CN111979323A - 用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，该方法基于二代测序检测组织全外显子测序(WES)的数据，对多个生物标志物进行检测，构建了一个综合预测肿瘤免疫治疗效果的预测模型，与传统的仅能检测单一生物标志物的方法相比，有效提升了对免疫检查点抑制剂疗效预测的准确性和适用性。
Description
技术领域
本发明属于生物信息学技术领域，涉及一种生物标志物检测方法，具体地说涉及一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法。
背景技术
癌症是死亡率很高的一种病种，也是全球最主要的非传染性疾病之一，在我国，每年有接近430万人被诊断为癌症，有超过280万人死于癌症。在医学上，癌症是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤，癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程，分为致癌、促癌、演进三个过程，与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不合理膳食、遗传因素密切相关。
抗肿瘤靶向药物和免疫检查点抑制剂是目前治疗癌症较为有效的手段，其中以PD-1/PD-L1和CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂在癌症治疗领域取得了令人瞩目的成就。其中，免疫检查点抑制剂疗法在临床肿瘤上展现出了令人震惊的光谱性和长效性，但其总体有效率依然比较有限，仅为10-40％，治疗获益患者比例低和治疗费用高昂，这两点成为免疫检查点抑制剂疗法临床推广的瓶颈。
寻找高效而精准的生物标记物，预测并筛选出对免疫检查点抑制剂疗法获益的肿瘤患者，是目前免疫治疗领域的世界性难题和研究热点。比较公认的免疫检查点抑制剂PD-1疗效评估潜在指标如PD-L1表达、肿瘤突变负荷(TMB)、错配修复功能缺陷/微卫星不稳定(dMMR/MSI)，以及一些探索性的指标如肿瘤内异质性(ITH)、白细胞抗原杂合性缺失(HLALOH)、HLA-I类基因进化多样性(HED)、肿瘤淋巴浸润细胞(TIL)等都不能完全将免疫检查点抑制剂获益的患者有效筛选出来。
肿瘤免疫循环是一个很复杂的过程，包含了七大步骤，目前这些单指标一般只涉及循环中的某个步骤，结合多指标的综合诊断模型将能够提升预测效果及适用性。怎样基于这些指标构建一个综合诊断模型以及，选择哪些指标来构建模型可以既经济又有效地提升预测效果是当前亟待解决的技术问题。
发明内容
为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种有效性高、预测效果准确、适用性好、成本低廉的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明提供一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其包括如下步骤：
S1、获取肿瘤样本与对照血液样本的全外显子测序数据；
S2、将所述测序数据与参考基因组的序列比对，得到比对结果；
S3、利用所述比对结果，进行变异检测，得到检测结果；
S4、利用所述检测结果，计算得到肿瘤样本的肿瘤突变负荷、肿瘤内异质性以及每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态和进化差异性；
S5、根据所述每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态校正所述进化差异性，并得到第一校正系数；
S6、对肿瘤样本的肿瘤内异质性转换，得到第二校正系数；
S7、通过所述第一校正系数和第二校正系数计算得到综合生物标志物的肿瘤突变负荷值。
作为优选，所述步骤S3中，所述检测结果包括肿瘤样本在全外显子范围内的体细胞突变、深度、突变频率、体细胞拷贝数变异信息、肿瘤纯度、肿瘤倍型和HLA-I类基因分型信息。
作为优选，所述步骤S5中，所述第一校正系数通过如下步骤获取：
S51、对肿瘤样本所有HLA-I类基因的基因进化差异性值取均值；
S52、利用函数公式转换得到第一校正系数，所述第一校正系数的取值范围为[0，1]。
作为优选，所述步骤S6中，所述第二校正系数通过对肿瘤样本的内异质性转换得到，所述第二校正系数的取值范围为[0，1]。
作为优选，所述步骤S7中，所述肿瘤突变负荷值通过如下方式计算：将所述第一校正系数、第二校正系数乘以所述肿瘤样本的肿瘤突变负荷，得到综合生物标志物肿瘤突变负荷值。
作为优选，所述第一校正系数的取值范围为[0.5，1)，所述第二校正系数的取值范围为[0.3，1]。
作为优选，所述参考基因组为hg19基因组；所述步骤S2还包括对比对结果去冗余处理的步骤。
作为优选，所述步骤S3中，通过varscan工具进行体细胞变异检测。
作为优选，所述步骤S4中，计算得到的肿瘤突变负荷为每Mb编码区域内的非同义体细胞突变个数，肿瘤内异质性为亚克隆突变簇中的体细胞突变数量占所有体细胞突变数量的比值；每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态通过LOHHLA工具检测；所述进化差异性值通过Grantham距离矩阵计算HLA-I类等位基因肽段结合域的序列差异性得到。
作为优选，所述步骤S1还包括对全外显子测序数据质控处理的步骤；所述步骤S5中所述校正所述进化差异性为：若白细胞抗原杂合性缺失阳性，则进化差异性设定为0，若白细胞抗原杂合性缺失阴性，则进化差异性保持不变。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，基于二代测序检测组织全外显子测序(WES)的数据，对多个生物标志物进行检测，构建了一个综合预测肿瘤免疫治疗效果的预测模型，与传统的仅能检测单一生物标志物的方法相比，有效提升了对免疫检查点抑制剂疗效预测的准确性和适用性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法的流程图；
图2是本发明实施例2所述的检测方法中各指标的ROC曲线及其AUC值；
图3是本发明实施例3所述的检测方法中各指标的ROC曲线及其AUC值。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，如图1所示，其包括如下步骤：
S1、获取肿瘤样本与对照血液样本的全外显子测序(WES)数据。
具体地，获取肿瘤样本和对照血液样本的WES原始测序下机数据，通过去接头及低质量数据的质控处理后，得到WES测序数据。
S2、将所述测序数据与对照血液样本的参考基因组的序列比对，得到比对结果。
将步骤S1中得到的WES测序数据与参考基因组进行比对，并去除冗余，得到比对结果，本实施例中，所述参考基因组为hg19基因组，比对过程采用bwa(Burrow-WheelerAligne)软件进行，然后采用picard工具进行去冗余，得到比对结果bam文件。
S3、利用所述比对结果，进行体细胞变异检测，得到检测结果。
具体地，利用步骤S2得到的肿瘤样本及对照血液样本的bam文件，通过变异检测软件检测肿瘤样本在全外显子范围内的体细胞突变、深度、突变频率、体细胞拷贝数变异信息，以及肿瘤纯度、肿瘤倍型和HLA-I类基因分型信息。本实施例中，所述体细胞变异检测通过varscan变异检测软件进行，细胞拷贝数变异信息以及肿瘤的纯度和倍型检测通过ascatngs工具进行，HLA-I类基因分型信息通过polysolver工具获取。
S4、利用步骤S3得到的所述检测结果，计算得到肿瘤样本的肿瘤突变负荷(TMB)、肿瘤内异质性(ITH)以及每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)和进化差异性(HED)。
其中，肿瘤突变负荷(TMB)为每Mb编码区域内的非同义体细胞突变个数，肿瘤内异质性(ITH)为亚克隆突变簇中的体细胞突变数量占所有体细胞突变数量的比例，每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)通过LOHHLA工具检测，进化差异性(HED)是利用Grantham距离矩阵计算HLA-I类等位基因肽段结合域的序列差异性得到。
S5、根据所述每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)校正所述进化差异性(HED)，并得到第一校正系数c1。
本实施例中，通过判断HLALOH是否为阳性来校正HED，若HLALOH为阳性，则HED值设为0，若HLA LOH阴性，则HED值保持不变。对肿瘤样本的所有HLA-1类基因的HED取均值，再利用函数公式转换得到第一校正系数c1，所述第一校正系数c1的取值范围为[0，1]，优选地，c1通过如下公式计算得到：c1＝tanh(HED/10)/2+0.5，c1的取值范围为[0.5,1)。
S6、对肿瘤样本的肿瘤内异质性(ITH)转换，得到第二校正系数c2。
本实施例中，所述对所述肿瘤样本的肿瘤内异质性(ITH)转换，得到的第二校正系数c2的取值范围为[0，1]，且优选地，采用如下公式：c2＝1-0.7*ITH，得到c2的取值范围为[0.3，1]。
S7、通过所述第一校正系数c1和第二校正系数c2计算得到综合生物标志物的肿瘤突变负荷值(oTMB)。
所述综合生物标志物的肿瘤突变负荷值(oTMB)的计算方式为：oTMB＝c1*c2*TMB。
实施例2
本实施例提供一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，以非小细胞肺癌免疫治疗队列肿瘤为例，具体的检测方法如下：
S1、获取69例患者的非小细胞肺癌免疫治疗队列肿瘤组织样本和对照血液样本的WES原始测序下机数据，通过去接头及低质量数据的质控处理后，得到WES测序数据。
S2、将69例测序数据与参考基因组hg19的序列比对，得到比对文件。
S3、利用所述比对结果，进行体细胞变异检测，得到69例患者的体细胞突变、深度、突变频率和体细胞拷贝数变异信息，以及获取肿瘤纯度、肿瘤倍型和HLA-I类基因分型信息。
S4、利用步骤S3得到的所述检测结果，计算得到69例肿瘤样本的肿瘤突变负荷(TMB)、肿瘤内异质性(ITH)以及每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)和进化差异性(HED)。
S5、根据所述每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)校正得到进化差异性(HED)值，并计算得到第一校正系数c1。
S6、对肿瘤样本的肿瘤内异质性(ITH)转换，得到第二校正系数c2。
S7、通过所述第一校正系数c1和第二校正系数c2计算得到综合生物标志物的肿瘤突变负荷值(oTMB)。根据每个患者的临床疗效有效性分为持续临床获益(DCB)和无持续临床获益(NDB)，利用这两个分组得到每个指标的ROC(受试者工作特征，Receiver OperatingCharacteristic)曲线及其AUC(Area Under Curve)值，AUC值是指ROC曲线下与坐标轴围成的面积，ROC曲线和AUC曲线如图2所示，图中，曲线1-TMB的ROC曲线(面积＝0.65)，曲线2-ITH的ROC曲线(面积＝0.66)，曲线3-HED的ROC曲线(面积＝0.50)，曲线4-oTMB的ROC曲线(面积＝0.70)，测试结果表明oTMB在非小细胞肺癌的免疫治疗疗效预测能力比其他单一生物标志物更好(AUC值最大)。
实施例3
本实施例提供一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，以鼻咽癌免疫治疗队列肿瘤为例，具体的检测方法如下：
S1、获取61例患者的鼻咽癌免疫治疗队列肿瘤组织样本和对照血液样本的WES原始测序下机数据，通过去接头及低质量数据的质控处理后，得到WES测序数据。
S2、将61例测序数据与参考基因组hg19的序列比对，得到比对文件。
S3、利用所述比对结果，进行体细胞变异检测，得到61例患者的体细胞突变、深度、突变频率和体细胞拷贝数变异信息，以及获取肿瘤纯度、肿瘤倍型和HLA-I类基因分型信息。
S4、利用步骤S3得到的所述检测结果，计算得到61例肿瘤样本的肿瘤突变负荷(TMB)、肿瘤内异质性(ITH)以及每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)和进化差异性(HED)。
S5、根据所述每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态(HLA LOH)校正得到进化差异性(HED)值，并计算得到第一校正系数c1。
S6、对肿瘤样本的肿瘤内异质性(ITH)转换，得到第二校正系数c2。
S7、通过所述第一校正系数c1和第二校正系数c2计算得到综合生物标志物的肿瘤突变负荷值(oTMB)。根据每个患者的临床疗效有效性分为持续临床获益(DCB)和无持续临床获益(NDB)，利用这两个分组得到每个指标的ROC(受试者工作特征，Receiver OperatingCharacteristic)曲线及其AUC(Area Under Curve)值，AUC值是指ROC曲线下与坐标轴围成的面积，ROC曲线和AUC曲线如图3所示，图中曲线1-TMB的ROC曲线(面积＝0.54)，曲线2-ITH的ROC曲线(面积＝0.60)，曲线3-HED的ROC曲线(面积＝0.40)，曲线4-oTMB的ROC曲线(面积＝0.63)。测试结果表明oTMB在鼻咽癌的免疫治疗疗效预测能力比其他单一生物标志物更好(AUC值最大)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、获取肿瘤样本与对照血液样本的全外显子测序数据；
S2、将所述测序数据与参考基因组的序列比对，得到比对结果；
S3、利用所述比对结果，进行变异检测，得到检测结果；
S4、利用所述检测结果，计算得到肿瘤样本的肿瘤突变负荷、肿瘤内异质性以及每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态和进化差异性；
S5、根据所述每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态校正所述进化差异性，并得到第一校正系数；
S6、对肿瘤样本的肿瘤内异质性转换，得到第二校正系数；
S7、通过所述第一校正系数和第二校正系数计算得到综合生物标志物的肿瘤突变负荷值。
2.根据权利要求1所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述检测结果包括肿瘤样本在全外显子范围内的体细胞突变、深度、突变频率、体细胞拷贝数变异信息、肿瘤纯度、肿瘤倍型和HLA-I类基因分型信息。
3.根据权利要求2所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述第一校正系数通过如下步骤获取：
S51、对肿瘤样本所有HLA-I类基因的基因进化差异性值取均值；
S52、利用函数公式转换得到第一校正系数，所述第一校正系数的取值范围为[0，1]。
4.根据权利要求3所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述第二校正系数通过对肿瘤样本的内异质性转换得到，所述第二校正系数的取值范围为[0，1]。
5.根据权利要求4所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S7中，所述肿瘤突变负荷值通过如下方式计算：将所述第一校正系数、第二校正系数乘以所述肿瘤样本的肿瘤突变负荷，得到综合生物标志物肿瘤突变负荷值。
6.根据权利要求4或5所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述第一校正系数的取值范围为[0.5，1)，所述第二校正系数的取值范围为[0.3，1]。
7.根据权利要求6所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述参考基因组为hg19基因组；所述步骤S2还包括对比对结果去冗余处理的步骤。
8.根据权利要求7所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过varscan工具进行体细胞变异检测。
9.根据权利要求8所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，计算得到的肿瘤突变负荷为每Mb编码区域内的非同义体细胞突变个数，肿瘤内异质性为亚克隆突变簇中的体细胞突变数量占所有体细胞突变数量的比值；每个HLA-I类基因的白细胞抗原杂合性缺失状态通过LOHHLA工具检测；所述进化差异性值通过Grantham距离矩阵计算HLA-I类等位基因肽段结合域的序列差异性得到。
10.根据权利要求9所述的用于预测肿瘤免疫治疗效果的生物标志物检测方法，其特征在于，所述步骤S1还包括对全外显子测序数据质控处理的步骤；所述步骤S5中所述校正所述进化差异性为：若白细胞抗原杂合性缺失阳性，则进化差异性设定为0，若白细胞抗原杂合性缺失阴性，则进化差异性保持不变。
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