CN114540488B - 一种用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合、检测装置、检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学技术领域，提供了一种用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合、检测装置、检测试剂盒及应用，所述基因组合包含633个基因，应用上述基因组合进行肿瘤突变负荷检测方法，以及应用该方法进行肿瘤突变负荷检测的装置，与现有技术中应用的全外显子检测以及现有的panel基因组检测相比，实现高效、准确的肿瘤突变负荷检测，本发明还提供了高通量靶向肿瘤突变负荷检测试剂盒，包括上述基因组合进行检测的探针和/或引物，能够用于评价癌症治疗产品的治疗效果，为癌症治疗产品的改进提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及医学技术领域，具体而言，涉及一种用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合、检测装置、检测试剂盒及应用。
背景技术
近些年来针对癌症的免疫治疗飞速发展，已有越来越多针对免疫检查点的药物开发上市。免疫检查点抑制剂利用癌症患者自身的免疫系统来对抗癌细胞，在肺癌，头颈癌，黑色素瘤等癌种的治疗中能给一部分患者带来长效稳定的治疗效果，但不是所有患者都能受益。
有研究发现，患者癌组织中的高突变数目与免疫反应呈正相关。同样的，各免疫检查点抑制剂的临床试验中也发现，具有较高突变数目的患者用药预后较好。TMB(肿瘤突变负荷)是目前用来评估肿瘤突变水平的指标，一般用WES(全外显子测序)的方法对肿瘤组织和对照样本进行检测，分析统计基因组上所有外显子的体细胞的非同义突变数目，再除以全外显子的长度(突变位点数/MB)。TMB已成为免疫治疗疗效的重要生物标志物。例如2018年针对晚期非小细胞肺癌的CheckMate227临床研究显示，当 TMB≥10mut/Mb时，使用纳武单抗加低剂量伊匹单抗的一年无进展生存率，明显高于铂类双联化疗(42.6％vs 13.2％)，无进展生存期也显著延长(7.2月vs 5.4月)。目前， NCCN的非小细胞肺癌治疗指南推荐需要纳武单抗等免疫治疗的患者检测TMB。越来越多的免疫药物开发和研究的临床试验也将TMB的检测作为患者入组的一个标准。
但由于WES的检测费用高，耗时长，临床转化率低，有研究或公司用目标区域基因panel代替WES来对TMB进行评估。例如2017年，FDA批准的FoundationOneCDx 基因检测试剂盒用此方法测量TMB。FoundationOneCDx试剂盒只对肿瘤样本测序，然后通过统计方法和人群数据库信息在基因突变中确定胚系突变并过滤。FoundationOneCDx试剂盒只覆盖0.79MB的外显子区域，而且仅能通过预测的方式进行胚系过滤。FDA在2020年批准的PGDxelioTMtissue complete试剂盒也使用的单样本检测方法，用1.3MB的目标区计算TMB。其他市场上各种基因panel的目标区域各不相同，计算TMB的方法也各不相同，与WES检测的一致性不能保证，需要一种能够使用基因panel准确检测TMB的方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供了一种用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合，以及采用该基因组合进行肿瘤突变负荷检测的方法，该方法能够实现有无配对样本均可准确检测TMB水平，并达到与全外显子(WES)检测TMB近似的准确度。
本发明的另一个目的在于，提供一种高通量靶向肿瘤突变负荷的检测装置，该检测装置使用上述的基因组合及检测方法，实现高效、准确的肿瘤突变负荷检测。
本发明还有一个目的在于，提供一种高通量靶向肿瘤突变负荷检测试剂盒，该试剂盒包括上述基因组合进行检测的探针和/或引物，能够用于评价癌症治疗产品的治疗效果。
本发明的实施例可以这样实现：
第一方面，本发明实施例提供一种用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合，所述基因组合包括以下基因：
第二方面，本发明实施例提供采用前述实施方式所述的基因组合进行肿瘤突变负荷检测的方法，所述方法包括首先获取肿瘤基因样本，然后对肿瘤基因样本中包含的前述实施方式所述基因组合进行测序并统计突变位点数量及各突变位点的突变频率，最后计算公式：根据肿瘤突变负荷＝肿瘤基因样本突变数量/基因组合区域碱基百万数，来计算肿瘤突变负荷。
上述的测序指的是能够实现边合成边测序的高通量测序方法，包括第二代测序技术。所述第二代测序技术是指由罗氏于2005年提出的，基于PCR和基因芯片发展而来的 DNA测序技术。
在可选的实施方式中，所述突变位点数量包括，单碱基突变和插入缺失突变数量。
优选地，所述突变位点数量去除oncokb中收录的热点突变位点数量。
本发明提供的基因组合选取的基因组合是临床关注的热点突变频发区域，针对该基因组合仍直接采用非同义突变计算TMB会导致TMB结果偏高，因此，需要去除热点突变区域，本发明以oncokb中收录的高频突变位点作为热点突变区域。
在可选的实施方式中，在统计突变位点数量之前，还包括对肿瘤样本基因的测序结果进行预处理。
优选地，所述预处理包括对测序结果进行质控处理和/或去重处理。
优选地，采用fastp对所述测序结果进行质控处理。
优选地，采用bwa将测序结果与参考基因组比对，并使用gencore对测序结果进行去重处理。
优选地，采用bwa将质控处理后的测序结果与参考基因组比对，并使用gencore对质控处理后的测序结果进行去重处理。
在可选的实施方式中，所述统计突变位点数量的方法包括利用基因组合变异检测工具对测序结果进行突变位点检测。
优选地，所述基因组合变异检测工具包括GATK的HaplotypeCaller或UnifiedGenotyper工具。
在可选的实施方式中，统计突变位点数量后还包括突变位点的过滤步骤。
优选地，所述过滤步骤包括去除肿瘤基因样本中与正常配对基因样本相同的突变位点。
优选地，所述过滤步骤包括去除肿瘤基因样本中与检测实施方自行构建的阴性池相同的突变位点。
优选地，所述阴性池包括来源于健康人白细胞的基因样本。
优选地，所述过滤步骤包括去除肿瘤基因样本中含有的千人基因组数据库中人群频率大于0.003的突变位点。
优选地，所述过滤步骤包括去除肿瘤基因样本中含有的胚系数据库位点。
优选地，所述胚系数据库包括dbSNP、dbSNPcommon、COSMIC中的一种或两种以上组合。
在可选的实施方式中，所述突变位点过滤步骤完成后还包括突变位点的校正步骤。
优选地，所述校正步骤包括去除肿瘤基因样本中突变频率在0.4～0.75或0.9～1范围内的突变位点。
优选地，所述校正步骤包括，将突变频率按照与0.5或1的距离有小到大排列，去除前9个突变位点。
群体中个体存在特有胚系突变的现象是较为常见的，且sitenum<9的个体占比大于 95％。因此，在single TMB分析过程中有一部分客观存在germline位点无法通过公共胚系位点数据库过滤掉，这样得到的TMB值比实际的理论值(paired方法)要高。为了平衡这个偏差，本申请引入了胚系位点校正步骤，即对每个样本过滤后位点进行germline 位点校正。去除样本突变频率在0.4-0.75，0.9-1范围内的位点，去除最大位点数为9。
第三方面，本发明实施例提供一种高通量靶向肿瘤突变负荷的检测装置，所述检测装置包括：
测序模块，用于获取待测基因样本，然后对基因样本在前述实施方式所述基因组合区域进行高通量测序，并收集测序结果。
统计模块，用于统计测序结果中的突变位点数量及各突变位点的突变频率。
分析模块，用于计算计算肿瘤突变负荷。
优选地，所述测序模块还用于对测序结果进行质控处理和/或去重处理。
优选地，所述分析模块还用于对突变位点进行过滤和/或校正。
第四方面，本发明实施例提供一种高通量靶向肿瘤突变负荷的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括对前述实施方式所述基因组合进行检测的探针和/或引物。
第五方面，本发明实施例提供前述实施方式所述的测试剂盒在评价癌症治疗产品的治疗效果中的应用。
优选地，所述癌症治疗产品包括免疫治疗药物。
优选地，所述癌症包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、消化道癌、胰腺癌、头颈癌或泌尿系统肿瘤。
本发明实施例的有益效果包括：
本发明提供的包含633个基因的、用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合，应用于肿瘤突变负荷检测时，相对于全外显子检测，所需成本更低，计算结果准确可靠、高效省时；相对于现有的panel基因组，与全外显子检测相比，具有更高的一致性。
本发明提供的应用上述基因组合进行肿瘤突变负荷检测方法，以及应用该方法进行肿瘤突变负荷检测的装置，与现有技术中应用的全外显子检测以及现有的panel基因组检测相比，实现高效、准确的肿瘤突变负荷检测。
本发明提供的高通量靶向肿瘤突变负荷检测试剂盒，包括上述基因组合进行检测的探针和/或引物，能够用于评价癌症治疗产品的治疗效果，为癌症治疗产品的改进提供了依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中TMB检测流程图；
图2为实施例3中TMB检测流程图；
图3为实施例2与实施例3所得TMB检测结果相关性分析图；
图4为实施例4与对比例1所得TMB检测结果相关性分析图；
图5为实施例5与对比例1所得TMB检测结果相关性分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参考基因组是指任何生物体或病毒的任何具体的已知基因组序列(无论是部分的或完整的)，它可以用于对来自受试者的识别的序列进行参比。例如，用于人类受试者以及许多其他生物体的参考基因组可见于美国国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)，对于人的样品来说，参照序列可以是人基因组hg18或hg19的序列。目前hg19的相关数据库相对较多且hg19测出来的碱基量比hg18要多，即样品比对率会相对较高，所以优先选择hg19。
Panel产品变异检测工具包括GATK的HaplotypeCaller或UnifiedGenotyper工具。
若出现术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例中的特征可以相互结合。
实施例1
本实施例提供了用于高通量靶向测序检测肿瘤突变负荷的基因组合，即Panel基因组，共包括633个基因，区域长度为1.59Mb，如下所示：
实施例2
本实施例提供了一种采用实施例1提供的基因组合进行TMB检测的方法，技术路线如图1所示，具体包括如下步骤：
2.1材料准备：
收集临床肿瘤样本260例作为测试样本用于获得用于肿瘤突变负荷检测的Panel基因组，同时收集每例临床肿瘤样本的正常配对样本。
2.2数据建库测序：
利用实施例1给出的Panel基因组的目标区域探针对每例临床肿瘤样本都进行捕获建库测序获得原始二代测序数据(rawdata)。
2.3测序数据质控
使用fastp对rawdata进行数据质控，将质控后的数据使用bwa与参考基因组(hg19) 比对，使用gencore对比对后的数据去重复得到去重后比对结果(bam)。
2.4突变位点检测
以去重后比对数据为输入，利用Panel产品变异检测工具进行突变位点检测获得突变位点信息结果，共获得39264个突变位点，该步骤也可用GATK的HaplotypeCaller 或UnifiedGenotyper工具，流程参数参考GATK官方文档。然后与正常配对样本对比，去除与正常配对样本检测一致的基因位点，去除后，共获得7034个比对后突变位点，再对得到比对后突变位点进行背景过滤，背景过滤选用的阴性池来源于为52例健康人白细胞的基因样本构成，并去除热点突变后，共获得4388个过滤后突变位点。
2.5 TMB的计算：
分别统计上述260例测试样本过滤后突变位点数量，而后除以基因组合区域碱基百万数1.59，得到各自TMB结果如表1所示。
实施例3
本实施例提供了一种采用实施例1提供的基因组合对实施例2收集的260例临床肿瘤样本进行TMB检测的方法，技术路线如图2所示，具体包括如下步骤：
3.1数据建库测序：
利用实施例1给出的Panel基因组的目标区域探针对实施例2收集的每例临床肿瘤样本都进行捕获建库测序获得原始二代测序数据(rawdata)。
3.2测序数据质控
使用fastp对rawdata进行数据质控，将质控后的数据使用bwa与参考基因组(hg19) 比对，使用gencore对比对后的数据去重复得到去重后比对结果(bam)。
3.3突变位点检测
以去重后比对数据为输入，利用Panel产品变异检测工具进行突变位点检测获得突变位点信息结果，共获得39264个突变位点，该步骤也可用GATK的Haplotype Caller 或Unified Genotyper工具，流程参数参考GATK官方文档。
3.4过滤人群频率：
过滤在千人基因组数据库中人群频率大于0.003的突变位点，过滤人群频率后突变位点为8824个。
3.5过滤胚系数据库：
选择胚系数据库dbSNP、dbSNPcommon、COSMIC，对上述获得的过滤人群频率后突变位点进行再次过滤，去除包含于胚系数据库dbSNP、dbSNPcommon、COSMIC中的突变位点，而后再对得到突变位点进行背景过滤，背景过滤选用的阴性池来源于52 例健康人白细胞的基因样本，得到过滤胚系数据库后的突变位点6483个。
3.6胚系突变位点校正：
在步骤3.5得到的6483个突变位点中筛选出突变频率在0.4～0.75范围内的突变位点，分别计算各突变位点的突变频率与0.5的差值绝对值，再筛选出突变频率在0.9～1范围内的突变位点，分别计算各突变位点的突变频率与1的差值绝对值，将上述得到的差值绝对值按照有小到大的顺序排列，并去除前9个突变位点，经去除热点突变位点后，共获得4284个校正突变位点。
3.7 TMB的计算：
分别统计上述260例测试样本校正突变位点数量，而后除以基因组合区域碱基百万数1.59，得到各自的TMB结果如表1所示。
表1 实施例2和实施例3计算得到的260例测试样本TMB结果
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对上述实施例2和实施例3得到的TMB结果进行一致性分析，通过线性拟合得到实施例2和实施例3所得TMB结果的线性拟合方程为y＝0.122+0.965*x，如图3所示，R2为0.987，P值为0.000，Spearman correlation＝0.896,Pearson correlation＝0.993，证明实施例2和实施例3所得TMB检测结果高度一致。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于，本实施例的测试样本为新采集的68例临床肿瘤样本，其检测结果如表2所示。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例的测试样本为新采集的68例临床肿瘤样本，其检测结果如表2所示。
对比例1
本对比例采用WES测序方法，使用全基因组外显子区域覆盖长度约为34Mb，采用GATK方法对实施例4新收集的68例临床肿瘤样本进行突变位点检测，并根据下述公式计算其WES TMB：
WES TMB计算公式为：
TMB＝S/L
S为检测出来的肿瘤体细胞突变包含单碱基突变和插入缺失突变并去除oncokb中收录的高频突变位点后的突变位点数目，L为WES覆盖编码序列(CDS)区域长度含有碱基的百万数，为34Mb，结果如表2所示。
表2 实施例4和5、对比例1所得TMB结果
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对上述对比例1和实施例4得到的TMB结果进行一致性分析，通过线性拟合得到对比例1和实施例4所得TMB结果的线性拟合方程为y＝2.872+1.208*x，如图4所示， R2为0.978，P值为0.000，Spearman correlation＝0.967，Pearson correlation＝0.989。证明实施例4检测得到的TMB结果与WES TMB结果高度相关，说明采用本发明提供的基因组合进行TMB检测的实施例4所得的检测结果具有较高的准确性。
对上述对比例1和实施例5得到的TMB结果进行一致性分析，通过线性拟合得到对比例1和实施例5所得TMB结果的线性拟合方程为y＝3.601+1.274*x，如图5所示， R2为0.984，P值为0.000，Spexarman correlation＝0.972，Pearson correlation＝0.991。证明实施例5检测得到的TMB结果与WES TMB结果高度相关，说明采用本发明提供的基因组合进行TMB检测的实施例5所得的检测结果具有较高的准确性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (1)
1.一种高通量靶向肿瘤突变负荷的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
测序模块，用于获取待测基因样本，然后对基因样本在基因组合的区域进行高通量测序，并收集测序结果；
统计模块，用于统计测序结果中的突变位点数量及各突变位点的突变频率；
分析模块，用于计算肿瘤突变负荷；
所述测序模块还用于对测序结果进行质控处理和去重处理；采用fastp对所述测序结果进行质控处理；采用bwa将质控处理后的测序结果与参考基因组比对，并使用gencore对质控处理后的测序结果进行去重处理；
所述分析模块还用于对突变位点进行过滤和校正；所述过滤步骤包括去除肿瘤基因样本中与检测实施方自行构建的阴性池相同的突变位点、去除肿瘤基因样本中含有的千人基因组数据库中人群频率大于0.003的突变位点，以及去除肿瘤基因样本中含有的胚系数据库位点；所述阴性池包括来源于健康人白细胞的基因样本；所述胚系数据库包括dbSNP、dbSNPcommon、COSMIC中的一种或两种以上组合；
所述校正步骤包括将肿瘤基因样本中突变频率在0.4～0.75或0.9～1范围内的突变位点的突变频率按照与0.5或1的距离由小到大排列，去除前9个突变位点；
所述基因组合包括以下基因：
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