CN114736967B - 预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 - Google Patents
预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114736967B CN114736967B CN202210494920.8A CN202210494920A CN114736967B CN 114736967 B CN114736967 B CN 114736967B CN 202210494920 A CN202210494920 A CN 202210494920A CN 114736967 B CN114736967 B CN 114736967B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- msi
- dmmr
- tumor
- patients
- akt1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 93
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 title abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 60
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 58
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 101150045355 akt1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101150083915 cdh1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 49
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 24
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 21
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 15
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims description 15
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 12
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 11
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 abstract description 48
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 abstract description 45
- 101000779418 Homo sapiens RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 37
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 19
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 abstract description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000038594 Cdh1/Fizzy-related Human genes 0.000 abstract 1
- 102100025805 Cadherin-1 Human genes 0.000 description 30
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 16
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 16
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 11
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 10
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 5
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 206010061968 Gastric neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 102100028908 Cullin-3 Human genes 0.000 description 3
- 101000916238 Homo sapiens Cullin-3 Proteins 0.000 description 3
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229940126546 immune checkpoint molecule Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000007471 Adenosine A2A receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010085277 Adenosine A2A receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000764817 Chromohalobacter salexigens (strain ATCC BAA-138 / DSM 3043 / CIP 106854 / NCIMB 13768 / 1H11) Oxygen-dependent choline dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 2
- 229940123965 Immunoglobulin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 101710197058 Lectin 7 Proteins 0.000 description 2
- 101710197064 Lectin 9 Proteins 0.000 description 2
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 2
- 102000007295 Mucin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010008701 Mucin-3 Proteins 0.000 description 2
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 2
- 101100514842 Xenopus laevis mtus1 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 2
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010202 multivariate logistic regression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012275 CTLA-4 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000004902 predicting drug resistance Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了能够预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的方法。本发明还提供了耐药基因AKT1和/或CDH1、它们的mRNA、cDNA或蛋白及其检测试剂。本发明的耐药基因及其检测试剂可以用于预测肿瘤患者对免疫治疗的耐药性，以及靶向疗法联合或不联合免疫治疗的敏感性。本发明的AKT1和/或CDH1基因突变能够作为预测dMMR/MSI‑H胃肠肿瘤患者中对免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的生物标志物，从而能够准确预测耐药人群，避免盲目用药，提高免疫检查点抑制剂疗法治疗的经济性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种可用于预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者对免疫检查点321制剂疗法的原发耐药的生物学标志物及其用途和使用方法。
背景技术
近年来，免疫检查点抑制剂疗法(immune-checkpoint inhibitor，ICI，包括抗PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制剂)已成为肿瘤治疗中广泛应用的治疗方案。2017年，美国FDA批准dMMR(DNA mismatch repair-deficient，错配修复功能缺陷)/MSI-H(microsatelliteinstability-high，高度微卫星不稳定)作为泛实体瘤患者进行免疫治疗的生物标志物。胃肠肿瘤，包括胃癌和结直肠癌，是dMMR/MSI-H型泛实体瘤中最常见的肿瘤之一。ICI对晚期或转移性dMMR/MSI-H胃肠肿瘤的临床疗效已在多项II期和III期研究中得到充分验证，客观缓解率(objective response rate,ORR)在33％至57.1％不等，即其中仍有一半左右甚至更多患者会发生免疫治疗原发耐药(不响应或快速进展)，不能从中获益。但是，临床上尚缺乏可靠的技术手段来甄别dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者中原发耐药的人群。因此，开发合适的生物标志物，精准筛选dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤免疫治疗耐药人群，减少患者不必要的治疗副作用和经济支出，是临床医生迫切需要解决的问题。
目前针对dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤免疫治疗耐药人群筛选生物标志物的研究报道较少。国外目前有四篇研究分别纳入了45例dMMR/MSI-H型胃肠道肿瘤患者、19例dMMR/MSI-H型胃癌患者、22例MSI-H型结直肠癌患者和29例高肿瘤突变负荷型(tumor mutationalburden-high；TMB-H)结直肠癌患者进行预测免疫治疗效果生物标志物的分析，均有分析TMB在区分免疫治疗效果中的作用，但研究结果并不一致。
尽管TMB已在2020年作为泛实体瘤患者进行免疫治疗的生物标志物获得美国FDA批准，但其批准引起颇多争议，TMB检测尚缺乏标准方法，不同检测机构的产品和算法各异，TMB阈值也无统一定论。针对dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤，有限的预测免疫治疗疗效的生物标志物研究中，有研究表明TMB低水平是免疫治疗效果差的生物标志物，也有研究显示TMB水平与免疫治疗效果无相关性，其中TMB检测平台和计算方法不一样，TMB-H的阈值为10～41不等。
因此，本领域急需一种可靠且方便应用于临床的预测dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的原发耐药性的生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够预测dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的原发耐药性的生物标志物，从而能够可靠且方便应用于临床。
在第一方面，本发明提供AKT1基因和/或CDH1基因、它们的mRNA、cDNA、或蛋白或检测试剂的用途，用于制备预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的检测试剂或检测试剂盒；或者预测肿瘤患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性的测试剂或检测试剂盒。
在具体的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。
在具体的实施方式中，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者。
在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。
在优选的实施方式中，所述预测是通过检测AKT1突变和/或CDH1突变的存在进行预测。
在优选的实施方式中，AKT1基因突变和/或CDH1基因突变的存在是胃肠肿瘤患者对ICI耐药的指征；AKT1突变和/或CDH1突变的存在是肿瘤患者对靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性的指征。
在优选的实施方式中，所述突变为点突变，包括但不限于单核苷酸多态性，碱基取代、插入、缺失、沉默突变、错义突变。
在优选的实施方式中，所述免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点，例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T-细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7/9等；优选PD-1、或PD-L1、或CTLA-4。
在第二方面，本发明提供一种用于预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的试剂盒，所述试剂盒中包括检测AKT1基因突变和/或CDH1基因突变、它们的mRNA、cDNA、或蛋白的试剂。
在具体的实施方式中，所述试剂盒还包括指导如何利用检测AKT1基因突变和/或CDH1基因突变的试剂来预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的使用说明书。
在具体的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。
在具体的实施方式中，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者。
在优选的实施方式中，所述检测剂在核酸水平进行；优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法；
在优选的实施方式中，所述检测剂在蛋白水平进行；优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括野生型AKT1基因和/或CDH1基因作为对照。
在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。
在第三方面，本发明提供AKT1基因和CDH1基因、它们的mRNA、cDNA、或蛋白或检测试剂的组合。
在优选的实施方式中，所述组合用于预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性或对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性，或用于制备预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的检测试剂或检测试剂盒，或用于制备预测肿瘤患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性的测试剂或检测试剂盒。
在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。
在第四方面，本发明提供一种预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的模型构建方法，包括以下步骤：
1)筛选能够预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药的基因；
2)构建并评估基因突变联合模型预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药；
3)验证突变联合模型在肿瘤患者中对免疫检查点抑制剂疗法耐药的预测价值；和
4)探究突变联合模型的预后价值。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者。
在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。
在第五方面，本发明提供一种预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药性，或者预测所述患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性的方法：
1)评估所述患者的AKT1基因突变；
2)评估所述患者的CDH1基因突变；
3)基于1)和2)评估结果预测所述患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性；或者预测所述患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者。
在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。
在优选的实施方式中，所述方法的具体步骤如下：
1)从样品中提取DNA，所述样品选自所述dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者的血液、血清、血浆、胸水、腹水、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种；
2)加入检测剂，靶向测序包含AKT1和CDH1两个基因的panel；
3)基因组改变分析：使用Burrows-Wheeler Aligner(v0.7.12)将原始测序序列与人类基因组参考序列(hg19)进行比对；以测序样本的配对白细胞DNA作为对照，去除胚系变异，获得样本体细胞变异；内容包括单碱基替换(SNV)、短片段插入缺失(Indel)、基因拷贝数变异(CNV)，基因重排、TMB、MSI；通过标准判断所鉴别的突变是否为真；MSI计算：选择已筛选出的覆盖范围排名前100的微卫星位点进行MSI(microsatellite instability,微卫星不稳定)测定；
4)预测所述患者对使用ICI的耐药性；或者预测所述患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性。
在第五方面，本发明提供AKT1基因和/或CDH1基因、它们的mRNA、cDNA、或蛋白或检测试剂，用于预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性；或者预测肿瘤患者对使用靶向AKT1和/或CDH1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ICI的敏感性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示在dMMR/MSI-H胃肠道肿瘤中，识别与ICI原发耐药相关的基因突变；(A)单变量Cox比例风险回归模型识别ICIs治疗后与PFS相关的特定基因突变。(B)特定基因-突变和野生型患者在ICI敏感组和耐药组中的百分比。(C和D)AKT1(C)或CDH1突变(D)与野生型患者PFS比较的Kaplan-Meier曲线。ICIs：免疫检查点抑制剂；dMMR：DNA错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；GI：胃肠；PFS：无进展生存；WT：野生型：Mut：突变体。
图2显示了发现队列中AKT1和CDH1基因的突变位点；
图3显示了IOpred在dMMR/MSI-H胃肠肿瘤中的模型构建及性能评价；其中(A)多变量Cox回归分析表明，AKT1和CDH1能够独立预测接受ICI治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者的PFS。AKT1和CDH1被整合为免疫肿瘤治疗预测因子(IOpred)，以识别不能从ICI获益的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者。(B-D)Kaplan-Meier曲线比较患有dMMR/MSI-H GI胃肠肿瘤(B)、胃癌(C)或肠癌(D)的IOpred-Mut和WT患者的PFS。(E)在患有dMMR/MSI-H胃肠肿瘤、胃癌或肠癌的ICI敏感和耐药患者中，IOpred-Mut和WT患者的百分比。(F)采用ROC曲线和AUC计算评价IOpred对dMMR/MSI-H胃肠肿瘤原发耐药的预测准确性。在胃肠道肿瘤数据集中，IOpred的AUC值为0.751(95％CI为0.639-0.862)，特异性为98％，敏感性为52％。dMMR：DNA错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；ICI：免疫检查点抑制剂；PFS：无进展生存；WT：野生型；Mut：突变；GI：胃肠；IC：肠癌；GC：胃癌；ROC：受试者特征；AUC：曲线下面积。
图4显示了验证队列中AKT1和CDH1基因的突变位点；
图5显示了ICIs对dMMR/MSI-H胃肠道肿瘤的原发耐药预测价值的验证；其中(A和B)在22例接受ICI治疗的dMMR/MSI-H胃肠道肿瘤患者中，IOpred-Mut和WT患者的PFS(A)和OS(B)的Kaplan-Meier曲线比较。(C)单因素Cox回归分析显示，只有IOpred与PFS显著相关。(D)在验证队列中，IOpred用于原发耐药预测的AUC值为0.658(95％CI 0.48-0.84)，特异性为91.67％，敏感性为40％。DNA错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；ICI：免疫检查点抑制剂；PFS：无进展生存；OS：总生存；WT：野生型；Mut：突变；GI：胃肠；AUC：曲线下面积；
图6显示了TCGA队列中AKT1/CDH1/IOpred突变或正常表型MSI-H胃肠肿瘤患者生存分析；其中(A-F)Kaplan-Meier曲线比较未接受ICI治疗的MSI-H TCGA-STAD和TCGA-CRC队列中AKT1/CDH1/IOpred-mut和WT患者的PFS(A-C)和OS(D-F)。MSI-H：高度微卫星不稳定；GI：胃肠；ICI：免疫检查点抑制剂；PFS：无进展生存期；OS：总生存期；WT：野生型；Mut：突变型；TCGA：癌症基因组图谱；STAD：胃腺癌；CRC：结直肠癌。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现AKT1基因和CDH1基因独立预测PFS和原发耐药。因此，AKT1和CDH1突变联合可以作为免疫肿瘤治疗预测因子(an immuno-oncology therapy predictor,IOpred)来识别对免疫检查点抑制剂(ICI)耐药的dMMR/MSI-H胃肠癌患者。在此基础上完成了本发明。
术语定义
原发性耐药
本文所用的术语“原发性耐药”或“原发耐药”是指开始免疫治疗后，首次肿瘤评估时为肿瘤进展(disease progression，PD)、3个月内死亡引起的不可评估(not estimable，NE)或无进展生存(progression-free survival，PFS)<6个月的稳定疾病(stabledisease，SD)的患者。
AKT1基因、CDH1基因和相关信号通路抑制剂
AKT1(NCBI登录号：NC_000014.9)作为AKT一种最常见的亚型，通过控制细胞内PI3Ks的水平成为PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性中心。PI3K/AKT/mTOR信号转导通路调节肿瘤细胞存活、增殖、分化、凋亡等多种过程，从而对肿瘤的发生、发展发挥关键性作用。该通路的过度活化广泛存在于各类癌种，包括乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、结直肠癌等。此外，越来越多的证据表明AKT1在调节免疫细胞发育中发挥着关键作用，包括T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞，它的突变通过创造免疫抑制条件和逃避免疫识别贡献于癌症的发生和发展。
CDH1(NCBI登录号：NC_000016.10)作为广泛报道的肿瘤抑制基因，编码上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)，参与调节上皮细胞间的粘附、迁移和增殖，其功能缺失突变与肿瘤侵袭和转移的增加相关。近几年，也有一些研究报道了CDH1表达与免疫疗效的相关性，例如Hugo等人报道了在接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者中，应答的患者相比于非应答的患者具有较高的CDH1表达。此外，在kwon等人进行的派姆单抗治疗晚期MSI-H型胃癌患者的II期试验中，19例患者中有5例有CDH1突变，他们均对抗PD-1治疗无反应。
突变
本文所用的“突变”或“基因突变”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
在具体的实施方式中，所述突变可以是点突变，包括但不限于单核苷酸多态性、碱基取代、插入、缺失、沉默突变、错义突变，等等。
免疫检查点抑制剂(ICI)
本文所用的“免疫检查点(immune cheeckpoint)”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指在免疫系统中起抑制作用的调节分子，其起到维持自身耐受、防止自身免疫反应、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化等作用。
免疫检查点分子表达于免疫细胞上，将抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，肿瘤形成免疫逃逸。与肿瘤相关的免疫检查点分子主要有：程序性死亡受体1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；本发明也包括一些新发现的免疫检查点，例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T-细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7/9等。在优选的实施方式中，免疫检查点分子是PD-1或PD-L1。
免疫检查点抑制剂就是针对相应的免疫检查点研发的一些抑制性药物，例如单抗类药物，其主要作用为阻断表达免疫检查点的肿瘤细胞与免疫细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用。
dMMR、MSI-H以及dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤
本文所用的“微卫星(Microsatellite)”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指基因组中的一类短串联重复DNA序列，一般由1-6个核苷酸组成，呈串联重复排列。由于其核心重复单元重复次数差异，微卫星具有群体多态性。
微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是指与正常组织相比，肿瘤中某个微卫星位点由于重复单元的插入或缺失而出现新的微卫星等位基因的现象。
DNA错配修复(Mismatch Repair,MMR)是重要的DNA错配修复机制，能识别及修复在DNA复制或重组过程中产生的DNA错配，小范围的碱基缺失或插入，对维持基因组稳定性、遗传后代的精确性有着重要的作用。当DNA错配修复出现功能性缺陷，即本文所述的“dMMR(DNA mismatch repair-deficient)”时，微卫星不稳定性的现象无法得到修复，积累到一定程度即出现高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)。IHC检测到的dMMR与NGS/PCR检测到的MSI-H的一致性在90％以上。dMMR/MSI-H是临床上的一项重要的肿瘤标志物。本文所用的“dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤”是指其特征为具有“dMMR或和MSI-H”的一类肿瘤。
在具体的实施方式中，所述发现队列中dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者，在该队列中，dMMR和MSI-H状态至少有3种检测方式(NGS，PCR和IHC)中的两种确认，其中NGS是必须进行的检测方式；所述验证队列中dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，包括dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者，在该队列中，dMMR和MSI-H状态有IHC和/或PCR确认。
本发明的首要目的是提供一种能够有效预测肿瘤，特别是dMMR/MSI-H胃肠癌患者对免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的方法。为此，本发明提供了一种预测dMMR/MSI-H胃肠肿瘤免疫治疗耐药的模型构建方法，所述方法包括以下步骤：
1.筛选能够预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药的基因
患者纳入分析需满足以下条件：1)病例记录为dMMR/MSI-H的胃肠肿瘤表型，其中dMMR经免疫组化(immunohistochemistry,IHC)确认，MSI-H经聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)确认；2)有ICI疗效数据；3)有使用ICI治疗前的任一形式的样本获得的NGS检测数据，本研究中采用组织或血液样品进行NGS检测。
根据上文的原发耐药的定义，将病人分为ICI-耐药组和ICI-敏感组。
通过三步法在发现队列中筛选原发耐药预测基因：
第一步：通过单变量Cox比例风险回归模型筛选与PFS(Progression-freesurvival，无进展生存期)显著相关的基因组突变(P<0.05)；
第二步：比较第一步筛选的基因在ICI-耐药组和ICI-敏感组突变频率的差异，识别有显著突变频率差异的基因(P<0.05)；
第三步：基因突变需要满足突变频率≥5％的标准，以保证两组之间的比例差异不是由随机发生的突变引起的。
通过以上三步连续步骤筛选出的基因突变作为生物标志物来预测dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者对免疫治疗耐药的情况。
2.构建并评估基因突变联合模型预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药
多个基因突变联合模型构建需满足以下两个条件：1)多变量Cox回归分析显示每个基因突变均是PFS的独立预测因子(P<0.05)；2)多变量逻辑回归分析显示每个基因突变均与原发性耐药独立相关(P<0.05)。符合以上条件的基因突变进行联合来预测对ICI耐药的dMMR/MSI-H胃肠癌患者。
联合模型通过以下分析评估其性能：1)单因素Cox回归分析该模型是否是接受ICI治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者PFS的独立预测因子；2)采用受试者工作特性(a receiveroperating characteristic,ROC)曲线及对应的曲线下面积(area under curve,AUC)来评价联合模型预测ICI原发耐药的准确性。
3.验证突变联合模型对dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药的预测价值
采用独立的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤验证队列
通过对数秩检验(log-rank test)方法比较卡普兰-迈耶生存曲线(Kaplan-Meiersurvival curves)分析突变联合模型与患者PFS和总生存(overall survival,OS)的相关性。
采用ROC曲线评价突变联合模型在验证队列中识别原发耐药患者的能力。
4.探究突变联合模型的预后价值
通过从公共数据库例如：癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下载未接受免疫治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者，探究突变联合模型对预后的影响，如对预后无影响，说明其仅作为免疫治疗疗效的标记物；如果与预后相关，需要计算交互p值，明确是否其ICI疗效预测价值来源于它的预后功能。
通过以上步骤，本发明人识别AKT1和CDH1为dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者免疫治疗耐药基因，并且这两个基因均独立预测PFS和原发耐药。基于此，AKT1和CDH1突变联合作为免疫肿瘤治疗预测因子(an immuno-oncology therapy predictor,IOpred)来识别对ICI耐药的dMMR/MSI-H胃肠癌患者。验证队列证实了IOpred的预测价值，TCGA展示IOpred无预后功能。
本发明还提供一种IOpred基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者对ICI原发耐药的试剂盒中的应用；
1.试验方法：本发明使用成品商业化试剂盒，对肿瘤细胞占比在20％以上的石蜡包埋组织及血液样本的DNA进行提取，提取后的核酸经过定量及分析合格后进入文库构建。
具体的：本发明文库构建使用探针杂交捕获方法，所用建库及杂交捕获试剂为商业化试剂，探针为定制。提取质控合格的核酸经聚焦超声仪将DNA剪切成250bp的片段。文库按照商业化试剂盒KAPA Hyper Prep Kit的协议制备。文库的浓度和大小分布分别用Qubit3.0荧光仪和LabChip GX Touch HT分析仪测定。文库浓度及片段均符合预期后按照要求进行上机测序。
库检合格后，把不同文库按照目标下机数据量的需求pooling后使用IlluminaNovaseq 6000进行PE100bp的测序。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
本发明靶向测序包含AKT1和CDH1两个基因的任何panel，包括但不限于：381、733或189个基因。可检测单碱基替换(SNV)、短片段插入缺失(Indel)、基因拷贝数变异(CNV)，基因重排、TMB、MSI，可为患者提供靶向、化疗、免疫治疗及遗传风险等相关的检测结果。
2.基因组改变分析
本发明检测基因组改变的内容，包括SNV、Indel、CNV和基因重排。使用Burrows-Wheeler Aligner(v0.7.12)将原始测序序列与人类基因组参考序列(hg19)进行比对。以测序样本的配对白细胞DNA作为对照，去除胚系变异，获得样本体细胞变异。
判断所鉴别的突变是否为真
MSI计算：选择已筛选出的覆盖范围排名前100的微卫星位点进行MSI(microsatellite instability,微卫星不稳定)测定。对于每个样本，计算微卫星不稳定位点的百分比，认为大于0.4的百分比为高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)，否则为微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。
在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括其他基因突变的检测剂。
鉴于AKT1和CDH1基因均为能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和蛋白水平上，本领域技术人员可以从转录和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生基因突变，这些都可以应用于本发明。
因此，在具体的实施方式中，所述检测剂可以在核酸水平进行检测，即检测AKT1和CDH1基因，或者它们的mRNA、cDNA、蛋白。优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。在另一具体的实施方式中，所述检测剂还可以在蛋白水平进行检测，即检测AKT1和CDH1基因的编码蛋白。优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
所述样品选自所述dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者的血液、血清、血浆、胸水、腹水、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
本发明还提供一种预测或筛查dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者对ICI原发耐药预测试剂盒，所述试剂盒中包含用于AKT1和CDH1突变检测的试剂。优选地，所述试剂盒中还包括其他基因突变检测的试剂。
本发明涉及的样本可以是肿瘤组织和外周血；或者，样本可以是：血清、血浆、脑脊液、胸腹水、肿瘤组织裂解液、细胞培养上清液、精液、尿液以及唾液样品中的至少一种。
本发明的优点：
1、尽管FDA已批准ICI用于dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者的治疗，但仍有约50％的患者不能从ICI治疗中长期获益，目前尚无明确的生物标志物来区分这些对ICI原发耐药的患者。本发明筛选出IOpred基因突变作为预测dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者中对ICI原发耐药的生物标志物；在本发明通过IOpred基因突变，能够准确预测耐药人群，避免盲目用药，提高ICI治疗的经济性能。
2、本发明中采用的IOpred基因突变可通过液体活检(本研究中使用的是血液)获取，克服了晚期患者组织难获取的问题，扩大了其在临床实践中的运用范围。
3、本发明方法有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，适于推广应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅以阐释为目的而非限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
实施例
本发明具体采用如下方法学进行研究
样本材料：
发现队列：65个ICI治疗前的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤组织样本及对照白细胞(WBC)样本(所有患者NGS鉴定均为MSI-H)，其中50例肠癌(intestinal cancer,IC)和15例胃癌(gastric cancer，GC)患者，38例具有一致的免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)鉴定的dMMR和MSI-H表型，26例为IHC鉴定的dMMR，没有PCR数据，1例为PCR-MSI-H，没有IHC数据。表1总结了患者的基线特征。研究通过靶向捕获NGS测序分析，具体涉及包含381或733个癌症相关基因的组合。
验证队列：22个ICI治疗前的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤血液样本，其中16个IC，6个GC患者，所有病例均经IHC诊断为dMMR，其中15例经肿瘤组织PCR鉴定为MSI-H，其余7例无PCR数据。表3总结了患者的基线特征。研究通过靶向捕获NGS测序分析，具体涉及包含189个癌症相关基因的组合。
实施例1.发现队列dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者表征
表1.发现队列中dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者基本特征
dMMR：错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；GI：胃肠；ICI：免疫检查点抑制物；ECOG PS：东方合作肿瘤学小组表现状态；IC：肠癌；GC：胃癌；PD-1：程序性死亡1；PD-L1：程序性死亡配体1；HER2：人表皮生长因子受体2；CTLA4：细胞毒性T淋巴细胞抗原-4；TPS：肿瘤比例评分；LS：林奇综合征。
大多数患者(62/65，95.38％)有良好的身体状况(ECOG 0或1)，并既往接受过至少一次全身性治疗(54/65，83.08％)。1例HER2阳性(1/53，1.89％)和8例(8/49，16.33％)PD-L1 TPS≥1％的患者。14例(21.54％)诊断为林奇综合征(Lynch syndrome，LS)。57例(57/65，87.69％)接受抗PD-1/L1单药治疗，8例(8/65，12.31％)接受抗PD-1/L1联合抗CTLA-4治疗。中位随访时间20.20个月，免疫治疗的客观反应率(objective response rate，ORR)为53.85％，其中部分缓解(partial response，PR)的29例，完全缓解的(complete response，CR)6例。中位PFS(MPFS)为10.43个月，中位总生存(MOS)为20.20个月。原发耐药定义为开始免疫治疗后，首次肿瘤评估时为肿瘤进展(disease progression，PD)、3个月内死亡引起的不可评估(not estimable，NE)或无进展生存(Progression-free survival，PFS)<6个月的稳定疾病(stable disease，SD)的患者。根据原发性耐药的定义，65例患者中，21例(32.31％)属于ICI-耐药组，44例(67.69％)为ICI-敏感组。两组间的人口统计学和基线特征在总体上是平衡的。
实施例2.筛选能够预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药的基因
通过三步法筛选原发耐药预测基因：
第一步：通过单变量Cox比例风险回归模型筛选与PFS显著相关的基因组突变(P<0.05)；共筛选出三个基因AKT1、CDH1和CUL3(P＝0.013for AKT1；P＝0.046for CUL3；和P＝0.046for CDH1)(图1A)。
第二步：比较第一步筛选的三个基因在ICI-耐药组和ICI-敏感组突变频率的差异，识别有显著突变频率差异的基因(P<0.05)，发现AKT1和CDH1在耐药组和敏感组突变频率有显著差异(P＝0.002for AKT1；P＝0.005for CDH1)，CUL3在两组的突变频率无差异(P＝0.080)，(图1B)。
第三步：基因突变需要满足突变频率≥5％的标准，以保证两组之间的比例差异不是由随机发生的突变引起的。AKT1和CDH1的突变频率均≥5％。进一步对AKT1和CDH1基因突变位点进行分析，发现基因变异位点散布于AKT1和CDH1基因全长(图2)。
通过以上三步连续筛选，识别AKT1和CDH1这两个基因作为生物标志物来预测预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者对免疫治疗耐药的情况。此外，Kaplan-Meier生存曲线展示接受ICI治疗后，AKT1或CDH1突变的患者相比于野生型患者均有较差的PFS(图1C和D)。
实施例3.构建AKT1和CDH1突变联合模型预测dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药
在发现队列中，有5名AKT1-mut(mut：突变)患者，6名CDH1-mut患者，1名AKT1和CDH1共突变患者。
鉴于满足以下两个条件：1，多变量Cox回归分析显示AKT1和CDH1是PFS的独立预测因子(P<0.05，图3A)；2，多变量逻辑回归分析显示AKT1和CDH1与原发性耐药独立相关(P<0.05)。我们联合AKT1和CDH1突变作为免疫肿瘤治疗预测因子IOpred来识别对ICI耐药的dMMR/MSI-H胃肠癌患者。发现无论是在dMMR/MSI-H表型的胃癌，肠癌还是整体的胃肠肿瘤中，IOpred-mut(CDH1或AKT1突变)的患者在接受ICI治疗后均有较差的PFS相比于野生型的患者(图3B-D)。为了进一步评价IOpred对免疫治疗疗效的预测价值，我们对IOpred与临床病理参数进行单因素Cox回归分析，结果显示IOpred是接受ICI治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者PFS的唯一预测因子(表2)。IOpred突变显著富集在原发耐药组中(图2E)。此外，采用受试者工作特性(a receiver operating characteristic，ROC)曲线及对应的曲线下面积(area under curve，AUC)来评价IOpred预测ICI原发耐药的准确性。AUC值为0.751(95％CI0.64-0.86)，特异性为98％(95％CI 0.88-1.00)，敏感性为52％(95％CI 0.32-0.72)。
表2.发现队列中dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者临床分子因素与PFS相关性的单因素和多因素分析
dMMR：DNA错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；GI：胃肠；ICI：免疫检查点抑制剂；Mut：突变；WT：野生型；PD-1：程序性死亡1；PD-L1：程序化死亡配体1；CTLA4：细胞毒性T淋巴细胞抗原4；Mono：抗PD-1/L1单药治疗；Comb：抗CTLA4联合抗PD-1/L1治疗；ECOG PS：东部合作肿瘤学小组(ECOG)表现状态(PS)；IC：肠癌；GC：胃癌；LS：林奇综合症。
实施例4.验证IOpred对dMMR/MSI-H胃肠癌患者免疫治疗耐药的预测价值
独立的验证队列包含22个接受免疫治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者，其基本特征展示在表3。在该队列中，AKT1和CDH1突变频率分别为13.64％(3/22)9.09％(2/22)。进一步对AKT1和CDH1基因突变位点进行分析，发现基因变异位点比较分散，没有明显的热点突变区域(图4)。生存分析展示接受ICI治疗后，IOpred-mut相比于IOpred-wt患者有显著差的PFS和OS(图5A和B)。Cox回归分析展示IOpred也是接受ICI治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者PFS的唯一预测因子(图5C)。在验证队列中，IOpred用于初步耐药预测的AUC值为0.658(95％CI 0.48-0.84)，特异性为91.67％(95％CI 0.65-0.99)，敏感性为40％(95％CI0.17-0.69)(图5D)。
表3.验证队列中dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者的基本特征
缩写：dMMR：错配修复缺陷；MSI-H：高度微卫星不稳定；GI：胃肠；ICI：免疫检查点抑制物；ECOG PS：东方合作肿瘤学小组表现状态；IC：肠癌；GC：胃癌；PD-1：程序性死亡1；PD-L1：程序性死亡配体1；HER2：人表皮生长因子受体2；CTLA4：细胞毒性T淋巴细胞抗原-4；TPS：肿瘤比例评分；LS：林奇综合征。
实施例5.IOpred预后价值的探究
通过从公共数据库TCGA下载未接受免疫治疗的dMMR/MSI-H胃肠肿瘤患者，探究IOpred对预后的影响，在152例患者TCGA队列中，30例患者为IOpred-Mut，包括18例结肠癌(CRC)和12例胃癌。在这些病例中，单个AKT1或CDH1突变和IOpred-mut均与PFS或OS无关(图6)。
可见IOpred不是预后标志物，仅作为ICI疗效的预测标志物，其突变与dMMR/MSI-H胃肠肿瘤中对ICI的原发耐药和PFS显著相关。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.AKT1基因突变和CDH1基因突变的检测试剂在制备预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的检测试剂盒中的用途，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃肠肿瘤患者，所述突变为点突变，所述免疫检查点为PD-1、PD-L1和/或CTLA-4。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤患者为dMMR/MSI-H型胃癌或肠癌患者。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述耐药性是原发耐药性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210494920.8A CN114736967B (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210494920.8A CN114736967B (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114736967A CN114736967A (zh) | 2022-07-12 |
| CN114736967B true CN114736967B (zh) | 2024-06-11 |
Family
ID=82285686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210494920.8A Active CN114736967B (zh) | 2022-05-07 | 2022-05-07 | 预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114736967B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946639A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-09-30 | 益善生物技术股份有限公司 | 构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒 |
| CN105223357A (zh) * | 2010-09-16 | 2016-01-06 | Cbs生物科学有限公司 | 预测肝癌预后的组合物或试剂盒 |
| WO2018183928A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating tumor |
| WO2019108807A1 (en) * | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Personal Genome Diagnositics Inc. | Process for microsatellite instability detection |
| AU2018304458A1 (en) * | 2017-07-21 | 2020-02-06 | Foundation Medicine, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods for cancer |
| CN114231628A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-25 | 无锡臻和生物科技有限公司 | 预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物组合及其应用 |
-
2022
- 2022-05-07 CN CN202210494920.8A patent/CN114736967B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105223357A (zh) * | 2010-09-16 | 2016-01-06 | Cbs生物科学有限公司 | 预测肝癌预后的组合物或试剂盒 |
| CN104946639A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-09-30 | 益善生物技术股份有限公司 | 构建基因突变测序文库的引物和方法以及试剂盒 |
| WO2018183928A1 (en) * | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating tumor |
| AU2018304458A1 (en) * | 2017-07-21 | 2020-02-06 | Foundation Medicine, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods for cancer |
| WO2019108807A1 (en) * | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Personal Genome Diagnositics Inc. | Process for microsatellite instability detection |
| CN114231628A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-25 | 无锡臻和生物科技有限公司 | 预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物组合及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Combination of AKT1 and CDH1 mutations predicts primary resistance to immunotherapy in dMMR/MSI-H gastrointestinal cancer;Wang, Z等;Journal for immunotherapy of cancer;第10卷(第6期);1-14 * |
| Molecular target: pan-AKT in gastric cancer;Byung Woog Kang等;ESMO Open;第5卷(第5期);e000728 * |
| 与胃癌发病相关的核心基因筛选及生物学功能分析;宋思源等;山东医药;第61卷(第30期);1-5 * |
| 肿瘤免疫治疗标志物的研究进展;邹建玲等;中国医学前沿杂志 (电子版);第9卷(第10期);21-25 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114736967A (zh) | 2022-07-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jia et al. | Titin mutation associated with responsiveness to checkpoint blockades in solid tumors | |
| Schrock et al. | Tumor mutational burden is predictive of response to immune checkpoint inhibitors in MSI-high metastatic colorectal cancer | |
| Meléndez et al. | Methods of measurement for tumor mutational burden in tumor tissue | |
| Rodrigues et al. | Immunogenomic analyses associate immunological alterations with mismatch repair defects in prostate cancer | |
| CA3121170A1 (en) | Next-generation molecular profiling | |
| WO2021112918A1 (en) | Pan-cancer platinum response predictor | |
| JP2015536667A (ja) | 癌のための分子診断検査 | |
| EP2326734A2 (en) | Pathways underlying pancreatic tumorigenesis and an hereditary pancreatic cancer gene | |
| WO2021222867A1 (en) | Immunotherapy response signature | |
| US20200386760A1 (en) | Prediction of response to immune-modulatory therapies | |
| KR20160073798A (ko) | 암 환자의 예후 및 항암제 감수성 예측용 마커 조성물 | |
| CN111254196B (zh) | Inpp4b基因变异在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 | |
| Bevins et al. | Comparison of commonly used solid tumor targeted gene sequencing panels for estimating tumor mutation burden shows analytical and prognostic concordance within the cancer genome atlas cohort | |
| US20240336971A1 (en) | Biomarkers for Therapy Response After Immunotherapy | |
| CN111088362A (zh) | Swi/snf复合体相关基因变异在预测非小细胞肺癌患者对ici疗法敏感性中的应用 | |
| CN112921091B (zh) | Flt3基因突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 | |
| Theelen et al. | Absence of PD-L1 expression on tumor cells in the context of an activated immune infiltrate may indicate impaired IFNγ signaling in non-small cell lung cancer | |
| Wu et al. | An ICD-Associated DAMP Gene signature predicts survival and immunotherapy response of patients with lung adenocarcinoma | |
| CN110923329B (zh) | Fgfr4点突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 | |
| CN111269979A (zh) | Arid1b基因变异在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 | |
| CN114736967B (zh) | 预测免疫检查点抑制剂疗法原发耐药的标志物及方法 | |
| CA3198134A1 (en) | Immunotherapy response signature | |
| CN112342296A (zh) | 用于实体瘤免疫检查点抑制剂疗法预测的kmt2家族基因变异标志物和试剂盒 | |
| WO2024203804A1 (ja) | 対象における免疫チェックポイント阻害剤（ｉｃｉ）による治療に対する有効性を予測する方法、対象における腫瘍を処置する方法 | |
| KR20230112567A (ko) | 면역항암제 유도 면역관련 이상반응의 발병 예측을 위한 snp 기반 모델 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |