DK176075B1 - Gærcelle opfattende en DNA-konstruktion, der tilvejbringer ekspression og secernering af et ikke-gærprotein, samt dobbeltstrenget DNA-molekyle - Google Patents

Description

DK 176075 B1 _ <_ >

Pi o III 5p ef s i| M il! f( I I5 £g| |.V f fetl ijl “s -*ffr II i t|

Ils Ilf v I

Hl III ? iff •‘jig 1^—^ 'X—.

|iis ill m 'j _ . „

III li! ii I

CD -Ξ5 _ 111 III II 1 • Ill II MI ! s ' _ in ni \ o =g§ s \ g: tBS ”11 s j

Jsl o ggg iyV a J

III ||| »/ έΐ ilul ill . JJS · 4 J V?| 5 «JIKi —t »- 2 * k >>otr 35·- w «»* — O «-» — < t~

(3 OU 13 C U

DK 176075 B1 FREMGANGSMÅDE til fremstilling af et rekombinant protein , Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af rekombinerede proteiner i gær. Opfindelsen angår nærmere bestemt en fremgansmåde til fremstilling af 5 et rekombinant protein omfattende et forbedret α-faktor ekspressionssystem, som tilvejebringer secernering af heterologe proteiner fra gærværtsceller.

Kurjan et al. (1982) Cell, 30:933-943 omtaler den første kloning og sekvente-ring af et gen, der koder for et gær α-faktor forstadiegen. Kurjan et al. omta-10 ler også i U.S. patentskrift nr. 4.546.082 kloningen af dette gen og foreslår, at α-faktor ledersekvensen kan an vendes til at styre secerneringen af heterologe proteiner i gær. Patentskriftet indeholder imidlertid ikke data, som indicerer, at patenthaveren nogensinde med held har anvendt α-faktor lederen til at udtrykke og secernere et heterologt protein i gær.

15 I EPO publikation nr. 1.16.201 omtales den første vellykkede anvendelse af α-faktor lederen til at styre ekspressionen og secerneringen af et heterologt protein, epidermal vækstfaktor, fra en transformeret gær. Efter dette arbejde har der været yderligere rapporter om ekspression af heterologe proteiner i 20 gær under anvendelse af α-faktor lederen. Se f.eks. Elliott et al. (1983) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 80:7080-7084; Bitter et al. (1984) Proc. Nat]. Acad..

Sci.. USA, 81:5330 Smith et al. (1985) Science, 229:1219-1229; EPO publikationer nr. 114.695, 123.228, 123.294, 123.544, 128.773 og 206.783. Se også Brake et al. i Protein Transport and Secretion, s. 103 (J.M. Gething, * 25 udg. 1984).

Med de ovenfor omtalte ekspressionssystemer frembringes en α-faktor leder i fuld længde fusioneret til et heterologt protein. Om end der med det ovennævnte arbejde påvises, at ekspressionssystemet har en bred anvendelig-30 hed, er det forud for udførelse af forsøget almindeligvis ikke muligt at forudsi- 2 DK 176075 B1 ge, om et bestemt heterologt protein med held vil blive secerneret, modnet og være biologisk aktivt. Se f.eks. EPO 206.783, ovenfor, s. 2-5, Rothblatt et al. (1987) EMBO 3., 6:3455-3463, V.L. MacKay, "Secretion of Heterologous Proteins in Yeast (under trykning).

5 På basis af ikke-publicerede resultater er det adskillige gange blevet omtalt, at deletioner fra “pro”-området i α-faktor lederen (mellem signalpeptidet og den første “spacer”) medfører et væsentligt fald i mængden af ikke-gærprotein, som secerneres fra gær, der er transformeret med de heterologe 10 konstruktioner. Sidu et al. (1987) omtaler i Gene 54:175-184, at sur phosphatase (PH05) fra gær secerneres i mediet fra en heterolog konstruktion, hvortil der både er anvendt en α-faktor leder i fuld længde og en trunkeret a-faktor leder, men at ekspressionsniveauerne er 3-4 x mindre end for PH05-genet under styring af dens homologe leder. Det er også blevet anført, at deletioner 15 i præpro-a-faktor forstadiegenet resulterer i et væsentligt fald i secernering af det native α-faktor peptid. Se f.eks. V.L. MacKay, ovenfor, Rothblatt et al., ovenfor.

Der er derfor et behov for at forbedre α-faktor ekspressionssystemet, navnlig 20 til brug for ikke-gærproteiner, som ikke produceres effektivt med de nuværende α-faktor ekspressionskonstruktioner.

Det har overraskende vist sig, at en trunkeret form af Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor leder sekvensen effektivt kan styre ekspressionen 25 og secerneringen af heterologe polypeptider i gær. Det er navnlig overra- «.

skende, at de trunkerede Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor ledersekvenser kan give en væsentlig forbedring af effektiviteten af ekspressionen af sådanne heterologe proteiner i forhold til ekspressionssystemer, som udnytter Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor lederen i fuld længde; 30 det vil sige højere niveauer af korrekt N-terminal processering, secernering af DK 176075 B1 3 heterologe proteiner, hvoriblandt en større procentdel af molekylerne er biologisk aktive osv. Disse resultater er navnlig overraskende på baggrund af rapporter om, at deletioner fra ledersekvensen i α-faktor forstadiet resulterer i faldende secemeringsniveauer af aktiv a-faktor.

5

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes derfor alternative Saccharo-myces eller Kluyveromyces cc-faktorbaserede ekspressionskonstruktioner, som navnlig er anven delige til ekspression af heterologe polypeptider, som enten ud trykkes ineffektivt af Saccharomyces eller Kluyveromyces a-faktor 10 lederkonstruktioner i fuld længde eller som ikke udtrykkes overhovedet af sådanne konstruktioner i fuld længde.

I én udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant protein, hvilken metode omfatter: 15 (1) frembringelse af en gær celle omfattende en DNA konstruktion, der tilve jebringer ekspression og secernering af et ikke-gærprotein, hvor DNA-konstruktionen omfatter (i) en gærgenkendende transkriptions initieringssekvens, som i 5' enden er linket til (ii) en kodende sekvens under styring både af den gærgenkendende transkriptions initieringssekvens, og af (iii) en gær-20 genkendende transkriptionsterminerings sekvens, hvilken terminerings sekvens er linket i 3’ enden til den kodende sekvens, - hvor den kodende sekvens koder for et forstadie polypeptid, der omfatter en ledersekvens og et ikke-gær protein koblet sammen ved et processerings-sted, hvilket processeringssted sikrer at ikke-gær proteinet kan spaltes fra 25 forstadie polypeptidet, ledersekvensen udgør de første ca. 25 til 50 N-terminale aminosyrerester af et Saccharomyces eller Kluyveromyces a-faktor leder polypeptid, og omfatter et enkelt Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie glycosyleringssted, samt et enkelt Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie peptid omfattende de første ca. 19 til ca. 23 30 N-terminale aminosyrerester af α-faktor forstadiet, og DK 176075 B1 4 (2) dyrkning af denne gær celle under betingelser som tilvejebringer ekspression og secernering af ikke-gær proteinet.

I en anden udførelsesform angår den foreliggende opfindelse et dobbelt-5 strenget DNA-molekyle, der omfatter et område, der koder for et forstadiepo-lypeptid, som kan secerneres af en gærvært, hvilket område under henvisning til en af strengene omfatter strukturen: 5'-AF-CH0-Xn-S-geri*-3' hvor 10 - AF koder for et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor signal peptid; - CHO koder for et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor glycosyle-ringssted; - Xn koder for et afstandspolypeptid med en længde på n aminosyrer, som ikke indeholder et glycosyleringssted eller et processeringssted, som gør det 15 muligt for gæren at spalte forstadiepolypeptidet in vivo, - n er et helt tal på fra 0 til ca. 30, - gen* koder for et ikke-gærprotein, og - S koder for et processeringssted, som muliggør spaltning af forstadiepolypeptidet.

20

Figur 1 er et arbejdsdiagram, som viser konstruktionen af pYBCA5 5 samt både nukleotid- og aminosyresekvensen af det i eksempel I anvendte syntetiske proinsulingen. De forskellige syntetiske oligonukleotider, som anvendes i konstruktionen, er markeret med sorte prikker. Pile over sekvensen viser 25 begyndelsen og slutningen af B-, C- og A-proinsulinkæderne. De sorte kasser markerer de dibasiske processeringssteder.

Figur 2 viser nukleotid- og aminosyresekvensen af et syntetisk oligonukleotid, som koder for en modificeret α-faktor leder og de første 13 aminosyrer af 30 proinsulingenet, som anvendes til konstruktion af pYGAI3 i eksempel I. Gly- DK 176075 B1 5 cosyleringsstederne i den modificerede α-faktor leder er blevet fjernet ved at ændre codonerne for Asn til at kode for Gin (indrammet). Pilene angiver forbindelsesstedet mellem den sekvens, som koder for KEX2- endopeptidasestedet og den N-terminale ende af human-proinsulin.

5

Figur 3 viser det syntetiske gen af fragment pYGAIC3, som koder for proinsu-linanalogen, hvor C-peptidet er blevet erstattet med et KEX2-endopeptidasested (indrammet). Det 133 bp lange syntetiske fragment, som der henvises til i eksempel II, er defineret af de vertikale og horisontale linier 10 gennem nukleotidsekvensen.

Figur 4 er et restriktionskort af gærfærgevektoren pAB24.

Figur 5 viser DNA-sekvensen af det syntetiske gen, som koder for det i ek-15 sempel III beskrevne IGF1.

Figur 6 er et restriktionskort af pYLUIGF1-55, en ekspressions vektor, der er beskrevet i eksempel III, og som koder for IGF1 under styring afen trunkeret α-faktor leder.

20

Figur 7 er et restriktionskort af pYLUIGF1-24, en ekspressions vektor, som er beskrevet i eksempel III, og som koder for IGF1 under styring af en a-faktor leder i fuld længde og med tre glycosyleringssteder.

25 Med mindre andet er anført, er der ved udøvelsen af den foreliggende 5 opfindelse blevet anvendt traditionelle metoder inden for molekylær biologi, mikrobiologi og rekombinant DNA-teknikker, hvilket vil være kendt af en fagmand. Sådanne metoder er fuldt ud forklaret i litte raturen. Se f.eks. Maniatis,

Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA 30 Cloning, bind I & II (D.N. Glover, red., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.

Gait, red., 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, 6 DK 176075 B1 j i red., 1984); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Ved beskrivelse af den foreliggende opfindelse vil følgende terminologi blive 5 anvendt i overensstemmelse med de definitioner, som er anført nedenfor.

En “replicon” er et hvilket som helst genetisk element (f.eks. plasmid, cosmid, kromosom, virus), der fungerer som en autonom enhed ved ONA-replikation in vivo - dvs, er i stand til at replikere under dets egenstyring.

10

En “vektor” er en replicon, såsom et plasmid, fag eller cosmid, hvortil der kan være knyttet et andet DNA-segment, hvorved det tilknyttede segment bringes til at replikere.

15 Et “dobbeltstrenget DNA-molekyle” refererer til den polymere form af deoxy-ribonukleotider (adenin, guanin, thymidin eller cytosin) i dens normale, dobbeltstrengede helix. Dette udtryk refererer kun til den primære og sekundære struktur af molekylet, og begrænser det ikke til nogen bestemte tertiære former. Dette udtryk omfatter således dobbeltstrenget DNA, som bla. findes i 20 lineære DNA-molekyler (f.eks. restriktionsfragmenter), vira, plasmider og kromosomer. Ved diskussion af strukturen af et bestemt dobbeltstrenget DNA-molekyle, vil der her blive beskrevet sekvenser i overensstemmelse med den normale konvention ved kun at angive sekvensen i 5’- til 3’-retningeri langs den ikke-transkriberede DNA-streng, dvs, den streng, som 25 har en sekvens, der er homolog med det mRNA, som frembringes fra en bestemt kodende sekvens.

En DNA “kodende sekvens" er en DNA-sekvens, som in vivo kan transkribe-res og translateres ti] et polypeptid, når det sættes under styring af hensigts-30 mæssige regulatoriske sekvenser. Grænserne for den kodende sekvens bestemmes af og omfatter translationsstart codonen ved 5’-enden (amino) og DK 176075 B1 7 en translationsstopcodon ved 3-enden (carboxy). En kodende sekvens kan omfatte, men er ikke begrænset til, prokaryotiske DNA-sekvenser, virale DNA-sekvenser, cDNA eller genomiske DNA-sekvenser fra eukaryotiske kilder (f.eks. pattedyr) eller syntetiske DNA-sekvenser.

5 “Gærgenkendte transkriptionsinitierings- og termineringssekvenser” refererer til DNA-regulatoriske områder, som flankerer en kodende sekvens, og som er ansvarlige for transkriptionen i gær af et mRNA, der er homolog med den kodende sekvens, som derefter kan translateres til det polypeptid, der er ko-10 det af den kodende sekvens. Transkriptionsinitieringssekvenser omfatter gærpromotorsekvenser, hvilket er DNA regulatoriske sekvenser, som er i stand til at binde gær RNA-polymerase i en celle og initiere transkription af en kodende sekvens i nedenstrømsretningen (3’-retningen). I forbindelse med den foreliggende opfindelse er promotorsekvensen ved dens 3’-ende 15 afgrænset af (og omfatter ikke) translationsstartcodonen for en kodende sekvens og strækker sig opstrøms (5’-retningen) til at omfatte det minimale antal nukleotider eller elementer, som er nødvendige for at initiere transkription ved niveauer, som kan påvises i forhold til baggrunden. Inden for promotorsekvensen vil der være et transkriptionsinitieringssted (kan bekvemt define-20 res ved kortlægning med nuclease SI) såvel som proteinbindende domæner (consensussekvenser), der er ansvarlige for bindingen af gær RNA polymerasen. Promotorer, som er brugbare ved den foreliggende opfindelse, omfatter vildtype α-faktor promotoren såvel som andre gær promotorer. Specielt foretrukne er gærpromotorer, som er involveret med enzymerne i den glyco-25 lytiske bane, f.eks. phosphoglucoisomerase, phosphofructokinase, phosphotrioseisomerase, phosphoglucomutase, enolase, pyrodruesyrekina-se, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, alkoholdehydrogenase såvel som hybrider af disse promotorer. Se f.eks. [ publikationer nr. 120.551 og 164.556.

30 DK 176075 B1 8

Transkriptionsinitieringssekvenser kan også omfatte andre regulatoriske områder, som er ansvarlige for promotorregulering eller -forstærkning. På lignende måde kan en transkriptionstermineringssekvens, som er anbragt 3’ for translationsstopcodonen enten være vildtype α-faktor transkriptionstermine-5 ringssekvensen eller en anden gærgenkendt termineringssekvens, således som sekvenserne fra generne for ovennævnte glycolytiske enzymer.

En kodende sekvens er “under styring” af transkriptionsinitierings og termine-ringssekvenser, når RNA-polymerase bindes til transkriptionsinitieringsse-10 kvensen og transkriberer den kodende sekvens til mRNA med en afslutning ved transkriptionstermineringssekvensen, og mRNA’et derefter translateres til det polypeptid, som er kodet af den kodende sekvens (dvs. “ekspression”).

Det forstadiepolypeptid, som er kodet af de kodende sekvenser ifølge den foreliggende opfindelse, "secerneres", når i det mindste en del (sædvanligvis 15 ikke gærproteinet uden Tedersekvensen) transporteres ekstracellulært, hvor det findes i cellevækstmediet. Sædvanligvis secerneres kun den del af forstadieproteinet, som er nedenstrøms ledersekvensen, og denne nedenstrøms del kan også udsættes for yderligere processering under secernering, såsom proteolytisk spaltning, glycosylering, foldning, dannelse af 20 disulfidbinding osv.

En celle er blevet “transformeret” med exogent DNA, når et sådant 25 exo-gent DNA er blevet ført inden for cellevæggen. Exogent DNA kan eller er ikke integreret (covalent koblet) med kromosomalt DNA, som udgør cellens ge-25 nom. Det exogene DNA kan opretholdes ekstrakromosomalt på en replicon, såsom et plasmid. Når det exogene DNA er blevet integreret i kromosomet, nedarves det af døtrecelleme ved kromosomreplikering. En celle, der er blevet transformeret med exogent DNA, som er integreret i kromosomet, omtales som en “stabilt” transformeret celle. En "klon” eller en “klonpopulation” er 30 en cellepopulation, som ved mitose hidrører fra en enkelt celle eller en fælles forfader.

! ~ DK 176075 B1 9

To DNA-sekvenser er “i alt væsentligt homologe", når der er mindst ca. 60% (fortrinsvis mindst ca. 75% og mest fortrinsvis mindst ca. 90%) af nukleoti-derne, som matcher sammen over en defineret længde af molekylerne. Se-5 kvenser, som er i alt væsentligt homologe, kan identificeres ved et Southern hybridiseringsforsøg under betingelser med en udvalgt stringenthed, hvilket er defineret for det specielle system. Fastlæggelse af passende hybridise-ringsbetingelser kan foretages af en fagmand. Se f.eks. Maniatis et al., se ovenfor, DNA Cloning, se ovenfor, Nucleic Acid Hybridization, se ovenfor.

10 Et “heterologt område” af et DNA-molekyle er et identificerbart segment af DNA inden for et større DNA-molekyle, som ikke findes associeret med det større molekyle i naturen. Når det heterologe område således koder for et pattedyrprotein, vil det heterologe om råde sædvanligvis være flankeret af DNA, som ikke flankerer pattedyr DNA-sekvensen i genomet i den oprindeli-15 ge organisme. Et andet eksempel på en heterologt kodende sekvens er en konstruktion, hvor den kodende sekvens i sig selv ikke findes i naturen (f.eks. et cDNA, hvor den genomiske, kodende sekvens indeholder intron-områder, eller syntetiske sekvenser, som har codoner, som adskiller sig fra organismer, der koder for det samme eller et lignende protein). Allele variationer el-20 ler naturligt forekommende muteringsbegivenheder giver ikke ophav til et “heterologt” område af DNA, sådan som udtrykket anvendes her.

Som anvendt her omfatter’ “gær” ascosporogene gærtyper (Endomyce tales), basidiosporogene gærtyper og gær, som tilhører Fungi imperfecti (Blastomy-25 cetes). De ascosporogene gærtyper inddeles i to familier, Spermophthora-ceae og Saccharomycetaceae. Sidstnævnte består af fire underfamilier, Schizosaccharomycoideae (f.eks. slægten Schizosaccharomyces), Nadso-nioidéae, Lipomycoideae og Saccharomycoideae (f.eks. slægterne Pichia, Kluyveromyces og Saccharomyces). De basidosporogene gærtyper omfatter 30 slægterne Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium og Filobasidiella. Gær, der tilhører Fungi Imperfecti, inddeles i to familier, Spo- DK 176075 B1 10 robolomycetaceae (f.eks. slægterne Sporobolomyces, Bullera) og Crypto-coccaceae (f.eks. slægten Candida). Af speciel interesse for den foreliggende opfindelse er arterne inden for slægterne Pichia, Kluyveromyces, Saccha-romyces, Schizosaccharomyces og Candida. Af speciel interesse er Saccha-5 romycesarterne S. cerevisiae, S. carisbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis og S. oviformis. Arter af speciel interesse inden for slægten Kluyveromyces omfatter K. lactis. Eftersom klassificeringen af gær kan ændre sig i fremtiden, defineres gær i forbindelse med den foreliggende opfindelse som beskrevet i Biology and Activities of Yeast (F.A. Skinner, S.M.

10 Passmore og R.R. Davenport, red., 1980) (Soc. App. Bacteriol. Symp. serie nr. 9). I forbindelse med ovennævnte er en fagmand sandsynligvis fortrolig med gærbiologien og håndteringen af gærgenetik. Se f.eks. Biochemistry and Genetics of Yeast (M. Bacila, B.L. Horecker & A.O.M. Stoppani, red., 1978), The Yeasts (A.H. Rose og J.S. Harrison, red., 2. udgave, 1987), The 15 Molecular Biology of the Yeast Saccharoniyces (Strathern et al., red., 1981).

Den fra ovennævnte referencer kendte teknik er medtaget her ved henvisning.

Ved den foreliggende opfindelse anvendes trunkerede ledersekvenser 15 fra 20 et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor gen. α-Faktor er et par-ringspheromonoligopeptid med en længde på ca. 13 aminosyrer frembragt ud fra et stort forstadiepolypeptid med en længde på fra ca. 100 til 200 aminosyrer (typisk fra ca. 120 til 160) (præpro-a-faktor). Forstadiet omfatter en hydrofob “signalsekvens" med ca. 20 aminosyrer (f.eks. ca. 19-23, typisk ca.

25 26-22) efterfulgt af et yderligere lederområde på ca. 60 hydrofile aminosyre- rester (“pron-området), som derefter er koblet til adskillige tandemgentagelser af den modne pheromonsekvens (typisk ca. 2-6) adskilt af korte oligopep-tidspacerområder (typisk ca. 6-8 aminosyrerester), som muliggør proteolytisk processering til det modne pheromon.

30 DK 176075 B1 11

Kloningen af forskellige præpro-a-faktor gener er blevet beskrevet. Se f.eks.

Kurjan et al., U.S. patent nr. 4.546.082, Singh et al. (1983), Nucleic Acids Res., 11:4049-4063, DK patentansøgning nr. 30 4222/88, indleveret 28. juli 1988, hvor den herfra kendte teknik er medtaget ved henvisning. Endvidere 5 kan DNA-sekvenser, som koder for præpro-genet, identificeres ved hybridi-sering med prober fra kendte præpro-a-faktor sekvenser. Se f.eks. Brake et al. (1983), Molec. & Cell Biol. 3:1440-1450. α-Faktor kan også oprenses fra en gærart, sekventeres og der kan udformes prober til kloning af præpro-a-faktor genet. Se f.eks. McCullough et al. (1979), J. Bacteriol. 138:146-154, 10 Sato et al. (1981), Agric. Biol. Chem. 44:1451-1453, Singh et al. (1983), se ovenfor. Det har også vist sig, at α-faktor ledersekvenseri fra én gærart kan fungere i en anden gærart. Se f.eks. U.S. ansøgning nr. 78.551, se ovenfor.

Den foreliggende opfindelse angår således ikke kun anvendelsen af a-faktor ledersekvenser fra Saccharomyces eller Kluyveromyces gær i almindelighed, 15 men anvendelsen af sådanne ledersekvenser i heterologe gærarter. Af bekvemmeligheds grunde vil opfindelsen imidlertid blive diskuteret med hensyn til præpro-a-faktor genet MFcd fra S. cerevisiae. Se f.eks. Kurjan et al., U.S. patent nr. 4.546.083, Singh et al. (1983), se ovenfor.

20 Med den foreliggende opfindelse anvendes kimære DNA-konstruktioner, som koder for hybride forstadiepolypeptider, der omfatter en leder sekvens og et ikke-gærpolypeptid. I forbindelse med den foreliggende opfindelse afgrænses leder-DNA-sekvensen som begyndende med den N terminale startcodon (methionin) i forstadiepolypeptidet til den condon, som koder for den sidste 25 aminosyrerest før processerings stedet, der ligger mellem ledersekvensen og den sekvens, som koder for ikke-gærproteinet. Ledersekvensen ifølge den foreliggende opfindelse er sammensat af én trunkeret form af en Saccharo-myces eller Kluyveromyces α-faktor ledersekvens, som typisk har en længde på fra ca. 25 til ca. 50 aminosyrerester. Ledersekvensen ifølge den forelig-30 gende opfindelse er således ca. 30 aminosyrerester kortere end den typiske DK 176075 B1 12 α-faktor leder i fuld længde. MF indeholder f.eks. en ledersekvens på 83 aminosyrerester efterfulgt af en hexapeptidspacersekvens, som spaltes af gærprocesseringsenzymer. Ved frembringelse af deletioner fra ledersekvensen er det vigtigt, at mindst ét glycosyleringssted (-Asn-Y-Thr/Ser-) bevares 5 til tilvejebringelse af effektiv secernering.

Det er også nødvendigt, at lederen bevarer en funktionel α-faktor signalsekvens. Som ovenfor anført har signalpeptidet sædvanligvis en længde på ca.

20 aminosyrer og karakteristiske træk omfatter en hydrofob kerne. Se f.eks.

10 von Heijne (1984), J. Mol. Biol. 173:243- 251. Alle de præpro-a-faktor sekvenser, som er undersøgt indtil i dag, koder for et hydrofobt peptid med en længde på ca. 20 aminosyrer. Om end den nøjagtige længde af et signalpeptid, som er nødvendigt for at styre forstadiepolypeptidet til secemeringsba-nen, ikke er defineret, vil det sædvanligvis kræve mellem ca. 19 og ca. 23 15 aminosyrerester, idet den minimale sekvens, som er nødvendig, let kan defineres ved at undersøge deletionsmutanter.

Med hensyn til MFa1 tænkes der således i forbindelse med den foreliggende opfindelse på deletioner i området fra ca. 30 til ca. 60 aminosyrerester, typisk 20 fra mellem ca. 33 og ca. 58 aminosyrerester og mere typisk mellem ca. 48 og ca. 58 aminosyrerester. Disse deletioner vil almindeligvis forekomme i området mellem og omfattende aminosyreresteme 26 til 83. Det foretrækkes, at deletionerne omfatter glycosyleringsstederne ved aminosyreresteme 57-59 og 67-69. De deleterede α-faktor ledersekvenser kan om ønsket delvis er-25 stattes med ikke-a-faktor ledersekvenser. Sekvenserne bør almindeligvis kode for hydrofile aminosyrerester, bør ikke kode for glycosylering eller pro-cesseringssteder og skal fortrinsvis udvælges til at opretholde den samlede længde af lederen til at være ca. 50 aminosyrerester eller mindre, fortrinsvis fra ca. 23 til 40 amino syrerester og mest fortrinsvis fra ca. 25 til 35 aminosy-30 rerester.

DK 176075 B1 13

Som ovenfor anført er der umiddelbart 3’ for ledersekvensen ifølge den foreliggende opfindelse et processeringssted, som muliggør at lederen spaltes fra ikke-gærproteinsekvensen, til hvilken den er fusioneret i forstadiepolypep-tidet. Det processeringssted, som anvendes ved den foreliggende opfindelse, 5 defineres som de codoner, der definerer det minimale antal af aminosyrere-ster, som specifikt genkendes til spaltning ved deri udvalgte proces (f.eks. kemisk, enzymatisk osv.). Inden for fagområdet kendes forskellige processe-ringssteder, herunder både de steder, som er aktive in vivo og in vitro. Der kan f.eks. med processeringsstedet tilvejebringes in vitro processering ved 10 kodning af et spaltningssted for et proteolytisk enzym, som ikke forekommer i gærværten. Det indvundne forstadiepolypeptid vil derefter blive behandlet med enzymet til spaltning af ikke-gærproteinet fra forstadiet. Et andet in vitro processeringssted er en methionincodon, som kan spaltes ved post ekspressionsbehandling med cyanogenbromid. Se f.eks. U.S. patent nr. 4.366.246.

15

In vivo processeringssteder kan udvælges blandt hvilke som helst peptidsignaler, som genkendes af et proteolytisk gærenzym, som vil tilvejebringe ekspression af den ønskede ikke-gærproteinsekvens. Specielt foretrukne processeringssteder er stederne for de enzymer, som er involveret i processe-20 ring af nativ præpro-a-faktor For eksempel fjerner dipeptidylaminopeptidase A (DPAPase A) terminale -X-Ala-sekvenser, hvor X er Glu eller Asp. Se f.eks. Julius et al. (1983), Cell 32:839-852. Den endopeptidase, som kodes af KEX2-genet, spalter basiske dipeptider omfattende Lys- og Arg-rester, dvs. Lys-Arg, Arg-Arg, Arg-Lys og Lys-Lys. Fuller et al., Microbiology 1986, s.

25 273-278 (1986). I gær spaltes α-faktor forstadiet først af KEX2- endopeptidasen og derefter trimmes den N-terminale ende af DPAPase A til tilvejebringelse af det modne α-faktor pheromon. Eftersom det ser ud til at sidstnævnte proteolytiske proces er et hastighedsbegrænsende trin, foretrækkes det at eliminere signalerne for DPAPase A, således at processe-30 ringsstedet kun omfatter signalet for KEX2-endopeptidasen. I en sådan udførelsesform vil ledersekvensen derfor være sammenføjet med ikke- DK 176075 B1 14 gærproteinsekvensen ved det dibasiske peptidgenkendelsessted for KEX2-endopeptidase, såsom Lys-Arg eller Arg-Arg.

Den carboxyterminale del af forstadiepolypeptidet ifølge den foreliggende 5 opfindelse er ét ikke-gærprotein. Den DNA-sekvens, som koder for denne del, defineres her som begyndende med den første codon nedenstrøms (3‘-retningen) den sidste codon i processeringsstedet til translationsstopcodo-nen, som definerer den carboxyterminale ende af forstadiepolypeptidet. Denne DNA-sekvens vil betragtes som kodende for et “ikke-gærprotein”, når det 10 set over hele sekvensen definerer et polypeptid, som ikke i det væsentlige er homologt med et polypeptid, som udtrykkes af gær. De foretrukne ikke-gærproteiner vil almindeligvis være pattedyrproteinsekvenser (herunder deres analoger, dvs. “muteiner”, fragmenter osv.). Som her defineret kan ikke-gærproteiner derfor omfatte et fusionsprotein, som omfatter pattedyr- og 15 gærsekvenser, såvel som “pro'-former af det modne pattedyrprotein. DNA-sekvenser, som koder for ikke-gærproteineme, kan være sekvenser, som er klonet fra ikke-gærorganismer, eller de kan være syntetiske sekvenser, der sædvanligvis fremstilles under anvendelse af gærforetrukne codoner. Sædvanligvis vil ikke-gærproteineme have en længde på mindst ca. 8 amino-20 syrer og kan omfatte polypeptider på op til ca. 100.000 dalton eller mere. Sædvanligvis vil ikke polypeptidsekvensen være mindre end ca. 300.000 dalton og mere sædvanligvis mindre end ca. 150.000 dalton. Af speciel interesse er polypeptider på fra ca. 5000 til ca. 150.000 dalton, mere foretrukket fra ca. 5000 til ca. 100.000 dalton. Illustrative ikke-gærproteiner, som har inte-25 resse, omfatter hormoner og faktorer, såsom væksthormon, somatomediner, epidermal vækstfaktor, luteiniserende hormon, thyroidstimulerende hormon, oxytocin, insulin, vasopressin, renin, caicitonin, follikelstimulerende hormon, prolactin, erythropoietin, kolonistimulerende faktorer, lymfokiner, såsom inter-leukin-2, globiner, immunoglobuliner, interferoner (f.eks. a, b eller q), enzy-30 mer, b-endorphin, enkephalin, dynorphin, insulinlignende vækstfaktorer mv.

DK 176075 B1 15 I en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse har DNA-konstruktioner, som koder for de ovenfor beskrevne forstadie polypeptider, strukturen: 5'-AF-CH0-X -S-gen*-3' 5 · · n hvor AF koder for et gær a-faktor signalpeptid, 10 CHO koder foret glycosyleringssted, X„ koder for et polypeptid med en længde på n aminosyrer, og som ikke indeholder et glycosyleringssted eller et processeringssted, som vil bevirke, at forstadiepolypeptidet spaltes in vivo af gærværten, 15 n er et helt tal på fra 0 til ca. 30, gen* koder for et ikke-gærprotein, og 20 S koder for et processeringssted, som vil muliggøre en spaltning af forstad i epolypeptidet.

Det signalpeptid, som kodes af AF, er det samme α-faktor signalpeptid, som er beskrevet ovenfor. Det har en længde på ca. 20 aminosyrerester (f.eks.

25 ca. 19-23) og er tilstrækkeligt langt til at styre forstadiepolypeptidet ind i gærens sekretoriske bane. Den præcise minimale eller maksimale længde kan bestemmes for en bestemt α-faktor ved at screene en serie af deletionskonstruktioner.

DK 176075 B1 16

Den DNA-sekvens, der defineres af CHO, koder for et glycosyleringssted.

Den vil sædvanligvis have en længde på 9 nukleotider inkluderende 3 codo-ner for aminosyrerne Asn-Y-Y’-, hvor Y er en hvilken som helst aminosyre-rest, og Y' er Thr eller Ser.

5

Xn koder, hvis den er til stede, for f.eks. dele af α-faktor lede ren, som ikke er deleteret, eller ikke-beslægtede aminosyre sekvenser. Xn vil almindeligvis have en maksimal længde på ca. 30 aminosyrerester, mere fortrinsvis en maksimal længde på ca. 20 aminosyrerester og mest fortrinsvis en maksimal 10 længde på ca. 10 aminosyrerester. Om end det ikke er nødvendigt, at Xn for nogen som helst polypeptider (dvs. n = 0), kan det være ønskeligt at tilvejebringe nogen afstand mellem glycosyleringsstedet CHO og processerings-stedet S i det tilfælde, at kulhydrattilføjelser på glycosyleringsstedet sterisk hindrer, at det middel, som spalter processeringsstedeme, får adgang. I så-15 danne tilfælde vil n sædvanligvis have et minimum på ca. 1, mere fortrinsvis et minimum på ca. 2, og mest fortrinsvis et minimum på ca. 3.

Hvis X er til stede, foretrækkes det, at det ikke indeholder nogen funktionelle glycosyleringssteder eller processeringssteder, som genkendes og spaltes af 20 gærværten. Når den afviger fra sekvenser, som findes i en α-faktor leder, foretrækkes det ydermere at vælge hydrofile aminosyrerester. Det er muligt, at længden af Xn vil påvirke effektiviteten af ekspressionen og secerneringen af ikke-gær proteinet. Udvælgelse af en passende længde af X til optimering af ekspression kan udføres ved screening af konstruktioner med for skellige 25 størrelser.

Ikke-gærproteinet, som kodes af gen*, og processeringsstedet, der kodes af 5, er som ovenfor beskrevet. 1 DNA-konstruktioneme ifølge den foreliggende opfindelse vil sædvanligvis opretholdes i en replicon, som er i stand til at opretholdes stabilt i en vært, DK 176075 B1 17 navnlig en gærvært. Repliconerne, sædvanligvis plasmider, vil omfatte et eller flere replikationssystemer, ønskeligt to replikationssystemer, hvilket muliggør, at repliconen bevares i både en gærvært til ekspression og i en proka-ryotisk vært ved kloning. Eksempler på sådanne gær-bakteriefærgevektorer 5 omfatter YEp24 (Botstein et al. (1979), Gene 8:17-24), pCI/1 (Brake et al.

(1984), Proc. Nat]. Acad. Sci. USA, 81:4642-4646) og YRp17 (Stinchomb et al. (1982), J. Mol. Biol. 158:157). Endvidere kan plasmidekspressionsvekto-ren være et plasmid med et højt eller lavt kopiantal, hvor kopiantallet sædvanligvis ligger på fra ca. 1 til ca. 200. Med gærvektorer med et højt kopiantal 10 vil der almindeligvis være mindst 10, fortrinsvis mindst 20 og sædvanligvis ikke over ca. 150 kopier i en enkelt vært. Afhængigt af det udvalgte ikke-gærprotein kan en vektor med et højt eller lavt kopiantal være ønskelig, hvilket afhænger af den virkning, vektoren og det fremmede protein har på værten. Se f.eks. Brake et al., se ovenfor. DNA-konstruktioner ifølge den forelig-15 gende opfindelse kan også integreres i gærgenomet med en integrerende vektor. Eksempler på sådanne vektorer kendes inden for fagområdet. Se f.eks. Botstein et al., se ovenfor.

En fagmand kan udvælge egnede gærværter og andre mikroorganismevær-20 ter ti! udøvelse af den foreliggende opfindelse. Når gærværter udvælges til ekspression, kan egnede værter omfatte de værter, som bl.a. har vist god secerneringskapacitet, lav proteolytisk aktivitet og en samlet robusthed. Gær og andre mikroorganismer kan sædvanligvis fås fra en række kilder, herunder Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Phy-25 sics, University of California, Berkeley, California samt American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Metoder til indføring af exogent DNA i gærværter er velkendte inden for fagområdet. Der er en lang række forskellige måder at transformere gær på.

30 Belæringer om spheroplasttransformation findes f.eks. i Hinnen et al. (1978),

Proc. Nati . Acad. Sci. USA, 75:1919-1933, og Stinchomb et al., EPO publi- DK 176075 B1 18 kation nr. 45.573. Transformanter dyrkes i et hensigtsmæssigt næringsmedium, når det hensigtsmæssigt opretholdes under et selektivt tryk for at sikre bevarelse af endogent DNA. Når ekspressionen er inducibel, kan vækst af gærværten tillades til opnåelse af en hø] tæthed af celler, og ekspressionen 5 kan derefter induceres. Det secernerede, modnede ikke-gærprotein kan høstes ved hjælp af en hvilken som helst traditionel måde og oprenses ved kromatografi, elektroforese, dialyse, opløsningsmiddel-opløsningsmiddel -ekstraktion og lignende.

10 EKSEMPLER

De efterfølgende eksempler gives alene til illustration og har ikke til hensigt at begrænse den foreliggende opfindelses rækkevidde. Det antages, at deponering af de biologiske udgangsmaterialer ikke er nødvendig til udøvelse af 15 den foreliggende opfindelse, eftersom enten det samme eller ækvivalent materiale er offentligt tilgængeligt.

Eksempel I

20 Med det efterfølgende eksempel tilvejebringes en sammenligning af ekspressions- og secerneringsniveauer opnået med modificerede α-faktor konstruktioner anvendt til at udtrykke human-proinsulin. Tre konstruktioner udnytter a-faktor ledere i fuld længde; én har en α-faktor leder med de tre native glyco-syleringssteder, hos én er alle tre glycosyleringssteder elimineret og hos én 25 er alle stederne, med undtagelse af ét ved Asn23 fjernet. Den fjerde konstruktion er en trun keret α-faktor leder, som bevarer et enkelt glycosyleringssted ved Asn23- A. pYGAM 30 DK 176075 B1 19

Dette plasmid koder for en α-faktor leder (Brake et al. (1984), Proc. Natl. ‘

Acad. Sci. USA, 81:4642-4646, EPO publikation nr. 116.201) koblet til hu-man-proinsulin. Proinsulinet er kodet af et syntetisk gen, der er fremstillet med gærforetrukne codoner (figur 30 1). α-Faktor ledersekvensen, det synte-5 tiske proinsulingen og α-faktor terminatorsekvensen er fra pYBCA5, hvis konstruktion er vist i figur 1. Transskriptionen medieres af det 404 bp lange Barn Hl-Nco l-GAPDH-promotorfragment. Travis et al. (1985), J. Biol. Chem., 260:4384-4389. Den 1206 bp lange Barn Hl-ekspressionskassette omfattende GAPDH-promotoren, den sekvens, som koder for α-faktor lederen koblet 10 til proinsulin og α-faktor terminatoren, blev klonet i det unikke Barn Hl-sted i gærfærgevektoren pAB24 (nedenfor) eller pCI/1, således at GAPDH-promotorsekvensen var proximal til Sal l-stedet i vektoren til frembringelse af plasmiderne pYGAI1-AB24 henholdsvis pYGAI1-C1/1. Den 1206 bp lange Ban HJ-ekspressionskassette blev også subklonet i det unikke Barn Hl-sted i 15 et derivat af pBR322 (pBR322(WEco Ri-Sal l)Bam Hl; Travis et al., se ovenfor). Dette plasmid blev kaldt pGAM.

Plasmid pAB24 (figur 4) er en gærfærgevektor, som indeholder den komplette 2m-sekvens (Broach, i Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 20 bind 1, s. 445 (1 og pBR322-sekvenser. Det indeholder også gær URA3-genet hidrørende fra plasmid YEp24 (Botstein et al. (1979), Gene 8:17) og gær LEU2d-genet hidrørende fra plasmid pCI/1. EPO publikation nr. 116.201. Plasmid pAB24 blev konstrueret ved at fordøje YEp24 med Eco RI og genligere vektoren til fjernelse af de partielle 2m-sekvenser. Det fremkomne 25 plasmid, YEp24WRI, blev lineariseret ved fordøjelse med Cia I og ligeret med det komplette 2m-plasmid, som var blevet lineariseret med Cla 1. Det fremkomne plasmid, pCBou, blev derefter fordøjet med Xba I, og det 8605 bp lange vektorfragment blev gelisoleret. Det isolerede Xba l-fragment blev ligeret med et 4460 bp langt Xba l-fragment, som indeholdt LEU2d-genet isoleret 30 fra pCI/1; orienteringen af LEU2d-genet er i samme retning som URA3-genet.

B. PYGAI3 DK 176075 B1 20

Piasmid pYGAI3 adskiller sig fra pYGAM ved, at det koder for en 25 modificeret α-faktor leder, hvor codoneme for Asn ved resterne 23, 57 og 67 er 5 blevet udskiftet til at kode for Gin, hvorved alle tre signaler for N-koblet glyco-sylering er elimineret.

• α-Faktor lederen og de N-terminale 13 aminosyrer af proinsulin, der 30 kodes af dette piasmid, blev konstrueret ved at ligere syntetiske oligoriukieoti-10 der til frembringelse af et 294 bp langt fragment med et 5’ Nco l-fremspring og et 3’ Hind lll-fremspring, hvis sekvens er vist i figur 2. Sekvensen af hensigtsmæssige oligonukleotider blev ændret under syntesen, således at codo-ner, som specificerede Asn ved positionerne 23, 57 og 67 i den naturlige a-faktor leder, nu specificerer Gin ved de samme positioner. DNA-sekvensen, 15 som specificerer de N-terminale 13 aminosyrer af proinsulin, var identisk med sekvensen i pYGAM. Det 294 bp lange syntetiske DNA (Nco 1-Hind III) fragment blev indsat i stedet for det sammenlignelige fragment i pGAM og pY-GAI1-C1/1, hvilket gav plasmiderne pGAI3 henholdsvis pYGAI3.

20 C. PYGAI8

Piasmid pYGAI8 indeholder DNA, som koder for en α-faktor leder, der eliminerer to af de tre glycosyleringssteder. Asn57.67 er blevet modificeret til Gln57.67- Det fremkomne piasmid har kun et enkelt glycosyleringssted ved 25 position Asn23 pYGAI8 blev fremstillet på følgende måde.

Der blev først isoleret et 5’-fragment fra ekspressionskassetten i pGAII ved at skære med Hpa II, efterfulgt af skæring med Bam Hl og derefter gelisolering af et 504 bp langt fragment indeholdende GAPDH-promotoren og den se-30 kvens, som koder for aminosyreresterne 1-33 i α-faktor lederen. Derefter blev piasmid pYGAI3, som koder for en α-faktor leder, der mangler glycosy- i DK 176075 B1 21 leringssteder, også sekventielt skåret med Hpa II og Bam Hl, og der blev isoleret et 702 bp langt fragment indeholdende sekvenser, som koder for modificerede α-faktor lederrester 34-83, LysArg-processeringsstedet, proinsulin sekvensen og α-faktor termineringssekvensen. Dette fragment blev derefter 5 ligeret til det 504 bp lange fragment fra pGAII, blev skåret med Bam Hl, og et 1206 bp langt fragment blev isoleret.

Det ovenfor nævnte 1,2 kb lange Bam Hl-fragment, som indeholdt en fuldstændig GAPDH-promotor/a-faktor leder/proinsulin/a-fakktor terminerings-10 ekspressionskassette, blev derefter ligeret til Bam Hl skåret og phosphatase-behandlet pBR322(WEco Rl-Sal l)Bam Hl til frembringelse af plasmid pGAI8, som blev klonet i E. coli.

Den 1,2 kb lange ekspressionskassette fra pGAI8 blev fjernet ved skæring 15 med Bam Hl, og derefter blev fragmentet gelisoleret. Det blev ligeret til Bam Hl-skåret og phosphatasebehandlet gærfærgevektor pAB24. Indsættelsen af ekspressionskassetten var i det unikke Bam Hl-sted i pBR322-sekvenserne, således at GAPDH-promotoren var proximalt det unikke Sal l-sted i vektoren.

Dette plasmid var pYGAI8.

20 D. PYGAI7

Plasmid pYGAI7 indeholdt DNA, som koder for en trunkeret α-faktor leder og det syntetiske gen for human-proinsulin. α-Faktor lederen er blevet trunkeret 25 således, at den kun koder for aminosyrer 1-35 i α-faktor lederen og derfor indeholder et enkelt sted for glycosylering ved Asn Denne gærekspressionsvektor blev konstrueret på følgende måde.

Først blev pGAII skåret med Hind III. En Hpa Il-Hind lll-linker med den efter-30 følgende struktur blev tilføjet: DK 176075 B1 22

5' -CGGCTAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTG7GGTTCTCACTTGGTTGA

CGATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGA- 5'

Efter tilføjelsen af linkeren blev det lineariserede plasmid skåret med Barn Hl, og et 558 bp langt Hpa Il-Barn Hl-fragment blev gelisoleret. Dette fragment indeholdt codoneme for aminosyreresterne 34-35 i α-faktor lederen koblet 5 direkte til et Lys-Arg-processeringssted og proinsulinsekvensen. Der er ingen intervenerende sekvenser mellem codonen for aminosyrerest 35 i a-faktor lederen og processeringsstedet umiddelbart stødende op til proinsulinsekvensen; 10 Dernæst blev pGAII skåret med Hpall og Barn Hl, og et 504 bp langt fragment blev gelisoleret. Dette fragment indeholdt GAPDH-promotoren og nu-kleotider, som koder for aminosyrerne 1-33 i α-faktor lederen, 3’-enden, som afsluttes i et Hpa Il-fremspring, der er komplementært til 5’-enden i det ovenfor beskrevne 558 bp lange Hpa 11-Barn Hl- fragment. Disse to fragmenter 15 blev ligeret sammen og skåret med Barn Hl til tilvejebringelse af en ekspressionskassette, som indeholdt GAPDU-promotoren, sekvenser, som koder for en modificeret α-faktor leder, der indeholder aminosyreresterne 1-35 direkte koblet til et Lys-Arg-processeringssted, proinsulingenet og α-faktor terminato-ren. Kassetten blev derefter ligeret ind i Barn Hl-stedet i pBR322(WEco 35 20 Ri-Sal l)Bam Hl, som ovenfor beskrevet, til frembringelse af plasmid pGAJ7 og blev klonet i E. coli.

pGAI7 blev derefter skåret med Barn Hl, og den 1062 bp lange ekspressionskassette blev gelisoleret. Ekspressionskassetten blev derefter ligeret ind i 25 Barn Hl-stedet i pAB24 til frembringelse af plasmid pYGAI7.

E. Sammenlignende ekspression DK 176075 B1 23

Saccharomyces cerevisiae stamme AB103.1 (Mata, leu2-3,112,ura3--52, his4-580, pep4-3(cire)) blev transformeret med plasmiderne pYGAI1-C1/1, pYGAI3, pYGAI1-AB24, pYGAI7 og pYGAI8 stort set som beskrevet af Hin-nen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 75:1929-1933. Transformanter 5 med pYGAII-C1/1 og pYGAI3 blev udvalgt for leucinprototrofi, transformanter med de andre plasmider blev ud valgt for ura-prototrofi.

Resultaterne vist, i tabel 1 sammenligner secernering af proinsulin 15 medieret af den naturlige α-faktor leder (pYGAI1-C1/1) eller α-faktor lederen med 10 Gin substitueret for Asn ved positionerne 23, 57 og 67 (pYGAI3). Inoculum-kulturer (0,2 ml af individuelle transformanter) blev dyrket i 48 timer i komplet syntetisk medium uden leucin (SD-leu, Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, s. 62 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)) og blev fortyndet 20 gange i samme, medium. Kulturer blev dyrket. 48-72 timer, kultursupernatan-15 terne blev fremstillet ved centrifugering og blev analyseret for immunoreaktiv krydsreagerende insulinlignende materiale (ILM) i en kompetitiv radioimmun-analyse med 125l-mærket insulin. Som det fremgår af tabel 1, resulterede fjernelsen af de tre glycosyleringssteder fra α-faktor lederen i stort set ingen secernering af insulinlignende materiale sammenlignet med den secernering, 20 som blev medieret af den native α-faktor leder.

Resultater i tabel 2 sammenligner transformanter af pYGAI1-pAB24 (nativ a-faktor leder i fuld længde), pYGAI8 (α-faktor leder i fuld længde med kun et glycosyleringssted ved Asn og pYGAI7 (trunkeret α-faktor leder indeholden-25 de et enkelt glycosyleringssted ved Asn for deres evne til at secernere insulinlignende materiale. Inoculumkulturer af de anførte transformanter (0,2 ml) i SD-Leu dyrket i 0,48 timer ved 30°C blev pelletteret ved centrifugering, vasket og fortyndet 20 til 50 gange i ura medium. Dette medium indeholder 0,67% gærnitrogenbase, 1% ravsyre, 0,35% NaOH, 0,5% casaminosyre, 2% 30 glucose, 0,005% adenin, 0,01% tryptophan og 0,02% threonin. Kulturerne blev dyrket ved 30°C i 48-72 timer, og kultursupematanterne blev fremstillet DK 176075 B1 24 og analyseret som ovenfor beskrevet. Resultater anført i tabel 2 viser, at de transformanter, som bærer den konstruktion, der indeholder den trunkerede α-faktor leder under bevarelse af et enkelt glycosyleringssted ved Asn almindeligvis secernerede mere immunoreaktivt insulinlignende materiale end de 5 transformanter, der bar konstruktionen med en nativ α-faktor leder i fuld længde. Transformanter, som bar konstruktionen med α-faktor lederen i fuld længde og med det samme enkelte glycosyleringssted (Asn23), secernerede langt mindre insulinkrydsreagerende materiale end de transformanter, som bar den native α-faktor leder i fuld længde eller den trunkerede α-faktor le-10 der.

TABEL 1 .

Effekten af eliminering af α-faktor lederglvcosyleringssteder på secerneringen af insul i ni ianende materiale

Transformant —650· ILM1^_,, „ mq/ml mq/ml-00^-q AB103-. 1 (pYGAIl-Cl/l)_1 5,9 0,24 0,04' 2 5,9 0,24 0,04 _3 2,1 0,08 0,04 AB103.1(pY GA13) } ND 0,003 _2 ND 0,007

Krydsreagerende insulinlignende materiale (ILM) bestemt ved en kompeti-15 tiv radioimmunanalyse med 125l-mærket insulin og insulin standarder. Resultaterne er angivet som ILM secerneret pr. ml kultur og i nogle tilfælde som ILM secerneret pr. ml normaliseret til en kulturcelletæthed med en absorbans på 1 ved bølgelængden 650 nm.

DK 176075 B1 25 TABEL 2

Effekt af trunkeret or-faktor leder eller g-faktor leder i fuld længde med et enkelt σΐvcosvléringssted ved Asn^ på secernering af insul i niianende materiale

Transformant Antal _ILM^_ forsøgt _mg/ml_ mq/rnl «OD^q_

Område Gen. Std. Område Gen. Std.

afv. afv.

AB103.1 (pYGAI1-AB24) 7 0,22-0,55 0,37 0,12 0,02-0,04 0,026 0,01 ABI03.1 (pYGAI7) 8 0,38-1,0 0,62 0,24 0,03-0,06 0,043 0,01 AB 103.1 ' (pYGAI8). 8 . 0,03-0,18.0,0? 0,05. 0,003τ0,01.0,007 0,003.

1) Der blev undersøgt et minimum på tre uafhængige transformanter.

5 2) Secerneret, krydsreaktivt insulinlignende materiale (ILM) blev bestemt ved ! en kompetitiv radioimmunanalyse med 125l-mærket insulin og insulinstandarder. Resultaterne er angivet som ILM secerneret pr. ml kultur og som ILM secerneret pr. ml normaliseret til en kultur celletæthed med en absorbans på i ved bølgelængden 650 rim.

10

Eksempel II

I dette eksempel sammenlignes ekspressionen af en α-faktor leder konstruktion i fuld længde og med alle glycosyleringssteder med en ekspressionskon-15 struktion, der indeholder en trunkeret α-faktor sekvens, som kun bevarer et i DK 176075 B1 26 enkelt glycosyleringssted ved Asn23. Det i dette eksempel anvendte ikke-gærprotein er en human-proinsulinana-log, hvor det forbindende nC"-peptid er blevet erstattet med et gær KEX2-endopeptidase-spaltningssted.

5 A. PYGAIC3

Plasmidet pGAIC3 blev fremstillet ved at udskifte det 231 bp lange Hind III-Sal l-fragment i pGAII, der koder for aminosyreme 14 til 30 i B-kæden, C-peptidet, A-kæden og 2-translationsstopcodoner, med et 132 bp langt synte- 10 tisk Hind Ill-Sal l-genfragment (vist i figur 3), som koder for aminosyreme 14 til 30 i B-kæden, et Lys-Arg KEX2-endopeptidase-spaltningssted, A-kæden og translationsstop codonerne. Plasmidet pYGAIC3 blev fremstillet ud fra pGAIC3 på følgende måde.

15 Plasmid pGAIC3 blev fordøjet med Barn Hl, og den 1107 bp lange Bam Hl-ekspressionskassette, som indeholdt GAPDH-promotoren, den sekvens, som koder, for α-faktor lederen koblet til proinsulinanalogen, og a-faktortranskriptionsterminatoren, blev isoleret og ligeret ind i Bam Hl-fordøjet og phosphatasebehandlet pAB24, og blev derefter klonet i E. coli. Der blev 20 opnået et plasmid pYGAIC3, i hvilket ekspressionskassetten var således orienteret, at GAPDH-promotoren var proximalt det unikke Sal l-sted i vektoren.

B. pYaFi 7C3 25 Plasmid pYaFL7C3 indeholder DNA, som koder for den for pYGAI7 oven for beskrevne trunkerede α-faktor leder koblet til sekvensen for proinsulinanalogen, som også er beskrevet ovenfor (pYGAIC3). Dette plasmid blev konstrueret på følgende måde. 1 Først blev pGAIC3 skåret med Hind III og Sal I, og der blev gelisoleret et 132 bp langt fragment. Dette fragment indeholdt sekvenser, som koder for alle DK 176075 B1 27 med undtagelse af de første 12 codoner i proinsulinanalogen. Det blev ligeret ind i et gelisoleret 4640 bp langt fragment fra Hind III- og Sal l-fordøjet pGAI7 til tilvejebringelse af plasmid pYaFL7C3. Efter kloning i E. coli blev dette plasmid skåret med Barn Hl, og der blev gelisoleret et 1062 bp langt 35 Barn 5 Hl-fragment. Denne ekspressionskassette indeholdt den trunkerede a-faktor lederkonstruktion pGAI7 med proinsulinanalogen i stedet for den normale proinsulinsekvens. Ekspressionskassetten blev derefter ligeret ind i Barn Hl-stedet i pAB24, som ovenfor beskrevet, til frembringelse af pYaFL7C3.

10 Sammenlignende ekspression

Der blev bestemt ekspressionsniveauer for pYGAIC3 og pYaFL7C3 i S. cere-visiae. Stamme AB103.1 er blevet beskrevet i eksempel I. Stamme ABJ10-4 er et derivat af Saccharomyces cerevisiae stamme AB110 (Mata, Ieu2, ura3-15 52, pep4-3, his4-580(cir°)), i hvilket der er blevet indført en deletion i pep4- genet. Disse stammer blev transformeret som ovenfor beskrevet med plasmideme pYGAIC3 og pYaF|_7C3, og der blev selekteret ura-prototrofe stammer. Inoculumkulturer blev dyrket i SD-leu (Sherman et al., se ovenfor) ved 30°C i 24-48 timer, blev derefter pelleteret ved centrifugering, blev vasket 20 og fortyndet 20 gange i ura medium (beskrevet ovenfor) og blev dyrket i 48-72 timer ved 30°C. Cellefrit konditioneret kulturmedium blev fremstillet ved centrifugering til analyse i en kompetitiv insulin-radioimmunanalyse.

Resultaterne er vist i tabel 3. Som det fremgår, medierer den trunkerede a-25 faktor konstmktion forøget secernering af immunoreaktiv proinsulinanalog sammenlignet med den naturlige α-faktor ledersekvens.

DK 176075 B1 28 TABFL 3

Secernering af ILH fra en proinsulinanalogkonstruktion medieret af en trunkeret o-faktor feder eller en naturlig et-faktor leder

Transformant Antal _ ILM^ _ forsøg1^ mg/ml_ mg/ml .ODc:o_

Område Gen. Std. Område Gen. Std.

afv. afv.

ABI 03.1 (pYGAIC3) 6 1-2,75 1,65 0,65 0,11-0,20 0,14 0,04 AB103.1 (pYaFL7C3) 6 1,5-6,63 4,46 2,15 0,14-0,60 0,40 0,19 AB110.4 (pYGAIC3) 3 1,15-1,4 1,28 0,13 0,10-0,12 0,11 0,01 ABI 10.4 (pYaFL7C3) 3 2,15-4,12 3,46 1,14 0,19-0,38- 0,31 0,10 1) Der blev undersøgt et minimum på tre uafhængige transformanter.

5 2) Secerneret, krydsreaktivt insulinlignende materiale (ILM) blev bestemt ved en kompetitiv radioimmunanalyse med 125 l-mærket insulin og insulinstandarder. Resultaterne er angivet som mængder af ILM pr. ml kultur og som mængde secerneret pr. ml normaliseret til en celletæthed med en absorbans på 1 ved bølgelængden 650 nm.

Eksempel III

10 DK 176075 B1 29 I dette eksempel beskrives konstruktionen af en trunkeret α-faktor ekspressionsvektor, som medierer forøgede ekspressionsniveauer af aktiv insulinlignende vækstfa ktor-1.

5 Der blev først fremstillet en DNA-sekvens, som koder for en trunkeret a-faktor leder og en kodende sekvens for IGF1. En syntetisk sekvens blev fremstillet ved standardmetoder under anvendelse afen “Applied Biosystems 380A DNA-syntesemaskine i overensstemmelse med leverandørens retningslinier. Der blev syntetiseret 14 DNA-sekvenser med en længde på fra 10 22 til 57 baser, de blev oprenset ved PAGE og individuelt phosphoryleret med T4-kinase i nærværelse af ATP. Sekvenserne blev derefter annelleret (eng.: annealed) og ligeret ved standardprocedurer.

Sekvensen af det syntetiske gen er vist i figur 5. Det oprensede, syntetiske 15 genfragment blev klonet i Nco l/Sal 1-fordøjet pBS100 (beskrevet nedenfor).

Det fremkomne plasmid blev kaldt pBS100 TaFJGFI.

Plasmid pBS100 indeholder en gærekspressionskassette klonet i et pBR322-derivat, pAB12. Ekspressionskasseten indeholder hybrid ADH-2/GAPDH-20 promotoren og GAPDH-terminatoren, som flankerer et ikke-essentielt gensegment. ADH-2/GADPH-promotoren er et 1200 bp langt Bam Hl-Nco I-fragment isoleret fra pJS103 (se nedenfor), og GAPDH terminatoren er et 900 bp langt Sal Ι-Bam 111-fragment isoleret fra plasmid pPAGi. EPO publikation nr. 164.556. Plasmid pBS100 indeholder også et ikke-essentielt frag-25 ment mellem Nco I- og Sal I- stederne, hvilket fragment erstattes med de genfragmenter, som har interesse. Ekspressionskassetten kan fjernes fra pBS100 ved fordøjelse med Barn Hl og klones i gærfærgevektorer til indføring i gærceller.

30 Plasmid pJSI03, der indeholder hybrid-ADH*2/GAPDG-promotoren, som er DK 176075 B1 30 anvendt ovenfor, blev konstrueret på følgende måde. ADH-2-delen af promotoren blev konstrueret ved at skære et plasmid, som indeholder vildtype ADH2-genet fra plasmid pADR2 (Beier et al. (1982), Nature 300:724-728) med restriktionsenzymet Eco R5, som skærer ved position +66 i forhold til 5 ATG-startcodonen, såvel som i to andre steder i ADR2, uden for ADH2-området. Den fremkomne blanding af et vektor fragment og to mindre fragmenter blev omsat med Bal3l-exonuclease til fjernelse af ca. 300 bp. Syntetiske Xho 1-linkere blev ligeret med det Bal3l-behandlede DNA. Det fremkomne DNA-linker-vektor fragment (ca. 5 kb) blev adskilt fra linkerne ved søjle-10 kromatografi, blev skåret med restriktionsenzymet Xho I, blev genligeret og anvendt til at transformere E. coli til ampicillinresistens. Positionerne af Xho 1-linkeren blev bestemt ved DNA-sekventering. Et plasmid, som indeholdt en Xho 1-linker i det ikke-transkriberede 5 5’-område af ADH2-genet (position -232 fra ATG) blev skåret med restriktionsenzymet Xho i, biev behandlet med 15 nuclease SI og blev derefter behandlet med restriktionsenzymet Eco RI til frembringelse af et lineært vektormolekyle med i stump ende ved Xho 1-linkeren og en Eco Rl-ende. GAPDH-delen af promotoren blev konstrueret ved at skære plasmid pPGAP ( publikation nr. 164.556) med enzymerne Barn Hl og Eco RI efterfulgt af isolering af et 0,4 kbp langt DNA-fragment. Dette 20 oprensede fragment blev derefter fuldstændigt fordøjet med enzymet Alu I, og der blev isoleret et ca. 200 bp langt fragment. Dette GAPDH-promotorfragment blev ligeret med det ADH-2-fragment, som var til stede på den ovenfor beskrevne lineære vektor, til frembringelse af plasmidet pJS103. 1 2 3 4 5 6

Der blev isoleret et Bam Hl-fragment fra pBS100TaFL IGF1. Dette fragment 2 indeholdt ADH2/GAPDH-prornotoren, en trunkeret α-faktor leder (AA 1-25, 3 81-83), et LysArg-processeringssted, en kodende sekvens for JGF1 og 4 GAPDH-terminatorsekvensen. Dette Barn Hl-fragment blev derefter klonet i 5 pAB24, som tidligere var blevet fordøjet med Barn Hl. Der blev udvalgt en 6 positiv klon, og medens den i starten blev kaldt plasmid 18.5, blev den derefter kaldt pYLUJGFI-55. (Se figur 6).

DK 176075 B1 31

Der blev også fremstillet en anden ekspressionsvektor, pYLUIGFI-24, ved hjælp af analoge metoder. Et restriktionskort er vist i figur 7. Denne vektor ligner pYLUIGF1-55 med undtagelse af, at den til styring af secernering har en α-faktor i fuld længde med tre glycosyleringssteder (sammenlign eksem-5 pel I.A.) og α-faktor terminatoren.

Gærstammen AB110 (EPO publikation nr. 164.556) blev transformeret med pYLUIGF1-55 og pYLUIGF1-24 ved traditionelle spheroplastdannende metoder (Hinnen et al. (1978), Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 75:1919-1933), og eks-10 pression blev sammenlignet.

Ekspressionen af IGFI fra AB110 (pYLUIGF1-55) og AB110 (pYLUIGFI-25) er ikke-konstitutiv. Induktion af IGF1 -ekspression blev opnået ved at tilvejebringe en lav koncentration af glucose i vækstmediet. Under standardbetin-15 gelser udnytter rysteflaskekulturer (25 ml) fuldt ud glucosen i mediet 18-24 timer efter inokulering. 25 ml Kultur af AB110 (pYLUIGF1-55) og AB110 (pXLUIGF1-24) blev således dyrket under standardbetingelser i 72 timer. Supematantprøver blev taget 49 og 72 timer efter inokulering og blev analyseret for biologisk IG F1 -aktivitet (RRA) og for immunoreaktivitet (RIA) med 20 antistoffer mod AGF1. Som det fremgår secernerede pYLUIGF1-55 med et trunkeret α-faktor lederprotein, hvoraf en væsentligt større fraktion var biologisk aktiv. Skønt pYLUIGF1-24 secernerede mere protein, som udviste reaktivitet med IFG1-antistoffer, var relativt lidt af dette protein biologisk aktivt.

25 Resultaterne er vist i tabel 4. Radioreceptoranalysen (RRA) måler IGF-1’s evne til at bindes til dens receptor. Dette er et mål for det rekombinerede po-lypeptids biologiske aktivitet, eftersom det formodes, at IGF-1 udviser hele sin aktivitet via dens receptor. Receptoranalysen er beskrevet i Marshall et al. (1974), J.Clin. Endocrinol. Metab. 19:283-292. Radioimmunoanalysen 30 (RIA) er en kompetitiv analyse, der måler mængden af protein, som antigent DK 176075 B1 32 krydsreagerer med nativ IFG-1, hvad enten det er biologisk aktivt eller ej. Analysen er beskrevet i Zapf et al. (1981), 3. Clin. Invest. 68:1321-1330.

TABEL 4

Secernering af IFG1 medieret af en tunkeret o-faktor leder eller en naturlig q-faktor leder

Transformant 49 timer 72 timer

RRA1) RIA2) RRA RIA

ABI 10 (pYLUIGFl-55) 1,0 14 1,3 14 ABI 10 (pYLUIGFl-24) 1,3 54 2,7 66 1) mg/ml 2) mg/ml 5 Deponering af biologiske materialer Følgende ekspressionsvektorer blev deponeret hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockwille, Maryland, USA, og vil blive opretholdt under retningslinierne ifølge Budapesttraktaten. Depone-10 ringsnumrene og datoerne for deponeringen er angivet nedenfor.

Deponeret materiale ATCC-nr. Deponeringsdato E. coli (pYGAI7) 67597 29/12/87 E. coli (pYaFL7C3) 67596 29/12/87 E. coli (pYLUIGFl-55) 67595 29/12/87 DK 176075 B1 33

Disse deponeringer er foretaget af hensyn til en fagmand. Disse deponeringer er hverken en indrømmelse af, at sådanne deponeringer er nødvendige til udøvelse af den foreliggende opfindelse, ej heller at ækvivalente udførelsesformer ikke ligger inden for en fagmands område på baggrund af den fo-5 religgende beskrivelse. Den offentlige tilgængelighed til disse deponeringer er ikke en tildeling af licens til fremstilling, anvendelse eller salg af de under dette patent eller et andet patent deponerede materialer. Nukleinsyresekven-serne i de deponerede materialer er inkorporeret i den foreliggende beskrivelse ved henvisning og er de styrende, hvis der er konflikt med nogen som 10 helst af de her beskrevne sekvenser.

Om end ovennævnte opfindelse er blevet beskrevet i nogen detalje for at illustrere opfindelsen, er det indlysende, at ændringer og modifikationer kan foretages af en fagmand inden for de tilhørende kravs rækkevidde.

Claims (38)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant protein, hvilken metode omfatter: 5 (1) frembringelse af en gær celle omfattende en DNA konstruktion, der tilve jebringer ekspression og secernering af et ikke-gærprotein, hvor DNA-konstruktionen omfatter (i) en gærgenkendende transkriptions initieringssekvens, som i 5' enden er linket til (ii) en kodende sekvens under styring både af den gærgenkendende transkriptions initieringssekvens, og af (iii) en gær-10 genkendende transkriptionsterminerings sekvens, hvilken terminerings sekvens er linket i 3’ enden til den kodende sekvens, - hvor den kodende sekvens koder for et forstadie polypeptid, der omfatter en ledersekvens og et ikke-gær protein koblet sammen ved et processerings-sted, hvilket processeringssted sikrer at ikke-gær proteinet kan spaltes fra 15 forstadie polypeptidet, ledersekvensen udgør de første ca. 25 til 50 N-terminale aminosyrerester af et Saccharomyces eller Kluyveromyces a-faktor leder polypeptid, og omfatter et enkelt Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie glycosyleringssted, samt et enkelt Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie peptid omfattende de første ca. 19 til ca. 23 20 N-terminale aminosyrerester af α-faktor forstadiet, og (2) dyrkning af denne gær celle under betingelser som tilvejebringer ekspression og secernering af ikke-gær proteinet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at ikke-gær proteinet er et 25 pattedyrprotein eller et forstadie til human insulin. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at forstadiet til human insulin er human proinsulin. 2 DK 176075 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at forstadiet til humaninsulin omfatter insulin a-kæde og insulin b-kæde koblet sammen af et gærgenkendt processeningssted, som spaltes in vivo.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at processerings- stedet spaltes af KEX2-genproduktet af Saccharomyces.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at pattedyrproteinet er insulinlignende vækstfaktor I. 10

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at gærcellen er fra slægten Saccharomyces.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at gærcellen er S. 15 cerevisiae.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor lederpolypeptidet er fra S. cerevisiae MFa1.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ledersekvensen ud gør de første ca. 28 til 40 N-terminale aminosyrerester, fortrinsvist de første 35 sammenhængende N-terminale aminosyrerester af et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor lederpolypeptid.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant protein, kendetegnet ved at den omfatter (1) transformering af gær celle med en DNA konstruktion, der tilvejebringer ekspression og secernering af et ikke-gærprotein, hvilken DNA konstruktion omfatter et dobbeltstrenget DNA molekyle, som omfatter et område, der ko-30 der for et forstadiepolypeptid, som kan secerneres af en gærvært, hvilket område under henvisning til en af strengene omfatter strukturen: 3 DK 176075 B1

5,-AF-CH0-Xn-S-gen*-3' hvor - AF koder for et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor signal peptid; - CHO koder for et glycosyleringssted, som omfatter aminosyre sekvensen 5 Asn-Y-Y’, hvor Y er en aminosyre og Y’ er Thr eller Ser; - Xn koder for et afstandspolypeptid med en længde på n aminosyrer, som ikke indeholder et glycosyleringssted eller et processeringssted, som gør det muligt for gæren at spalte forstadiepolypeptidet in vivo, - n er et helt tal på fra 0 til ca. 30, 10. gen* koder for et ikke-gærprotein, og - S koder for et processeringssted, som muliggør afspaltning af forstadiepolypeptidet, og (2) dyrkning af denne transformerede gær celle under betingelser, som sikrer ekspression og secernering af ikke-gær proteinet. 15

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at AF koder for et polypeptid på ca. 19 til 23 aminosyrer.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at n er et heltal 20 fra ca. 0 til ca. 20, fortrinsvist fra ca. 0 til ca. 10, mest fortrinsvist fra ca. 3 til ca. 10.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at gær værten er Saccharomyces. 25

15. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor signal peptidet er et Saccharomyces signal peptid. 4 DK 176075 B1

16. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at S koder for et processeringssted, der kan genkendes in vivo af gær værten.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at S koder for et 5 dipeptid, som genkendes af KEX2-endopeptidasen.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at dipeptidet er 5’-Lys-Arg-3’ eller 5’-Arg-Arg-3’.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 11,kendetegnet ved, at DNA moleky let omfatter et replicon.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det område, der koder for et forstadiepolypeptid, er under styring af gærgenkendte 15 transkriptionsinitierings- og termineringssekvenser, og at repliconen er en gærreplicon.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19 eller 20, kendetegnet ved, at repliconen er et plasmid eller et kromosom. 20

22. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant protein, kendetegnet ved at den omfatter: (1) transformering af gær celle med en DNA konstruktion, der tilvejebringer ekspression og secernering af et ikke-gærprotein, hvilken DNA konstruktion 25 omfatter et dobbeltstrenget DNA molekyle omfattende en nukleotid sekvens, der koder for de første ca. 25 til ca. 50 sammenhængende N-terminale aminosyrer af en Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie ledersekvens, som omfatter netop ét Saccharomyces eller Kluyveromyces a-faktor forstadie ledersekvens glycosyleringssted, og 30 (2) dyrkning af denne transformerede gær celle under betingelser, som sikrer ekspression og secernering af ikke-gær proteinet. 5 DK 176075 B1

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at nukleotid sekvensen koder for de første ca. 25 til ca. 40, fortrinsvist de første ca. 35, mest fortrinsvist de første ca. 28, sammenhængende N-terminale aminosyrer af en

5 Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie ledersekvens, som omfatter netop ét gær α-faktor forstadie ledersekvens glycosyleringssted.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nukleotid sekvensen koder for aminosyrerne 1-25 linket til aminosyrerne 81-83 i en Sac- 10 charomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie ledersekvens.

25. Dobbeltstrenget DNA-molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter et område, der koder for et forstadiepolypeptid, som kan secerneres af en gærvært, hvilket område under henvisning til en af strengene omfatter strukturen: 5'-AF-CHO-X -S-geri*-3' 15. n . hvor - AF koder for et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor signal peptid: - CHO koder for et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor glycosyleringssted;

20. Xn koder for et afstandspolypeptid med en længde på n aminosyrer, som ikke indeholder et glycosyleringssted eller et processeringssted, som gør det muligt for gæren at spalte forstadiepolypeptidet in vivo, - n er et helt tal på fra 0 til ca. 30, - gen* koder for et ikke-gærprotein, og

25. S koder for et processeringssted, som muliggør spaltning af forstadiepoly peptidet. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 11 eller dobbeltstrenget DNA molekyle ifølge krav 25, kendetegnet ved, at CHO koder for et Saccharomyces eller

30 Kluyveromyces α-faktor glycosyleringssted. 6 DK 176075 B1

27. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at gær værten er S. cerevisiae.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at leder kon struktionen AF-CHO-Xn-S er de første ca. 25-40, fortrinsvist de første ca. 28-40, mest fortrinsvist de første ca. 35-40, sammenhængende N-terminale rester af et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor signal peptid.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at ikke-gær proteinet er human proinsulin.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved, at DNA konstruktionen er et plasmid pYGAI7 (ATCC Accession Number 67597). 15

31. Fremgangsmåde ifølge krav 29, kendetegnet ved, at humaninsulinen omfatter insulin a-kæde og insulin b-kæde koblet sammen af et gærgenkendt processeringssted, som spaltes in vivo af KEX2 genproduktet af Saccharomyces. 20

32. Fremgangsmåde ifølge krav 31,kendetegnet ved, at DNA konstruktionen er et plasmid pY.alfa.f|_7C3(ATCC Accession Number 67596).

33. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at lederkonstruk-25 tionen AF-CHO-Xn-S er aminosyrerne 1-25 linket til aminosyrerne 81-83 i et Saccharomyces eller Kluyveromyces α-faktor forstadie ledersekvens.

34. Fremgangsmåde ifølge krav 33, kendetegnet ved, at ikke-gær 30 proteinet er insulinlignende vækstfaktor I. 7 DK 176075 B1

35. Fremgangsmåde ifølge krav 34, kendetegnet ved, at DNA konstruktionen er et plasmid pYLUIGFI-55 (ATCC Accession Number 67595).