JPWO2020145288A1 - 耐熱性イソアミラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
従って、本発明の課題は、耐熱性の向上に寄与する別の変異点を見出し、新たなイソアミラーゼ、及びその製造法を提供することにある。
[2]前記配列同一性が90%以上である[1]記載のイソアミラーゼ。
[3]さらに、A554P、M277I、A549P及びA580Tから選ばれる1又は2以上のアミノ酸変異を有する[1]又は[2]記載のイソアミラーゼ。
[4]さらに、A554P、M277I、A549P及びA580Tのアミノ酸変異を有する[1]又は[2]記載のイソアミラーゼ。
[5]アミノ酸変異が、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T、及びA554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574Vから選ばれる変異を含む変異である[1]〜[4]のいずれか1記載のイソアミラーゼ。
[6][1]〜[5]のいずれか1記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
[7][6]記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
[8][7]記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
[9][8]記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
[10][1]〜[5]のいずれか1記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
[11]さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する[10]記載のデンプン糖化用酵素組成物。
また、当該欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼと配列番号1のアミノ酸配列との配列同一性は、80%以上が好ましく、85%以上がより好ましく、90%以上がさらに好ましく、95%以上がさらに好ましく、99%以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、BLAST、FASTA又はGENETYX(ソフトウエア開発社製)などを用いることができる。
さらに好ましいアミノ酸変異としては、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574Vが挙げられる。
本発明のイソアミラーゼは、必要により他の1種以上の酵素と混合したデンプン糖化用酵素組成物とすることも好ましい。他の1種以上の酵素は、上述したβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼから選択することができる。
Pseudomonas amyloderamosaゲノムを鋳型としてプライマーPSTPIA−F(AAACTGCAGATGAAGTGCCCAAAGATTCTC(配列番号2))及びHINDPIA−R(CCCAAGCTTCTACTTGGAGATCAACAGCAG(配列番号3))を用いて耐酸性イソアミラーゼ遺伝子配列を含む約2.3kbの断片を取得した。この断片を制限酵素Pst I及びHind IIIで消化し、pHSG398(タカラバイオ株式会社)を制限酵素Pst I及びHind IIIで消化した約2.2kbの断片と連結することにより、p−PIを取得した。ネイティブの耐酸性イソアミラーゼの発現プラスミドであるプラスミドp−PIに部位特異的変異導入を行い、一重変異体(D268S)発現プラスミドp−PID268Sを取得した。同様に一重変異体(A241T)発現プラスミドp−PIA241T、一重変異体(M574V)発現プラスミドp−PIM574V、五重変異体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)発現プラスミドp−PI5Mを取得した。また、p−PI5Mに部位特異的変異導入を行い、最適化 五重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T)発現プラスミドp−PI5Ms、六重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T)発現プラスミドp−PI6M、七重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574V)発現プラスミドp−PI7Mを取得した。
ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ発現プラスミドp−PI、一重変異体(D268S)発現プラスミドp−PID268S、一重変異体(A241T)発現プラスミドp−PIA241T、一重変異体(M574V)発現プラスミドp−PIM574V、五重変異体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)発現プラスミドp−PI5M、最適化 五重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T)発現プラスミドp−PI5Ms、六重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T)発現プラスミドp−PI6M、七重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574V)発現プラスミドp−PI7Mにより大腸菌DH5α株を形質転換し、それぞれのイソアミラーゼを生産する大腸菌株を取得した。これらの大腸菌を30μg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地(酵母エキス 0.5%、トリプトン1.0%、塩化ナトリウム 0.5%、IPTG 0.1mM pH7.2)で、30℃3日培養し、培養液1Lを得た。超音波により菌体を破砕後、遠心分離(10,000g、10分間)を行い、上清をUF濃縮(旭化成社製 AIPモジュール)により、1,000U/mLとなるように濃縮した。これらを0.2μmのポアサイズの膜で除菌することにより、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ、一重変異体(D268S)イソアミラーゼ、一重変異体(A241T)イソアミラーゼ、一重変異体(M574V)イソアミラーゼ、五重変異体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)イソアミラーゼ、最適化 五重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T)イソアミラーゼ、六重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T)イソアミラーゼ、七重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574V)イソアミラーゼの酵素溶液とした。
実施例2で調製した各酵素溶液を40℃、50℃、55℃、57.5℃、60℃、62.5℃、65℃に10分間保ったのちに氷冷し、残存活性を測定した。各温度における残存活性のプロットより作成された近似式を用いて残存活性が50%になる温度を算出し、この温度をネイティブ耐酸性イソアミラーゼと比較した場合に、増加する度合いを耐熱化度とした。七重変異体のアミノ酸配列を配列番号4に示す。
イソアミラーゼの活性測定法は、以下のとおりである。
0.5%ワキシーコーンスターチ溶液0.35mLに、0.5Mの酢酸緩衝液(pH4.5)0.1mLを混合し、適時希釈した酵素液を0.1mL加え、45℃で15分間反応させる。その後、0.1N HClにて5倍希釈したヨード溶液(0.05Mヨウ素を含む0.5Mヨウ化カリウム溶液)0.5mLを加えて酵素反応を止め、10mLの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて610nmで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下で1分間に0.01吸光度を増加する酵素量を1単位とした。
その結果、図1及び表1に示すように、一重変異体(D268S)で約2.9℃、一重変異体(A241T)で約2.1℃、一重変異体(M574V)で約3.4℃、五重変異体(A554P/M277I/D268A/A549P/A580T)で約6.0℃、最適化五重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T)で約6.8℃、六重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T)で約7.1℃、七重変異体(A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574V)で約8.2℃の耐熱化度の向上が確認された。
デンプンの糖化として、還元糖遊離試験を行った。10mM酢酸緩衝液(pH4.5)に溶性デンプンを30%(重量/重量)となるように加温溶解し、(1)0.05mg/mLに溶解したグルコアミラーゼ(和光純薬株式会社製)を30%溶性デンプン1gあたり20mg及び五重変異体イソアミラーゼを30%溶性デンプン1gあたり125U添加したもの、(2)グルコアミラーゼを30%溶性デンプン1gあたり20mg及び六重変異体イソアミラーゼを30%溶性デンプン1gあたり125U添加したもの、(3)グルコアミラーゼを30%溶性デンプン1gあたり20mg及び七重変異体イソアミラーゼを30%溶性デンプン1gあたり125U添加したものそれぞれを55℃、60℃、62.5℃で16時間反応させた。
100℃、5分間加熱し反応を停止させ、生成した還元糖量について、以下に示すDNS法にて測定した。
還元糖量の測定法は、以下のとおりである。
DNS(3,5−ジニトロサリチル酸)溶液1.5mLに、適時希釈したサンプル液を0.5mL加えた後に撹拌し、沸騰水中で5分間反応させる。水冷後、4mLの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて540nmで測定する。還元糖量はグルコース溶液を用いて作製した検量線より算出した。DNS溶液は、1%DNS溶液4400mLに4.5%水酸化ナトリウム溶液を1500mLとロッセル塩1275g溶解した後、別に調製したフェノール溶液(1%フェノール、2.44%水酸化ナトリウム)を345mLと、炭酸水素ナトリウムを34.5g加えて撹拌溶解し、2日間暗所保存後、ろ紙にて濾過したものを使用した。
その結果を表2に示した。五重変異体イソアミラーゼを用いた55℃反応において得られた還元糖量を100%としたとき、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は102%、七重変異体イソアミラーゼを用いた際は102%に向上した。また、60℃反応においては、五重変異体イソアミラーゼでは100%と変化がないのに対して、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は102%、七重変異体イソアミラーゼでは105%に向上した。さらに、62.5℃反応においては、五重変異体イソアミラーゼでは98%に低下したのに対して、六重変異体イソアミラーゼを用いた際は99%、七重変異体イソアミラーゼでは99%であった。したがって、五重変異体イソアミラーゼに比べて、六重変異体又は七重変異体イソアミラーゼを使用した場合の方が明らかに還元糖生成量の向上が認められた。さらに、55℃から60℃の温度上昇に伴って五重変異体イソアミラーゼは枝切り効果に変化が無いのに対し、六重変異体又は七重変異体イソアミラーゼは枝切り効果が向上し、歩留りの向上が認められたことから、変異による熱安定性効果が確認された。
Claims (11)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号1で表されるアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列であって、配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるイソアミラーゼにおいて、D268S、A241T及びM574Vから選ばれる1又は2以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
- 前記配列同一性が90%以上である請求項1記載のイソアミラーゼ。
- さらに、A554P、M277I、A549P及びA580Tから選ばれる1又は2以上のアミノ酸変異を有する請求項1又は2記載のイソアミラーゼ。
- さらに、A554P、M277I、A549P及びA580Tのアミノ酸変異を有する請求項1又は2記載のイソアミラーゼ。
- アミノ酸変異が、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T、A554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T、及びA554P/M277I/D268S/A549P/A580T/A241T/M574Vから選ばれる変異を含む変異である請求項1〜4のいずれか1項記載のイソアミラーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
- 請求項6記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
- 請求項7記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
- 請求項8記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
- さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する請求項10記載のデンプン糖化用酵素組成物。
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