CN110079589A - 一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其将待测基因组片断化后，切胶回收不同片段大小的目的片段，再通过高通量测序分别建库测序，基于大小不同的片段测序结果，通过对不同片段之间重叠分析，进一步鉴定基因组内的结构变异情况。本发明方法除了能够检测SNPs外，还能更加简单有效的通过检测不同片段文库之间的重叠群，对与基因组上的缺失，插入和错配的结构变异进行有效检测，相较于现有分析方法，本发明方法具有成本低，速度快，效率高、结果完整等优势。
Description
技术领域
本方法涉及基因组测序技术领域，尤其涉及一种精准高效的获得全基因组范围内的结构变异。
背景技术
生命的遗传信息存储于DNA序列之中，基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础，是生物多样性的最初变异来源。其中单核苷酸的变异是DNA序列的最常见、最基本的变异。高等动植物基因组上的结构性变异研究对于基因组进化、群体多态性分析以及疾病易感性等方面的研究有着重要的意义。高等动植物基因组上的变异主要分为三大类：1.单核苷酸变异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，通常称为单核苷酸多态性，是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，它包括单碱基的转换，颠换，插入以及缺失等形式。通俗的说法就是单个DNA碱基的不同。全基因组关联分析(Genome-wideassociation study，GWAS)即是应用基因组中数以百万计的SNPs为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种策略。目前，对于SNP的检测方法有很多，包括荧光探针法、单碱基延伸法、焦磷酸测序法、电泳法和PCR重测序法等，但这些方法各有其局限性，费用高，易出现假阳性，灵敏度低等缺陷。2.小的In Del(Insertion and Deletion)，指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除，其长度通常在50bp以下(这个长度范围的变异可以利用Smith-Waterman的比对算法来获得)；SNP的数量由In Del的密度决定，In Del本身也是一种核苷酸插入/缺失突变，且In Del能够引起附近碱基发生热点突变。所以作为多数自发突变的发生根源的In Del，对物种基因组结构和适应性进化起着非常重要的作用，在解开肿瘤发生机制、作物和家畜遗传育种等方面具有重大潜在应用价值。3.大的结构性变异，这种类型比较多，包括长度在50bp以上的长片段序列的插入或者删除、染色体倒位，染色体内部或染色体之间的序列易位，拷贝数变异，以及一些形式更为复杂的变异。第二代短reads高通量测序技术的发展在带来了测序成本降低的同时，这种短读长的测序方式也给人类的变异检测带来了很大的挑战。
随着芯片技术和第二代测序技术的诞生和迅猛发展，极大地促进了对生物信息学的研究，例如国际千人基因组计划，然而需要指出的是，对于千人基因组计划，基本上只关注于一些大片段的序列删除和一些特定的序列插入方面的检测，而忽视了很多基因组上其他形式的变异。关于这方面的局限性，一方面可能是由于生物信息检测方法上的不完善，另一方面可能也和千人基因组本身的数据特点有关，使得他们难以准确地获得更多的信息。这就促使我们开发更加高效有益的检测方法。高通量测序能够在单碱基精度之下对全基因组范围内所有类型的变异进行检测，而芯片技术针对大片段的序列删除比较敏感。作为序列中分布密度最大的两种分子标记，In Del和SNP分布并不均匀，它们的位置具有一定互补性。SNP在高等动植物基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。与SNP标记相比，In Del标记能更准确地鉴定样品间的亲缘关系，对In Del的检测和分析有助于找到与疾病相关的一些位点，为后续的疾病病理确定，治疗方案探索有重要意义。由于在同一个基因内，有可能仅仅发生一种类型的突变，也又可能同时具有两种或者两种以上的突变类型。普通的检测方法往往一次只能检测一个样本的一种类型的变异，无法同时应对多样本、多基因、多检测类型的需求。
因此，现有技术有待于进一步发展和进步。
发明内容
针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其将待测基因组片断化后，切胶回收不同片段大小的目的片段，再通过NGS建库、测序，最后进行数据分析组装，如图6所示。
本发明具体技术方案如下：
一种精准高效的获得全基因组范围内结构变异的方法，按照如下步骤进行：
(1)基因组DNA的提取：利用酚-氯仿提取待测样品基因组。
所述基因组DNA经过琼脂糖电泳检测提取DNA样品的完整性，以及ThermoScientific NanoDrop 2000/2000c进行纯度检测，并用进行定量。
(2)基因组DNA的片段化及其检测回收：使用Covaris S220对步骤(1)提取的基因组进行超声打断，使其片段分布于200～700bp，并利用Agilent Bioanalyzer 2100来检测基因组DNA的片段化分布，如图1所示，之后通过Life technology公司开发的预制琼脂糖凝胶电泳系统分别回收200bp、300bp和500bp大小的片段。
所述基因组的随机片段化的方法常见的有两种：超声打断和酶打断。超声打断可以通过Covaris系列仪器完成；酶打断可用片段化酶(NEB公司的Fragmentase)或者转座酶完成。本发明利用Covaris系列仪器超声打断。所述的片段化分布的检测是通过AgilentHigh Sensitivity DNA Kit完成。
(3)将步骤(2)回收的DNA片段末段补平和加腺嘌呤尾巴。
所述的片段化DNA末段修复和加“A”的实现是通过KAPA Hyper Prep Kit进行完成或者等价产品。
(4)将步骤(3)DNA片段的两端加上测序时需要的DNA接头序列。
所述的接头序列的连接是通过KAPA Hyper Prep Kit完成，或者等价产品。
(5)对步骤(4)的产物进行纯化。
所述产物的纯化是通过Backman AMPure XP Beads或离心柱型DNA纯化回收试剂盒(QIAGEB公司或Zymo公司)的方法完成的。
(6)对步骤(5)的产物进行PCR扩增。
所述产物的pcr富集按下述反应条件进行：98℃45s；98℃10s，60℃30s，72℃30s，7-10循化；72℃1min；4℃保存。
(7)扩增文库的预制琼脂糖凝胶电泳系统检测及其目标片段(320bp、420bp和620bp)的回收，并利用Agilent Bioanalyzer 2100来检测基因组DNA的片段化分布，如图2～5所示；。
(8)被选择DNA文库的测序：根据文库的浓度，按照Illumina相关仪器的要求，上机测序。
有益效果
本发明提供一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法，该方法除了能够检测SNPs外，还能更加简单有效的通过检测不同片段文库之间的重叠群，对与基因组上的缺失，插入和错配的结构变异进行有效检测，相较于现有分析方法，本发明方法具有成本低，速度快，效率高、结果完整等优势。
附图说明
图1本发明实施例中Covaris S220片段化基因组DNA的片段分布图；
图2本发明实施例中200bp、300bp和500bp文库片段(加上接头后)分布检测图；
图3～5本发明实施例中文库片段分布Agilent Bioanalyzer 2100检测图；
图6本发明实施例中以单个突变位点为例的模式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施方案中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，均来自常规PCR、测序建库生化试剂商店(Thermo Fisher、NEB、KAPA、Illumina等)购买。
本实施例中以C2C12细胞的基因组为研究对象，后续实验的开展均依托于此。
1.基因组DNA的提取
利用酚-氯仿抽提法提取C2C12细胞基因组。具体操作如下：
1)消化：10μL 10％SDS(终浓度为1％)，5μL蛋白酶K(终浓度为100～200μg/ml)，并轻轻振荡10min，混匀后放在55℃的烘箱内消化至透明。
2)抽提步骤1：加入等体积平衡酚(约700μL)，上下轻轻混匀10min，13000r/min离心10min，小心吸取上清液置于空白管内。
3)抽提步骤2：加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)混合液，混匀10min，13000r/min离心10min，小心吸取上清液置于空白管内。
4)沉淀：在上清液中加入两倍体积的-20℃冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少10min，4℃13000r/min离心20min，弃上清液。
5)漂洗：加入500μL的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000r/min离心2min，吸去上清液。
6)干燥：将管倒立在卷纸上，晾干DNA沉淀块，除去残余乙醇。
7)溶解：加入适量TE(pH 8.0)或灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，保存以备电泳检测。
2.物理的方式打断基因组
本实施例采用Covaris S220完成基因组的片段化。首先将基因组DNA充分溶解，补充体积至130μL，加入Covaris DNA打断管，之后利用Covaris S220超声打断系统对基因组DNA进行片段化，具体的参数如表1所示：
表1
| 目的片段峰值(bp) | 350bp |
| Peak Incident Power(W) | 120 |
| Duty Factor(％) | 20 |
| Cycles per Burst | 250 |
| Treatment Time(s) | 240 |
| Sample Volume(μL) | 130 |
打断产物通过预制琼脂糖凝胶电泳系统检测(图1)，如片段分布符合预期，利用离心柱型DNA纯化回收试剂盒(QIAGEN公司或Zymo公司)别切胶回收200bp、300bp和500bp区域。本实施例中使用ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit进行实验，具体操作如下：
1)使用手术刀或其他方法从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段(200bp、300bp和500bp区域)，将其转移到1.5ml微量离心管中，称取重量；
2)按100mg琼脂糖胶块加入300μL ADB缓冲液的比例加入缓冲液；
3)55℃孵育5-10min，使其充分溶解至透明状态；
4)将完全融化的琼脂糖溶液加入Zymo-Spin TM柱中，置于2ml收集管中，13000g离心30～60s；
5)弃废液，向柱中加入200μL洗涤缓冲液，13000g离心30～60s；
6)弃废液，加入200μL洗涤缓冲液，13000g离心30s；
7)将Zymo-Spin柱放入新的1.5ml管中，将6-10μL水向吸附膜中间位置悬空滴加，13000g离心1min以洗脱DNA。
3.将步骤2回收的DNA片段末段补平和加腺嘌呤尾巴。
按表2所示反应体系进行配置：
表2
| 成分 | 体积(μL) |
| Fragmented,double-stranded DNA | 25 |
| End Repair&A-Tailing Buffer | 3.5 |
| End Repair&A-Tailing Enzyme Mix | 1.5 |
| Total volume: | 30 |
将配置好体系的使用移液器轻轻吹打充分混匀或者涡旋混匀，短暂离心后放置PCR仪中，程序如表3所示：
表3
| 温度 | 时间 |
| 20℃ | 30min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | ∞ |
4.将步骤3修复后的DNA片段的两端加上测序时需要的DNA接头序列
按表4所示反应体系进行配置：
表4
| 成分 | 体积(μL) |
| End repair and A-tailing reaction product | 30 |
| Adapter stock | 2.5 |
| PCR-grade water | 2.5 |
| Ligation Buffer | 15 |
| DNA Ligase | 5 |
| Total volume: | 55 |
将配置好体系的使用移液器轻轻吹打充分混匀或者涡旋混匀，短暂离心后放置PCR仪中，20℃孵育15min。
5.对步骤4的产物进行纯化。
本实施例中对步骤4所述产物的纯化是通过0.8×Beckman AMPure XP Beads完成的。具体操作如下：
1)加入44μL Beckman AMPure XP涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育10min；
2)将反应管短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)移除上清；
3)加入500μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，小心移除上清；
4)重复步骤3)一次；
5)开盖空气干燥约5min；
6)将反应管从磁力架上取出，加入10μL Nuclease-free water混匀，室温孵育10min；
7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取10μL上清至新的无菌PCR管中。
6.PCR扩增
按表5所示反应体系进行配置：
表5
| 成分 | 体积(μL) |
| KAPA HiFi HotStartReadyMix(2X) | 12.5 |
| KAPA Library Amplifcation Primer Mix(10X) | 2.5 |
| Adapter-ligated library | 10 |
| Total volume: | 25 |
将配置好体系充分混匀并短暂离心后放置PCR仪中，程序设置如下：98℃45s；98℃10s，60℃30s，72℃30s，7-10循环；72℃1min；4℃保温。
7.对步骤6的产物进行纯化
本实施例中对步骤6所述产物的纯化是通过1.0×Beckman AMPure XP Beads完成的。具体操作如下：
1)加入25μL Beckman AMPure XP涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育10min；
2)将反应管短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)移除上清；
3)加入500μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，小心移除上清；
4)重复步骤3)一次；
5)开盖空气干燥约5min；
6)将反应管从磁力架上取出，加入20μL Nuclease-free water混匀，室温孵育10min。
7)将反应管短暂离心并置于磁力架上，待溶液澄清后小心吸取20μL上清至新的无菌PCR管中。
8.扩增文库的预制琼脂糖凝胶电泳系统检测及其上机测序片段的回收与定量。
本实施例对于扩增文库的检测通过预制琼脂糖凝胶电泳系统完成(图2)。切胶回收步骤参照步骤2。
本实施例利用Agilent Bioanalyzer 2100来检测文库的片段分布(图3-图5)。
9.被选择DNA文库的测序：根据文库的浓度，按照Illumina相关仪器的要求，上机测序。
本发明利用二代高通量测序技术高效获得全基因组范围内的分子标记信息的优势，利用切胶回收待测样本不同大小的目的片段进行建库，可以在全基因组范围内获得大量的SNPs位点，还可以通过分析片段大小不同的文库，通过彼此之间的重叠，进一步分析得到大量的In Del和大的结构变异等基因组结构变异的信息。本发明方法具有成本低，速度快，效率高、结果完整等优势。当所研究物种的基因组参考序列信息未知或者不完全时，此方法的优势尤为显著。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，将待测基因组片断化后，切胶回收不同片段大小的目的片段，再通过高通量测序分别建库测序，基于大小不同的片段测序结果，通过对不同片段之间重叠分析，进一步鉴定基因组内的结构变异情况。
2.根据权利要求1所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，所述基因组片段化步骤之前包括基因组DNA的提取，利用酚-氯仿提取待测样品基因组。
3.根据权利要求2所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，提取的待测样品基因组经过琼脂糖电泳检测提取基因组DNA的完整性，通过Thermo ScientificNanoDrop 2000/2000c进行纯度检测，并用进行定量。
4.根据权利要求3所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，所述将待测基因组片断化后，切胶回收不同片段大小的目的片段步骤具体为：对提取的基因组利用超声打断和酶打断，使其片段分布于200～700bp，之后通过琼脂糖凝胶电泳系统分别回收200bp、300bp和500bp大小的片段。
5.根据权利要求4所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，利用Agilent Bioanalyzer 2100来检测基因组DNA的片段化分布，琼脂糖凝胶电泳系统采用Life technology公司开发的E-预制琼脂糖凝胶电泳系统。
6.根据权利要求4所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，所述通过高通量测序分别建库测序步骤具体为：
1)将回收的不同大小DNA片段末段补平和加腺嘌呤尾巴，将处理后DNA片段的两端加上测序时需要的DNA接头序列；
2)将步骤1)处理后产物纯化后进行PCR扩增；
3)扩增文库的检测及其目标片段320bp、420bp和620bp的回收；
4)对所选择DNA文库的测序。
7.根据权利要求6所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，步骤1)DNA片段末段补平和加腺嘌呤尾巴以及DNA接头序列的连接均通过KAPA Hyper Prep Kit进行完成。
8.根据权利要求6所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，步骤2)产物的纯化是通过Backman AMPure XP Beads或离心柱型DNA纯化回收试剂盒完成。
9.根据权利要求6所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，步骤2)PCR扩增按以下反应条件进行：98℃45s；98℃10s，60℃30s，72℃30s，7-10循化；72℃1min；4℃保存。
10.根据权利要求6所述的精准获得全基因组范围内结构变异的方法，其特征在于，步骤3)中扩增文库通过E-预制琼脂糖凝胶电泳系统检测。
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| CN201910421671.8A CN110079589A (zh) | 2019-05-21 | 2019-05-21 | 一种精准获得全基因组范围内结构变异的方法 |
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