CN109957606A - 靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，包括以下步骤：步骤1、制备带有生物素标记的探针；步骤2、提取石蜡包埋组织(FFPE)中的基因组DNA(如通过FFPE基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取)，用于后续实验或者存放于‑20℃；步骤3、将基因组DNA片段化；步骤4、构建捕获前文库；步骤5、利用步骤1制备的带有生物素标记的探针对步骤4构建的捕获前文库进行靶向捕获，获得目的片段；步骤6、将步骤5获得的目的片段进行PCR扩增，获得扩增产物；步骤7，分离纯化步骤6获得的扩增产物，构成测序文库。通过本发明构建的测序文库，能够在耐药基因检测时快速找到耐药原因，从而方便针对耐药进行处理。
Description
技术领域
本发明涉及靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法。
背景技术
靶向药物(targetedmedicine)是随着当代分子生物学、细胞生物学的发展产生的高科技药物，它通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。靶向药物通常分围小分子药物和单克隆抗体药物。
靶向药物是针对肿瘤基因开发的，它能够识别肿瘤细胞上由肿瘤细胞特有的基因所决定的特征性位点，通过与之结合(或类似的其他机制)，阻断肿瘤细胞内控制细胞生长、增殖的信号传导通路，从而杀灭肿瘤细胞、阻止其增殖。由于这样的特点，靶向药物不仅效果好，而且副作用要比常规的化疗方法小得多。
靶向药物治疗是近二十年来肿瘤治疗领域发展最为迅速的治疗模式(不同于传统的手术与放疗等局部疗法)。靶向药物需要找到癌症患者体内的“靶点”，即相应的基因突变，只要有相应的基因突变，靶向药物便可通过抑制肿瘤生长所需的特定分子靶点，精准的攻击癌细胞。比如肺癌、胃癌、乳腺癌的病人，在使用靶向药物之前，通常需要做肿瘤的基因检测，基因检测对于特定靶点靶向药物的选择，具有重大的指导意义。临床结果显示：不经筛选的使用靶向药物，药物平均有效率仅为30％-40％，靶向药物的疗效与基因突变状态是密切相关的。
靶向药耐药是指恶性肿瘤细胞对于治疗药物作用的耐受性，靶向药耐药性一旦产生，其药物的作用就明显下降，如果再继续服用，对治疗病情无任何好处，还会增加药物治疗的副作用。靶向药耐药根据发生原因可以分围获得性耐药和天然耐药性。
医学上耐药又称抗药性，是指恶性肿瘤细胞对于治疗药物作用的耐受性，靶向药耐药性一旦产生，其药物的作用就明显下降，如果再继续服用，对治疗病情无任何好处，还会增加药物治疗的副作用。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。以肺癌为例，天然性耐药指的是患者本身虽然存在EGFR靶点突变，但由于天然存在KRAS基因突变，导致像易瑞沙和特罗凯一类靶向药治疗效果不好，有的患者使用4.5个月即产生耐药。而获得性耐药是在靶向药治疗过程中，由于该靶点信号通路持续受到药物抑制，肿瘤为了逃避药物作用产生其他基因突变，抑制靶向药对EGFR靶点的治疗作用，从而导致耐药。
癌症的耐药性是成功治疗癌症的主要障碍之一。基因突变在癌细胞中很常见。癌症耐药性的一个重要原因就是肿瘤细胞的自然变化。癌细胞不断地进化和适应，获得新的基因突变。肿瘤通常是由具有不同突变的细胞组成的复合物，也就是说，肿瘤中的细胞虽然相似，但并不完全相同。当接触到化疗药物时，正常形式的靶向细胞可以被杀死，而基因突变的细胞可以避免药物的攻击。这些耐药细胞不再需要与其他细胞竞争营养，可能开始主宰肿瘤。
判断耐药的原因唯一的方法就是穿刺活检，并进行病理分型和肿瘤耐药基因检测，通过对耐药基因的检测找到耐药原因，并针对耐药进行处理。如果未进行活检检测，就盲目更换治疗方案，有可能继续无效，以至于耽误治疗时间，加重病情。
发明内容
本发明的目的是提供靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，便于在对耐药基因进行检测时快速找到耐药原因。
实现本发明目的的技术方案是：靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，包括以下步骤：
步骤1、制备带有生物素标记的探针；
步骤2、提取石蜡包埋组织(FFPE)中的基因组DNA(如通过FFPE基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取)，用于后续实验或者存放于-20℃；
步骤3、将基因组DNA片段化；
步骤4、构建捕获前文库；
步骤5、利用步骤1制备的带有生物素标记的探针对步骤4构建的捕获前文库进行靶向捕获，获得目的片段；
步骤6、将步骤5获得的目的片段进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤7，分离纯化步骤6获得的扩增产物，构成测序文库。
所述步骤1制备的带有生物素标记的探针采用安捷伦科技有限公司的带有生物素标记的探针设计系统eArray设计，长度为120mer。
所述步骤1制备的带有生物素标记的探针能检测到的目标基因位点的获取包括以下步骤：
步骤11、从FDA(Food and DrugAdministration，美国食品药品监督管理局)或者CFDA(China Food and DrugAdministration，国家食品药品监督管理局)已批准的或处于临床试验III/IV期的所有靶向治疗药物耐药突变位点中获取；
步骤12、从目前权威的肿瘤诊疗指南推荐的靶向药物检测的耐药突变位点中获取；
步骤13、从人类癌症相关体细胞突变目录中获取；
步骤14、基于文献调研、临床试验信息给出的增减建议，确定真正全面可靠的靶向药物耐药位点用于下游分析。
所述步骤1制备的带有生物素标记的探针能检测到的基因位点包括：ABL1、ALK、AR、BRAF、BTK、CTNNB1、EGFR、ESR1、FLT3、KIT、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K2_ENST00000262948、MET、MTOR、NF2、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CA_ENST00000263967、PTEN、SMO。
所述步骤3将基因组DNA片段化具体为：通过Covaris M220打断仪将基因组DNA打断至直片段主峰位置出现在150～200bp。
所述步骤4构建捕获前文库具体包括以下步骤：
步骤41、将步骤3得到的片段化DNA进行末端修复和3’末端添加A，获得具有粘性末端A的DNA片段；
步骤42、将步骤41获得的具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，获得连接产物；
步骤43、对步骤42获得的连接产物进行PCR扩增，获得扩增产物，然后分离扩增产物，构成捕获前文库。
所述步骤41中的末端修复具体为：基因组DNA片段化后形成5'或3'端突出末端，利用具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性的T4DNAPolymerase，以及具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性的Klenow DNAPolymerase，将5'端突出末端补平，3'端突出末端削平；DNA中的磷酸二酯键打断之后磷酸基团随机在3'或5'端，利用T4Polynucleotide Kinase将5'磷酸化，去除3'端磷酸基团，以便进行连接反应。
所述步骤41中的3’末端添加A具体为：在已修复的DNA平末端3'端上加具有粘性末端的A，获得具有粘性末端A的DNA片段，为下步TA连接做准备。
所述步骤42具体为：利用T4DNALigase进行TA连接，使具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，封闭DNA链上缺口酶，生成磷酸二酯键，为后续步骤提供引物结合位点。
所述步骤5具体为：浓缩步骤4构建的捕获前文库，加入封闭液封闭文库上的衔接子；然后将带有生物素标记的探针会与目标DNA片段进行液相杂交，联袂亲和素磁珠会与带有生物素标记的探针牢固结合，使目标DNA片段通过带有生物素标记的探针间接结合到磁珠上；然后再高温条件下洗脱非目标DNA，洗脱后，加入标签，获得目的片段。
采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：通过本发明构建的测序文库，能够在耐药基因检测时快速找到耐药原因，从而方便针对耐药进行处理。
具体实施方式
(实施例1)
本实施例的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，包括以下步骤：
步骤1、制备带有生物素标记的探针，带有生物素标记的探针采用安捷伦科技有限公司的带有生物素标记的探针设计系统eArray设计，带有生物素标记的探针长度为120mer。带有生物素标记的探针能检测到的目标基因位点的获取包括以下步骤：
步骤11、从FDA(Food and DrugAdministration，美国食品药品监督管理局)或者CFDA(China Food and DrugAdministration，国家食品药品监督管理局)已批准的或处于临床试验III/IV期的所有靶向治疗药物耐药突变位点中获取；
步骤12、从目前权威的肿瘤诊疗指南推荐的靶向药物检测的耐药突变位点中获取，如美国国立综合癌症网络NCCN临床实践指南、欧洲肿瘤学会ESMO临床实践指南和国内的CSCO等机构制定的肿瘤诊疗指南或专家共识建议；
步骤13、从人类癌症相关体细胞突变目录中获取，如Cosmic数据库，Cosmic数据库对临床研究中的获得性耐药和原发性耐药的报道进行了整理和注释，包括基因、突交、药物，癌种及参考文献等信息；
步骤14、基于文献调研、临床试验信息给出的增减建议，确定真正全面可靠的靶向药物耐药位点用于下游分析。
步骤2、提取石蜡包埋组织中的基因组DNA(可以通过FFPE基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，如自凯杰生物科技有限公司生产的FFPE基因组DNA提取试剂盒)，用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤3、将基因组DNA片段化，具体为：通过Covaris M220打断仪将基因组DNA打断至直片段主峰位置出现在150～200bp。
步骤4、构建捕获前文库，具体包括以下步骤：
步骤41、将步骤3得到的片段化DNA进行末端修复和3’末端添加A，获得具有粘性末端A的DNA片段；
末端修复具体为：基因组DNA片段化后形成5'或3'端突出末端，利用具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性的T4DNAPolymerase，以及具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性的Klenow DNAPolymerase，将5'端突出末端补平，3'端突出末端削平；DNA中的磷酸二酯键打断之后磷酸基团随机在3'或5'端，利用T4Polynucleotide Kinase将5'磷酸化，去除3'端磷酸基团，以便进行连接反应。
3’末端添加A具体为：在已修复的DNA平末端3'端上加具有粘性末端的A，获得具有粘性末端A的DNA片段，为下步TA连接做准备。
步骤42、将步骤41获得的具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，获得连接产物，具体为：利用T4DNALigase进行TA连接，使具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，封闭DNA链上缺口酶，生成磷酸二酯键，为后续步骤提供引物结合位点。
步骤43、对步骤42获得的连接产物进行PCR扩增，构成捕获前文库。
步骤5、利用步骤1制备的带有生物素标记的探针对步骤4构建的捕获前文库进行靶向捕获，获得目的片段，具体为：浓缩步骤4构建的捕获前文库，加入封闭液封闭文库上的衔接子；然后将带有生物素标记的探针会与目标DNA片段进行液相杂交，联袂亲和素磁珠会与带有生物素标记的探针牢固结合，使目标DNA片段通过带有生物素标记的探针间接结合到磁珠上；然后再高温条件下洗脱非目标DNA，洗脱后，加入标签，获得目的片段。
步骤6、将步骤5获得的目的片段进行PCR扩增，获得扩增产物。
步骤7，分离纯化步骤6获得的扩增产物，构成测序文库。
本实施例的步骤1制备的带有生物素标记的探针能检测到的基因位点、对应药物、突变位点以及文献的Pubmed Id如下表所示：
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、制备带有生物素标记的探针；
步骤2、提取石蜡包埋组织中的基因组DNA，用于后续实验或者存放于-20℃；
步骤3、将基因组DNA片段化；
步骤4、构建捕获前文库；
步骤5、利用步骤1制备的带有生物素标记的探针对步骤4构建的捕获前文库进行靶向捕获，获得目的片段；
步骤6、将步骤5获得的目的片段进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤7，分离纯化步骤6获得的扩增产物，构成测序文库。
2.根据权利要求1所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤1制备的带有生物素标记的探针能检测到的目标基因位点的获取包括以下步骤：
步骤11、从FDA或者CFDA已批准的或处于临床试验III/IV期的所有靶向治疗药物耐药突变位点中获取；
步骤12、从目前权威的肿瘤诊疗指南推荐的靶向药物检测的耐药突变位点中获取；
步骤13、从人类癌症相关体细胞突变目录中获取；
步骤14、基于文献调研、临床试验信息给出的增减建议，确定真正全面可靠的靶向药物耐药位点用于下游分析。
3.根据权利要求1或2所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤1制备的带有生物素标记的探针能检测到的基因位点包括：ABL1、ALK、AR、BRAF、BTK、CTNNB1、EGFR、ESR1、FLT3、KIT、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K2_ENST00000262948、MET、MTOR、NF2、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CA_ENST00000263967、PTEN、SMO。
4.根据权利要求1所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤3将基因组DNA片段化具体为：通过Covaris M220打断仪将基因组DNA打断至直片段主峰位置出现在150～200bp。
5.根据权利要求1所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤4构建捕获前文库具体包括以下步骤：
步骤41、将步骤3得到的片段化DNA进行末端修复和3’末端添加A，获得具有粘性末端A的DNA片段；
步骤42、将步骤41获得的具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，获得连接产物；
步骤43、对步骤42获得的连接产物进行PCR扩增，获得扩增产物，然后分离扩增产物，构成捕获前文库。
6.根据权利要求5所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤41中的末端修复具体为：基因组DNA片段化后形成5'或3'端突出末端，利用具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性的T4 DNAPolymerase，以及具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性的Klenow DNA Polymerase，将5'端突出末端补平，3'端突出末端削平；DNA中的磷酸二酯键打断之后磷酸基团随机在3'或5'端，利用T4 PolynucleotideKinase将5'磷酸化，去除3'端磷酸基团，以便进行连接反应。
7.根据权利要求6所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤41中的3’末端添加A具体为：在已修复的DNA平末端3'端上加具有粘性末端的A，获得具有粘性末端A的DNA片段，为下步TA连接做准备。
8.根据权利要求6所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤42具体为：利用T4 DNA Ligase进行TA连接，使具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，封闭DNA链上缺口酶，生成磷酸二酯键，为后续步骤提供引物结合位点。
9.根据权利要求1所述的靶向药耐药性检测试剂的测序文库构建方法，其特征在于：所述步骤5具体为：浓缩步骤4构建的捕获前文库，加入封闭液封闭文库上的衔接子；然后将带有生物素标记的探针会与目标DNA片段进行液相杂交，联袂亲和素磁珠会与带有生物素标记的探针牢固结合，使目标DNA片段通过带有生物素标记的探针间接结合到磁珠上；然后再高温条件下洗脱非目标DNA，洗脱后，加入标签，获得目的片段。
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| WO2016082057A1 (zh) * | 2014-11-25 | 2016-06-02 | 深圳华大基因研究院 | 游离dna测序文库的构建方法 |
| CN105648090A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-06-08 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 基于单分子靶向测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用 |
| CN105780129A (zh) * | 2014-12-15 | 2016-07-20 | 天津华大基因科技有限公司 | 目标区域测序文库构建方法 |
| CN106497920A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-03-15 | 深圳华大基因研究院 | 一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法及试剂盒 |
| CN108424955A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-08-21 | 合肥中科金臻生物医学有限公司 | 一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016082057A1 (zh) * | 2014-11-25 | 2016-06-02 | 深圳华大基因研究院 | 游离dna测序文库的构建方法 |
| CN105780129A (zh) * | 2014-12-15 | 2016-07-20 | 天津华大基因科技有限公司 | 目标区域测序文库构建方法 |
| CN105648090A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-06-08 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 基于单分子靶向测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用 |
| CN106497920A (zh) * | 2016-11-21 | 2017-03-15 | 深圳华大基因研究院 | 一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法及试剂盒 |
| CN108424955A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-08-21 | 合肥中科金臻生物医学有限公司 | 一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用 |
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