PT89367B - Melhoramentos na expressao e secrecao de proteinas heterologas em levedura utilizando sequencias guias alfa-factor truncadas - Google Patents

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PT89367B
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Description

(57) Resumo:
IIML7WO I niHL
DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES
77< '
X 7 , '40/260
FOLHA DO RESUMO
Modalidade e n.° (íj) T D
Data do pedido: (22)
Classificação Internacional (51)
Requerente (Q) :
CHIRON CORPORATION, norte americana (Estado da Califórnia), industrial e comercial, com sede em 4560 Horton Street, Emeryville, Califórnia 94608, Estados Unidos da América
Inventores (72):
Patrícia Tekamp-Olson , cientista norte americana, residente em 1426 43rd Avenue, San Francisco, Califórnia 94122, Estados Unidos da América .
nAo preencher as zonas sombreadas
Reivindicação de prioridade(s) @ Figura (para interpretação do resumo)
Data do pedido Pais de Origem N.° de pedido
30.Dez.1987 E.U.A. 139.682
Epígrafe: (54)
MELHORAMENTOS NA EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE PROTEÍNAS HETEROLOGAS EM LEVEDURA UTILIZANDO SEQUÊNCIAS GUIAS ALFA-FACTOR TRUNCADAS
Resumo: (máx. 150 palavras) @
Este invento refere-se a um sistema de expressão o<-factor de levedura, que e' composto por uma sequência guia truncada, contendo 0 péptido de sinal r<-factor e um local de glicosilação, ligados por um local de processamento a uma 'sequência que codifica a proteína isenta de levedura.
TITULAR: CHIRON CORPORATION
EPÍGRAFE:MELHORAMENTOS NA EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS EM LEVEDURA UTILIZANDO SEQUÊNCIAS
GUIAS ALFA-FACTOR TRUNCADAS
MEMÓRIA DESCRITIVA
Campo Técnico
A presente invenção refere-se à produção de proteínas recomblnantes em levedura. Mais particularmente, a presente invenção destina-se a um sistema de expressão de o<-factor melhorado que proporciona a secreção de proteínas heterólogas a partir de células hospedeiras de levedura.
Antecedentes
Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-94 3 revela a primeira clonagem e formação de sequência de um gene que codifica um gene precursor o^-factor de levedura. Kurjan et al., na Patente Norte-Americana N® 4.546.082, também relata a clonagem deste gene, e sugere que a sequência guia «χ-factor pode ser em pregada para dirigir a secreção de proteínas heterólogas em levedura. A patente, todavia, não contém dados que possam indicar que os requerentes tivessem usado com êxito o guia e/-factor para expressar e segregar uma proteína heteróloga em levedura.
A publicação da EPO N? 116.201 descreve a primeira aplicação com êxito do guia (χ'-factor para dirigir a expressão e secreção de uma proteína heteróloga, factor de desenvolvimen to epidérmico, a partir de uma levedura transformada. Subsequentes a este trabalho, existem relatórios adicionais da expressão de proteínas heterólogas em levedura empregando o guia oç-factor. Ver, por exemplo, El1io 11 et al. (1983) Pr o c. Na t 1 1 Acad. Sei. E.U.A. 80;7080-7084; Bitter et al. (1984) Proc.
Nat'l Acad. Sei. E.U.À. 81 ; 5330-5 3 34; Smith et al. (1985) Science 229:1219-1229; Publicação das EPO N?s 114.695; 123.228;
123.294; 123.544; 128.773 e 206.783. Ver também Brake et al . em Protein Transport and Secretion, p, 103 (J.M. Gething ed. 1984).
Os sistemas de expressão nos relatórios acima iri dicados produzem um guia tf-factor de comprimento completo fun dido até uma proteína heteróloga. Embora o trabalho acima mencionado demonstre que o sistema de expressão ^-factor é grandemente útil, não é geralmente prognosticável antes de se rea lizar a experiência se uma proteína heteróloga particular será segregada com êxito, processada e biologicamente activa. Ver, por exemplo, EPO 206.783, supra, págs. 2-5; Rothblatt et al. (1987) EMBO J. 6: 3455-3463; V.L. MacKay, Secretion of Hetero logous Proteins in Yeast (na prensa).
Têm aparecido vários relatórios, com base em dados não publicados, cujas anulações a partir da região pro do guia ^-factor (entre o péptido de sinal e o primeiro espaçador) provocam declínios substanciais na quantidade de proteína isenta de levedura segregada pela levedura transformada pelas formações heterólogas. Sidu et al . (1987) Gene 5^*175-184, relata que a fosfatase de ácido de levedura (PH05) θ segregada dentro do meio a partir de uma formação heteróloga empregando tanto um guia e>(-factor de comprimento completo, como um guia
-factor truncado, mas aqueles níveis de expressão são 3-4X menos que o gene PH05 sob o controle do seu guia homólogo. Foi também referido que anulações no gene precursor prepro- t^-fac tor resulta em declínios substanciais na secreção do péptido
-factor nativo. Ver, por exemplo, V.L. MacKay, supra; Rothblatt et al., supra.
Existe, portanto, uma necessidade de melhorar o sistema de expressão o<-factor, particularmente para aplicações de proteínas isentas de levedura que não são produzidas eficien temente por formações de expressão c^-factor correntes.
Sumário da invenção
Verificou-se surpreendentemente que uma forma truncada da sequência guia do o(-factor pode eficientemente dirigir a expressão e secreção dos polipéptidos heterólogos em levedura. Particularmente surpreendente é a descoberta de que as sequências guias do o^-factor truncadas podem substancialmente melho rar a eficiência de expressão de tais proteínas heterólogas , em relação aos sistemas de expressão utilizando o comprimento total do guia oç-factor, isto é, níveis mais elevados de processarnento
N-terminal correcto, secreção de proteínas heterólogas em que uma maior percentagem das moléculas são biologicamente activas, etc. Estes resultados são particularmente surpreendentes em vista de relatórios em que anulações a partir da sequencia guia do precursor oí-factor resultam em níveis decrescentes de secreção do o<-factor activo.
presente invento proporciona, portanto, formações de expressão alternativas com base no <x-factor, as quais são particularmente úteis para a expressão de polipéptidos heteró logos que são quer ineficientemente expressos por formações guia o(-factor de comprimento total, ou não são expressos de qualquer modo por tais formações de comprimento total.
Numa forma de realização, o presente invento é d_i rígido a uma célula de levedura que compreende uma formação DNA que proporciona a expressão e secreção de uma proteína isenta de levedura, compreendendo a referida formação de DNA, uma sequência que codifica sob o controle de sequências de in_i ciação e terminação de transcrição de levedura reconhecida, co dificando a referida sequência de codificação um polipéptido precursor constituído por uma sequência guia e a referida proteína isenta de levedura ligada por um local de processamento, que proporciona a clivagem da referida proteína isenta de leve dura,a partir do referido polipéptido precursor, em que a refe rida sequência guia é de cerca de 25 a cerca de 50 resíduos N-terminal do referido polipéptido precursor,e compreende o pép tido sinal de um precursor t><-factor de levedura e um único ljo cal de glicosilação.
Numa outra forma de realização, a presente invenção é destinada a uma molécula DNA de dupla fibra compreendendo uma região codificando um polipéptido precursor segregável por um hospedeiro de levedura, tendo a referida região, com re ferência a uma das fibras de DNA, a estrutura:
5’-AF-CH0-Xn-S-Gene*-3' na qual
AF codifica um
CIIO codifica um
X cod i f i ca um
π
primento, que
não contém um local peptido sinal oç-factor de local de glicosilação;
polipéptido de aminoácidos ou um local de processamento, que clivagem do referido polipéptido levedura;
n,em comde glicosilação proporciona pre cursor in vivo por levedura;
é um número inteiro de a cerca de 30;
Gene* codifica uma proteína isenta de levedura,
S codifica um local de processamento que proporciona clivagem do referido polipéptido precursor.
presente invento refere-se,também, a métodos de emprego das células acima e formações L)NA para produzir proteí nas recombinantes, assim como as composições de proteínas recombinantes produzidas pelos métodos acima. Outras formas de realização serão também facilmente evidentes para os normalmen te entendidos na técnica
Descrição das Figuras
A Figura é um diagrama de fluxo mostrando a cons trução de pYBCA5» ® ambas as sequências de nucleótido e de ami noácido do gene proinsulina sintético empregado no Exemplo
I.
Os vários oligonucleótidos sintéticos usados na formação são delineados por marcas negras. As setas acima da sequência mostram o início e o fim das cadeias de proinsulina
B,
As caixas marcam os locais de processamento dibásico.
Figura 2 é uma sequência de nucleótido aminoáeido de um oligonucleótido sintético codificando um guia o(-fa£ tor modificado, e os primeiros 13 aminoácidos do gene proinsu lina usados para construir pYGA!3 no Exemplo I. 0 guia -factor modificado teve os locais de glicosilação removidos mudando o s codões p°r Asn23>57j67 para codificar Gin (encaixado), a sequência codificando o local endopeptida se KEX2 e o N-terminus de proinsulina humana.
A Figura 3 mostra o gene sintético do fragmento pYGAIC3 codificando o análogo proinsulina, em que um local endopeptidase KEX2 substitui o péptido C (encaixado). 0 fragmento 133 bp sintético referido no Exemplo II é definido pelas l_i nhas vertical e horizontal através da sequência de nucleótido.
A Figura 4 é um mapa de restrição do vector pAB24 de ida e volta de levedura.
A Figura 5 mostra a sequência DNA do gene sintético codificando o IGF1 descrito no Exemplo III.
A Figura 6 é um mapa de restrição de pYLUIGFl-55, um vector de expressão descrito no Exemplo III codificando IGF1 sob o controle de um guia (χ-factor truncado.
A Figura 7 é um mapa de restrição de pYLUIGFl-24, um vector de expressão descrito no Exemplo III codificando IGF1 sob o controle de um guia (χ-factor de comprimento completo com três locais de glicosilação.
Descrição Pormenorizada
A prática do presente invento empregará, a menos que seja indicado de outro modo, técnicas de biologia molecular, microbiologia e recombinante DNA convencionais, dentro do conhe cimento do ramo. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Vols. I & II (D.N. Glover, ed, 1985); Oligonucleotide Synthesi s (M.J. Gait, ed 1989); Transcription and Translation (B.D. Harnes & S.J. Higgins, eds. 1989); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Na descrição do presente invento, será utilizada a seguinte terminologia de acordo com as definições indicadas abaixo.
Um replicão é um elemento genético (por exemplo, plasmídeo, cosmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como uma unidade autónoma de replicação DNA in vivo, isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controle.
Um vector é um replicão tal como um plasmídeo, fage, ou cosmídeo ao qual outro segmento DNA pode ser ligado, de modo a realizar a replicação do segmento ligado.
Uma molécula DNA de dupla fibra refere-se à forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timi^ dina , ou citosina) na sua espiral normal, ou de dupla fibra. Este termo refere-se apenas a uma estrutura primária e secunda ria da molécula, e não limita a mesma a quaisquer formas terciárias particulares. Assim, este termo inclui DNA de dupla fi^ bra encontrada, entre outras, em moléculas DNA lineares (por exemplo, fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos, e cromossomas. Na discussão da estrutura de uma molécula DNA particu lar com dupla fibra, serão aqui descritas sequências de acordo com a convenção normal para dar apenas a sequência na direcção 5' a 3' ao longo da fibra não transcrita de DNA, isto é, tendo a fibra uma sequência homóloga à da mRNA produzida a partir de uma sequência de codificação particular.
Uma sequência que codifica DNA é a sequência DNA que pode ser transcrita e traduzida num polipéptido in vivo, quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. As demarcações da sequência de codificação são determinadas por, e incluem o codão de partida da transia ção no terminus 5' (amino), e um codão de paragem de translação no terminus 3' (carboxi). Uma sequência que codifica pode incluir, mas não está a elas limitada, sequências DNA procari óticas, sequências DNA virais, sequências cDNA ou DNA genómi^ cas, a partir de fontes eucarióticas (por exemplo, mamíferos), e mesmo sequências DNA sintéticas.
Sequências de iniciação e terminação da transcri. ção de levedura reconhecida refere-se a regiões reguladoras de DNA que flanqueiam uma sequência que codifica, e são responsáveis pela transcrição em levedura de um homólogo mRNA, para a sequência que codifica, a qual pode ser então traduzida no polipéptido codificado pela sequência que codifica. As sequências de iniciação de transcrição incluem sequências prc> motoras de levedura, que são sequências reguladoras de DNA ca pazes de ligar polimerase RNA de levedura numa célula e iniciação da transcrição de uma sequência que codifica a jusante (direcção 3'). Com o fim de definir a presente invenção, a s£ quência promotora está demarcada (e exclui) no seu terminus
3' pela translação do codão de partida de uma sequência de co dificação, e estende-se a montante (direcção 5'), para incluir o número mínimo de nucleótidos ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima dos antecedentes. Dentro da sequência do promotor será encontrado um local de iniciação de transcrição (convenientemente defini_ do por delineamento com nuclease Sl), assim como domínios de proteína ligação (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da levedura polimerase RNA. Os promotores úteis no presente invento, incluem o promotor -factor do tipo selva gem, assim como outros promotores de levedura. Particularmen te preferidos são os promotores envolvidos com os enzimas numa passagem glicolítica, por exemplo, fosfoglucoisomerase, fosfo fructoquinase, fosfotrioseisomerase, fosfoglucomutase, enolase, quinase pirúvica, deshidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato, deshidrogenase de álcool, assim como híbridos destes promotores. Ver, por exemplo, Publicação EPO N?s 120.551; 164.556.As sequências de iniciação de transcrição podem também incluir re giões de regulação responsáveis pela regulação ou intensifica ção do promotor. De maneira análoga, uma sequência de terminador de transcrição, localizada 3' para o codão de paragem de translação, pode ser quer do tipo selvagem de sequência de terminação de transcrição <Y-factor quer de outra sequência de terminação reconhecida de levedura, tais como as provenientes dos genes para os enzimas glicolíticos acima.
Uma sequencia de codificação está sob o controle das sequências de iniciação da transcrição e de terminação, quando a polimerase RNA liga a sequência de iniciação de tran£ crição, e transcreve a sequência de codificação em mRNA termi nando na sequência de terminação de transcrição e o mRNA é então traduzido para o polipéptido codificado pela sequência que codifica (isto é, expressão). 0 polipéptido precursor codificado pelas sequências de codificação do presente invento é segregado quando,pelo menos uma porção,(normalmente uma proteína isenta de levedura na ausência da sequência guia) é transportada extracelularmente, onde a mesma é encontrada no meio de desenvolvimento de célula. Usualmente, é apenas gregada a porção de proteína precursora, a jusante, da sequên cia guia, e esta porção, a jusante, pode também ser submetida a um processamento adicional durante a secreção , tal como clivagem pro teo lí ti ca , gl i co sila ção , dobragem, formação de l_i gação de dissulfito, etc.
Uma célula foi transformada por DNA exógeno quando tal DNA exógeno tinha sido introduzido dentro da parede da célula. 0 DNA exógeno pode ou não ser integrado (co-valentemente ligado) a DNA cromossómico compondo o genoma da cé^ lula
O DNA exógeno pode ser mantido extracromossomicamente num replicão tal como um plasmídeo.
Quando DNA exógeno se tor nou integrado até ao cromossoma, o mesmo é herdado por células irmãs,através de replicação do cromossoma. Uma célula que tenha sido transformada pelo DNA exógeno,que está integrada no cromossoma,é referida como uma célula transformada de maneira estável”. Um olone ou população clonal é uma população de células derivadas de uma célula única, ou ascendente comum por mitose.
As duas sequências DNA são substancialmente homó
Iogas quando pelo menos cerca de 6o$> (de preferência pelo menos cerca de 75$, e com maior preferência, pelo menos, cerca de 90$) dos nucleótidos emparelham sobre um comprimento defini do das moléculas. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas numa experiência de hibridização a Sul, sob condições de um rigor seleccionado como definido p.a ra aquele sistema particular, A definição de condições apropri adas de hibridização está dentro do conhecimento do ramo. Ver, por exemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning,supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Umaregião heteróloga de uma molécula DNA é um segmento identificável de DNA,dentro de uma molécula maior de DNA,que não é encontrado em associação com a molécula maior em natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica uma proteína de mamífero, a região heteróloga será usualmente flanqují ada por DNA que não flanqueia a sequência DNA de mamífero no genoma do organismo de fonte. Outro exemplo de uma sequência heteróloga de codificação é uma construção em que a própria se quência de codificação não é encontrada em natureza (por exemplo, um cDNA em que a sequência de codificação genómica contém intrões, ou sequências sintéticas tendo codões diferentes provenientes de organismos que codificam a mesma proteína ou uma proteína semelhante). Variações alélicas ou eventos mutacionais que ocorrem naturalmente não dão lugar a uma região heterólo ga de DNA,como aqui utilizada.
Como aqui utilizado, o termo levedura” inclui ie veduras ascoesporogéneas (Endomycetales), leveduras basidioes11 porogéneas e levedura que pertence ao Fungi imperfecti (Blastomycetes). As leveduras ascoesporogéneas são divididas em duas famílias, Spermophthoraceae e Saccharomycetaceae. A últjL ma é constituída por quatro sub-famílias, Schizosaccharomycoi deae (por exemplo, genus Schizosaccharomycss), Nadsonioideae, Lipomycoldeae e Saccharomycoideae (por exemplo, géneros Pichia, Kluyveromyces e Saccharomyces). As leveduras basidioesporogéneas incluem os
Rhodosporidium,
Sporidiobolus
Filobasidium e
Filobas id ie1la
As leveduras que pertencem ao Fungi Imperfecti
Sporobolomycetaceae (por exemplo, géneros Sporobolomyces, Bullera) e Cryptococcaceae (por exemplo, genus Candida). De parti_ cular interesse para a presente invenção são espécies dentro dos géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces
Schizosaccha romyces e Candida. De particular interesse são as espécies Sa£
charomyces S. cerevisiae, S. carisbergensis, S. diastaticus,
S. douglasii, S.kluyveri, S. norbensis e S. oviformis. Espé-
cies de particular interesse no género Kluyveromyces incluem
K, Lactis. Visto que a classificação da levedura pode mudar no futuro, para os fins da presente invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (F.A. Skinner, S.M. Pasmore &. R.R. Davenport eds. 19θθ) (Soc, App. Bacteriol. Symp. Series N? 9). Além do que antecede, os vulgarmente entendidos na técnica estão presumivelmente familiarizados com a biologia de levedura e a manipulação das genjé ticas de levedura. Ver, por exemplo, Biochemistry and Genetict of Yeast (M. Bacila, B.L. Horecker & A.O.M. Stoppani eds.1978); The Yeasts (A.H. Rose & J.S. Harrison eds, 2? ed., 1987); The
Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Strathern et al. eds. 1981). As revelações das referências anteriores são aqui incorporadas como referência.
A presente invenção emprega sequências guia truncadas a partir de um gene <y-factor de levedura. 0 c^-factor é um oligopéptido unindo feromona com cerca de 13 resíduos em comprimento, produzido a partir de um grande polipéptido precursor entre cerca de 100 e 200 resíduos (tipicamente cerca de 120-160) em comprimento (prepro-o<-fac tor) . 0 precursor é cons tituído por uma sequência de sinal hidrofóbica de cerca de 20 resíduos (por exemplo, cerca de 19-23, tipicamente cerca de
20-22), seguida por uma região guia adicional de cerca de 60 re síduos hidrofílicos (a região pro), que é então ligada a várias repetições, umas atrás das outras, da sequência feromona madura (tipicamente cerca de 2-6)' separadas por curtas regiões de espaçador oligopéptido (tipicamente cerca de 6-8 resíduos), o que proporciona o processamento proteolítico para a feromona madura.
A clonagem de vários genes prepro--factor tem sido relatada. Ver, por exemplo
Kurjan et al., patente norte-americana N? 4.546.082
Singh (1983) Nucleic Acids
Res. 11: 4θ49-4θ63; comummente conhecido pedido de patente
N? 88.115, depositado em 27 de Julho de 1988, cujas revelações são aqui incorporadas como referência. Além disso, as sequências DNA codificando o gene prepro-^-factor podem ser identificadas po'r hibridização com sondas a partir de sequências pre pro-oç-factor conhecidas. Ver, por exemplo, Brake et al. (1983)
Molec. & Cell Biol. 3,:1440-1450. 0 «^-factor pode também ser purificado a partir de espécies de levedura, sequenciadas, sondas designadas para clonar o gene prepro- -f ac tor . Ver , por exemplo, McCullough et al. (1979) J.
Bacteriol. 138:146-154;
Sato et al . (1981) Agric. Biol. Chem :1451-1453; Singh et guia (1983), supra. Foi também determinado o<-factor proveniente de uma espécie que a sequência de levedura pode ser funcional em outras especies de levedura.
Ver, por exemplo pedido de patente N? 88.115, supra
Assim, a presente invenção contempla não apenas a utilização de sequências guia tor a partir de levedura em geral, mas também a utilização de tais sequências guia em espécies de levedura heterólogas.Para facilidade de apresentação, contudo, a invenção será discutida em termos do gene prepro-oé-factor MFal a partir de S. cerg_ visiae
Ver, por exemplo, Kurjan et al., patente norte-america na
N? 4.5^6.083;
Singh et al. (1983), supra
A presente invenção emprega formações de
DNA quimér icas codificando polipéptidos precursores híbridos cons tituídos por uma sequência guia e um polipéptido isento de levedura. Para é definida os fins da presente invenção, a sequência guia DNA como começando no codão de partida N-terminal (metio nina) do polipéptido precursor, através do codão que codifica o último resíduo de aminoácido, antes do local de processamento que se interpõe entre a sequência guia e a sequência que co difica a proteína isenta de levedura. A sequência guia da presente invenção é constituída por· uma forma truncada de uma sequência guia (/-factor de levedura, tipicamente cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácido em comprimento. Assim, a s£ quência guia da presente invenção é aproximadamente 30 r e síduos de aminoácido mais curta que o guia «X-factor típico de comprimento total
MFal, por exemplo, contém uma sequência guia de 83 resíduos de aminoácido seguidos por uma sequência espaçadora de hexapéptido que é clivada por enzimas de proces^ sarnento de levedura. Ao fazer anulações da sequência guia é importan te que, pelo menos, um local de glicosilação (-Asn-Y-Thr/Ser-) seja retido para proporcionar uma secreção ef icien te
É também necessário que o guia retenha uma sequência de sinal <x-factor funcional.
Como indicado acima péptido de sinal é usualmente de cerca de 20 aminoácidos em comprimen to , e aspectos característicos incluem um núcleo hidrofóbico. Ver, por exemplo, von Heijne, (1984) J
Mol. Biol.
173:243-251.
Todas as sequências prepro- <<-factor, examinadas presentemente,codificam para um péptido hidrofóbico com cerca de 20 resíduos em comprimento. Embora o comprimento exacto de um péptido de sinal, necessário para dirigir o polipeptido precursor para o caminho secretário não esteja definido, o mesmo é normalmente exigido entre cerca de e cerca de 23 resíduos, sendõ a sequência mínima exigida, facilmente definípelo teste dos mutantes vel de anulação.
Assim, com referência ao MFal, as anulações den-
tro da gama de cerca de 3 0 a cerca de 60 resíd uos, tipicamen-
te entre cerca de 33 e cerca de 58 resíduos, e mais tipicamen
te entre cerca de 48 e cerca de 58 resíduos, s ão contempladas
pela presente invenção
Estas anulações ocorrerão geralmente na região entre, e incluindo resíduos 26 a 83. Prefere-se que as anulações incluam locais de glicosilação nos resíduos
57sequências guia de ctf-factor anuladas podem ser substituídas , em parte, por sequências guia isentas de «<-factor, caso se deseje. As sequências devem geralmente codi.
ficar resíduos de aminoácido hidrofílicos, não devem codificar locais de glicosilação ou processamento, e de preferência devem ser escolhidas para manter o comprimento total do guia com 50 resíduos ou menos, de preferência cerca de 23 a 40 resíduos, e com maior preferência cerca de 25 a resíduos
Como se indicou acima, a sequência guia da presente invenção tem imediatamente na 3 da mesma,um local de processamento que permite a clivagem do guia a partir da sequência de proteína isenta de levedura, à qual está fundido no polipeptido precursor. 0 local de processamento empregado na presente invenção é definido como os codões que definem o número mínimo de resíduos de aminoácido que são especificamen te reconhecidos para clivagem pelo processo seleccionado (por exemplo químico, enzimático, etc.)
Vários locais de proces sarnento são conhecidos na técnica, incluindo tanto os activos in vivo como in vitro, Por exemplo , o local de processamento pode proporcionar, in vitro, o processamento codificando um local de clivagem para um enzima proteolítico que não ocorre no hospedeiro de levedura. 0 polipeptido precursor re cuperado deve então ser tratado com o enzima, para clivar a proteína isenta de levedura, a partir do precursor. Outro local de processamento in vitro é um codão de metionina que pode ser clivado por tratamento pós-expressão com brometo de cianogé16 nio. Ver, por exemplo, a patente norte-americana N? 4.366.246.
Os locais de processamento in vivo podem ser escolhidos de quaisquer sinais de péptido reconhecidos por um enzima proteolítico de levedura, que proporcionará a expressão da desejada sequência de proteína isenta de levedura. Os locais de processamento particularmente preferidos são aqueles destinados aos enzimas envolvidos no processamento do pre pro-oc-factor nativo. Por exemplo, a dipeptidil aminopeptida se A (DPAPase A) remove as sequências terminais -X-Ala-, em que X é Glu ou Asp. Ver, por exemplo, Julius et al. (1983) Cell 32:839-852. A endopeptidase codificada pelo gene KEX2 faz a clivagem de dipéptidos básicos constituídos por resíduos Lys e Arg; isto é, Lys-Arg, Arg-Arg, Arg-Lys e Lys-Lys. Fuller et al., Microbiology 1986, págs. 273-278 (1986). Em l_e vedura, o precursor of-factor é primeiramente clivado pela en dopeptidase KEX2, e depois os N-terminais são ordenados pela DPAPase A, para proporcionar feromona oQ-factor madura. Visto parecer que o último processo proteolítico é uma fase que limita a proporção, prefere-se eliminar os sinais para DPAPase A, de tal modo que o local de processamento seja formado apenas pelo sinal para a endopep tidase IÍEX2 . Portanto, numa tal forma de realização, a sequência guia será ligada à sequência de proteína isenta de levedura pelo local de reconhecimento de péptido dibásico para a endopeptidase KEX2, tal como Lys-Arg ou Arg-Arg.
A porção carboxi terminal do polipéptido precursor da presente invenção é uma proteína isenta de levedura. A sequência DNA codificando esta porção é aqui definida como começando com o primeiro codão a jusante (direcção 3'),a par tir do último codão do local de processamento, através do co dão de paragem de translação que define o carboxi terminal do polipéptido precursor. Esta sequência DNA será considerada para codificar uma proteína isenta de levedura quando, sobre a sua completa sequência, a.mesma define um polipéptido que não é substancialmente homólogo a um polipéptido expresso pela levedura. Em geral, as proteínas preferidas isein tas de levedura serão a sequência de proteína de mamíferos
(incluindo os seus análogos; isto é, muteínas, fragmentos,
etc.) . Como aqui definidas, as proteínas isentas de levedu-
ra podem incluir, portanto, uma proteína de fusão composta
por sequências de mamíferos e levedura, assim como formas
pro de proteína de mamíferos madura.
As sequências DNA codificando as proteínas ise tas de levedura podem ser sequências clonadas a partir de o ganismos isentos de levedura, ou as mesmas podem ser sequên cias sintéticas, usualmente preparadas utilizando codões de levedura preferidos. Usualmente,, as proteínas isentas de levedura terão pelo menos cerca de 8 aminoácidos em comprimen to e podem incluir polipéptidos até cerca de 100.000 daltons ou mais. Usualmente, a sequência de polipéptido isenta de levedura será inferior a cerca de 300.000 daltons, e mais u sualmente menos de 150.000 daltons. De particular interesse são polipéptidos de cerca de 5.000 a cerca de 150.000 dal tons, mais particularmente de cerca de 5.000 a cerca de
100.000 daltons. Proteínas ilustrativas, com interesse, i sentas de levedura incluem hormonas e factores, tais como hormona de crescimento, somatomedinas, factor de desenvolvimento Qpidêrmicqhormona luteinizadora, hormona estimulante da tiróide, oxitocina, insulina, vasopressina, renina, calcitonina,hormona estimuladora de folículo, prolactina, eritropoietina, factores estimulantes da colónia, linfoquinas tal como interleuquina-2, globinas, imunoglobu1inas, interferões, (por exemplo, a, b ou q), enzimas, b-endorfina, enquefalina, dinorfina, factores de desenvolvimento semelhante a insulina, etc.
Numa forma de realização preferida da presente invenção, as formações de DNA codificando os polipéptidos pre cursores acima descritos têm a estrutura:
5’-AF-CHO-X -S-Gene*-3' n
em que AF codifica um péptido de sinal alfa-factor de levedura; CHO codifica um local de glicosilação; codifica um polipéptido de n aminoácidos, em comprimento, que não contém um local de glicosilação ou local de proces.samento que fará com que o polipéptido precursor seja clivado in vivo pelo hos pedeiro de levedura; n é um número inteiro de 0 a cerca de 30; Gene codifica uma proteína isenta de levedura, e S cod_i fica um local de processamento que proporciona a clivagem do referido polipéptido precursor, péptido de sinal codificado por AF é o mesmo péptido de sinal tó-factor acima descrito. 0 mesmo tem aproxji madamente 20 resíduos em comprimento (por exemplo, cerca de 19-23), e é de comprimento suficiente para dirigir o polipép tido precursor para o caminho secretório de levedura. 0 com primento mínimo ou máximo preciso pode ser determinado para um Ύ-factor particular separando uina série de formações de anulação .
A sequência DNA definida por CHO codifica um local de glicosilação. A mesma terá geralmente nove nucleóti^ dos em comprimento, incluindo três codões para os aminoácidos Asn-Y-Y’-, em que Y é qualquer resíduo de aminoácido, e Y' é Thr ou Ser.
Xn, se estiver presente, codifica, por exemplo, porções do oc-factor guia que não foram anuladas ou sequências de aminoácido não referenciadas. Em geral X^ será um máximo de cerca de 30 resíduos aminoácido, mais preferivelmente um máximo de cerca de 20 resíduos, e com maior preferência um máximo de cerca de 10 resíduos.’ Embora possa não ser necessário que X^ codifique quaisquer polipéptidos (isto é, η = o), pode ser desejado proporcionar algum espaçamento entre o local de glicosilação CHO, e o local de processamento S, no caso em que adições de hidrato de carbono no local de glicosilação, atrasa, ds modo estéril, o acesso do agente que faz a cli vagem dos locais de processamento. Em tal caso, n terá normalmente um valor mínimo de cerca de 1, mais preferivelmente um mínimo de cerca de 2, embora seja mais preferido um mínimo de cerca de 3.
É preferido que X^, se estiver presente,não con tenha quaisquer locais de glicosilação funcionais ou locais de processamento, reconhecidos e clivados pelo hospedeiro de levedura. Além disso, quando se parte de sequências encontra das num guia \-factor, é preferido escolher resíduos de amino ácido hidrofílico. É possível que o comprimento de vá afe£ tar a eficiência de expressão e secreção da proteína isenta de levedura. A seLecção do comprimento timizar a expressão, pode ser feita apropriado de X , para opatravés de formações de se paração de vários tamanhos.
A proteína isenta de levedura codificada por
Gene e o local de processamento codificado por S são como a cima descritos.
As formações DNA da presente invenção serão nor malmente mantidas num replicão capaz de manutenção estável num hospedeiro, particularmente um hospedeiro de levedura. Os replicões, usualmente plasmídeos, incluirão um ou mais èistemas de replicação, desejavelmente dois sistemas de replicação, que permitem a manutenção do replicão tanto num hospedeiro de leve dura para expressão, como num hospedeiro procariótico para cio nagem. Exemplos de tais vectores de ida e volta de levedura
-bactéria incluem YEp24 /^Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24/, pCl/1 Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad.
:4642-46467 e YRpl7 £Stnichomb et al. (1982)
Sei. E.U.A. 81:
Mol. Biol.
U8:157j. Além disso, um vector de expressão de plasmídeo pode ser um plasmídeo de número de cópias elevado ou baixo, variando geralmente o número de cópias de cerca de 1 a cerca de 200.
Com vectores de Levedura de número de cópias elevado, será ge— ralmente de pelo menos 10, de preferência pelo menos 20 e usu almente não excedendo cerca de
150 cópias num único hospedeiro.
Conforme a proteína isenta de levedura escolhida pode ser des sejavel um vector de numero de copias elevado ou baixo, dependendo do efeito do vector e da proteína estranha no hospedeiro.
Ver, por exemplo, Brake et al., supra, As formações DNA da pre sente invenção podem também ser integradas no genoma de ievedu ra por meio de um vector de integração
Exemplos de tais vecto res são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo
Botstein et al., supra.
A selecção da levedura adequada e de outros hos pedeiros de microorganismos, para a prática da presente invenção, está compreendida nos conhecimentos no ramo. Quando se se leccionam hospedeiros de levedura para expressão, os hospedei ros adequados podem incluir aqueles que mostram ter, inter alia, boa capacidade de secreção, baixa actividade proteo1ítica,e tc> tal rebustez. A levedura e outros microorganismos estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes, incluindo : Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medicai Ph^ sics, University of Califórnia, Berkeley, Califórnia; e the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
Métodos de introdução de DNA exógeno, em hospe deiros de levedura, são vasta variedade de vias pio, a transformação de bem conhecidos na técnica. Existe uma para transformar a levedura. Por exem esferoplasto é ensinada, por exemplo, por Hinnen et al. (1978)
Proc. Natl. Acad. Sei
E.U.A.2^:1919-1933, θ Stinchcomb et al., Publicação EPO N?
*45.573. Os trans formantes são desenvolvidos num meio nutriente apropriado e, quando for apropriado, mantido sob pressão selectiva para asse gurar a retenção de DNA endógeno. Onde a expressão é induzí vel, pode ser permitido o desenvolvimento do hospedeiro de levedura para proporcionar uma elevada densidade de células, e depois a expressão é induzida. A proteína segregada, isenta de levedura processada pode ser colhida por quaisquer meios convencionais, e purificada por cromatograf ia , ele c tro f ore se , diíí lise, extracção solvente-solvente, e análogos.
Exemplos
Os exemplos seguintes são proporcionados apenas com fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção. Crê-se que o depósito dos materiais biológi^ cos, de partida, não é necessário para a prática da presente invenção, visto que,quer os mesmos materiais,quer materiais equivalentes,estão publicamente disponíveis.
I.
exemplo seguinte proporciona uma comparação dos níveis de expressão e secreção obtidos com formações -factor modificadas, usadas para expressar a proinsulina humana. Três formações empregam guias o<-factor de comprimento total; tendo uma um guia ©(.-factor com três locais de glicosi_ lação nativos, outra tendo todos os três dos locais de glicosilação eliminados, e tendo outra todos os locais removidos, excepto o do Asn^^· A quarta formação é um guia o<-factor tru_n cado que retém um único local de glicosilação em Asn^.
A. pYGAIl
Este plasmídeo codifica um guia o<-factor /írake et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 81:9692-9696; Publ_i cação EPO N?. 116,201^, ligado a proinsulina humana. A proinsulina é codificada por um gene sintético fabricado com codões preferidos de levedura (Figura 1). A sequência guia o^-factor, o gene de proinsulina sintética e a sequência de terminação oq-factor, são provenientes de pYBCA5, cuja formação está representada na Figura 1. A transcrição é mediada pelo fragmento promotor 4θ4 bp BamHI-Ncol GAPDH. Travis et al.(1985)
J. Biol. Chem. 260: 4384-4389. A sequência de expressão (cas sette de expressão) 1206 bp BamHI, que consiste no promotor GAPDH, a sequência codificando o guia oC-factor ligado à proin sulina,e a terminação ^-factor foi clonada no único local BamHI do vector de ida e volta de levedura pAB24 (abaixo ) ou pC1/1,de tal modo que a sequência de promotor GAPDH estava próxima do local Sall do vector, para dar os plasmídeos pYGAIl-AB24 ou pYGAIl-Cl/1, respectivamente. A sequência de expressão (cas— sette de expressão) 1206 bp BamHI foi também subclonada no úni co local BamHI de um derivado de pBR322 /~pBR322 (WEcoRISalI)BamHI; Travis et al. supra ♦ Este plasmídeo foi denominado pGAIl.
plasmídeo pAB24 (Figura 4) é um vector de ida e volta de levedura que contém a sequência 2m completa /~Broach, ems Molecular Biologyof the Yeast Sacoharomyces, Vol. 1, pág. 445 e sequências pBR322. 0 mesmo também contém o gene de levedura URA3 derivado do plasmídeo YEp24 /Botstein et al. (1979) Gene 8hl7_/ θ o gene LEU2d de levedura derivado do plasmídeo pCl/1. Publicação EPO N-. 116.201. 0 plasmídeo pAB24 foi construído macerando YEp24 com EcoRI, e religando o vector para remover as sequências 2m parciais. 0 plasmídeo re sultante, YEp24WRI, foi linearizado por digestão com Ciai e ligado com o plasmídeo 2m completo que tinha sido linearizado com Ciai. 0 plasmídeo resultante, pCBou, foi depois macerado com Xbal e o fragmento de vector 8605 bp foi isolado em gel. Este fragmento Xbal isolado foi ligado com um fragmento 446O bp Xbal, contendo o gene LEU2d isolado de pCl/1; a orientação do gene LEU2d está na mesma direcção que o gene URA3.
B. pYGAI3 plasmídeo pYGAI3 difere do pYGAIl pelo facto de o mesmo codificar um guia o^-factor modificado, em que os codões para Asn nos resíduos 23, 57 θ 67 foram mudados pa ra codificar Gin, eliminando assim todos os três sinais para a glicosilação N-ligada.
guia oC-factor e os aminoácidos N-terminal de proinsulina, codificados por este plasmídeo, foram cons truídos por ligação de oligonucleótidos sintéticos para dar um fragmento 294 bp com uma projecção 5' Ncol, e uma projecção 3' HindIII, a sequência que está representada na Figura
2. A sequência dos oligonucleótidos apropriados foi alterada durante a síntese, de modo que os codões que especificam Asn nas posições 23, 57 e 67 do guia c^-factor natural especificam, agora, Gin nas mesmas posições. A sequência DNA especifican do os aminoácidos N-terminal 13 de proinsulina era idêntica à do pYGAIl. 0 fragmento 294 bp NDA sintético (NcoI-HindIII) substitui o fragmento comparável de pGAIl e pYGAIl-Cl/1,que deram os plasmídeos pGA!3 e pYGAI3, respectivamente.
C. PYGAI8 plasmídeo pYGAl8 contém DNA codificando um guia b<-factor que elimina dois dos três locais de g 1 i co s i 1 aç ao .
pYGAl8 foi preparado como segue.
Primeiro, um fragmento 5' Foi isolado da sequência de expressão (cassette de expressão) de pGAIl por corte com Hpall, seguido por corte com BaeiHI,e depois isolando com gel um fragmento 5θ4 bp contendo o promotor GAPDH e os resíduos de codificação de sequência 1-33 do guia o(-factor. Em seguida, o plasmídeo pYGAI3 codificando um guia of-factor que não contém locais de glicosilação foi também sequencialmente cortado com Hpall e BamHI, e um fragmento 7θ2 bp isolado contendo sequências codificando resíduos guia e^-factor modificados 34-83, o local de processamento LysArg, a sequência proinsulina e a sequência de terminação cy-factor. Este fragmento foi depois ligado ao fragmento 504 bp a partir de pGAIl, cortado com BamHI e um fragmento 1206 bp isolado.
fragmento 1,2 kb BamHI acima que contém um promo tor GAPDH completo/guia Of-factor/proinsulina/sequência de expressão (cassette de expressão) de terminação Qf-factor foi então ligado em BamHI-cortado e pBR322 (WEcoRI-SalI) BamHI,tra tado com fosfatase, para dar o plasmídeo pGAl8, o qual foi clonado em E, coli.
A sequência de expressão (cassette de expressão)
1,2 kb, a partir de pGAl8, foi removida por corte com BamHI, e depois isolando com gel o fragmento. A mesma foi ligada a BamHI-cortado e ao vector pAB24 de ida e volta de levedura, tratada com fosfatase. A inserção da sequência de expressão (cassette de expressão) foi no único local BamHI das sequên cias pBR322, de tal modo que o promotor GAPDH estava próximo do único local Sall do vector. Este plasmídeo era o pYGAl8.
D. pYGAI7 plasmídeo pYGAI7 contém o DNA que codifica um guia o<-factor truncado, e o gene sintético para a proinsulj na humana. 0 guia c\-factor foi truncado, de modo a que o mesmo codifique apenas aminoácidos 1-35 do guia o^-factor, e contém, portanto, um único local para glicosilação em Asn2^.
Este vector de expressão de levedura foi construído como segue.
Primeiro, o pGAll foi cortado com HindIII. Foi adicionado um ligante HpalI-HindIII com a seguinte estrutura:
5'-CGGCTAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGA
CGATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGA-5'
Depois da adição do ligante, o plasmídeo linearizado foi corta do com BamHI, e um fragmento 55θ bp HpalI-BamHI foi isolado com gel. Este fragmento contém os codões para os resíduos 34-35 do guia oZ-factor ligado directamente a um local de proces sarnento Lys-Arg, e a sequência de proinsulina. Não há sequências de intervenção entre o codão para o resíduo 35 do guia -factor e o local de processamento, directamente adjacente à sequência de proinsulina.
Segundo, o pGAll foi cortado com Hpall e BamHI, e do um fragmento 504 bp isolado com gel. Este fragmento contém promotor GAPDH e nucleótidos codificando aminoácidos 1-33 guia of-factor o final 3' que termina numa projecção Hpall complementar à extremidade
5' do fragmento 558 bp HpalI-BamIII acima descrito
Estes dois fragmentos foram ligados em conjuri to e cortados com BamHI, para proporcionar uma sequência de ex pressão (cassette de expressão) contendo o promotor GAPDH, sequências codificando um guia c<-factor modificado contendo resíduos 1-35 directamente ligados a um local de processamen to Lys-Arg, o gene proinsulina, e a terminação ^-factor.A sequência (cassette) foi então ligada dentro de uni local BamHI de pBR322 (WEcoRI-SalI)BamHI, como descrito acima, para dar o plasmídeo pGAI7 e clonado em E. coli.
pGAl7 foi então cortado com BamHI, e a sequência de expressão (cassette de expressão) 1062 bp isolada com gel. A sequência de expressão (cassette de expressão) foi então ligada dentro do local BamHI de pAB24 para dar o plasmídeo pYGAI7.
E. Expressão Comparativa
Os plasmídeos pYGAIl-Cl/l, pYGAI3, pYGAIl-AB24, pYGAI7 e pYGAl8 foram transformados na estirpe Saccharomyces cerevisiae AB10 3.1 (Mata, Leu2-3,112,ura3-52, his4-580, pep4-3^*”cir°_J7) , essencialmente como descrito por Hinnen et al.
(1978) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 7 5 : 1929-1933. Os transfor mantes de pYGAIl-Cl/1 e pYGAl3 foram seleccionados para prototrofia de leucina etransformantes dos outros plasmídeos foram seleccionados para prototrofia de ura.
Os dados apresentados na Tabela 1 comparam a seereção de proinsulina (pYGAI1-Cl/l) ou pelo mediada pelo guia (χ-factor natural guia V-factor com Gin, que substitui
Asn nas posições 23, 57 θ 67 (pYGAI3). Culturas inócuas (0,2ml de transformantes individuais) foram desenvolvidas durante 48 horas em meio completamente sintético isento de leucina SD-leu; Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, pág. 62 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)^7 e diluídas 20 vezes no mesmo meio. As culturas foram desenvolvidas durante 48-72 horas, os sobrenadantes da cultura foram preparados por centrifugação e foram ensaiados para material semelhante a insulina de reacção cruzada imunoreactiva (iLM), num ensaio de competição radioimu ne com insulina rotulada 125j. Como pode ver-se na Tabela 1, a eliminação dos três locais de glicosilação a partir do guia γ-factor resultou essencialmente na ausência de secreção do ma terial semelhante a insulina, em comparação com o mediado pelo guia of-factor nativo.
Os dados apresentados na Tabela 2 comparam os transformantes de pIGAll-pAB24 (guia oç-factor nativo de comprimento total), pYGATS (guia t^-factor de comprimento total com apenas um local de glicosilação em
Asn23) e pYGAI7 (guia
Ύ-factor truncado contendo um único local de glicosilação em
com a sua capacidade para segregar material semelhante a insulina. Culturas inócuas dos transformantes indicados (0,2 ml) em SD-Leu desenvolveram-se durante 0,48 horas a 30°C foram transformadas em pequenas esferas por centrifugação, lavadas e diluídas 20-50 vezes em meio ura”. Este meio contém 0,67/ de levedura com base de azoto, 1% de ácido succínico, 0,35 % de
NaOH, 0,5$ de ácidos casamino, 2$ de glucose, 0,005$ de adenina, 0,01$ de triptofano e 0,02$ de treonina.
As culturas desen volveram-se a 30°C durante 48-72 horas e os sobrenadantes da cultura foram preparados e ensaiados como se descreveu anter i ormente
Os dados apresentados na Tabela 2 mostram que os trans formantes que transportam a formação empregando o guia ck- f a ctor truncado, retendo um único local de glicosilação em Asn
23’ segregam geralmente mais material imunoreactivo semelhante a insulina que os transformantes que suportam a formação corn o guia <X. -factor nativo de comprimento completo. Os transforman-
tes que suportam a formação com o guia 0< -factor de comprimen
to completo com o mesmo local único de glicosilaçã o (Asn^) se
gregam muito menos material de insulin a de reacção cruzada que
os transformantes que suportam o guia -factor na tivo de com-
primento completo ouo guia <x- factor truncado.
Tabela 1. Efeito de Eliminação de Locais d e Glicosila-
ção do Guia de p<-Fa ctor sobre a Secreção do
Material Semelhante a Insulina
Transformante θθ650 ilm!
mg/ml mg/ml,OD65O
AB103.1[pYGAIL-Cl/l]-i 5,9 .24 .04
-2 5,9 .24 .04
-3 2,1 .08 .04
AB103.1[pYGAI3] -1 ND .003 -
-2 ND .007
1) 0 material semelhante a insulina de reacçãi j cruzada
(ILM), como determinado por um ensaio de competição
5 radioimune com insulina rotulada I e padrões de insulina. Os dados são referidos como segregação de ILM por ml de cultura e, em alguns casos, como ILM segregada por ml normalizado para uma densidade de célula de cultura com uma absorvência a um comprimento de onda de 650 mm de 1.
Tabela 2. Efeito de Ouia -factor Truncado ou de Comprimento Total lação em
com um único local de Glicosi sobre Secreção de material Semelhante a Insulina
Transformante no. de
Testes mg/ml
ILM- _________ mg/ml OD55Q
Variação Média
Aoanelho Variação Média Padrão
Aparelho Padrão
AB103.1
[pYGAI1-AB24] 7 .22-.55 .37 .12 .02-.04 .026 .01
AB103.1 [pYGAI7] 8 .38-1,0 .62 .24 .03-.06 .043 .01
AB103.1 [pYGAI8] 8 .03-.18 .09 .05 .003-.01 .007 .003
1) Um mínimo de três transformantes independentes foram testados.
2) Material segregado de reacção cruzada semelhante a insulina (ILM) foi determinado por um ensaio de compe-
125 tição radioimune com insulina rotulada I e padrões de insulina. Os dados são referidos como ILM segregado por ml de cultura e como ILM segregado por ml normalizado para uma densidade de célula de cultura com uma absorvência a um comprimento de onda de 650 mm de 1.
II.
Este exemplo compara a expressão de uma formação guia o(-factor de comprimento completo, retendo todos os locais de glicosilação, a uma formação de expressão empregando uma sequência -factor truncada que retém apenas um unico local de glicosilação em Asn£3. A proteína ra utilizada neste exemplo é um análogo de isenta de leveduproinsulina humana em que o péptido de ligação C foi substituído por um local de clivagem de levedura KEX2 endopeptidase
A. pYGAIC3 plasmídeo pGAIC3 foi feito substituindo o fra£ mento 231 bp HindIII-SalI de pGAll que codifica aminoácidos 14 até 30 da cadeia B, o péptido C, a cadeia A e dois codões de paragem de translação com um fragmento de gene 132 bp sintético HindIII-SalI (representado na Figura 3) que codifica aminoácidos 14 até 30 da cadeia B, um local de clivagem de Lys-Arg KEX2 endopeptidase, a cadeia A, e os codões de paragem de translação. 0 plasmídeo pYGAlC3 foi preparado a partir de pGAlC3 como segue.
plasmídeo pGAIC3 foi macerado com BamHI, e a sequência de expressão (cassete de expressão) 1107 bp BamHI contendo o promotor GAPDH, a sequência codificando o guia 0< -factor ligado ao análogo proinsulina, e a terminação de transcrição c< -factor foi isolada e ligada a BamHI macerada e pAB24 tratado com fosfatase, e depois clonada em E. coli. 0 plasmídeo pYGAIC3 foi obtido, no qual a sequência de expre£ são (cassete de expressão) foi orientada de modo tal que o promotor GAPDH estava próximo do único local Sall do vector,
B. PYafL7C3 plasmídeo pYaF^7C3 contém DNA codificando o. guia °(-factor truncado, acima descrito, para pGAI7 ligado à sequência pata o análogo proinsulina, também acima descrito (pYGAIC3). Este plasmídeo foi construído como segue.
Primeiro, o pGAIC3 foi cortado com HindIII e
Sall, e um fragmento 132 bp foi isolado com gel. Este fragmento contém sequências codificando todos menos os primeiros 12 codões do análogo proinsulina. 0 mesmo foi ligado num fragmento 4640 bp isolado com gel a partir de HindIII e Sall, macerados com pGAI7, para proporcionar o plasmídeo paf^7C3. Depois de clonagem em E. coli, este plasmídeo foi cortado com BamHI e um fragmento 1062 bp BamHI foi isolado com gel. Esta sequência de expressão (cassetede expressão) contém a formação guia o< -factor truncada de pGAI7 com o análogo proinsulina em lugar da sequência de proinsulina normal. A sequência de expressão (cassete de expressão) foi então ligada no local BamHI de pAB24, como descrito acima, para dar pYafL7C3.
Expressão Comparativa
Os níveis de expressão foram determinados para pYGAlC3 θ pYaf^7C3 em duas estirpes de S. cerevisiae. A estirpe AB103.1 foi descrita no Exemplo 1. A estirpe AB110-4 é um derivado da estirpe ABI10 de Saccharomyces cerevisiae (Mata, leu2, ura3-52. pep4-3. his4~ 580 /cir°_7) em que uma anulação foi executada no gene pepA. Estas estirpes foram transformadas como se descreveu anteriormente com plasmideos pYGAIC3 e pYaf 7C3, e prototrófos ura foram selecionados. As culturas inócuas foram desenvolvidas em SD-leu /Sherman et al., supra.] a 30°C durante 24-48 horas, depois transformadas em pequenas esferas por centrifugação, lavadas e diluídas 20 vezes em meio ura (acima descrito), e desenvolvidas durante 48-72 horas a 30°C. 0 meio de cultura condicionado isento de célula foi preparado por centrifugação para ensaio num ensaio de competição de insulina radioijnune.
Os resultados estão apresentados na Tabela 3. Como pode ver-se a formação -factor truncada media a secreção aumentada do análogo proinsulina imunoreactivo, comparado com a sequência guia o(-factor natural.
Tabela 3. Secreção de ILM a partir de uma Formação
Análoga de Proinsulina Mediada por um
Guia oC -factor Truncado ou Guia A -factor na tura1
Transformante no. de ______________ ilm^______________
Testes1 mg/ml mg/ml, OD^q
Variação Média Ap^rglho Variação FÉdia Ap^glho
AB103.1
[pYGAIC3] 6 1-2,75 1,66 .65 .11-.20 .14 .04
AB103.1 [pYafL7C3] 6 1,5-6,63 4,46 2,15 .14-.60 .40 .19
AB110.4 [pYGAIC3] 3 1,15-1,4 1,28 .13 .10-.12 .11 .01
AB110.4 [pYafL7C3] 1) Um mínimo 3 de 2,15-4,12 3,46 1,14 três transformantes .19-.38 independ .31 entes . 10 foram
testados.
2) 0 material semelhante a insulina de (iLM) de reacção cruzada segregado foi determinado por um ensaio de
5 competição radioimune com insulina rotulada I e padrões de insulina. Os resultados são referidos como quantidades de ILM por ml de cultura e como quantidade segregada por ml normalizada para uma densidade de célula com uma absorvência a 650 mm de comprimento de onda = 1.
III.
Este exemplo descreve a construção de um vector de expressão ©(-factor truncado que media os níveis de expressão aumentados de factor-1 de desenvolvimento, semelhante a insulina, activo.
Primeiro, a sequência DNA codifica um guia o( -factor truncado e uma sequência codificando para IGF1 foi preparada. Uma sequência sintética foi preparada por processos padrão empregando uma máquina de síntese, denominada Apllied Biosystems 38OA DNA de acordo com a indicação do fabricante. Catorze sequências DNA foram sintetizadas variando de 22 a 57 bases em comprimento, purificadas por PAGE, e fosforiladas individualmente por quinase T4 na presença de ATP. As sequências foram então fortalecidas e ligadas por processos padrão.
A sequência do gene sintético está representada na Figura 5. 0 fragmento de gene sintético purificado foi clonado em Ncol/Sall, macerado pBSIOO (descrito abaixo). 0 plasmídeo resultante foi denominado pBSIOO Taf^ IGF1.
plasmídeo pBSIOO contém uma sequência de expressão (cassete de expressão) de levedura clonada num derivado de pBR322, pAB12. A sequência de expressão (cassete de expressão) contém o promotor híbrido ADH-2/GAPDH e a terminação GAPDH flanqueando um segmento de gene não essencial. 0 promotor ADH-2/GADPH é um fragmento 1200 bp BamHI-Ncol isolado a partir de pJS103 (ver abaixo) e a terminação GAPDH é um fragmento 900 bp SalI-BamHI isolado do plasmídeo pPAGl. Publicação EPO No. 164.556. 0 plasmídeo pBSIOO contém também um fragmento não essencial entre os locais Ncol e Sall que é substituído pelos fragmentos de gene de interesse. A sequên cia de expressão (cassete de expressão) pode ser removida de pBSIOO por digestão com BamHI e clonada em vectores de ida e volta de levedura para introdução em células de levedura .
plasmídeo pJS103, que contém o promotor híbrido ADH-2/GAPDH empregado acima, foi construído como segue. A porção ADH-2 do promotor foi construída por corte de um plasmídeo contendo o gene ADH2 de tipo selvagem a partir do plasmídeo pADR2 /Beier et al. (1982) Nature 300;724-7287 com enzima de restrição EcoR5, o qual corta na posição +66 em relação ao codão de partida ATG, assim como em dois outros locais em pADR2, fora da região ADH2. A mistura resultante de um fragmento de vector e dois fragmentos mais pequenos foi feita reagir com Bal31 exonuclease para remover cerca de 300 bp. Ligantes Xhol sintéticos foram ligados sobre a DNA tratada com Bal31. 0 fragmento de vector ligante DNA resultante (cerca de 5 Rb) foi separado dos ligantes por croma
- 36 tografia de coluna, cortado com enzima Xhol de restrição, religado, e utilizado para transformar E. coli resistente ã ampicilina. As posições do ligante Xhol foram determinadas pela sequência DNA. Um plasmídeo que continha um ligante Xhol dentro da região não transcrita 5' do gene ADH2 (posição -232 a partir de ATG) foi cortado com o enzima de restrição Xhol, tratado com nuclease Sl, e subsequentemente tratado com o enzima de restrição EcoRI para criar uma molécula de vector linear que tem uma extremidade moderada 1 no local do ligante Xhol e uma extremidade EcoRI. A porção GAPDH do promotor foi construída cortando o plasmídeo pPGAP /Publicação EPO No. 169.5567 com os enzimas BamHI e EcoRI, seguindo-se o isolamento do fragmento 0,9 Kbp DNA. Este fragmento purificado foi então completamente macerado com o enzima Alui e um fragmento aproximadamente 200 bp foi isolado. Este fragmento promotor GAPDH foi ligado ao fragmento ADH-2 presente sobre o vector linear acima descrito para dar o plasmídeo pJS103.
Um fragmento BamHI foi então isolado de pBSIOO Ta^ IGF1. Este fragmento contém o promotor ADH2/GAPDH, um guia o(.-factor truncado (AA 1-25, 81-83) um local de processamento LysArg, uma sequência de codificação para IGF1, e a sequência de terminação GAPDH. Este fragmento BamHI foi então clonado em pAB24, previamente macerado com BamHI. Um clone positivo foi seleccionado, e embora inicialmente denominado plasmídeo 18,5, o mesmo foi subsequentemente designado pYLUIGFl-55XVer Figura 6) .
Um segundo vector de expressão, pYLUIGFl-24 foi também preparado por métodos análogos. Um mapa de restrição está representado na Figura 7. Este vector é semelhante ao pYLUIGFl-55, excepto em que o mesmo tem um guia «-factor de comprimento total dirigindo a secreção com três locais de glicosilação (comparar Exemplo I.A.) e a terminação ©<-fac tor.
A estirpe AB11O de levedura (Publicação EPO No. 164.556) foi transformada com pYLUIGFl-55 e pYLUIGFl-24 por técnicas convencionais de esferoplastia /Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 75:1919-1933?. e a expressão foi comparada.
A expressão de IGF1 a partir de AB110 (pYLUIGFl-55) θ AB110 (pYLUIGFl-24) é não constitutiva. A indução da expressão IGF1 foi conseguida levando-a a uma concentração baixa de glucose no meio de desenvolvimento. Sob condições padrão, culturas em frasco agitado (25 ml) utilizam completamente a glucose no meio por 18-24 horas depois da inoculação. Assim, culturas de 25 ml de AB11O (pYLUIGFl-55) e AB11O (pXLUIGFl-24) foram desenvolvidas sob condições padrão durante 72 horas. Amostras de sobrenadante foram tomadas 49 e 72 horas depois da inoculação e ensaiadas para a actividade biológica IGF1 (RRA) e para imunoreactividade (RIA) com anti-corpos anti-IGFl. Como pode ver-se, o pYLUIGFl-55 com um guia 0/ -factor truncado, segrega proteína da qual uma fraeção substancialmente maior era biologicamente activa. Embora o pYLUIGFl-24 segregue mais proteína que a reactividade apre sentada com anti-corpos IGF1, uma parte relativamente pequena desta proteína era biologicamente activa.
Os resultados estão apresentados na Tabela 4, 0 ensaio radioreceptor (RRA) mede a capacidade do IGF-1 para se ligar Ao seu receptor. Esta é uma medida da actividade biológica do polipéptido recombinante visto que se crê que o IGF-1 exerce toda a sua actividade através do seu receptor. 0 ensaio de receptor é descrito em Marshall et al. (197^) J. Clin. Endorinol. Metab. 19:283-292. 0 rad ioimunoensaio (RIA) é um ensaio competitivo que mede a quantidade de proteína antigenicamente de reacção cruzada com IGF-1 nativo, quer seja ou não biologicamente activa. 0 ensaio é descrito em Zapf et al. (1981) J. Clin. Invest. 68:1321-1330.
Tabela *4. Secreção de IGF1 Mediado por um Guia οζ-factor truncado ou um guia
-factor
Natural
Transformante 49 hrs
72 hrs rraí RIA— RRA RIA
AB110
(pYLUIGFl-55) 1.0 14 1 . 3 14
AB110
(pYLUIFGl-24) 1.3 54 2 . 7 66
1) mg/ml
2) mg/ml
Depósito de Materiais Biológicos
Os vectores de expressão seguintes foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland, E.U.A., e serão mantidos sob as previsões do Tratado de Budapeste
Os números de acesso e as datas de abaixo.
Material Depositado
Número de ATCC
Data de Depósito
E, coli (pYGAI7)
E. coli (pYafL7C3)
E. coli (pYLUIGFI-55)
67597
67596
67595
12/29/87
12/29/87
12/29/87
Estes depósitos foram efectuados para conveniência dos especialistas na técnica. Estes depósitos não são quer uma admissão de que tais depósitos sejam exigidos para a realização da presente invenção nem que as formas de realização equivalentes não estejam no conhecimento da técnica em virtude da presente descrição. A disponibilidade pública destes depósitos não constitui a concessão de uma licença para fa bricar ou qualquer outra patente
As sequências de ácido nucleíco dos materiais depositados são incorporadas na presente descrição como referência, e são controladoras se em conflito com quaisquer sequências aqui descritas.
Embora a invenção antecedente tenha sido descrita com algum pormenor com fins ilustrativos, será óbvio que alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas pelos técnicos normalmente entendidos nesta matéria.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1- Uma célula de levedura que compreende uma formação DNA que proporciona a expressão e secreção de uma proteína isenta de levedura, compreenden do a referida formação DNA uma sequência codificando sob o controle de sequências de iniciação e de terminação da transcrição de levedura-reconhecida, codificando a referida sequência de codificação um polipéptido precursor constituído por uma. sequência guia e a referida proteína isenta de levedura, ligadas por um local de processamento que proporciona a clivagem da referida proteína isenta de levedura, a partir do referido polipéptido precursor, caracterizada pelo facto de a referida sequência guia ser de cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de N-terminal do referido polipéptido percur sor, e compreendendo o péptido sinal de um precursor οχ-factor de levedura, e um único local de g1icosi1 ação.
  2. 2- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterj, zada pelo facto de a proteína isenta de levedura ser uma proteína de mamífero.
  3. 3- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracter_i_ zada pelo facto de a referida proteína de mamífero ser um precursor da insulina humana.
  4. 4- Uma célula,· conforme reivindicado na re i v i nd i cação 3, caracter_[ zada pelo facto de o referido precursor de insulina humana ser pr£ insulina humana.
  5. 5- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracteH zada pelo facto de o referido precursor de insulina humana compreender uma cadeia de insulina _a e uma cadeia de insulina ligadas por um local de processamento de levedura-reconhecida, clivada in vivo.
  6. 6- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracter/ zada pelo facto de o referido local de processamento ser clivado pelo gene KΕX2, produto de Saccharomyces.
  7. 7- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterj_ zada pelo facto de a referida proteína de mamífero ser o factor I de desenvolvimento, semelhante à insulina.
  8. 8- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracteH zada pelo facto de a referida célula de levedura ser proveniente da espécie Saccharomyces.
  9. 9- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a referida célula de levedura ser S. cerevisiae.
  10. 10- Uma célula, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de o percursor α-factor de levedura ser S cerevisiae MFal.
  11. 11- Uma célula de levedura compreendendo uma molécula de DNA com dupla fibra, caracterizada pelo facto de a mesma compreender uma região codificando um polipéptido percursor, secretável por um hospedeiro de levedura, tendo a referida região, com referência a uma das fibras, a estrutura:
    5'-AF-CHO-Xn-S-Gene*-3' em que:
    AF codifica um sinal α-factor de levedura;
    CHO codifica um local de glicosilação;
    Xn codifica um polipéptido de n aminoãcidos em comprimento, não contendo um local de glicosilação ou um local de processamento, que proporciona a clivagem do referido polipéptido percursor in vivo, por meio de levedura;
    n é um número inteiro de 0 a cerca de 30;
    ★
    Gene codifica uma proteina isenta de levedura; e
    S codifica um local de processamento que proporciona a clivagem do referido polipéptido percursor.
  12. 12- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicaçSo 11, caracterizada pelo facto de AF codificar um polipéptido de cerca de 19 a 23 aminoácidos em comprimento.
  13. 13- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de n ser um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 20.
  14. 14- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de n ser um número inteiro de cerca de 0 a cerca de 10.
  15. 15- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de n ser um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10.
  16. 16- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de o referido hospedeiro de levedura ser um Saccharomyces.
  17. 17- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de o referido péptido de sinal α-factor de levedura ser um péptido de sinal Saccharomyces.
  18. 18- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 11, caracterizada pelo facto de S codificar um local de processamento reconhecido in vivo, pelo referido hospedeiro de levedura.
  19. 19- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizada pelo facto de S codificar um dipêptido reconhecido pela endopeptidase KEX2.
  20. 20- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 19, caracterizada pelo facto de o referido dipêptido ser 5'-Lys-Arg-3', ou 5'-Arg-Arg-3'.
  21. 21- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a mesma compreender um replicão.
  22. 22- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto de a referida região codificando o referido polipéptido percursor estar sob o controle de sequências de transcrição, iniciação e terminação de levedura-reconhecida, e de o referido replicão ser um replicão de levedura.
  23. 23- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 22. caracterizada pelo facto do referido replicão ser um plasmídeo.
  24. 24- Uma célula de levedura, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizada pelo facto de o referido replicão ser um cromossoma.
    Lisboa, 30 de Dezembro de 1988
    IWUSTRIAl FEL0 AjENTE OFICIAL da p.whedade o ÁDiJí/J
    RESUMO
    MELHORAMENTOS NA EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE PROTEÍNAS HETEROLOGAS
    DE LEVEDURA UflLIZANDO SEQUENCIAS GUIAS ALFA-F.A.CTOR TRUNCADAS
    Este invento refere-se a um sistema de expressão a-factor de levedura, que é composto por uma sequência guia truncada, contendo o péptido de sinal a-factor e um local de glicosilação, ligados por um local de processamento a uma sequência que codifica a proteína isenta de levedura.
    7 FOLHAS - FOLHA 1
    Κρη I
    J, C
    GlyVll VolcuAsplysArqPheVtlAlnGlnHBLtuGysGlyScrtiHleuVilGIuAUteuTyrtevVilCylGIyGluAraGlyPhcPh.TyrThrProlysThrffrãXrSjluAUCluAiplcuClnVilGlyGInVÍl
    GGWTAd:CTTGGATAAAAGATCGTTAAGCAACACTTCTGTGGTTÍrCACTTC«TTGAAGCTTTGTACTTG6TTTGlà;TCAAAGAGGnTCTTCIArtCTCCAAAGAímGAAG5aAS£rGAACACTTCCAACTTCGTCAAGTT CCtJATGGGAACCTATTnCTAACCAAnGGTVTCAACACACCAAGAGTGAACCAACnqjAAACATGAACCAAACACCACTTTCTCfAAAGAAGATGTGAGGTncVXIXncÍTrCGACTTCVAACGTTCAACCAGnCAA
    C 4- A J,
    CluLeuGylGy1GylProG1yAliG1y$«rt«uG1nPn>LeuAl4l.«uG1uG1y$erLeuG1r .ytArilyU*V41G1uGlnCysCysThr$«rI1«Cyi$<rt««TyrG1nL<uGlMAinTyrCysAsnpC AM CAATrCGGrCtlGGTCCACGTCCTGGTTCTTTGCAACCATTGGCniGdMGTTCTUGCW \AGAG.tGTATTGTTGAACAATGTTGtACnCTATHÓlCTnGIIÍCAATTGGAAAACTACTGTAAtIWTAGCGTc4tCÇAC CnAACCCACCACCAGGTCMfGACCAAGAAACGTTCGTAACCGAAACCncCAAGAAAVTirTCTCltCArAACAAÍTTCTTACAACAVAAGATAAACAAGAAAUTGGTTAACCTrnMVACAnGAnATCGCAGÒBn;;
    ku2
    FIG. I
    7 FOLHAS - FOLHA 2
    Sequência do Fragmento do Gene Sintético de pYGAI3
    122
    182
    242
    NLA111 ALUI HPA11 TAQ1 PST1 BBV-1 ALUI BBV-2 MB011-1
    FNU4H1 MAE3
    SFAN1-1 DDE1
    F0K1-2
    MNL1-1
    FNU4H1
    GSU1-1
    BBV-1 HINC11-1
    FNU4H1
    MB011-1
    XBA1
    MAE1
    HINF1
    HPA1
    HIND111
    ALUI
    RSA1
    MetArgPheProSerllePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSerAlaLeuAlaAla
    ICATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT jÃqrCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGTCAAAATAAGCGTÇGTAGGAGGCGTAATÇGACGA
    1 NLA111, 24 PST1, 38 BBV FNU4H1, 41 SFAN1, 42 F0K1, 45 MNL1 , 55 ALUI, 56 BBV FNU4H1, 60 GSU1,
    ProValpIiírhrThrThrGluAspGluThrAlaGlnlleProAlaGluAlaValIleGly
    CCAGTC CAA ACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT GGTCAG GTT rGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCA
    80 MB01Í, 101 HPA11, 109 ALUI, 120 MAE3,
    TyrLeuAspLeuGluGlyAspPheAspValAlaValLeuProPheSeqGlqSerThrAsn
    TACTTAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTC1 ATGAATCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAG
    124 DDE1, 144 TAQ1,
    AAAGCACAAAT ítitcgtgttta
    AsnGlyLeuLeuPhelle 31r ThrThrlleAlaSer IleAlaAlaLysGluGluGlyVal AACGGGTTATTGTTTATA GA? ACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TTGCCCAATAACAAATAl GTITGATGATAACGGTCGTAACGACGATTTCTTCTTCCCCAT
    221 BBV FNU4H1, 230 MB011,
    SerLeuAspLysArg^heValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeu
    TCTCTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTG GCTTTG AGAGATCTATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTT C
    244 XBA1, 245 MAE1, 255 HINF1, 260 HINC11 HPA1, 294 HIND111,
    295 ALUI, 301 RSA1,
    Tyr
    302 TACTT
    ATGAA
    FIG. 2
    7 FOLHAS - FOLHA 3
    Sequência do Fragmento do Gene Sintético de pYGAIC3
    HIND3 ALUI
    RSA1
    RSA1 RSA1
    SAL1
    GluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThrLysArg GAÍAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGACTAAGAGA cttcSã^acatgaaccaaacaccâcttixitccaaagaagatgtgaggtttctgattctct
    2 HIND3, 3 ALUI, 9 RSA1,
    GlylleVaLGluGlnCysCysThrSerlleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCys
    61 ggtattgttgaâcaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgt ccataacaacttgttacaaçatgaagataaacaagaaacatggttaaccttttgatgâca
    80 RSA1, 99 RSA1,
    121
    AsnOC AM
    AACTAAT AGCG TCGhcCGAÇ TTGATTATCGCAGCAGC'I|;
    134 SAL1,
    FIG. 3
    181
    1 FOLHAS - FOLHA 4
    FIG. 4
    7 FOLHAS - FOLHA 5
    T«JL IGF1
    MET 122 2.45 ASNTHRTHRSER
    CATGAGATTTCCTTCAATTTTTACAGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACATCT TCTAAAGGAAGTTAAAAATGTCGTCAAAATAAGCGTCGTAGGAGGCGTAATCGACGAGGTCAGTTGTGATGTAGA
    8.4 3 9.4 7
    3.4 7 4.4 9
    LEUASPLYSARG CTAGATAAAAGAGGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCTGAATTGGTCGATGCTTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTT GATCTATTTTCTCCAGGTCTTTGGAACACACCACGACTTAACCAGCTACGAAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAA
    10.4 9
    6.4 7
    550 12
    TCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCTAGAAGAGCCCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTT AGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGATCTTCTCGGGGTGTTTGGCCATAGCAACTGCTTACAACAAA
    11.4 8 1251
    7.4 8
    Ϊ2 CAGATCTTGTGACTTGAGAAGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCTTGATAAG
    GTCTAGAACACTGAACTCTTCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGAACTATTCAGCT
    13.48 14.22
    FIG. 5
    7 FOLHAS - FOLHA 6
PT89367A 1987-12-30 1988-12-30 Melhoramentos na expressao e secrecao de proteinas heterologas em levedura utilizando sequencias guias alfa-factor truncadas PT89367B (pt)

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