CN110527724A - 一组探针集及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一组探针集及其应用，更具体地，本发明涉及一组探针集、构建高通量测序文库的方法、确定待测样本单核苷酸突变和单体型的方法、构建高通量测序文库的装置以及确定待测样本单核苷酸突变和单体型的系统。本发明可以同时检测多种单基因遗传病或遗传性肿瘤的基因情况，捕获特异性好、灵敏度高、覆盖率广，能够有效实现34种PGD的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一组探针集及其应用，更具体地，本发明涉及一组探针集、构建高通量测序文库的方法、确定待测样本单核苷酸突变和单体型的方法、构建高通量测序文库的装置以及确定待测样本单核苷酸突变和单体型的系统。
背景技术
胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)是指在体外受精(IVF)过程中形成胚胎，在胚胎植入子宫之前，对具有已知疾病遗传风险或有HLA配型需求的胚胎进行活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病或符合预期人类白细胞抗原(HLA)配型的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法，可有效提高IVF成功率，降低遗传疾病患儿的出生率。PGD可对带有多数单基因遗传病风险的胚胎进行检测，如其中的极具地域特点的单基因病地中海贫血。地中海贫血(简称地贫)是一种由珠蛋白基因缺陷引起的溶血性单基因病，全世界大约7％的人群携带地中海贫血基因突变，每年有大约50万重型地贫新生儿出生。在我国，长江流域以南的两广、云贵及海南地区为地贫高发区，地贫基因携带者大于本地人口总数的10％、甚至20％。
目前，在国内外的地贫检测中，STR技术材料繁杂，位点较少，覆盖面不广；aCGH和SNP Array等方案成本较高，通量较低，在这些常规技术中，都无法对预期区域、位点以外的信息做检测，而近年来开展的高通量检测技术，其覆盖面广、成本较低、通量较高等优点使其在短时间内获得快速发展。
目前，针对胚胎植入前染色体非整倍体筛查的方法主要有：聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)技术，微阵列(Microarrays)技术和二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)。近年来发展起来的微阵列技术有微阵列比较基因组杂交(Array Comparative Genomic Hybridization，array-CGH)技术和单核苷酸多态性微阵列(Single Nucleotide Polymorphism-based Array，SNP array)技术。
PCR实验原理：聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加；在PGD应用中，PCR技术方法包括传统PCR，短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测，多重PCR，实时荧光定量PCR(qPCR)等技术，通过目标基因位点的复制及放大来检测目标基因基因型别，指导体外受精胚胎的选择及植入。如在STR检测中，PGD选择的STR位点必须是杂合子，而且在配子的减数分裂过程中，基因和STR位点之间可能有基因重组，因此必须同时分析疾病基因两侧的多个STR相关疾病标记来避免误诊的可能。一般建议至少选择5个人群中平均杂合子率85％以上的STR位点进行诊断，进行多个STR位点的胚胎单倍型分析也会明显提高单个或少量细胞的检出率。
CGH实验原理：用不同颜色的荧光染料分别标记待测DNA跟对照DNA，两种DNA等量混合后与处于有丝分裂中期的染色体杂交，用相应的软件分析荧光显微镜所成图像。如果待测DNA信号强于对照DNA信号，证明有染色体三体或者CNVs重复，反之，则证明有染色体单体或者CNVs缺失；如果二者信号相当，则证明染色体正常。Array-CGH实验原理同CGH很相似，只是用带有基因组片段克隆载体的microarray代替了CGH中的有丝分裂中期染色体，但分辨率高于CGH。SNP array实验原理：用带有单链SNP片段探针的microarray同片段化的单链基因组DNA杂交，捕获基因组DNA的SNP位点，并通过软件分析得出基因组SNP情况，简单原理见图1。
但上述技术存在如下缺陷：PCR技术需对待测位点进行筛选、引物设计及实验调整，前期耗时较长，且在检测过程中无法避免由于扩增等位基因脱扣(allele dropout,ADO)率所带来的影响；SNP array技术由于其快速准确及高分辨率的特性已初步用于临床，但高昂的价格及检测过程中过量信息带来的分析困难是该项技术存在的缺点。
因此，建立一种液相捕获探针结合BGISEQ-500的PGD技术方案，克服现有技术前期耗时长、检测成本高的缺点，从而解决大部分遗传缺陷问题，对我国的优生优育工作具有极大的意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供一种探针集及其应用，所述探针集及其组成的试剂盒、装置和系统可以同时检测多种单基因遗传病或遗传性肿瘤的基因情况，通过家系连锁分析也可避免由于扩增ADO带来的检测错误。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一组探针集，包括分别特异性识别多个目的基因的多个探针，且探针集中每个探针均是根据下列探针设计原则获得：
(1)所述探针的长度为80-95nt，优选为85-92nt；
(2)进行探针设计时，间隔1bp窗口滑动；
(3)去除含有未知碱基序列的探针；
(4)当多个探针之间属于重复序列的比例为100％时，去除所述多个探针；
(5)保证每个目标区域的探针覆盖度均为2X；
(6)特异性识别GC含量高于0.6区域，重复设计探针1-2次。
本发明中，所述探针设定目标区域基因列表，所述目标区域为SNP所在区域，将目标区域向上下游延伸预定长度35-50bp，优选为40-45bp，以便获得经过处理的目标区域，通过每个探针1bp窗口滑动，设定探针长度为80-95nt，获得初始探针集；将初始探针集通过筛选去除含有未知碱基的探针序列，确定筛选后的探针属性参数，确定每条探针的分值，筛选后获得探针集；为保证高覆盖度，本申请探针集允许的探针之间碱基的重复序列比例为100％；即如果一些探针与探针之间碱基重复序列的比例为100％时，所述重复探针则全部丢弃；将所述探针识别目标区域编码区上设计深度为2X，即同一区域探针覆盖度一般为2次；对于高GC的区域(GC含量>0.6)，探针设计会在原有基础上重复设计1-2次以降低高GC带来的捕获影响。
本发明中，所述探针软件中的重复序列为使用repeatMasker、windowMasker等序列屏蔽软件识别的非复杂重复和散在重复。
本发明中，发明人发现，所述探针集对其特异性识别的34种疾病的PGD的检测，捕获特异性好、灵敏度和覆盖度非常高，能够有效用于PGD的捕获检测。
本发明中，所述探针的长度为80-95nt，例如可以是80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、92nt、93nt、94nt或95nt，优选为85-92nt，进一步优选为90nt。
本发明中，所述目标区域向上下游延伸预定长度35-50bp，例如可以是35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp或50bp。
根据本发明，利用本发明的探针集能够准确有效地捕获探针特异性识别的目标序列，从而能够有效构建获得目标序列的核酸测序文库，进一步，将该核酸测序文库用于高通量测序，能够有效确定待测样本的序列信息，进而通过家系连锁分析，可以实现单基因遗传病/遗传性肿瘤的家系连锁检测。
根据本发明，所述目的基因为选自下列的至少一种：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA。
本发明中，根据所述基因采用上述探针设计原则，可以针对不同的目的基因进行设计从而得到相应的检测探针集，部分探针组列举如下：
TSC1基因(SEQ ID NO.1-6)：
GAGATGGGAAATGCACTGGCTGACCTTGACCTCGGTCTTTCCCTTTCCTGGACACGACACCATCCCCACCTGCAACCCAGTGAGATGTGA；
AACGTGGAAGCAAGAGATGCAGAAAAATCACTGCCAGCCGTTTTCCCTGTGGCCGTGACTTGCTGGGTTGCTGCCCTTGTCACCAAAAAA；
TGCCAGCCGTTTTCCCTGTGGCCGTGACTTGCTGGGTTGCTGCCCTTGTCACCAAAAAACCATAACCCTAATTCTAAGCAGTCTGCATTT；
TCTTGATAATGCTGTCCATTTACCCTTTCTCCTCCTCTCAGACAGAGATTTTTCAGTGCGGTCTAAAGTCTTTCACCATTAAGTCAGATG；
ATTTTTCAGTGCGGTCTAAAGTCTTTCACCATTAAGTCAGATGCCTCAGGCTTGATTTCTGGGCTTGACAGTTAACATCTCACCCTTCAT；
AAATCCTGCGTGCCCTGAAGGCCCTGCAGCGCCCCAGTGCCAGGACCTGGCGCCAGGTGTTTCTGTTGGTGATGCCGTTTGTTTGTTATT；
PRPF31基因(SEQ ID NO.7-12)：
GCTGAGCCTAGGAAGCAAGATAGGAGATGACAAGGGTGCCCAGATCATCAACTTCTGAAGAATTTCTCATCCCTGCACCCCAGAGCCTCT；
ATAGGGAGGGCTTAATCATTTGCTTGCCTGCCTTATCAGTGTTACGAAGGCATTTTCCACCTTCCACTTCCTTTTCCGTTTGGACAAAAA；
ATACATAAGACAGTTCCAGGGAAGGGGAGTAGCTTGCTCAGAACAGGGAAGCTGCCCAGGAGTCTTTCCCCTGATTCTCAGACCACGATC；
AACAGGGAAGCTGCCCAGGAGTCTTTCCCCTGATTCTCAGACCACGATCCCGTGCTCAGCTCCTCGCGGATTCAAGGCTGATGAAGGCAA；
TAACAAGTGTTGGCCTCCCACAGGTACATGTCAGCATCTCCTTCCTTTCAGAGGCTGAATGCTTGTCCATTTATGTAGATCCCACACTTT；
AGAATTTGGACAGAGTACAGCAAGGGTGGTTTTATCTGCAGCCTCAGCTGCAAAGACTGGAATGGAGGGTGCCGGAATTATCTGGAAGAT.
优选地，所述探针游离于溶液。
任选地，所述探针结合于固相基质上，形成芯片。
第二方面，本发明提供了一种用于检测疾病相关基因变异的试剂盒，包括第一方面所述的探针集。
优选地，所述疾病为α/β地中海贫血、镰刀型贫血、枫糖尿病、先天性肾上腺皮质增生症、氧化磷酸化偶联障碍1、肝豆状核变性、糖原积累病II型、粘多糖II型、肌营养不良、脊髓小脑性共济失调、多囊肾、Alport综合征、黑蒙病、Usher综合征II型、血友病、嗜血细胞综合征、苯丙酮尿症、睾丸女性化综合征、半乳糖血症、囊性纤维变性、脊髓型肌萎缩症、Huntington舞蹈病、囊性肉芽肿、视网膜色素变性、遗传性耳聋、多发性神经纤维瘤、乳腺癌、多发性内分泌腺瘤病、Marfan综合征、脆性X综合征、Von Hippel-Lindau综合征、成骨发育不全症、结节性硬化症、RETT综合征或HLA配型的至少一种。
优选地，所述疾病相关的基因为：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA基因的至少一种。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的探针集和/或第二方面所述的试剂盒在制备疾病相关基因变异诊断试剂中的用途。
根据本发明，所述疾病选自但不限于α/β地中海贫血、镰刀型贫血、枫糖尿病、先天性肾上腺皮质增生症、氧化磷酸化偶联障碍1、肝豆状核变性、糖原积累病II型、粘多糖II型、肌营养不良(包括Becker型和Duch型)、脊髓小脑性共济失调、多囊肾、Alport综合征、黑蒙病、Usher综合征II型(眼科)、血友病、嗜血细胞综合征、苯丙酮尿症、睾丸女性化综合征、半乳糖血症、囊性纤维变性、脊髓型肌萎缩症、Huntington舞蹈病、囊性肉芽肿、视网膜色素变性、遗传性耳聋、多发性神经纤维瘤、乳腺癌、多发性内分泌腺瘤病、Marfan综合征、脆性X综合征、Von Hippel-Lindau综合征、成骨发育不全症、结节性硬化症、RETT综合征或HLA配型中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述疾病的相关基因为：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA基因中的至少一种。
第四方面，本发明提供一种构建高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)基因组DNA打断修复，获得DNA片段；
(2)接头连接，加入标签接头，获得连接产物；
(3)第一轮PCR扩增；
(4)杂交洗脱，利用第一方面所述的探针集和/或第二方面所述的试剂盒对步骤(3)的扩增产物进行筛选；
(5)第二轮PCR扩增；
(6)环化，制备得到所述文库。
本发明中，所述打断修复和接头连接的步骤都是采用的本领域的常规方法，本领域技术人员可以根据需要调节打断修复和接头连接的步骤和试剂，从而实现打断修复和接头连接，在此不作特殊限定。
本发明中，通过在连接反应中加入标签接头，每个样本单独一个接头，可以对多个样品混合后杂交，进行并行上机测序，在保证快速准确及高分辨率的基础上，能够大大的降低检测成本。
本发明中，第一轮PCR扩增采用的引物可以根据加入的标签接头位点进行设计。
本发明中，所述杂交洗脱具体为将不同标签接头标记的样本进行等量混合，浓缩蒸干后，加入block混合液溶解，解链、孵育，配制杂交缓冲液和探针缓冲液，分别孵育后，将样本管、杂交缓冲液和探针缓冲液混匀，杂交；其中，解链、孵育和杂交的条件本领域技术人员可以根据不同的样本和探针进行选择和调整，只要能够实现最后的杂交都是可行的，在此不作特殊限定。
根据本发明，步骤(6)所述环化的孵育条件为90-98℃孵育3-8min，优选为93-96℃孵育4-6min，所述环化的温度例如可以是90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃，所述环化的时间例如可以是3min、4min、5min、6min、7min或8min。
本发明中，第二轮PCR扩增采用的引物根据加入的标签接头位点进行设计。
根据本发明，步骤(1)之前还包括获取基因组DNA的步骤，所述获取基因组DNA的步骤为DNA直接提取和多重置换扩增的方式获得。
根据本发明，所述基因组DNA来源于哺乳动物，更优选所述哺乳动物为人和/或小鼠，进一步优选为人。
根据本发明，所述基因组DNA通过外周血、胚胎、组织或尿液中的任意一种或至少两种的组合中获得，优选为外周血和胚胎。
根据本发明，所述外周血的基因组DNA采用直接提取得到，所述DNA直接提取可以采用试剂盒提取，如QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Cat No./ID:51106)，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不作特殊限定。
本发明中，所述胚胎的获得包括胚胎D3卵裂球和/或D5囊胚外滋养层细胞采集，具体步骤如下：在受精卵发育至第三天卵裂球期，透明带打孔活检出1个胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中；或在受精卵发育至第五天囊胚期，在显微操作仪下采用激光打孔的方法活检1个胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中，短暂离心；保存有细胞的PCR管可以直接进行细胞全基因组扩增，建议使用REPLI-g Single Cell Kit(Cat No./ID:150345)，也可以将PCR管直立保存在-80℃，禁止上下颠倒。
根据本发明，所述胚胎的基因组DNA采用全基因组扩增得到，所述全基因组扩增方法包括裂解细胞和扩增，所述裂解细胞能够实现细胞裂解释放DNA的方法都可行，可以通过加入细胞裂解缓冲液使细胞裂解；所述扩增通过加入扩增缓冲液和扩增酶混合液，实现扩增。
根据本发明，步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)和步骤(6)之后还包括纯化的步骤，优选为磁珠纯化。
第五方面，本发明提供一种确定目标区域单核苷酸突变和单体型的方法，包括如下步骤：
(1’)根据第四方面所述的方法，构建待测样本及其家系成员样本的高通量测序文库，所述高通量测序文库包含目标区域的核酸序列；
(2’)对步骤(1’)的高通量测序文库进行测序，获得待测样本及其家系成员的测序结果；
(3’)基于所述测序结果进行数据比对，确定待测样本目标区域的单核苷酸突变和单体型。
本发明中，通过对构建的文库进行测序分析，联合家系成员样本的家系连锁分析，可以避免胚胎因扩增引入ADO而检测有误，保证了检测的精准性，减少假阴性概率。
根据本发明，所述待测样本为胚胎。
优选地，所述家系成员包括胚胎的父母双方和家系遗传病先证者，所述家系成员还包括胚胎的父母双方的父母和/或胚胎的父母双方的兄弟姐妹，所述家系成员还可以包括其他亲戚，所述其他亲戚为胚胎父母三代直系亲属。
根据本发明，所述测序采用高通量测序技术，优选BGISEQ-500二代高通量测序技术，本发明中，对高通量测序技术不作限定，适用于BGIseq系列中的建库方法、测序平台以及测序方法都是可行的。
根据本发明，步骤(2’)之后还包括测序数据过滤的步骤，优选根据测序结果中的序列的碱基平均质量值和所含的N碱基数量占比进行过滤。
根据本发明，所述数据比对包括：将测序结果与参考基因组序列进行比对，用于确定待测样本单核苷酸突变，具体方法如下：用公开软件picard-tools(http://broadinstitute.github.io/picard/)对过滤后的BAM文件进行排序及重复序列标注，根据性染色体X Y上的测序深度判断待检样本性别；基于公开软件GATK(https://software.broadinstitute.org/gatk/best-practices/)对的目标区域进行SNVs检测；基于公开软件ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对SNVs(单核苷酸突变)结果进行注释。
根据本发明，所述参考基因组为所述待测样本来源物种的参考基因组序列，优选人类参考基因组，进一步优选为hg19。
根据本发明，进一步将单核苷酸突变与家系成员样本进行比对，得出所述待测样本单体型。
优选地，当待测样本来源的家系存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本纯合母本杂合SNP突变位点以及母本纯合父本杂合的SNP突变位点作为第一有效SNP位点，并统计其数目；
基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据先证者所患疾病的遗传关系和所述先证者的单体型，确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态。
本发明中，所述待检基因区为根据目标区域，以及待测样本家系所患疾病确定的相关基因区域。
优选地，基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本纯合母本杂合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本纯合母本杂合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与母本一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型M1的SNP位点支持总数MA1和先证者为单体型M2的SNP位点支持总数MA2；
将待测胚胎样本携带的与母本一致的碱基算为支持胚胎单体型EM1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EM2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EM1的SNP位点支持总数EMA1和胚胎为单体型EM2的SNP位点支持总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/MA1，HM2＝EMA2/MA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型；
针对父本杂合母本纯合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本杂合母本纯合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与父本一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型F1的SNP位点支持总数FA1和先证者为单体型F2的SNP位点支持总数FA2；
将待检胚胎携带的与父本一致的碱基算为支持胚胎单体型EF1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EF2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EF1的SNP位点支持总数EFA1和胚胎为单体型EF2的SNP位点支持总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/FA1；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型。
优选地，当待测样本来源的家系不存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的SNP突变位点，以及母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的SNP突变位点作为第二有效SNP位点，并统计其数目；
基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据所述家系的疾病的遗传关系确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态。
优选地，基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的第二有效SNP位点，将父本杂合位点中与祖父或祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，并且：
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF1；
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF2；
统计待检基因区域内支持单体型F1的第二有效SNP位点的总数HFA1，支持单体型F2的第二有效SNP位点的总数HFA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EF1的总数EFA1，支持胚胎单体型EF2的总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/HFA1，HF2＝EFA2/HFA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
针对母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的第二有效SNP位点，将母本杂合位点中与外祖父或外祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，并且：
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM1；
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM2；
统计待检基因区域内支持单体型M1的第二有效SNP位点的总数HMA1，支持单体型M2的第二有效SNP位点的总数HMA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EM1的总数EMA1，支持胚胎单体型EM2的总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/HMA1，HM2＝EMA2/HMA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型。
第六方面，本发明提供一种构建高通量测序文库的装置，包括：
打断修复单元，所述打断修复单元用于基因组DNA打断修复，获得DNA片段；
接头连接单元，所述接头连接单元与打断修复单元连接，用于接头连接，加入标签接头，获得连接产物；
第一扩增单元，所述第一扩增单元用于第一轮PCR扩增；
杂交洗脱单元，所述杂交洗脱单元设置有利用第一方面所述的探针和/或第二方面所述的试剂盒，用于利用所述液相和/或所述试剂盒探针对步骤(3)的扩增产物进行筛选；
第二扩增单元，所述第二扩增单元与所述杂交洗脱单元连接，用于第二轮PCR扩增；
环化单元，用于制备得到所述文库。
本发明中，所述打断修复单元和接头连接单元都是采用的本领域的常规方法，本领域技术人员可以根据需要调节打断修复单元和接头连接单元的条件和试剂，从而实现打断修复和接头连接，在此不作特殊限定。
本发明中，通过在连接反应单元中加入标签接头，每个样本单独一个接头，可以对多个样品混合后杂交，进行并行上机测序，在保证快速准确及高分辨率的基础上，能够大大的降低检测成本。
本发明中，第一轮扩增单元采用的引物根据加入的标签接头位点进行设计。
本发明中，所述杂交洗脱单元具体为将不同标签接头标记的样本进行等量混合，浓缩蒸干后，加入block混合液溶解，解链、孵育，配制杂交缓冲液和探针缓冲液，分别孵育后，将样本管、杂交缓冲液和探针缓冲液混匀，杂交；其中，解链、孵育和杂交的条件本领域技术人员可以根据不同的样本和探针进行选择和调整，只要能够实现最后的杂交都是可行的，在此不作特殊限定。
根据本发明，所述环化的孵育条件为90-98℃孵育3-8min，优选为93-96℃孵育4-6min，所述环化的温度例如可以是90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃，所述环化的时间例如可以是3min、4min、5min、6min、7min或8min。
本发明中，第二轮扩增单元采用的引物根据加入的标签接头位点进行设计。
根据本发明，步骤(1)之前还包括获取基因组DNA的单元，所述获取基因组DNA的单元与所述打断修复单元连接，用于从样本中获取基因组DNA，所述获取基因组DNA的单元为DNA直接提取和多重置换扩增的方式获得。
根据本发明，所述基因组DNA来源于哺乳动物，更优选所述哺乳动物为人和/或小鼠，进一步优选为人。
根据本发明，所述基因组DNA通过外周血、胚胎、组织或尿液中的任意一种或至少两种的组合中获得，优选为外周血和胚胎。
根据本发明，所述外周血的基因组DNA采用直接提取得到，所述DNA直接提取可以采用试剂盒提取，如QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Cat No./ID:51106)，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不作特殊限定。
本发明中，所述胚胎的获得包括胚胎D3卵裂球和/或D5囊胚外滋养层细胞采集，具体步骤如下：在受精卵发育至第三天卵裂球期，透明带打孔活检出1个胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中；或在受精卵发育至第五天囊胚期，在显微操作仪下采用激光打孔的方法活检1个胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中，短暂离心；保存有细胞的PCR管可以直接进行细胞全基因组扩增，建议使用REPLI-g Single Cell Kit(Cat No./ID:150345)，也可以将PCR管直立保存在-80℃，禁止上下颠倒。
根据本发明，所述外周血的基因组DNA采用直接提取得到，所述DNA直接提取可以采用试剂盒提取，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不作特殊限定。
根据本发明，所述胚胎的基因组DNA采用全基因组扩增得到，所述全基因组扩增方法包括裂解细胞和扩增，所述裂解细胞能够实现细胞裂解释放DNA的方法都可行，可以通过加入细胞裂解缓冲液使细胞裂解；所述扩增通过加入扩增缓冲液和扩增酶混合液，实现扩增。
根据本发明，步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)和步骤(6)之后还包括纯化单元，优选为磁珠纯化单元。
第七方面，本发明提供一种确定目标区域单核苷酸突变和单体型的系统，包括：
文库构建装置，所述文库构建装置为根据第六方面所述的装置，构建待测样本及其家系成员样本的高通量测序文库，所述高通量测序文库包含目标区域核酸序列；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对文库构建装置构建的高通量测序文库进行测序，获得待测样本及其家系成员的测序结果；
分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果进行数据比对，确定待测样本目标区域的单核苷酸突变和单体型。
本发明中，通过含有构建的文库装置的分析系统，联合家系成员样本的家系连锁分析，可以避免胚胎因扩增引入ADO而检测有误，保证了检测的精准性，减少假阴性概率。
根据本发明，所述待测样本为胚胎。
优选地，所述家系成员包括胚胎的父母双方和家系遗传病先证者，所述家系成员还包括胚胎的父母双方的父母和/或胚胎的父母双方的兄弟姐妹，所述家系成员还可以包括其他亲戚，所述其他亲戚为胚胎父母三代直系亲属。
根据本发明，所述测序装置采用高通量测序平台，优选BGISEQ-500二代高通量测序平台，本发明中，对高通量测序技术不作限定，适用于BGIseq系列中的建库方法、测序平台以及测序方法都是可行的。
根据本发明，步骤(2’)之后还包括测序数据过滤的装置，用于将所述测序数据根据测序结果中序列的碱基平均质量值和所含的N碱基数量占比进行过滤。
根据本发明，所述数据比对具体包括：将测序结果与参考基因组序列进行比对，用于确定待测样本单核苷酸突变，具体方法如下：用公开软件picard-tools(http://broadinstitute.github.io/picard/)对过滤后的BAM文件进行排序及重复序列标注，根据性染色体X Y上的测序深度判断待检样本性别；基于公开软件GATK(https://software.broadinstitute.org/gatk/best-practices/)对的目标区域进行SNVs检测；基于公开软件ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对SNVs(单核苷酸突变)结果进行注释。
根据本发明，所述参考基因组为所述待测样本来源物种的参考基因组序列，优选人类参考基因组，进一步优选为hg19。
根据本发明，进一步将单核苷酸突变与家系成员样本进行比对，得出所述待测样本单体型，所述待测样本的分析结果如下：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本纯合母本杂合SNP突变位点以及母本纯合父本杂合的SNP突变位点作为第一有效SNP位点，并统计其数目；
基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据先证者所患疾病的遗传关系和所述先证者的单体型，确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
其中，基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本纯合母本杂合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本纯合母本杂合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与母本一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型M1的SNP位点支持总数MA1和先证者为单体型M2的SNP位点支持总数MA2；
将待测胚胎样本携带的与母本一致的碱基算为支持胚胎单体型EM1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EM2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EM1的SNP位点支持总数EMA1和胚胎为单体型EM2的SNP位点支持总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/MA1，HM2＝EMA2/MA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型；
针对父本杂合母本纯合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本杂合母本纯合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与父本一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型F1的SNP位点支持总数FA1和先证者为单体型F2的SNP位点支持总数FA2；
将待检胚胎携带的与父本一致的碱基算为支持胚胎单体型EF1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EF2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EF1的SNP位点支持总数EFA1和胚胎为单体型EF2的SNP位点支持总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/FA1，HF2＝EFA2/FA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
当待测样本来源的家系不存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的SNP突变位点，以及母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的SNP突变位点作为第二有效SNP位点，并统计其数目；
基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据所述家系的疾病的遗传关系确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
其中，基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的第二有效SNP位点，将父本杂合位点中与祖父或祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，并且：当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF1；
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF2；
统计待检基因区域内支持单体型F1的第二有效SNP位点的总数HFA1，支持单体型F2的第二有效SNP位点的总数HFA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EF1的总数EFA1，支持胚胎单体型EF2的总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/HFA1，HF2＝EFA2/HFA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
针对母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的第二有效SNP位点，将母本杂合位点中与外祖父或外祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，并且：当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM1；
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM2；
统计待检基因区域内支持单体型M1的第二有效SNP位点的总数HMA1，支持单体型M2的第二有效SNP位点的总数HMA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EM1的总数EMA1，支持胚胎单体型EM2的总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/HMA1，HM2＝EMA2/HMA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明可以实现胚胎单细胞或少量细胞的全基因组扩增及检测，在胚胎活检时间上可进行灵活选择；不仅如此，本发明能够同时检测多个样本，大大降低了检测成本，且本发明通过家系连锁分析方法，避免胚胎因扩增引入ADO而检测有误，保准检测的精准性，减少假阴性概率；
(2)本发明可以同时检测多种单基因遗传病或遗传性肿瘤的基因情况，捕获特异性好、灵敏度高、覆盖率广，能够有效实现34种PGD的检测。
附图说明
图1为SNP array简单原理示意图；
图2为本发明的构建高通量测序文库的装置的结构示意图；
图3为本发明的确定目标区域单核苷酸突变和单体型的系统的结构示意图；
图4为本发明单体型判断流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
实施例1探针集的制备
本实施例提供一组探针集，所述探针集根据以下目的基因进行设计，所述目的基因包括：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2和HLA；
所述探针集中的每个探针根据下列探针设计原则获得：
(1)所述探针的长度为90nt；
(2)探针设计时，间隔1bp窗口滑动；
(3)去除含有未知碱基序列的探针；
(4)当多个探针之间属于重复序列的比例为100％时，去除所述多个探针；
(5)保证每个目标区域的探针覆盖度均为2X；
(6)特异性识别GC含量高于0.6区域，重复设计探针2次；
由于设计得到的探针集数目庞大，在此，对所述探针集针对部分目的基因的部分探针进行列举，具体列举的探针是针对TSC1基因和PRPF31基因进行设计的部分探针，具体如下所示：
TSC1基因(SEQ ID NO.1-6)：
GAGATGGGAAATGCACTGGCTGACCTTGACCTCGGTCTTTCCCTTTCCTGGACACGACACCATCCCCACCTGCAACCCAGTGAGATGTGA；
AACGTGGAAGCAAGAGATGCAGAAAAATCACTGCCAGCCGTTTTCCCTGTGGCCGTGACTTGCTGGGTTGCTGCCCTTGTCACCAAAAAA；
TGCCAGCCGTTTTCCCTGTGGCCGTGACTTGCTGGGTTGCTGCCCTTGTCACCAAAAAACCATAACCCTAATTCTAAGCAGTCTGCATTT；
TCTTGATAATGCTGTCCATTTACCCTTTCTCCTCCTCTCAGACAGAGATTTTTCAGTGCGGTCTAAAGTCTTTCACCATTAAGTCAGATG；
ATTTTTCAGTGCGGTCTAAAGTCTTTCACCATTAAGTCAGATGCCTCAGGCTTGATTTCTGGGCTTGACAGTTAACATCTCACCCTTCAT；
AAATCCTGCGTGCCCTGAAGGCCCTGCAGCGCCCCAGTGCCAGGACCTGGCGCCAGGTGTTTCTGTTGGTGATGCCGTTTGTTTGTTATT；
PRPF31基因(SEQ ID NO.7-12)：
GCTGAGCCTAGGAAGCAAGATAGGAGATGACAAGGGTGCCCAGATCATCAACTTCTGAAGAATTTCTCATCCCTGCACCCCAGAGCCTCT；
ATAGGGAGGGCTTAATCATTTGCTTGCCTGCCTTATCAGTGTTACGAAGGCATTTTCCACCTTCCACTTCCTTTTCCGTTTGGACAAAAA；
ATACATAAGACAGTTCCAGGGAAGGGGAGTAGCTTGCTCAGAACAGGGAAGCTGCCCAGGAGTCTTTCCCCTGATTCTCAGACCACGATC；
AACAGGGAAGCTGCCCAGGAGTCTTTCCCCTGATTCTCAGACCACGATCCCGTGCTCAGCTCCTCGCGGATTCAAGGCTGATGAAGGCAA；
TAACAAGTGTTGGCCTCCCACAGGTACATGTCAGCATCTCCTTCCTTTCAGAGGCTGAATGCTTGTCCATTTATGTAGATCCCACACTTT；
AGAATTTGGACAGAGTACAGCAAGGGTGGTTTTATCTGCAGCCTCAGCTGCAAAGACTGGAATGGAGGGTGCCGGAATTATCTGGAAGAT.
实施例2系统的组成
(1)进一步，发明人还提供了采用实施例1中的探针集构建高通量测序文库的装置，具体装置结构如图2所示，所述装置包括打断修复单元、接头连接单元、第一扩增单元、杂交洗脱单元、第二扩增单元和环化单元，具体如下：
获取基因组DNA的单元，所述获取基因组DNA的单元与所述打断修复单元连接，用于从样本中获取基因组DNA；
打断修复单元，所述打断修复单元与获取基因组DNA单元连接，用于基因组DNA打断修复，获得DNA片段；
接头连接单元，所述接头连接单元与打断修复单元连接，用于接头连接，加入标签接头，获得连接产物；
纯化单元，所述纯化单元与所述接头连接单元连接，用于纯化连接产物；
第一扩增单元，所述第一扩增单元与纯化单元连接，用于第一轮PCR扩增；
纯化单元，所述纯化单元与所述第一扩增单元连接，用于纯化第一轮PCR扩增产物；
杂交洗脱单元，所述杂交洗脱单元与纯化单元连接，并设置有所述探针，用于利用所述探针对步骤(3)的扩增产物进行筛选；
第二扩增单元，所述第二扩增单元与所述杂交洗脱单元连接，用于第二轮PCR扩增；
纯化单元，所述纯化单元与所述第二扩增单元连接，用于纯化第二轮PCR扩增产物；
环化单元，用于制备得到所述文库。
纯化单元，所述纯化单元与所述环化单元连接，用于纯化第一轮PCR扩增产物；
(2)进一步，为了实现样本目标区域的单核苷酸突变和单体型的检测，发明人还提供了一种确定目标区域单核苷酸突变和单体型的系统，具体系统如图3所示，所述系统包括文库构建装置1000、测序装置2000和分析装置3000，具体如下：
文库构建装置，所述文库构建装置为步骤(1)中的构建高通量测序文库的装置，构建待测样本及其家系成员样本的高通量测序文库，所述高通量测序文库包含目标区域核酸序列；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对文库构建装置构建的高通量测序文库进行测序，获得待测样本及其家系成员的测序结果；
数据过滤装置，所述数据过滤装置与所述测序装置连接，用于将所述测序数据根据测序结果中序列的碱基平均质量值和所含的N碱基数量占比进行过滤；
分析装置，所述分析装置与所述数据过滤装置相连，用于基于所述测序结果进行数据比对，确定待测样本目标区域的单核苷酸突变和单体型。
通过所述系统，联合家系成员样本的家系连锁分析，可以避免胚胎因扩增引入ADO而检测有误，保证了检测的精准性，减少假阴性概率。
实施例3α地中海贫血疾病样本采集及分析
1)样本采集
本实施例家系为α地中海贫血疾病家系，常染色体隐性遗传疾病，具体采集样本的步骤如下：
(1)胚胎D3卵裂球或D5囊胚外滋养层细胞采集并进行多重置换扩增：
采集：在受精卵发育至第三天卵裂球期，透明带打孔活检出1个胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中；或在受精卵发育至第五天囊胚期，在显微操作仪下采用激光打孔的方法活检一小片胚胎细胞，洗涤后置于装有4μL细胞保存液的PCR管中，短暂离心；保存有细胞的PCR管可以直接进行细胞全基因组扩增，也可以将PCR管直立保存在-80℃，禁止上下颠倒；
细胞裂解：向已经收集到细胞的PCR管中加入由细胞裂解缓冲液混合液，在65℃下反应10min，使细胞裂解，并释放出其中的DNA；
扩增：向细胞裂解的反应液中加入由扩增缓冲液和扩增酶配制的混合液，在30℃下反应2-8h，65℃3min，将得到的DNA进行样本浓度的测定，反应完成后的扩增产物可直接用于下游分析或置于-20℃冰箱保存；
(2)家系成员外周血采集并提取DNA：
抽取家系成员静脉血5-10mL，家系成员包括夫妻双方、丈夫父亲、妻子父亲，使用QIAamp DNABloodMini试剂盒，按试剂盒说明书进行血液DNA提取及纯化，将得到的DNA进行样本浓度的测定，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测样本纯度，检测完成后产物可直接用于下游分析或置于-20℃冰箱保存；
具体由合作医院对家系成员抽取外周血进行突变信息的检测、提取淋巴细胞DNA，并对家系中夫妻体外受精形成的胚胎进行活检，且在活检后进行胚胎细胞全基因组扩增，家系成员淋巴细胞DNA产物及胚胎全基因组扩增产物送至本实验室进行后续操作，家系信息见如下表1所示：
表1
| 样本名 | 性别 | 家系成员突变信息 |
| 妻子(Mother) | F | 携带，αα/-SEA |
| 丈夫(Father) | M | 携带，αα/-THAI |
| 妻父(Maternal) | M | 正常 |
| 夫父(Paternal) | M | 携带，αα/-THAI |
| 胚胎1(Embryo1) | -- | -- |
| 胚胎2(Embryo2) | -- | -- |
| 胚胎3(Embryo3) | -- | -- |
| 胚胎4(Embryo4) | -- | -- |
| 胚胎5(Embryo5) | -- | -- |
2)样本建库
采用实施例2的装置构建文库，具体步骤如下：
(1)DNA打断修复：对WGA产物进行定量，取一定量的WGA产物，向其中加入由DNA打断修复酶和DNA打断修复缓冲液组成的混合液，在37℃下反应30min，65℃下反应15min；
(2)接头连接：建议使用MGICare胚胎植入前单基因遗传病检测试剂盒(深圳华大智造科技有限公司，货号：940-200045-00)进行接头连接、PCR、杂交洗脱及环化相关反应，向步骤(1)中的反应产物中加入由试剂盒中末端修复缓冲液和末端修复酶配制的混合液，然后向其中加入标签接头1-16(每个样本单独一个接头)，在23℃下反应30min，使用磁珠纯化连接反应产物；
(3)向步骤(2)反应纯化后的DNA中，加入由PCR反应液和PCR引物配制的混合液，在98℃下反应2min，然后在98℃15s，56℃15s，72℃30s下循环8个cycles，在72℃下延伸5min，4℃保持；扩增完成后，使用0.6×+0.4×磁珠进行两步法片段选择纯化，并测定纯化后样本的浓度；
其中PCR引物具体为：
F(SEQ ID NO.13)：/5Phos/GAACGACATGGCTACGA；
R(SEQ ID NO.14)：TGTGAGCCAAGGAGTTG.
(4)杂交洗脱：将不同标签接头标记的样本进行等量混合，混合后总量为1μg，将产物浓缩蒸干后，加入block混合液进行再溶解，标识为样本管；在其他PCR管内配制杂交缓冲液混合液，由-80℃中取出实施例1中探针集并配制探针混合液，使用PCR仪将样本管进行95℃5min解链并65℃保持，杂交缓冲液混合液在65℃孵育至少5min，探针混合液在65℃孵育至少2min后迅速将三种混合液转移至一管并吹打混匀，保持65℃24h进行杂交；
杂交完成后，将M-280Streptavidin磁珠与连接缓冲液进行洗脱并重悬，取出杂交反应液与M-280Streptavidin磁珠混合后，室温旋转孵育30min，使用洗脱缓冲液1洗脱并室温孵育15min，洗脱缓冲液2洗脱，65℃孵育10min并重复3次，用无酶水重悬磁珠。
(5)后PCR扩增：向步骤(4)反应重悬后的磁珠中，加入由PCR反应液和PCR引物配制的混合液，在98℃下反应2min，然后在98℃15s，56℃15s，72℃30s下循环14个cycles，在72℃下延伸5min，4℃保持；扩增完成后，使用磁珠进行纯化，并测定纯化后样本的浓度；
(6)环化：取出168ng产物，95℃孵育5min，结束后立即转移冰浴，加入由环化反应缓冲液和环化反应酶配制的混合液，37℃孵育30min；配制消化反应缓冲液与消化酶混合液加入环化后产物中，37℃孵育30min，反应结束后加入0.5M EDTA终止反应，加入磁珠进行纯化，纯化完成后将单链DNA产物进行定量。
3)测序分析
采用实施例2的系统对实施例3的文库进行分析，具体的分析流程如图2所示，采用BGIseq-500测序平台进行上机测序，测序循环数为PE100+10，将测序得到的结果进行数据分析，具体如下：
(1)数据过滤及比对：
采用的数据过滤参数为：a.过滤掉整条序列质量值小于20的；b.过滤整条序列N碱基数超过5个的；用BWA(Version:0.7.15)软件将所有家系样本比对到hg19上，并统计结果如下表2所示：
表2
(2)检测目标区域单核苷酸突变及单体型判断
对BAM文件中插入序列大于1000bp的进行过滤，用picard-tools(Version:1.95)对BAM文件进行排序及重复序列标注，用GATK(Version:3.7)检测目标区域的SNVs，用ANNOVAR对SNVs进行注释。
依据判断规则：
(1)当待测样本来源的家系存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本纯合母本杂合SNP突变位点以及母本纯合父本杂合的SNP突变位点作为第一有效SNP位点，并统计其数目；
基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据先证者所患疾病的遗传关系和所述先证者的单体型，确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
其中，基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
(i)针对父本纯合母本杂合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本纯合母本杂合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与母本一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型M1的SNP位点支持总数MA1和先证者为单体型M2的SNP位点支持总数MA2；
将待测胚胎样本携带的与母本一致的碱基算为支持胚胎单体型EM1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EM2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EM1的SNP位点支持总数EMA1和胚胎为单体型EM2的SNP位点支持总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/MA1，HM2＝EMA2/MA；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型；
(ii)针对父本杂合母本纯合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本杂合母本纯合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与父本一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型F1的SNP位点支持总数FA1和先证者为单体型F2的SNP位点支持总数FA2；
将待检胚胎携带的与父本一致的碱基算为支持胚胎单体型EF1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EF2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EF1的SNP位点支持总数EFA1和胚胎为单体型EF2的SNP位点支持总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/FA1，HF2＝EFA2/FA2，当同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；当同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
(2)当待测样本来源的家系不存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的SNP突变位点，以及母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的SNP突变位点作为第二有效SNP位点，并统计其数目；
基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据所述家系的疾病的遗传关系确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
其中，基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
(i)针对父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的第二有效SNP位点，将父本杂合位点中与祖父或祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，并且：当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF1；
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF2；
统计待检基因区域内支持单体型F1的第二有效SNP位点的总数HFA1，支持单体型F2的第二有效SNP位点的总数HFA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EF1的总数EFA1，支持胚胎单体型EF2的总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/HFA1，HF2＝EFA2/HFA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
(ii)针对母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的第二有效SNP位点，将母本杂合位点中与外祖父或外祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，并且：当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM1；
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM2；
统计待检基因区域内支持单体型M1的第二有效SNP位点的总数HMA1，支持单体型M2的第二有效SNP位点的总数HMA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EM1的总数EMA1，支持胚胎单体型EM2的总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/HMA1，HM2＝EMA2/HMA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型。
结果如下表3所示：
表3
从表3总结了整个致病基因HBA在相应单体型上的SNVs分布情况，也可将待检的致病基因人工划分为不同区间分别进行单体型进行判断，其中，F1、F2是来自父亲的两个单体型，M1、M2是来自母亲的两个单体型，F1-L、F1-M、F1-U分别代表基因下游、内部、上游中F1单体型SNP支持数。同理，F2-L、F2-M、F2-U，M1-L、M1-M、M1-U，M2-L、M2-M、M2-U分别代表其他3个单体型在基因不同区域的SNP支持数。
根据家系遗传关系可知，丈夫从夫父遗传了致病单体型，从夫母遗传了非致病单体型；妻子从妻夫遗传了非致病单体型，从妻母遗传了致病单体型。依据判断规则：根据家系SNVs检测结果，挑选出父亲纯合母亲杂合或者母亲杂合父亲杂合的点做为有效SNVs点，并统计其数目；根据先证者和待检胚胎在有效SNVs点的类型，判断待检胚胎是否携带致病单体型；进行有效位点总结及单体型判断，进行家系间的单体型判断。
由此可知，F2为丈夫和夫父共有的携带致病突变的单体型，F1为丈夫和夫母共有的携带非致病突变的单体型；M1为妻子和妻母共有的携带致病突变的单体型，M2为妻子和妻母共有的携带非致病突变的单体型，以此单体型关系结合表3中胚胎的单体型结果进行胚胎患病状态评估，具体结果如下：
关于单体型判断规则，本实施例中依据待检样本与总的有效SNV数的比值大小进行单体型判断，具体的来自父亲或母亲的两条单体型上的SNV数除以与相应区间的有效SNV数，若F1的比值大于0.2且F2的比值小于0.05，则判断样本继承F1；反之，若F2的比值大于0.2且F1的比值小于0.05，则判断样本继承F2，对来自母亲的单体型也采用此策略和阈值进行判断。比如Embryo1中F1_U/F1_U的有效SNV数比值为(61/76＝0.80)与F2_U/F2_U的有效SNV数(3/129＝0.02)，可知样本继承F1，对于其他区段，也采用相同方法进行判读，不满足条件的则相应区间的单体型无法分出。也可直接比较样本中两种单体型的有效SNV数做为验证，比如Embryo1中F1的SNVs数(68)要远远大于F2的SNVs数(5)，则可判断样本的单体型为F1。
实施例4血友病样本采集及分析
1)样本采集：
血友病为X染色体隐性遗传疾病，妻子为携带者，妻母正常，丈夫正常，胚胎情需结合胚胎型别及母源单体型进行分析。具体采集的步骤同实施例3，家系信息见如下表4所示：
表4
| 样本名 | 性别 | 家系成员突变信息 |
| 妻子(Mother) | F | 携带，F8基因22号内含子倒位 |
| 丈夫(Father) | M | 正常 |
| 妻母(Maternal) | F | 正常 |
| 胚胎1(Embryo1) | -- | -- |
| 胚胎2(Embryo2) | -- | -- |
| 胚胎3(Embryo3) | -- | -- |
| 胚胎4(Embryo4) | -- | -- |
| 胚胎5(Embryo5) | -- | -- |
2)样本建库
具体的建库方法和实验条件同实施例3。
3)测序分析
具体的分析方法同实施例3，统计结果如下表5所示：
表5
同实施例3，由于血友病为X染色体隐性遗传疾病，且家系中妻子为携带者，丈夫正常，所以在本家系中无需分析父源单体型，只需根据胚胎型别及母源单体型遗传情况判断患病情况。但由于本家系中5个胚胎的覆盖度偏低，其中3个胚胎捕获区域中大于10X reads覆盖度均低于建议范围60％，剩余2个胚胎覆盖也均不超过70％，可见胚胎的全基因组扩增效果较差或细胞状态不佳，区域的SNP数较少，经人工筛选分析，其在疾病判断上检测目标区域单核苷酸突变及单体型判断如表6：
表6
以此类推，本家系在胚胎扩增状态不合格的情况下，此方法也可在疾病符合孟德尔遗传规律时鉴定疾病分型，同理，也可鉴定芯片中其他致病基因，推断致病单体型，即可推断出胚胎的患病状态。
实施例5枫糖尿病样本采集及分析
1)样本采集：
枫糖尿病为常染色体隐形遗传疾病，妻子和丈夫均为携带者，育有一患病子女。具体采集的步骤同实施例3，家系信息见如下表7所示：
表7
| 样本名 | 性别 | 家系成员突变信息 |
| 妻子(Mother) | F | BCKDHA基因c.392A>G携带 |
| 丈夫(Father) | M | BCKDHA基因EX 2-4DUP携带 |
| 子女-先证者(Proband) | F | 患病，c.392A>G复合EX 2-4DUP突变 |
| 胚胎1(Embryo1) | -- | -- |
| 胚胎2(Embryo2) | -- | -- |
| 胚胎3(Embryo3) | -- | -- |
| 胚胎4(Embryo4) | -- | -- |
| 胚胎5(Embryo5) | -- | -- |
2)样本建库
具体的建库方法和实验条件同实施例3。
3)测序分析
具体的分析方法同实施例3，统计结果如下表8所示：
表8
在疾病判断上检测目标区域单核苷酸突变及单体型判断如表9：
表9
实施例6多囊肾样本采集及分析
1)样本采集：
本家系为PKD1基因突变的多囊肾病家系，为常染色体显性遗传疾病，妻子基因型正常，丈夫与夫母均为同位点突变患者，所以在本家系中胚胎患病情况只需分析父源单体型。具体采集的步骤同实施例3，家系信息见如下表10所示：
表10
| 样本名 | 性别 | 家系成员突变信息 |
| 妻子(Mother) | F | 正常 |
| 丈夫(Father) | M | PKD1基因，c.12448C＞Tp.R4150C |
| 夫母(Paternal) | F | PKD1基因，c.12448C＞Tp.R4150C |
| 胚胎1(Embryo1) | -- | -- |
| 胚胎2(Embryo2) | -- | -- |
| 胚胎3(Embryo3) | -- | -- |
2)样本建库
具体的建库方法和实验条件同实施例3。
3)测序分析
具体的分析方法同实施例3，统计结果如下表11所示：
表11
根据实施例3中所述方法，本家系中，在疾病判断上检测目标区域单核苷酸突变及单体型判断如表12：
表12
同样可采用实施例3的方法进行脆性X综合征、β地中海贫血、镰刀型贫血、枫糖尿病、先天性肾上腺皮质增生症、氧化磷酸化偶联障碍1、肝豆状核变性、糖原积累病II型、粘多糖II型、Becker型肌营养不良、Duch型肌营养不良、脊髓小脑性共济失调、多囊肾、Alport综合征、黑蒙病、Usher综合征II型(眼科)、嗜血细胞综合征、苯丙酮尿症、睾丸女性化综合征、半乳糖血症、囊性纤维变性、脊髓型肌萎缩症、Huntington舞蹈病、囊性肉芽肿、视网膜色素变性、遗传性耳聋、多发性神经纤维瘤、多发性内分泌腺瘤病、Marfan综合征、脆性X综合征、Von Hippel-Lindau综合征、成骨发育不全症、结节性硬化症、RETT综合征和HLA配型样本的采集、建库和分析，发明人发现，若家系遗传病遗传方式符合孟德尔遗传定律，采用上述实施例3的分析方法可以判断上述样本的单体型，从而确认胚胎的具体携带情况，由于分析的过程与实施例3类似，在此不再进行赘述。
综上所述，本发明能够同时检测多个样本，大大降低了检测成本，且本发明通过家系连锁分析方法，避免胚胎因扩增引入ADO而检测有误，保证检测的精准性，减少假阴性概率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一组探针集，其特征在于，包括分别特异性识别多个目的基因的多个探针，且探针集中每个探针均是根据下列探针设计原则获得：
(1)所述探针的长度为80-95nt，优选为85-92nt；
(2)进行探针设计时，间隔1bp窗口滑动；
(3)去除含有未知碱基序列的探针；
(4)当多个探针之间属于重复序列的比例为100％时，去除所述多个探针；
(5)保证每个目标区域的探针覆盖度均为2X；
(6)特异性识别GC含量高于0.6区域，重复设计探针1-2次。
2.根据权利要求1所述的探针集，其特征在于，所述目的基因为选自下列的至少一种：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA；
优选地，所述探针游离于溶液；
任选地，所述探针结合于固相基质上，形成芯片。
3.一种用于检测疾病相关基因变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的探针集。
优选地，所述疾病为α/β地中海贫血、镰刀型贫血、枫糖尿病、先天性肾上腺皮质增生症、氧化磷酸化偶联障碍1、肝豆状核变性、糖原积累病II型、粘多糖II型、肌营养不良、脊髓小脑性共济失调、多囊肾、Alport综合征、黑蒙病、Usher综合征II型、血友病、嗜血细胞综合征、苯丙酮尿症、睾丸女性化综合征、半乳糖血症、囊性纤维变性、脊髓型肌萎缩症、Huntington舞蹈病、囊性肉芽肿、视网膜色素变性、遗传性耳聋、多发性神经纤维瘤、乳腺癌、多发性内分泌腺瘤病、Marfan综合征、脆性X综合征、VonHippel-Lindau综合征、成骨发育不全症、结节性硬化症、RETT综合征或HLA配型的至少一种；
优选地，所述疾病相关的基因为：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA基因的至少一种。
4.如权利要求1或2所述的探针和/或如权利要求3所述的试剂盒在制备疾病相关基因变异诊断试剂中的用途；
优选地，所述疾病为α/β地中海贫血、镰刀型贫血、枫糖尿病、先天性肾上腺皮质增生症、氧化磷酸化偶联障碍1、肝豆状核变性、糖原积累病II型、粘多糖II型、肌营养不良、脊髓小脑性共济失调、多囊肾、Alport综合征、黑蒙病、Usher综合征II型、血友病、嗜血细胞综合征、苯丙酮尿症、睾丸女性化综合征、半乳糖血症、囊性纤维变性、脊髓型肌萎缩症、Huntington舞蹈病、囊性肉芽肿、视网膜色素变性、遗传性耳聋、多发性神经纤维瘤、乳腺癌、多发性内分泌腺瘤病、Marfan综合征、脆性X综合征、VonHippel-Lindau综合征、成骨发育不全症、结节性硬化症、RETT综合征或HLA配型中的至少一种；
优选地，所述疾病的相关基因为：HBA1,HBA2,HBB,BCKDHA,CYP21A2,GFM1,ATP7B,GAA,IDS,DMD,ATXN1,ATXN2,ATXN7,CACNA1A,PKD1,PKD2,PKHD1,COL4A5,GUCY2D,USH2A,F8,F9,SH2D1A,PAH,AR,GALT,CFTR,SMN1,SMN2,HTT,CYBB,PRPF31,GJB2,GJB3,SLC26A4,NF1,NF2,BRCA1,BRCA2,RET,FBN1,FMR1,VHL,COL1A1,COL1A2,TSC1,MECP2或HLA基因中的至少一种。
5.一种构建高通量测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因组DNA打断修复，获得DNA片段；
(2)接头连接，加入标签接头，获得连接产物；
(3)第一轮PCR扩增；
(4)杂交洗脱，利用权利要求1或2所述的探针集和/或权利要求3所述的试剂盒对步骤(3)的扩增产物进行筛选；
(5)第二轮PCR扩增；
(6)环化，制备得到所述文库。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)之前还包括获取基因组DNA的步骤；
优选地，所述基因组DNA来源于哺乳动物，更优选所述哺乳动物为人和/或小鼠，进一步优选为人；
优选地，所述基因组DNA通过外周血、胚胎、组织或尿液中的任意一种或至少两种的组合中获得，优选为外周血和胚胎；
优选地，所述外周血的基因组DNA采用直接提取得到；
优选地，所述胚胎的基因组DNA采用全基因组扩增得到；
优选地，步骤(6)所述环化的孵育条件为90-98℃孵育3-8min，优选为93-96℃孵育4-6min；
优选地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)和步骤(6)之后还包括纯化的步骤，优选为磁珠纯化。
7.一种确定目标区域单核苷酸突变和单体型的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1’)根据权利要求5或6所述的方法，构建待测样本及其家系成员样本的高通量测序文库，所述高通量测序文库包含目标区域的核酸序列；
(2’)对步骤(1’)的高通量测序文库进行测序，获得待测样本及其家系成员的测序结果；
(3’)基于所述测序结果进行数据比对，确定待测样本目标区域的单核苷酸突变和单体型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样本为胚胎；
优选地，所述家系成员包括胚胎的父母双方和家系遗传病先证者；
优选地，所述家系成员还包括胚胎的父母双方的父母和/或胚胎的父母双方的兄弟姐妹；
优选地，所述测序采用高通量测序技术，优选BGISEQ-500二代高通量测序技术；
优选地，步骤(2’)之后还包括测序数据过滤的步骤，优选根据测序结果中的序列的碱基平均质量值和所含的N碱基数量占比进行过滤；
优选地，所述数据比对具体包括：将测序结果与参考基因组序列进行比对，用于确定待测样本单核苷酸突变；
优选地，所述参考基因组为所述待测样本来源物种的参考基因组序列，优选人类参考基因组；
优选地，进一步将单核苷酸突变与家系成员样本进行比对，得出所述待测样本单体型；
优选地，当待测样本来源的家系存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本纯合母本杂合SNP突变位点以及母本纯合父本杂合的SNP突变位点作为第一有效SNP位点，并统计其数目；
基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据先证者所患疾病的遗传关系和所述先证者的单体型，确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
优选地，基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本纯合母本杂合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本纯合母本杂合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与母本一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型M1的SNP位点支持总数MA1和先证者为单体型M2的SNP位点支持总数MA2；
将待测胚胎样本携带的与母本一致的碱基算为支持胚胎单体型EM1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EM2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EM1的SNP位点支持总数EMA1和胚胎为单体型EM2的SNP位点支持总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/MA1，HM2＝EMA2/MA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型；
针对父本杂合母本纯合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本杂合母本纯合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与父本一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型F1的SNP位点支持总数FA1和先证者为单体型F2的SNP位点支持总数FA2；
将待检胚胎携带的与父本一致的碱基算为支持胚胎单体型EF1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EF2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EF1的SNP位点支持总数EFA1和胚胎为单体型EF2的SNP位点支持总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/FA1，HF2＝EFA2/FA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
优选地，当待测样本来源的家系不存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的SNP突变位点，以及母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的SNP突变位点作为第二有效SNP位点，并统计其数目；
基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据所述家系的疾病的遗传关系确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
优选地，基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的第二有效SNP位点，将父本杂合位点中与祖父或祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，并且：
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF1；
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF2；
统计待检基因区域内支持单体型F1的第二有效SNP位点的总数HFA1，支持单体型F2的第二有效SNP位点的总数HFA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EF1的总数EFA1，支持胚胎单体型EF2的总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/HFA1，HF2＝EFA2/HFA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
针对母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的第二有效SNP位点，将母本杂合位点中与外祖父或外祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，并且：
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM1；
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM2；
统计待检基因区域内支持单体型M1的第二有效SNP位点的总数HMA1，支持单体型M2的第二有效SNP位点的总数HMA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EM1的总数EMA1，支持胚胎单体型EM2的总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/HMA1，HM2＝EMA2/HMA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型。
9.一种构建高通量测序文库的装置，其特征在于，包括：
打断修复单元，所述打断修复单元用于基因组DNA打断修复，获得DNA片段；
接头连接单元，所述接头连接单元与打断修复单元连接，用于接头连接，加入标签接头，获得连接产物；
第一扩增单元，所述第一扩增单元用于第一轮PCR扩增；
杂交洗脱单元，所述杂交洗脱单元并设置有利用权利要求1或2所述的探针和/或权利要求3所述的试剂盒，用于利用所述探针和/或所述试剂盒对步骤(3)的扩增产物进行筛选；
第二扩增单元，所述第二扩增单元与所述杂交洗脱单元连接，用于第二轮PCR扩增；
环化单元，用于制备得到所述文库；
优选地，步骤(1)之前还包括获取基因组DNA的单元，所述获取基因组DNA的单元与所述打断修复单元连接，用于从样本中获取基因组DNA；
优选地，所述基因组DNA来源于哺乳动物，更优选所述哺乳动物为人和/或小鼠，进一步优选为人；
优选地，所述基因组DNA通过外周血、胚胎、组织或尿液中的任意一种或至少两种的组合中获得，优选为外周血和胚胎；
优选地，所述外周血的基因组DNA采用直接提取得到；
优选地，所述胚胎的基因组DNA采用全基因组扩增得到；
优选地，所述环化的孵育条件为90-98℃孵育3-8min，优选为93-96℃孵育4-6min；
优选地，步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)和步骤(6)之后还包括纯化单元，优选为磁珠纯化单元。
10.一种确定目标区域单核苷酸突变和单体型的系统，其特征在于，包括：
文库构建装置，所述文库构建装置为根据权利要求9所述的装置，构建待测样本及其家系成员样本的高通量测序文库，所述高通量测序文库包含目标区域的核酸序列；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对文库构建装置构建的高通量测序文库进行测序，获得待测样本及其家系成员的测序结果；
分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果进行数据比对，确定待测样本目标区域的单核苷酸突变和单体型；
优选地，所述待测样本为胚胎；
优选地，所述家系成员包括胚胎的父母双方和家系遗传病先证者；
优选地，所述家系成员还包括胚胎的父母双方的父母和/或胚胎的父母双方的兄弟姐妹；
优选地，所述测序采用高通量测序技术，优选BGISEQ-500二代高通量测序技术；
优选地，步骤(2’)之后还包括测序数据过滤的装置，用于将所述测序数据根据测序结果中序列的碱基平均质量值和所含的N碱基数量占比进行过滤；
优选地，所述数据比对具体包括：将测序结果与参考基因组序列进行比对，用于确定待测样本单核苷酸突变；
优选地，所述参考基因组为所述待测样本来源物种的参考基因组序列，优选人类参考基因组；
优选地，进一步将单核苷酸突变与家系成员样本进行比对，得出所述待测样本单体型；
优选地，所述待测样本的分析结果如下：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本纯合母本杂合SNP突变位点以及母本纯合父本杂合的SNP突变位点作为第一有效SNP位点，并统计其数目；
基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据先证者所患疾病的遗传关系和所述先证者的单体型，确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
优选地，基于第一有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本纯合母本杂合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本纯合母本杂合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与母本一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型M1的SNP位点支持总数MA1和先证者为单体型M2的SNP位点支持总数MA2；
将待测胚胎样本携带的与母本一致的碱基算为支持胚胎单体型EM1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EM2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EM1的SNP位点支持总数EMA1和胚胎为单体型EM2的SNP位点支持总数EMA2；
计算H值，其中HM1＝EMA1/MA1，HM2＝EMA2/MA2；
若同时满足HM1>＝0.2和HM2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EM1单体型；
若同时满足HM1<＝0.05和HM2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EM2单体型；
针对父本杂合母本纯合的第一有效SNP位点，将先证者的SNP位点与父本杂合母本纯合的SNP位点进行分析，将先证者携带的与父本一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，不一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，然后确定在待检基因区内先证者为单体型F1的SNP位点支持总数FA1和先证者为单体型F2的SNP位点支持总数FA2；
将待检胚胎携带的与父本一致的碱基算为支持胚胎单体型EF1的碱基，不一致的碱基算为支持胚胎单体型EF2的碱基，然后确定在待检基因区内胚胎为单体型EF1的SNP位点支持总数EFA1和胚胎为单体型EF2的SNP位点支持总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/FA1，HF2＝EFA2/FA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
优选地，当待测样本来源的家系不存在先证者时，按照如下步骤确定待测样本目标区域的单体型：
根据家系单核苷酸突变检测结果，挑选出待检基因区父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的SNP突变位点，以及母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的SNP突变位点作为第二有效SNP位点，并统计其数目；
基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型；
根据所述家系的疾病的遗传关系确定致病单体型；以及
基于所述致病单体型和所述待测胚胎样本的单体型，确定所述待测胚胎样本是否携带致病单体型，并确定所述待测胚胎样本的致病状态；
优选地，基于第二有效SNP位点及其数目，确定待测胚胎样本的单体型，进一步包括：
针对父本杂合母本纯合且祖父或祖母纯合的第二有效SNP位点，将父本杂合位点中与祖父或祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型F1的碱基，一致的碱基算为支持单体型F2的碱基，并且：
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF1；
当所述支持单体型F1的碱基与家系中母本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型F2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EF2；
统计待检基因区域内支持单体型F1的第二有效SNP位点的总数HFA1，支持单体型F2的第二有效SNP位点的总数HFA2，以及待测胚胎样本中所述待检基因区域内支持胚胎单体型EF1的总数EFA1，支持胚胎单体型EF2的总数EFA2；
计算H值，其中HF1＝EFA1/HFA1，HF2＝EFA2/HFA2；
若同时满足HF1>＝0.2和HF2<＝0.05，则判断所述待测胚胎样本携带EF1单体型；
若同时满足HF1<＝0.05和HF2>＝0.2，则判断所述待测胚胎样本携带EF2单体型；
针对母本杂合父本纯合且外祖父或外祖母纯合的第二有效SNP位点，将母本杂合位点中与外祖父或外祖母的纯合位点不一致的碱基算为支持单体型M1的碱基，一致的碱基算为支持单体型M2的碱基，并且：
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基不一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M1的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM1；
当所述支持单体型M1的碱基与家系中父本的该SNP位点的碱基一致时，若待测胚胎样本的该SNP位点为纯合则弃用该SNP位点，若待测胚胎样本的该SNP位点为杂合位点且存在与所述支持单体型M2的碱基一致的碱基，则判定该SNP位点支持胚胎单体型EM2；
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