FI102190B - Menetelmä pesäkkeitä stimuloivan tekijä-1:n uusien muotojen valmistami seksi ja siinä käytettäviä DNA-sekvenssejä, vektoreita, ilmentämisjärj estelmiä ja rekombinanttisoluja - Google Patents

Description

1 102190

Menetelmä pesäkkeitä stimuloivan tekijä-l:n uusien muotojen valmistamiseksi ja siinä käytettäviä DNA-sekvenssejä, vektoreita, ilmentämisjärjestelmiä ja rekombinanttisoluja 5 Tekniikan ala

Kyseinen keksintö koskee rekombinanttiteknologian käyttöä lymfokiinien tuottamiseksi, joita yleensä tuot-tuu alhaisina pitoisuuksina. Spesifisemmin keksintö koskee uusien, ihmisen pesäkkeitä stimuloivaa tekijä-l:tä (CSF-1) 10 koodaavien DNA-sekvenssien kloonausta ja ilmaisua.

Tekniikan taso

Tiettyjen tekijöiden, joita moninaiset kudokset tuottavat erittäin alhaisina pitoisuuksina, kyky stimuloida luuydinkantasolujen kasvua ja kehitystä jyvässo-15 luiksi ja/tai makrofageiksi on tunnettu lähes 15 vuotta.

Tällaisten tekijöiden läsnäolo lukuisista lajeista peräisin olevassa/olevissa seerumissa, virtsanäytteissä ja kudosuutteissa on osoitettavissa käyttäen in vitro määritystä, joka mittaa puolikiinteään kasvualustaan maljoi-20 tettujen luuydinsolujen pesäkemuodostuksen stimuloitumis-ta. Ei ole olemassa luotettavaa tunnettua in vivo määritystä. Koska nämä tekijät indusoivat kyseisten pesäkkeiden muodostusta, tekijöitä yhteisesti on kutsuttu pesäkkeitä stimuloiviksi tekijöiksi (CSF).

: 25 Sittemmin on osoitettu, että ihmis-CSF-proteiineja on olemassa ainakin neljä alaluokkaa, jotka voidaan määritellä saatavissa pesäkkeissä tavattavien solutyyppien mukaan. Yksi alaluokka, CSF-1, johtaa pääasiallisesti makro-fageja sisältäviin pesäkkeisiin. Muut alaluokat tuottavat 30 pesäkkeitä, jotka sisältävät sekä neutrofiilisiä jyvässolu-ja että makrofageja; jotka sisältävät pääasiallisesti neut-rofiilisiä jyvässoluja; ja jotkasisältävät neutrofiilisiä ja eosinofiilisiä jyvässoluja ja makrofageja.

Löytyy ensimmäiseen kolmeen edeltävään ihmis-35 CSF:ään nähden analoqisia hiiritekijöitä. Lisäksi hiiri-tekijä nimelä IL-3 indusoi hiiren luuydinsoluista pesäkkeitä, jotka sisältävät kaikkia näitä solutyyppejä sekä 2 102190 megakaryosyyttejä, punasoluja ja syöttösoluja erilaisina yhdistelminä. Tunnetaan myös ihmis-IL-3. Näistä CSF-tyy-peistä ovat yleiskatsauksia esittäneet Dexter, T. M. Nature 309 (1984) 746, ja Vadas, M.A. et.ai.. J. Immunol.

5 110 (1983) 793, Metcalf, D. Science 229 (1985) 16-22;

Clark, S.C. et. ai.. Science 236 (1987) 1229-1237.

Tässä kyseessä oleva keksintö käsittelee ensimmäisen näistä alaluokista, CSF-l:n, jäseniin lukeutuvien proteiinien rekombinanttituotantoa. Tätä alaluokkaa on 10 edelleen luonnehdittu ja hahmoteltu spesifisten radioim-muunimääritysten ja radioreseptorimääritysten avulla, esim. puhdistettua CSF-l:tä vastaan tuotetut vasta-aineet kykenevät pysäyttämään spesifisesti CSF-l-aktiivisuuden vaikuttamatta kyseisten muiden alaluokkien biologisiin 15 aktiivisuuksiin, ja makrofagi solulinja J774 sisältää reseptoreita, jotka sitovat spesifisesti CSF-l:tä. Kuvauksen näistä määrityksistä julkaisivat Das, S.K. et. ai. Blood 58 (1981) 630.

On julkaistu puhdistusmenetelmiä eri CSF-proteii- 20 neille.

Stanley, E.R. et. ai. J. Biol. Chem. 252 (1977) 4305 ilmoittivat CSF-proteiinin puhdistuksesta hiiren L929-soluista spesifiseen aktiivisuuteen noin 1 x 108 yksikköä/mg, joka proteiini niinikään stimuloi pääasiassa 25 makrofagituotantoa. Waheed, A. et. ai.. Blood 6 0 (1982) 238 kuvasivat hiiren L-solu-CSF-1:n puhdistusta näennäiseen homogeenisuuteen kaniinivasta-ainekolonnia käyttäen ja ilmoittivat hiirisekvenssin 25 ensimmäistä aminohappoa (Ben-Avram, C.M. et. ai. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA 882 30 (1985) 4486.

Stanley, E.R. et. ai.. J. Biol. Chem. 252 (1977) 4305-4312 julkaisivat puhdistusmenettelyn ihmisvirtsasta peräisin olevalle CSF-l:lle ja Das, S. K. et. ai, Blood 58 (1981) 630; Biol. Chem. 257 (1982) 13679 saivat 35 spesifisen aktiivisuuden 5 x 107 yksiköä/mg omaavaa ih- misvirtsaCSF-1:tä, joka tuotti ainoastaan makrofagipesäk-keitä, ja luonnostelivat viljellyistä hiiren L-soluista 3 102190 ja ihmisvirtsasta valmistettujen CSF-1-proteiinien gly-kosylaation suhdetta niiden aktiivisuuksiin. Wang, F.F. et. ai.. J. Cell. Biochem. 21 (1983) 263 eristivät ihmis-virtsa-CSF-1:tä spesifiseen aktiivisuuteen 108 U/mg. Wa-5 heed, A. et. ai. julkistivat ihmisvirtsa-CSF-1:n puhdistuksen spesifiseen aktiivisuuteen 0,7 - 2,3 x 107 U/mg kaniinivastaainekolonnissa (Exp. Hemat. 12 (1984) 434) .

Wu, M. etj. al^., Biol. Chem. 254 (1979) 6226 ilmoittivat CSF-proteiinin valmistuksen viljellyistä ihmi-10 sen haimasyöpä- (MIAPaCa-) soluista, joka proteiini johti hiiren jyvässolu- ja makrofagipesäkkeiden kasvuun. Saadun proteiinin spesifinen aktiivisuus oli noin 7 x 107 yksik-köä/mg.

Eri CSF-tyyppien osittain puhdistettuja valmistuk-15 siä on ilmoitettu myös ihmisen ja hiiren keuhkosoluilla käsitellystä kasvualustasta (Fojo, S.S. et. ai.. Biochemistry 17 (1978) 3109; Burgess, A.W. et. ai. J. Biol.

Chem. 252 (1977) 1998); ihmisen T-imusoluvarhaismuo-tosoluista (Lusis, A.J. et. ai. Blood 57 (1981) 13; US-20 patenttijulkaisu 4 438 032); ihmisen istukalla käsitellystä kasvualustasta näennäiseen homogeenisuuteen ja spesifiseen aktiivisuuteen 7 x 107 U/mg (Wu, M. et. ai. Biochemistry 19 (1980) 3846).

CSF-proteiinien yleensä, ja CSF-1:n erityisesti, : 25 hyödyntämisessä jossain hyödyllisessä käytössä on merkit tävä vaikeus ollut, ettei niitä ole ollut saatavana riittävinä määrinä erillisessä ja luonnehdintakelpoisessa muodossa, jolloin niiden käyttäminen terapeuttisessa käytössä olisi käytännöllistä tai edes mahdollista. Kyseinen 30 keksintö korjaa nämä puutteet tarjoamalla lähtöainetta .· puhdistetun ihmis- ja hiiri-CSF-1:n saamiseksi käyttökel poisina määrinä rekombinaatiomenettelyiden avulla.

Toisen alaluokan CSF-proteiinia, hiiri- ja ihmis- GM-CSF:ää, on puhdistettu ja cDNA:t kloonattu. Tämän pro-35 teiinin osoitettiin olevan muista CSF-tyypeistä, esim.

CSF-1:stä, poikkeava, Goughin et. ai, Nature 309 (1984) 763-767, toimesta. Tätä GM-CSF-proteiinia kuvataan edel- 4 102190 leen patenttijulkaisussa W087/02060, joka julkaistiin 9. huhtikuuta 1987, hyödylliseksi syöpäpotilaiden hoidossa valkosolujen uudelleensynnyttäraiseksi perinteistä syöpä-hoitoa seuraten ja virus-, bakteeri-, home- ja parasiit-5 titartunnan todennäköisyyden vähentämiseksi esim. immuunikadon (AIDS:n) yhteydessä. Hiiri-IL-3:a ovat kloonanneet Fung, M.C. et. ai.. Nature 307 (1984) 233. Ihmis-ja gibboni-IL-3:a ovat kloonanneet Yang, Y.-C. et. ai., Cell 47 (1986) 3-10, ja Dorssers, L. et. ai.. Gene 10 (1987), painossa. Katso myös Yokota, T. et. ai. PNAS 81 (1984) 1070-1074; Wong, G.G. et^_ ai* Science 228 (1985) 810-815; Lee, F. et^. ai* PNAS 82 (1985) 4360-4364; ja Cantrell, M. A. ai*, PNAS 82 (1985) 6250-6254) .

Yhtä ihmis-CSF-1-muotoa koodaavan cDNA:n kloonaus, 15 erityisesti alla pcCSF-17:ksi nimetty klooni, on myös julkaistu (Kawasaki, E. S. et. ai. Science 230 (1985) 292 296); PCT-hakemusjulkaisu nro W086/04607, julkaistu 14. elokuuta 1986. Ihmis-CSF-1:n "pitkää muotoa" koodaavan kloonin talteenoton ovat julkaisseet Wong, G.G. et.

20 ai.. Science 235 (1987) 1504-1509 ja Ladner, M.D. et. ai.. EMBO J^. 6 (1987) 2693-2698.

Keksinnön kuvaus

Kyseinen keksintö koskee ihmis-CSF-l-proteiinien aiemmin julkistamattomien muotojen valmistusta. Erityisesti kuva-: 25 taan ihmisproteiinien ja vastaavien hiiriproteiinien eri laisia "pitkiä muotoja", sekä lyhyestä muodosta saatuja spesifisiä uusia muteiineja.

Täten eräänä näkökohtana tässä kuvataan ihmis- tai hiiri-CSF-l-proteiinien (huCSF-1 ja muCSF-1) alaryhmää ja 30 näitä proteiineja koodaavaa DNA:ta. Jotkut tässä kuvattujen proteiinien spesifiset muodot sisältävät noin 522 aminohappoa, tai ovat tämän pituisesta natiivista sekvenssistä saatuja fragmentteja ja/tai muteiineja; muut ovat pcCSF-17:n koodaaman proteiinin yksittäis- tai kak-35 soiskorvausmuteiineja. Pitkään muotoon liittyviä ihmis-proteiineja kuvataan suhteessa kuviossa 2 esitettyyn aminohapposekvenssiin, merkittyinä LCSF, ja lyhyeeseen 5 102190 muotoon liittyviä kuviossa 1 esitettyyn, merkittyinä SCSF.

Lisänäkökohtina keksintö koskee näiden proteiinien tuotannossa hyödyllisiä materiaaleja, niiden tuotannossa 5 hyödyllisiä modifioituja mikro-organismeja ja solulinjoja ja parannettuja tuotantomenetelmiä.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuviossa 1 esitetään DNA-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi ihmis-CSF-1:n "lyhyttä muotoa" (SCSF) 10 koodaavalle cDNA-kloonille, nimettynä pcCSF-17:ksi.

Kuviossa 2 esitetään huCSF-l:n "pitkää muotoa" (LCSF) koodaavan cDNA:n cDNA-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi.

Kuvio 3 on kaaviokuva genomisesta kloonista, jossa 15 näkyy ihmis-CSF-1:n lyhyen ja pitkän muodon alkuperä.

Kuviossa 4 esitetään cDNA-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi muCSF-l:tä koodaavalle hiiren 4 kb:n kloonille.

Kuviossa 5 esitetään cDNA-sekvenssi ja johdettu 20 aminohapposekvenssi samanlaista muCSF-l:tä koodaavalle hiiricDNA:n 2 kb:n kloonille.

Kuviossa 6 esitetään RP-HPLC rekombinantti-CSF:lle, joka on tuotettu Ε^_ colissa SCSF/CV158:aa koodaavan geenin ilmaisusta.

25 Kuviossa 7 esitetään RP-HPLC rekombinantti- CSF: lie, joka on tuotettu E_i. colissa asp59SCSF/CVl50: tä koodaavasta geenistä.

Kuviossa 8 esitetään RP-HPLC-analyysi vastaavalle N-päätydeletoidulle muodolle, asp59SCSF/NV2CVl50.

30 Keksinnön mukaiselle DNA-sekvenssille on tun nusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa I esitetään. Keksinnön mukaiselle vektorille, ilmentämisjärjestelmälle ja rekombinanttibakteeri-isäntäsolulle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 6, 8 ja 9 vastaavasti esite-35 tään. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rekombinantti- CSF-l:n valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 10 esitetään.

102190

Kuviossa 9 esitetään RP-HPLC-analyysi ^spggSCSF/N^^3C^150jtä koodaavan geenin ilmaisutuotteelle.

Suoritusmuotoja keksinnön suorittamiseksi A. Määritelmiä 5 "Pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1- (CSF-1-) aktiivi suutta omaavalla proteiinilla" tarkoitetaan proteiinia, joka osoittaa alalla CSF-l:lle käsitetyn mukaisen aktii-visuusspektrin, eli käytettynä Metcalfin, D., J. Cell. Physiol. 76 (1970) 89, standardimuotoisessa in vitro pe-10 säkestimulaatiomäärityksessä se johtaa pääasiallisesti makrofagipesäkkeitten muodostukseen. Natiivi CSF-1 on glykosyloitu dimeeri; joissain tapauksissa dimeroitumisen arvellaan olevan aktiivisuudelle välttämätöntä. Keksinnön ja CSF-1:n määritelmän puitteissa tarkastellaan sekä dimee-15 risiä että monomeerisiä muotoja. Monomeerinen muoto voidaan muuttaa dimeeriksi tarjoamalla in vitro sopivat olosuhteet, ja monomeeri sinänsä on käyttökelpoinen antigeeninä anti-CSF-l-vasta-aineiden tuottamiseksi.

Ilmeisesti esiintyy jonkin verran lajispesifisyyttä: 20 ihmis-CSF-1 vaikuttaa sekä ihmis- että hiiriluuydinsolui- hin; hiiri-CSF-1 ei osoita aktiivisuutta ihmissolujen yhteydessä. Tämän vuoksi "ihmis"-CSF-1:n tulisi olla positiivinen Dasin, S.K. et. ai., Blood 58 (1981) 630, spesifisessä hiiriradioreseptorimäärityksessä, vaikka välttä-25 mättä ei esiinny täydellistä korrelaatiota. Proteiinin biologisen aktiivisuuden inhiboi yleensä myös ihmisvirt-sa-CSF-l:tä neutraloiva vastaseerumi (Das, S.K., et. ai. supra). Kuitenkin tietyissä erityisissä olosuhteissa (kuten esimerkiksi jonkin tietyn vasta-ainevalmisteen 30 tunnstaessa CSF-l-epitoopin, joka ei ole biologiselle toiminnalle oleellinen ja jota epitooppia ei esiinny testattavassa nimenomaisesa CSF-l-muteiinissa), tämä kriteeri saattaa olla täyttymättä.

Nyttemmin on todettu CSF-1:n tiettyjä muita ominai-35 suuksia, mukaanlukien tämän proteiinin kyky stimuloida 7 102190 E-sarjan prostaglandiinien, interleukiini-l:n ja interferonin eritystä kypsistä makrofageista (Moore, R., et-, ai. Science 223 (1984) 178) . Näiden viimemainittujen aktiivisuuksien mekanismia ei tällä hetkellä ymmärretä, ja tässä 5 kyseessä olevan määrittelyn tarkoituksiin määritelmän täyt-tymiskriteeri nojaa kykyyn stimuloida monosyytti/makrofagi-pesäkkeitten muodostusta käytettäessä tarkoituksenmukaisen lajin luuydinsoluja lähtömateriaalina, useimmissa olosuhteissa (katso yllä) tämän aktiivisuuden inhiboitumiseen puh-10 distetun ihmisvirtsa-CSF-1:n vastaisen neutraloivan vasta-seerumin toimesta, ja silloin kuin lajityypille tarkoituksenmukaista, positiiviseen vasteeseen radioreseptorimääri-tyksessä. (Tiedetään, että CSF-l:n lisäännyttävä vaikutus rajoittuu yksitumaisten fagosyyttien solulinjojen soluihin 15 (Stanley, E. R. The Lymphokines (1981), Stewart, W. E., II, et. ai., toim., Humana Press, Clifton, NJ, ss. 102-132) ja että CSF_reseptorit rajoittuvat näihin solulinjoihin (Byrne, P.V., et. ai. Cell. Biol. 91 (1981) 848) ja istukan tropo-blastisukuisiin soluihin.

20 Kuten kaikkien proteiinien osalta asian laita, täsmäl linen kemiallinen rakenne riippuu lukuisista tekijöistä.

Koska ionisoitumiskykyisiä amino- ja karboksyyliryhmiä on molekyylissä läsnä, nimenomainen proteiini voidaan saada happamana tai emäksisenä suolana, tai neutraalissa muodos-25 sa. Kaikki tällaiset valmisteet, jotka säilyttävät aktiivisuutensa sopiviin ympäristöolosuhteisiin vietyinä, lukeutuvat määritelmän piiriin. Lisäksi primääristä aminohappo-sekvenssiä voidaan, mikäli se voidaan tehdä aktiivisuutta tuhoamatta, modifioida hapettamalla tai pelkistämällä, tai 30 lisätä johdannaismuodostuksella käyttäen sokeriosuuksia (glykosylointi) tai muilla täydentävillä molekyyleillä kuten lipidit, fosfaatti-, asetyyliryhmät ja samankaltaiset, tavallisemmin konjugoimalla sakkarideihin.

Tässä julkistettujen geenien koodaamia proteiineja 35 voidaan prosessoida myös proteolyysillä. Arvellaan, että 8 102190 CSF-1 saattaa esiintyä luonnossa yhtenä tai useampana C-pää-tydeletoituna muotona. Primäärinen aminohapporakenne (riippumatta siitä, onko se leikkaantunut C-päädystä vai ei) saattaa niinikään aggregoitua muodostamaan komplekseja, 5 useimmiten dimeerejä. Natiivi ihmisvirtsa-CSF-1 eristetään erittäin glykosyloituna dimeerinä, jonka pituus on 45-90 kd:tä, mittausmenetelmästä ja ilmoittavasta henkilöstä riippuen. Muista lähteistä, kuten monosyyteistä, HL-60- ja PanC-solulinjoista, peräisin olevat natiivit ihmis-CSF-l-proteii-10 nit omaavat samankaltaisia ominaisuuksia. MIAPaCa-peräinen CSF-1 näyttää olevan kompleksinen seos glykosyloituja dimee-risiä proteiineja, joiden monomeerien molekyylipainot ovat 70, 48, 40, 30 ja 26 kdrtä SDS-PAGE-immuuniblot-määrityk-sillä määritettyinä. Tietyt puolet tällaisista lisäyksistä 15 tulevat suoritetuiksi tuottavan isännän translaation jäl keisten prosessointijärjestelmien toimesta; muita tällaisia modifikaatioita voidaan tehdä in vitro. Joka tapauksessa tällaiset modifikaatiot sisältyvät määritelmään, kunhan proteiinin yllä määritellyn mukainen aktiivisuus ei tuhou-20 du. On luonnollisesti odotettavissa, että tällaiset modi fikaatiot saattavat vaikuttaa aktiivisuuteen kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti, joko tehostamalla tai alentamalla proteiinin aktiivisuutta eri määrityksissä. Hakeva taho on nimenomaisesti osoittanut, että ei-glykosyloitu mo-25 nomeeri saattaa omata aktiivisuutta tietyissä määrityksissä.

• Deglykosyloidun monomeerin molekyylipainoa on tutkit tu, mutta selkeitä johtopäätöksiä ei voitu tehdä ottaen huomioon vaikeus varmistaa proteolyysin puuttuminen fermen-toinnissa, puhdistuksessa ja deglykosylaatioreaktiossa.

30 Kuitenkin Das, S.K., et. ai., J. Biol. Chem. 257 (1982) 13679-13684, kuvasivat tämän deglykosyloidun dimeerin mo-lekyylipainon olevan ainoastaan 14-17 kdrtä. Wongin, G.G., et. ai. (1987) (supra), raportoiman rekombinaatio-tuotetun CSF-1:n molekyylipaino ilmeisesti on noin 21 kdrtä. 35 Toisaalta CSF:n "lyhyelle" 224 aminohapon muodolle (SCSF) 9 102190 johdetun aminohapposekvenssin perusteella laskettu mole-kyylipaino on noin 26 kd:tä, kun taas "pitkän” muodon (LCSF) molekyylipainon on laskettu olevan noin 55 kd:tä. Ilmaistaessa näiden geenien deletoituja rakenteita 5 E. colissa (jossa ei esiinny glykosylaatiota) ne luonnollisesti johtavat proteiineihin, joiden molekyylipaino on huomattavasti alhaisempi, 17-18 kd:tä SCSF/C%?15Q:lle ja noin 30 kdrtä LCSF/CV221;lie. Ilmaistaessa LCSF tai SCSF nisäkäs- tai hyönteissoluissa saadaan korkeampia molekyy-10 lipainoja, mutta on vaikeata sanoa, missä määrin nämä johtuvat glykosylaatiosta ja missä määrin ne johtuvat primäärisestä aminohapposekvenssistä sinänsä. Kuten edellä on mainittu, vaikuttaa siltä, että natiivisti tuotetut proteiinit saattavat itseasiassa sisältää C-päätytypistyksiä.

15 Tiedetään luonnollisesti hyvin, että bakteereissa tuotetut kypsät proteiinit, joita välittömästi edeltää ATG-aloituskodoni, voivat sisältää tai olla sisältämättä N-päätymetioniinin tuotto- ja talteenottomuodossaan. Täten molemmat muodot luetaan mukaan. Lisäksi N-päätysekvenssin 20 lievä modifiointi saattaa auttaa N-päätymetioniini proses soinnissa ja jatkotekstissä osoitetaan, että jäännöksien 1 ja 2 (kummatkin glutamiinihappo-) tai jäännöksien 1-3 (glu-glu-val) deletio auttaa tällä tavalla. Täten myös nämä muodot sisältyvät selvästi määritelmään.

25 N-päädyssä tehokkaammin prosessoitujen ilmaisutuot- . teiden antamisen ohella E. colissa näitä N \72- ja N V3-mu- teiineja koodaavista geeneistä tuotetut proteiinit ovat verraten homogeenisiä RP-HPLC:llä määritettyinä verrattuna ilmaisutuotteisiin geeneistä, jotka koodaavat muotoja, jois-30 sa kyseiset kaksi N-päätyglutamiinihappojäännöstä ovat tal lella. Tämä heterogeenisyys saattaa olla näiden proteii-.· nien ilmaisuun bakteereissa liittyvä ilmiö, koska sitä ei esiinny ilmaistaessa geenit nisäkässoluissa kuten CV-1-soluissa.

10 102190

Mitä tulee N-päätymodifikaatioiden vaikutukseen N-päätymetioniiniprosessointiin: ilmaistaessa kypsää proteiinia koodaavia rakenteita solunsisäisesti E. colissa vaikuttaa siltä, että tuottunutta proteiinia ei ole oleel-5 lisesti laisinkaan prosessoitu N-päätymetioniinin poistamiseksi, eli proteiinipuhdistuksesta talteensaatu sekvens-soitavissa oleva materiaali kokonaisuudessaan alkaa metrllä. Kuitenkin jos ilmaistaan 2-deletoituja CSF-l-muteiineja koodaavia vastaavia rakenteita samanlaisissa olosuhteissa, 10 23 % proteiinista on N-pääty-met-vajaassa muodossa. NV3-ra- kenteille N-päädyssä metioniin poistamiseksi prosessoidun proteiinin prosentuaalinen osuus kohoaa noin 95 %:iin.

Heterogeenisyyden osalta suoritettaessa käänteisfaa-si-HPLC-analyysi eri rekombinanttirakenteista E. colissa 15 tuotetulle pelkistyneelle CSF-l-proteiinille kypsää N-pää- tyä koodaavat rakenteet osoittavat heterogeenisyyttä kahdella tasolla. Ensinnäkin esiintyy kaksi suunnilleen saman rao-lekyylipainon ja saman näennäisen aminohappokoostumuksen omaavaa piikkiä, joiden pinta-alasuhde on noin 70:30. Muka-20 na on lisäpiikki tuloksena sisäisestä uudelleenaloituksesta, joka esiintyy tyrosiinin jäännökseksi 59 koodaavissa klooneissa kuten esitetty kuviossa 6. Tämä komplikaatio poistetaan geenin uudelleensuunnittelulla ylävirtaan asemasta 65 kuten alla kuvattu. Rakenteissa, jotka koodaavat 2-25 ja N ^73-muotoja ja jotka koodaavat asp:n jäännökseksi 59, edullisesti GAT-kodonista, ei esiinny sisäistä uudelleen-aloitusfragmenttia ja ne sisältävät vain proteiinia, joka omaa kypsä-proteiinikoostumuksien 70 %:n piikin retentio-a jän.

30 Yhteenvetona N-pääty- ja C-päätydeletioiden ja -agg- regaatioiden ohella ketjun yksittäisiä aminohappojäännök-• - siä voidaan modifioida hapettamalla, pelkistämällä tai muulla johdannaismuodostuksella, ja näitä proteiineja voidaan myös pilkkoa ja/tai aggregoida aktiivisuuden säi-35 lyttäneiden fragmenttien saamiseksi. Tällaiset aktiivi- 102190 suutta ei-tuhoavat muutokset eivät poista proteiinisek-venssiä määritelmän piiristä, ja sisällytetään nimenomaan mukaan. Muista lajeista saatu CSF-1 saattaa sopia määritelmään proteiinista, joka omaa "ihmis"-CSF-l-aktii-5 visuutta, sen ansiosta, että se osoittaa edellä esitetyn mukaisen vaadittavan aktiivisuuskuvion ihmissubstraat-tiin nähden.

Kuviossa 1 esitetään aminohapposekvenssi ihmis-CSF-l:n nimenomaiselle muodolle, jota koodaa rekombinantti-cDNA-10 klooni pcCSF-17. Tämä proteiini sisältää 224 aminohappoa kypsässä sekvenssissä ja 32 aminohapon johtosekvenssin.

Kuten tässä osoitettu tämän kloonin ilmaisutuotteena tuotettu proteiini on aktiivista CSF-1:lie spesifisissä määrityksissä, nimittäin luuydinlisääntymismäärityksessä (jossa 15 aktiivisuus tuhotaan lisäämällä anti-CSF-l-vasta-aineita), pesäkestimulaatiomäärityksissä ja radioreseptorimääri-tyksessä.

Kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin, pääteltynä tässä havainnollistetusta cDNA-kloonista, omaava kyp-20 sä proteiini nimetään lyhenteellä CSF-1 (SCSF).

Kuviossa 1 esitetään 32 jäännöksen otaksutun sig-naalisekvenssin läsnäolo, joka oletettavasti lohkeaa erityksen nisäkässoluista yhteydessä; SCSF:ää edustavat tuossa kuviossa esitetyt aminohapot 1-224. Nimenomaisesti kek-25 sintöön sisältyvät muteiinit, jotka ovat monomeerejä tai dimeerejä tietyistä SCSF-sukulaismuodoista, jotka on osoitettu tässä niiden erojen SCSF:stä avulla.

Kätevyyden vuoksi SCSF:n aminohapposekvenssiä käytetään mallina ja muut läheistä sukua olevat CSF-l-aktiivi-30 suutta omaavat sekvenssit osoitetaan viittaamalla kuvios sa 1 esitettyyn sekvenssiin. Koska N-päätymetioniini ; voi olla läsnä tai puuttua, molemmat muodot luetaan mu kaan kaikissa tapauksissa, joissa CSF-l-proteiini tuotetaan bakteereissa. Tietyn aminohapon korvaaminen ilmoite-35 taan viittaamalla aminohappojäännökseen, jonka se korvaa.

12 102190 Täten esimerkiksi ser^SCSF viittaa proteiiniin, joka omaa kuviossa 1 esitetyn sekvenssin lukuunottamatta, että aminohappo asemassa 90 on seriini eikä kysteiini. Päätydeletiot ilmoitetaan NV:llä, jota seuraa N-pääty-5 sekvenssistä deletoitujen aminohappojen lukumäärä, tai CV:Hä ja viimeisen säilyneen aminohapon asemalla dele-toitaessa jäännöksiä C-päätysekvenssistä. Täten "SCSF/Ny^'1 tai "SCSF:n NV^-muoto" viittaa kuvion 1 mukaiseen CSF-l:een, josta natiivista N-Däädystä on deletoi-10 tu 4 ensimmäistä aminohappoa; "SCSF/C^ISO" tai "SCSF:n C ^130-muoto" viittaa CSF-l:een, josta aminohappoa 130 seuraavat viimeiset 94 aminohappoa on deletoitu. Alla havainnollistetaan esimerkiksi asp^gSCSFsää (joka sisältää geenin asemaan 59 koodaaman asparagiinihappojäännök-15 sen, eikä cDNA:n koodaamaa tyrosiinijäännöstä) ja SCSF/C'y’ISSjaa, joka käsittää ainoastaan SCSF:n aminohapot 1-158.

CSF-l-proteiineja, jotka sisältävät aminohapposekvenssejä, jotka ovat sukua talteenotetusta pitkän muodon 20 cDNA:sta johdetuille sekvensseille, eli jotka sisältävät 298 aminohapon "ylimäräisen" segmentin insertoituna jäännöksen 150 kohdalle pcCSF-17:n koodaamassa proteiinissa, pidetään proteiinin pitkinä muotoina, ja kuviossa 1-522:na esitetty aminohapposekvenssi nimetään mielivaltaisesti 25 LCSFzksi. Jälleen E. colissa tuotettuna tätä saattaa edeltää tai saattaa olla edeltämättä metioniini. LCSFzn muteiinien osalta merkitseminen on analogista edellä SCSFrään liittyen kuvattuun nähden.

Se 522 aminohapon sekvenssi, joka on koodautu-30 nut esimerkiksi pcDBhuCSF-4:ään ja sen vastaaviin kloonei- hin, on LCSFtn aminohapposekvenssi ja voidaan myös merki-1 tä huCSF-1. Hiirisekvenssien osalta molemmat talteensaa- dut kloonit koodaavat 520 aminohappoa sisältäviä "pitkiä muotoja". Nämä kaksi tiiviisti homologista sekvenssiä 35 merkitään yhteisesti muLCSF-1:ksi. Tässä käytettyihin 13 102190 lyhenteisiin kuuluu myös "huCSF-1" kaikille proteiinin ihmismuodoille ja "muCSF-1" sen hiirimuodoille.

Tässä käytettynä "erillinen peptidi" tai "muteiini" viittaa nimenomaiseen primääriseen aminohapposekvenssiin, 5 joka ei ole osa suuremmasta sekvenssistä. Täten nämä ilmai sut viittaavat peptidimolekyyleihin, jotka eivät omaa lisää N- ja C-aminohapposekvenssijatkeita. Tässä esitetyt CSF-l-aktiivisuutta omaavat proteiinivalmisteet voivat kuitenkin olla monomeerejä, dimeerejä tai muita näiden 10 erillisten peptidien tai muteiinien aggregaatteja.

"Toiminnallisesti kytketty" viittaa limittymiseen siten, että rakenneosien normaali toiminta voidaan suorittaa. Täten kontrollisekvensseihin "toiminnallisesti kytketyllä" koodaavalla sekvenssillä tarkoitetaan konfiguraatiota, jossa 15 koodaava sekvenssi voidaan ilmaista näiden sekvenssien säätelyn alaisena.

"Kontrollisekvensseillä" viitataan DNA-sekvensseihin, jotka ovat välttämättömiä toiminnallisesti kytketyn koo-daavan sekvenssin ilmaisemiseksi tietyssä isäntäorganis-20 missä. Prokaryooteille soveliaita kontrollisekvenssejä ovat esimerkiksi promoottori-, valinnaisesti operaattori-sekvenssi, ribosomisitoutumiskeskus, ja mahdollisesti muut toistaiseksi huonosti ymmärretyt sekvenssit. Eukaryoottis-ten solujen tiedetään käyttävän promoottoreita, polyadeny-25 laatiosignaaleja ja tehostimia.

"Ilmaisujärjestelmällä" viitataan DNA-sekvensseihin, jotka sisältävät halutun koodaavan sekvenssin ja kontrolli-sekvenssit toiminnallisesti kytkettyinä, jolloin näillä sekvensseillä transformoidut isännät kykenevät tuottamaan 30 koodattuja proteiineja. Transformoinnin suorittamiseksi ilmaisujärjestelmä voidaan sisällyttää vektoriin; kuitenkin « : oleellinen DNA saatetaan yhtä kaikki myös integroida isän- täkromosomiin.

Tässä käytettynä "solua", "solulinjaa" ja "soluvil-35 jelmää" käytetään keskenään vaihtoehtoisesti ja kaikkiin 102190 tällaisiin merkintöihin lukeutuvat jälkeläiset. Täten "transformantteihin" tai "transformoituihin soluihin" kuuluvat ensisijainen kohdesolu ja siitä peräisin olevat viljelmät riippumatta siirtojen lukumäärästä. Huomattakoon 5 myös, että kaikki jälkeläiset eivät ehkä ole täsmälleen identtisiä DNA-sisällön osalta johtuen harkituista tai tahattomista mutaatioista. Mukaan luetaan mutanttijälkeläiset, jotka omaavat saman funktionaalisuuden kuin minkä suhteen alkuperäinen transformoitu solu seulottiin. Tarkoitet-10 taessa erillisiä merkintöjä se ilmenee selvästi asianyhtey- destä.

"Tehokas määrä" tarkoittaa spesifioidun toiminnan, kuten kasvainten tappaminen tai kasvainkuorman vähentäminen tai tarttuvien tautien parantaminen, suorittamiseksi teho-15 kasta määrää.

B. CSF-l:n tuottaminen farmaseuttiseen käyttöön:

Geenien hankkiminen

Vaikka CSF-l:ksi nimetyn aktiivisuuskuvion olemassaolosta oli jo jonkin aikaa oltu perillä, vastuussa olevaa 20 proteiinia ei ollut koskaan saatu sekä riittävän puhtaana että riittävinä määrinä sekvenssimäärityksen mahdollistumiseksi, eikä riittävän puhtaana ja riittävänä määränä ollakseen hyödyllistä terapeuttisessa käytössä. Koska ei ollut ollut saatavana täysin puhtaita käytännöllisiä mää-25 riä proteiinia eikä sen koodaavaa DNA:ta, ei ollut ollut mahdollista optimoida rakennemodifikaatioita muteiineja tuottamalla, eikä ollut ollut mahdollista käyttää tätä proteiinia terapeuttisessa yhteydessä.

Rekombinanttimenettelyiden käyttö korjaa nämä puut- 30 teet. Kuten on kuvattu PCT WO86/04607:ssä (supra), eristetyn ihmisvirtsa-CSF-1:n N-päätysekvenssiin perustuvia koettimia käytettiin ihmisgeenikirjaston seulontaan täysimittaisen geenin saamiseksi. Ihmisgenomin kloonattu sekvenssi voidaan ilmaista suoraan käyttäen sen omia kont-35 rollisekvenssejä, tai nisäkäsjärjestelmille soveltuvis- 15 102190 sa introneita prosessoimaan kykenevissä rakenteissa. Genomisekvenssejä käytettiin samoin koettimina ihmis-cDNA-kirjastolle, joka oli saatu CSF-l:tä tuottavasta solulin-jasta, CSF-l-aktiivisuutta omaavaa proteiinia koodaavan 5 pcCSF-17-cDNA:n saamiseksi. Tämä cDNA voidaan sopivasti valmistettuna ilmaista suoraan COS- tai CV-l-soluissa ja se voidaan rakentaa vektoreihin, jotka soveltuvat ilmaisuun laajassa isäntävalikoimassa. Kuten edeltävässä hakemus julkaisussa on kuvattu , tietyt primäärirakenteen modi-10 fikaatiot osoittavat niinikään CSF-l-aktiivisuutta.

Kuten tässä kuvattu proteiinin 224 aminohappomuotoa koodaavaa ihmis-cDNA:ta käytettiin koettimena hiiri-CSF-l:tä koodaavien sekvenssien saamiseksi cDNA-pankista valmistettuna AgtlO:een L-929-mRNA:sta, jota oli rikastettu 15 CSF-1-tuottokyvyn suhteen. Saatiin kaksi samankaltaista 52JD aminohapon proteiinia koodaavaa kloonia. Kloonit poikkeavat näyttävästi 31-ei-translatoidulla alueella. Pitem-mässä 4 kb:n hiirikloonissa 3'-ei-translatoitu alue on yli 2 kb:tä ja muistuttaa vastaavaa ihmissekvenssiä vain 20 vähän; toinen lyhempi 2 kb:n klooni sisältää noin 500 bp:tä ei-translatoitua aluetta ja osoittaa huomattavaa homologiaa vastaavaan ihmis-DNA:han nähden.

Sitten näitä hiirikirjastosta saatuja CSF-1:n pitkiä muotoja käytettiin perustana koettimien valmistuksessa 25 vastaavan pitkän ihmissekvenssin saamiseksi, jonka primää- rirakenne on koodautunut genomiin. Hiiri-cDNA-sekvenssien vertaamisen ihmisgenomisekvenssiin perusteella geenin alueen, joka joskus käyttäytyy kuten intronialue, todettiin koodaavan aminohapposekvenssiä, joka osoittaa huomat-30 tavaa homologiaa hiirisekvenssin sisältyvään "ylimääräi seen" 298 aminohapon segmenttiin nähden. Tämä mahdollisti oligonukleotidikoettimen rakentamisen perustuen • "ylimääräiseen" DNA:hän, joka hiirijärjestelmässä oli translatoitunut proteiiniksi. Koska ihmisen genomisek-35 venssi oli saatavana, koettimen rakenne suunniteltiin otta maan huomioon täsmällinen ihmissekvenssi.

16 102190

Oli valmistettu pcCSF-17:ää Okayama-Berg-rvektorina MIAPaCa-mRNA:sta, jota oli rikastettu CSF-l:tä koodaavil-la aineksilla; kuitenkin cDNA-kirjasto, josta pitkää muotoa koodaava cDNA saatiin, valmistettiin MIAPaCa-so-5 luista uutetusta kokonais-mRNA:sta ja kloonattiin "λgtlO:een 'XgtlO-kirjastoa seulottiin ensin käyttäen koettimena pcCSF-17-sekvenssejä ja valitut koetinpositiiviset ehdokkaat seulottiin käyttäen oligonukleotidikoetinta perustuen hiiri-cDNA:n "ylimääräiseen" translatoituvaan sekvenssiin, 10 mutta modifioituna vastaamaan sukulaisaluetta ihmisgeno-missa. Saatiin useita ihmisproteiinin vastaavaa "pitkää muotoa" koodaavia klooneja.

"Pitkä muoto" syntyy ilmeisesti erosta mRNA-paloit-telussa kuten esitetty kuviossa 3. "Ylimääräinen" koodi-15 sekvenssi mRNA:ssa syntyy DNA:sta, joka sijaitsee ekso-nin 6 ylävirtapäädyssä; se on leikkaantunut pois lyhyessä muodossa. Erilaiset mRNA-koodatut LCSF:t poikkeavat samoin 3'-päädyssä (mutta eivät proteiinisekvenssissä).

Proteiinin "pitkää muotoa" koodaava cDNA sekä hiiri-20 että ihmisjärjestelmistä voidaan ilmaista samankaltaisella tavalla kuin käsiteltiin edeltävän lyhyen muodon yhteydessä. Sopivia isäntiä ovat nisäkässolut primäärisen proteiinituotteen tehokkaamman prosessoinnin saamiseksi ja ligatoinnin ilmaisuvektoreihin ansiosta bakteeri-, 25 hiiva- ja hyönteissolut tai muut isännät.

Luonnollisesti kutakin näistä sekvensseistä koodaa-van DNA:n saatavana olo tuottaa mahdollisuuden kodonisek-venssin modifiointiin muteiinimuotojen luomiseksi, jotka niinikään omaavat CSF-l-aktiivisuutta.

30 Täten nämä työvälineet voivat tarjota ihmis- tai hiiri-CSF-1:n täydellisen koodisekvenssin, josta voidaan rakentaa moninaisiin isäntäjärjestelmiin soveltuvia ilmaisuvektoreita ja ilmaista koodisekvenssit. Saatavana olevien isäntien moninaisuus tällaisille isännille 35 sopivien ilmaisuvektorien ohella mahdollistaa valinnan 17 102190 translaation jälkeisten prosessointijärjestelmien välillä ja ympäristötekijöiden valinnan, jotka tuovat konformaatio-säätelyä näin tuotettuun proteiiniin.

Edeltävästä on ilmeistä, että CSF-l:tä koodaavan 5 sekvenssin osat ovat hyödyllisiä koettimina muiden CSF-l:tä koodaavien sekvenssien saamiseksi moninaisista lajeista. Täten cDNA:n tai genomi-DNA:n osia, jotka koo-daavat vähintään kuutta aminohappoa, voidaan replikoida E. colissa ja käyttää denaturoituja muotoja koettimina 10 muiden CSF-l:tä koodaavien DNA-sekvenssien saamiseksi.

Koska mahdollisesti ei esiinny täsmälleen tarkkaa sopivuutta ihmismuodon nukleotidisekvenssin ja muun lajin vastaavan osuuden sekvenssin välillä, noin 18 nukleotidiä sisältävät oligomeerit {jotka koodaavat kyseistä 15 kuuden aminohapon pituutta) ovat todennäköisesti välttämättömiä hybridisaation saamiseksi riittävän ankarissa olosuhteissa väärien positiivisten eliminoimiseksi. Kuutta aminohappoa koodaavat sekvenssit antaisivat tällaisia koettimia varten riittävän informaation.

20 C. Sopivia isäntiä, kontrollijärjestelmiä ja menetelmiä

Yleensä ottaen CSF-l:n jonkin rekombinanttimuodon tuotanto käsittää tyypillisesti seuraavan:

Ensin hankitaan DNA, joka koodaa kypsää (käytettynä 25 tässä kaikki muteiinit kattaen) proteiinia, esiproteii- I nia, tai CSF-l-proteiinin fuusiota lisäsekvenssiin, joka ei tuhoa sen aktiivisuutta, tai lisäsekvenssiin, joka on pilkottavissa säädellyissä olosuhteissa (kuten peptidaa-sikäsittely) aktiivisen proteiinin saamiseksi. Jos intro-30 nit eivät katkaise sekvenssiä, se sopii ilmaistavaksi mis sä tahansa isännässä. Jos esiintyy introneja, ilmaisuun .* päästään niitä prosessoimaan kykenevissä nisäkäsjärjestel missä tai muissa eukaryoottisissa järjestelmissä. Tämän sekvenssin tulisi olla irtileikattavassa ja talteensaata-35 vassa muodossa. Leikattu tai talteenotettu koodisekvenssi 18 102190 sijoitetaan sitten edullisesti toiminnalliseen kytkentään sopivaan kontrollisekvenssiin toisiintuvassa ilmaisuvekto-rissa. Tätä vektoria käytetään sopivan isännän transfor-moimiseksi ja transformoitua isäntää viljellään suotui-5 sissa olosuhteissa rekombinantti-CSF-1:n tuottamisen aikaan saamiseksi. Valinnaisesti CSF-1 eristetään kasvualustasta tai soluista; proteiinin talteenotto ja puhdistus eivät ehkä ole välttämättömiä joissain tapauksissa, joiden yhteydessä pieni määrä epäpuhtauksia voidaan sallia. Esimer-10 kiksi solujen in vitro viljelmältä, josta aiotaan eristää lymfokiinitekijä annettavaksi kohteelle, ei joskus edellytetä täydellistä puhtautta. Kuitenkin suora käyttö hoidossa kohteelle antamalla vaatisi luonnollisesti tuotetun CSF-1:n puhdistusta.

15 Kukin edeltävistä vaiheista voidaan suorittaa lukui silla tavoilla. Esimerkiksi halutut koodisekvenssit voidaan saada valmistamalla sopiva cDNA solulähettiläästä ja manipuloimalla cDNA.ta täydellisen sekvenssin saamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan hankkia geenifragmentteja 20 ja käyttää niitä suoraan tarkoituksenmukaisissa isännis sä. Lukuisissa isännissä toiminnallisten ilmaisuvektorien rakentamiset tehdään käyttäen tarkoituksenmukaisia repli-koneja ja kontrollisekvenssejä kuten jatkotekstissä esitetty. Voidaan lisätä sopivia restriktiokeskuksia, ellei 25 normalisti saatavana, koodisekvenssin päihin leikatta vissa olevan geenin saamiseksi näihin vektoreihin inser-toitavaksi.

Kontrollisekvenssit, ilmaisuvektorit ja transformaa-tiomenetelmät riippuvat geenin ilmaisemiseksi käytetyn 30 isäntäsolun tyypistä. Yleensä ottaen prokaryootti-, hiiva-, hyötenis- tai nisäkässolut ovat tällä hetkellä käyttökel-‘ poisia isäntiä. Koska natiivi CSF-1 erittyy glykosyloi- tuna dimeerinä, arveltiin oikeaan translaation jälkeiseen prosessointiin kykenevien isäntäjärjestelmien olevan 35 edullisia. Koska prokaryoottiset isännät eivät kykene 102190 aikaansaamaan glykosylaatiota tai kontrolloitua dimeroi-tumista, olisivat nämä isännät käteviä, vain, mikäli ei-glykosyloitu muoto voidaan puhdistaa ja prosessoida aktiiviseksi muodoksi. Näin on, kuten tulee ilmenemään, 5 asianlaita CSF-l:n kohdalla. CSF-1 voidaan tuottaa tehokkaasti monomeerinä E. colissa ja uudelleenlaskostaa käyttäen erilaisia menettelytapoja aktiiviseksi, ei-glykosyloi-duksi dimeerimuodoksi.

Kuitenkin voidaan käyttää myös eukaryoottisia soluja. 10 Erityisesti edullisia ovat hyönteis- tai nisäkässolut.

Jos halutaan eritystä, voidaan olla varmempia hyönteis-tai nisäkässoluisäntien natiivin signaalisekvenssin tunnistamisesta, joka tekee tämän erityksen mahdolliseksi, ja siksi puhdistuksen helpommaksi. CSF-1:tä tuottuu sta-15 biilisti CHO-soluissa ja sitä voidaan tuottaa myös stabiilista transformoiduissa CV-l-soluissa ja virustartutetuissa hyönteissoluissa.

Ihmis-CSF-1:n nimenomaisesa tapauksessa nyttemmin kerääntyvät todisteet viittaavat siihen, että proteiinin 20 C-päädyssä saattaa tapahtua huomattavaa deletoitumista sekä rekombinanttiolosuhteissa että natiiveissa olosuhteissa ja että proteiinin in vitro aktiivisuus on yhä tallella. Vaikuttaa siltä, että eristetyt natiivit proteiinit saattavat olla jonkinlaisessa C-päädystä typistetys-25 sä muodossa tai sellaisten seoksena ja saattavat osoit taa vaihtelevaa C-päätyprosessointia. Näiden "typisty-neitten" muotojen aktiivisuuden todentaa selvästi niiden harkittu tuottuminen. SCSF/Cyi50:tä koodaavasta DNAssta tuotettu muteiini esimerkiksi on täysin aktii-30 vinen CSF-l-määrityksissä kuten on LCSF/C ^190:tä koo daavasta cDNA:sta tuotettu. Geenien sekä pitkien että .· lyhyitten muotojen rekombinantti-ilmaisun tuotteet vaikuttavat omaavan alhaisempia alayksikkömolekyyli-painoja kuin voitaisiin odottaa täysimittaisen sekvens-35 sin perusteella. Uskotaan, että "luontaista" prosessoin- 20 102190 tia saattaa tapahtua moninaisissa proteolyysikeskuksissa, mukaanlukien esimerkiksi pitkässä muodossa arg-jäännös asemassa 223, lys-jäännös asemassa 238, arg-jäännös asemassa 249 tai arg asemassa 411. Koska on selvää, että tietyt 5 C-päätylyhennetyt muodot ovat aktiivisia, käytettyihin rakenteisiin saattavat lukeutua myös koodisekvenssin vastaavat lyhennetyt muodot.

C.l. Kontrollisekvenssejä ja vastaavia isäntiä Prokaryootteja edustavat useimmiten eri E. coli 10 -kannat. Kuitenkin muita mikrobikantoja voidaan niinikään käyttää, kuten Bacillus-lajeja, esimerkiksi Bacillus subtilis, eri Pseudomonas-lajeja, tai muita bakteerikantoja. Tällaisissa prokaryoottisissa järjestelmissä käytetään plasmidivektoreita, jotka sisältävät toisiintumiskeskuk-15 siä ja kontrollisekvenssejä, jotka ovat peräisin isännän kanssa yhteensopivasta lajista. Esimerkiksi E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen pBR322:n johdannaisia, jonka plasmidin eristivät E. coli-lajista Bolivar et. ai. Gene 2 (1977) 95. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetra-20 sykliiniresistenssigeenejä, ja tarjoaa täten lisämerkkejä, jotka voidaan joko säilyttää tai tuhota haluttua vektoria rakennettaessa. Tavallisesti käytettyjä prokaryoottisia kontrollisekvenssejä, joihin tässä määritellään lukeutuviksi promoottorit transkription alkuunsaattamiseksi, valin-25 naisesti operaattorin kanssa, ribosomisitoutumiskeskussek- venssien ohella, ovat sellaiset tavanomaisesti käytetyt promoottorit kuten beta-laktamasi- (penisillinaasi-) ja laktoosi- (lac-) promoottorijärjestelmät (Chang et. ai., Nature 198 (1977) 1056) ja tryptofaani- (trp-) promootto-30 ri järjestelmä (Goeddel. et. ai., Nucleic Acids Res. _8 (1980) 4057) ja lambda-peräinen P^-promoottori ja N-gee-niribosomisitoutumiskeskus (Shimatake et. ai., Nature 292 (1981) 128), josta on tehty käyttökelpoinen kannettavana kontrollikasettina. Kuitenkin voidaan käyttää mitä tahan- 35 sa saatavana olevaa prokaryoottien kanssa yhteensopivaa promoottorijärjestelmää.

21 102190

Alunperin ilmeni jonkinasteista vastahakoisuutta bakeerijärjestelmien käyttämisessä CSF-l:n nimenomaisessa tapauksessa ottaen huomioon sen translaation jälkeisen prosessoinnin korkea aste, johon kuuluu glykosylointi ja 5 dimerointi. Lisäksi erityisesti proteiinin N-päätyosuu- dessa esiintyy lukuisia kysteiinijäännöksiä. LCSF-alayk-sikkö on itseasiassa kaikkiaan 10 kysteiinijäännöstä viimeisen ollessa asemassa 225; SCSFrssä on seitsemän. Molemmat sisältävät täten kysteiinijäännökset asemissa 7, 31, 10 49, 90, 102, 139, 146; pitkä muoto omaa lisäkysteiinit ase missa 157, 159 ja 225. Uskotaan, että prosessointiin dimee-rin muodostamiseksi kuuluu moninkertaisten ketjunsisäisten sidosten ja ainakin yhden ketjujen välisen sidoksen muodostuminen. On kuitenkin saatavana menettelytapoja bakteereis-15 sa tuotettujen tämän tyyppisten proteiinien uudelleenlas- kostamiseksi ja on kehitetty spesifisiä menettelyjärjes-telyjä, jotka ovat hyödyllisiä puhtaan biologisesti aktiivisen CSF-l:n valmistamiseksi bakteereista.

Bakteerien ohella isäntinä voidaan niinikään käyttää 20 eukaryoottisia mikrobeja kuten hiivaa. Eniten käytetään

Saccharomyces cerevisiae1 n, leipomohiivan, laboratorio-kantoja, vaikkakin yleisesti on saatavana muitakin kantoja. Vaikka havainnollistetaan 2 mikronin toisiintumisalkukoh-taa käyttäviä vektoreita, Broach, J.R., Meth.Enz♦ 101 (1983) 25 307, tunnetaan muitakin hiivailmaisuun sopivia plasmidi- vektoreita (katso esimerkiksi Stinchcomb, et. ai. Nature 282 (1979) 39, Tschempe, et. ai.. Gene 10 (1980) 157 ja Clarke, L., et. ai., Meth.Enz. 101 (1983) 300). Kontrol- lisekvensseihin hiivavektoreille” kuuluvat promoottorit 30 glykolyysientsyymien synteesille (Hess, et. ai., J. Adv.

Enzyme Reg. Ί_ (1968) 149; Holland et. al. Biochemistry 17 [ (1978) 4900). Muita alla tunnettuja promoottoreita ovat 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottori (Hitzeman et. ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073) ja muiden glykolyyttisten 35 entsyymien promoottorit kuten glyseraldehydi-3-fosfaatti- 22 102190 dehydrogenaasin, heksokinaasin, pyruvaattidekarboksylaa-sin, fosfofruktokinaasin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraa-sin, 3-fosfoglyseraattimutaasin, pyruvaattikinaasin, tri-oosifosfaatti-isomeraasin, fosfoglukoosi-isomeraasin ja 5 glukokinaasin. Muita promoottoreita, joiden lisäetuna on kasvuolosuhteitten säätelemä transkriptio, ovat promoottorialueet alkoholidehydrogenaasi-2ϊlie, isosytokromi-C:lie, happamalle fosfataasille, typpimetaboliaan liittyville hajotusentsyymeille, ja maltoosi- ja laktoosikäytöstä 10 vastaaville entsyymeille (Holland ibid.). Uskotaan niinikään, että lopetussekvenssit ovat toivottavia koodisek-venssien 3'-päädyssä. Tällaisia lopettajia tavataan 3'-ei-translatoituvilla alueilla, jotka seuraavat koodaavia sekvenssejä hiivaperäisissä geeneissä. Monet havainnolliste-15 tuista vektoreista sisältävät kontrollisekvenssejä, jotka ovat peräisin enolaasigeenin sisältävästä plasmidista peno46 (Holland, M.J., et. ai. J. Biol. Chem. 256 (1981) 1385) tai YEpl3:sta sadusta LEU2-geenistä (Broach, J., et. ai. Gene j3 (1978) 121), kuitenkin mikä tahansa vek-20 tori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoot torin, replikoitumisen alkukohdan ja muita kontrollisek-venssejä, on sopiva.

On luonnollisesti myös mahdollista ilmaista poly-peptidejä koodaavia geenejä monisoluisista organismeista 25 saaduissa eukaryoottisissa isäntäsoluviljelmissä. Katso * esimerkiksi Tissue Culture, Academic Press, Cruz ja

Patterson, toimittajat (1973) . Käyttökelpoisia isäntäsolu-linjoja ovat hiirimyelooman N51-, VERO- ja HeLa-solut, ja kiinalaisen hamsterin munasarja-' (CHO-) solut. Tällaisten 30 solujen ilmaisuvektorit sisältävät yleensä nisäkässolujen kanssa yhteensopivia promoottoreita ja kontrollisekvensse-jä kuten esimerkiksi tavanomaisesti käytetyt varhais- ja myöhäispromoottorit apinaviruksesta 40 (SV 40) (Fiers et. ai., Nature 273 (1978) 113), tai muut viruspromootto-35 rit kuten polyoomasta, adenovirus-2:sta, nautasyyläviruk- 23 1 02 1 90 sesta, tai lintusarkoomaviruksista peräisin olevat, tai immunoglobuliinipromoottorit ja lämpöiokkipromoottorit. Nisäkässoluisäntätransformaatioiden yleisiä näkökohtia on kuvannut Axel; US-pate'ntti julkaisu nro 4 399 216, joka jul-5 kaistiin 16. elokuuta 1983. Vaikuttaa nyttemmin siltä, että myös "tehostaja"-alueet ovat tärkeitä ilmaisun optimoimiseksi; nämä ovat yleensä promoottorialueesta ylävirtaan tavattavia sekvenssejä. Replikoitumisalkukohtia voidaan tarvittaessa saada viruslähteistä. Kuitenkin integroi-10 tuminen kromosomiin on DNA-replikaation tavallinen mekanismi eukaryooteissa. Isänniksi on nyttemmin saatavana myös kasvisoluja ja saatavana on kasvisolujen kanssa yhteensopivia kontrollisekvenssejä kuten nofaliinisyntaasipromootto-ri- ja polyadenylaatiosignaalisekvenssit (Depicker, A., 15 et. ai., J. Mol. Appi. Gen. 1 (1982) 561).

Vast'ikään on lisäksi kuvattu hyönteissoluja käyttäviä ilmaisujärjestelmiä, jotka käyttävät bakulovirusvekto-rien tarjoamia kontrollijärjestelmiä (Miller, D.W. £t. ai. julkaisussa Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K., 20 et. ai. toimittajat, Plenum Publishing, osa 8, ss. 277 - 297). Myös nämä järjestelmät ovat hyödyllisiä CSF-l-tuotan-nossa.

C.2. Transformaatiot Käytetystä isäntäsolusta riippuen transformointi suo-25 ritetaan käyttäen kyseisille soluille soveliaita standardi- menettelyitä. Cohenin, S.N., Proc.Natl. Acad. Sei. (USA) 69 (1972) 2110, kuvaamaa kalsiumkloridia käyttävää kalsiumkä-sittelyä käytetään prokaryooteille tai muille soluille, jotka sisältävät huomattavia sol-useinämäes teitä. Tietyille 30 kasvisoluille käytetään tartutusta Agrobacterium tumefaciensilla (Shaw, C.H. et. ai. Gene 23 (1983) 315). Vailla tällaisia soluseinämiä oleville nisäkässoluille on edullinen Grahamin ja van der Ebin, Virology 52 (1978) 546, kalsiumfosfaattisaostusmenetelmä. Transformaatiot 35 hiivoihin suoritetaan Van Solingenin, P. et._al., J. Bact♦ 130 (1977) 946 ja Hsiao, C.L., et. ai. Proc. Natl. Acad.

Sei. (USA) 7_6 (1979) 3829 menetelmän mukaan.

24 1 02 1 90 C.3. mRNA:n seulonta Northern-blot-määrityksen avulla; cDNA- tai genomikirjaston seulonta RNA fraktioidaan Northern blot-määritystä varten aga-roosilevygeelielektroforeesin avulla täysin denaturoivissa 5 olosuhteissa käyttäen formaldehydiä (Maniatis, T. , et. ai.

Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harbor Press, ss. 202 -203) tai 10 mM metyylielohopeaa (CH^HgOH) (Bailey, J.M., et. al. Anal. Biochem. 70 (1976) 75-85; ja Sehgal, P.B., et. al. Nature 288 (1980) 95-97) denaturoivana aineena.

10 Metyylielohopeageelejä varten valmistetaan 1,5 %:sia geele jä sulattamalla agaroosia juoksevassa puskurissa (100 mM boorihappo, 6 mM natriumboraatti, 10 mM natriumasetaatti,

1 mM EDTA, pH 8,2), jäähdyttämällä 60°C:een ja lisäämällä 1/100 tilavuus 1 M CH^HgOHita. RNA liuotetaan 0,5 x juokse-15 vaan puskuriin ja denaturoidaan inkuboimalla 10 mM metyyli-elohopeassa 10 min ajan huoneen lämpötilassa. Lisätään glyserolia (20 %) ja bromifenolisinistä (0,05 %) näytteiden panostamiseksi. Suoritetaan näytteiden elektroforeesi 500 -600 volttitunnilla puskuria uudelleenkierrättäen. Elektro-20 foreesin jälkeen geeliä pestään 40 minuutin ajan 10 mM

2-merkaptoetanolissa metyylielohopean myrkyllisyyden poistamiseksi ja valmistetaan Northern blot-näytteet siirtämällä RNA geelistä kalvosuodattimelle.

cDNA- tai genomikirjastoja seulotaan käyttäen pesäke-25 tai plakkihydridisaatiomenettelyä. Bakteeripesäkkeet tai fagiplakit nostetaan kaksinkertaisille nitroselluloosasuo-datinpapereille (S & S tyyppi BA-85). Plakkeihin tai pesäkkeisiin tuotetaan lyysi ja DNA kiinnitetään suodattimeen 5 minuutin sarjakäsittelyllä liuoksella 500 mM NaOH, 30 1,5 M NaCl. Suodattimia pestään kahdesti 5 minuutin ajan kummallakin kerralla 5 x standardisuolaliuossitraalilla : (SSCtllä) ja ilmakuivataan ja paistetaan 80°C:ssa 2 tun nin ajan.

Northern blot-geelejä tai cDNA- tai genomiseulonnan 35 kaksoissuodattimia esihybridisoidaan 25-42°C:ssa 6-8 tun tia suodatinta kohden 10 ml:11a DNA-hybridisaatiopuskuria 25 102190 ilman näytettä (0-50 % formamidi, 5-6 x SSC, pH 7,t), 5x Denhardtin liuos (polyvinyylipyrrolidiini, sekä Ficoll ja nautaseerumialbumiini;. 1 x = 0,02 % kutakin), 20-50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0, 0,2 % SDS, 20 ^ug/ml po-5 ly U (cDNA:ta seulottaessa), ja 50 ^ug/ml denaturoitua lohensperma DNA:ta). Sitten näytteet hybridisoidaan inku-boimalla sopivassa lämpötilassa noin 24-36 tunnin ajan käyttäen kinaasikäsitellyn koettimen sisältävää hydridisaatio-puskuria (oligomeereille). Pitemmät-cDNA- tai genomifrag-10 menttikoettimet leimattiin nik-translaation tai pohjustin-jatkeen avulla.

Sekä esihybridisaation että hybridisaation olosuhteet riippuvat halutusta ankaruudesta ja vaihtelevat esimerkiksi koettimen pituuden mkaan. Tyypillisinä suhteellisen pitkien 15 (esim. yli 30-50 nukleotidia) koettimien olosuhteina käyte tään lämpötilaa 42-55°C ja noin 20-50 % formamidia sisältävää hybridisaatiopuskuria. Noin 15 nukleotidin oligomeeri-koettimille tarvittaviin alhaisempiin ankaruusasteisiin käytetään noin 25-42°C:een alempia lämpötiloja ja alempia 20 formaldehydipitoisuuksia (0-20 %). Pitempien koettimien kyseessä ollen suodattimet voidaan pestä, esimerkiksi neljään kertaan 30 minuutin ajan kullakin kerralla 40-55°C:ssa liuoksella 2x SSC, 0,2 % SDS ja 50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,0, ja pestään sitten kahdesti liuoksella 0,2x 25 SSC ja 0,2 % SDS, ilmakuivataan, ja autoradiokuvataan -70°C:ssa 2-3 päivän ajan. Pesuolosuhteet ovat jossain määrin lievemmät lyhyemmillä koettimilla.

C.4. Vektorien rakentaminen

Sopivien, halutut koodi- ja kontrollisekvenssit sisäl-30 tävien vektorien rakentamisessa käytetään standardiligatoin- ti- ja -restriktiomenettelyitä, joista alalla ollaan hyvin perillä. Eristettyjä plasmideja, DNA-sekvenssejä tai syntetisoituja oligonukleotidejä pilkotaan, räätälöidään ja uudelleenligatoidaan haluttuun muotoon.

26 102190

Paikkaspesifinen DNA-pilkkominen suoritetaan, käsittelemällä sopivalla restriktioentsyymillä (tai entsyymeillä) olosuhteissa, joista alalla ollaan yleisesti perillä ja joiden yksityiskohdat spesifioi näiden kaupallisesti saatavana 5 olevien restriktioentsyymien valmistaja. Katso esim. New

England Biolabs, tuotekatalogi. Yleensä ottaen pilkotaan noin 1 ^ug plasmidi- tai DNA-sekvenssiä yhdellä yksiköllä entsyymiä noin 20 ^.ulissa puskuriliuosta; tässä esitetyissä esimerkeissä käytetään tyypillisesti ylimäärin restriktio-10 entsyymiä DNA-substraatin täydellisen pilkkoutumisen varmis tamiseksi. Työskentelyyn sopivat noin 1-2 tunnin inkubointi-ajat noin 37°C:ssa, vaikkakin voidaan sallia vaihteluita. Kunkin inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenoli/kloroformilla, mitä saattaa seurata uuttaminen eette-15 rillä, ja nukleiinihappo otetaan vesifraktioista talteen etanolisaostuksen avulla. Haluttaessa voidaan suorittaa pilkottujen fragmenttien kokoerotus polyakryyliamidigeeli-tai agaroosigeelielektroforeesin avulla standardimenettelyi-tä käyttäen. Yleinen kuvaus kokoerotuksista löytyy lähtees-20 tä Methods in Enzymoloqy 65 (1980) 499-560.

Restriktiopilkotuista fragmenteista voidaan tehdä tylppäpäätyisiä käsittelemällä E. coli DNA-polymeraasi-I:n (Klenow) suurella fragmentilla neljän deoksinukleotiditri-fosfaatin (dNTPrn) läsnäollessa käyttäen noin 15-20 minuu-25 tin inkubointiaikoja 20-25°C:ssa liuoksessa 50 mM Tris / pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM dTT ja 5-10 ^uM ku takin dNTPttä. Klenow-fragmentti täyttää tahmeat 5'-päädyt, mutta jyrsii pois esiinpistävät 31-yksisäikeet, vaikka neljää dNTP:tä on läsnä. Haluttaessa voidaan suorittaa 30 selektiivinen paikkaus käyttämällä vain yhtä, tai useampaa valikoitua, dNTP:tä tahmeitten päätyjen luonteen sanelemien • rajoituksien puitteissa. Klenow-käsittelyn jälkeen seosta uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. Käsittely Sl-nukleaasilla sopivissa olosuhteissa johtaa 35 minkä tahansa yksisäikeisen osuuden hydrolyysiin.

27 102190

Synteettisiä oligonukleotidejä voidaan valmistaa Matteuccin et. ai. (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 3185 -3191) triesterimenetelmän mukaan tai käyttäen automaattisia synteesimenetelmiä. Yksisäiejuosteiden kinasoituminen 5 juottamista edeltävästi tai leimausta varten aikaansaadaan käyttäen ylimäärin, esim. noin 10 yksikköä, polynukleoti-dikinaasia 1 nM substraattia kohden liuoksen 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitoli, 1-2 mM ATP, läsnäollessa. Jos kinasointi suoritetaan koettimen leimaamisek-10 si, ATP sisältää korkean spesifisen aktiivisuuden ^Prtä.

Ligatoinnit suoritetaan 15-30 ^ul:n tilavuuksissa seu-raavissa standardiolosuhteissa ja lämpötiloissa: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM dTT, 33 /ug/ml BSA, 10 mM - 50 mM NaCl, ja joko 40 ^um ATP, 0,01 - 0,02 (Weiss-) 15 yksikköä T4 DNA-ligaasia 0°C:ssa ("tahmea pääty"-ligatoin- nille), tai 1 mM ATP, 0,3 - 0,6 (Weiss-) yksikköä T4 DNA-ligaasia 14°C:ssa ("tylppä pääty"-ligatointia varten). Mole-kyylinsisäiset "tahmea pääty"-ligatoinnit suoritetaan tavallisesti 33-100 yug/ml:n kokonais-DNA-pitoisuuksissa 20 (5-100 nM kokonaisloppupitoisuus). Molekyylien väliset tylp pä pääty-ligatoinnit (joissa tavallisesti käytetään 10-30 kertaista mooliylimäärä liittäjiä) suoritetaan 1 ^,uM:n lop-pupäätypitoisuudessa.

"Vektorifragmentteja" käyttävässä vektorirakentamises-25 sa vektorifragmenttia käsitellään tavallisesti bakteeripe

räisellä emäksisellä fosfataasilla (BAP:llä) 5'-fosfaatin poistamiseksi ja vektorin uudelleenligatoitumisen estämiseksi. BAP-hajottamiset suoritetaan pH:ssa 8 noin 150 mM

-h +2

Tris-liuoksessa Na :n ja Mg :n läsnäollessa noin yksi yk-30 sikköä BAP:tä mikrogrammaa vektoria kohden käyttäen 60°C:ssa noin tunnin kejstävinä. Nukleiinihappofragmenttien talteen-ottamiseksi valmistetta uutetaan fenoli/kloroformilla ja etanolisaostetaan. Vaihtoehtoisesti uudelleenligatoituminen voidaan estää kaksoispilkotuissa vektoreissa ei-toivottujen 35 fragmenttien lisärestriktioentsyymipilkkomisella.

28 1 02 1 90 C.5. DNA-sekvenssien modifiointi cDNA:sta tai genomi-DNA:sta saaduille vektoriosuuk-sille, jotka vaativat.sekvenssimodifikaatioita, käytetään paikkaspesifistä pohjustesuuntautuvaa mutageneesiä. Tämä 5 menettelytapa on nyttemmin alan standardimenettely ja se suoritetaan käyttäen synteettistä pohjusteoligonukleotidia, joka komplementoi mutatoivaa yksisäiefagi-DNA:ta lukuunottamatta rajoitettua epäsopivuutta, joka edustaa haluttua mutaatiota. Lyhyesti,synteettistä oligonukleotidia käytetään 10 pohjusteena ohjaamaan fagia komplementoivan säikeen syntee siä ja saatava kaksisäie-DNA transformoidaan fagin kantavaan isäntäbakteeriin. Maljoitetaan transformoidun bakteerin viljelmiä pinta-agariin, mikä sallii plakkimuodostuk-sen fagin sisältävistä yksittäisistä soluista.

15 Teoreettisesti 50 % uusista plakeista sisältää fagin, joka omaa yksittäisenä säikeenä mutatoidun muodon; 50 % omaa alkuperäisen sekvenssin. Plakit hybridisoidaan kinaa-sikäsittelyllä synteettisellä pohjusteella lämpötilassa, joka sallii täsmällisen vastakappaleen hybridisaation, mut-20 ta jossa epäsopivuudet alkuperäiseen säikeeseen nähden ovat riittävät estämään niiden hybridisoituminen. Sitten valitaan koettimeen hybridisoituvat plakit, viljellään niitä ja otetaan DNA talteen. Alla spesifisissä esimerkeissä kuvataan paikkaspesifisen mutaation yksityiskohtia.

25 C.6. Rakenteesta varmistuminen

Alla esitetyissä rakenteissa plasmidirakenteen oikeat ligatoinnit varmistetaan transformoimalla ensin E. coli kanta MM294, tai muu sopiva isäntä, ligatointiseoksella. Onnistuneet transformantit valitaan ampisilliini-, tetra-30 sykliiniresistenssin tai muun antibioottiresistenssin pe rusteella tai käyttäen muita merkkejä plasmidirakenteen muodosta riippuen kuten alalla tiedetään. Transformanteis-ta valmistetaan sitten plasmideja Clewellin, D.B. et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 62 (1969) 1159, menetelmän mu-35 kaan, valinnaisesti kloramfenikolivahvistusta seuraten 29 1 02 1 90 (Clewell, D.B. J. Bacteriol. 110 (1972) 667). Eristetty DNA analysoidaan restriktioanalyysin avulla ja/tai sekvens-soidaan Sangerin, F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 74 (1977) 5463, dideoksimeneteliuMn mukaan kuten edelleen kuvan-5 neet Messing et. ai., Nucleic Acids Res♦ 9_ (1981) 309, tai

Maxamin et. ai., Methods in Enzymology 65 (1980) 499, mene telmän mukaan.

C. 7. Esimerkeissä käytetyt isännät

Kloonauksessa ja ilmaisussa käytetyt isäntäkannat 10 ovat seuraavat:

Kloonausta ja sekvenssointia varten ja rakenteen ilmaisemiseksi useimpien bakteeripromoottorien säätelyn alaisena käytettiin isäntänä E. coli-kantaa MM294, joka saatiin laitoksesta E. coli Genetic Stock Center, GCSC n:o 6135.

15 Ilmaisua varten PTΝ-,^,,-promoottorin säätelyn alaisena käy- L· Kob tetään E. coli-kantaa K12 MClOOO-lambdalysogeeni, N?N53c1857 SusPqq, ATCC 39531.

Ml3-fagirekombinantteja varten käytetään fagi-tar-tutukselle alttiita E. coli-kantoja, kuten E. coli K12-kanta 20 DG98. Kanta DG98 on talletettu laitokseen ATCC 13. heinäkuu ta 1984 ja sen hakunumero on 39768.

Nisäkäsilmaisuun on tässä päästy COS-7-, COS-A2-, CV-1- ja CHO-soluissa.

D. Edulliset suoritusmuodot 25 Tämän keksinnön rekombinantti-CSF-l-proteiineja voidaan pitää kahtena sarjana "perus"-proteiineja, LCSF ja sen muteiinit ja tietyt spesifiset SCSF:n muteiinit. Nämä proteiinit omaavat samankaltaisen primäärisen aminohappo-sekvenssin, mutta eivät identtistä sekvenssiä, ja vaihtelevia 30 pituuksia, joista kaikki osoittavat, tai ovat spesifisesti pilkottavissa muteiiniksi, joka osoittaa, CSF-l:lle tunnusomaista aktiivisuuskuviota, eli ne kykenevät stimuloimaan luuydinsolujen differentioitumista pääasiassa monosyyteiksi ja "Määritelmiä" kohdassa edellä esitettyjen rajoitusten 35 puitteissa ovat immuunireaktiivisia natiivia CSF-l:ta vastaan 30 Ί 02190 muodostettujen vasta-aineiden suhteen ja CSF-l-aktiivisuu-teen liittyvien reseptorien suhteen. Tiettyjä muteiinisuo-ritusmuotoja, joiden osalta viitataan SCSF:ään, ei nimenomaisesti kuvattu PCT-hakemusjulkaisussa n:ro W086/04607, jo-5 ka perustuu useiden tämän kantahakemusjulkaisujen prioriteettiin. Samoin sanotussa EPO-hakemusjulkaisussa ei julkisteta ihmisen ja hiiren CSF-l:n pitkiä muotoja; erityisesti LCSFsää ja sen sukulaismuteiineja. Erityisen edullisia ovat tietyt LCSF:n N- ja C-päätydeletoidut muodot.

10 Tiettyjä spesifisiä SCSF-muteiinien suoritusmuotoja julkistetaan EPO-hakemusjulkaisussa. Kuten on esitetty kyseisessä EPO-hakemusjulkaisussa asema 59 on vaihtuva asp:n ja tyr:n välillä, eli alunperin saadun SCSF:n ohella mukaan luetaan muteiinit, joissa SCSF-sekvenssiä on muutettu kor-15 vaarnalla tyr asp:llä asemassa 59 (eli asp^ SCSF). Kääntäen LCSF omaa asp:n asemassa 59 ja se voidaan korvata tyr:llä (tyr59 LCSF).

Tässä julkistetaan se SCSF:n ja LSCF:n muteiiniluokka, josta puuttuu N-päädystä 2 tai 3 jäännöstä, ja joka täten 20 omaa N-päätysekvenssin valittuna ryhmästä, joka koostuu sekvensseistä val-ser-glu-tyr-cys-ser ja ser-glu-tyr-cys-ser. Nämä NV2- tai N*\73-muteiinit voivat edustaa SCSF:n ja LCSF:n kypsien muotojen vastaavia N^2-, N ^3-muteiineja, eli SCSF/N^2, SCSF/N V 3, LCSF/Ny2, ja LCSF/Ny7^. Lisäksi mu-25 kaan luetaan kuitenkin näiden N ^2- ja 3-mutionien C-pää-dystä typistetyt muodot kuten alla tarkemmin kuvataan.

Samoin erityisen kiinnostavia ovat erilaiset C-pääty-deletiomuteiinit. EPO-hakemusjulkaisussa mainittiin edellä julkistetut lyhennetyt muodot vain SCSF:lie - ja vain C^158 30 ja sitä pidemmät. Alan teknisen tason perusteella ei ole selvää, missä määrin natiivit proteiinit prosessoidaan C-pää-- dystä in vivo. Nyttemmin on selvitetty, että vähintäänkin C-päätyalue aina SCSF:n aminohappoon 150 voi olla deletoi-tunut ja proteiini säilyttää in vitro CSF-l-aktiivisuuden 35 luuydinlisääntymismäärityksessä. Lisäksi uskotaan, että 3i 102190 se 23 aminohapon hydrofobinen sekvenssi, joka kattaa asemat 166-188 lyhyessä muodossa ja 464-486 pitkässä muodossa, voi omata membraaniankkurifunktion ja voi tulla erotetuksi proteiinista, kun tämä kuljetaan membraanin läpi 5 ja erittyy. Tämä osuus saattaa myös olla vastuussa membraa- nisitoutumisesta sinänsä, ja sallia CSF-l:n, sen sitoutuessa solumembraaneihin, vuorovaikutuksen muiden solujen kanssa sitoutumiskeskuksessa. Yksittäin nämä sekvenssit saattavat olla kokonaisuudessaan tai osittain ei-välttämättömiä. 10 Joka tapauksessa vaikuttaa siltä, että CSF-l-muotoja, jotka ovat korostetusti lyhyempiä kuin kumpikaan koodatuista SCSFtstä tai LCSF:stä, tavataan natiivia proteiinia eristettäessä, ja rekombinanttituotannosta saaduissa erittyneissä proteiineissa. Tämän hetkiset tiedot viittaavat sii-15 hen, että SCSF:tä koodaavien rakenteiden ilmaisu CV-l-so-luissa saattaa johtaa SCSF/C ¢7158saan supernatantissa.

Täten keksinnön piiriin kuuluvat CSF-l-proteiinit, jotka käsittävät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät vain 150 ensimmäistä aminohappoa SCSFrstä tai LCSF:stä, 20 tai niiden vaihtoasema-59-tyr- tai asp-muteiinit kuten

yllä kuvattu (jotka ovat siten identtisiä viimeistä aminohappoa lukuunottamatta) tai niiden N ¢72- tai N V3-muunnokset, joita valinnaisesti jatkaa mielivaltainen kappalemäärä aminohappoja jatkosekvenssinä. Tässä ryhmässä erityisen 25 edullisia ovat C-päätydeletiot, jotka vastaavat SCSF/C

150: tä, SCSF/C 1/158: aa, LCSF/C y'lSO: tä, LSCF/C 0.90 :ää, LCSF/C yi91:tä, LCSF/C7221:tä, LCSF/C ^223:a, LCSF/C V236:ta, LCSF/C ^/238:aa, LCSF/C ^249:ää, LCSF/C ^258:aa ja LCSF/C^ 411:tä ja niiden vastaavat ja N^3-muodot.

30 Samoin edullisia ovat rakenteet, jotka koodaavat edellä mainittuja C-päätydeletioita, joissa on tehty yhden tai kahden aminohapon, modifikaatioita sekvenssiin "perus”-sekvenssiin nähden.

32 102190 Täten erilaiset CSF-l-muodot voivat niinikään sisältää mutaatioita, jotka eivät tuhoa funktionaalisuutta alueilla, jotka eivät lajin puitteissa ole erittäin säilyviä. Nämä ovat 1-5 aminohapon deletioita ja/tai substituutioita asemis-5 sa 15-20, 51-52 ja/tai 75-84. Muu tällainen alue on alue 191-193 SCSFrssä ja 489-491 LCSF:ssä. EPO-hakemusjulkaisussa, johon edellä viitattiin, julkistetaan vain SCSF:n mutant-teja ja sen C-päätymuteiini, joka on deletoitu C\7158:ksi; täten nämä muteiinit ovat uusia koska ne koskevat sekä pitkä-10 muotoista LCSFiää että sen muteiineja tai edelleen lyhennet tyjä SCSF/C^7150-158-muteiineja. Erityisesti on todettu, että sekä SCSFsn että LCSF:n glu,-2_niu°dot ja niiden muteiinit ovat aktiivisia.

Tässä on samoin osoitettu, että yhden tai useamman 15 glykosylaatiokeskuksen muuttaminen voi johtaa aktiivisiin proteiineihin. LCSF omaa neljä glykosylaatiokeskusta - kohdassa 122-124, 140-142, 349-351 ja 383-385; SCSF omaa vain kyseiset ensimmäiset kaksi. Täten mukaan luetaan myös mikä tahansa muteiini, joka sisältää inaktivoivan mutaation yh-20 dessä tai useammassa näistä keskuksista.

Lisäksi kysteiinin asemassa 90 on osoitettu olevan ei-välttämätön immuunireaktiivisuudelle. Täten mukaan luetaan muteiinit, jotka ovat ala9Q tai ser9Q, kun aiottu tarkoitus nojaa vain antigeenisyyteen. LCSF:n kysteiinit ase-25 massa 157 ja 159 ovat myös ei-välttämättömiä aktiivisuudelle ] ja ser^?, seri59 ja ser^^ser^^ LCSF-muteiineilla (mukaan lukien N- ja C-päätteissä deletoidut muodot) on parempi homogeenisuus HPLC:ssä. Uskotaan niinikään, että sekä LCSF:n että SCSFtn oletetut membraaniankkurialueet eivät ole vält-30 tämättömiä CSF-l-aktiivisuuden joillekin tyypeille.

Muita edullisia muotoja ovat muteiinit, jot-’· ka vastaavat kuvioissa 5 ja 6 esitettyjen hiiriproteiinien aminohapposekvenssejä, ja niiden muteiinit, jotka vastaavat ihmis-LCSF:lie esitettyjä.

35 CSF-l:tä koodaavan DNA:n edulliset suoritusmuodot

Aminohapposekvenssien modifioinnin lisäksi proteii- 33 102190 nia koodaavaa DNA-sekvenssiä voidaan modifioida ilmaisun avustamiseksi nimenomaisissa järjestelmissä. Esimerkiksi E. colissa natiivin sekvenssin ensimmäisten kuuden aminohapon kodonien muuttamisesta bakteerien suosimiin kodonei** 5 hin seuraa tuotannon korkeampi aste sekä LCSFrlle että SCSF:lle ja niiden typistetyille muodoille. Täten vektorit (merkitty alla O/E "yli-ilmaisemiselle") sisältävät N-pääty-koodisekvenssin GAAGAAGTTTCTGAATAT tai sen N \7 - tai N V3-typistelmien mukaisia DNA-sekvenssejä. Tämä otetaan mukaan 10 synteettisenä Hindlll/BstXI-fragmenttina ja poikkeaa natii-vista (sekvenssistä) GAGGAGGTGTCGGAGTAC esitetyissä alleviivatuissa asemissa. Keksinnön eräs näkökohta käsittää CSF-l:tä koodaavan DNA:n, milloin se on määrä ilmaista solunsisäises-ti bakteereissa, tarjoamisen muodossa, jossa sopiva kappa-15 lemäärä kodoneja N-päädyssä on valittu bakteerien suosimien kodonikäytäntösääntöjen mukaan.

Samoin bakteeri-ilmaisuun nähden ylävirtaan ATGrstä asemassa 65 sijaitsevia DNA-sekvenssejä voidaan modifioida tämän ATG:n käytön estämiseksi sisäisenä aloituskeskuksena.

20 Tämä on vakavampi ongelma tyr^^- kuin asp^-rakenteissa.

Paikkaspesifisessä mutageneesissä käytetään pohjustetta, jonka sekvenssi 5'-3' on * * » «Γ *

GGTACAAGATATCATGGAAGATACAATGCGCTTC

25 tähdillä merkittyjen muutosten tekemiseksi natiiviin geeniin. Seurauksena ei ole minkäänlaisia muutoksia koodautu-viin aminohappoihin.

E. Käytettävyys ja anto

Keksinnön mukaiset CSF-l-proteiinit kykenevät sekä 30 stimuloimaan monosyyttiprekursori/makrofagisolutuotantoa kantaydinsoluista, tehostaen täten immuunijärjestelmän tehokkuutta, että stimuloimaan näiden differentioituneiden solujen sellaisia toimintoja kuten lymfokiinien eritys kypsissä makrofageissa. Ne ovat samoin hyödyllisiä tartun-35 tavastaisia aineita, erityisesti virusvastaisina ja mikro- bivastaisina aineina.

34 102190

Eräänä sovellutuksena nämä proteiinit ovat hyödyllisiä kemoterapian apuaineina. Ollaan hyvin perillä siitä, että kemoterapeuttisen hoidon seurauksena immuunijärjestelmä vaimentuu. Monasti vaikka kemoterapeuttiset hoidot ovat 5 menestyksekkäitä kasvainsolujen, joita vastaan ne on ohjattu, tuhoamisessa, niiden seurauksena kohde kuolee johtuen tästä kemotoksisten aineiden sivuvaikutuksesta immuunijärjestelmän soluihin. CSF-l:n antamisen, johtuen CSF-l:n kyvystä välittää ja tehostaa luuydinperäisten prekursoreiden 10 kasvua ja differentioitumista makrofageiksi, tällaisille potilaille seurauksena immuunijärjestelmä jälleenstimuloi-tuu estämään tämän sivuvaikutuksen ja ehkäisemään täten potilaan taipumuksen menehtyä sekundääritartuntaan. Muita potilaita, joille olisi apua tällaisesta hoidosta, ovat 15 leukemian vuoksi luuydinsiirroilla hoidettavat; he ovat usein immuunivaimennetussa tilassa hylkimisen estämiseksi. Myös näiden potilaiden kohdalla immuunivaimennus voitaisiin tehdä käänteiseksi antamalla CSF-l:tä.

Yleensä ottaen kuka tahansa kohde, joka kärsii immuu-20 nivaimennuksesta, johtuipa se kemoterapiasta, luuydinsiir- rosta tai muista, immuunivaimennuksen tahattomista muodoista kuten sairaus (esim. immuunikato), hyötyisi CSF-l:n saatavana olosta farmakologiseen käyttöön. Lisäksi kohteet voitaisiin varustaa tehostetuilla määrillä aiemmin differen-25 tioituneita makrofageja myötäsyntyisen järjestelmän makro- • fagien täydentämiseksi, jolloin makrofagit tuotetaan luu ytimen tai muiden sopivien CSF-l:llä käsiteltyjen valmisteiden in vitro-viljelmässä. Näitä valmisteita ovat potilaan omat verimonosyyttivalmisteet, joita voidaan täten 20 viljellä ja palauttaa paikalliseksi tai systeemiseksi hoi doksi.

CSF-l:n kyky stimuloida makrofagien lymfokiinituo-tantoa ja tehostaa niiden kykyä tappaa kohdesoluja tekee CSF-l:stä niinikään välittömästi hyödyllisen syöpien ja 25 tulehdusten hoidossa.

35 102190 CSF-1 stimuloi hiiriperäisten makrofagien interfero-nituotantoa (Fleit, H.B. et.al., J. Cell Physiol. 108 (1981) 347) ja ihmisperäinen, osittain puhdistettu CSF-1 MIAPaCa-soluista stimuloi poly-IC-indusoitua interferoni-5 ja TNF-tuotantoa ihmisen monosyyteistä. Lisäksi CSF-1 sti muloi ihmisen verimonosyyttien myeeli-CSF:n tuotantoa.

AIDS:ista kärsivien potilaiden hoitamisesta CSF-1:llä, yksinään tai yhdessä erytropoietiinin ja/tai virusvastai-sen aineen kanssa ja/tai IL-2:n kanssa, ilmoitetaan 10 W087/03204:ssä, julkaistu 4. kesäkuuta 1987. US-patentti- julkaisussa 4 482 485, annettu 13. marraskuuta 1984, ilmoitetaan, että CSF-1:tä voidaan käyttää tukevassa ominaisuudessa syövän hoidossa. Lisäksi EP-118 915:ssä, julkaistu 19. syyskuuta 1984, ilmoitetaan CSF-l:n käytöstä jyvässolu-15 kadon ja makrofagisolukadon estämiseksi ja hoitamiseksi syö- päterapiaa saavissa potilaissa, tulehdusten estämiseksi ja siirrettyä luuydintä omaavien potilaiden hoitamiseksi. Ralp et. ai., Cell Immunol. 105 (1987) 270-279, ilmoittavat CSF-1:n ja lymfokiinin yhdistelmän lisäkasvainvastaisesta 20 vaikutuksesta hiirisarkooma-TU5-kohteissa.

(Hiiri-CSF-1:n ilmoitetaan epäyhtenäisesti stimuloivan hiirimakrofageja P815-kasvainsolujen kasvua estäviksi (Wing, E.J. et.al., J. Clin. Invest. 69 (1982) 270), tai ei tappavan muita leukemiakohteita (Ralph, P. et. ai., 25 Cell. Immunol. _76 (1983) 10). Nogawa, R.T. et. ai.,

Cell. Immunol. ^3 (1980) 116, ilmoittavat, että CSF-1 saattaa stimuloida makrofagit syömään ja tappamaan hiivaa).

Täten immuunivaimennuksen voittamisen ohella sinänsä CSF-1:tä voidaan käyttää hyökkäävien organismien tai pahan-30 laatuisten solujen tuhoamiseksi epäsuorasti stimuloimalla . makrofagierityksiä ja -aktiivisuutta.

CSF-1:tä voidaan käyttää yhdistettynä toiseen lymfo- kiiniin tai sytokiiniin, kuten esim. ΰ^-IFN, ySJ-IFN, j^IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4 tai TNF, kasvainten hoitamiseksi.

35 36 1 02 1 90 Tässä kuvattu CSF-1 voidaan formuloida alalla vakiollisilla perinteisillä tavoilla proteiiniyhdisteiden antamiseksi. Edullinen antotie on ruiskeena; kokoonpanoihin lukeutuu liuoksia tai suspensioita, emulsioita tai kiinteä 5 kokoonpano injisointivalmisteeksi rekonstituoitavaksi. So pivia täyteaineita ovat esimerkiksi Ringerin liuos, Hankin liuos, vesi, suolaliuos, glyseroli, dekstroosiliuokset, ja samankaltaiset. Lisäksi mainittua CSF-1:tä voidaan esi-inkuboida soluvalmisteiden kanssa tarkoituksenmu-10 kaisten vasteiden stimuloimiseksi ja viedä kohteeseen joko valmiste kokonaisuudessaan tai sen supernatantti. Kuten alla esitetty eri tyyppisten verisolujen vasteena CSF-l-stimulaa-tiolle tuottamat materiaalit ovat tehokkaita haluttuja kohteita vastaan ja itse näiden verisolujen hyökkäysominai-15 suudet hyökkääviä viruksia tai syöpäsoluja vastaan saattavat tehostua. Voidaan ottaa kohteen omia soluja ja käyttää tällä tavalla tai esimerkiksi käyttää inkuboinnissa toisesta yhteensopivasta yksilöstä peräisin olevia monosyyttejä tai imusoluja.

20 On edullista, että farmaseuttisissa kokoonpanoissa käy tetään CSF-1:n "ihmis"-muotoja; kuitenkin tämän proteiinin hiirimuodot ovat erityisen hyödyllisiä kätevissä hiirimal- lijärjestelmissä CSF-l-aktiivisuuksien mutkikkaan kuvion määrittämiseksi.

25 F. Ihmis-CSF-1:n kloonaus ja ilmaisu

Seuraava havainnollistaa ihmis-CSF-1:n koodisekvens-sin saamisessa käytettyjä menetelmiä, tämän sekvenssin viemiseksi ilmaisuvektoreihin ja halutun proteiinin ilmaisun saamiseksi. Luonnollisesti DNA:n hankintaa ei tarvitse tois-30 taa; julkistetut sekvenssit voidaan saada osittain tai koko naisuudessaan synteesin avulla.

F.l. Natiivin ihmis-CSF-1:n puhdistus ja koettimen muotoilu

Puhdistettiin ihmisvirtsa-CSF-1:tä standardimenetel-35 millä kuten kuvanneet Das, S.K., et. ai. Blood 58 (1981) 630, 37 102190 mitä seurasi affiniteettipuhdistusvaihe, jossa käytettiin rotan hiiri-CSF-l-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, nimettynä YYGl06:ksi, .kiinnitettynä Sepharose 4B-kolonniin (Stanley, E.R., Methods Enzymol♦ 116 (1985) 564). Viimei-5 nen vaihe puhdistuksessa oli käänteisfaasi-HPLC 0,1 % TFA/30 % asetonitriili - 0,1 % TFA/60 % asetonitriili-pus-kurijärjestelmässä. Puhdistuksen yksityiskohdat ja tulokset sekä koettimien muotoilu on kuvattu PCT-hakemusjulkaisussa W086/04607 (supra).

10 F.2. Ihmisgenomisekvenssin valmistus CSF-l:tä koodaava ihmisgenomisekvenssi saatiin Maniatiksen ihmisgenomikirjastosta Λ-fagi Charon-4:ssä käyttäen koettimia, jotka oli suunniteltu koodaamaan ih-misproteiinin N-päätysekvenssiä, kuten kuvattu PCT-hakemus-15 julkaisussa WO86/04607 (supra). Talletettiin Charon-4A-fagi, joka sisälsi CSF-l-sekvenssin arvosteltuna hybridisoitumi-sesta koettimeen kuten alla kuvattu, ja joka nimettiin phCSF-liksi, talletuslaitokseen the American Type Culture Collection (ATCC) 2. huhtikuuta 1985 ja sen hakunumero on 20 4Ö177. Tämän fagin myöhemmässä tutkimuksessa havaittiin, että uudelleenjärjestäytymisiä ja/tai geletioita oli tapahtunut, eivätkä oikeat sekvenssit olleet tallella. Tämän vuoksi nimettiin phCSF-la:ksi vaihtoehtoinen genomikirjastosta samalla tavalla saatu pesäke ja lisäännytettiin 25 stabiilisuuden toisiintumisen aikana varmistamiseksi ja talletettiin se ATCC-laitokseen 21. toukokuuta 1985 ja se sai hakunumeron 40185. phCSF-la sisälsi 18 kb:n insertin ja kykeni synnyttämään restriktioentsyymipilkkoutumistuot-teita, jotka myös hybridisoituivat koettimeen ja sitä käy-30 tettiin sekvenssimäärityksessä ja lisäkoetinrakentamisessa.

Sekvenssoitiin phCSF-la:han sisältyvä 18 kb:n geeni kokonaisuudessaan. Geeni sisältää 9 eksonia 8 intronin erottamina verrattuna kuvion 1 psCSF-17-sekvensseihin. Kypsän proteiini-cDNA:n alueet vastaavat tarkalleen genomin ekso-35 nikodoneja lukuunottamatta kodonia 59; ihmis-CSF-l-proteii- 38 102190 nin "pitkässä muodossa" esiintyy venynyt koodialue ekso-nin 6 5'-päädyssä kuten alla tarkemmin kuvataan.

Kuvio 3 esittää kaaviokuvan ihmis-CSF-1:n genoraira-kenteesta. Ensimmäinen eksoni sisältää ei-translatoitu-5 van 5'-sekvenssin ja signaalisekvenssin ensimmäiset 13 aminohappojäännöstä. Jäljelle jäävät signaalisekvenssin 19 aminohappoa ja kypsän CSF-proteiinin ensimmäiset 22 aminohappoa koodautuvat toisesta eksonista. Lopetuskodoni ilmaantuu eksonissa 8, joka sisältää niinikään 9 bp:tä 10 3'-ei-translatoituvaa sekvenssiä. Geenin katto on noin 18 kb:tä ja se sisältää ainakin 9 eksonia, todennäköisimmin 10, jotka vaihtelevat kooltaan 63 bp:stä 2-3 kb:n oletettuun maksimiin. Uskotaan, että 3'-ei-translatoitu-va sekvenssi voi täydentyä joko eksonilla 9 tai eksonil-15 la 10. Vaikka esitetään kaksi erillistä eksonia, ei ole selvää, onko olemassa 9. introni ja 10. eksoni vai sisältyykö eksoniin 9 vaihtoehtoinen leikkauskeskus. Kuten alla tarkemmin kuvataan CSF-l:n lyhyt muoto on tulosta leik-kauskeskuksen eksonin 6 3'-päädyn vaiheilla käytöstä; 20 pitkä muoto on tulosta leikkauskeskuksesta kohdassa, joka kuviossa 3 esiintyy tuon eksonin alkukohtana.

Kuviossa 3 havainnollistettujen eksonien ja intronien koot ovat seuraavat: 25 Ekso- Koko Intro- Koko ni (bp) ni (kb) 1 217 I 3.1 2 123 II 1; 3 3 63 ΙΠ 1.3 30 4 171 IV 4J6 5 148 V 1T2 tai 2.1 6 1025 tai 131 VI 0,6 7 49 VII 0.3 3 60 VIII 0,8 35 9 1400 (?) (IX) 7 (10) 7 39 1 02 1 90

Se, että genomiklooni tulee transkriptoiduksi lukuisiin RNA-transkripteihin leikkauskeskuksista riippuen, todennetaan Northern-analyysillä. Indusoitiin MIAPaCa-solu-ja seerumivapaissa olosuhteissa 50 ng:lla/ml PMA:ta ja 5 10 ^uM:lla retiinihappoa 3 päivän ajan kolmessa perättäi sessä indusoinnissa ja eristettiin mRNA kolmatta indusoin-tia seuraten alla kuvatun yleisen menettelyn mukaan. mRNA-isolaatilla suoritettiin elektroforeesiajo 2,5 M formaldehydiä sisältävässä 1 %:sessa agaroosigeelissä, siirrettiin 10 siirtokuvana nitroselluloosalle ja seulottiin tarkoituksen mukaisella oligonukleotidilla. Saadaan lukuisia nauhoja, jotka vastaavat mRNA-tyyppejä 16S, 18S, 26S, 28S, ja pooli vastaten 22-25S:ää.

ML06, koodisekvenssiä genomin eksonissa 8 vastaava 15 20-meeri, hybridisoituu kaikkien näistä transkripteihin; täten todentaen, että kaikki koodaavat CSF-l:tä. Eksonin 8 sekvenssit ovat luonnollisesti yhteisiä sekä pitkille että lyhyille muodoille. (Toinen koetin, GM15, sellaiseen hiiri-31-ei-translatoituvaan sekvenssiin sopiva 21-meeri, joka 20 ei osoita homologiaa ihmisklooneihin nähden, ei hybridisoi- du yhteenkään MIAPaCa-transkriptiin.

GMll, pitkän eksonin 6 5'-päädyssä sijaitseva ja tä ten pitkän muodon sekvenssissä 894 bp:tä sisältävää "yli-määrä”inserttiä vastaava 40-meeri, hybridisoituu 28S-trans-25 kripteihin ja ryhmään 22-25S, mutta ei loppuihin kolmeen.

Täten ilmeisesti nämä transkriptit vastaavat pitkää muotoa.

20-meeri, JV30, joka sopii 5'-päätyyn genomin eksonissa 9, hybridisoituu 22-25S-ryhmään ja 16S:n ja 18S:n RNAthan, mutta ei 26S:n tai 28S:n. Tämän vuoksi 26S ja 28S vaikutta-30 vat seuraavan prosessoinnista, jonka kuviossa 3 esitetään kattavan oletetun eksonin 10. Lisäkoetin, ihmis-CSF-l-geno-, mifragmetnista, joka alkaa (kohdassa) 1500 bp:tä eksoniin 9, valmistettu 4,2 kb:n koetin, hybridisoituu vain 26S-ja 28S-transkripteihin.

40 1 02 1 90 CSF-l:tä koodaavaa genomifragmenttia voidaan käyttää ilmaisua varten eukaryoottisissa, introneja prosessoimaan kykenevissä soluissa. Genomifragmentin ilmaisemiseksi insertti ligatoidaan sopivaan isäntävektoriin kuten nauta-5 syylävirusvektori tai muu nisäkäsvirusvektori välittömästi sopivasta promoottorista, kuten hiiren tai ihmisen metallo-tioneiinipromoottori, alavirtaan.

F.3. Ihmis-CSF-1:tä koodaavan cDNA:n hankinta pcCSF-17 (SCSF) 10 Ihmisperäistä haimasyöpäsolulinjaa MIAPaCa-2 käytet tiin mRNA-lähteenä koettimien oikeellisuuden toteamiseksi ja cDNA-kirjaston muodostamiseksi, joka sisältää ihmis-CSF-l:tä koodaavan sekvenssin intronivapaan muodon. MIAPaCa-solulinja tuottaa CSF-l:tä tasolla, joka alittaa 15 noin 10-kertaisesti hiiri-L-929-solujen tuottotason.

pcCSF-17 saatiin tästä kirjastosta, kuten kuvattu PCT-hake-musjulkaisussa W086/04607.

Lyhyesti, 300 000 kloonin kirjastoa, joka oli saatu rikastetusta MIAPaCa-mRNA:sta Okayaman ja Bergin menetel-20 män mukaan, seulottiin sitten erittäin ankarissa olosuh teissa käyttäen genomi-DNA:sta saatua eksoni II-koetina. Noukittiin 10 kyseiseen koettimeen hybridisoituvaa pesäkettä ja puhdistettiin kukin pesäke. Näistä klooneista määritettiin CSF-l:tä koodaavien sekvenssien läsnäolo ohimene-25 vän ilmaisemisen COS-7-soluissa avulla. SV40-promoottorin sisältävää kloonausvektoria sinänsä käytettiin COS-7-solu-jen transformoinnissa.

Plasmidi-DNA puhdistettiin 10 positiivisesta kloonista käyttäen CsCl-gradienttia, ja COS-7-solut transfektoi-30 tiin käyttäen kalsiumfosfaattikanssasaostusmenettelyn muun nosta (Wang, A.M. et. ai., Science 228 (1985) 149). Kolmen päivän inkuboinnin jälkeen CSF-l-tuotanto määritettiin suorittamalla viljelmäsupernatanteista oleellisesti Dasin, S.K. et. ai., Blood 58 (1981) 630, julkistaman mukainen 35 radioreseptorimääritys ja pesäkestimulaatio- (luuydinli- säännytys-) määritys, joka suoritettiin oleellisesti 41 102190

Prystowskyn, M.B. et. ai., Am. J. Pathol. 114 (1984) 149, julkistaman mukaan. Valituista kymmenestä kloonista' 9 ei onnistunut osoittamaan ohimenevää CSF-1-tuotantoa COS-7-soluissa. Yhtä kloonia, joka kuitenkin osoitti ilmaisua, 5 viljeltiin, eristettiin plasmidi-DNA ja sekvenssoitiin insertti. DNA-sekvenssi, päätellyn aminohapposekvenssin ohella, on esitetty kuviossa 1. Täysimittainen cDNA on pituudeltaan 1,64 kb:tä ja koodaa 224 aminohapon kypsää CSF-l-proteiinia (SCSF) kuten esitetty kuviossa 1. Klooni 10 nimettiin CSF-17:ksi Cetus-talletusnumerolla CMCC 2347 ja talletettiin talletuslaitokseen the American Type Culture Collection 14. kesäkuuta 1985 hakunumerolla 53149. CSF-1:tä koodaavan DNA käsittämä plasmidi nimettiin pcCSF-17:ksi. LCSF:ää koodaavat kloonit 15 Käytettiin pcCSF-17:ää valmistettuna kuten edellä kuvattu koettimena muiden CSF-1:tä koodaavien kloonien saamiseksi ihmis-cDNA kirjastosta. Kokonais-mRNA valmistettiin MIAPaCa-soluista täsmälleen kuten kuvattu PCT-hake-musjulkaisussa W086/04607 (supra) ja sitä käytettiin cDNA-20 kirjaston saamiseksi ^gtlO-fagivektoreissa ligatoimalla käänteistranskriptit EcoRI-liittäjiin ja insertoimalla täten hankitun cDNA:n EcoRI-pilkkomistuotteet r\gtlO:n EcoRI-keskukseen kuten kuvanneet Huynh, T.V., et. ai. julkaisussa DNA Cloning Techniques; A Practical Approach, 25 IRL Press, Oxford, 1984, D. Glover, toim.

Seulottiin yli miljoona fagia käyttäen CSF-17:stä saatua yksisäikeistä korkealeimattua koetinta standardi-menettelyitä käyttäen, joista seuraava lyhyt yhteenveto: pcCSF-17-DNA:n EcoRI-fragmentti, joka sisältää 30 CSF-1:n koodisekvenssin kokonaisuudessaan (pcCSF-17:ssä välittömästi koodisekvenssin lopetuskodonia seuraten esiin-. tyy EcoRI-keskus), insertoitiin Ml3:een ja syntetisoitiin leimattu toinen säie seuraavasti: noin 1 pikomoolia Ml3:a, joka sisälsi yksisäikeisen EcoRI-pilkotun pcCSF-17:n, juo-35 tettiin 10 pikomooliin sekvenssointipohjustetta liuoksessa 102190 20 mM Tris, pH 7,9, 20 mm MgC^, 100 mM NaCl, ja’ 20. mM y?-merkaptoetanoli, 67°C:ssa 5 minuutin ajan ja siirret-tiin sitten 42°C:een 45 minuutiksi. Juotettuun valmisteeseen lisättiin 100 ,umol dATP:tä, dCTP:tä, ja dTTP:tä kuta-5 32' kin ja 2,5 ^umol P-leimattua (oOdGTP:tä sekä 5 U:ta Klenow-fragmenttia. Reaktioseosta inkuboitiin 37°C:ssa 20 minuuttia ja DNA otettiin talteen P-6-dG- (Bio-Rad) spin-kolonnissa ja keitettiin 10 minuuttia säikeiden erottamiseksi toisistaan .

Täten valmistettuja koettimia käytettiin plakkien (jotka oli siirretty nitroselluloosaan) seulomiseksi hybri-disoimalla ankarissa olosuhteissa (50 % formamidi, 5x SSC, 5x Denhardtin liuos) 42°C:ssa 18 tunnin ajan.

Noin 150 fagiplakkia oli positiivisia. Viisi näistä 15 150 koetinpositiivisesta plakista oli edelleen koetinposi- tiivisia käytettäessä oligonukleotidia JDll, 14-meeri, joka komplementoi emäksiä eksonin 2 ja 3 leikkausliittymäkohdan alueella hybridisoitaessa 45°C:ssa yön yli liuoksessa 5x SSC, 5x Denhardtin liuos.

20 Sitten kyseiset viisi JDll-positiivista kloonia saa tettiin hybridisoitumaan oligonukleotidiin GM11, joka omaa sekvenssikomplementtinukleotidit 506-545 kuviosta 2. Kuten kuvattu edellä tämä sekvenssi on täysin istuva siihen ih-misgenomisekvenssin osuuteen nähden, joka vastaa alla ku-25 vatun hiiri-cDNA:n "ylimäärä"-osuutta, joka koodaa hiiri- CSF-l-proteiinin "pitkissä muodoissa" "ylimääräistä" 298 aminohapon segmenttiä. Hybridisointi suoritettiin liuoksessa 20 % formamidi, 5x SSC, 5x Denhardtin liuos, 45°C:ssa 18 tuntia kestävänä. Kolme kloonia oli positiivisia mukaan-30 lukien oleelliset kloonit 4 ja 25.

Täydellinen DNA-sekvenssi cDNA-inserttien klooneissa 4 ja 25 keskeisille koodialueille sekä johdettu aminohappo-sekvenssi on esitetty kuviossa 2. Sekvenssi saatiin integroimalla genomikloonin, phCSF-la, kuvattu edellä, tunnettu 35 sekvenssi käyttäen alla kuvattujen hiirisekvenssien 298 ami- 43 1 02 1 90 nohapon "ylimäärä"-inserttiä oppaana esitetyn täydellisen sekvenssin päättelemiseksi. Esitetyssä sekvenssissä näkyy "ylimäärä"-segmentin liitosjatke, joka on riittävä koodaamaan geeniin eksonin 6 5'-sivustassa sisältyvät 5 298 "ylimäärä"-aminohappoa pcCSF-17:n sekvenssiin Gly- jäännöksen aminohappoasemassa 150 kodonin ensimmäisen nukleotidin väliin lukualueeseen lopun CSF-17-sekvenssin kanssa. Insertti muuttaa kodonin asemassa 150 asparagiini-hapon kodoniksi, seuraava kodoni insertin päässä rekonsti-10 tuoituu Gly-kodoniksi ja loppujäännössekvenssi, joka al kaa His-Glu-Arg- jne., C-päädyn Vai-jäännökseen asti pysyy samana kuin pcCSF-17:ssä. LCSF on sekvenssin osalta muuten identtinen SCSF:ään nähden jäännökseen 150 asti, paitsi että se omaa Aspin, eikä Tyriää, asemassa 59.

15 Kaksi klooneista, 4 ja 25, kloonattiin Ml3mpl8:aan ja M13mpl9:ään sekvenssointia varten kuviossa 2 esitettyjen tulosten varmistamiseksi EcoRI-restriktiokeskuksia käyttäen. Restriktioentsyymianalyysin perusteella nämä kaksi kloonia vaikuttivat identtisiltä. Määritettiin kloo-20 nin 4 täydellinen sekvenssi ja se on kuviossa 2 esitetty sekvenssi; kloonin 25 osittainen sekvenssointi antaa yhtäpitäviä tuloksia. Sitten ne alakloonattiin modifioituun Okayama-Berg-vektoriin pcDB, joka valmistettiin julkaistuista Okayama-Berg-vektoreista pcDVl ja pLl (Okayama, 25 H. et. ai. , Mol. Cell. Biol. _3 (1983) 280-289) seuraavasti: pcDVlitä pilkottiin Hindlllilla ja Kpnlillä ja eristettiin suuri fragmentti, joka tuo mukanaan AmpR:n, pBR322:n toisiintumisen alkukohdan ja polyadenylaatiokes-kuksen. pLlitä pilkottiin Hindlllilla ja Pstlillä ja eris-30 tettiin SV40-promoottorin ja toisiintumisen alkukohdan mukanaan tuova pieni fragmentti. Nämä fragmentit uudelleen-.· ligatoitiin kolmenkeskisessä ligatoinnissa synteettiseen,

Kpnl/PstI:llä pilkottuun oligonukleotidifragmenttiin

CTGCAGGAGCTCAGATCTTCTAGAGAATTCTCGAGCGGCCGCATCGATGGTACC 3 e GACGTCCTCGAGTCTAGAAGATCTCTTAAGAGCTCGCCGGCGTAGCTACCATGG

44 102190 pcDB:n saamiseksi, joka vastaa viitteessä esitettyä pcD-x:ää, jossa "x":n korvaa polyliittäjä. Täten pcDB sisältää SV40-varhaispromoottorin ja välittömästi siitä alavirtaan sijaitsevan liittäjän, jota seuraa polyadenylaatiokeskus.

5 Polyliittäjäalueelle ligatoitujen sekvenssien tulisi ilmaistua SV40-varhaispromoottorin säätelyn alaisina.

Koska klooneista 4 ja 25 vaikutti puuttuvan joitain 5'-päätysekvenssejä CSF-17:ään verrattuna, korvattiin ennen ilmaisun testaamista kloonien 4 ja 25 ylävirta-alueet 10 ylävirta-alueilla pcCSF-17:stä.

Menettelyjärjestys tässä korvauksessa oli seuraava: pcCSF-asp59-BamBcl:tä (katso alla) pilkottiin Smalrllä, joka leikkaa ei-translatoituvan sekvenssin äärimmäisen 5'-päädyn kohdalta (katso kuvio 1), ja ligatoitiin linea-15 risoitu plasmidi EcoRI-liittäjiin ja uudelleen kiinnitettiin. Sitten uudelleenligatoitua plasmidia pilkottiin EcoRI:lla, joka poistaa koodialueen Smal-keskuksesta äärimmäisessä 5'-päädyssä EcoRI-keskukseen välittömästi lo-petuskodonista alavirtaan kokonaisuudessaan. Tämä ligatoi-20 tiin pcDB:n polyliitäjään EcoRI-keskuksessa. BstXI-keskuk- sesta, joka keskus sijaitsee suunnilleen CSF-17:n kypsän proteiinisekvenssin (katso kuvio 1) kodonin aminohapolle 8 kohdalla, alavirtaan sijaitsevat koodisekvenssit poistettiin pilkkomalla BstXI:llä ja Kpnl:llä. (Kpnl leikkaa liit-25 täjään hieman lopetuskodonin toisella puolella sijaitsevasta

EcoRI-keskuksesta alavirtaan). Tämä poistettu alavirtasek-venssi korvattiin analogisella Bstl/Kpnl-fragmentilla pMl3-4:stä ja pMl3-25:stä. Saatavat kloonit, pcDBhuCSF-4 ja pcDBhuCSF-25 sisälsivät täten koodisekvenssit alavir-30 taan aminohapon noin 8 kodonista klooneista 4 ja vastaavasti 25, ja ylävirtasekvenssit pCSF-17:stä. Ligatoidut • » sekvenssit ovat lukualueella ja SV40-varhaispromoottorin säätelyn alaisina..

45 1 02 1 90

Muteiineja koodaavat sekvenssit/eukaryoottiset ilmaisuvektorit

Tehtiin modifikaatioita pcCSF-17-inserteistä vastaavien, SCSF-proteiinien muteiineja koodaavien plasmidien 5 saamiseksi, Paikkaspesifistä mutegeneesiä varten pcCSF-17:ää ja M13mpl8:aa pilkottiin samalla restriktioentsyymillä, joka leikkaa tarkoituksenmukaisen alueen CSF-l-koodisekvenssis-tä, ja leikattu sekvenssi ligatoitiin Ml3-vektoriin. Toisen säikeen synteesissä ja halutun mutat.oidun DNA:n talteenotos-10 sa käytettiin seuraavia oligonukleotidipohjusteita: pc O 5 2 SCSF. 5·-TACCTTAAACCGGCATTTCTC-3', joka luo uuden Hpall-keskuksen kodonien 52-53 kohdalle; gln52SCSF, 5'-TACCTTAAACAGGCCTTTCTC-3', joka luo uuden Stul-keskuksen kodonien 52-53 kohdalle; 15 asp59SCSF. 5'-GGTACAAGATATCATGGAG-31, joka luo uuden EcoRV-keskuksen kodonien 59-60 kohdalle.

Toisen säikeen jatkamista Klenowia käyttäen seuraten fagit transformoitiin E. coli DG98:aan ja seulottiin saatavat plakit kinaasikäsitellyllä leimatulla koettimella.

20 Plakkipuhdistuksen jälkeen palautettiin halutut mutatoi- dut insertit korvaamaan ei-mutatoituja inserttejä pcCSF-l:ssä ja saatiin pCSF-pro52, pCSF-gln52 ja vastaavasti pCSF-asp59.

Valmistettiin myös kolme deletiomutanttia, jotka koodaavat C-päätydeletoitua SCSF/C ^158:aa, sisältäviä plas-25 mideja: pCSF-Bam, pCSF-BamBcl, ja pCSF-BamTGA. pCSF-Bam:ää • varten pcCSF-17:ää pilkottiin BamHI:llä ja eristettiin koo- dialueen ylävirta-BamHl/BamHI-fragmentti ja uudelleenliga-toitiin se vektorifragmenttiin. Ligatointiseos transformoitiin E. coli MM294:ään ja eristettiin oikean suuntautu-30 misen omaavat plasmidit. Saatava pCSF-Bam koodaa 158:aa aminohappoa CSF-l-proteiinista fuusioituna vektorista peräisin oleviin 6 jäännökseen C-päädyssä: arg-his-asp-lys-ile-his.

pCSF-BamBcl:tä varten, joka sisältää CSF-l-koodisek-35 venssin kokonaisuudessaan lukuunottamatta seriinin asemassa 46 1 02 1 90 159 mutatoitumista lopetuskodoniksi, koodisekvenssi leikattiin pcCSF-17:stä ja ligatoitiin Ml3:een paikkaspesi-fistä rautageneesiä varten käyttäen pohjustetta: 5 *-GAGGGATCCTGATCACCGCAGCTCC-3·-5 Tästä seuraa uusi BclI-keskus kodonien 159-160 kohdalle. Mutatoitu DNA leikattiin BstXI/EcoRI:llä ja ligatoitiin BstXI/EcoRI:llä pilkottuun pcCSF-17:ään, ligatointiseos transformoitiin E. coli DG105:een, dam -isäntä, ja eristettiin plasmidi-DNA.

10 pCSF-BamTGA:ta varten, jossa kodonit alavirtaan lope- tuskodonista asemassa 159 ovat deletoituneet, pCSF-BamBcl:tä pilkottiin Xholsllä ja Bell:llä ja ligatoitiin insertti XhoI/BamHI:llä pikottuun pcCSF-17:ään.

Lisäksi valmistettiin pCSF-Glyl50, joka sisältää TGA-15 lopetuskodonin histidiinin asemasta asemassa 151, pcCSF-17-insertistä paikkaspesifisen mutageneesin avulla sopivaa poh-justinta käyttäen kuten edellä kuvattu. Sopiva pohjustin on 5'-AGCCAAGGCTGATCAAGGCAGTCC-3’.

Täten koodisekvenssin alavirtaosuus leikattiin pcCSF-17:stä 20 BstXI/EcoRI:llä M13-vektoreihin mutageneesiä varten ja pa lautettiin plakkipuhdistuksen jälkeen BstXI/ECoRl-insert-tinä.

"Kaksois"-muteiineja valmistettiin samalla tavalla. Täten esimerkiksi pCSF-asp59-glyl50:n kohdalla, joka koo-25 daa asp5gSCSF/CV150:tä, pilkottiin pcCSF-asp59:ää

BstXI/EcoRI:llä C-päätyfragmentin sijoittamiseksi Ml3:een paikkaspesifistä mutageneesiä varten samalla pöhjustimella kuin edellä pCSF-glyl50:n luomiseksi. Mutatoitu fragmentti palautettiin sitten vektoriin pCSF-l-asp59-glyl50:n saa-30 miseksi.

Vastaavalla tavalla toistettiin menettely pCSF-BamBcl:n valmistamiseksi (lukuunottamatta pCSF-asp59:n käyttöä pCSF:n asemasta lähtöplasmidina) pCSF-asp59-BamBclI:n saamiseksi.

Käyttäen edellä pCSF-gln52:n ja pCSF-asp59:n valmis-35 tuksen yhteydessä kuvattuihin nähden analogisia menettelyitä 47 102190 valmistetaan vastaavat plasmidit, jotka sisältävät vastaavien muteiinien pitkät muodot, pLCSF-gln52 ja pLCSF-tyr59. Menettely on kuten edellä kuvattu lukuunottamatta, että aina käytettäessä tuossa menettelyssä pcCSF-17:ää korva-5 taan pcDBhuCSF-4 tai sen ekvivalentti plasmidi ja tehdään tarkoituksenmukaiset muutokset pohjustimeen tyr^-muteiinia varten.

Paikkaspesifistä mutageneesiä käytetään niinikään haluttujen mutaatioiden saamiseksi kummankin proteiinin glyko-10 sylaatiokeskuksissa ja kysteiinin asemassa 90 korvaamiseksi; sitä voidaan käyttää myös erilaisten C-päätydeletioiden saamiseksi LCSFsää koodaavasta DNA:sta.

F.4. CSF-l:n ohimenevä ilmaisu pcCSF-17:n ilmaisu 15 Plasmidi-DNA:n CSF-17:stä (pcCSF-17) ilmaisu COS-7-so- luissa varmistettiin ja kvantitoitiin käyttäen luuydinli-sääntymismääritystä, pesäkestimulaatiomääritystä ja radio-reseptorimääritystä. Palautettakoon mieleen, että luuydin-lisääntymismäärityksen spesifisyys CSF-l:lle perustuu vain 20 CSF-l-vastaseerumin kykyyn vähentää aktiivisuutta; pesäke- stimulaatiomäärityksen osalta saatavien pesäkkeitten luonteeseen. Molemmat määritykset osoittivat CSF-l-tuotannon olevan luokkaa useita tuhansia yksiköitä millilitraa kohden.

25 Luuydinlisäännyttäminen

Luuydinstimulaatiomääritystä, joka mittaa proteiinin biologista aktiivisuutta, varten luuydinsoluja Balb/C-hii-ristä käsiteltiin 72 tunnin supernatanttien sarjalaimennok-silla ja solujen lisääntyminen mitattiin leimatun tymidii-30 nin otosta, oleellisesti kuten kuvanneet Moore, R.N. et.ai., J. Immunol. 131 (1983) 2374; Prystowsky, M.B. et. ai., :* Am. J. Pathol. 114 (1984) 149. Indusoitujen MIAPaCa-solu- jen kasvualustaa käytettiin kontrollina. Spesifisyys CSF-l:lle varmistettiin ihmisvirtsa-CSF-1:tä vastaan tuotetun kanii-35 nivastaseerumin kyvystä tukahduttaa tymidiinin ottoa. Tulok- 48 1 02 1 90 set COS-7-solusupernatanteille, jotka oli transfektoitu pcCSF-17:llä (CSF-17-supernatantti) laimennoksena 1:16, on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 5 3 H-tymidiinin otto (tuiketta/min) ei lisäyk- tavallinen anti-ihmis- siä_ seerumi_ CSF-1 -seerumi 10 kasvualusta 861 786 2682 MIAPaCa-super- natantti 12255 16498 3302 CSF-17-super- natantti 16685 21996 2324 15 (Ihmisvastainen CSF-l-seerumi valmistettiin kuten kuvanneet Das et. ai., supra).

MIAPaCa-supernatantti (yllä käytettynä 1:16 laimennoksena) sisälsi 125 U/ml CSF-aktiivisuutta vastaten 2000 U:ta/ml laimentamattomassa supernatantissa, jolloin 1 yksik-20 kö pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta määritellään määrä- 5 na CSF:ää, joka tarvitaan tuottamaan yhden pesäkkeen 10 luuydinsolusta/ml Stanleyn, E.R., et. ai., J. Lab. Clin. Med. 79 (1972) 657, määrityksessä.

Nämä tulostiedot osoittavat, että luuydintä stimuloi-25 va aktiivisuus liittyy CSF-1:een, koska anti-CSF-l-seerumi inhiboi tymidiinin ottoa. Tässä luuydinlisääntymismäärityk-sessä neljälle laimennokselle välillä 1:8 - 1:64 saatujen tulosten regressio antoi CSF-1:n arvioidulle aktiivisuudelle CSF-17-supernatanteissa arvon 2358 U/ml, joka vähe-30 ni 424 U:hun/ml vastaseerumin läsnäollessa, mutta osoitti ilmeisen kohoamisen 3693 U:hun/ml ei-immuuniseerumin läs-näollessa. Tämä oli rinnastettavissa radioreseptorimääri-tyksessä alla esitettyihin tasoihin.

. 102190 49

Pesäkestimulointi CSF-17-supernatanttien suora määritys pesäkestimulaa-tion suhteen (Stanley, E.R. et. ai., J. Lab. Clin. Med. (supra), antoi 4287 U/ml, johon ei-immuuniseerumin läsnäolo 5 ei oleellisesti vaikuttanut, mutta joka pieneni arvoon 0 U/ml kaniinin anti-ihmis-CSF-1:n läsnäollessa. Tämä on verrattavissa 2562 U:n/ml arvoon MIAPaCa-supernatanteille. pcCSF-17:llä transformoidulla COS-7-supernatantilla indusoiduista pesäkkeistä 85 %:n morfologia .oli yksitumainen; 10 MIAPaCa-supernatantilla indusoiduilla pesäkkeillä ilmeni suhde 94 % makrofageja - 6 % jyvässoluja.

Radioreseptorimääritys 125

Radioreseptorimääritys mittaa kxlpailua I-leimatun CSF-l:n ja testiyhdisteen välillä spesifisistä reseptoreista 15 J774.2-hiirimakrofagisolujen pinnalla. MIAPaCa-supernatant- tia, josta määritettiin pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus kuten edellä, käytettiin standardina (2000 U:ta/ml). pcCSF-17:llä transformoidun C0S-7-supernatantin CSF-l-pitoi-suudeksi todettiin 2470 U:ta/ml 1:10 laimennoksesta mitattu-20 na ja 3239 U:ta/ml 1:5 laimennoksesta mitattuna.

Täten verrattavia arvoja CSF-l-pitoisuudelle COS-7-so-lujen pcCSF-17:llä transformoidussa kasvualustassa todettiin kaikissa määrityksissä.

SCSF:n ilmaisu 25 Samalla tavalla kuin edellä kuvattu pcCSF-17:lle mute- ” iineja koodaavat plasmidit transfektoitiin COS-A2-soluihin ja määritettiin CSF-l-aktiivisuuden tilapäinen ilmaisu luu-ydinlisäännytysmäärityksen ja radioimmuunimäärityksen avulla anti-CSF-vasta-aineita käyttäen. pCSF-pro52:n ilmaisutuote 30 on inaktiivinen, mikä viittaa siihen, että kuten on odotettu korvaus proliinilla ei ole säilyvä. Kaikki muut muteiinit osoittivat aktiivisuutta kummassakin kokeessa kuten tulokset alla osoittavat: so 102190

Taulukko 2 CSF-l-rakenteiden ilmaisu COS-soluissa 5 radioim- muuni- luuydinmääritys pesäkkeitä CSF-1- määritys lisääntyminen plasmidi (yksikköä/ml) (yksikköä/ml) (yksikköä/ml) pcCSF-17 3130 2798 10 3080 3487 9750 3540 3334 11.500 pCSF-pro52 54,8 <25 <100 * 51, 9 <25 <100 45,3 <25 <100 15 pCSF-gln52 1890 2969 6200 2250 2308 5500 1910 2229 4400 pCSF~asp59 3210 3381 9000 4680 3417 6800 3470 2812 10.600 20 pCSF-Bam 9600 8048 22.600 8750 8441 21.900 8400 10.995 21.700 pCSF-BamBcl 8800 26.000 10.700 21.600 15,450 24.200 25 pCSF-BamTGA 8450 7550 23.200 9700 20.000 pCSF-Glyl50 26.850 55.710 51 102190

Taulukko 3

Hiiriluuydinpesäkemääritys 5 CSF-1- Pesäkkeitä muodostavia plasmidi yksikSitä/ml- pCSF-17 1 “·°°° 2 25,000 3 23.500 io pcSF-asp59glyiso l ipsioSo 3 132[000 pCSF-aspcqBamBcl 1 72.000 2 78.000 15 pcDBhuCSF-4:n ja pcDBhuCSF-25:n ilmaisu

Transfektoitiin ihmis-CSF-l-koodaavan DNA:n pitkän muodon sisältävät Okayama-Berg-tyyppiset vektorit (pcDBhuCSF-4 ja pcDBhuCSF*-25) COS-A2-soluihin täsmälleen analogisella tavalla C0S-7-solujen transfektoinnin 20 pCSF-17:llä yhteydessä edellä kuvattuun nähden. Trans- fektoitujen solujen supernatantit analysoitiin CSF-1:n suhteen käyttäen radioimmuunimääritystä CSF-1:tä vastaan tuotetulla vastaseerumilla valmistettuna kuten kuvanneet Das et. ai., (supra), ja myös edellä kuvatussa luuydin- 25 lisäännytysmäärityksessä. Tulokset, yksiköissä CSF.l:tä millilitrassa, on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4 pcDBhuCSF-4:n ja -25:n ilmaisu COS-A2-soluissa 30 RIM (yksik- LY-määritys näyte köä/ml_ (yksikköä/ml) pcDBhuCSF-4 16.979 9.200 pcDBhuCSF-25 15.926 8.000 kasvualusta 12.5 <50 valetartutus 25.0 <50 35 52 1 02 1 90

Kuten esitetty kummalla tahansa vektorilla transfektoi-tujen solujen supernatantit sisälsivät CSF-l-aktiivisuutta omaavaa proteiinia.

Samankaltaisella tavalla saadaan näiden spesifisten 5 LSCF-pitkä muotoproteiinien muteiinimuodot.

F.5. CSF-l:n eukaryoottinen ilmaisu stabiilisti transformoiduissa soluissa COS-7- tai COS-A2-järjestelmät tuottavat rekombinant-ti-CSF-l:tä sallimalla Okayama-Berg-tyyppisten vektorisek-10 venssien toisiintumisen ja ilmaisun niistä. Kyseessä on väliaikainen ilmaisujärjestelmä.

Ihmis- tai hiiri-CSF-l-sekvenssejä voidaan niinikään ilmaista stabiilisti prokaryoottisissa tai eukaryoottisissa järjestelmissä. Yleensä ottaen prokaryoottiset isännät tar-15 joavat helpon tuotannon, kun taas eukaryootit sallivat natiivin signaalisekvenssin käytön erityksen aikaansaamiseksi ja suorittavat minkä tahansa halutun translaation jälkeisen prosessoinnin. Tämä saattaa olla tärkeätä CSF-l:n kyseessä ollen, koska natiivi proteiini on dimeeri. Bakteerit 20 tuottavat CSF-l:tä monomeerinä, joka sitten voitaisiin saat taa dimerointiolosuhteisiin uuttamista seuraten, mikäli tarpeen.

Okayama-Berg-plasmidia pcCSF-17, tai analogisia, mu-teiineja koodaavaa DNA:ta sisältäviä vektoreita, esim.

25 pCSF-aspgg-gly^cjQ ja pCSF-asp5g-BamBcl, tai analogisia vektoreita pcDBhuCSF-4, pcDBhuCSF-25, pcDBmuCSF-L ja pcDBmuCSF-S, tai muita LCSF:n muteiineja koodaavia vektoreita, jotka sisältävät CSF-l:tä koodaavan cDNA:n SV40-promoot-torin säätelyn alaisina, voidaan myös käyttää stabiilin 30 ilmaisun aikaansaamiseksi apinan CV-l-soluissa, emosolulin- ja, josta COS-7-solulinja saatiin. Apinaisännän CV-l-soluja kasvatetaan yhteenkasvamisvaiheeseen ja kotransformoidaan sitten käyttäen 10 ^ug ilmaisuvektoria ja vaihtelevia määriä (1, 2, 5 ja 10 ug) pRSV-NE02:ta (Gorman, C. et. ai. , 35 Science 221 (1983) 551-553) 500 000 solua kohden. Trans- formantteja kasvatetaan 10 % FBS-kasvualustaa sisältävässä 53 1 02 1 90 DMEM:ssä, joka sisältää 100 ^ug/ml G418-antibioottia, jolle pRSV-NE02-plasmidi tuottaa resistenssin. CV-l-solu- -5 12 linja osoittaa G418-transformaatiotiheyttä noin 10 ' pesäkettä 10® solua kohden ^ug:aa DNA:ta kohden.

5 CV-l-solut kotransformoidaan kuten edellä kuvattu ja valikoidaan G418-pitoisessa kasvualustassa. Resistentit kloonit testataan G418-resistentin fenotyypin stabiili-suuden suhteen kasvun G418 vapaassa kasvualustassa avulla ja palautetaan sitten G418-pitoiseen kasvualustaan. Näiden 10 viljelmien kyky säilyä elinkelpoisina palautettaessa ne an tibioottia sisältävään kasvualustaan viittaa siihen, että pRSV-NE02-DNA on integroitunut pysyvästi solugenomiin.

Koska merkkiplasmidilla stabiilisti transformoidut solut ovat noin 50 %:n todennäköisyydellä integroineet kotrans-15 fektoivan plasmidin DNA:n, noin puolet näistä soluista sisältää niinikään kromosomi-DNA:ssaan ilmaisujärjestelmän CSF-l-proteiinille.

Kuten edellä stabiilisti transformoiduiksi osoitettujen CV-l-solujen G418-resistenteistä pooleista noukitaan 20 useita klooneja ja kasvatetaan kaksoispulloissa lähes yh- teenkasvamisvaiheeseen. Kustakin kaksoiskappaleesta yksi pullo tartutetaan SV40-viruksella 5 monikerrantartutuksel-la ja kasvualustasta kerätään sato 6 päivän kuluttua tar- tutuksesta CSF-l:n määritystä varten radioimmuunimääri- 125 25 tystä käyttäen. Immuunimääritys perustuu I-leimatun MIAPaCa-CSF-1:n kilpailuun puhdistettua ihmisvirtsa-CSF-l:tä vastaan tuotetusta "Rabbit 52" polyklonaalisesta vasta-seerumista.

Yksi transfektiosta pcCSF-17:llä valituista CV-1-30 klooneista osoitti 2335 U:n/ml CSF-l-tuotantoa tämän mää rityksen mukaan, kun taas SV40:llä tartuttamattomat solut osoittivat alle 20 U:ta/ml. Kontrollit, joina käytettiin 10 ^,ug:lla pcCSF-17:ää transformoituja C0S-7-soluja, osoittivat 2400 U:n/ml CSF-l-tuotantoa ilman SV40-tartutusta.

102190 54 CSF-1:tä tuottava CV-l-solulinja sisältää CSF-l-il-maisujärjestelmän stabiilisti genomiinsa integroituneena ja täten sitä voidaan käyttää CSF-1-tuotantoon SV40:llä tartutettaessa. Oletetaan tartutuksen "pelastavan" ilmai-5 sujärjestelmän genomista ja tarjoavan SV40 T-antigeenin, joka on välttämätön pelastetun DNA:n toisiintumiselle.

Ilman SV40-tartutusta CSF-1:tä koodaava integroitunut geeni ei tule tehokkaasti ilmaistuksi.

CSF-1:tä koodaavan sekvenssin ilmaisun CV-1-10 (CSF-17-) solulinjan toimesta optimointi osoitti 6500-8000 U:ta/ml mitattuna radioimmuunimäärityksellä 6 päivän kuluttua SV40-tartutuksesta monikertatartutusta arvolla ainakin 1 ja 10 %:n FBS-kasvualustaa käyttäen. Tutkimukset 10 monikerran ilmaisutasoissa osoittivat verrattavaa tuo-15 tantoa, mutta tuotanto aleni poistettaessa FBS kasvualustasta toisena tartutuksen jälkeisenä päivänä.

Vaihtoehdossa sopivia kontrollijärjestelmiä ja isäntä-vektoreita, jotka sallivat ilmaisun muissa eukaryoottisissa isännissä, voidaan käyttää CSF-1:tä koodaavia inerttejä 20 vastaanottamassa. Esimerkiksi voidaan käyttää CHO-soluja ja sopivia vektoreita. Lisäksi nämä sekvenssit sisältäviä bakulovirusvektoreita käytetään hyönteissolujen tartutuk-sessa proteiinin tuottamiseksi kuten kuvanneet Miller, D.W. et. ai. julkaisussa Genetic Engineering (1986) ss. 277 -25 297 (supra).

F.6. Prokaryoottinen ilmaisu

Prokaryoottista ilmaisua varten cDNA kloonia, tai ge-nomisekvenssiä josta intronit °n leikattu esimerkiksi paikka-spesifisen mutageneesin avulla, muutetaan ATG-aloitusko-30 donin sijoittamiseksi välittömästi glutamiinihaposta N-pää- dyssä ylävirtaan, ja Hindlll-keskuksen välittömästi ATG:stä ylävirtaan kätevän keskuksen luomiseksi insertointia stan-dardi-isäntäilmaisuvektoreihin alla varten. Tämä voidaan suorittaa suoraan käyttäen insertiopaikkaspesifistä muta-35 geneesiä synteettisen oligomeerin ohella, joka sisältää 55 102190 haluttua AAGCTTATG:tä komplementoivan uuden sekvenssin natiivia johto- ja N-päätykoodisekvenssiä komplementoivien nukleotidisekvenssien sivuamana.

Koodisekvenssin kokonaisuudessaan sisältävä DNA-frag-5 mentti leikattiin pcCSF-17:stä tai pcDBhuCSF-4:stä EcoRI:llä pilkkomalla, eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla ja otettiin elektroeluutiolla talteen. Mutageneesin suorittamiseksi myös isäntäbakteriofagin Ml3mpl8 DNA:ta käsiteltiin EcoRI:llä ja ligatoitiin kyseiseen puhdsitettuun frag-10 menttiin standardiolosuhteissa ja transfektoitiin syväjääh- dytettyyn transformoitumiskelpoiseen E. coli K12-kantaan DG98. Solut majoitettiin kasvualustaan, joka sisälsi -4 5x10 M rsopropyylitiogalaktosidia (IPTGitä), joka hankittiin valmistajalta Sigma Chem. (St. Louis, MO), ja 40 15 yug/ml X-gal:ia. Ei-komplementoivat valkeat plakit noukittiin tuoreeseen kasvualustaan. Miniviljelmiä seulottiin odotetun kokoisen yksisäikeisen rekombinanttifagi-DNA:n suhteen ja halutun rekombinanttifagin rakenteesta varmistuttiin restriktioanalyysiä käyttäen.

20 Syntetisoitiin CSF-l-sekvenssin N-pääty- ja johto- koodiosuuksia komplementoiva, mutta halutun AAGCTTATG-sek-venssin komplementin sisältävä 34-meeri ja puhdistettiin se. Vaihtoehdossa käytettäessä negatiivisen orientaation M13-säiettä käytettiin positiivisen orientaation 34-meeriä.

25 Osa tätä 34-meerivalmistetta, myöhemmin koettimena käytettäväksi, leimattiin radioaktiivisesti Maxamin ja Gilbertin menettelytavan (Maxam, A. et. ai.. Methods in Enzymoloqy 68 (1980) 521, Academic Press), muunnoksen mukaan kuten edellä esitetty.

30 Mutageneesin suorittamiseksi edellä valmistettu re- kombinanttibakteriofagi valmistettiin E. coli Kl2-kantaan DG98 ja puhdistettiin yksisäikeinen fagi-DNA. Juotettiin toisiinsa yksi pikomooli yksisäikeistä fagi-DNA:ta ja 10 pikomoolia edeltävää synteettistä nukleotidipohjustetta 35 (ei kinaasikäsiteltyä) kuumentamalla 1 minuutin ajan 56 1 02 1 90 67°C:ssa ja sitten 30 minuutin ajan 37°C:ssa 15 ^ulissa liuosta 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 20 mM MgC^r 100 mM NaCl, 20 mM 2-merkaptoetanoli. Juotettua DNA:ta inkuboitiin DNA-polymeraasi-I: llä (Klenov/) ja 500 ^u mikromoolilla kuta-5 kin dNTP:tä 30 minuutin ajan 0°C:ssa ja lämmitettiin sit ten 37°C:seen. Otettiin näytteitä (0,05 tai 0,25 pmol) 5 min, 20 min ja 45 min kuluttua, transformoitiin E. coli K12-kantaan DG98 ja maljoitettiin.

Kasvatuksen jälkeen maljoja jäähdytetään 4°C:ssa 10 ja plakit nostetaan valmistajalta Biodyne hankittujen

Pall-kalvojen tai S & S-suodattimien avulla (1-2 min ensimmäiselle suodattimelle, yli 10 min toiselle suodatti-melle). Suodattimet danaturoidaan liuoksessa 2,5 M NaCl, 0,5 M NaOH (5 min). Denaturoiva väliaine neutraloidaan 15 3 M natriumasetaatilla pH 5,5:een tai 1 M NaCl:ää sisäl tävällä 1 M Tris-Cl-puskurilla, pH 7,5, paistetaan suodattimia 80°C:ssa iri vacuo 1 tunnin ajan ja esihybridisoidaan sitten ankarissa olosuhteissa. Suodattimia seulotaan sitten kinaasikäsitellyllä edellä valmistetulla synteettisel-20 lä 34-meerillä ankarissa olosuhteissa, pestään ja autoradio- kuvataan yön ajan -70°C:ssa.

Kunkin halutun mutatoidun fagin rengasmuotoa käsiteltiin EcoRI:llä, tehtiin tylppäpäätyiseksi Klenow-entsyymil-lä ja pilkottiin sitten HindIII:lla geenin irtileikkaamisek-25 si Hindlll/tylppäfragmenttina.

Isäntävektorina käytettiin plasmidia pFC54.t (ATCC 39789), joka sisältää PT-promoottorin ja Bacillus thuringiensis1 n positiivisen retrosäätelysekvenssin (kuten kuvattu EPO-hakemusjulkaisussa nro 717 331, julkaistu 29. maa-30 liskuuta 1985). pFC54.t:tä pilkottiin Hindlll/BamHI(tylp pä): llä ja halutut koodisekvenssit ligatoitiin vektoriin käyttäen Hindlll/EcoRI(tylppä)-leikattua fragmenttia pcCSF-17:stä tai pcDBhuCSF-4:stä peräisin olevasta mutatoi-dusta M13:sta. Transformointia E. coli MC1000 lambdalyso-35 geeniin ja indusointia seuraten saatiin CSF-l-tuotantoa, 57 102190 oletettavasti SCSF:ää ja vastaavasti LCSFcää, mistä varmistuttiin kuten edellä kuvattu.

Täten esimerkiksi.Hindlll/EcoRI(tylppä)-fragmentti pcCSF-17:stä mutatoidusta M13-substraatista ligatoitiin 5 pFC54.t:hen kuten edellä kuvattu pPLCSF-17:n saamiseksi.

Sitten pPTCSF-17:ää pilkottiin BamHI:llä ja uudelleenli-gatoitiin pP_CSF-17/C Yl58:n saamiseksi, joka sisältää kypsän SCSF:n koodisekvenssin ATG-aloituskodonin edeltä-mänä, ja typistettiin proteiinin koodaamiseksi, joka omaa 10 SCSF-sekvenssin ensimmäiset 158 aminohappoa, joita seuraa lukualueella oleva proliini ja lopetuskodoni pFC54.t:n retrosäätelysekvenssistä. pPLCSF-17/CYl58:aa modifioitiin edelleen paikkaspesifisen mutageneesin avulla. Leikattiin irti Hindlll/BamHI-koodisekvenssi ja ligatoitiin se Ml3:een.

15 Käytettiin sopivaa pohjustinta lopetuskodonin sijoittamiseksi välittömästi aminohappoa 158 koodaavan kodonin jälkeen ja TGA:n sijoittamiseksi sen perään. Tämä luo BamHI/BclI-kes-kuksen jatkokäsittelyä silmälläpitäen. Mutatoitu fragmentti leikattiin sitten M13:sta ja uudelleenligatoitiin 20 HindllI/BamHI-pilkottuun pPLCSF-17/C Yl58:aan pPLCSF-17/cy 158TGA:n saamiseksi.

Muita korvaavien aminohappojen kodoneja omaavia rakenteita ovat modifikaatiot, jotka korvaavat lys:n asemassa 52 gln:llä tai pro:lla ja/tai tyr:n asemassa 59 aspsllä SCSF:ssä. 25 Nämä rakenteet valmistettiin analogisesti alkuperäisestä pPTCSF-17:stä Hindlll/EcoRI(tylppä)-fragmentin sisältävien Ml3-inserttien paikkaspesifisen mutageneesin avulla. HindIII/EcoRI-fragmentteja näistä mutatoiduista fageista käytetään sitten alkuperäisen Hindlll/EcoRI-insertin tilalla 30 vastaavia vektoreita rakennettaessa. Yleensä ottaen halutut mutaatiot valittuihin sijaintikohtiin voidaan tehdä tämän • standardimenettelytavan muunnoksien mukaan.

On mahdollista parantaa CSF-l:n tuotantotasoa mistä tahansa edeltävästä rakenteesta muuttamalla kolmas nukleo-35 tidi kussakin N-päädyn kuudesta ensimmäisestä kodonista.

58 1 02 1 90

Minkä tahansa muteiinin CSF-l-koodifragmentin sisältävää pFC54.t:tä pilkotaan Hindlll/BstXI:llä ja leikkaantunut fragmentti (joka sisältää ATG:n ja lyhyen osuuden seuraa-5 vaa koodisekvenssiä) korvataan synteettisellä Hindlll/-BstXI-segmentillä, jossa kuuden ensimmäisen kodonin sekvenssi on: GAAGAAGTTTCT GAATAT. Saatava analoginen ilmaisu-vektori ei osoita mitään muutosta koodautuneessa aminohapposekvenssissä; kuitenkin ilmaisutasot paranivat käytettäes-10 sä tätä modifioitua vektoria. Vastaavat vektorit on varustettu etuliitteellä O/E (yli-ilmaisu). Täten esimerkiksi muodostuu O/E pPTCSF-17, O/E pP_CSF-17/C 7158, ja 0/EpPLCSF-17/C 7158TGA.

Vastaava vektori, 0/EpP^CSF-17aspg^/C 7158TGA 15 syntetisoitiin kuten edellä kuvattu lukuunottamatta, että alkuperäisen EcoRI-insertin sisältävä M13 kaksoismutatoi-tiin Hindlll-keskuksen ja ATG-aloituskodonin sijoittamiseksi välittömästi ennen kypsän proteiinin aminohappoa 1, ja tyrosiinikodonin jäännöksen 59 kohdalla korvaamiseksi 20 asparagiinihappoa edustavalla kodonilla. Vastaavat vektorit 0/EpPLCSF-17asp59/C 7158, ja 0/EpPLCSF-17asp5g/C 7158TGA muodostuvat täten vastaavasti. Kaikissa edeltävissä tapauksissa kutakin välivaihevektoria voidaan pilkkoa HindIII:lla ja BstXI:llä ja korvata ensimmäistä kuutta aminohappoa koo-25 daava natiivi sekvenssi edulliset kodonit siäsltävällä synteettisellä DNA-fragmentilla.

Lisäksi kaikkia edeltäviä vektoreita modifioidaan koodaamaan N-päätydeletioita omaavia proteiineja korvaamalla irtileikattu HindIII/BstXI-DNA sopivalla synteet-30 tisellä fragmentilla. Tällä tavalla rakennettiin vastaavat CSF/N ^2 : ta ja -N 3 : a, joista puuttuu glu-glu ja .· glu-glu-val, koodaavat vektorit.

Rakennettiin myös analogisia vektoreita, jotka sisälsivät lopetuskodonin välittömästi glysiinijäännöksen 35 SCSF-proteiinin asemassa 150 jälkeen. Nämä vektorit saatiin 59 102190

HindiII/EcoRI-fragmentin pPTCSF-17:stä tai

Jj pPLCSF-17aspj.g:stä tai niiden vastaavien muteiinien mutageneesillä Hindlll/Smal-pilkotun M13:een. Saatavat vektorit, esimerkiksi pPLCSF-17/C 150 ja pPLCSF-17asp59/-5 cYl50, koodaavat sen vuoksi kypsän SCSF-proteiinin 150:tä ensimmäistä aminohappojäännöstä.

Edeltävät vektorit E. coli-A -lysogeeni-isäntään kuten DG116 transformoituina ja korkeassa lämpötilassa (noin 42°C) indusoituina tuottavat CSF-l:tä ja sen muteiineja monomee-10 risessä tai aggregoidussa deglykosyloidussa muodossa. Tämän proteiinin tuottuminen voidaan todeta käyttämällä standar-diradioimmuunimäärityksiä tai muita CSF-l-spesifisiä määrityksiä. Proteiinin aktiivisuutta voidaan mitattavasti parantaa uudelleenlaskostamismenettelyiden käytöllä.

15 On myös valmistettu rakenteita käyttäen PT-promootto- rin tilalla fosfataasi-A:n promoottoria tai erityksen johto-sekvenssiä. Kontrollisekvenssit, mukaanlukien pFC54.t:ssä läsnäolevia vastaavat 3'-retrosäätelysekvenssit, saadaan insertoimalla haluttu koodisekvenssi Narl/BamHI:llä pil-20 kottuun pSYC1089:ään, nämä kontrollit sisältävä isäntä- vektori .

Tämän vektorin hyödyntämiseksi oleelliset CSF-koodisek-venssit uudelleenligatoidaan Ml3:een välittömästi ATG:tä edeltävän Hindlll-keskuksen muuttamiseksi Clal-keskukseksi. 25 Sitten mutatoitu sekvenssi leikataan irti Clal/BclI-frag- menttina ja ligatoidaan pilkottuun pSYC1089-vektoriin kuten kuvattu. Tämän rakenteen tuotteet, jotka vastaavat PL~promoottorin säätelyn alaisina P^-vektorisarjassa tuot-tuvia lyhyitä muotoja, erittyvät ääreisplasmatilaan E. co-30 lissa ilmaistuina ja ovat suhteellisen liukoisia verrat tuna PT-säätelyn alaisina ilmaistujen geenien tuotteisiin.

• Vektoreita, jotka voidaan rakentee käyttäen tässä kuvattua phoA-järjestelmää, ovat pPhoA-LCSF/C ^158 ja pPhoA/-nV3C^150. Nämä vektorit transformoidaan ilmaisua varten 35 ei-7i-lysogeeni-isäntään, kuten E. coli MM294.

6„ 102190

Vektoreita rakennettiin myös käyttäen pitkä muoto-kloonista peräisin olevaa DNA:ta. Vektoria O/E pPLCSF-17asptjg/C^7 150, jota kuvattiin edellä, käytettiin isäntävektorina pitkä muoto-rakenteille ja erilai-5 sille pitkä muoto-koodisekvenssin C-päätytypistelmille.

Koska sekvenssit ylävirtaan BstXI-keskuksesta ovat yhteisiä sekä lyhyille että pitkille muodoille, lyhyen muodon ja sen muteiineja sisältävät vektorit voidaan muuttaa pitkän muodon vektoreiksi vaihtamalla tämän vektorin 10 BstXI-BamHI-fragmentti, jolloin sekvenssin alavirtaosuu- det TGA-lopetuskodoniin ja se mukaanlukien BstXI-BamHI-ragmentin Ml3:sta ohella, joka sisältää pitkän muodon koo-daavan sekvenssin kloonista 4, tai sen C-päätytypistel-miä, leikkaantuvat irti.

15 Tämän mukaisesti klooni 4-insertin sisältävää Ml3- kloonia mutatoitiin sopivilla oligomeereillä lopetuskodo-nien inertoimiseksi jäännöksien asemissa 150, 190, 191,

221, 223, 236, 238, 249, 258 ja 411 jälkeen. Esimerkiksi klooni 4-insertin sisältävää Ml3-käänteissäiettä pohjus-20 tettiin oligonukleotidilla GGCTTGACCTGATCAGACTCTGAGG

lopetuskodonin sijoittamiseksi treoniinijäännöksen asemassa 191 jälkeen ja yksittäisen BclI-keskuksen tuottamiseksi välittömästi sitä seuraamaan. Pilkottiin fagin muta-toitua rengasmuotoa BstXI:llä ja BamHI:llä ja ligatoitiin 25 BstXI/BamHI:llä pilkottuun O/E pPLCSF-17asp59/C ^7150 reen O/E pPLLCSFasp^g/C 7^50:n saamiseksi.

Mutatoitua pitkää muotoa voidaan käyttää vastaavien lyhyen muodon fragmenttien korvaamiseksi vektoreissa, jotka koodaavat N-päätydeletioita omaavia CSF-l-proteiineja, 30 sekä vastaavissa rakenteissa phoA-kontrolloiduissa vekto reissa. Esimerkiksi pPhoA-LCSF/N 73C ^/221 ja \ pPhoA-LCSF/C 1^221 rakennettiin ja transformoitiin E. coli MM294:ään. Luonnollisesti voidaan tuottaa useampi kuin yksi pitkän muodon mutaatio; samoin voidaan tehdä aminohap-35 pokorvauksia kuten gly^ ta-*- t^r59 61 102150

Lisärakenteita on valmistettu muteiineille, jotka koodaavat SCSFrää, LCSF:ää ja niiden muteiineja, joissa molemmille proteiineille yhteiset glykosylaatiokeskukset asemissa 122-124 ja 140-142 on korvattu aminohapoilla, 5 joihin ei kohdistu glykosylaatiota. Näiden rakenteiden bakteeri-ilmaisusta tuotetut CSF-proteiinit ovat biologisissa määrityksissä aktiivisia; tämä tukee oletusta, että glykosylaatio ei ole aktiivisuudelle välttämätöntä. Kuitenkin minkä tahansa kysteiinijäännöksen välillä ase-10 mat 1-150 korvaaminen seriinillä tai alaniinilla johtaa inaktiivisiin proteiineihin, lukuunottamatta, että substituution asemassa 90 käsittävät muteiinit omaavat immuno-reaktiivisuutta. Ilmeisesti kaikki nämä seitsemän kysteiiniä tarvitaan, tai ovat ainakin toivottavia, oi- keanlaiseksi uudelleenlaskostumiseksi.

N172- ja Np3-muteiinien rakentaminen keksinnön mukaisesti mistä tahansa edeltävästä vektorista on äärimmäisen suoraviivaista ja käsittää yksinkertaisesti Hindlll/BstXI-fragmentin poistamisen ja sen korvaamisen 20 synteettisellä fragmentilla, johon ei sisälly kodoneja ensimmäiselle kahdelle tai kolmelle aminohapolle, tapauksesta riippuen. Täten kutakin edeltävää vektoria voidaan modifioida tässä kuvattuja muteiineja koodaavan vektorin saamiseksi tämän yksinkertaisen korvausmenettelyn avulla.

25

Valmistettuihin rekombinanttiorganismeihin kuuluu E. coli DG116 Tk-lysogeeni transformoituna seuraavilla plasmideilla, jotka ovat rakenteita mainittujen lyhyt muo-to-peräisten CSF-l-muteiinimuotojen ilmaisemiseksi; 62 102190

Rakenne Koodattu proteiini-

pPLCSF-17 SCSF

pPLCSF-17gln52 3ln52SCSF

pPLCSF-17pro52 Pco52SCSF

^ pPLCSF-17/C7l58 SCSF/C7l58-pro pPLCSF-17gln52/CVl58 gln52SCSF/C7l58-pco pPLCSF-17pro52/CVl58 pr052SCSF/C7l58-pco

pPtiCSF-17aspS9 aspggSCSF

pPLCSF-17/C7l58TGA SCSF/C7158 O/E pPLCSF-17/C7lS8TGA SCSF/C71S8 pP^CSF-17pro52/C7l58TGA pro52SCSF/C7l58 10 pPLCSF-17asp59/C7lS8TGA asps9SCSF/C7l58 O/E pPLCSF-17asp59/C7l58TGA asps9SCSF/C7l58 pPLCSF-17/C7l50 SCSF/C7150 O/E pPlCSF-17/C7150 SCSF/C7150 pPLCSF-17asp59/C7l50 asp59SCSF/C7l50 O/E pPLCSF-17asp59/C7lSO asp59SCSF/C7l50 O/E pPt,CSF-17asp5g/ asp59SCSF/N72C7l50 15 N72C7150 O/E pPLCSF-17asp59/ asp59SCSF/N73C7l50

N73C71SO

Rakennetaan seuraavat analogiset pitkän muodon muunnoksia koodaavat rekombinanttiorganismit: 20 O/E pPLLCSF/C7l50 LCSF/C71/C7150 O/E pPLLCSFgln52/C7l50 glll52LCSF/C7l50 O/E pPLLCSFtyr59/C7l90 tyr59LCSF/C7l90 O/E pPLLCSF/C7l91 LCSF/C7191 O/E pPlLCSF/N72C7191 LCSF/N72C7190 O/E pPLLCSF/C7221 LCSF/C7221 25 O/E pPt,LCSF/N73C7221 LCSF/N73C7221 O/E pPLLCSF/C7223 LCSF/C7223 O/E pP^LCSF/C7235 LCSF/C7236 O/E pPt4LCSF/C72 3 8 LCSF/C7238 O/E pPLLCSF/C7249 LCSF/C7249 O/E pPLL.CSF/C7250 LCSF/C7250 O/E pPLLCSF/C7411 LCSF/C7411 phoA-LCSF/C7221 ' LCSF/C7221 30 pftoA-LCSF/NV3C7221 LCSF/N73C7221 O/E phoA-LCSF/C7221 LCSF/C7221 O/E phoA-LCSF/N73CV221 LCSF/N73C7221

K

Rakenteiden ilmaisemiseksi sopivasti transtormoituja E. coli-soluja ( λ-lysoqeeni, esim. DG116 PT-rakenteille, ” .Li 35 ei-lysogeeni, esim. iMM294 PhoArlle) kasvatetaan haluttuun solutiheyteen ja indusoidaan sitten koodatun proteiinin tuo- 63 1 02 1 90 tanto. Mikäli ilmaisu tapahtuu PL~promoottorin säätelyn alaisena, lämpötilan nostaminen 37°C:seen tai 42°C:seen indusoi ilmaisun. Noin 0,5 - 2 %:n kasaminohappoja lisääminen kasvualustaan auttaa niinikään ilmaisun lisäämisessä.

5 Edellä kuvatut rakenteet johtavat CSF-l:n muodostukseen ei-liukoisena solunsisäisenä proteiinina, joka voidaan ottaa talteen lyysin läpikäyneistä soluista, puhdistaa ja uudelleenlaskostaa. Samankaltaisia menettelyitä voidaan käyttää phoA-kontrolloiduilla geeneillä transformoidun 10 E. colin ääreisplasmatilaan erittyneen CSF-l:n puhdistami seksi ja uudelleenlaskostamiseksi.

Yleensä ottaen uudelleenlaskostaminen alkaa liukoisesta monomeeristä kaaotrooppisessa ympäristössä, jota ylläpidetään pelkistävissä olosuhteissa. Tällaiseen yllä-15 pitoon saattaa kuulua sopivan pelkistimen kuten ^o-merkapto-etanolin tai ditiotreitolin (DTT:n) käyttö, mutta CSF-1 saattaa olla valmiiksi pelkistynyt ja hapettavien aineiden poissulkeminen saattaa riittää. Liukoista proteiinia säilytetään tyypillisesti esimerkiksi 8 M ureassa tai 7 M guanidi-20 niumhydrokloridissa pH:ssa noin 7 - 8,5 noin 25-100 mM tio- liyhdistettä läsnäollessa. Tästä liukoisesta muodosta lähtien monomeeri saatetaan joko uudelleenlaskostaa suoraan tai puhdistaa lopuista proteiineista sopivalla puhdistusmenettelyl-lä kuten kromatografiaa adsorboivassa geelissä tai geeli-25 permeaatiokromatografiaa uudelleenlaskostamista edeltävästi.

Geelipermeaatiokromatografia on edullinen, koska se sallii halutun monomeeripituuden, joka yleensä tunnetaan edeltäkäsin, helpon erottamisen koon perusteella vaihtelevan mole-kyylipainon omaavista epäpuhtauksista. Puhdistuksen suoritus-30 ta pelkistävissä olosuhteissa edellytetään disulfidikytket- tyjen yhteenkerääntymien muodostuksen estämiseksi. Täten käytetystä kromatografiamenettelystä riippumatta sisällytetään edullisesti pelkistin kromatografiakolonnien tai erien panostamiseksi käytettyihin liuoksiin ja eluointiliuoksiin.

35 Joissain tapauksissa pelkistin voidaan korvata matalalla 64 102190 pH:llaf matalan pH:n estäessä disulfidisiltamuodostuksen joissain kromatografiajärjestelmissä jopa pelkistimen puuttuessa.

Sitten osittain puhdistettuun monomeeriin kohdistetaan 5 uudelleenlaskostamisolosuhteet dimeerin muodostamiseksi. Proteiinipitoisuus tämän vaiheen aikana on huomattavan tärkeä seikka. Yleensä saannot kasvavat, jos proteiinipitoisuus on alle 2 mg/ml CSF-l-proteiinia; edullinen on pitoisuus-alue 0,03 - 0,3 mg/ml. Uudelleenlaskostamisolosuhteisiin 10 saattaa kuulua kaaotrooppisen ympäristön asteittainen poistaminen sopivan aikajakson kuluessa, tavallisesti useamman tunnin. Yksi helppo menetelmä on näytteen laimentaminen kaotrooppisen aineen haluttuun pitoisuuteen, mutta tämä ei mahdollisesti ole tietyissä tapauksissa edullista, kos-15 ka myös proteiini laimenee. Edullisempia ovat menetelmät, jotka tuottavat vakiollisen proteiinipitoisuuden, kuten dialyysi tai ontto kuitu-diasuodatus. Menettelyn loppuvaiheessa kaaotrooppisen ympäristön tyhjentyessä saavutetaan ei-denaturoiva taso. Esimerkiksi jos kaaotrooppisena ai-20 neena käytetään guanidiinihydrokloridia saavutetaan alle noin 2 M:n, edullisesti 0,5 - 1 M:n, loppupitoisuus.

Uudelleenlaskostaminen kaaotrooppisen ympäristön poistuessa suoritetaan tavalla, joka sallii sulfhydryyli-ryhmien hapettumisen disulfideiksi saatavan biologisesti 25 aktiivisen dimeerisen konfiguraation vakiinnuttamiseksi, • jota CSF-l:n kyseessä ollen stabiloi disulfidien, joista yksi tai useampi saattaa liittää kyseiset kaksi ketjua toisiinsa, muodostuminen. Muodostuu myös ketjunsisäisiä disulfideja. Sopivia redox-olosuhteita, jotka edistävät 30 tätä dimeerimuodostusta, ovat SH/disulfidireagenssiyhdis- . telmät kuten hapettunut ja pelkistynyt glutationi. Pelkis- tyneen glutationin suhde hapettuneeseen tai muu sulfhydryy-li/disulfidiyhdistelmäsuhde on tyypillisesti noin 2 mM/-0,1 mM - 0,5 mM/1,0 mM. Vaihtoehtoiset menetelmät tämän 35 hapettumisen aikaansaamiseksi ovat myös hyväksyttäviä.

65 1 02 1 90

Pelkkä pelkistimen poistaminen ilman varmuustoimenpiteitä ja metalli-ionien poissulkemiseksi saattaa riittää joidenkin oikeanlaisten disulfidisidosten muodostumisen aikaansaamiseksi, mutta tämä on vähemmän edullista. Joka tapauk-5 sessa liuoksen pH tulisi uudelleenlaskostumisprosessin kestäessä pitää noin pHrssa 7,5 - 9,0. On selvää, että uu-delleenlaskostumisprosessissa ei enää käytetä pelkistäviä olosuhteita, joissa puhdistus alunperin suoritettiin.

Uudelleenlaskostumisprosessin kuluessa saattaa muo-10 dostua monomeerin ei-liukoisia yhteenkerääntymiä. Tämä mi nimoidaan kontrolloimalla lämpötilaa, jolloin alhaiset, noin 0-4°C:een lämötilat ovat edullisempia kuin 25-37°C:een korkeammat lämpötilat. Kun uudelleenlaskostuminen on päättynyt, dimeeri puhdistetaan muista proteiineista standardi-15 menettelyitä käyttäen.

Ilmaistaessa E. colissa N-päätydeletoituja muteiineja koodaavia rakenteita kuten edellä mainittiin metioniini-N-päädyssä prosessoituu tehokkaammin kuin vastaavien kypsien sekvenssien kyseessä ollen. Erityisesti pP CSF-17/C Vl50:n li 20 ilmaisu johtaa proteiiniin, jossa useimmat, elleivät kaik ki, sekvenssoitavissa olevat molekyylit sisältävät N-pääty-metioniinin; vastaava pPLCSF-17/N ^2C 7^50:n ilmaiseminen johtaa proteiiniin, jossa vain 78 %:ssa molekyyleistä N-päätymetioniini on säilynyt. pPLCSF-17/N\73 ^150:n ilmai-25 seminen antaa proteiinin, jossa vain noin 5 % tuotteesta • sisältää metioniinin N-päädyssä.

Kuvioissa 6-9 esitetään N-päätydeletioiden vaikutus saatavan proteiinin heterogeenisyyteen. Kuvioissa 6 ja 7 esitetään RP-HPLC-analyysit puhdistetulle E. colissa 30 pPLCSF-17/C\7l58:aa (tyr59) ja vastaavasti pP^CSF-17/C^7150:tä (asp^g) käyttäen ilmaistulle CSF-l:lle. Kuten esitetty kummassakin kuviossa, esiintyy kaksi pääasiallista piikkiä kohdassa noin 18 kd:tä kyseisissä pelkistävissä olosuhteissa, joissa nämä analyysit ajettiin. Johtopiik-35 ki, merkittynä 18 K-A kuviossa 6 (ja vastaava piikki ku viossa 7), käsittää noin 70 % kokonais-18 kd-proteiinista, 66 1 02 1 90 ja omaa oleellisesti saman aminohappokoostumuksen ja SDS-PAGE-alayksikkömolekyylipainon kuin jälkipiikki (merkittynä 18 K-B). Lisäksi 158-kodonirakenne johtaa huomattavaan epäpuhtauteen 15 kd:n proteiinin muodossa, 5 joka on ilmeisesti tuote sisäisen uudelleenaloituksen tuotetta. Tämä piikki vaikuttaa puuttuvan 150-kodoni-(asp^g) rakenteen tuotteesta, joka on esitetty kuviossa 7.

Tuloksia kuviossa 7 tulisi verrata kunnolla kuvioiden 8 ja 9 tuloksiin, jotka edustavat RP-HPLC-analyysiä 10 pPTCSF-17/NV2C Y"l50:n ja vastaavasti pPTCSF-17/N ^30 Vl50:n ilmaisusta. Kummassakin tapauksessa merkittävä RP-HPLC:ssä havaittu heterogeenisyys on hävinnyt ja saadaan yksittäinen, kuvion 7 johtavaa 70 %:n piikkiä vastaava piikki.

G. Hiiri-CSF-1 15 Valmistettiin intronivapaa hiiri-CSF-1:tä koodaava DNA-sekvenssi käyttäen suuria määriä CSF-l:tä tuottavaa hiirisidekudosmuodostussolulinjaa. L-929-solulinjaa, jota on saatavana ATCCcltä, käytettiin mRNA-lähteenä cDNA-kir-jaston tuottamiseksi. Saatiin talteen kaksi CSF-l:n 20 "pitkää muotoa" koodaavaa kloonia käyttäen ihmisen "lyhyt muoto"-cDNA:ta koettimena. Hiiri-CSF-1:n arvellaan olevan noin 80 %:sesti homologista ihmismateriaaliin nähden johtuen N-päätysekvenssin homologiasta, sekä ihmis- että hii-ri-CSF-l-valmisteiden kyvystä stimuloida makrofagipesäk-25 keitä luuydinsoluista, ja rajoitetusta ristireaktiivi- : suudesta radioreseptori- ja radioimmuunimäärityksien osal ta (Das, S.K. et. ai., Blood 58 (1981) 630).

Hiiri-CSF-l-proteiini on erityisen hyödyllinen malli-järjstelmissä CSF-l:n aktiivisuusprofiilin selvittämiseksi. 30 G.l. Hiiri-CSF-l-cDNA:n valmistus CSF-17-koettimen käyttö

Kokonais-lähetti-mRNA uutettiin ja puhdistettiin hiiri-L-929-soluista. Hiiri-L-929-soluja viljeltiin 8 päivän ajan DME-kasvualustassa ja kerättiin saalis sitten 35 sentrifugoimalla talteen. Kokonaissytoplasmalähetti-RNA

67 102190 eristettiin soluista saman menettelyjärjestelyn mukaan kuin esitetty edellä MIAPaCa-mRNA:lie.

Kokonais-mRNA-valmiste ajettiin sukroosigradienteil-la kuten kuvattu PCT-hakemusjulkaisussa W086/04607 (supra) 5 mRNArn valmistuksen MIAPaCa-soluista yhteydessä, paitsi, että käytettiin 5-25 %:n sukroosigradienttia siinä esitetyn 5-20 %:n gradientin tilalla.

Näytteitä gradientin kustakin fraktiosta ruiskutettiin Xenopus laevis-varhaismunasoluihin ja tuotteet mää-10 ritettiin radioimmuunimäärityksellä valmistettuja anti- CSF-l-vasta-aineita vastaan Dasin et. ai. (surpa) mukaan. Esiintyy kaksi mRNA-piikkiä fraktioista 17-20 ja 23-26, jotka osoittivat translatoitunutta CSF-l:een nähden immuu-nireaktiivista tuotetta.

15 Yhdistettiin fraktiot 19-20 ja 24-25 ja käytettiin niitä cDNA-kirjaston rakentamiseksi^gtlO:een kuten kuvanneet Huynh et. ai.(supra). Insertointia edeltävästi raaka-cDNA-valmiste ligatoitiin EcoRI-liittäjiin, pilkottiin EcoRIrllä, ja suoritettiin kaksisäie-cDNA:n elektroforee-20 si 5 %:sessa akryyliamidigeelissä. Eluoitiin vain yli 800 bp:tä sisältävä DNA ja ligatoitiin se sitten ^gtlO-var-siin ja pakattiin käyttäen pakettia Vector Cloning Systems (Strategene) Gisapak.

. 32

Seulottiin noin yksi miljoona fagiplakkia P-leima- 25 tulla yksisäie-CSF-17-DNA:11a, joka oli valmistettu kuten kuvattu edellä ihmis-CSF-1:n pitkän muodon eristyksen yhteydessä.

Puhdistettiin joukko fagiplakkeja, jotka hybridisoi-tuivat koettimeen, ja valittiin kaksi kloonia, joista toi-30 nen omasi 2 kb:n insertin ja toinen 4 kb:n insertin, jat kotutkimuksiin. Restriktiokartoitus osoitti näiden kloonien omaavan laajan yhteisen alueen, ja molemmat kloonit alakloonattiin M13mpl8:aan ja M13mpl9:ään dideoksisekvens-sointia silmälläpitäen; kloonien kummatkin säikeet sekvens-35 sointiin. Kummankin kloonin nukleotidisekvenssi ja päätelty 68 1 02 1 90 niiden koodaama aminohapposekvenssi on esitetty·kuvioissa 4 ja 5.

Kuten esitetty kuviossa 4 pitempi, 4 kb:n klooni alkaa nukleotidillä 24 verrattuna ihmis-CSF-17:ään, joka 5 on esitetty kuviossa 1, ja omaa 159 bp:n ei-translatoitu- van 5'-sekvenssin, jota seuraa 96 bp:tä johtosekvenssiä koodaavaa DNA:ta. Kypsän proteiinin koodisekvenssi alkaa tämän kloonin nukleotidillä 256 ja jatkuu edelleen 1560 nukleotidin verran, koodaten täten 520 aminohapon proteii-10 nia. Esiintyy huomattavaa sekvenssihomologiaa ihmisen "pitkän muodon" CSF-l:tä koodaavaan sekvenssiin nähden. Lopetuskodonin nukleotidin 1816 jälkeen nukleotidisekvens-si kuitenkin poikkeaa suuresti ihmisen 3'-ei-translatoitu-vasta sekvenssistä pcCSF-17:ssä ja "pitkä muoto"-kloo-15 neissa.

Lyhyempi 2 kb:n klooni omaa noin 500 bp:tä 3'-ei-trans-latoituvaa sekvenssiä, joka on huomattavasti homologisempi CSF-17:ssä tavattavaan 31-ei-translatoituvaan sekvenssiin nähden. DNA-sekvenssi lyhyemmälle, 2 kb:n kloonille on 20 esitetty kuviossa 5. Tämä on 90 bp:tä lyhyempi 5'-päädystä, mutta sisältää saman koodisekvenssin kuin 4 kb:n klooni lukuunottamatta kahta nukleotidivaihtoa, joista molemmat johtavat muutoksiin aminohapposekvenssissä. Oleelliset asemat ovat 1034 pitemmässä (944 lyhyemmässä) kloonissa, ja 25 1192 pitemmässä (1102 lyhyemmässä) kloonissa. G lyhyemmän " kloonin asemassa 944 johtaa Gly:hyn kypsän proteiinin asemas sa 259; vastaava A pitemmässä kloonissa johtaa Asp:hen tässä asemassa. Jälkimmäinen muutos, T:stä pitemmässä C:ksi lyhyemmässä kloonissa, johtaa seriinin asemassa 312 muut- 30 tumiseen proliiniksi lyhyemmässä kloonissa.

Täten kuten esitetty kuvioissa 4 ja 5 hiiri-CSF-pro-teiini on karkeasti ottaen homologinen ihmisproteiinin pitkään muotoon nähden, ja ilmeisesti sisältää 296 aminohapon segmentin, joka vastaa sitä "ylimäärä"-peptidisekvenssiä, 35 joka on "insertoitunut" CSF-17-DNA:n koodaamaan peptidiin.

69 1 02 1 90

Hiiri-CSF-1:tä koodaavat pitempi ja lyhyempi klooni, joita kuvataan edellä ja kuvioissa 5 ja 6, leikattiin irti 7(gtl0:stä EcoRI: llä pilkkomalla ja kloonattiin modifioituun Okayama/Berg-kloonausvektoriin pcDB, sijoittaen ne tä-5 ten SV40-varhaispromoottorin säätelyn alaisuuteen, pcDBmuCSF-L:n ja vastaavasti pcDBmuCSF-S:n saamiseksi.

Muteiinimuodot Täsmälleen samankaltaisella tavalla kuin edellä kuvattu ihmissekvenssien yhteydessä on nyttemmin saatavana 10 hiirisekvenssin mutatoituja muotoja eristetyn DNA:n ansiosta. Erityisesti voidaan saada tyr^g- ja gln^- ja tyrj-ggln,^” muotoja modifioimalla DNA inserttejä pcDBmuCSF-L:ssä ja pcDBmuCSF-S:ssä täsmälleen samankaltaisella tavalla edellä pcCSF-17:lle kuvattuun nähden. Modifioidut vektorit 15 koodaavat sitten proteiinin muteiinimuotoja, jotka on nimetty asp5g-muLCSF:ksi, gln^^uLCSF:ksi ja vastaavasti tyrgggln52-muLCSF:ksi.

G.2. Hiiri-CSF-l-DNA:n ilmaisu

Transfektoitiin ilmaisuvektorit pcDBmuCSF-L ja 20 pcDBmuCSF-S COS-A2-soluihin käyttäen DEAE-dekstraania klo-rokiinilisäyksen ohella kuten edellä kuvattu.

Supernatantit kerättiin 72 tunnin kuluttua ja testattiin CSF-l-aktiivisuuden suhteen käyttäen edellä kuvattua luuydinlisäännytysmääritystä. Kumpikin supernatantti sisäl-25 si CSF-l-aktiivisuutta tämän määrityksen mukaan kuten osoit tavat tulokset taulukossa 5.

Taulukko 5 pcDBmuCSF-L:n ja pcDBmuCSF-S:n ilmaisu COS-A2-soluissa näyte luuydinmääritys 30 (yksikköä/ml) (2 kb:n hiiriklooni) pcDBmuCSF-S 11.533 (4 kb:n hiiriklooni) pcDBmuCSF-L 5.033 70 102190

Samankaltaisella tavalla saadaan hiirisekvenssin muteiinimuodot.

H. CSF-l:n koostaminen

Rekombinanttituotettu ihmis-CSF-1:n lyhyt tai pitkä 5 muoto voidaan koostaa lääkkeenantoa varten farmaseuttisia standardimenettelyitä käyttäen. Tavallisesti CSF-1- valmistetaan ruiskeena annettavaan muotoon, ja sitä voidaan käyttää joko yksinomaisena aktiivisena ainesosana tai yhdistettynä muihin proteiineihin tai muihin, täydentävää tai saman-10 kaltaista aktiivisuutta omaaviin yhdisteisiin. Tällaisia muita yhdisteitä saattavat olla vaihtoehtoiset kasvainvas-taiset aineet kuten adriamysiini, tai lymfokiinit, kuten IL-1, -2, ja -3, alfa-, beta- ja ^interferonit ja kasvain-kuoliotekijä. CSF-1:n muodostaman aktiivisen ainesosan vai-15 kutusta voidaan lisätä tai parantaa tällaisten lisäkompo- nenttien läsnäololla. Kuten edellä kuvattu CSF-1 saattaa olla hyödyllisillä tavoilla vuorovaikutuksessa sopivien verisolujen kanssa, ja keksinnön mukaisiin kokoonpanoihin lukeutuvat tämän vuoksi tällaisten solujen ja CSF-1:n in-20 kubaatioseokset, valinnaisesti lisälymfokiinien läsnäolles sa. Voidaan käyttää joko tällaisten inkubointiseosten su-pernatanttifraktioita tai myös solut sisältävää seosta kokonaisuudessaan .

Talletukset 25 Hakijat ovat 2. huhtikuuta 1985 tallettaneet talle tuslaitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) fagi phCSF-l:n E. coli DG98:ssa, hakunumero 40177. Toukokuun 21. päivänä 1985 phCSF-la, nimellä CMCC 2312 Cetus-kokoelmassa, talletusta varten nimettynä 30 phCSF-la/ /^-Charon-4A:ksi, talletettiin ATCC:hen ja sen hakunumero on 40185. Kesäkuun 14. päivänä 1985 pcCSF-17 *· E. coli MM294:ssä, nimettynä CMCC 2347:ksi, talletettiin ATCC:hen ja sen hakunumero on 53149.

Lisäksi pcDBCSF4, tässä nimellä pcDBhuCSF-4 (CMCC 35 2894), talletettiin ATCC:hen 24. lokakuuta 1986 ja sen 71 102190 ATCC hakunumero on 67250. Huhtikuun 7. päivänä 1987 pPLCSF-17-asp5g/cV^150 DGll6:ssa (CMCC 2946) talletettiin ATCCshen ja sen hakunumero on 67,383. Hiirisekvenssiplasmi-dit pcDBmuCSF53 ja pcDBmuCSFlO, tässä nimellä pcDBmuCSF-S 5 ja vastaavasti pcDBmuCSF-L, talletettiin ATCC:hen samoin mainittuna päivämääränä ja niiden CMCC-numerot ovat 2892 ja 2893, ja ATCC-numerot 67,248 ja 67,249.

Lisätalletuksia tehtiin 14. huhtikuuta 1987 seuraavasti : 10 Kanta CMCC n:o ATCC n:o pPhoA-LCSF/cV1221 MM294:ssä 3084 67,391 O/E pPLLCSF/- NV3V221 DG116: ssa 3095 67,390 15 O/E pPLCSF-17asp59/- cVlSO DG116:ssa 3044 67,389 Nämä talletukset tehtiin Budapestin sopimuksen sopimusehtojen mukaisesti, "the International Recogniton of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent 20 Procedure and the Regulations thereunder" (Budapestin so pimus) . Tämä takaa elinkelpoisen viljelmän ylläpidon 30 vuoden ajan talletuspäivämäärästä lukien. Talletukset tarjotaan saatavaksi ATCC:n toimesta Budapestin sopimuksen ehdoilla, ja hakevan tahon ja ATCC:n väliselle yhteisymmär-25 rykselle alisteisesti, mikä takaa jatkuvan ja rajoittamattoman saatavana olon kyseessä olevan US-patentin julkaisuajankohtana. Hakija lupaa, että mikäli talletettu viljelmä kuolee tai katoaa tai tuhoutuu sitä sopivissa olosuhteissa viljeltäessä, se korvataan viivytyksettä il-^ moituksen vastaanottamiseen nähden elinkelpoisella näytteellä samaa viljelmää. Talletuksien saatavana oloa ei tule käsittää luvaksi harjoittaa keksintöä niiden oikeuksien vastaisesti, jotka on myönnetty jonkin hallituksen auktoriteetilla sen patenttilakien mukaisesti.

35 72 1 02 1 90 Nämä talletukset tehtiin oleellisen yleisön mukavuudeksi, eivätkä muodosta myönnytystä, että kirjallinen kuvaus ei olisi riittävä mahdollistamaan keksinnön harjoittamisen, tai aikomusta rajata keksintö näihin spesifisiin 5 rakenteisiin. Tätä edeltävästi on esitetty täydellinen kir jallinen kuvaus, joka sallii alan tavanomaisen taidon omaavan harjoittajan toistaa talletetut rakenteet ja rakentaa vaihtoehtoisia DNA:n muotoja, tai sitä sisältäviä organismeja, mikä mahdollistaa keksinnön harjoittamisen sellaisena, 10 kuin se patentoitavaksi vaaditaan.

Tässä esitettyjen havainnollistavien suoritusmuotojen ei tule käsittää rajaavan keksinnön kattavuutta, vaan se tulee määrittää oheisten patenttivaatimusten mukaisesti.

Claims (10)

73 102190

1. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se 5 koodaa ihmisen pesäkkeitä stimuloiva tekijä-l:n (CSF-1) NV3- tai NV2-muteiinia, jolla on ainakin NV3- tai NV2/CSFl:n lyhyt muoto (SCSF)/CV150:n tai NV3- tai NV2/CSF~l:n pitkä muoto (LCSF)/CV150:n aminohappo-sekvenssi tai jomman kumman modifikaation, jossa 1-2 10 aminohappoa on korvattu, aminohapposekvenssi, ja jonka mu-teiinin dimeerit stimuloivat alustavasti makrofaagien pesäkkeiden muodostusta in vitro CSF-l-määritysmenetelmässä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa CSF-l-polypeptidiä, 15 joka lisäksi sisältää kuviossa 2 aminohappoina 150 - 447 esitetyn aminohapposekvenssin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa CSF-l-polypeptidiä, joka on SCSF/CVl58-pro:n NV3-muteiini tai SCSF:n tai

20 SCSF/CVl58:n gln52- tai pro52-NV3-muteiini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa CSF-l-polypeptidiä, joka valitaan seuraavista: (a) LCSF:n, SCSF:n, LCSF/CV150:n, SCSF/CVl50:n 25 NV3-muteiinit tai NN2-muteiinit ja niiden glns2-muteiinit; (b) polypeptidien LCSF/CV150 - LCSF/CV411 kaikkien mahdollisten C-päätteen deleetioiden NV3-muteiinit tai Nfl2-muteiinit ja niiden tyrsg- ja gln52-muteiinit; (c) LCSF/CV190:n, LCSF/CV191:n, LCSF/CV221:n,

30 LCSF/CV223:n, LCSF/CV236:n, LCSF/CV238:n, LCSF/CV249:n, -“· · LCSF/CV258:n ja LCSF/CV411:n NV3-muteiinit tai NN2- muteiinit ja niiden tyrsg- ja gln52-muteiinit; ja (d) SCSF/CVl58:n NV3-muteiinit tai NN2-muteiinit.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, 35 tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, joka käsittää LCSF/NV3CV221:n. 74 102190

6. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen DNA-sekvenssin ja replikonin, joka toimii bakteereissa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vektori, tun nettu siitä, että se sisältää 0/EpPLLCSF/NV3CV221:n, joka on saatavissa ATCC 67390:stä.

8. Ilmentämisjärjestelmä, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukai- 10 sen DNA-sekvenssin tai patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen vektorin, toiminnallisesti liittyneenä sopiviin kont-rollisekvensseihin.

9. Rekombinanttibakteeri-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaa- 15 patenttivaatimuksen 8 mukaisella ilmentämisjärjestelmällä.

10. Menetelmä ihmisen rekombinantti-CSF-l-poly-peptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 9 mukaisia bakteerisoluja olosuhteissa, jotka mahdollistavat CSF-l:n tuoton. 75 102190