JPH02231082A - 新規ｃＤＮＡフラグメント - Google Patents
新規ｃＤＮＡフラグメントInfo
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- JPH02231082A JPH02231082A JP1049636A JP4963689A JPH02231082A JP H02231082 A JPH02231082 A JP H02231082A JP 1049636 A JP1049636 A JP 1049636A JP 4963689 A JP4963689 A JP 4963689A JP H02231082 A JPH02231082 A JP H02231082A
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は生理活性ペプチドの生産に有用な新規ＯＮ＾フ
ラグメントに関し、更に詳しくはヒト脳性ナトリウム利
尿活性のあるペプチド（ヒ｝ ＢＮＰ）をコードする塩
基配列を含有するＯＮ＾フラグメントに関する。
ラグメントに関し、更に詳しくはヒト脳性ナトリウム利
尿活性のあるペプチド（ヒ｝ ＢＮＰ）をコードする塩
基配列を含有するＯＮ＾フラグメントに関する。
１９８３〜１９８４年にラットおよびヒトの心房より分
泌される新しいナトリウム利尿ベブチドの構造決定が次
々に発表された〔例えば、：Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．．
１ １ ７．８ ５ ９ （１９８３） ；
Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ，
Ｃｏｍｍｕｎ，．１１８，１３１〜ｌ ３ ９ （１
９８４）］。これらのべブチドは心房性ナトリウム利尿
ペプチド（以下、八ＮＰという）と命名され、強力なナ
トリウム利尿作用、血管平滑筋弛緩作用を有し、新しい
タイプのペプチド系循環器用薬剤として注目されている
。
泌される新しいナトリウム利尿ベブチドの構造決定が次
々に発表された〔例えば、：Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．．
１ １ ７．８ ５ ９ （１９８３） ；
Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ，
Ｃｏｍｍｕｎ，．１１８，１３１〜ｌ ３ ９ （１
９８４）］。これらのべブチドは心房性ナトリウム利尿
ペプチド（以下、八ＮＰという）と命名され、強力なナ
トリウム利尿作用、血管平滑筋弛緩作用を有し、新しい
タイプのペプチド系循環器用薬剤として注目されている
。
一方、１９８８年にはブタの脳より新しい利尿ペプチド
が単離精製され、構造決定もされ、ブタ脳性ナトリウム
利尿ペプチド（以下、ブタＢＮＰという》と命名された
［Ｎａｔｕｒｅ−， ３ ３ ２ ． Ｎ（１６１５９
．７ ８ 〜８ １ （１９８Ｂ） ； ８ｉｏｃｈｅ
ｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ．Ｃｏｍｓｕｎ， ．
１ ５５． ７２６〜７３２（１９８８）） ．
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の薬理作用はＡ
ＮＰとほとんど同じであり、利尿作用、ナトリウム利尿
作用、血圧降下作用、ヒヨコ直腸弛緩作用等を有し、そ
の比活性も八ＮＰとほぼ同等である。ただし直腸弛緩活
性は８８Ｐの方が八ＮＰより３〜４倍高い。このような
性質よりＢＮＰも新しいベプチド系Ｉ！環器用薬剤とし
て期待されている。また、ブタＢＮＰについては、ＤＮ
Ａレベルの研究も行なわれ、ブタＢＮＦおよびその前駆
体をコードする塩基配列を有するｃＤＮ＾のクローニン
グが報告されてぃる１”Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，． １ ５ ７ ，４
１ ０ （１９８Ｂ）］。
が単離精製され、構造決定もされ、ブタ脳性ナトリウム
利尿ペプチド（以下、ブタＢＮＰという》と命名された
［Ｎａｔｕｒｅ−， ３ ３ ２ ． Ｎ（１６１５９
．７ ８ 〜８ １ （１９８Ｂ） ； ８ｉｏｃｈｅ
ｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ．Ｃｏｍｓｕｎ， ．
１ ５５． ７２６〜７３２（１９８８）） ．
脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の薬理作用はＡ
ＮＰとほとんど同じであり、利尿作用、ナトリウム利尿
作用、血圧降下作用、ヒヨコ直腸弛緩作用等を有し、そ
の比活性も八ＮＰとほぼ同等である。ただし直腸弛緩活
性は８８Ｐの方が八ＮＰより３〜４倍高い。このような
性質よりＢＮＰも新しいベプチド系Ｉ！環器用薬剤とし
て期待されている。また、ブタＢＮＰについては、ＤＮ
Ａレベルの研究も行なわれ、ブタＢＮＦおよびその前駆
体をコードする塩基配列を有するｃＤＮ＾のクローニン
グが報告されてぃる１”Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，． １ ５ ７ ，４
１ ０ （１９８Ｂ）］。
ところでＢＮＰはヒトの疾患治療薬として用いるもので
あるため、抗原性等の問題より．ヒト由来のＢＮＰの開
発が要望されていた。しかし、ヒト由来のＢＮＰについ
ては蛋白、ペプチドのレベルでも、ＤＮＡのレベルでも
その存在および構造が未だ証明されていない。
あるため、抗原性等の問題より．ヒト由来のＢＮＰの開
発が要望されていた。しかし、ヒト由来のＢＮＰについ
ては蛋白、ペプチドのレベルでも、ＤＮＡのレベルでも
その存在および構造が未だ証明されていない。
［：ｉ！ｔ１ｇを解決するだめの手段］かかる実情にお
いて、本発明者らはヒト由来のＢＮＰ （ヒ｝ＢＮＰ
）を取得すべく種々検討してきたところ、ブタＢＮＰ前
駆体をコードするｃＤＮ八フラグメントをプローブとし
て用い、ヒト組織のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、該ヒト組織中よりＢＮＰをコード
するｃＤＮ八をクローニングすることに成功し、本発明
を完成した。
いて、本発明者らはヒト由来のＢＮＰ （ヒ｝ＢＮＰ
）を取得すべく種々検討してきたところ、ブタＢＮＰ前
駆体をコードするｃＤＮ八フラグメントをプローブとし
て用い、ヒト組織のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、該ヒト組織中よりＢＮＰをコード
するｃＤＮ八をクローニングすることに成功し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明はヒト由来の脳性ナトリウム利尿ペプ
チドをコードする塩基配列を含んでなるＤＮＡフラグメ
ントを提供するものである。
チドをコードする塩基配列を含んでなるＤＮＡフラグメ
ントを提供するものである。
本発明のＯＮ＾フラグメントは例えば次のようにして調
製される。
製される。
まず、ヒトＢＮＰが含有されていると考えられるヒト組
織より全ＲＮ＾を分離し、これよりｍＲＮ八を精製し、
常法によりＣロＮＡライブラリーを構築する。
織より全ＲＮ＾を分離し、これよりｍＲＮ八を精製し、
常法によりＣロＮＡライブラリーを構築する。
次いでこのｃＤＮＡライブラリーよりブタロＮＰ前駆体
をコードするＤＮＡフラグメントをプローブとするハイ
ブリダイゼーションによってヒト［］ＮＰクローンをス
クリーニングすれば、本発明のＤＮＡフラグメントが得
られる。以下に本発明ＤＮＡフラグメントの製法につい
て説明する。
をコードするＤＮＡフラグメントをプローブとするハイ
ブリダイゼーションによってヒト［］ＮＰクローンをス
クリーニングすれば、本発明のＤＮＡフラグメントが得
られる。以下に本発明ＤＮＡフラグメントの製法につい
て説明する。
（１）ｃＤＮ＾ライブラリーの構築
ｍＲＮ＾を調製するためのヒト組織としては、ヒト脳、
ヒト心房等が用いられる。ＲＮ八の分離は、例えばヒト
心房断片をグアニジルチオシアネートとともにホモジナ
イズし、トリフルオロ酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心
により行うことができる。
ヒト心房等が用いられる。ＲＮ八の分離は、例えばヒト
心房断片をグアニジルチオシアネートとともにホモジナ
イズし、トリフルオロ酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心
により行うことができる。
ｍＲＮ＾の精製はオリゴ（ｄＴ）セルロース力ラムクロ
マトグラフィーにて常法により行われる。得られたｍＲ
Ｎ＾よりｃＤＮ＾を合成するには、例えばｃＤＮ八合成
キット（ファルマシア製）を用いる方法、岡山一ベルグ
（ Ｂｅｒｇ）の方法、グラブラーとホフマンの方法や
その変法、他の市販のキットなどを用いて常法により行
われる。得られたｃＤＮＡに制限酵素ＢｃｏＲＩアダプ
ターを付加後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等で５′
端をリン酸化してベクター（例えばλｇｔｌＯ）とライ
ゲーションし、さらにインビトロバッケージングをする
ことにより、ｃＤＮ＾ライブラリーを構築する。
マトグラフィーにて常法により行われる。得られたｍＲ
Ｎ＾よりｃＤＮ＾を合成するには、例えばｃＤＮ八合成
キット（ファルマシア製）を用いる方法、岡山一ベルグ
（ Ｂｅｒｇ）の方法、グラブラーとホフマンの方法や
その変法、他の市販のキットなどを用いて常法により行
われる。得られたｃＤＮＡに制限酵素ＢｃｏＲＩアダプ
ターを付加後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等で５′
端をリン酸化してベクター（例えばλｇｔｌＯ）とライ
ゲーションし、さらにインビトロバッケージングをする
ことにより、ｃＤＮ＾ライブラリーを構築する。
（２） ヒトＢＮＰクローンのスクリーニングヒトＢＮ
Ｐクローンのスクリーニングは、ブタＢＮＰのｃＯＮＡ
断片のラベル体をプローブとして用いて行なわれる。こ
のｃＤＮ＾断片はブタＢＮＰのｃＤＮ＾クローニング［
Ｂｉｏｃｈｅｍ，旧ｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ，，１ ５ ７． ４ １ ０ （１９８８）］
の過程で得られた不完全長のクローンであるｐＢＮＰ
− ８ ２ （３２０ｂｐ）を制限酵素Ｘｈｏ ＩとＲ
ｓａ Ｉで消化して得られる１２０ｂｐ断片（ブタＢＮ
Ｐの活性部位であるブタＢＮＰ − ２ ６《アミノ酸
２６残基からなる）とその上流３０ｂｐを含むＤＮＡ断
片》であり、プローブはこのｃＤＮ＾断片を″２Ｐでラ
ベルして調製される。該プローブと前述のｃＯＮ＾ライ
ブラリーをハイブリダイズせしめ、陽性クローンを選択
する。選択された陽性クローンλｈ８ＮＰ− ５ ７を
制限酵素で切断すれば本発明のＤＮＡフラグメントが得
られる。
Ｐクローンのスクリーニングは、ブタＢＮＰのｃＯＮＡ
断片のラベル体をプローブとして用いて行なわれる。こ
のｃＤＮ＾断片はブタＢＮＰのｃＤＮ＾クローニング［
Ｂｉｏｃｈｅｍ，旧ｏｐｈｙｓ， Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ，，１ ５ ７． ４ １ ０ （１９８８）］
の過程で得られた不完全長のクローンであるｐＢＮＰ
− ８ ２ （３２０ｂｐ）を制限酵素Ｘｈｏ ＩとＲ
ｓａ Ｉで消化して得られる１２０ｂｐ断片（ブタＢＮ
Ｐの活性部位であるブタＢＮＰ − ２ ６《アミノ酸
２６残基からなる）とその上流３０ｂｐを含むＤＮＡ断
片》であり、プローブはこのｃＤＮ＾断片を″２Ｐでラ
ベルして調製される。該プローブと前述のｃＯＮ＾ライ
ブラリーをハイブリダイズせしめ、陽性クローンを選択
する。選択された陽性クローンλｈ８ＮＰ− ５ ７を
制限酵素で切断すれば本発明のＤＮＡフラグメントが得
られる。
得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定は、常法
例えばＤＮＡフラグメントをシークエンシング用ベクタ
ーに組み込み、ρｈＢＮＰ − ５ ７を作成し、つい
でｃＤＮＡ領域の制限酵素地図を作成し、さらに適当な
長さに切断する制限酵素を用いて得られる［ＩＮ＾断片
をそれぞれシークエンシング用ベクターに組み込み直し
てサブクローニングし、サンガーらの方法によって全塩
基配列を決定することができる。
例えばＤＮＡフラグメントをシークエンシング用ベクタ
ーに組み込み、ρｈＢＮＰ − ５ ７を作成し、つい
でｃＤＮＡ領域の制限酵素地図を作成し、さらに適当な
長さに切断する制限酵素を用いて得られる［ＩＮ＾断片
をそれぞれシークエンシング用ベクターに組み込み直し
てサブクローニングし、サンガーらの方法によって全塩
基配列を決定することができる。
かくして決定された本発明ＤＮＡの塩基配列およびヒト
ＢＮＰのアミノ酸配列は第２図に示す通りである。第２
図の塩基配列のうち、１〜４０２はアミノ酸数１３４残
基よりなるヒトＢＮＰプレ前駆体ポリペプチドをコード
し、このうち７９〜４０２はアミノ酸数１０８残基より
なるヒ｝ ［ＩＮＦ前駆体ポリペプチドをコードすると
考えられる。このことは前駆体の前にあるシグナルペプ
チドの構造がブタとヒトとで非常によく似ており、また
＾ｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
（塩基番号７ ３−９ ０に対応）のアミノ酸配列がブ
タＢＮＰにも同様にありこの中のＳｅｔ−Ｈｉｓの結合
が切れてブタＢＮＰ前駆体が生成している［８ｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，，１
５ ７． ４ １ ０ （１９８８））ことから判断
した。またこのうち３０７〜４０２はアミノ酸数３２残
基よりなるヒトＢＮＰ − ３ ２をコードすると考え
られる。
ＢＮＰのアミノ酸配列は第２図に示す通りである。第２
図の塩基配列のうち、１〜４０２はアミノ酸数１３４残
基よりなるヒトＢＮＰプレ前駆体ポリペプチドをコード
し、このうち７９〜４０２はアミノ酸数１０８残基より
なるヒ｝ ［ＩＮＦ前駆体ポリペプチドをコードすると
考えられる。このことは前駆体の前にあるシグナルペプ
チドの構造がブタとヒトとで非常によく似ており、また
＾ｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
（塩基番号７ ３−９ ０に対応）のアミノ酸配列がブ
タＢＮＰにも同様にありこの中のＳｅｔ−Ｈｉｓの結合
が切れてブタＢＮＰ前駆体が生成している［８ｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，，１
５ ７． ４ １ ０ （１９８８））ことから判断
した。またこのうち３０７〜４０２はアミノ酸数３２残
基よりなるヒトＢＮＰ − ３ ２をコードすると考え
られる。
このことはまだヒトＢＮＰがペプチドとして単離されて
いないため断定はできないが前駆体からプロセッシング
を受けヒトロＮＰが生成すると考えられる。ブタの場合
ブタＢＮＰ−２６（アミノ酸２６残基よりなる） （
Ｎａｔｕｒｅ ，３ ３ ２． ７ ８〜８ １（１
９８８））ブタＢＮＰ−３２（アミノ酸３２残基よりな
る） （Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ， Ｃｏｍｍｕｎ．，１５５．７２６〜７ ３ ２
（ｔ９８Ｂ））が単離され、ＡＮＰにおいてもヒトでは
ヒトα＾ＮＰ （アミノ酸２８残基よりなる） （
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏａ＋
ｍｕｎ，，１ １ ８， １ ３ １〜１ ３ ９
（１９８４）］ラットではラットα＾ＮＰ （アミノ
酸２８残基よりなる）（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ．Ｂｉｏｐ−
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，， １ １ Ｔ ，８
５ ９ − ８ ６ ５ （１９８３））が単離され
ている。これらはすべてその前駆体に存在する后ｇおよ
びＰｒｏ−＾ｒｇ後で切断され生成されている。ヒ｝
［ＩＮＰの場合活性に必要と思われるＣｙｓ（１１２８
目）から１｛ｉｓ（１３４番目）の２３アミノ酸残基か
らなるベブチドの前に存在するＡｒｇが１０２番目の＾
ｒｇでありＰｒｏ＾『ｇの構造をもっていることからこ
の後でプロセッシングを受けアミノ酸数３２残基よりな
るヒトロＮＰ−３２が生成すると考えｔこ。
いないため断定はできないが前駆体からプロセッシング
を受けヒトロＮＰが生成すると考えられる。ブタの場合
ブタＢＮＰ−２６（アミノ酸２６残基よりなる） （
Ｎａｔｕｒｅ ，３ ３ ２． ７ ８〜８ １（１
９８８））ブタＢＮＰ−３２（アミノ酸３２残基よりな
る） （Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ， Ｃｏｍｍｕｎ．，１５５．７２６〜７ ３ ２
（ｔ９８Ｂ））が単離され、ＡＮＰにおいてもヒトでは
ヒトα＾ＮＰ （アミノ酸２８残基よりなる） （
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏａ＋
ｍｕｎ，，１ １ ８， １ ３ １〜１ ３ ９
（１９８４）］ラットではラットα＾ＮＰ （アミノ
酸２８残基よりなる）（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ．Ｂｉｏｐ−
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，， １ １ Ｔ ，８
５ ９ − ８ ６ ５ （１９８３））が単離され
ている。これらはすべてその前駆体に存在する后ｇおよ
びＰｒｏ−＾ｒｇ後で切断され生成されている。ヒ｝
［ＩＮＰの場合活性に必要と思われるＣｙｓ（１１２８
目）から１｛ｉｓ（１３４番目）の２３アミノ酸残基か
らなるベブチドの前に存在するＡｒｇが１０２番目の＾
ｒｇでありＰｒｏ＾『ｇの構造をもっていることからこ
の後でプロセッシングを受けアミノ酸数３２残基よりな
るヒトロＮＰ−３２が生成すると考えｔこ。
また八ＮＰの場合前駆体にも生理活性があることが判っ
ておりし｝ ＢＮＰの場合も同様と考えられ、医薬品と
して考えた場合前駆体、ヒ｝ＢＮＰ−３２どちらも有用
な物質である。
ておりし｝ ＢＮＰの場合も同様と考えられ、医薬品と
して考えた場合前駆体、ヒ｝ＢＮＰ−３２どちらも有用
な物質である。
なお、全長ＯＮ＾及びそれに対応するアミノ酸の配列は
図２に示した通りであるが、必ずしも全長ベプチドのみ
がヒ｝ ＢＮＰ活性を示すものではない。
図２に示した通りであるが、必ずしも全長ベプチドのみ
がヒ｝ ＢＮＰ活性を示すものではない。
すなわち、この全長ＯＮ＾で産生させる全長のべブチド
のみが有用であるとは限らず、例えばＣ端が短縮された
ものを得ることもある。あるいは部分的にアミノ酸をコ
ードするコドンに入れ換えてヒ｝ ＢＮＦ活性を示すペ
プチドを産生させることもできる。さらに、それらのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は一種類に限らない
ことは常識であり、一旦全長ＯＮ＾を特定すれば種々の
変種ＤＮＡを作りこれを用いてヒ｝ １３ＮＰ活性を有
するペプチドを産生させることができる。従って本発明
で意味するヒト由来の脳性ナトリウム利尿ベプチド（ヒ
トＢＮＰ）とは全長ヒ｝ ＢＮＦに限定されずＢＮＰ活
性を有しているペプチドのことであり、ヒト由来の脳性
ナトリウム利尿ペプチドをコードする塩基配列とはそれ
らをコードする塩基配列を意味する。
のみが有用であるとは限らず、例えばＣ端が短縮された
ものを得ることもある。あるいは部分的にアミノ酸をコ
ードするコドンに入れ換えてヒ｝ ＢＮＦ活性を示すペ
プチドを産生させることもできる。さらに、それらのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は一種類に限らない
ことは常識であり、一旦全長ＯＮ＾を特定すれば種々の
変種ＤＮＡを作りこれを用いてヒ｝ １３ＮＰ活性を有
するペプチドを産生させることができる。従って本発明
で意味するヒト由来の脳性ナトリウム利尿ベプチド（ヒ
トＢＮＰ）とは全長ヒ｝ ＢＮＦに限定されずＢＮＰ活
性を有しているペプチドのことであり、ヒト由来の脳性
ナトリウム利尿ペプチドをコードする塩基配列とはそれ
らをコードする塩基配列を意味する。
本発明ＤＮＡフラグメントを用い、常法により発現ベク
ターを導入し、発現させることによりヒトＢＮＰ ，ヒ
｝ ＢＮＰ前駆体、さらにはそれらと生物学的活性を同
じくする各種ペプチドを産生させることができる。得ら
れるヒ｝ ＩＩＮＰは優れた平滑筋弛緩作用、利尿及び
ナ｝ ＩＪウム利尿作用、血圧降下作用を有し、かつヒ
ト由来であるため安全性が高く、例えば心臓性浮腫、腎
臓性浮腫、肝性浮腫、肺浮腫、高血圧症、うつ血性心不
全、急性及び慢性腎不全等の治療薬として有用である。
ターを導入し、発現させることによりヒトＢＮＰ ，ヒ
｝ ＢＮＰ前駆体、さらにはそれらと生物学的活性を同
じくする各種ペプチドを産生させることができる。得ら
れるヒ｝ ＩＩＮＰは優れた平滑筋弛緩作用、利尿及び
ナ｝ ＩＪウム利尿作用、血圧降下作用を有し、かつヒ
ト由来であるため安全性が高く、例えば心臓性浮腫、腎
臓性浮腫、肝性浮腫、肺浮腫、高血圧症、うつ血性心不
全、急性及び慢性腎不全等の治療薬として有用である。
また投与方法は、ベプチド系医薬の投与に使用されてい
る方法すなわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射により
、あるいは舌下投与、鼻内投与、直腸投与により投与す
ることが可能である。
る方法すなわち静脈注射、筋肉内注射、皮下注射により
、あるいは舌下投与、鼻内投与、直腸投与により投与す
ることが可能である。
またこのペプチドは危険な又は有害な副作用を生じさせ
ることなく投与できる量は、０．５μｓ／ｋｇ〜１００
ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましい。
ることなく投与できる量は、０．５μｓ／ｋｇ〜１００
ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましい。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例！
（１） ｃＤＮ＾ライブラリーの構築ヒト心房断片３
ｇを液体窒素で破砕した後、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法
（Ｃｈｉ″ｒ−ｇｗｉｎ ， Ｊ． Ｍ．ら： １３ｉ
ｏｃｈ−ｅｍｉｓｔｒｙ ， １ ８ ． ５２９４
〜５２９９（１９７９）］に従い、グアニジウムチオシ
Ｔネート水溶液を添加しホモジナイズした。ついでトリ
フル才口酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心によって全１
１Ｎ八を分離した。次いで常法によりこれをオリゴ（
ｄＴ）セルロース力ラムクロマトグラフィーで精製し、
３７μｇのポリ （Ａ）”ＲＮ＾（ｍＲＮ＾）を単離し
た。
ｇを液体窒素で破砕した後、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法
（Ｃｈｉ″ｒ−ｇｗｉｎ ， Ｊ． Ｍ．ら： １３ｉ
ｏｃｈ−ｅｍｉｓｔｒｙ ， １ ８ ． ５２９４
〜５２９９（１９７９）］に従い、グアニジウムチオシ
Ｔネート水溶液を添加しホモジナイズした。ついでトリ
フル才口酢酸セシウム平衡密度勾配超遠心によって全１
１Ｎ八を分離した。次いで常法によりこれをオリゴ（
ｄＴ）セルロース力ラムクロマトグラフィーで精製し、
３７μｇのポリ （Ａ）”ＲＮ＾（ｍＲＮ＾）を単離し
た。
続いてｃＤＮ八合成キット（ファルマシア製）を用いて
３，ｕｇのｍＲＮＡからｃＤＮ八を合成し、ＢｃｏＲ
Ｉアダプターを付加後Ｔ４ポリヌクレ才チドキナーゼで
５′端をリン酸化してベクターλｇｔｌＯとライゲーシ
ョンした。ベクターとしては［！ｃｏＲ Ｉによる切断
と脱リン酸化したλｇｔｌｏアームズを用いた。
３，ｕｇのｍＲＮＡからｃＤＮ八を合成し、ＢｃｏＲ
Ｉアダプターを付加後Ｔ４ポリヌクレ才チドキナーゼで
５′端をリン酸化してベクターλｇｔｌＯとライゲーシ
ョンした。ベクターとしては［！ｃｏＲ Ｉによる切断
と脱リン酸化したλｇｔｌｏアームズを用いた。
このλ８ｔ１０アームズ２μｇに対しライゲーションに
用いたｃＩｌｌＮ＾はｃＤＮ八合成に用いたＲＮ八に換
算して０．１μｇ相当である。ライゲーション後パッケ
ージングキット（ギガパックゴールド：ストラタジー刈
１を使ってパッケージングしてｃＯＮＡライブラリーの
構築を終了した。
用いたｃＩｌｌＮ＾はｃＤＮ八合成に用いたＲＮ八に換
算して０．１μｇ相当である。ライゲーション後パッケ
ージングキット（ギガパックゴールド：ストラタジー刈
１を使ってパッケージングしてｃＯＮＡライブラリーの
構築を終了した。
ｃＯＮ＾ライブラリーの構築成績を調べるため少量を大
腸菌ｃ６００およびｃ ６ ０ ０ ｈｆｌに接種した
ところ、ｃ６００で出現したプラークのうち９０％が透
明で１０％が濁っていた。このことにより組み換えファ
ージはライブラリー中の９０％を占めていることがわか
った。また、ｃＤＮＡライブラリー全体では約７Ｘ１０
’のブラークを生じることがわかった。
腸菌ｃ６００およびｃ ６ ０ ０ ｈｆｌに接種した
ところ、ｃ６００で出現したプラークのうち９０％が透
明で１０％が濁っていた。このことにより組み換えファ
ージはライブラリー中の９０％を占めていることがわか
った。また、ｃＤＮＡライブラリー全体では約７Ｘ１０
’のブラークを生じることがわかった。
（２） ヒトＢＮＦクローンのスクリーニングスクリー
ニングはＣＤＮ＾ライブラリーの一部を大腸菌ｃ６００
ｈｆｌに接種し、出現した５ＸＩＯ’プラークについて
行った。一方、スクリーニングのためのプローブはブタ
ＢＮＰのｃＤＮ＾断片を３２ｐでラベルしたものを用い
た。このｃＤＮ八断片はブタＢＮＰのｃＤＮＡクローニ
ングＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｔｅ．， １ ５ ７ ， ４ １ ０
（１９８Ｂ））の過程で得られた不完全長クローンで
あるｐ［］ＮＰ− ８ ２ （３２０ｂｐ）から制限酵
素Ｘｈｏ ＩとＲｓａ Ｉで切り出される１２０ｂｐ断
片（ブタＢＮＰの活性部位であるブタＢＮＰ−２６（ア
ミノ酸２６残基からなる）とその上流３０ｂｐを含むＯ
Ｎ＾断片）をアクリルアミドゲル電気泳勤で精製して調
整した。まずプラークをナイロンフィルターにトランス
ファーし、アルカリ処理後中和して紫外線照射でＤＮＡ
を固定した。
ニングはＣＤＮ＾ライブラリーの一部を大腸菌ｃ６００
ｈｆｌに接種し、出現した５ＸＩＯ’プラークについて
行った。一方、スクリーニングのためのプローブはブタ
ＢＮＰのｃＤＮ＾断片を３２ｐでラベルしたものを用い
た。このｃＤＮ八断片はブタＢＮＰのｃＤＮＡクローニ
ングＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｔｅ．， １ ５ ７ ， ４ １ ０
（１９８Ｂ））の過程で得られた不完全長クローンで
あるｐ［］ＮＰ− ８ ２ （３２０ｂｐ）から制限酵
素Ｘｈｏ ＩとＲｓａ Ｉで切り出される１２０ｂｐ断
片（ブタＢＮＰの活性部位であるブタＢＮＰ−２６（ア
ミノ酸２６残基からなる）とその上流３０ｂｐを含むＯ
Ｎ＾断片）をアクリルアミドゲル電気泳勤で精製して調
整した。まずプラークをナイロンフィルターにトランス
ファーし、アルカリ処理後中和して紫外線照射でＤＮＡ
を固定した。
５×デーンハーツ（ロｅｎｈａｒｄｔｓ ）溶液、１０
０／ｊｇ／一の変性サケ精子ＯＮ＾及び０．１％ＳＯＳ
を含む４ｘ ｓｓｃ溶液０．６Ｍ ＮａＣｊ！と０．０
６Ｍクエン酸３ナトリムにフィルターを浸して６０℃で
３時間プレハイブリダイゼーションした。引き続きＲａ
ｎｄｏｍ ｐｒｉｍ−ｅｄ ＯＮ＾ラベリンクキット
（ベーリンガーマンハイム社製》によってｓａｐでラベ
ルしたブローブを２Ｘ １ ０ ’ｃｐｆｆｌ／一にな
るようにハイブリダイゼーション液（プレハイブリダイ
ゼーション液と同一組成）に加え、その中でフィルター
を６０℃で一昼夜インキユベートした。
０／ｊｇ／一の変性サケ精子ＯＮ＾及び０．１％ＳＯＳ
を含む４ｘ ｓｓｃ溶液０．６Ｍ ＮａＣｊ！と０．０
６Ｍクエン酸３ナトリムにフィルターを浸して６０℃で
３時間プレハイブリダイゼーションした。引き続きＲａ
ｎｄｏｍ ｐｒｉｍ−ｅｄ ＯＮ＾ラベリンクキット
（ベーリンガーマンハイム社製》によってｓａｐでラベ
ルしたブローブを２Ｘ １ ０ ’ｃｐｆｆｌ／一にな
るようにハイブリダイゼーション液（プレハイブリダイ
ゼーション液と同一組成）に加え、その中でフィルター
を６０℃で一昼夜インキユベートした。
次にフィルターを０．１％ＳＯＳを含む２ＸＳＣ（：溶
液で洗浄し、風乾後、オートラジオグラフィーに供した
。
液で洗浄し、風乾後、オートラジオグラフィーに供した
。
これにより５５個のハイブリダイゼーションポジティブ
プラークを得た。この５５個のポジティブプラークがヒ
ト八ＮＰをコードするＤＮＡ（６８０ｂｐ）をブローブ
としてハイブリダイズするが否が試みたところ、すべて
陰性であった。この結果、このｃＤＮ＾は公知のヒト八
ＮＰをコードするｃＤＮＡとは異なることが明らかであ
る。上記５５個のボジディブプラークをモノクローン化
し、ついで常法によりλファージＤＮＡを調製した。こ
れを制限酵累ＢｃｏＲ Ｉで切断して得られるＤＮＡ断
片を調べたところ、λｈＢＮＰ− ５ ７と命名したク
ローンに最長約’ｒｏｏｂｐのｃＤＮ＾が挿入されてい
た。このインサートｃロＮ八をシークエンス用ベクター
であるブルースクリプト （ロｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ
（ＫＳ（＋）） ． ストラタジーン製》に組み込み
ｐｈＢＮＰ − ５ ７を作成した。このプラスミドを
含有する大腸菌はＢ， ｃｏｌｉ ｌＩ［］１０１ ／
ｐｈＢＮＰ − ５ ７と命名し、微工研に微工研条寄
第２２９９号（ＦＢＲＭＢＰ− ２ ２ ９ ９ ）と
して寄託した。
プラークを得た。この５５個のポジティブプラークがヒ
ト八ＮＰをコードするＤＮＡ（６８０ｂｐ）をブローブ
としてハイブリダイズするが否が試みたところ、すべて
陰性であった。この結果、このｃＤＮ＾は公知のヒト八
ＮＰをコードするｃＤＮＡとは異なることが明らかであ
る。上記５５個のボジディブプラークをモノクローン化
し、ついで常法によりλファージＤＮＡを調製した。こ
れを制限酵累ＢｃｏＲ Ｉで切断して得られるＤＮＡ断
片を調べたところ、λｈＢＮＰ− ５ ７と命名したク
ローンに最長約’ｒｏｏｂｐのｃＤＮ＾が挿入されてい
た。このインサートｃロＮ八をシークエンス用ベクター
であるブルースクリプト （ロｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ
（ＫＳ（＋）） ． ストラタジーン製》に組み込み
ｐｈＢＮＰ − ５ ７を作成した。このプラスミドを
含有する大腸菌はＢ， ｃｏｌｉ ｌＩ［］１０１ ／
ｐｈＢＮＰ − ５ ７と命名し、微工研に微工研条寄
第２２９９号（ＦＢＲＭＢＰ− ２ ２ ９ ９ ）と
して寄託した。
ついでこのｃＤＮＡ領域の制限酵素地図を作成した。
更に適当な長さに切断される制限酵素を用いてｃＤＮ＾
断片を得、それぞれをブルースクリプトに組み直してサ
ブクローニングした。
断片を得、それぞれをブルースクリプトに組み直してサ
ブクローニングした。
挿入ｃＤＮ＾領域の制限酵素切断部位と塩基配列決定の
ストラテジーを第１図に示す。塩基配列はサンガーらの
方法（ Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ，
ＵＳＡ，７４．５４６３〜５４６７ （１９７７） ）
を用いて決定した。
ストラテジーを第１図に示す。塩基配列はサンガーらの
方法（ Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ，
ＵＳＡ，７４．５４６３〜５４６７ （１９７７） ）
を用いて決定した。
第２図にこのｃＤＮＡの塩基配列及びその塩基配列に対
応するアミノ酸配列を示す。
応するアミノ酸配列を示す。
該挿入ＯＮ＾の配列は翻訳開始コドン＾ＴＧからはじま
り翻訳終止コドンＴ八八で終る長い翻訳可能領域を有す
る。全長６ ９ ２ ｂｐであるこのｃＤＮ＾は塩基対
番号−９９〜−１までは５′側非翻訳領域であり、１〜
７８まではシグナルペプチドをコードし、７９〜４０２
はヒトＢＮＰ前駆体をコードしていると考えられる。そ
のうち３０７〜４０２はヒトＢＮＰ−３２（アミノ酸３
２残基よりなる）をコードしていると考えられる。また
４０３〜５９３は３′側非翻訳領域である。
り翻訳終止コドンＴ八八で終る長い翻訳可能領域を有す
る。全長６ ９ ２ ｂｐであるこのｃＤＮ＾は塩基対
番号−９９〜−１までは５′側非翻訳領域であり、１〜
７８まではシグナルペプチドをコードし、７９〜４０２
はヒトＢＮＰ前駆体をコードしていると考えられる。そ
のうち３０７〜４０２はヒトＢＮＰ−３２（アミノ酸３
２残基よりなる）をコードしていると考えられる。また
４０３〜５９３は３′側非翻訳領域である。
この中で、ヒトＢＮＰ − ３ ２をコードしている３
０７〜４０２の塩基配列に対応するアミノ酸配列はその
うちのアミノ酸１７残基がシスティンのジスルフィド結
合でつくる環状構造をもちブタＢＮＰと非常によく似た
構造をしている。
０７〜４０２の塩基配列に対応するアミノ酸配列はその
うちのアミノ酸１７残基がシスティンのジスルフィド結
合でつくる環状構造をもちブタＢＮＰと非常によく似た
構造をしている。
実施例２
ポリペプチドの製造
λｈＢＮＰ− ５ ７から制限酵素ＢｃｏＲ Ｉで切り
出されたｃＤＮ＾を、プラスミドブルースクリプトに挿
入することによって構築された組み換えブラスミドであ
るクローンｐｈＢＮＰ − ５ ７を利用して、γ一ロ
ＮＰを生産するベクターを得ることができる。
出されたｃＤＮ＾を、プラスミドブルースクリプトに挿
入することによって構築された組み換えブラスミドであ
るクローンｐｈＢＮＰ − ５ ７を利用して、γ一ロ
ＮＰを生産するベクターを得ることができる。
すなわち、ｐｈＢＮＰ − ５ ７の挿入ｃＤＮ八のｒ
−ＢＮＰコード領域の直前に、位置指向性突然変異に
よって新たな制限酵素認識部位と翻訳開始コドン（＾Ｔ
Ｇ ）を導入し、この新しい認識部位を利用してフラグ
メントを分離する。次に、発現ベクター用プラスミドの
プロモーターのすぐ下流に上記フラグメントを挿入し、
このブラスミドを大腸菌に導入する。ポリペプチドを合
成するに足る十分な栄養物を与えて大腸菌を培養し、次
いでｒ −ＢＮＰを回収する。また、ｆｌｈＢＮＰ −
５ ７の挿入ｃＤＮＡ上で、位置指向性突然変異の位
置および塩基配列を変えることによってＢＮＰ−３２、
あるいはロＮＰを大腸菌で生産するためのフラグメント
が得られ、これらの７ラグメントが挿入された発現ベク
ターを大腸菌に導入し、これを培養することによりＢＮ
Ｐ −３２あるいはＢＮＰを回収することができる。
−ＢＮＰコード領域の直前に、位置指向性突然変異に
よって新たな制限酵素認識部位と翻訳開始コドン（＾Ｔ
Ｇ ）を導入し、この新しい認識部位を利用してフラグ
メントを分離する。次に、発現ベクター用プラスミドの
プロモーターのすぐ下流に上記フラグメントを挿入し、
このブラスミドを大腸菌に導入する。ポリペプチドを合
成するに足る十分な栄養物を与えて大腸菌を培養し、次
いでｒ −ＢＮＰを回収する。また、ｆｌｈＢＮＰ −
５ ７の挿入ｃＤＮＡ上で、位置指向性突然変異の位
置および塩基配列を変えることによってＢＮＰ−３２、
あるいはロＮＰを大腸菌で生産するためのフラグメント
が得られ、これらの７ラグメントが挿入された発現ベク
ターを大腸菌に導入し、これを培養することによりＢＮ
Ｐ −３２あるいはＢＮＰを回収することができる。
第１図はポジティブクローンλｈＢＮＰ− ５ ７に挿
入されたｃＯＮ＾断片の塩基配列決定のストラテジーお
よび該ｃＤＮ八の制限酵素地図を示す。 第２図は第１図のストラテジーに従って決定されたｃＤ
Ｎ＾の塩基配列およびこの塩基配列に対応するアミノ酸
配列を示す。 以 上
入されたｃＯＮ＾断片の塩基配列決定のストラテジーお
よび該ｃＤＮ八の制限酵素地図を示す。 第２図は第１図のストラテジーに従って決定されたｃＤ
Ｎ＾の塩基配列およびこの塩基配列に対応するアミノ酸
配列を示す。 以 上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒト由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドをコードす
る塩基配列を含んでなるＤＮＡフラグメント。 ２、ヒト由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドが次のアミ
ノ酸配列よりなるものである請求項１記載のＤＮＡフラ
グメント。 【遺伝子配列があります。】 ３、ヒト由来の脳性ナトリウム利尿ペプチドが次のアミ
ノ酸配列よりなるものである請求項１記載のＤＮＡフラ
グメント。 【遺伝子配列があります。】 ４、次の塩基配列を有するものである請求項１または２
記載のＤＮＡフラグメント。 【遺伝子配列があります。】 ５、次の塩基配列を有するものである請求項１または３
記載のＤＮＡフラグメント。 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04963689A JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
| DK90104021T DK0385476T4 (da) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Fysiologisk aktivt polypeptid og DNA |
| AT90104021T ATE124994T1 (de) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologisch aktives polypeptid und dna. |
| ES90104021T ES2076981T5 (es) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Polipeptido fisiologicamente activo y su adn. |
| DE69020755T DE69020755T3 (de) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologisch aktives Polypeptid und DNA. |
| EP90104021A EP0385476B2 (en) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| US08/192,800 US7211380B1 (en) | 1989-03-01 | 1994-02-07 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| US09/902,161 US20020086843A1 (en) | 1989-03-01 | 2001-07-11 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| US10/335,847 US20030162710A1 (en) | 1989-03-01 | 2003-01-03 | Physiologically active polypeptide and DNA |
| CL200401266A CL2004001266A1 (es) | 1989-03-01 | 2004-05-25 | Procedimiento para la preparacion de un fragmento de adn que codifica un polipeptido de cerebro humano y posee actividad natriuretica; procedimiento de preparacion del polipeptido; fragmento de adn; polipeptido. |
| US11/737,521 US20090105464A1 (en) | 1989-03-01 | 2007-04-19 | Physiologically active polypeptide and dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04963689A JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000369462A Division JP3346764B2 (ja) | 2000-12-05 | 2000-12-05 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231082A true JPH02231082A (ja) | 1990-09-13 |
| JP3160276B2 JP3160276B2 (ja) | 2001-04-25 |
Family
ID=12836702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04963689A Expired - Lifetime JP3160276B2 (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | 新規ｃＤＮＡフラグメント |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3160276B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03505280A (ja) * | 1988-05-31 | 1991-11-21 | サイオス ノバ インコーポレイテッド | 新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術 |
-
1989
- 1989-03-01 JP JP04963689A patent/JP3160276B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03505280A (ja) * | 1988-05-31 | 1991-11-21 | サイオス ノバ インコーポレイテッド | 新規ナトリウム排出亢進性および血管拡張性ペプチドを生産するための組換え技術 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3160276B2 (ja) | 2001-04-25 |
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