JP7189020B2 - 癌のエピジェネティックプロファイリング - Google Patents
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Description
この出願は、シンガポール出願第10201601141X号、2016年2月16日出願およびシンガポール出願第10201606828P号、2016年8月16日出願の優先権の利益を主張し、これらの内容は、すべての目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、癌、特に、癌における調節エレメントに関する。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備える、方法が提供される。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を示す、方法が提供される。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナルに基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在を、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在は、被験者における癌の予後を示す、方法が提供される。
a)被験者から得られた生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を対照生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナルに対して比較するステップと、
f)少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと、
g)少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を癌または胃腸疾患関連SNPを備える参照ゲノム配列に対してマッピングするステップと
を備え、1つ以上の癌または胃腸疾患関連SNPと関連付けられた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在は、癌または胃腸疾患に対する被験者の感受性を示す、方法が提供される。
a)癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、癌細胞生存期間または癌細胞生存率を予測する、方法が提供される。
本明細書に用いられる以下の単語および用語は、示された意味を有するものとする。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体または複数の抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域または複数の領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備える。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体または複数の抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域または複数の領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を示す、方法が提供される。
a)被験者から得られた癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体または複数の抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域または複数の領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナルに基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在を、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在は、被験者における癌の予後を示す、方法が提供される。
a)被験者から得られた生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体または複数の抗体と接触させるステップと、
b)生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域または複数の領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を対照生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナルに対して比較するステップと、
f)少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと、
g)少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在を癌または胃腸疾患関連SNPを備える参照ゲノム配列に対してマッピングするステップと
を備え、1つ以上の癌または胃腸疾患関連SNPと関連付けられた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在または非存在は、癌または胃腸疾患に対する被験者の感受性を示す、方法が提供される。
a)癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)癌生体試料から核酸を単離するステップであって、単離された核酸は、ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備える、単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーをヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、マッピングするステップと、
d)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーを同定するために、単離された核酸中の少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つのエンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度を非癌生体試料から得られた少なくとも1つのスーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップと、
f)被験者における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を少なくとも1つのスーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと
を備え、非癌生体試料と比較して、癌生体試料における少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、癌細胞生存期間または癌細胞生存率を予測する、方法が提供される。
1次組織試料および細胞株
1次患者試料は、SingHealth Centralised Institutional Review Boardからの認可および患者署名入りインフォームド・コンセントを伴ってSingHealth組織リポジトリから得た。この研究に用いた「正常」(すなわち、非悪性)試料は、胃から、腫瘍から遠く離れ、外科的評価の際に腫瘍または腸上皮化生/異形成の視認できる証拠を示していない部位から収集した試料を指す。腫瘍試料は、40%超の腫瘍細胞を含むことを凍結切片によって確認した。FU97、MKN7、OCUM-1およびRERF-GC-1B細胞は、Japan Health Science Research Bank(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)から得た。KATO-IIIおよびSNU16細胞は、American Type Culture Collectionから得た。NCC-59は、Korean Cell Line Bankから得た。YCC3、YCC7、YCC21、YCC22は、Yonsei Cancer Centre,韓国から贈られた。細胞株の同一性は、Centre for Translational Research and Diagnostics(Cancer Science Institute of Singapore,シンガポール)で行ったSTR DNAプロファイリングによって確認した。STRプロファイルを標準ANSI/ATCC ASN-0002-2011命名法に従って評価し、本発明者らの細胞株のプロファイルは、参照データベースに対して80%超の類似性を示した。MKN7細胞-ICLAC(http://iclac.org/databases/cross-contaminations/)により概して誤認される1つの株は、Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank(JCRB細胞バンク)におけるMKN7参照プロファイルとの完全な一致(100%)を示すことによってこれを確認した。マイコプラズマ汚染を検出するために、MycoAlert(登録商標)Mycoplasma Detection Kit(Lonza)およびMycoSensor qPCRアッセイキット(アジレント・テクノロジー)を用いた。すべての細胞株がマイコプラズマ汚染について陰性であった。この研究のために、OCUM-1およびSNU16細胞を2つの理由で主要細胞株モデルとして選択した。第1に、OCUM-1およびSNU16細胞は、低分化胃腺癌をもつ患者から元々単離され、この研究における1次GCの過半数が低分化である(63%)。第2に、OCUM-1およびSNU16は、これまでに多くの他の公表された研究で胃癌(GC)モデルとして用いられ、従って、この分野で受け入れられたGCモデルであると見做される。従って、Capture-C、4C、エンハンサーCRISPR、転写因子結合、および転写因子ノックダウンを含めて、いくつかの実験のための一貫した細胞株モデルとしてOCUM-1およびSNU16を用いた。
Nano ChIPseqをわずかな修正を伴って記載したように行った。1次組織については、ChIPごとに約5mgサイズの小片を得るために、剃刀の刃を用いて新鮮冷凍癌および正常組織を液体窒素中で切開した。組織片を室温において10分間、1%ホルムアルデヒト/PBSバッファー中で固定した。グリシンを125mMの最終濃度まで添加することによって固定を停止した。組織片をTBSEバッファーで3回洗浄した。細胞株ついては、100万個の新鮮な収集細胞を室温において10分(min)間、1%ホルムアルデヒト/溶媒バッファー中で固定した。グリシンを125mMの最終濃度まで添加することによって固定を停止した。固定した細胞をTBSEバッファーで3回洗浄して、遠心分離した(5,000r.p.m.,5分)。ペレット状の細胞および粉砕した組織を100μlの1%SDS溶解バッファー中に溶解して、Bioruptor(Diagenode)を用いて300~500bpへ超音波処理した。ChIPは、次の抗体:H3K4me3(07-473,ミリポア)、H3K4me1(ab8895,アブカム)、H3K27ac(ab4729,アブカム)を用いて行った。
アラインメント前に最初および最後の10個の塩基をトリミングした後に、Burrows-Wheeler Aligner(BWA-MEM,バージョン0.7.0)を用いて配列リードをヒト参照ゲノム(hg19)に対してマッピングした。高品質のマッピングリード(MAPQ≧10)のみを下流解析のために維持した。MAPQ値(≧10)を選んだが、その理由は、i)この値が、良好/確信的なリードマッピングに用いるのに良い値であることが先に報告され、ii)MAPQ≧10が、彼らのソフトウェアを用いた確信的なマッピングに用いるのに適した閾値であることもBWAアルゴリズムの開発者らによって示され、iii)リードアラインメントに関する様々なアルゴリズムを評価する研究が、マッピング品質スコアは、リードマッピングが真/正確である尤度と良好には相関付けられないことも示し、かつマッピング精度について得られる精度のレベルが10~12MAPQの閾値間で横這いになることを示したためである。この研究は、複数の試料で確実に検出され、解析のロバスト性を高める反復性予測エンハンサーおよびスーパーエンハンサーに焦点を合わせる。配列カバレッジは、ウィンドウサイズが50bpで、リード長を200bpに延長したMEDIPSを用いて計算した。入力ライブラリと比較して著しいChIP濃縮(FDR<5%)を伴うピークをCCAT(バージョン3)を用いて検出した。ライブラリおよび領域サイズによって正規化したマッピングリードの総数、キロベース当たり、100万マッピングリード当たりのリード(RPKM)と等価なメトリックをカウントすることによって、領域内のピーク密度を計算した。この正規化法は、リードが長い方の領域に入る確率が高くなることによるバイアスを調整し、これまでの研究に適用されてきた。この研究は、研究を他の研究と比較可能にするためにRPKMベースの正規化を適用することを選んだ。バックグラウンド・シグナルを考慮するために、各ChIPライブラリのリード密度を対応する入力ライブラリに対して補正した。COMBATを用い、試料変動を確実に等しくするために、複数の試料にわたってリード密度を潜在的なバッチ効果(例えば、ChIPアッセイのデータ)について補正した。2つ以上の細胞株で検出した17,360個の反復性予測エンハンサーのうちで、98%が少なくとも1つの1次試料(正常またはGC)中に存在した。
2つの異なる方法を用いて、ChIPライブラリ(H3K27ac、H3K4me3およびH3K4me1)の品質を評価した。第1に、ChIP品質、特にH3K27acおよびH3K4me3をタンパク質コード遺伝子のアノテートされたプロモーターにおけるそれらの濃縮レベルを調べることによって推定した。具体的には、本研究は、高発現タンパク質コード遺伝子と関連付けられた1,000個のプロモーターにおける入力および入力補正ChIPシグナルのメジアン・リード密度を計算した。試料ごとに、データ品質のサロゲートとしてH3K27ac割る入力のリード密度比を比較し、H3K27ac/入力比が4倍より大きかった試料のみを維持した。この基準を用いると、50個のH3K27ac試料(GC株および1次試料)のうち48個が4倍より大きい濃縮を示し、好結果の濃縮を示した。H3K4me3ライブラリ(プロモーターマーク)についても同様の解析を行い、すべての42個のライブラリがこの品質管理基準を満たした。第2に、CHANCE(CHip-seq Analytics and Confidence Estimation(CHip-seqアナリティクスおよび信頼推定))、CHip-seq品質管理および好結果または弱い濃縮を用いたことをライブラリが示すかどうかを指示するプロトコル最適化のためのソフトウェアを用いた。本研究における試料の大多数(85%)がCHANCEによって評価した通り好結果の濃縮を示すことがわかった。両方の方法によって評価した、ライブラリごとの評価状況を表1に報告する。
エピゲノムロードマップ正常胃組織のクロマチンアクセシビリティ・プロファイルは、Gene Expression Omnibusから得た(GSM1027325,GSM1027320)。クロマチンアクセシビリティ・プロファイルのリード密度を予測エンハンサー領域について計算し、RPKM単位で100,000個のランダムに選択した領域に対して比較した。本研究は、25個のロードマップ・クロマチンアクセシビリティおよびH3K27acプロファイルから、オープンクロマチン領域(.narrowPeak)および活性な調節エレメント(H3K27ac,.gappedPeak)と重複する予測エンハンサーの割合も計算した。転写因子結合濃縮解析については、ENCODE(wgEncodeRegTfbsClusteredV3.bed)によってキュレートしたP300および他の転写因子の結合座標をUCSCゲノムブラウザからダウンロードした。BEDTools交差を用いて少なくとも1bpの重複を同定した。進化的塩基配列保存性(evolutionary sequence conservation)のレベルをPhastConstスコア(Castelo R.phastCons100way.UCSC.hg19:UCSC phastCons conservation scores for hg19. R package version 3.2.0)を用いて評価した。エンハンサー中間点から500bp以内の最高スコアをエンハンサー保存スコアとして用いた。予め検出したエンハンサー領域を除いて、10,000個のランダムに選択した領域についても保存スコアを計算した。
予測エンハンサーは、アノテートされた転写開始点(TSS)から少なくとも2.5kbにあり、H3K4me1の濃縮およびH3K4me3の枯渇も示す、濃縮されたH3K27acの領域として定義した。この研究のためのTSSアノテーションは、GENCODEバージョン19に由来した。H3K4me3/H3K4me1対数比をGC細胞株および1次試料から集約したH3K4me3およびH3K4me1シグナルを用いて計算した。高いH3K27acシグナルを示すが、高いH3K4me3/H3K4me1対数比(>2.4)を示す遠位予測エンハンサーは、誤った予測として分類し、従って、解析から除外した。次に、ROSEアルゴリズムを用いて、予測エンハンサーを予測スーパーエンハンサーまたは典型エンハンサーへ再分割した。複数のGC株にわたって少なくとも1つの塩基重複をもつ予測スーパーエンハンサー領域をBEDToolsを用いてマージし、予測スーパーエンハンサー領域とは別個の領域に局在している予測エンハンサーを予測典型エンハンサーと名付けた。個々の試料における予測典型または予測スーパーエンハンサーの存在をバックグラウンド超のH3K27ac濃縮のレベル(P<0.01,経験的検定)によって判定し、このレベルは、100,000個のランダムに選択した領域からのH3K27acシグナル(RPKM単位)であった。予測エンハンサー/スーパーエンハンサーを遺伝子へ割り当てるために、予測エンハンサー/スーパーエンハンサー中心から、ランダムに選んだ領域を超えるH3K27ac濃縮を伴うプロモーター(TSSにおける500bpのフランキング)として定義される、最近接の活性な転写開始点(TSS)への距離を算出した。反復性予測スーパーエンハンサーと関連付けられた遺伝子をフィシャーの片側正確検定を用いて癌遺伝子濃縮について試験した。上位500個の癌遺伝子を用いた。反復性予測エンハンサーおよび予測スーパーエンハンサーを同定するために、各GC株における領域をシグナル強度に従ってランク付けした。ランクプロダクト(rank prduct)を計算するために、複数の株にわたって各予測エンハンサー/スーパーエンハンサーのランクを乗算した。ランクプロダクトの統計学的有意性を判定するために、観測したランクプロダクトを帰無分布に対して比較し-各株におけるランクをリシャッフルして、ランクプロダクトを計算した。10,000回の反復についてリシャッフル手順を繰り返した。帰無分布未満の観測したランクプロダクトを統計学的に有意であると見做した。
スーパーエンハンサー/遺伝子の割り当ては、3つの直交する相互作用データセットを用いて検証した。これらは、以下を含んだ。
i)12個の細胞株からPreSTIGEによって検出した所定の相互作用。シス調節エレメントおよび標的遺伝子を含む、PreSTIGE相互作用データは、PreSTIGEウェブサイト(prestige.case.edu)からダウンロードした。
ii)デフォルト・パラメータを用いたGREATによるシス調節エレメント/遺伝子の割り当て
iii)K562、HCT-116、NB4、MCF-7、HeLa-S3およびGM12878細胞におけるRNAPII ChIA-PET研究からのエンハンサー-プロモーター相互作用の参照セット。ChIA-PET相互作用データは、encodeproject.orgおよびGSE72816からダウンロードした。各生物学的レプリケートで同定したすべての相互作用を検証のために考慮した。これらの相互作用は、2つの遺伝子座(アンカー)を含み、一方は、TSSの2.5kb以内にあり、他方のアンカーは、本発明者らの研究において見出した予測スーパーエンハンサー領域と重複する。
反復性予測スーパーエンハンサー/遺伝子プロモーターまたは予測典型エンハンサー/遺伝子プロモーター相互作用において強化された生物学的プロセスを同定するために、GOrilla(遺伝子オントロジー・アノテーション)を用いた。デフォルトGOrillaパラメータを用い、GENCODE v19からの遺伝子をバックグラウンドとして用いた。比較可能性を確保するために、反復性予測スーパーエンハンサーと同数に一致させるべく、複数の細胞株にわたって最も高いH3K27acをもつ予測典型エンハンサーを選択した。前者を選択するために、予測典型エンハンサーを各株でランク付けして、ランクプロダクト・スコアに基づいてそれらを選んだ。次に、反復性予測スーパーエンハンサーと関連付けられた最も有意な項目(1.5倍超の濃縮)を上位の予測典型エンハンサーと関連付けられた濃縮レベルに対して比較した。より大きい遺伝子間領域が隣接する遺伝子に対してはGREATが補正を提供するため、GORillaに加えて、デフォルト・パラメータを用いたGREATを利用して、反復性予測スーパーエンハンサーおよび上位の予測典型エンハンサーと関連付けられた機能的濃縮をさらに調べた。有意な(濃縮も1.5倍超の)項目を二項p値(Binomial p-value)に基づいて順序付けた。
2倍以上のH3K27ac濃縮または枯渇を示し、絶対値差分が0.5RPKMより大きい領域は、GCと対応する正常試料との間で差次的に存在すると見做した。主成分分析(PCA:principle component analysis)のために、2人以上の患者において体細胞増加を示す予測スーパーエンハンサーからのシグナルを用いた。PCA分析は、Rを用いて行い、「pca3d」パッケージを用いてプロットした。腫瘍および正常試料からの100個の予測スーパーエンハンサー(表2)の平均シグナルに基づいて、検定力80%および第1種の誤り5%(http://powerandsamplesize.com/)を達成するために必要なサンプルサイズを推定した。この結果は、推奨サンプルサイズ13(平均)をもたらし、本研究(19N/T)ではこれを満たした。1次試料に基づいて、3つのクラスの予測スーパーエンハンサー:i)体細胞増加、ii)体細胞欠失、およびiii)非変化を定義した。i)、ii)およびiii)と関連付けられた遺伝子を先にHnisz,2013において報告された遺伝子群へマッピングし、各遺伝子群がいくつかの遺伝子オントロジー・カテゴリーの編集物であり、様々な癌ホールマークの代わりとして用いられる。Rにおいてフィシャーの片側正確検定を用いて統計学的有意性を計算した。反復的に増加する体細胞予測スーパーエンハンサーの系列特異性を異なる組織タイプにわたって評価するために、胃の予測スーパーエンハンサー間の重複を他の非胃組織に対して計算した。観測した全重複対偶然による全重複に基づいて、各非胃組織との濃縮比を計算した。
Capture-Cを先に簡潔に記載したように行い、1×107個の細胞を2%ホルムアルデヒドによって架橋し、溶解、均質化、DpnII消化、ライゲーションおよび解架橋がそれに続いた。オリゴキャプチャに適したDNAを生成するためにCovarisを用いてDNAを150~200bpへ超音波処理した。シークエンシングライブラリ調製(ニュー・イングランド・バイオラボ)のために3μgの剪断DNAを用いた。カスタマイズしたビオチン標識オリゴ(IDT,表3)への逐次的ハイブリダイゼーションおよびDynabeads(LifeTech)を用いた濃縮により、予測スーパーエンハンサー配列のダブルキャプチャ(double captured)を行った。キャプチャしたDNAをIllumina MiSEQ上で150bpペアエンド構成を用いてシークエンシングした。
4Cテンプレートをわずかな修正を伴う先に公表されたプロトコルを用いて調製した。手短かに言えば、培養細胞を単一細胞の懸濁物中に希釈し、クロマチンを室温において10分間、1%ホルムアルデヒトで架橋した。細胞を溶解し、架橋したDNAを主要な制限酵素HindIII-HF[R3104L,ニュー・イングランド・バイオラボ(NEB)]で消化した。次に、HindIII-で消化したDNAがT4 DNAリガーゼ(EL0013,サーモサイエンティフィック)を用いた近接性ライゲーション(proximity ligation)を受けて、Proteinase K(AM2546,アンビオン)を用いた架橋除去がそれに続き、3Cライブラリをもたらした。3Cライブラリは、次に、DpnII(R0543L,NEB)を用いた第2の制限酵素消化を受けて、T4 DNAリガーゼを用いた環状化反応がそれに続いた。ビューポイントごとに、スケールアップ・インバース、ネステッドPCR(scale-up inverse,nested PCR)(表4)を行うために3.2μgの結果として生じた4Cテンプレートを用いて、そのうちの32個の反応(各々が100ng)をプールし、MinElute PCR Purification kit(Qiagen)を用いて精製した。10μgのPCR産物を、次に、4~20% TBE PAGEゲル上に流した(ウェル当たり5μg)。ゲル上で、200bp~600bpのスメアを切り取り、不要なPCR産物のバンドを除去した。次に、Illumina MiSeq上の次世代シークエンシングのために、切り取ったゲル片からDNAを抽出した(2x250bp)。
Feng Zhang研究室によって作成されたオンラインソフトウェア(http://tools.genome-engineering.org)を用いてCRISPR sgRNA標的検索を行った。sgRNA対は、欠失について同定したエンハンサーに隣接する配列を標的とするように設計した。端的には、エンハンサーの5’末端の100bp上流/20bp下流に対応する配列、およびエンハンサーの3’末端の20bp上流/100bp下流に対応する配列を検索のために用いた。コード領域オフターゲット(off-target)予測の最低レベルとのトップヒットを選んだ。sgRNAをpSpCas9(BB)-2A-GFPまたは-Puroベクター(Addgene)へクローニングした。端的には、オリゴヌクレオチドの対をCRISPR標的ごとに設計して、Integrated DNA Technologies,Inc.から調達した。次に、クローニングを容易にするために両側にオーバーハングを含むDNAデューレックスを形成すべくオリゴヌクレオチド対をアニールした。個々のエンハンサーの5’末端を標的とするために用いるガイドRNAをBbsI-消化pSpCas9(BB)-2A-GFPベクター中へクローニングし、一方で各エンハンサーの3’末端を標的とするsgRNAをBbsI消化pSpCas9(BB)-2A-Puroベクター中へクローニングした。インサートおよびベクターをT4 DNAリガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラボ)を用いて連結した。DH5α細胞をライゲーション産物により形質転換して、アンピシリンを補充したLB寒天上に蒔いた。コロニーを選び取り、培養して、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(プロメガ)を用いてプラスミドを抽出した。サンガーシークエンシングを行うことによってプラスミドの配列を確認した。これらの実験に用いたオリゴヌクレオチドを表6にリストする。
GFP陽性細胞に対して細胞をFACSソートし、AllPrep DNA/RNA Micro Kit(QIAGEN)を用いて細胞からすべてのRNAを抽出した。iScript Select cDNA Synthesis Kit (バイオ・ラッド)をランダムプライマーとともに用いて、プールした細胞に対して逆転写を行った。CFX384 TouchリアルタイムPCR解析システム(バイオ・ラッド)上でTaqMan Gene Expression Master MixおよびTaqManプローブ(アプライドバイオシステムズ)を用いてqPCRを実施した。すべてのqPCR実験をトリプリケートで実行し、mRNAレベルを判定するために平均値を用いた。参照遺伝子としてGAPDHおよび式2-ΔΔCTを用いた比較CT法を利用して相対的定量化を行った。
胃腫瘍および対応する正常胃組織からのゲノムDNAをAffymetrix SNP6.0アレイ上でハイブリダイズした。(Affymetrix,サンタクララ,カリフォルニア,米国)。.CELフォーマットのデータを以下の順序で処理した、(1)正規化:Affymetrix Genotyping Console4.2を用いて、生の.CELファイルを処理した。ハイブリダイゼーション・バッチによる正常胃組織のSNP6.0プロファイルから参照モデルを作成した。1次正常試料からの参照モデルを用いて、細胞株および1次腫瘍試料におけるコピー数の変化を判定した。(2)セグメンテーション:DNAcopy Rパッケージに実装されたcircular binary segmentation(CBS)アルゴリズムを用いて、コピー数のセグメンテーション・データを生成した。変化点を検出するためのp値カットオフが0.01、順列数が10,000であった。コピー数増加および欠失領域を、それぞれ、平均対数比>0.6および<-1.0を示すために定義した。DNAメチル化レベルをアッセイするために、さらにIllumina HumanMethylation450(HM450)Infinium DNAメチル化アレイを用いた。methylumi R BioConductorパッケージを用いて、メチル化β値を算出し、バックグラウンドを補正した。BMIQ法(Rにおけるwatermelonパッケージ)を用いて正規化を行った。
すべてのRNAをQiagen RNeasy Miniキットを用いて抽出した。RNA-seqライブラリを、製造業者の使用説明書に従って、Illumina Stranded Total RNA Sample Prep Kit v2(イルミナ,サンディエゴ,カリフォルニア,米国)、Ribo-Zero Goldオプション(Epicentre,マジソン,ウィスコンシン,米国)および1μgトータルRNAを用いて構築した。完成したライブラリをAgilent Bioanalyzer(アジレント・テクノロジー,パロアルト,カリフォルニア)を用いて検証し、Illumina Cluster Stationを介してIlluminaフローセルへ適用した。ペアードエンド101bpリードオプションを用いてシークエンシングを行った。TopHat2-2.0.12(デフォルト・パラメータおよび--library-type fr-firststrand)を用いて、RNA-seqリードをヒトゲノム(hg19)へアラインした。マッピングリードの塩基配列ごとの品質および配列ごとの品質スコアをFastQCバージョン0.10.1(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)を用いて評価した。遺伝子レベルにおける転写物存在量をCufflinksによって推定した。ゼロより大きい変動を示す1次サンプルからの遺伝子発現をComBatを用いて潜在的なバッチ効果に対して補正した。遺伝子発現値は、FPKM単位で測定した。群間の差次的な発現を少なくとも2倍変化した発現および0.5FPKMの絶対値差分を示す遺伝子として同定した。
k-medoidsアプローチを用いて7つの独立した研究からのGC試料をクラスター化した。すべての7つの研究において発現値をもつ遺伝子のみを解析に用いた。アウトカム・メトリック(outcome metric)として全生存期間を用いたカプランマイヤー生存解析を採用した。カプランマイヤー曲線の有意性を評価するためにログランク検定を用いた。コックス回帰を用いて、年齢、腫瘍段階、Laurenの組織学的サブタイプおよび地域性(アジア人対非アジア人)のような、追加変数を伴う多変量解析を行った。
形質関連SNPをゲノムワイド関連研究(2015年8月27日)のUCSCブラウザからダウンロードした。この研究のために、本発明者らは、非コード領域で発生するSNPに焦点を合わせて、コード領域内のSNPを除外した。各形質/疾患からのSNPと体細胞予測スーパーエンハンサーとの間の重複をBEDtools‘intersect(交差)’を用いて計算し(nGWAS)、nGWASを予測スーパーエンハンサーの外部の疾患関連SNPの総数(nGWAS’)に対して比較した。追加の対照として、一般に用いられる2つのSNPアレイ(Illumina HumanHap550およびAffymetrix SNP6)からのすべてのSNPのセットを用いて、「SNPバックグラウンド」モデルを作成した。予測スーパーエンハンサーと重複するSNPバックグラウンドからのSNPの数を算出して(nBackground)、予測スーパーエンハンサーの外部のバックグラウンドSNPの総数(nBackground’)に対して比較した。予測スーパーエンハンサーにおける正常SNPの比をnBackground/nBackground’として計算した。予測スーパーエンハンサーにおける疾患関連SNP数の増加がこれらの領域におけるSNPの高出現率と関連付けられると予想すると、本発明者らの帰無仮説は、結果として、疾患関連SNPの比と正常SNPの比(濃縮比)との間に何も差がないということである。統計学的に有意と見做される濃縮p値<0.01を用いて、カイ二乗検定を実施した。リスク関連SNPとヒストン修飾との間の関係を理解するために、本研究は、少なくとも2つの独立した研究において疾患と関連付けられるがわかった胃腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および結腸直腸癌)で検証されたSNPを同定した。GATK Unified Genotyperを用いて、試料を疾患関連SNPの存在に基づいて2つの群に分類した。疾患関連SNP有りまたは無しの試料において腫瘍と、対応する正常との間でH3K27acシグナルの差を比較した。
本研究は、ReMapデータベースを用いて、体細胞増加予測スーパーエンハンサーおよび非変化予測スーパーエンハンサーにおける転写因子の濃縮を調べた。予測スーパーエンハンサーと少なくとも60%が重複した転写因子部位をカウントして、上位10個の最も濃縮された転写因子のランクを比較した。転写因子の結合密度は、領域の100万塩基対(Mbp)の単位のトータルサイズで除した、その領域で検出した全結合部位として計算した。CDX2については、他の転写因子の近接した結合を予測するために、HOMERをデフォルト・パラメータとともに用いて反復的に増加する体細胞予測スーパーエンハンサーにおいてCDX2結合部位を検査した。HOMER出力から同定した上位20個の転写因子を発現相関解析のために用いた。加えて、PScanChIPをJASPAR2016とともに用いてCDX2共結合モチーフも同定した。CDX2と潜在的な共結合パートナーとの間の発現相関(スピアマンの相関)を評価した。
製造業者の使用説明書に従って、Dharmafect 1トランスフェクト剤を用い、6ウェルプレートにおいて細胞(2×105)に50nMでトランスフェクトするために、ON-TARGETplus Human siRNA SMARTpools(HNF4αおよびCDX2)、individual ON-TARGETplus Human individual siRNAs(HNF4α)ならびにON-TARGETplus Non-targeting siRNA対照(Dharmacon/サーモフィッシャーサイエンティフィック)を用いた。定量的RT-PCRおよび/またはウエスタンブロット解析を用いて、72時間のRNAi処理後のノックダウン効率を検査した(図23)。
細胞(2×105)をRIPAバッファー(シグマ)中に収集して、氷上で10分間溶解させた。Pierce BCAタンパク質アッセイ(サーモサイエンティフィック)を用いて上清の濃度を測定した。ライセートを探索するために、CDX2(1:500;MU392A-UC,Biogenex),HNF4α(1:1000;sc-8987,Santa Cruz Biotechnology)およびGAPDH(1:3000;60004-1-Ig,Proteintech Group)抗体を用いた。
すべてのRNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて単離して、DNAをRNase-Free DNase Set(Qiagen)を用いて除去した。Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen)を用いて2ugのRNAを逆転写し、相補的DNAをSYBRGreen PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ)を用いて増幅した。倍率変化をGAPDHへ正規化した。プライマー配列は、次の通りである。HNF4α:F1-5’GTGCGGAAGAACCACATGTACTC3’(SEQ ID NO:143)、R1-5’CGGAAGCATTTCTTGAGCCTG3’(SEQ ID NO:144)、F2-5’CTGCAGGCTCAAGAAATGCTT3’(SEQ ID NO:145)、R2-5’TCATTCTGGACGGCTTCCTT3’(SEQ ID NO:146)、F3-5’TGTCCCGACAGATCACCTC3’(SEQ ID NO:147)、R3-5’CACTCAACGAGAACCAGCAG3’(SEQ ID NO:148);CDX2:F1-5’GCAGCCAAGTGAAAACCAGG3’(SEQ ID NO:149)、R1-5’CCTCCGGATGGTGATGTAGC3’(SEQ ID NO:150)、F2-5’AGTCGCTACATCACCATCCG3’(SEQ ID NO:151)、R2-5’TTCCTCTCCTTTGCTCTGCG3’(SEQ ID NO:152);GAPDH:F-5’CCAGGGCTGCTTTTAACTC3’(SEQ ID NO:153)、R-5’GCTCCCCCCTGCAAATGA3’(SEQ ID NO:154)。
細胞を室温において10分間、1%ホルムアルデヒトで架橋し、0.2Mの最終濃度までグリシンを添加することにより停止した。クロマチンを抽出して、500bpへ超音波処理した。クロマチン免疫沈澱(ChIP)のために、CDX2(MU392A-UC,Biogenex)およびHNF4α(sc-8987,Santa Cruz Biotechnology)抗体を用いた。ChIPのために、製造業者のプロトコル(ニュー・イングランド・バイオラボ)に従ってChIPed DNA(10ng)をDNAシークエンシング(ChIP-seq)ライブラリ・コンストラクション(library construction)とともに用いた。ChIP-seqピーク抽出(peak calling)を正規化するために、免疫沈降前の細胞からの入力DNAを用いた。シークエンシング前に、陽性および陰性対照ChIP領域が線形範囲内で増幅したことを検証するためにqPCRを用いた。バイオアナライザー(アジレント・エクノロジー)を用いて、ライブラリ試料のサイズ分布をチェックした。腸型およびびまん型GC(腸型10個,びまん6個)に特異的な反復的に増加する予測スーパーエンハンサーを比較した最初の解析では、2つのサブタイプ間でCDX2結合における有意差は何も観測されなかった。しかしながら、CDX2発現には同じサブタイプの個々の腫瘍間で高いサブタイプ内の変動性があることをより深い解析が明らかにし、これは、CDX2発現が腸サブタイプGCと絶対的に関連付けられるわけではないというこれまでの報告と一貫性がある。従って、この研究は、GCをそれらの個々のCDX2発現レベルによって順序付けて調べる、相補的な解析を行った。次に、高(n=8)および低(n=8)CDX2発現を示したGC試料において同定した反復性体細胞増加予測スーパーエンハンサーにおけるCDX2結合密度を計算した。差次的な結合シグナル解析は、1次試料において体細胞増加を示すか、もしくは何も変化を示さず、OCUM-1またはSNU16細胞株においても検出されたそれらの予測スーパーエンハンサーに跨る200ビンについてCDX2およびHNF4αに対する結合シグナルを計算した。シグナルは、RPKM単位で測定した。H3K27ac強度に対する転写因子(TF)ノックダウンの効果を推定するために、独立した野生型(WT:wild type)試料間で観測したH3K27acシグナル変動を備える内部標準を定義した。TFサイレンスした(siCDX2、siHNF4α、およびダブルTF)試料に対するWT試料間の差を測定し、次に、それらの差をこのバックグラウンド変動に対して比較した。バックグラウンド変動の差>99%のサブ領域をH3K27ac枯渇と称し、一方でバックグラウンド変動の差<1%をH3K27ac増加と称した。予測スーパーエンハンサーに対応するH3K27ac枯渇サブ領域の統計学的な濃縮をフィシャーの片側正確検定を用いて実施した。差次的な領域と、近接するCDX2/HNF4α結合部位へのそれらの距離との関係を調べるために、領域をそれらの距離分布に基づいて3つのカテゴリー(近い、中間、遠位)にさらに分離した。H3K27ac枯渇サブ領域と、CDX2-HNF4α共結合部位との間の距離を解析するために、CDX2およびHNF4α頂点間の中点位置を用いた。TFサイレンスした細胞における遺伝子発現と体細胞増加予測スーパーエンハンサーとの間の関連付けを調べるために、本発明者らは、1次試料においてH3K27ac予測スーパーエンハンサー・シグナルと有意な正の発現相関を示し(r>0.4;P<0.05;両側t検定)、GC細胞株においても観測した予測スーパーエンハンサーに連結された遺伝子を選択した。予測スーパーエンハンサー標的遺伝子発現に対する転写因子ノックダウンの有意性を評価するために、順列アプローチを用いた。具体的には、TFサイレンシング後にH3K27ac枯渇を示す予測スーパーエンハンサーに焦点を合わせて、本発明者らは、遺伝子への実際のスーパーエンハンサーの割り当てを10,000回並べ替えた。次に、並べ替えた遺伝子/スーパーエンハンサー・セットにおける下方制御された遺伝子の数が、実際の遺伝子/スーパーエンハンサー・セットにおける下方制御された遺伝子の実験的に観測した数を超過する回数をカウントすることによって、経験的なP値を導出した。
本研究の間に発生させたヒストンNanoChIP-seq(GSE76153およびGSE75898)、SNPアレイ(GSE85466)、RNA-seq(GSE85465)およびDNAメチル化データ(GSE85464)は、Gene Expression Omnibusに寄託した。先に寄託し、この研究に用いたヒストンChIP-seq(GSE51776およびGSE75595)ならびにSNPアレイ(GSE31168およびGSE36138)は、Gene Expression Omnibusにおいて入手可能である。エピゲノムロードマップからの正常胃組織のクロマチンアクセシビリティ・プロファイルは、Gene Expression Omnibus(GSM1027325、GSM1027320)から得た。この研究において解析したRNAPII ChIA-PETデータは、encodeproject.orgおよびGene Expression Omnibus(GSE72816)から得た。
GC細胞株の遠位予測エンハンサーの景観
Nano-ChIPseqを用いて、19個の1次GC、19個の対応する正常胃組織、および複数のヒストンH3修飾(H3K27ac、H3K4me3、H3K4me1)をカバーする11個のGC細胞株から110個のクロマチン・プロファイル(プロファイル当たり平均約3.3×107リード)を発生させた。1次GCの臨床情報および分子分類を表8に、シークエンシング統計データを表1に、GC株に関する臨床病理学的詳細を表9に提示する。このシリーズは、腺癌を形成する10個の腺(53%、腸型)、高浸潤性孤立細胞をもつ6個の試料(32%、びまん型)および混合組織の3個のGC試料(15%)を含んだ。腫瘍(n=12)のうちの60%超がステージ3以上(AJCC第7版)であった。マッピング品質フィルターにおける変更、生物学的レプリケートおよびプロモーターChIP濃縮の解析、ならびに品質管理ソフトウェアCHANCE(CHip-seq ANalytics and Confidence Estimation)による評価を含めて、Nano-ChIPseqデータの広範な品質管理解析を行った。マッピング閾値の厳しさを(MAPQ≧10から20へ)増加させても、マッピング統計を感知できるほど変化させることはなく-全マッピングリードのうちの90%超が維持されて、それぞれ、ChIP濃縮ピークのうちの85%および予測エンハンサーのうちの98%を再発見した(図7)。Nano-ChIPseqによって発生させたKATO-III細胞の生物学的レプリケート間の、さらに従来のChIP-seqによって発生させた独立したKATO-III H3K27acデータに対する、ヒストンピークの一致は、高い再現性(約85%および約90%の重複)(図8)を確認した。高発現タンパク質コード遺伝子と関連付けられた1,000個のプロモーターにおける入力および入力で補正したH3K27acならびにH3K4me3シグナルの比較は、それぞれ、50個のうちの48個(96%)のH3K27acおよび42個のうちの42個(100%)のH3K4me3ライブラリにおける好結果の濃縮を明らかにした。ChIP濃縮のCHANCE解析は、特に(プロモーターにおいて枯渇した)H3K4me1について、試料の大多数(85%)が好結果の濃縮を示すことを明らかにした(方法)。これらの結果は、Nano-ChIPseqコホートの良好な技術的品質を実証する。Nano-ChIPseqに加えて、さらに、DNAメチル化解析(Infinium HumanMethylation 450K BeadChipアレイ)、コピー数解析(AffymetrixSNPアレイ)およびIllumina RNA-シークエンシングのために試料を処理した。
ROSEアルゴリズムを用いて、全体として3,759個の非冗長予測スーパーエンハンサーを包含する、GC株当たり133~1,318個の予測スーパーエンハンサーを同定した(図2a)。従って、GC細胞株の予測エンハンサーのうちの約10%が予測スーパーエンハンサー活性と関連付けられると推定される。予測典型エンハンサーと比較して、予測スーパーエンハンサーは、反復性が著しくより強い傾向を示し(図2b;片側比率検定,P<2.2×10-16)、3,345個の予測スーパーエンハンサーが少なくとも2つのGC細胞株において活性であった。注目したのは、既知のタンパク質コードGC癌遺伝子(例えば、MYCおよびKLF5;図10a)と関連付けられた予測スーパーエンハンサー、さらに、長鎖非コードRNA(lncRNA:long-noncoding RNA)をコードする、MALAT1遺伝子座(図2c)のような非タンパク質コード遺伝子領域にある予測スーパーエンハンサーがGC増殖を促進することが最近示されたことである。
どの細胞株の予測スーパーエンハンサーが体細胞変化とも関連付けられるかをインビボで判定するために、本研究は、19個の1次GCおよび対応する正常胃組織にわたってH3K27ac濃縮レベルをこれらの領域について比較した。これまでの研究が、限られた標本サイズに起因して、GCの個別的な分子サブタイプの存在を示唆したのに対して、現在の研究は、対応する正常組織と比較して、複数のGC組織中に保存された予測エンハンサーの差に焦点を合わることを選んだ(考察を参照)。解析の前に、公表されたプロファイルに対する相関付け(セクション「エピゲノムロードマップに対する1次胃非悪性試料の比較」を参照)によって、1次胃正常試料が胃上皮を確かに反映していることを確認した。3,759個の細胞株の予測スーパーエンハンサーのうちで、3分の2が腫瘍と対応する正常試料との間で差次的な濃縮を示した(図3a、表2、以降は体細胞が変化したと称する)。予測スーパーエンハンサーのうちの半数近く(n=1,748;47%)が2つ以上の1次GCにおいて体細胞増加(腫瘍における2倍超の濃縮,最小0.5RPKMの差)を示し、これらの増加した予測スーパーエンハンサーを用いた主成分分析(PCA)は、GCと対応する正常組織との間の分離を確認した(図3b)。これらの結果の一貫性を支持して、すべての品質管理基準に合格したそれらの正常/腫瘍(N/T)1次対(14対、前を参照)のみを用いたときに、これらの反復性体細胞増加予測スーパーエンハンサーのうちの圧倒的多数(85%、1.5超の倍率変化閾値)を再発見した。予想外に、癌細胞株におけるそれらの活性にも係わらず、予測スーパーエンハンサーのうちの実質的な比率(18%)が、1次GCにおける増加ではなく、むしろ体細胞欠失と関連付けられた(図3a)。これらの後者の領域は、1次腫瘍ではエピジェネティックにサイレンスされたが、インビトロ培養の間に細胞株中で再活性化された領域を表すかもしれない可能性がある(図13a)。予測スーパーエンハンサーのうちの11%(n=416)は、GCおよび正常組織間で変化しないH3K27acレベルを示し(図3a、図13b)、これらの領域は、癌関連ではないが「ハウスキーピング」または一般的な組織機能に関係することと一貫性があった。最後に、細胞株の予測スーパーエンハンサーのうちの21%(n=808)は、解析のための1次試料において十分なH3K27ac濃縮を示さなかった(RPKM<0.5)(図13c)。興味深いことに、このクラスは、GC株における低反復性とも関連付けられた(図3a-黒いヒストグラム)。全体として解釈すると、これらの結果は、細胞株に由来する予測スーパーエンハンサーを1次腫瘍および対応する正常対照からのヒストン修飾データを用いて少なくとも3つのカテゴリー-体細胞増加、体細胞欠失、および非変化へさらに下位分類できることを実証する。上位100個の体細胞予測スーパーエンハンサーのリストを表2に提示する。
コピー数データとの統合は、体細胞予測スーパーエンハンサーのうちの過半数がコピー数中立領域に局在化されることを明らかにした(図14a~c、「胃癌におけるコピー数変化と予測スーパーエンハンサーとの間の関連付け」と題するセクション)。予測スーパーエンハンサーと遺伝子発現との間の関連付けを検討するために、本研究は、先のパスウェイ解析(図2)と同じ予測スーパーエンハンサー/遺伝子の割り当てを用いて、同じ1次試料からのRNA-seq情報を調べた。体細胞増加予測スーパーエンハンサーは、対応する正常試料と比較して、高められた遺伝子発現と関連付けられ、一方で体細胞欠失予測スーパーエンハンサーは、減少した発現と関連付けられた(P<2.2×10-16、ウェルチ片側t検定;図4a)。
予測スーパーエンハンサーの異質性の生物学的および臨床的関連性をさらに探索すべく、本研究は、体細胞修飾状況(増加、欠失、非変化)によってカテゴリー化した癌ホールマーク解析を行った。10個の癌ホールマークのうちで、体細胞増加予測スーパーエンハンサーは、浸潤(P=8.6×10-11,フィシャーの片側正確検定)、血管新生(P=2.4×10-4,フィシャーの片側正確検定)、細胞死抵抗性(P=7.8×10-3,フィシャーの片側正確検定)に関係する遺伝子中で著しく濃縮されて、体細胞欠失および予測非変化スーパーエンハンサーを1桁超過した(図5a)。これらの結果は、体細胞増加予測スーパーエンハンサーが進行性GCと関連付けられた形質に関与しうることを示唆する。86個の細胞および組織試料の予測スーパーエンハンサー・プロファイルに対して比較したときに、GCにおける体細胞増加予測スーパーエンハンサーのうちの60%超が高組織特異性を示した。他の癌タイプ、例えば、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸管癌および膵臓癌においてこれまでに記載された予測スーパーエンハンサーとの有意な重複(図21)(P<0.001,経験的検定)も観測し、いくつかのGC関連予測スーパーエンハンサーが他の癌タイプにおいても活性でありうることを示唆した。
最後に、体細胞増加予測スーパーエンハンサーと関連付けられたトランス作用因子を探索した。GC予測スーパーエンハンサーは、他のゲノム領域と比較して、著しく濃縮されたENCODE TF結合プロファイルを示し、TF「ホットスポット」としての前者を支持した(P<2.2×10-16,片側比率検定)。ReMapデータベースを調べて、本研究は、次に、異なる予測スーパーエンハンサー・カテゴリーと関連付けられた特異的なTFを同定した。体細胞増加および非変化予測スーパーエンハンサーの両方がCEBPB、MYC、およびFOXA1結合における濃縮を示した。しかしながら、上位10個の濃縮されたTFの中で、CDX2は、体細胞増加予測スーパーエンハンサーにおいて濃縮の上昇を示し(ランク#2)、非変化予測スーパーエンハンサー(ランク#8)と比較して結合密度がおよそ30%増加した(図6aおよび6b)。
いくつかのエンハンサーサブ領域が癌特異的な必須性を呈しうるというコンセプトの証明として、この研究は、GC細胞または正常ES細胞のいずれかにおいてCLDN4サブエンハンサー領域(e1)を欠失させることができる程度を試験した(図15,16;表12)。図24に示すように、CLDN4 e1エンハンサーサブ領域のホモ接合型欠失は、H1 ES細胞(図26,27)では容易に達成されたが、SNU16 GC細胞では達成されず(図25,28)、SNU16癌細胞の生存にとってCLDN4 e1の1つのコピーの維持が必須でありうることを示唆した。
Nano-ChIPseqによって定義した遠位予測調節エレメントを遺伝子発現へ相関付けるために、複数の株にわたって高反復性を示す80個の予測スーパーエンハンサーを同定した(P<0.0001,経験的検定)。高反復性予測典型エンハンサーを同定するためにも同じアプローチを用いた。予測スーパーエンハンサーおよび予測典型エンハンサーの両方に対して、遠位調節エレメントと関連付けられた遺伝子は、ランダムに選択された遺伝子より高発現(higher expression that)を示した(図10b)。予測スーパーエンハンサー/典型エンハンサー関連遺伝子の発現の比較は、予測スーパーエンハンサー関連遺伝子に対してより高い全体的な発現レベル(パーセンタイル単位)を明らかにした(P=5.2×10-3,ウィルコクソン片側順位和検定)。これらの結果は、予測スーパーエンハンサーおよび予測典型エンハンサーにおけるH3K27ac濃縮と、標的遺伝子発現との間の正の関連付けを示唆する。
この研究における非悪性胃組織が筋肉、免疫細胞などではなく、胃上皮を確かに反映することを確認するために、この研究からの非悪性胃H3K27acプロファイルを先に公表された正常胃プロファイルと比較し、胃平滑筋プロファイルとも比較した。Nano-ChIPseqプロファイルごとに、H3K27acシグナルのうちの70%(平均)が公表された正常胃プロファイルと重複し、一方で34%(平均)のみが胃平滑筋と重複した。結果は、非悪性胃試料が胃平滑筋ではなく胃上皮を確かに反映することを示唆する。
本研究は、反復性体細胞変化予測スーパーエンハンサーが体細胞コピー数の変化(sCNA:somatic copy number alterations)と関連付けられうる程度を検討した。予測スーパーエンハンサー間の重複、ならびに細胞株および1次GCからのコピー数情報をインハウスで発生させたAffymetrix SNP6.0アレイデータを用いて計算した。sCNAの領域を確信的に同定することを許容するために、解析を(平均ゲノムワイド・カバレッジより2倍高い)10kb当たり少なくとも6個のSNPプローブによってカバーした領域に制限した。sCNA解析の信頼性を確認し、後者において見出したGC細胞株(FU97,KATO-III,MKN7,OCUM-1,RERFGC1B,SNU16)について、解析における平均98%のコピー数増加および82%のコピー数欠失をCancer Cell Line Encyclopediaにも報告した。
GCは、臨床的に異質性のある疾患であり、外科手術および化学療法に加えて、トラスツズマブ(抗HER2)およびラムシルマブ(抗VEGFR2)のみが臨床的に認可され、他の分子標的剤は、現在まで不成功であることが判明している。胃腫瘍発生における重要なパスウェイとしてエピゲノム調節解除が出現して、GCではクロマチン修飾遺伝子(例えば、ARID1A)が頻繁に変異し、エピジェネティックな変化が胃前悪性と関連付けられる。しかしながら、現在まで、GCエピゲノム研究のうちの圧倒的多数が腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングの文脈におけるプロモーターDNAメチル化に焦点を合わせてきた。対照的に、GCにおける遠位調節エレメント(すなわち、エンハンサー)については、現在、ごくわずかしか知られていない。
Claims (22)
- 対応する1次非癌生体試料と比較して、被験者から得られた1次癌生体試料における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在を判定するための方法であって、
a)前記被験者から得られた前記1次癌生体試料をヒストン修飾H3K27acに対して特異的な少なくとも1つの抗体と接触させるステップと、
b)前記1次癌生体試料から核酸を単離するステップであって、前記単離された核酸は、前記ヒストン修飾H3K27acに特異的な少なくとも1つの領域を備え、前記核酸は、前記ヒストン修飾H3K27acに特異的なクロマチンの免疫沈降によって前記癌生体試料から単離される、前記単離するステップと、
c)アノテートされたゲノム配列を用いて、少なくとも1つのエンハンサーを前記ヒストン修飾H3K27acのシグナル強度に基づいてマッピングするステップであって、前記少なくとも1つのエンハンサーは、アノテートされた転写開始点から少なくとも2.5kbにある、前記マッピングするステップと、
d)前記1次癌生体試料における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーを同定するために、前記単離された核酸中の前記少なくとも1つのエンハンサーを少なくとも1つの参照核酸配列中の少なくとも1つの癌関連エンハンサーに対してマッピングするステップと、
e)前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの前記シグナル強度を前記対応する1次非癌生体試料から得られた前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの参照シグナル強度に対して比較するステップであって、前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの前記シグナル強度は、前記ヒストン修飾H3K27acのReads Per Kilobase of transcript per Million(RPKM:100万当たり、トランスクリプトのキロベース当たりのリード)値に基づいており、前記RPKMの値はバッチ効果について補正される、前記比較するステップと、
f)前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在を前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーのシグナル強度における変化に基づいて判定するステップと、を備え、
前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在を判定するステップは、前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーに対する前記RPKM値が、
i)前記対応する1次非癌生体試料から得られた前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの前記RPKM値と比較して、RPKM値における2より大きい倍率変化、および
ii)前記対応する1次非癌生体試料から得られた前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの前記RPKM値と比較して、0.5RPKMより大きい絶対値差分であることを判定するステップを備える、
方法。 - 前記1次癌および対応する1次非癌生体試料は、単一の細胞、複数の細胞、細胞のフラグメント、体液または組織を備える、請求項1に記載の方法。
- 前記1次癌および対応する1次非癌生体試料は、同じ被験者から得られる、請求項1~2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌および非癌生体試料は、各々が異なる被験者から得られる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸は、クロマチンの免疫沈降によって前記1次癌生体試料から単離される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの参照核酸配列は、少なくとも1つの癌細胞株から得られる、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーは、ROSE(Ranking of Super Enhancer)アルゴリズムを用いて同定される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーは、前記少なくとも1つの参照核酸配列中の前記少なくとも1つのエンハンサーと重複する少なくとも1つの核酸塩基対を備える、請求項7に記載の方法。
- 前記対応する1次非癌生体試料の前記RPKM値と比較して、前記1次癌生体試料からのRPKM値における増加は、前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーの存在を示す、請求項8に記載の方法。
- 前記対応する1次非癌生体試料の前記RPKM値と比較して、前記1次癌生体試料からのRPKM値における減少は、前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーの非存在を示す、請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーは、遺伝子転写開始点に対して1000kb以内に配置される、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子は、癌関連遺伝子、血管新生遺伝子、細胞増殖遺伝子、細胞浸潤遺伝子、ゲノム不安定性と関連付けられた遺伝子、細胞死抵抗性遺伝子、細胞エナジェティクス遺伝子、細胞周期遺伝子または腫瘍促進遺伝子のうちの1つ以上である、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子は、CLDN4、ABHD11、WBSCR28、ATAD2、KLH38、WDYHV1、CDH17、CCAT1、CLDN1、SMURF1、GDPD5、ADAMTS12、ASCL2、ASPM、ATP11A、AURKA、CAMK2N1、CBX2、CCNE1、CD9、CDC25B、CDCA7、CDK1、CXCL1、E2F7、ECT2、LAMC2、NID2、PMEPA1、RARRES1、RFC3、SLC39A10、TFAP2A、TMEM158、LINC00299およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記1次癌生体試料は、胃癌である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対応する1次非癌生体試料と比較して、前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在を示す、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在または非存在は、前記被験者における前記癌の予後を示す、請求項15に記載の方法。
- 前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの存在は、被験者における癌生存の予後不良を示す、請求項16に記載の方法。
- 前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの非存在は、被験者における癌生存の予後改善を示す、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーは、細胞浸潤遺伝子、血管新生遺伝子または細胞死抵抗性遺伝子、癌関連遺伝子、細胞増殖遺伝子、ゲノム不安定性と関連付けられた遺伝子、細胞エナジェティクス遺伝子、細胞周期遺伝子または腫瘍促進遺伝子のうちの1つ以上と関連付けられる、請求項16に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーは、CLDN4、ABHD11、WBSCR28、ATAD2、KLH38、WDYHV1、CDH17、CCAT1、CLDN1、SMURF1、GDPD5、ADAMTS12、ASCL2、ASPM、ATP11A、AURKA、CAMK2N1、CBX2、CCNE1、CD9、CDC25B、CDCA7、CDK1、CXCL1、E2F7、ECT2、LAMC2、NID2、PMEPA1、RARRES1、RFC3、SLC39A10、TFAP2A、TMEM158、LINC00299およびそれらの組み合わせからなる群から選択された遺伝子と関連付けられる、請求項16に記載の方法。
- 細胞における少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーの活性を調節するのに用いるためのCDX2およびHNF4αの阻害薬であって、前記少なくとも1つの癌関連スーパーエンハンサーは、請求項15に記載の方法によって検出され、CDX2およびHNF4αの前記阻害薬は、siRNAである、阻害薬。
- 前記対応する1次非癌生体試料と比較して、前記1次癌生体試料における前記少なくとも1つのスーパーエンハンサーの増加したシグナル強度は、癌細胞生存期間または癌細胞生存率を予測する、請求項1に記載の方法。
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