CN118098339A - 标志物在胃癌免疫联合化疗中的应用、检测模型的构建方法和检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了标志物在胃癌免疫联合化疗中的应用、检测模型的构建方法和检测装置，属于分子生物医学技术领域。通过对胃癌患者免疫联合化疗前的基线组织样本进行DNA和RNA高通量测序，根据患者疗效数据，对比响应组和非响应组患者基因突变，RNA表达水平以及免疫微环境特征的差异，使用全子集回归方法进行模型特征参数挑选，最终确定了四个与疗效相关的分子标志物：ERBB3基因突变，CDH1基因突变，HLA‑DQB1基因表达量以及细胞富集得分，采用logistic回归建立了疗效预测模型，并在验证集中进行模型性能评价。基于该模型评分能够很好地预测患者免疫联合化疗疗效。
Description
技术领域
本发明涉及标志物在胃癌免疫联合化疗中的应用、检测模型的构建方法和检测装置，属于分子生物医学技术领域。
背景技术
胃癌是威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位于前列。我国大多数胃癌患者确诊时为局部进展期或晚期，而对于不可手术局晚期或者晚期患者，5年生存率仅为10％，预后极差。同时晚期胃癌患者治疗方案有限，化疗仍然是这类患者的标准治疗方案，中位生存期约在1年左右。虽然随着抗HER2靶向药物在晚期胃癌患者中的应用，使得晚期胃癌患者的中位OS突破了1年，但该部分人群仅约占胃癌的20％，晚期胃癌的治疗仍存在巨大的未被满足的临床需求。
近几年，随着免疫药物在胃癌中的应用，一系列临床试验如CheckMate-649研究，ORIENT-16研究以及RATIONALE 305研究中均证实免疫联合化疗能够使得患者的生存有所提高，目前国内外指南均已将其作为一线治疗方案。但虽然免疫联合化疗在晚期胃癌患者中能够显示出较好的疗效，但只有约20-30％的患者对于免疫治疗有响应，因此有效地免疫疗效预测标志物对于患者选择起着重要的作用。在先前的研究中已经证实，肿瘤中相关基因可能会影响免疫治疗的疗效，如TGFBR2、RHOA和PREX2基因突变的胃癌患者免疫联合化疗的无进展生存期(PFS)获益均更短。CDH1基因是胃癌发生发展中重要的抑癌基因，研究发现携带CDH1基因突变的dMMR/MSI-H胃肠癌肿瘤患者使用免疫单药的疗效较差。ERBB3基因参与调控PI3K/AKT及ERK通路，通常被认为与不良预后相关，然而一些小鼠和细胞研究表明，与ERBB基因野生型相比，携带ERBB2/ERBB3基因突变的胆囊肿瘤或癌症细胞对于免疫联合治疗更为敏感。
除了基因突变会影响免疫疗效外，肿瘤免疫微环境(TME)，尤其是肿瘤浸润淋巴细胞也是影响患者疗效和预后的重要因素。TME是个复杂和动态的网络，包含不同浸润和驻留细胞、血管、细胞外基质和信号分子。因此，目前已经开发了几种评分系统来定量表征TME的总体免疫状态并预测治疗反应，如TMEscore和TIDE等。TMEscore已在研究中被证实能够预测胃癌患者免疫治疗疗效，同时有证据表明，与黑色素瘤患者的PD-L1水平或TMB相比，TIDE更准确地预测一线免疫治疗的反应。除了以上针对TME的综合评分外，很多开放的软件能够利用RNA数据去评估患者免疫细胞浸润情况。R包‘Cibersort’2015年首次发表于Naturemethod，其基于线性支持向量回归对芯片表达矩阵或RNA测序表达矩阵进行去卷积，以评估样本中22种免疫细胞的富集评分。研究发现使用‘Cibersort’包对免疫新辅助胃癌患者免疫细胞进行分析，获得PR的患者治疗前后极化巨噬细胞(M1和M2)显著增加，而幼稚细胞(M0)减少。
目前已有不少专利预测胃癌免疫疗效，如CN113450873公开了一些可以预测免疫疗效的mRNA标志物；CN115612737公布了PD-L1蛋白表达以及乳酸脱氢酶A水平可以用于胃癌免疫治疗疗效和预后的评估。相关专利都只聚焦单一层面对免疫疗效的预测，但免疫治疗疗效受多方面因素的影响，更为全面地分析比较影响疗效的可能变量，对免疫治疗疗效预测是必要的。
发明内容
本发明通过对胃癌患者免疫联合化疗的基线组织样本进行DNA和RNA高通量测序，根据患者疗效数据，对比响应组和非响应组患者基因突变，RNA表达水平以及免疫微环境特征差异，找到了可以预测患者疗效的分子标志物，利用标志物对患者的疗效进行评估时，具有较好的区分效果。本发明筛选得到了2个新的可以用于评估胃癌免疫联合化疗疗效的标志物，分别为HLA-DQB1基因表达量和T细胞富集得分。
本发明的技术方案是：
检测标志物的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用，所述的分子标志物是由ERBB3基因、CDH1基因、HLA-DQB1基因以及T细胞。
检测ERBB3基因和CDH1基因的试剂是检测基因突变的试剂；检测HLA-DQB1基因的试剂是检测RNA表达量的试剂；检测T细胞的试剂是检测免疫细胞丰度的试剂。
所述的RNA表达量由RNA-seq检测获得；免疫细胞丰度是由T细胞富集得分所确定。
本发明中所述的突变是指单核苷酸变异(SNV)或者插入缺失变异(InDel)。
所述的疗效预测是指客观缓解率(ORR)治疗响应或者非响应。
一种胃癌免疫联合化疗疗效预测的模型的构建方法，包括如下步骤：，
分别对于响应组样本和非响应组样本，进行ERBB3基因突变、CDH1基因突变、HLA-DQB1基因表达量和T细胞丰度的检测；
将获得的结果按照线性模型进行拟合，获得判定风险评分模型。
评分score＝1.375+8.3795*ERBB3-2.8391*CDH1+0.043*HLA-DQB1 -12.0883* T细胞，其中ERBB3和CDH1基因为其突变情况，野生型为0，变异型为1；HLA-DQB1为其基因表达量；/>T细胞为基于RNA表达数据通过R包‘Cibersort’评估获得的T细胞富集得分。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下方法的计算机程序：
步骤1，获得以下分子特征的突变，RNA表达信息以及免疫微环境特征：所述的ERBB3基因和CDH1基因的变异情况，HLA-DQB1基因的表达量情况，基于RNA表达数据通过R包‘Cibersort’评估获得的T细胞富集得分；
步骤2，通过如下公式计算出样本的风险评分：
评分score＝1.375+8.3795*ERBB3-2.8391*CDH1+0.043*HLA-DQB1 -12.0883*T细胞，其中ERBB3和CDH1基因为其突变情况，野生型为0，变异型为1；HLA-DQB1为其基因表达量；/>T细胞为基于RNA表达数据通过R包‘Cibersort’评估获得的 T细胞富集得分；
步骤3，根据患者样本的评分对胃癌患者免疫联合化疗的疗效进行分类，大于阈值的样本被判定为具有更好的疗效。
检测HLA-DQB1基因表达量的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用。
检测T细胞丰度的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用。
有益效果
通过对胃癌患者免疫联合化疗前的基线组织样本进行DNA和RNA高通量测序，根据患者疗效数据，对比响应组和非响应组患者基因突变，RNA表达水平以及免疫微环境特征的差异，使用全子集回归方法进行模型特征参数挑选，最终确定了四个与疗效相关的分子标志物：ERBB3基因突变，CDH1基因突变，HLA-DQB1基因表达量以及T细胞富集得分，采用logistic回归建立了疗效预测模型，并在验证集中进行模型性能评价。基于该模型评分能够很好地预测患者免疫联合化疗疗效。
附图说明
图1：本专利的研究流程。
图2：总人群中top20高频突变图谱。
图3：响应组和非响应组患者间TMB差异。
图4：响应组和非响应组免疫相关基因表达差异。A：33个免疫相关基因表达量热图；B：响应组中CTLA4和HLA-DQB1两个基因的表达量显著高于非响应组。
图5：响应组和非响应组免疫微环境特征差异。A：基于R包‘Cibersort’分析得到的免疫细胞浸润热图；B：两组患者中T细胞和CD8+T细胞的富集得分差异；C：两组患者基于R包‘TMEscore’分析得到的胃癌肿瘤微环境评分差异；D：两组患者基于在线网站TIDE评估获得的T细胞功能障碍和耗竭评分差异。
图6：疗效预测模型构建。A：全子集回归方法基于AIC和BIC筛选得到的前5个最优模型组合；B：模型在训练集及验证集中的AUC曲线；C：基于疗效预测模型预测得到的患者总生存期曲线；D：采用Bootstrap法内部验证(1000次重复抽样)，Hosmer-Lemeshow拟合优度检验结果。
图7：模型在模型在不同年龄，性别，肿瘤原发灶部位，Lauren分型以及PD-L1表达亚组中的性能。
具体实施方式
本发明通过对55例接受一线免疫联合化疗的伴腹膜转移胃癌患者治疗前的基线组织进行了靶向DNA测序，其中50例患者同时进行全转录组RNA测序。通过对比响应组和非响应组患者的基因突变，RNA表达情况以及免疫微环境特征，筛选得到了一个由4个特征所组成的、被证明是胃癌免疫联合化疗疗效的潜在生物标志物以及判定模型，并通过内部和外部数据对模型性能进行了验证。
临床研究中样本基本情况
55例伴腹膜转移胃癌患者中位年龄55岁，年龄范围26-85岁，男性和女性占比基本持平(45.5％vs 54.5％)，原发灶位置以胃窦和胃体为主，患者以低分化为主，占比为80.0％。Lauren分型中弥漫型占比为56.4％，肠型和混合型分别为25.4％和18.2％，50例进行PD-L1检测的患者CPS≥1的比例为58.0％。54例具有MS状态的患者中，MSS/MSI-L及MSI-H的患者比例分别为92.6％和7.4％。
表1患者基础临床特征
以上治疗样本中，接受PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗联合治疗，其中29例接受信迪利单抗联合化疗，24例接受卡瑞利珠单抗联合化疗，1例接受信迪利单抗+替雷利珠单抗联合化疗，1例接受替雷利珠单抗联合化疗。
患者的PD-L1表达情况采用抗体22C3进行检测。MS状态根据基因panel区域覆盖的52个微卫星位点的稳定性确定。免疫联合化疗疗效根据实体瘤反应评估标准(RECIST)指南1.1版，进行评估。总生存期(OS)计算是从免疫联合治疗开始到死亡或最后一次随访日期。
根据患者的疗效数据，分为响应组(PR)和非响应组(SD+PD)对比两组临床和分子特征差异，寻找疗效相关标志物。
疗效相关临床特征分析
部分临床特征可能影响患者疗效，因此对比响应组和非响应组间临床特征差异，试图寻找能够预测疗效的潜在临床标志物。通过对比两组临床特征，响应组患者中MSI-H的比例更高(P＝0.028，Fisher检验)，其他包括PD-L1表达在内的特征在两组间无差异。
表2：响应组和非响应组间临床特征差异
胃癌免疫联合化疗疗效相关基因或通路分析
55例患者治疗前肿瘤组织样本使用世和基因的437基因panel进行二代测序,该基因panel全面覆盖重要癌症相关信号通路基因，具体基因列表见表3。同时其中50例患者进行全转录组RNA测序。
表3：437panel基因列表
DNA提取和测序文库制备
使用QIAamp DNA FFPE组织提取试剂盒(Qiagen)，从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本中提取基因组DNA。所有样本经HE染色，由病理医生判读证实肿瘤含量至少为10％。分别使用Qubit3.0荧光定量仪和NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)评估提取的DNA的浓度和质量。然后，使用Covaris M220超声系统将基因组DNA超声破碎成300-350bp片段，并用Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter)进行纯化。使用KAPAHyper Prep Kit(KAPA Biosystems)制备测序文库。将带有不同分子标签的文库混合。使用上述的437个基因panel和IDT xGen Lockdown Reagents对混合文库进行靶向富集。富集后的文库采用Illumina p5(5'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA3')和p7(5'CAA GCA GAAGAC GGC ATA CGA GAT 3')引物在KAPA Hifi Hot Start Ready Mix(KAPA Biosystems)中进行扩增，然后通过qPCR方法用KAPA Library Quantification kit(KAPA Biosystems)定量测序文库。最终文库采用Illumina Hiseq 4000平台进行测序，平均测序深度至少为900×。
DNA测序结果分析
测序数据由验证过的世和基因生信自动化流程进行分析，主要步骤如下所述。采用bck2fastq进行数据拆分，然后用Trimmomatic进行FASTQ文件质量过滤(QC)，删除低质量碱基(based phredscore低于15)或N碱基。采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA-mem，v0.7.12；https://github.com/lh3/bwa/tree/master/bwakit)将所测序列比对到人类参考基因组hg19上，应用Picard去除PCR所导致的重复序列。使用Genome Analysis Toolkit(GATK 3.4.0)在插入缺失周围进行局部组装校正比对并重新校准碱基质量分数。VarScan2软件用于检测单核苷酸变异(SNV)和插入/缺失突变，参数如下：最小测序深度＝20，最小碱基质量＝25，最小变异等位基因频率(VAF)＝0.02，最小变异支持读数＝3，正负两条链均测到变异，并且链偏倚不大于10％。由ANNOVAR针对以下数据库注释：dbSNP(v138)，1000Genome，ExAC，COSMIC(v70)，ClinVAR和SIFT。如果突变在1000Genomes Project或65000exomes project(ExAC)中的人群频率>1％则被移除。SV分析采用FACTERA软件(http://factera.stanford.edu)以默认参数进行。对于CNV分析，我们将微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)结果作为“金标准”，采用38个样本对我们的CNV程序进行综合试验验证。我们通过对同一批次中100个正常样品进行主成分分析，降低拷贝数数据中的系统噪音。对于拷贝数丢失，阈值为0.65，对于拷贝数增加，阈值为2.0。TMB计算通过将panel覆盖的所有单碱基替换突变和缺失插入突变总数除以panel大小，纳入计算的突变包含同义突变，同时剔除已知的驱动突变。MS状态根据基因panel区域覆盖的52个微卫星位点的稳定性确定。
RNA提取和测序
使用RNeasy FFPE Kit(Qiagen)组织RNA提取试剂盒提取基线组织样本总RNA，随后采用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)对提取的RNA进行定量。通过具有RiboErase(HMR)和Dnase酶的KAPA Standard RNA-Seq Kit试剂盒去除核糖体RNA和残余基因组DNA，然后使用AgencourRNA Clean XP Beads进行纯化。使用KAPA Stranded RNA-SeqLibrary Preparation Kit文库构建试剂盒进行包括RNA片段化，双链cDNA合成、连接子连接和聚合酶链式反应扩增在内的文库构建工作，而后使用Agilent High Sensitivity DNA试剂盒对文库进行质控，随后在Illumina HiSeq平台(Illumina)上测序，测序通量为30Mb。
基因表达分析
测序数据由验证过的世和基因生信自动化流程进行分析，主要步骤如下所述。采用bck2fastq进行数据拆分，然后用Trimmomatic进行FASTQ文件质量过滤(QC)。采用STAR软件(STAR，v2.7.3a，https://github.com/alexdobin/STAR)将所测序列比对到人类参考基因组hg19上，RSEM软件(v1.231，https://github.com/deweylab/RSEM)用于基因水平的定量。
免疫微环境分析
基于患者的RNA表达数据，采用公开的R包‘CIBERSORT’(https://github.com/jason-weirather/CIBERSORT)进行免疫相关细胞浸润分析。‘CIBERSORT’利用线性支持向量回归的原理对常见22种免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积，来估计免疫细胞的丰度。R包‘TMEscore’(https://github.com/DongqiangZeng0808/TMEscore)用于评估胃癌肿瘤微环境特征(TMEscore)，其中TMEscore A为免疫相关信号，而TMEscore B为基质相关信号。T细胞功能障碍和耗竭评分(TIDE)使用在线工具网站Tumor Immune Dysfunction andExclusion(TIDE,http://tide.dfci.harvard.edu)进行评估。以上使用的公开软件或网址均已被众多研究引用。
患者分组
患者疗效根据实体瘤反应评估标准(RECIST)指南1.1版，进行评估。总生存期(OS)计算是从免疫联合治疗开始到死亡或最后一次随访日期。根据患者的疗效数据，分为响应组(PR)和非响应组(SD+PD)对比两组基因或通路突变频率差异，免疫相关基因表达差异以及免疫微环境特征差异，寻找疗效相关标志物，具体流程见图1。
疗效相关基因或通路分析
首先对所有55例患者的基因突变图谱进行描绘，整体高频突变基因为TP53，ARID1A，CDH1，LRP1B及ATM。而后在响应组和响应组间使用Fisher检验，对比突变频率≥5％的58个基因和通路间的频率差异，寻找可能提示疗效的标志物。
表4：响应组和非响应组间基因和通路频率差异(n＝58)
根据上表的筛选结果可以看出，高频突变基因TP53，ARID1A，LRP1B及ATM频率在两组间没有差异，但CDH1基因在非响应组中的频率显著高于响应组(40.6％vs 13.0％，P值为0.036)，同时还发现ERBB2基因和ERBB3基因在响应组中的频率显著高于非响应组。此前报道跟免疫治疗疗效相关的MMR通路，DDR相关的通路如HR，FA等通路在两组间的突变频率均无差异。
除了对于两组患者间基因和通路突变频率差异外，我们另外还去比较了两组患者TMB的差异。如图3所示响应组的TMB会略高于非响应组，但两组间差异不显著，P＝0.125(秩和检验)。
两组间基因及通路差异对比，发生此前被报道能够提示患者疗效的标志物TMB及MMR通路等在两组间的差异并不显著，提示这些标志物可能并不能太好地提示患者的疗效，寻找更为有效的疗效标志物十分重要。通过基因和通路突变频率对比，发现ERBB2和ERBB3两个基因在响应组富集，存在这两个基因突变的患者可能提示较好地疗效，而CDH1基因在非响应组中富集，提示该基因突变的患者疗效可能较差。除了DNA突变层面，为了更加全面地寻找可能的疗效标志物，进一步去比较了两组患者在转录组层面的差异。
疗效相关RNA表达特征分析
由于患者接受的为免疫联合化疗，因此分析中关注两组患者免疫相关基因表达的差异。通过t检验对比响应组和非响应组33个免疫相关基因的表达情况，结果如图4A，B所示，响应组患者中CTLA4和HLA-DQB1两个基因的表达量显著高于非响应组。与临床PD-L1结果一致，CD274基因(编码PD-L1蛋白)在两组间的表达无差异，同时其他免疫相关基因在两组间也无差异。综合以上结果提示，CTLA4和HLA-DQB1两个基因高表达的患者，可能免疫联合化疗疗效更好。
疗效相关免疫微环境特征分析
除了对比两组免疫相关基因的表达差异外，进一步基于RNA表达数据比较了两组患者免疫微环境特此差异。免疫微环境特征比较，包括以下内容：基于R包‘Cibersort’分析得到的免疫细胞浸润的差异，R包‘TMEscore’分析得到的胃癌肿瘤微环境评分以及在线网站TIDE评估获得的T细胞功能障碍和耗竭评分。
采用秩和检验对比了响应组和非响应组间基于‘Cibersort’包得到的免疫细胞浸润情况，结果如图5A，B所示。响应组患者中 T细胞富集得分更低，CD8+T细胞的富集得分显著高于非响应组，P值分别为0.005和0.029。两组患者基于R包‘TMEscore’分析得到的胃癌肿瘤微环境评分和在线网站TIDE评估获得的T细胞功能障碍和耗竭评分均无差异(图5C，D)。
模型构建和验证
上述对比响应组和非响应组患者的临床特征，基因及通路突变频率，免疫相关基因表达以及免疫微环境特征差异，发现响应组患者中MSI-H比例高，ERBB3基因及ERBB2基因突变频率更高，CDH1基因突变频率更低，HLA-DQB1基因以及CTLA4基因表达量更高，同时 T细胞富集得分更低，CD8+T细胞富集得分更高。将各特征单独预测疗效，预测结果如表5所示，AUC范围在0.595-0.757间，敏感性在19.05％-90.48％间，特异性在39.29％-100.00％间，准确性在61.22％-77.55％间。/> T细胞富集得分和HLA-DQB1基因变异也具有一定的判定性能。
表5.各特征单独对疗效预测的性能结果
进一步地，为了建立更佳的免疫联合化疗疗效预测模型，采用全子集回归基于赤池信息准则(AIC)和贝叶斯信息准则(BIC)两个参数来挑选模型构建的变量。全子集回归可以对所有放入的变量的可能组合模型都进行拟合，然后根据参数筛选出现最佳模型。在研究中结合AIC和BIC两个参数对全子集回归结果进行筛选，AIC和BIC都是衡量模型拟合优度的准则，通过平衡模型的复杂性和模型的拟合优度来选择模型，但BIC对模型复杂度的惩罚更大，所以在模型选择时，使用BIC往往会选择更简单的模型，综合两个参数可以得到性能较优，同时避免过拟合的模型。AIC和BIC的值越小，代表模型的优度越好。
将研究中发现的MS状态，ERBB2基因突变，ERBB3基因突变，CDH1基因突变，HLA-DQB1基因以及CTLA4基因表达量， T细胞和CD8+T细胞富集得分，共8个变量在同时进行DNA和RNA检测的49例患者中进行全集子回归，找到最优的模型组合。全子集回归方法基于AIC和BIC筛选得到的前5个最优模型组合如图6A所示。综合AIC和BIC结果，确定最佳的模型预测组合为ERBB3基因突变，CDH1基因突变，HLA-DQB1基因表达以及/> T细胞富集得分四个特征。
采用以上四个特征进行logistics回归模型构建，最终得到的模型评分为：score＝1.375
+8.3795*ERBB3-2.8391*CDH1+0.043*HLA-DQB1-12.0883* T细胞，其中，ERBB3和CDH1基因为其突变情况，野生型为0，变异型为1；HLA-DQB1为其通过RNA-seq检测得到的基因表达量；/> T细胞为基于RNA表达数据通过R包‘Cibersort’评估获得的富集得分。依据公式进行计算，得分越高的患者疗效越好。根据约登指数确定模型最佳阈值为-0.475，模型AUC(95％CI)为0.918(0.846-0.991)(图6B)，敏感性为95.24％
(76.18％-99.88％)，特异性为78.57％(59.05％-91.70％)，准确性为85.71％(72.76％-94.06％)。以约登指数确定的-0.475为阈值，将患者划分为高低得分两组，发现高得分组患者OS也更长(图6C)，表明该模型也可提示患者预后。同时模型在不同年龄，性别，肿瘤原发灶部位，Lauren分型以及PD-L1表达亚组中预测性能无差异，AUC均在0.85以上(图7)。
为了进一步验证模型性能，以临床研究NCT02589496作为外部验证数据，同时采用Bootstrap法(1000次重复采样)进行内部验证。NCT02589496研究是一项帕博利珠单抗(pembrolizumab)在晚期胃或胃食管交界处腺癌患者中的单臂、单中心、开放标签II期试验。研究共入组61例转移性胃癌患者，接受帕博利珠单抗治疗，其中52.5％接受帕博利珠单抗作为二线治疗，47.5％的患者接受帕博利珠单抗作为三线治疗。入组患者中55例进行了全外显子检测，45例进行了全转录组检测，其中同时有突变数据，RNA表达数据以及疗效数据的患者共45例，作为外部验证集。
在外部验证集中AUC(95％CI)为0.785(0.637-0.933)(图6B)，以-0.475作为阈值，验证集的敏感性为75.00％(42.81％-94.51％)，特异性为78.79％(61.09％-91.02％)，准确性为77.78％(62.91％-88.80％)。Bootstrap法内部验证(1000次重复抽样)，Hosmer-Lemeshow拟合优度检验P＝0.599，表明模型拟合较好(图6D)。
通过上述多组学全面的分析，找到了四个可以预测胃癌免疫联合化疗疗效的标志物：ERBB3基因突变，CDH1基因突变，HLA-DQB1基因表达以及 T细胞富集得分，其中HLA-DQB1基因表达量和/> T细胞富集得分为新发现的2个跟胃癌免疫联合化疗疗效相关的标志物。构建出的胃癌患者免疫联合化疗预测模型能够较好的预测患者疗效，同时模型在不同年龄，性别，肿瘤原发灶部位，Lauren分型以及PD-L1表达亚组中预测性能无差异。此外通过内部验证和外部验证都证实了模型的良好预测性能。/>
Claims (10)
1.检测标志物的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用，其特征在于，所述的分子标志物是由ERBB3基因、CDH1基因、HLA-DQB1基因以及细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测ERBB3基因和CDH1基因的试剂是检测基因突变的试剂；检测HLA-DQB1基因的试剂是检测RNA表达量的试剂；检测 细胞的试剂是检测免疫细胞丰度的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的RNA表达量由RNA-seq检测获得；免疫细胞丰度是由细胞富集得分所确定。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，本发明中所述的突变是指单核苷酸变异(SNV)或者插入缺失变异(InDel)。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的疗效预测是治疗响应或者非响应。
6.一种胃癌免疫联合化疗疗效预测的模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：分别对于响应组样本和非响应组样本，进行ERBB3基因突变、CDH1基因突变、HLA-DQB1基因表达量和细胞丰度的检测；
将获得的结果按照线性模型进行拟合，获得判定风险评分模型。
7.根据权利要求6所述的胃癌免疫联合化疗疗效预测的模型的构建方法，其特征在于，评分细胞，其中ERBB3和CDH1基因为其突变情况，野生型为0，变异型为1；HLA-DQB1为其基因表达量；/>细胞为/>细胞富集得分。
8.一种计算机可读取介质，其特征在于，其记载有可以运行以下方法的计算机程序：
步骤1，获得以下分子特征的突变，RNA表达信息以及免疫微环境特征：所述的ERBB3基因和CDH1基因的变异情况，HLA-DQB1基因的表达量情况，细胞富集得分；
步骤2，通过如下公式计算出样本的风险评分：
评分细胞，其中ERBB3和CDH1基因为其突变情况，野生型为0，变异型为1；HLA-DQB1为其基因表达量；/>细胞为/>细胞富集得分。
步骤3，根据患者样本的评分对胃癌患者免疫联合化疗的疗效进行分类，大于阈值的样本被判定为具有更好的疗效。
9.检测HLA-DQB1基因表达量的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用。
10.检测细胞丰度的试剂在用于制备胃癌免疫联合化疗疗效预测试剂中的应用。
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