CN105861653A - 一种检测肿瘤相关基因突变的质控物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肿瘤相关基因突变的质控物及其制备方法,属于临床检验学和生物技术领域。一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,由人正常细胞系基因组DNA和含有肿瘤相关基因突变的DNA片段组成。本发明得到的含不同基因突变DNA片段与基因组DNA混合制作的NGS检测质控品提供了一种可用于制造EQA的质控品的方法。这种利用合成含肿瘤相关基因突变DNA片段与基因组DNA混合制作质控品的方法尚属首例。这种方法也能用于制作一系列的用于其他NGS个体化检测的混合核酸样本质控品。
Description
技术领域
本发明公开了一种检测肿瘤相关基因突变的质控物及其制备方法,属于临床检验学和生物技术领域。
背景技术
作为一种与肿瘤密切相关的致病因素,许多研究表明基因变异对于肿瘤具有相当显著的诊断和预后价值,如CFTR基因与囊性纤维化,BRCA1、BRCA2基因与遗传性乳腺癌和卵巢癌,EGFR基因与肺癌等。此外,由于肿瘤细胞基因组的异质性,相似组织来源的肿瘤可能具有不同的突变型,而不同组织来源的肿瘤也可具有相似的基因改变,因此对精确检测基因变异对于肿瘤个体化治疗至为关键。
目前常规的基因变异检测技术包括Sanger测序、焦磷酸测序、扩增阻滞变异系统(ARMS)、荧光原位杂交技术及等位基因特异PCR等。但这些传统的基因检测手段普遍通量较低,且限于较高的费用、时间等成本,无法同时大量检测临床相关的基因变异。
随着新一代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)的出现,大规模平行测序成为可能,相较于第一代测序技术,NGS技术检测速度快、准确率高、成本低、覆盖度广。目前商业化的NGS平台包括罗氏公司的454测序平台,Illumina公司的Solexa测序平台,ABI公司的SOLiD测序平台,以及Life Technologies公司的Ion Torrent测序平台,还有华大基因收购美国Complete Genomics Inc(CG)后推出的基于CG平台的BGISEQ-1000等。随着NGS技术的不断成熟,加上其具有传统测序技术所缺乏的精确、灵敏、价廉、平行大规模处理等优势,NGS在肿瘤临床诊断和治疗中的应用逐渐开展起来,利用NGS技术可以进行肿瘤基因组序列的重测序,继而对肿瘤相关基因的不同类型变异(点突变、插入、缺失等)、拷贝数变异以及基因相关性和多态性进行分析。尽管肿瘤相关基因突变NGS检测在国内越来越多的临床实验室得以开展,但不同实验室在应用NGS进行肿瘤相关基因突变检测的室间质量评价尚为空白。目前国内外尚没有文献报道关于肿瘤相关基因突变NGS检测质量评价的文章,因此评价不同实验室的检测性能情况及改善提高其检测的水平迫在眉睫。
要开展NGS检测肿瘤相关基因突变的室间质量评价,一个好的质控品是保证检测质量的关键。对于NGS技术进行基因检测,临床血标本或血标本来源基因组DNA及电子序列文件均可作为室间质量评价的样本,其中临床标本质控品来源局限,一致性较差,且具有潜在的感染性风险,因此在应用过程中较为局限;电子序列文件具有安全经济方便,并且灵活的优点,但由于不同平台、不同处理流程中对电子文件格式的要求不同,使其作为质评样本的应用受到限制。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能用于肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品。
本发明要解决的另一个技术问题是提供肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明选择人正常细胞系,培养后先提取得到相应的基因组DNA,再通过合成得到多个含有不同肿瘤相关基因突变的DNA片段,将不同DNA片段与基因组DNA按一定拷贝数比例混合以制备质控品。这种方法能够制备大量模拟从临床样本提取的DNA质控品。
一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,由人正常细胞系基因组DNA和含有肿瘤相关基因突变的DNA片段组成。
所述人正常细胞系为人正常细胞系GM12878或人正常细胞系GM19240,它们都是标准细胞系,即DNA序列已经明确测定过的细胞系。
所述含有肿瘤相关基因突变的DNA片段是含有肿瘤相关基因热点和/或罕见突变所在的基因序列,除变异处其余位置碱基序列与所选人正常基因组DNA序列一致。
所述肿瘤相关基因热点和/或罕见突变为下述基因位点中的一个或多个:
(1)NM_005228.3(EGFR):c.493C>T(p.Arg165Trp)
(2)NM_000142.4(FGFR3):c.1948A>C(p.Lys650Gln)
(3)NM_005896.2(IDH1):c.395G>A(p.Arg132His)
(4)NM_000141.4(FGFR2):c.1124A>G(p.Tyr375Cys)
(5)NM_002834.3(PTPN11):c.182A>G(p.Asp61Gly)
(6)NM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)
(7)NM_004333.4(BRAF):c.1799T>A(p.Val600Glu)
(8)NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G(p.Leu858Arg)
(9)NM_004119.2(FLT3):c.2520_2521insGGATCC(p.Ser840_Asn841insGlySer)
(10)NM_004985.3(KRAS):c.34G>C(p.Gly12Arg)
(11)NM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser752delinsAla)
(12)NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TT>CC(p.Leu755Pro)
(13)NM_017617.3(NOTCH1):c.5965G>A(p.Asp1989Asn)
(14)NM_002524.4(NRAS):c.35G>A(p.Gly12Asp)
(15)NM_006206.4(PDGFRA):c.1664A>G(p.Tyr555Cys)
(16)NM_001014432.1(AKT1):c.49G>A(p.Glu17Lys)
(17)NM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val561insGluArg)
(18)NM_004985.3(KRAS):c.34G>T(p.Gly12Cys)
(19)NM_005228.3(EGFR):c.2156G>C(p.Gly719Ala)
(20)NM_004972.3(JAK2):c.1821G>C(p.lys607Asn)
(21)NM_002524.4(NRAS):c.38G>A(p.Gly13Asp)
(22)NM_000516.4(GNAS):c.601C>A(p.Arg201Ser)
(23)NM_005343.2(HRAS):c.181C>A(p.Gln61Lys)
(24)NM_000222.2(KIT):c.1675_1680delGTTGTT(p.Val559_Val560del)
(25)NM_006218.2(PIK3CA):c.1624G>A(p.Glu542Lys)
(26)NM_004333.4(BRAF):c.1405_1407del3(p.Gly469del)
(27)NM_002168.2(IDH2):c.419G>A(p.Arg140Gln)
(28)NM_004972.3(JAK2):c.1849G>T(p.Val617Phe)。
本公开所选择28个肿瘤基因突变位点,这28个突变中,除EGFR c.493C>T为无明显临床意义突变外,均为肿瘤相关体细胞突变,是根据美国国立综合癌症网络发布的最新指南,ClinVar数据库及相关文献,以肺癌、结直肠癌等发病率高、与基因变异关系密切的肿瘤为主,筛选得到各致病性突变,每种突变都与相应的肿瘤相关,大多为肿瘤治疗与预后相关突变,如:EGFR c.2156G>C、KRAS c.34G>T与非小细胞肺癌,BRAF c.1799T>A与恶性黑色素瘤等。这些突变发生频率高低不一,有些为热点突变,如:EGFR c.2573T>G;有些为较罕见突变(本专利所选用的方法也解决了肿瘤相关罕见突变样本较难获取的问题),如:ERBB2c.21732174delTTinsCC。这些与不同肿瘤相关的多种突变包括点突变和小片段(<50bp)缺失/插入突变,其组成的质控样品盘能覆盖大多数肿瘤相关基因检测项目,以此样品盘来开展肿瘤相关基因突变NGS检测室间质量评价更有意义。
所述含有肿瘤相关基因突变的DNA片段为序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.28中的一个或多个核苷酸序列。
所述含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,含有KRAS c.34G>T(p.Gly12Cys)或含有IDH2c.419G>A(p.Arg140Gln)突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9。
一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,由8个混合阳性样本和1个正常对照样本组成,每个混合阳性样本由3-5个选自序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.28的肿瘤DNA序列和人正常细胞系基因组DNA按比例混合组成,正常对照样本为人正常细胞系基因组DNA。
所述含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,序列表SEQ ID No.18所示的突变DNA片段或序列表SEQ ID No.27所示的突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9。
一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品的制备方法,包括以下步骤:
(1)培养人正常细胞系,提取基因组DNA;
(2)合成含有不同肿瘤突变的DNA片段;
(3)制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品。
所述步骤(1)人正常细胞系,为人正常细胞系GM12878或人正常细胞系GM19240。
所述步骤(2)含有不同肿瘤突变的DNA片段,为序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.28中的至少两个核苷酸序列。
所述步骤(3)制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,是指将步骤(1)得到的人正常细胞系基因组DNA与步骤(2)得到的含有不同肿瘤突变的DNA片段中的至少三个核苷酸序列进行混合,得到混合阳性样本;其中含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,含有KRASc.34G>T(p.Gly12Cys)或含有IDH2c.419G>A(p.Arg140Gln)突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9;其中两个低拷贝数比例突变为随机挑选;将步骤(1)得到的人正常细胞系基因组DNA作为正常对照样本。
本发明选取了一种人正常细胞系GM12878,将细胞培养达到一定数量,提取细胞基因组DNA;同时选取28种肿瘤相关基因热点/罕见突变进行合成相应克隆,酶切,电泳并回收得到相应DNA片段后,将其以3~5个为一组分别与基因组DNA按一定比例混合,建立含有8个混合阳性样本和1个仅由基因组DNA组成的正常对照样本的NGS检测质控样品盘。这种通过合成的突变DNA片段与基因组DNA混合制作的质控品DNA质量高,稳定性好,同时能够人为控制和选择所需的基因突变种类的质控品,克服了传统质控品的不足。通过利用含有目的突变DNA片段与基因组DNA混合制作的质控品操作简便,合成周期短,能够大批量生产。本研究制作的质控品能够作为肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,用于室间质量评价(EQA),并且具用较好的重复性和一致性。
本发明的创新点在于:本发明得到的混合DNA样本质控品可以模拟临床真实标本提取的基因组DNA。因此,我们得到的质控品可以用于EQA,在将DNA质控品作为EQA评估试验的质控品发放时,由于DNA稳定性较好,它可以在室温下无需冰袋进行邮寄并能较长时间保存在-20℃条件下。我们的研究中得到的含不同基因突变DNA片段与基因组DNA混合制作的NGS检测质控品提供了一种可用于制造EQA的质控品的方法。这种利用合成含肿瘤相关基因突变DNA片段与基因组DNA混合制作质控品的方法尚属首例。这种方法也能用于制作一系列的用于其他NGS个体化检测的混合核酸样本质控品。
下面结合具体实施方式对本发明进行说明,以使公众更好地理解本发明内容及应用,并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换,均属于本发明保护范围。
具体实施方式
以下为实施例中涉及的主要材料和试剂:
人正常细胞系GM12878,Coriell Cell Repositories,美国
QIAamp DNA Mini Kit,凯杰企业管理(上海)有限公司,中国
FastDigestTM限制性内切酶,Thermo Fisher Scientific,美国
天根普通质粒小提试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司,中国
天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司,中国
实施例1:制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品
一、方法
1、培养人正常细胞系,提取基因组DNA
(1)细胞培养:人正常细胞系GM12878,分别用含15%胎牛血清RPIM-1640培养液培养,培养基中含有15%胎牛血清,100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素;在37℃含5%CO2的恒温细胞培养箱中培养,细胞传代无需蛋白酶消化,将细胞扩大培养至107-108并处于对数生长期。
(2)人基因组DNA提取:按照试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit,凯杰企业管理(上海)有限公司,中国)说明书操作,得到人正常细胞系GM12878基因组DNA产物,分装保存。
2.合成含有不同突变的DNA片段
(1)序列合成:在Genebank中查找本发明的28个肿瘤相关基因热点/罕见突变所在基因序列上的位置,并标记出包含该位点的长约400bp左右的序列;根据各序列特点在其两端分别加上酶切位点及保护性碱基,设计得到完整序列后,委托上海生工生物工程有限公司合成相应DNA片段;该28个肿瘤相关基因热点/罕见突变见下表,各自具体序列信息见序列表。
表1:28个肿瘤相关基因热点/罕见突变
(2)质粒酶切验证:得到28个含有各肿瘤相关基因突变的puc57载体克隆后,对其分别进行酶切电泳,委托上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序验证,为序列表SEQID No.1至SEQ ID No.28所示的核苷酸序列。
①扩增后提取阳性质粒:将含有相应阳性质粒的大肠杆菌BL21菌液接种至LB平皿,37℃过夜培养,挑取单个菌落于LB培养液,37℃摇动培养18h;用天根普通质粒小提试剂盒,按说明书操作提取菌液质粒。
②酶切及电泳:根据合成时在两端添加的酶切位点,加入相应的核酸内切酶,37℃孵育3~4h,将各酶切后产物在电泳仪内100UV电泳20min。所用核酸内切酶包括:BamHI,EcoRI,KpnI,BgIII和XbaI。以对含有突变NM_005228.3(EGFR):c.2156G>C(p.Gly719Ala)的DNA片段为例,其50μL酶切体系如下:
表2
③电泳后凝胶回收DNA片段并测得浓度后进行测序:电泳分离后,用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,按说明书操作回收28个含有各肿瘤相关基因突变的DNA片段,测得其浓度,分别进行Sanger测序验证,于-20℃保存。
3、制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品。
(1)将28个DNA片段中每3~5个为一组分别与基因组DNA进行混合,建立NGS检测质控样品盘,每套共含8个混合阳性样本和1个仅由基因组DNA组成的正常对照样本;
(2)根据各DNA片段和基因组DNA的序列长度及浓度,利用拷贝数(copies/ul)计算公式:6.02×1023×浓度(ng/ul)×10-9/(DNA长度×660),使得混合阳性样本中除KRASc.34G>T(p.Gly12Cys)和IDH2c.419G>A(p.Arg140Gln)突变片段与基因组DNA的拷贝数比例为1%~5%外,其余每种突变片段与基因组DNA拷贝数比例均不低于10%。
表3:肿瘤相关基因突变NGS检测质控样品盘组成及其对应的序列表
二.结果
合成DNA片段测序验证结果:28种含肿瘤相关基因突变的DNA片段Sanger测序结果显示均符合预期序列结果。
实施例2:用Illumina测序平台对肿瘤相关基因突变NGS检测质控品进行验证
一.方法:利用NextSeq CN500测序平台进行验证
取实施例1得到的一套质控品样品盘,将其视为常规DNA标本在北京吉因加科技有限公司进行靶向NGS检测,经文库建立、模板制备、上机测序和生物信息学分析等步骤得出检测结果。
该实施例中靶向NGS检测范围是下列表中基因的编码区域(CDS区)变异。
表4
二.结果:见表5
表5
本实施例检测结果显示,北京吉因加科技有限公司利用NextSeq CN500测序平台能检测出本次质控样本盘中所含全部突变,且所报告的突变频率也与预期相符,即通过Illumina测序平台对该肿瘤相关基因突变NGS检测质控品进行了验证。本发明可用作基于Illumina测序平台的肿瘤基因突变NGS检测的质控品。
实施例3:用Ion Torrent PGM测序平台对肿瘤相关基因突变NGS检测质控品进行验证
一.方法:利用Ion Torrent PGM测序平台进行验证
取实施例1得到的一套质控品样品盘,将其视为常规DNA标本在赛默飞世尔科技(中国)有限公司进行靶向NGS检测,经文库建立、模板制备、上机测序和生物信息学分析等步骤得出检测结果。
该实施例中靶向NGS检测范围为两种商品化检测盘Cancer Hotspot Panel v2和Colon and Lung Cancer Panel v2。
二.结果
测序比对后所得结果见表6。
表6
本实施例检测结果显示,赛默飞世尔科技(中国)有限公司利用Ion Torrent PGM测序平台能检测出本次质控样本盘中大多数突变,所报告的突变频率也与预期相符;部分预期突变由于超出其检测范围而未在结果中报告,即通过离子半导体测序平台对该肿瘤相关基因突变NGS检测质控品进行了验证。本发明可用作基于离子半导体测序平台的肿瘤基因突变NGS检测的质控品。
Claims (10)
1.一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:由人正常细胞系基因组DNA和含有肿瘤相关基因突变的DNA片段组成。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:所述人正常细胞系为人正常细胞系GM12878或人正常细胞系GM19240。
3.根据权利要求1或2所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:所述含有肿瘤相关基因突变的DNA片段是含有肿瘤相关基因热点和/或罕见突变所在的基因序列。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于,所述肿瘤相关基因热点和/或罕见突变为下述基因位点中的一个或多个:
(1)NM_005228.3(EGFR):c.493C>T(p.Arg165Trp)
(2)NM_000142.4(FGFR3):c.1948A>C(p.Lys650Gln)
(3)NM_005896.2(IDH1):c.395G>A(p.Arg132His)
(4)NM_000141.4(FGFR2):c.1124A>G(p.Tyr375Cys)
(5)NM_002834.3(PTPN11):c.182A>G(p.Asp61Gly)
(6)NM_000546.5(TP53):c.448_459del12(p.Thr150_Pro153del)
(7)NM_004333.4(BRAF):c.1799T>A(p.Val600Glu)
(8)NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G(p.Leu858Arg)
(9)NM_004119.2(FLT3):c.2520_252linsGGATCC(p.Ser840_Asn84linsGlySer)
(10)NM_004985.3(KRAS):c.34G>C(p.Gly12Arg)
(11)NM_005228.3(EGFR):c.2237_2254del18(p.Glu746_Ser752delinsAla)
(12)NM_004448.2(ERBB2):c.2263_2264TT>CC(p.Leu755Pro)
(13)NM_017617.3(NOTCH1):c.5965G>A(p.Asp1989Asn)
(14)NM_002524.4(NRAS):c.35G>A(p.Gly12Asp)
(15)NM_006206.4(PDGFRA):c.1664A>G(p.Tyr555Cys)
(16)NM_001014432.1(AKT1):c.49G>A(p.Glu17Lys)
(17)NM_006206.4(PDGFRA):c.1681_1682insAGAGGG(p.Arg560_Val56linsGluArg)
(18)NM_004985.3(KRAS):c.34G>T(p.Gly12Cys)
(19)NM_005228.3(EGFR):c.2156G>C(p.Gly719Ala)
(20)NM_004972.3(JAK2):c.1821G>C(p.lys607Asn)
(21)NM_002524.4(NRAS):c.38G>A(p.Gly13Asp)
(22)NM_000516.4(GNAS):c.601C>A(p.Arg201Ser)
(23)NM_005343.2(HRAS):c.181C>A(p.Gln61Lys)
(24)NM_000222.2(KIT):c.1675_1680delGTTGTT(p.Val559_Val560del)
(25)NM_006218.2(PIK3CA):c.1624G>A(p.Glu542Lys)
(26)NM_004333.4(BRAF):c.1405_1407del3(p.Gly469del)
(27)NM_002168.2(IDH2):c.419G>A(p.Arg140Gln)
(28)NM_004972.3(JAK2):c.1849G>T(p.Val617Phe)。
5.根据权利要求4所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:所述含有肿瘤相关基因突变的DNA片段为序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.28中的一个或多个核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:所述含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,含有KRAS c.34G>T(p.Gly12Cys)或含有IDH2 c.419G>A(p.Arg140Gln)突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9。
7.一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:由8个混合阳性样本和1个正常对照样本组成,每个混合阳性样本由3-5个选自序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.28的肿瘤DNA序列和人正常细胞系基因组DNA按比例混合组成,正常对照样本为人正常细胞系基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,其特征在于:所述含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,序列表SEQ ID No.18所示的突变DNA片段或序列表SEQID No.27所示的突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9。
9.一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)培养人正常细胞系,提取基因组DNA;
(2)合成含有不同肿瘤突变的DNA片段;
(3)制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品。
10.根据权利要求9所述的一种肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品的制备方法,其特征在于:
所述步骤(1)人正常细胞系,为人正常细胞系GM12878或人正常细胞系GM19240;
所述含步骤(2)含有不同肿瘤突变的DNA片段,为序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.28中的至少三个核苷酸序列;
所述步骤(3)制备肿瘤相关基因突变NGS检测的质控品,是指将步骤(1)得到的人正常细胞系基因组DNA与步骤(2)得到的含有不同肿瘤突变的DNA片段中的至少三个核苷酸序列进行混合,得到混合阳性样本;其中含有肿瘤相关基因突变DNA片段中,含有KRAS c.34G>T(p.Gly12Cys)或含有IDH2 c.419G>A(p.Arg140Gln)突变DNA片段与基因组DNA拷贝数之比为1∶99~1∶19,其余每个含有肿瘤相关基因突变的DNA片段与基因组DNA拷贝数之比均为1∶1~1∶9;其中两个低拷贝数比例突变为随机挑选;将步骤(1)得到的人正常细胞系基因组DNA作为正常对照样本。
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