonia)属的蛋白质脱酰胺酶或其突变体。关于这些蛋白质脱酰胺酶的更具体的示例，例如能够参照JP2000-50887A、JP2001-218590A、WO2006/075772A1、WO2015/133590等。这些蛋白质脱酰胺酶可以单独使用一种，也可以组合使用多种。
这些蛋白质脱酰胺酶中，从更进一步提高本发明的效果的观点出发，可举出优选为源自金黄杆菌属的蛋白质脱酰胺酶或其突变体，更优选为源自金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶或其突变体。
作为源自金黄杆菌属的蛋白质谷氨酰胺酶或其突变体的进一步优选的具体例，可举出以下的[A]和[B]中列举的蛋白质谷氨酰胺酶。
[A]源自解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)种的蛋白质谷氨酰胺酶
[B]包含以下(1)至(3)中任一项所示的多肽的蛋白质谷氨酰胺酶：
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及
(3)相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上，且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
上述[A]的源自解朊金黄杆菌种的蛋白质谷氨酰胺酶中，从更进一步提高本发明的效果的观点出发，可举出优选为源自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶。
上述[B]的蛋白质谷氨酰胺酶为耐热性优异的蛋白质谷氨酰胺酶。上述(1)所示的多肽是源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的蛋白质谷氨酰胺酶，上述(2)和(3)所示的多肽是上述(1)所示多肽的突变体。上述(1)～(3)的多肽不仅包含人为进行替换而得到的多肽，还包含原本具有这样的氨基酸序列的多肽。
在上述(2)的多肽中，导入的氨基酸的改变可以是包含仅从替换、添加、插入和缺失中的一种改变(例如仅替换)，也可以包含两种以上的改变(例如，替换和插入)。在上述(2)的多肽中，任意不同部位中的氨基酸的差异的数量只要为1个或多个即可，例如可举出1～80个，优选为1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、或1～30个，更优选为1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、或1～4个，进一步优选为1～3个，特别优选为1或2个或者1个。
另外，在上述(3)的多肽中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上即可，可举出优选为80％以上，更优选为85％以上、或88％以上，进一步优选为90％以上、或93％以上，进一步优选为95％以上、96％以上、或97％以上，特别优选为98％以上、或99％以上。
在此，在上述(3)的多肽中，相对于序列号1或2所示的各氨基酸序列的序列一致性是与序列号1或2所示的氨基酸序列进行比较而算出的序列一致性。另外，“序列一致性”是指，表示通过BLAST PACKAGE[sgi32bit edition,Version 2.0.12；available fromNational Center for Biotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(TatianaA.Tatsusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,Vol.174,p247-250,1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extensionCost value:1即可。
在上述(2)和(3)的多肽中，序列号1和2所示的氨基酸序列中的第176位(半胱氨酸)、第217位(组氨酸)和第237位(天冬氨酸)的氨基酸被认为是蛋白质谷氨酰胺酶活性催化残基，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。
在上述(2)和(3)的多肽中，在对序列号1或2导入氨基酸替换的情况下，作为导入的氨基酸替换的优选的一个方式，可举出保守性替换。即，作为上述(2)和(3)的多肽中的替换，例如可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其他的非极性氨基酸；如果替换前的氨基酸为非电荷性氨基酸，则替换为其他的非电荷性氨基酸；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其他的酸性氨基酸；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他的碱性氨基酸。
在上述(2)和(3)的多肽中，“显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性”是指，在测定65℃的蛋白质谷氨酰胺酶残余活性的情况下，上述(1)的多肽与蛋白质谷氨酰胺酶残余活性相同，具体而言，在将上述(1)的多肽的该蛋白质谷氨酰胺酶残余活性设为1的情况下，上述(2)和(3)的多肽的该蛋白质谷氨酰胺酶残余活性显示为0.8～1.2左右。应予说明，在65℃的蛋白质谷氨酰胺酶残余活性是指将酶暴露于4℃或65℃的温度环境中10分钟，将暴露于4℃的温度条件下的酶的蛋白质谷氨酰胺酶活性设为100％时的、暴露于65℃的温度条件下的酶的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量(％)。
1-2-2.蛋白质脱酰胺酶的制备方法
蛋白质脱酰胺酶能够由成为上述蛋白质脱酰胺酶的来源的微生物的培养液、或使用了编码上述蛋白质脱酰胺酶的DNA的转化体的培养液来制备。
作为使用编码上述蛋白质脱酰胺酶的DNA的转化体的例子，可举出使用编码上述[B]的蛋白谷氨酰胺酶的DNA的转化体。作为编码上述[B]的蛋白质谷氨酰胺酶的DNA，可举出以下(i)至(iii)中任一项所示的DNA。
(i)包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA；
(ii)包含与序列号3或4所示的碱基序列具有76％以上的同源性、且编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽的碱基序列的DNA；以及
(iii)包含编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽的碱基序列的DNA，与该DNA在严格条件下杂交的DNA包含与包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA互补的碱基序列。
关于上述(i)的DNA，序列号3所示的碱基序列是编码包含上述(1)的多肽中的序列号1所示的氨基酸序列的多肽的基因，序列号4所示的碱基序列是编码包含上述(1)的多肽中的序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因。
作为上述(ii)的DNA的优选例，可举出具有与序列号3或4所示的碱基序列具有80％以上，更优选为85％以上、或88％以上，进一步优选为90％以上、或93％以上，进一步优选为95％以上、96％以上、或97％以上，特别优选为98％以上、99％以上的同源性的碱基序列的DNA。
在此，DNA的“同源性”可以使用具有将基准序列与查询序列进行比较的算法的、公开或市售的软件来计算。具体而言，能够使用BLAST、FASTA、或GENETYX(GENETYXCORPORATION)等，将它们设定为默认参数使用即可。
另外，与上述氨基酸序列的替换、添加、插入或缺失对应，在序列号3或4中记载的碱基序列中，在多个碱基中发生了替换、附加、插入或缺失的突变的碱基序列，只要其编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽，就包含在上述(ii)的DNA中。
关于上述(iii)的DNA，严格条件是指，将固定有DNA的尼龙膜在包含6×SSC(1×SSC是将氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g溶解于1升的水中而得到的溶液)、1w/v％SDS、100μg/mL鲑鱼精子DNA、0.1w/v％牛血清白蛋白、0.1w/v％聚乙烯吡咯烷酮、0.1w/v％Ficoll的溶液中在65℃下与探针一起保温20小时而进行杂交的条件。
关于杂交法的详细步骤，能够参照Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等。
以下，示出通过杂交得到上述[B]的DNA的方法的一个例子，但得到该DNA的方法不限于以下方法。
首先，按照常规方法将从适当的基因源得到的DNA连接到质粒、噬菌体载体上，制作DNA文库。将该文库导入适当的宿主而得到的转化体在平板上培养，将生长的菌落或斑块转移到硝化纤维素或尼龙的膜上，在改性处理后将DNA固定在膜上。在包含预先利用32P等标记该膜的探针的上述组成的溶液中，在上述严格条件下保温，进行杂交。作为探针，可以使用编码序列号1或2记载的氨基酸序列的全部或一部分的多核苷酸。
杂交结束后，冲洗非特异性吸附的探针，通过放射自显影术等鉴定与探针形成杂交体的克隆。重复该操作直到杂交体形成克隆能够分离。最后，从得到的克隆中，选择编码具有目标酶活性的蛋白质的基因。基因的分离可以通过碱法等公知的多核苷酸提取法来实施。
本发明的DNA也可以从产生上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的微生物中分离。例如，能够以源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的基因组DNA为模板，通过使用从已知的氨基酸序列信息中考虑基因的简并而设计的引物或探针或基于已知的碱基序列信息而设计的引物或探针而进行的PCR或杂交法，从上述微生物的基因组中分离目标DNA。
在本发明的DNA中，包含源自密码子的简并的多种DNA。人为制作编码相同氨基酸序列的多种DNA，可以使用公知的基因工程学方法容易地进行。例如，在基因工程学的蛋白质的生产中，在编码目标蛋白质的本来的基因上使用的密码子在宿主中使用频率低的情况下，有时蛋白质的表达量低。在这样的情况下，可以通过不改变编码的氨基酸序列并在宿主中将密码子利用频率最优化，实现目标蛋白质的高表达。
作为表示密码子利用频度的指标，可以选择各密码子的宿主最适密码子利用频度的总计。最适密码子可定义为对应于同一氨基酸的密码子中利用频度最高的密码子。密码子利用频率只要是在宿主中最适化的密码子就没有特别限定，例如，作为大肠杆菌的最适密码子的示例，可举出以下密码子。F：苯丙氨酸(ttt)、L：亮氨酸(ctg)、I：异亮氨酸(att)、M：蛋氨酸(atg)、V：缬氨酸(gtg)、Y：酪氨酸(tat)、终止密码子(taa)、H：组氨酸(cat)、Q：谷氨酰胺(cag)、N：天冬酰胺(aat)、K：赖氨酸(aaa)、D：天冬氨酸(gat)、E：谷氨酸(gaa)、S：丝氨酸(agc)、P：脯氨酸(ccg)、T：苏氨酸(acc)、A：丙氨酸(gcg)、C：半胱氨酸(tgc)、W：色氨酸(tgg)、R：精氨酸(cgc)、G：甘氨酸(ggc)。
作为在基因中导入突变并人为改变氨基酸序列的方法，能够使用Kunkel法、Gapped duplex法等公知的方法、以及利用了位点特异性突变诱发法的突变导入试剂盒，例如QuikChangeTM定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)(AgilentTechnologies公司)、GeneArtTM定点突变系统(Thermo Fisher Scientific公司)、TaKaRa定点突变系统(Mutan-K，Mutan-Super Express Km等：Takara Bio公司)等。
DNA的碱基序列的确定可以通过利用惯用的方法进行序列确定来进行。例如，能够通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)等进行。另外，可以利用适当的DNA测序仪来分析序列。
对于得到的DNA是否是编码目标蛋白质谷氨酰胺酶的DNA的确认，可以将确定的碱基序列与序列号3或4记载的碱基序列进行比较来进行。或者，可以将由确定的碱基序列推定的氨基酸序列与序列号1或2记载的氨基酸序列进行比较来进行。
上述[B]的DNA能够通过连接启动子和终止子来构建表达盒，进而，该表达盒能够通过插入至表达载体来构建重组载体。或者，上述[B]的DNA能够通过插入至表达载体而构建重组载体。
上述的表达盒或重组载体中，作为控制因子，除了启动子和终止子以外，还能够根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。这些控制因子只要可工作地连接于上述[B]的DNA即可。可工作地连接是指，调节上述[B]的DNA的各种控制因子和上述[B]的DNA以能够在宿主细胞中工作的状态连接。
作为表达载体，优选在宿主内可自律性增殖的噬菌体、质粒、或由病毒作为基因重组用途而构建的表达载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为能够在商业上获得的表达载体，可举出pQE系载体(QIAGEN公司)、pDR540、pRIT2T(Cytiva公司)、pET系载体(Merck公司)等。表达载体只要选择使用与宿主细胞的适当组合即可，例如，在将大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可举出pET系载体与DH5α大肠菌株的组合、pET系载体与BL21(DE3)大肠菌株的组合、或pDR540载体与JM109大肠菌株的组合等。
将上述表达盒或重组载体导入宿主，通过转化宿主，得到转化体。
作为在转化体的制造中使用的宿主，只要能够导入基因，表达盒或重组载体稳定，且能够自主增殖并且能够表达包含组装的DNA的基因的性状，就没有特别限制，例如，作为优选例，可举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等的芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等的假单胞菌属等的细菌；酵母等，除此之外，也可以是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。
作为导入表达盒或重组载体的具体方法，例如可举出重组载体法、基因组编辑法。向宿主导入表达盒或重组载体的条件根据宿主的种类等适当设定即可。如果宿主是细菌的情况下，则例如可举出使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法以及电穿孔法等。如果宿主是酵母的情况下，则例如可举出电穿孔法(Electroporation method)、原生质球法和醋酸锂法等。如果是宿主为动物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等。如果是宿主为昆虫细胞的情况，则例如可举出磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法等。如果是宿主为植物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、以及PEG法等。
表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的确认可以通过PCR法、Southern杂交法、以及Northern杂交法等进行。在通过PCR法确认表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的情况下，例如，从转化体中分离、纯化基因组DNA或表达盒或重组载体即可。
表达盒或重组载体的分离、纯化例如在宿主为细菌的情况下，基于将细菌裂解而得到的溶菌物进行。作为裂解方法，例如可利用溶菌酶(Lysozyme)等溶菌酶来实施处理，可根据需要并用蛋白酶及其它酶、以及十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。
进而还可以组合冻融及弗氏压碎处理之类的物理破碎方法。从溶菌物中分离、纯化DNA例如可以通过将利用苯酚处理以及蛋白酶处理的除蛋白处理、核酸酶处理、醇沉淀处理以及市售的试剂盒适宜组合来进行。
DNA的切断可以按照常规方法、例如使用限制酶处理来进行。作为限制酶，例如使用作用于特定的核酸序列的II型限制酶。DNA与表达盒或表达载体的结合，例如使用DNA连接酶进行。
然后，将分离·纯化的DNA作为模板，在导入的DNA上设计特异性引物，进行PCR。对通过PCR得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，利用溴化乙锭和SYBR Green液等进行染色，然后将扩增产物作为条带进行检测，由此能够确认转化。
另外，也能够使用预先用荧光色素等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。进而，也可以采用使扩增产物结合于微孔板等固相并通过荧光和酶反应等确认扩增产物的方法。
作为从成为上述蛋白质脱酰胺酶的来源的微生物的培养液、或使用了编码上述蛋白质脱酰胺酶的DNA的转化体的培养液中回收蛋白质脱酰胺酶的方法，没有特别限定。例如，在使用蛋白质脱酰胺酶分泌型微生物的情况下，可根据需要预先通过过滤、离心处理等从培养液中回收菌体后，对目标酶进行分离和/或纯化。另外，在使用蛋白质脱酰胺酶非分泌型微生物的情况下，可根据需要预先从培养液回收菌体后，通过加压处理、超声波处理等破碎菌体而使目标酶露出后，对目标酶进行分离和/或纯化。作为酶的分离和/或纯化方法，可没有特别限制地使用公知的蛋白质分离和/或纯化方法，例如可举出离心分离法、UF浓缩法、盐析法、使用离子交换树脂等的各种色谱法等。分离和/或纯化的酶能够通过冷冻干燥、减压干燥等干燥法进行粉末化，另外，也能够在该干燥法中使用适当的赋形剂和/或干燥助剂进行粉末化。另外，分离和/或纯化后的酶也能够通过加入适当的添加剂并进行过滤灭菌而液态化。
1-2-3.蛋白质脱酰胺酶的使用量
作为蛋白质脱酰胺酶的使用量，没有特别限定，作为相对于燕麦蛋白质1g的使用量，例如可举出0.01U以上、0.05U以上、或0.1U以上。从更进一步提高本发明的效果的观点出发，作为每1g燕麦蛋白质的蛋白质脱酰胺酶的使用量，可举出优选为0.2U以上、或0.5U以上，更优选为0.75U以上、或1U以上，进一步优选为1.3U以上、或1.5U以上。作为每1g燕麦蛋白质的蛋白质脱酰胺酶使用量的范围上限，没有特别限定，例如可举出40U以下、30U以下、20U以下、10U以下、5U以下、3U以下或2U以下。
另外，作为每1g燕麦(燕麦整粒换算量。以下相同。)的蛋白质脱酰胺酶的使用量，例如可举出0.005U以上、0.01U以上或0.02U以上。从更进一步提高本发明的效果的观点出发，作为每1g燕麦的蛋白质脱酰胺酶的使用量，可举出优选为0.05U以上、0.075U以上或0.1U以上，更优选为0.125U以上或0.15U以上，进一步优选0.175U以上或0.2U以上。作为每1g燕麦的蛋白质脱酰胺酶使用量的范围上限，没有特别限定，例如可举出4U以下、3U以下、2U以下、1U以下、0.6U以下、0.4U以下、0.3以下或0.25U以下。
关于蛋白质脱酰胺酶的活性，将苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸(Z-Gln-Gly)作为底物，将1分钟内游离1μmol的氨的酶量作为1单位(1U)。
1-3.并用酶
在利用蛋白质脱酰胺酶对未进行加热处理(即预加热处理)的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序中，能够并用其他酶。作为能够并用的酶，可举出α-淀粉酶以及β-淀粉酶。从提高通过本发明制造的加工燕麦饮食品或食品原材料、特别是加工燕麦饮料的可溶性的观点出发，优选并用α-淀粉酶以及β-淀粉酶。
作为α-淀粉酶，没有特别限定，例如可举出源自曲霉(Aspergillus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属的α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，进一步优选解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶。
需要说明的是，在本发明中使用α-淀粉酶的情况下，允许使用具有夹杂β-葡聚糖酶活性的α-淀粉酶酶制剂。在本发明中，在特定的温度条件下使蛋白质脱酰胺酶发挥作用，因此即使将具有夹杂β-葡聚糖酶活性的α-淀粉酶酶制剂与蛋白质脱酰胺酶并用，也能够使夹杂的β-葡聚糖酶失活而不使α-淀粉酶失活。因此，即使使用具有夹杂β-葡聚糖酶活性的α-淀粉酶酶制剂，也能够抑制夹杂的β-葡聚糖酶引起的β-葡聚糖的分解。
作为β-淀粉酶，没有特别限定，例如可举出源自植物(小麦、大豆)和源自芽孢杆菌(Bacillus)属的β-淀粉酶，可举出优选为源自芽孢杆菌(Bacillus)属的β-淀粉酶，更优选为源自弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)种的β-淀粉酶。
作为每1重量份燕麦(其中燕麦整粒换算量)中使用的α-淀粉酶的量，没有特别限定，例如以它们的总量计，可举出0.1U～20U、或0.5U～10U，优选为1U～6U、2U～5U、或3U～4U，更优选为3.1U～3.7U、或3.2U～3.6U。关于α-淀粉酶的活性，将1分钟内使马铃薯淀粉的碘显色减少10％的酶量作为1单位(1U)。
作为每1重量份燕麦(其中燕麦整粒换算量)中使用的β-淀粉酶的量，没有特别限定，例如以它们的总量计，可举出0.005U～5U、或0.01U～3U、优选0.025U～1.5U、或0.05U～0.75U、更优选0.075U～0.5U、或0.1U～0.3U。关于β-淀粉酶的活性，以马铃薯淀粉为底物，将相当于1分钟1mg葡萄糖的带来还原力增加的酶量作为1单位(1U)。
1-4.反应条件等
本发明中，在利用蛋白质脱酰胺酶对未进行加热处理(即预加热处理)的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序中，在65℃～75℃的温度条件下进行该处理。通过在65℃～75℃的温度条件下使蛋白质脱酰胺酶发挥作用，一方面有效地使β葡聚糖酶失活，另一方面蛋白质脱酰胺酶本身有效地发挥蛋白质脱酰胺作用。
关于上述温度条件的范围的上限的优选例，有时也取决于使用的蛋白质脱酰胺酶的耐热性，从更进一步提高本发明的效果的观点出发，可举出73℃以下，更优选为70℃以下。另外，作为上述温度条件的范围的下限的其他例子，例如即使超过65℃，具体而言为66℃以上、67℃以上、68℃以上或69℃以上，也能够良好地得到本发明的效果。
在利用蛋白质脱酰胺酶进行处理的工序中使用上述并用酶的情况下，并用酶共存于利用蛋白质脱酰胺酶的酶反应体系中。
作为利用蛋白质脱酰胺酶对未进行加热处理(即预先加热处理)的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的时间，没有特别限定，根据加料规模等适当确定即可，例如可举出30分钟以上，优选为1小时以上，更优选为1.5小时以上，进一步优选为2小时以上。作为该时间范围的上限，没有特别限定，例如可举出12小时以下、6小时以下、3小时以下、或2.5小时以下。
处理结束后，在进行酶失活处理后进行冷却，根据需要进行后处理，得到加工燕麦饮食品或食品原材料。
1-5.加工燕麦饮食品或食品原材料
通过本发明的制造方法得到的加工燕麦饮食品或食品原材料能够抑制β-葡聚糖的分解，因此进行了富含β-葡聚糖且蛋白质的含酰胺基的侧链被分解的加工。作为蛋白质的含酰胺基的侧链被分解的方式的具体方式，可举出可溶性蛋白质的量(与原料的燕麦中包含的物质相比)增加等方式。本发明中，优选的加工燕麦饮食品或食品原材料为饮料(即加工燕麦饮料)，特别优选为加工燕麦奶。
进而，得到的加工燕麦饮食品或食品原材料也可以经过干燥工序而作为加工燕麦饮食品或食品原材料的干燥物来制备。作为干燥的方法，没有特别限定，例如可举出冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等，作为干燥物的形状，可举出粉末、细粒、颗粒等。这样的干燥物可以用于在水中溶解和/或分散而制备燕麦饮料，也可以用作饮料以外的各种食品的材料。
2.用于特定用途的蛋白质脱酰胺化剂
如上所述，通过利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下对未进行加热处理(即预先加热处理)的燕麦饮食品或食品原材料进行处理，能够使β-葡聚糖酶失活，同时能够使蛋白质脱酰胺酶有效发挥作用。因此，本发明也提供一种蛋白质脱酰胺化剂，包含蛋白质脱酰胺酶；为了使未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料在抑制β葡聚糖分解的同时进行蛋白质脱酰胺化，将所述蛋白质脱酰胺化剂在65℃～75℃的温度条件下使用。
在用于上述特定用途的蛋白质脱酰胺化剂中，使用的成分的种类、使用量、处理条件等如上述“1.加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法”一栏所示。
实施例
以下，举出实施例具体说明本发明，本发明不被解释为限定于以下实施例。
[使用的燕麦饮食品或食品原材料]
使用燕麦(整粒)的粉碎物即燕麦粉(蛋白质含量13重量％、β-葡聚糖含量0.41重量％)。该燕麦粉在由燕麦制备的过程中，未受到基于加热处理(预先加热处理)的热历史。
[使用的酶]
·源自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(天野酶株式会社制造)
·源自金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的61798株的蛋白质谷氨酰胺酶
·源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶(天野酶株式会社制造)
·源自弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)的β-淀粉酶(天野酶株式会社制造)
需要说明的是，以下，有时也将蛋白质谷氨酰胺酶记载为“PG”。
(源自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶)
(1)耐热性蛋白质谷氨酰胺酶产生株的选出
从申请人拥有的非公知的菌株文库中，以蛋白质谷氨酰胺酶活性和温度稳定性为指标，选出金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株，储存于包含甘油的培养液中。
(2)选出株的培养
以成为表示的浓度的方式在水中溶解表1的成分，在121℃高压灭菌30分钟，制备培养基。将选出的菌株接种于培养基，在120rpm、30℃下进行40～48小时的培养。培养后，离心分离培养液，回收菌体，仅采集上清液。在上清液中添加硅藻土进行过滤，进而，使用超滤膜进行培养滤液浓缩。
(3)酶的纯化
利用盐析、苯基-琼脂糖凝胶(Phenyl-sepharose)以及丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)S-100处理浓缩液，纯化酶。关于57594株和61798株各自的培养液的纯化后的浓缩级分，将SDS-PAGE图像分别示于图1和图2。图1的泳道7表示纯化前级分，泳道8～10表示来自57594株培养物的纯化级分，泳道11表示分子量标记。图2的泳道1表示分子量标记，泳道2～4表示来自61798株培养物的纯化级分。如图1和图2所示，在纯化级分中能够确认到18kDa(用箭头表示的条带)作为纯化物。
[表1]
(4)酶学性质评价试验
对由57594株和61798株各自的培养液得到的18kDa纯化级分(源自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和源自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶)评价以下酶学性质。对源自现有的解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶，也同样评价以下酶学性质。
(4-1)蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定
·利用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸(Z-Gln-Gly；肽研究所)，将制成30mmol/L的溶液作为底物溶液。
·将应该测定活性的酶溶液0.1mL放入试管中，在37±0.5℃的恒温水槽中放置1分钟后，加入预先在37±0.5℃放置10分钟的底物溶液1mL，立即混合。
·通过将该液体放置10分钟进行酶反应之后，加入0.4mol/L三氯乙酸溶液1mL，停止酶反应。
·测定空白通过在试管中加入酶溶液0.1mL，按照0.4mol/L三氯乙酸溶液1mL、底物溶液1mL的顺序添加而制备。
·进行利用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)的显色反应，基于波长630nm处的吸光度的值，对通过10分钟的酶反应而游离得到的氨进行定量。
·将1分钟内生成1μmol的氨的酶量定义为1个单位(1U)，由通过酶反应游离得到的氨量算出活性值。
(4-2)温度稳定性试验
利用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)置换纯化级分，进行10分钟4℃下的静置，或者，进行10分钟40℃、50℃、60℃、65℃、70℃或75℃下的加热后，利用(4-1)的方法进行酶反应，进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将暴露于4℃条件的纯化级分的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、暴露于各温度中的加热条件的纯化级分的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶残余活性(％)。将结果示于图3。如图3所示，65℃下的源自解朊金黄杆菌9670株的PG的残余活性为11％，与之相对，源自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的残余活性为65％，源自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的残余活性为66％。
(4-3)最适温度试验
将酶反应温度变更为37℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，除此以外，利用与(4-1)相同的方法进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将表示各纯化级分的最大活性的温度条件(对于源自解朊金黄杆菌9670株的PG为60℃，对于源自57594株的PG和源自61798株的PG为65℃)下的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、各温度条件中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图4。如图4所示，源自解朊金黄杆菌9670株的PG的最适温度为60℃，与之相对，源自57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适温度为65℃。
(4-4)pH稳定性试验
利用伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液将纯化级分调节至pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，在各pH下、在37℃放置过夜(18小时)后，利用(4-1)的方法进行酶反应，进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将pH6时的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、暴露于各pH条件的纯化级分中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶残余活性(％)。将结果示于图5。
(4-5)最适pH试验
利用伯瑞坦-罗宾森缓冲液将底物溶液的pH调节至pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12，在各pH下进行酶反应，除此以外，利用与(4-1)相同的方法进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将pH6时的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、各pH条件中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图6。
(5)序列
基于推定为与57594株和61798株为近缘的金黄杆菌(Chryseobacterium)属细菌的序列信息设计了简并引物。以57594株和61798株的基因组DNA为模板，使用简并引物，通过PrimeSTAR(R)GXL DNA聚合酶(Polymerase)(Takara Bio公司)扩增基因片段。通过NucleoSpin(R)Gel and PCR Clean-up(Takara Bio公司)，回收扩增片段，进行基于简并引物的序列分析。其结果，确定源自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列(序列号1)；包含编码序列号1的结构基因(序列号3)的源自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶基因周边碱基序列(序列号5)；源自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列(序列号2)；以及包含编码序列号2的结构基因(序列号4)的源自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶基因周边碱基序列(序列号6)。获得的蛋白质谷氨酰胺酶中，将61798株供于以下试验。
[酶活性测定方法]
(1)蛋白质脱酰胺酶活性测定法
与上述“[使用的酶]”中的“(4)酶学性质评价试验”的“(4-1)蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定”相同，测定蛋白质谷氨酰胺酶的活性。
(2)α-淀粉酶活性测定法
将1％马铃薯淀粉底物溶液(0.1mol/L乙酸(pH5.0))10mL在37℃加热10分钟后，加入包含α-淀粉酶的试样溶液1mL，立即振荡混合。将该液体在37℃放置10分钟后，将该液体1mL加入到0.1mol/L盐酸试液10mL中，立即振荡混合。接着，称量该液体0.5mL，加入0.0002mol/L碘试液(日局)10mL，振荡混合后，将水作为对照，测定波长660nm处的吸光度(AT)。另外，加入1mL水代替试样溶液，同样进行操作，测定吸光度(AB)。将在1分钟内使马铃薯淀粉的基于碘的显色减少10％的酶量作为1单位(1U)。
[数1]
α-淀粉酶活性(U/g，U/mL)＝(AB-AT)/AB×1/W
AT：反应液的吸光度
AB：空白液的吸光度
W：试料溶液1mL中的试料的量(g或mL)
(3)β-淀粉酶活性测定法
使用马铃薯淀粉作为底物，预先在105℃干燥2小时，称量其干燥物1.0g，添加水20mL，边搅拌边缓缓添加氢氧化钠试液(2mol/L)5mL而形成糊状。接着，边搅拌边在水浴中加热3分钟后，添加水25mL。冷却后，添加盐酸试液(2mol/L)和盐酸试液(0.1mol/L)进行中和，添加1mol/L乙酸·乙酸钠缓冲液(pH5.0)10mL，进一步添加水而达到100mL，将其作为底物溶液。
量取底物溶液10mL，在37℃加热10分钟，添加试样溶液1mL并立即振荡混合，在相同温度下加热10分钟后，进一步添加斐林试剂4mL并轻轻振荡混合，在水浴中加热15分钟后冷却到25℃以下，添加碘化钾试液(β-淀粉酶转化酶活性试验用)2mL和硫酸(1→6)2mL，制成被检液。另外，使用水10mL来代替底物溶液，与被检液的制备同样进行操作，作为比较液。对于被检液和比较液，利用0.05mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定游离的碘。在滴定接近终点时，添加可溶性淀粉试液1～2滴，将产生的蓝色消失的时刻作为终点。
将1分钟内产生的相当于1mg的葡萄糖的还原力增加的酶量作为1单位(1U)，由以下数学式进行计算。
[数2]
β-淀粉酶活性(U/g，U/mL)＝葡萄糖的量(mg)×1/10×1/M
葡萄糖的量(mg)＝(b-a)×1.6×f
a：酶反应液的滴定值(mL)
b：空白液的滴定值(mL)
1.6：0.05mol/L硫代硫酸钠液1mL相当于1.6mg的葡萄糖量
1/10：反应时间(分钟)的单位换算系数
M：试样溶液1mL中的试样的量(g或mL)
f：0.05mol/L硫代硫酸钠液(定量用)的因数
[试验例]
(1)方法
将1.35g的燕麦粉悬浮在10mL的自来水中，制备燕麦粉水悬浮液(燕麦奶)。将制备的燕麦粉水悬浮液的详细组成示于表2。一边搅拌燕麦粉水悬浮液，一边加热至60℃、65℃、或70℃，添加α-淀粉酶0.7mg(4.55U)、β-淀粉酶0.4mg(0.26U)和表3所示的PG的表示量，进行120分钟酶反应。反应后，煮沸10分钟使PG失活，在室温下冷却。由此，得到加工燕麦奶。
[表2]
燕麦(整粒基准)浓度 13.5重量％
源自燕麦的蛋白质含量 1.76重量％
源自燕麦的β-葡聚糖含量 0.41重量％
[表3]
(2)β-葡聚糖含量测定
对于得到的加工燕麦奶，使用β-Glucan Assay Kit(Mixed Linkage)(Megazyme公司)定量β-葡聚糖含量。将结果示于图7。
(3)蛋白质脱酰胺化率测定
对于得到的加工燕麦奶，使用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)对游离氨量进行定量。另一方面，对于材料中使用的燕麦粉水悬浮液(燕麦奶)，加入3N浓硫酸并混合，在110℃处理3小时后，冷却并用6N氢氧化钠中和，通过离心分离得到上清液。对于得到的上清液，使用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药公司)对游离氨量进行定量。将加工燕麦奶的游离氨量除以原料的燕麦粉水悬浮液(燕麦奶)的游离氨量，导出蛋白质脱酰胺化率。
(4)结果
由图7可知，与反应温度为60℃的情况相比，能够确认到：在反应温度为65℃和70℃的情况下，β-葡聚糖显著增多。即，表明在该试验例的反应体系中，在65℃以上β-葡聚糖酶失活。
另一方面，由图8可知，尽管是β-葡聚糖酶失活的高温，但即使在反应温度为65℃和70℃的情况下，也能够确认到脱酰胺化反应有效发生，即蛋白质谷氨酰胺酶不失活，能够有效发挥作用。另外，在反应温度为70℃的情况下，基于源自耐热性高的61798株的PG的脱酰胺化率显著地高。
序列表
<110> 天野酶制品株式会社
<120> 加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法
<130> 22027WO
<150> JP2021-086113
<151> 2021-05-21
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 1
Met Lys Lys Phe Leu Leu Ser Met Met Val Phe Val Thr Met Leu Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ala Cys Ser Asp Ser Ala Ala Asn Gln Asp Pro Asn Leu Val
20 25 30
Ala Lys Glu Ser Asn Glu Ile Ala Met Lys Asp Phe Gly Lys Thr Val
35 40 45
Pro Val Gly Ile Glu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Lys Val Ser Phe Met
50 55 60
Val Ser Ala Gln Pro Tyr His Ile Lys Asp Ser Lys Glu Asn Ala Gly
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Met Ile Arg Gln Ala Val Glu Asn Glu Thr Pro Val His
85 90 95
Ile Phe Leu Lys Thr Asn Thr Thr Glu Ile Ala Lys Val Asp Lys Pro
100 105 110
Thr Asp Asp Asp Ile Arg Tyr Phe Lys Ser Val Phe Asn Lys Glu Glu
115 120 125
Arg Gly Asp Ser Lys Lys Ala Val Ser Val Ile Pro Asn Leu Ala Thr
130 135 140
Leu Asn Ser Leu Phe Thr Gln Ile Lys Asn Gln Ala Cys Gly Thr Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Pro Cys Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys
165 170 175
Tyr Ala Arg Ala His Lys Met Arg Gln Ile Leu Leu Asn Ala Gly Tyr
180 185 190
Asp Cys Glu Lys Gln Phe Val Tyr Gly Asn Leu Arg Ala Ser Thr Gly
195 200 205
Thr Cys Cys Val Ser Trp Val Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Phe
210 215 220
Lys Asn Ala Ser Gly Ile Val Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu
225 230 235 240
Phe Ser Ser Gly Pro Val Thr Asp Ala Ala Trp Arg Ala Ala Cys Thr
245 250 255
Asn Thr Ser Cys Gly Ser Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala
260 265 270
Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Asp Asn
275 280 285
Asn Tyr Val Asn Thr Asn Cys Val Leu Asn Ile Phe Ser Ser Leu Ser
290 295 300
Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser Val Ala Ser Cys Gly Phe
305 310 315
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 2
Met Lys Lys Phe Leu Leu Ser Met Met Val Phe Val Thr Val Leu Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ser Cys Ser Asp Ser Ser Ala Asn Gln Asp Pro Asn Leu Val
20 25 30
Ala Lys Glu Ser Asn Glu Ile Ala Met Lys Asp Phe Gly Lys Thr Val
35 40 45
Pro Val Gly Ile Glu Lys Glu Asp Gly Lys Phe Lys Val Ser Phe Ile
50 55 60
Val Ser Ala Gln Pro Tyr Gln Ile Lys Asp Thr Lys Glu Asn Ala Gly
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Met Ile Lys Glu Ala Val Glu Asn Glu Thr Pro Val Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Ala Asn Ser Asn Glu Ile Ala Lys Val Asp Lys Ala
100 105 110
Thr Ala Asp Asp Ile Arg Tyr Phe Lys Ser Val Phe Asn Lys Glu Glu
115 120 125
Arg Gly Asp Ser Arg Lys Ala Val Ser Val Ile Pro Asn Leu Ala Thr
130 135 140
Leu Asn Ser Leu Phe Thr Gln Ile Lys Asn Gln Ala Cys Gly Thr Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Pro Cys Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys
165 170 175
Tyr Ala Arg Ala His Lys Met Arg Gln Ile Leu Leu Asn Ala Gly Tyr
180 185 190
Asp Cys Glu Lys Gln Phe Val Tyr Gly Asn Leu Arg Ala Ser Thr Gly
195 200 205
Thr Cys Cys Val Ser Trp Val Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Phe
210 215 220
Lys Asn Ala Ser Gly Ile Val Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu
225 230 235 240
Phe Ser Ser Gly Pro Val Thr Asp Thr Ala Trp Arg Ala Ala Cys Thr
245 250 255
Asn Thr Ser Cys Gly Ser Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala
260 265 270
Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Asp Asn
275 280 285
Asn Tyr Val Asn Thr Asn Cys Val Leu Asn Ile Phe Ser Ser Leu Ser
290 295 300
Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser Val Ala Ser Cys Gly Phe
305 310 315
<210> 3
<211> 960
<212> DNA
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 3
atgaaaaaat ttctgttatc catgatggta ttcgtgacga tgctgtcatt caatgcctgt 60
tcagattcag ctgccaatca ggatcccaat cttgttgcta aagagtctaa tgaaatcgcc 120
atgaaagatt tcggtaaaac tgttccggta gggattgaaa aagaagaggg aaaatttaaa 180
gtctctttta tggtgagtgc tcagccatac cacattaaag acagtaagga aaatgcaggt 240
tatatttcta tgatcagaca agccgttgaa aacgaaactc ctgttcatat tttcctgaaa 300
accaacacca ctgaaattgc aaaagtagat aaacctactg atgatgatat ccgttatttc 360
aaatctgttt tcaataaaga agagagagga gacagcaaaa aagcagtgag tgttattcct 420
aacctggcaa cactgaacag cttatttacg cagattaaaa accaggcttg cggtacttct 480
acagcatctt ctccatgtat cactttcaga tatccggtgg atggatgtta tgcaagagct 540
cacaaaatga gacagatcct ccttaatgca ggctacgact gtgaaaagca gttcgtttac 600
ggaaacctga gagcttctac aggaacttgc tgcgtatcat gggtatatca cgtagccata 660
ttggtaagct tcaaaaatgc ttccggaatt gttgagaaaa gaatcatcga tccttcacta 720
ttctccagcg gacccgtaac tgacgcagca tggagagccg cttgtaccaa cacaagctgt 780
ggatctgctt ctgtatcttc ttatgccaat acagcaggaa acgtgtacta cagaagtcca 840
tcaggatctt tactgtatga taacaattat gtaaatacca attgtgtatt gaatatattc 900
tcatcccttt caggatgttc tccttctcct gcaccaagtg tagcgagctg cggattttaa 960
<210> 4
<211> 960
<212> DNA
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 4
atgaaaaaat ttcttttatc catgatggta ttcgtgacgg tactttcatt taactcctgt 60
tcggattcaa gtgccaatca ggatccgaat cttgttgcta aagagtctaa tgaaattgct 120
atgaaagact ttggtaaaac tgttccggta gggatagaaa aagaggatgg aaagtttaaa 180
gtttccttta tagtttcagc gcagccgtat caaattaaag atacaaaaga aaatgcggga 240
tatatctcca tgatcaaaga ggctgtagaa aatgaaactc ctgttcaggt tttcctgaaa 300
gccaattcta acgaaatcgc aaaggtagac aaagcaacag cggatgacat ccgttatttc 360
aaatctgttt tcaacaaaga agagagaggc gacagcagaa aagctgtgag cgttattcct 420
aatcttgcaa cgctgaacag cttattcact cagatcaaaa accaggcttg cggaacttct 480
acagcatctt caccgtgtat cacattcaga tatcctgtgg atggatgcta tgcgagagct 540
cacaaaatga gacaaatcct tttgaatgca ggctacgact gtgaaaaaca gttcgtttac 600
gggaacctaa gagcatctac aggaacatgc tgtgtgtctt gggtatatca cgtagccatt 660
ttggtaagct tcaaaaatgc ttccggaatt gttgagaaaa gaattattga tccgtcacta 720
ttctccagcg gacctgtaac agatactgca tggagagccg catgtaccaa cacaagctgt 780
ggatctgctt ctgtttcttc ttatgccaat acagcaggaa atgtatacta cagaagccca 840
tccggttctt tattatatga taacaattat gtaaatacca actgtgtatt gaacatattc 900
tcatcccttt caggatgttc tccttcccct gcacctagtg tagcaagctg tggattttaa 960
<210> 5
<211> 1028
<212> DNA
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 5
caaaatagtg aactattata gttaaaaagt tcactgaaaa ttaaccacca aaatataaaa 60
actatgaaaa aatttctgtt atccatgatg gtattcgtga cgatgctgtc attcaatgcc 120
tgttcagatt cagctgccaa tcaggatccc aatcttgttg ctaaagagtc taatgaaatc 180
gccatgaaag atttcggtaa aactgttccg gtagggattg aaaaagaaga gggaaaattt 240
aaagtctctt ttatggtgag tgctcagcca taccacatta aagacagtaa ggaaaatgca 300
ggttatattt ctatgatcag acaagccgtt gaaaacgaaa ctcctgttca tattttcctg 360
aaaaccaaca ccactgaaat tgcaaaagta gataaaccta ctgatgatga tatccgttat 420
ttcaaatctg ttttcaataa agaagagaga ggagacagca aaaaagcagt gagtgttatt 480
cctaacctgg caacactgaa cagcttattt acgcagatta aaaaccaggc ttgcggtact 540
tctacagcat cttctccatg tatcactttc agatatccgg tggatggatg ttatgcaaga 600
gctcacaaaa tgagacagat cctccttaat gcaggctacg actgtgaaaa gcagttcgtt 660
tacggaaacc tgagagcttc tacaggaact tgctgcgtat catgggtata tcacgtagcc 720
atattggtaa gcttcaaaaa tgcttccgga attgttgaga aaagaatcat cgatccttca 780
ctattctcca gcggacccgt aactgacgca gcatggagag ccgcttgtac caacacaagc 840
tgtggatctg cttctgtatc ttcttatgcc aatacagcag gaaacgtgta ctacagaagt 900
ccatcaggat ctttactgta tgataacaat tatgtaaata ccaattgtgt attgaatata 960
ttctcatccc tttcaggatg ttctccttct cctgcaccaa gtgtagcgag ctgcggattt 1020
taactaat 1028
<210> 6
<211> 1029
<212> DNA
<213> 金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）
<400> 6
tagtgaacta taaaaactaa aagttcacta aaaattaacc accaaaatat aaaaactatg 60
aaaaaatttc ttttatccat gatggtattc gtgacggtac tttcatttaa ctcctgttcg 120
gattcaagtg ccaatcagga tccgaatctt gttgctaaag agtctaatga aattgctatg 180
aaagactttg gtaaaactgt tccggtaggg atagaaaaag aggatggaaa gtttaaagtt 240
tcctttatag tttcagcgca gccgtatcaa attaaagata caaaagaaaa tgcgggatat 300
atctccatga tcaaagaggc tgtagaaaat gaaactcctg ttcaggtttt cctgaaagcc 360
aattctaacg aaatcgcaaa ggtagacaaa gcaacagcgg atgacatccg ttatttcaaa 420
tctgttttca acaaagaaga gagaggcgac agcagaaaag ctgtgagcgt tattcctaat 480
cttgcaacgc tgaacagctt attcactcag atcaaaaacc aggcttgcgg aacttctaca 540
gcatcttcac cgtgtatcac attcagatat cctgtggatg gatgctatgc gagagctcac 600
aaaatgagac aaatcctttt gaatgcaggc tacgactgtg aaaaacagtt cgtttacggg 660
aacctaagag catctacagg aacatgctgt gtgtcttggg tatatcacgt agccattttg 720
gtaagcttca aaaatgcttc cggaattgtt gagaaaagaa ttattgatcc gtcactattc 780
tccagcggac ctgtaacaga tactgcatgg agagccgcat gtaccaacac aagctgtgga 840
tctgcttctg tttcttctta tgccaataca gcaggaaatg tatactacag aagcccatcc 900
ggttctttat tatatgataa caattatgta aataccaact gtgtattgaa catattctca 960
tccctttcag gatgttctcc ttcccctgca cctagtgtag caagctgtgg attttaatta 1020
atttataga 1029

Claims (5)

1.一种加工燕麦饮食品或食品原材料的制造方法，其特征在于，所述制造方法包括利用蛋白质脱酰胺酶在65℃～75℃的温度条件下对未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料进行处理的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述蛋白质脱酰胺酶为源自解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述蛋白质脱酰胺酶为包含以下的(1)至(3)中任一项所示的多肽的蛋白质谷氨酰胺酶：
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及
(3)相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述燕麦饮食品或食品原材料为燕麦奶。
5.一种蛋白质脱酰胺化剂，其特征在于，包含蛋白质脱酰胺酶，其在65℃～75℃的温度条件下使用，以使未进行加热处理的燕麦饮食品或食品原材料在抑制β葡聚糖分解的同时进行蛋白质脱酰胺化。
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